CN111961138B - 疫苗融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包括SARS‑CoV‑2抗原多肽和鞭毛蛋白或其片段。本申请还提供了所述融合蛋白的制备方法和用途。本申请所述的融合蛋白能够诱导机体产生针对SARS‑CoV类病毒的抗原的细胞免疫反应。

Description

疫苗融合蛋白
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种包含SARS-CoV-2抗原多肽和鞭毛蛋白或其片段的融合蛋白。
背景技术
细菌鞭毛蛋白（flagellin）作为TLR5的天然配体，是一种强有力的激动剂，可被用作佐剂，激活机体天然免疫反应和获得性免疫反应。TLR5在黏膜固有层DCs中高表达，通过激活下游MyD88信号通路，鞭毛蛋白可促使细胞分泌细胞固和趋化因子，快速诱导天然免疫应答，活化的DCs迁移到次级淋巴器官，促进获得性免疫应答。鞭毛蛋白N端和C端由高度保守的α螺旋组成，构成TLR5的识别位点，且序列中间高变异区缺失不会显著影响其促炎性反应和佐剂活性，因此可将抗原与鞭毛蛋白保守区融合表达，增强其佐剂效应。
以细菌鞭毛蛋白为佐剂的疫苗具有低剂量有效性，可避免疫苗对机体产生副作用。鞭毛蛋白能诱导产生黏膜IgA，具有良好的黏膜佐剂效应。基于鞭毛蛋白的融合蛋白所形成的重组疫苗，较易生产且生产成本低。
2019年暴发的新冠病毒（2019-nCoV）疫情是21世纪人类遭遇的第三次冠状病毒袭击，可引起严重的人类呼吸系统疾病，具有较高的致死率。目前，尚无有效的药物用于治疗新冠病毒，开发针对性的疫苗是避免病毒大范围传播，疫情防控的长期有效办法。
发明内容
本申请提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括SARS-CoV-2抗原多肽和鞭毛蛋白或其片段。本申请所述的融合蛋白能够识别相应的受体（例如，血管紧张素转化酶2（ACE2）），能够诱导生物体产生相应的抗体，该抗体可以识别SARS-CoV类病毒的棘突蛋白（S1蛋白），从而诱导机体产生特异性的细胞免疫反应。
本申请所述的融合蛋白，能够正确表达且成分单一，构象正确，并且能够被受体ACE2识别并相互作用。使用本申请的融合蛋白免疫机体后产生的血清中包含不同类型的SARS-CoV-2病毒的S蛋白的抗体，可正确识别SARS-CoV-2病毒的S蛋白。本申请的融合蛋白能够刺激机体产生抑制SARS-CoV-2病毒感染细胞的抗体，且与病毒感染痊愈病人的血清抗体竞争结合病毒蛋白，还能诱导机体长生活化的T细胞，促进细胞因子的分泌。因此，本申请的融合的蛋白可开发作为SARS-CoV-2病毒的重组疫苗蛋白，具有重要的应用价值。
本申请所述的鞭毛蛋白或其片段可以发挥佐剂功能，增强宿主对SARS-CoV-2抗原多肽的免疫应答。在某些情形中，所述鞭毛蛋白或其片段可以将针对SARS-CoV-2抗原多肽的免疫应答增强至少约1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、75、100、150、500、1000倍或者以上。在另一些情形中，所述鞭毛蛋白或其片段可以减少实现特定水平的免疫应答（细胞和/或体液和/或粘膜的）所需的SARS-CoV-2抗原多肽的量，例如，减少至少约15%、25%、35%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或以上。在另一些情形中，所述鞭毛蛋白或其片段可以延长免疫应答持续的时间（例如，延长至少约1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍以上或者更长的时间）。
一方面，本申请提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括SARS-CoV-2抗原多肽和鞭毛蛋白或其片段，其中所述SARS-CoV-2抗原多肽包含B细胞表位热点区域I和/或B细胞表位热点区域II，所述B细胞表位热点区域I包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述B细胞表位热点区域II包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述鞭毛蛋白或其片段包括鞭毛蛋白的N端恒定区和鞭毛蛋白的C端恒定区。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2抗原多肽位于所述鞭毛蛋白的N端恒定区和所述鞭毛蛋白的C端恒定区之间。
在某些实施方式中，所述鞭毛蛋白或其片段不包含完整的鞭毛蛋白高变区。
在某些实施方式中，所述鞭毛蛋白或其片段不包含鞭毛蛋白高变区。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2抗原多肽的N端与所述鞭毛蛋白的N端恒定区的C端可操作连接；且所述SARS-CoV-2抗原多肽的C端与所述鞭毛蛋白的C端恒定区的N端可操作连接。
在某些实施方式中，所述鞭毛蛋白的N端恒定区包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述鞭毛蛋白的C端恒定区包含SEQ ID NO: 7-8中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述B细胞表位热点区域II位于所述SARS-CoV-2抗原多肽的N端。
在某些实施方式中，所述B细胞表位热点区域I为SARS-CoV-2受体结合结构域RBD。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2抗原多肽包含B细胞表位热点区域I中的至少一个细胞表位，和B细胞表位热点区域II中的至少一个细胞表位。
在某些实施方式中，所述B细胞表位热点区域I的N端与所述B细胞表位热点区域II的C端可操作连接。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2抗原多肽还包含氨基酸序列SEQ ID NO:3所示的T细胞表位热点区域中的至少一个T细胞表位。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2抗原多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3所示的T细胞表位热点区域。
在某些实施方式中，所述T细胞表位热点区域的N端与所述B细胞表位热点区域I的C端可操作连接。
在某些实施方式中，其还包含CD4+细胞表位。
在某些实施方式中，所述CD4+细胞表位包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CD4+细胞表位位于所述的SARS-CoV-2抗原多肽的N端或C端。
在某些实施方式中，所述CD4+细胞表位的N端与所述T细胞表位热点区域的C端可操作连接。
在某些实施方式中，所述CD4+细胞表位的C端与所述B细胞表位热点区域I的N端可操作连接。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 9-12中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白能够激活源自哺乳动物的T细胞和/或B细胞介导的免疫反应。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，所述核酸分子编码所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供了载体，所述载体包含所述的分离的核酸分子。
另一方面，本申请提供了细胞，所述细胞包含所述的分离的核酸分子，和/或所述的载体。
另一方面，本申请提供了制备所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在能够产生所述融合蛋白的条件下，培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或，所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了免疫原性组合物，其包含所述的SARS-CoV-2抗原多肽和鞭毛蛋白或其片段。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2抗原多肽和所述鞭毛蛋白或其片段偶联。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋白在用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗SARS-CoV类病毒引起的疾病。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV类病毒选自下组：SARS-CoV、SARS-CoV-2及其突变体。
在某些实施方式中，所述疾病包括重症急性呼吸综合征（SARS）和/或新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。
另一方面，本申请提供了产生SARS-CoV-2抗体的方法，所述方法包括施用所述的融合蛋白。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述融合蛋白的一般结构。
图2显示的是本申请所述融合蛋白的示例性结构。
图3显示的是本申请所述融合蛋白SC2V7表达成功的Western Blot结果。
图4显示的是本申请所述融合蛋白SC2V8表达成功的Western Blot结果。
图5显示的是本申请所述融合蛋白与ACE2受体结合的ELISA结果。
图6显示的是免疫接种后的小鼠血清特异性结合SARS-CoV-2病毒的RBD蛋白。
图7显示的是免疫接种后的小鼠血清特异性结合SARS-CoV-2病毒的RBD蛋白。
图8显示的是免疫接种后的小鼠血清阻断SARS-CoV-2假病毒侵染ACE2阳性宿主细胞。
图9显示的是免疫接种后的小鼠血清与痊愈病人血清竞争结合SARS-CoV-2病毒的RBD蛋白。
图10显示的是免疫接种HLA-A02转基因小鼠后的T细胞经疫苗活化后分泌细胞因子。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“SARS-CoV-2抗原多肽”通常是指能够在生物体中引发、产生或生成针对SARS-CoV-2抗原免疫应答的多肽分子。在本申请中，融合蛋白的SARS-CoV-2抗原多肽可以位于鞭毛蛋白的N端恒定区和C端恒定区之间的多肽部分。例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域I和B细胞表位热点区域II。所述SARS-CoV-2抗原多肽还可以包含其他区域，例如T细胞表位热点区域和/或CD4+结合表位。
在本申请中，术语“表位”通常是指抗原决定簇，即指分子中被免疫系统识别（例如被抗体识别）的部分。在本申请中，所述“抗原表位”可以与“表位”相互使用。例如，表位可以是被免疫系统识别的抗原上不连续的三维位点。表位通常由分子的化学活性表面基团（例如氨基酸或糖侧链）组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位根据结构，可分为构象表位和非构象表位（线性表位）。构象表位与非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下前者丧失结合，而后者则不会。只位于抗原物质表面、易与抗原识别受体或抗体结合的表位可称为功能性表位；位于分子内部、无免疫原性的表位可称为隐藏性表位。
在本申请中，术语“B细胞表位”通常是指可结合B细胞，从而诱导和/或产生B细胞介导的免疫反应的表位。
在本申请中，术语“T细胞表位”通常是指可结合T细胞，从而诱导和/或产生T细胞介导的免疫反应的表位。
在本申请中，术语“B细胞表位热点区域”通常是指包含至少两个所述B细胞表位的氨基酸序列。在所述B细胞表位热点区域中，通常可以包括多个（例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个）所述B细胞表位，因此可被视为是B细胞表位的“热点区域”。在某些情况下，所述B细胞表位热点区域可具备线性结构。
在本申请中，术语“T细胞表位热点区域”通常是指包含至少两个所述T细胞表位的氨基酸序列。在所述T细胞表位热点区域中，通常可以包括多个（例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个）所述T细胞表位，因此可被视为是T细胞表位的“热点区域”。在某些情况下，所述T细胞表位热点区域可具备线性结构。
在本申请中，术语“CD4+细胞表位”通常是指可以结合CD4+细胞的表位。CD4+细胞是T淋巴细胞的一种，通常是指细胞表面表达有CD4的细胞。所述CD4+细胞可以在遇到抗原呈递细胞（APC）表面MHC-II分子结合的抗原时被激活，从而快速分裂并开始分泌调节免疫反应的细胞因子。
在本申请中，术语“鞭毛蛋白”通常是指一种单体蛋白，可聚合形成与细菌运动相关的鞭毛。鞭毛蛋白可由鞭毛形细菌（例如，鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium））以及非鞭毛形细菌（例如，大肠杆菌（Escherichia coli））表达。鞭毛蛋白可以由基体、丝体（filament）和连接两者的钩子（hook）形成。丝体由单种蛋白一一鞭毛蛋白的长的多聚体形成，在末端具有小的帽蛋白。鞭毛蛋白的分子结构包含D0、D1、D2和D3四个结构域。蛋白链自D0结构域中的N端起始，通过其它结构域D1、D2和D3到分子末端，并在分子末端转弯形成大的环，然后通过D3、D2和D1结构域返回，使D0结构域中的C端非常靠近其N端。鞭毛蛋白的聚合由N端和C端的保守区（通常包含D0和D1）介导，而鞭毛蛋白的中间部分（interveningregion）（通常包含D2和D3）在物种之间非常不同，为高度可变的。
通常来说，鞭毛蛋白可以通过高度保守区激活先天免疫系统。由Toll样受体5（TLR5）以及Nod样受体（NLR）Ipaf和Naip5介导的先天免疫系统细胞（例如，树突状细胞、巨噬细胞等）能够感测鞭毛蛋白。已证实TLR和NLR在先天免疫应答和适应性免疫应答的激活中起作用。由于鞭毛蛋白结构体系中蛋白质在通过D0、D1、D2和D3所有结构域并且再返回形成环，一种多种结构域可以从鞭毛蛋白序列中删除，通过再连接两个末端形成连续的肽链，从而形成编码蛋白衍生物。在某些情形中，鞭毛蛋白顶部的结构域（例如全部或部分的高度保守区）可以被多肽（例如，抗原多肽）取代，只要该多肽的N端和C端可以被连接到鞭毛蛋白的N端和C端。
编码已知鞭毛蛋白多肽的核苷酸和氨基酸序列可在NCBI GenBank数据库中公开获得。已知的鞭毛蛋白可以来自鼠伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium），幽门螺旋杆菌（H.Pylori），霍乱弧菌（V.Cholera），粘质沙雷氏菌（S.marcesens），痢疾志贺氏杆菌（S.flexneri）、梅毒螺旋菌（T.Pallidum），嗜肺乳杆菌（L.pneumophila），伯氏疏螺旋体菌（B.burgdorferei），艰难梭状芽孢杆菌（C. difficile），苜蓿根瘤菌（R.meliloti）、根癌农杆菌（A.tumefaciens）、羽扇豆根瘤菌（R.lupini）、克氏巴尔通体菌（B.clarridgeiae）、奇异变型杆菌（P.Mirabilis）、枯草芽孢杆菌（B.subtilus）、李斯特单胞菌（L.monocytogenes）、绿脓杆菌（P.aeruginosa）及大肠杆菌（E.coli）。
示例性的鞭毛蛋白可包括来自伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）（UniPro登录号：Q56086）、鼠伤寒沙门氏菌（A0A0C9DG09）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）（A0A0C9BAB7）和霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）（Q6V2X8）的鞭毛蛋白。在本申请中，鞭毛蛋白或其片段具有与鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少50%、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在本申请中，术语“鞭毛蛋白或其片段”通常是指可包含全长鞭毛蛋白、其免疫原性片段，以及与鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。例如，鞭毛蛋白或其片段可以是删除了顶部结构域（例如全部或部分的高度保守区）的部分。又例如，鞭毛蛋白或其片段可以包含鞭毛蛋白的C端恒定区和鞭毛蛋白的N端恒定区。在某些情况下，鞭毛蛋白或其片段可以包含不完整的鞭毛蛋白高变区。在另一些情况下，鞭毛蛋白或其片段可以不包含鞭毛蛋白高变区。
在本申请中，术语“鞭毛蛋白的C端恒定区”通常是指鞭毛蛋白C端的活性片段（例如，激活TLR5的活性）。鞭毛蛋白的C端恒定区通常由高度保守的α螺旋组成。其长度可以为约50个、约100个或约110个氨基酸长度。如本领域技术人员理解的，鞭毛蛋白的C端恒定区的大小在一定程度上依赖于鞭毛蛋白的来源而变。例如，本申请所述的鞭毛蛋白的C端恒定区可包含鞭毛蛋白的第403-495位氨基酸序列。在本申请中，术语“鞭毛蛋白的C端恒定区”包括全长的鞭毛蛋白的C端恒定区，其功能性变体或其功能性片段（例如，末端删除45个氨基酸的片段）。示例性的鞭毛蛋白的C端恒定区可包含SEQ ID NO:7-8中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“鞭毛蛋白的N端恒定区”通常是指鞭毛蛋白N端的活性片段（例如，激活TLR5的活性）。鞭毛蛋白的N端恒定区可以由高度保守的α螺旋组成。其长度可以为约100个、约150个或200个氨基酸长度。如本领域技术人员理解的，鞭毛蛋白的N端恒定区的大小在一定程度上依赖于鞭毛蛋白的来源而变。例如，本申请所述的鞭毛蛋白的N端恒定区可包含鞭毛蛋白的第1-176位氨基酸序列。在本申请中，术语“鞭毛蛋白的N端恒定区”包括全长的鞭毛蛋白的N端恒定区，其功能性变体或其功能性片段。示例性的鞭毛蛋白的N端恒定区可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“鞭毛蛋白高变区”通常是指鞭毛蛋白的N端恒定区和C端恒定区之间的结构域，其可包含鞭毛蛋白的D3结构域和/或D2结构域。在不同来源的鞭毛蛋白中，高变区序列是高度可变的。在本申请中，融合蛋白中的鞭毛蛋白高变区可以全部或部分缺失。
本申请所述的鞭毛蛋白的N端恒定区、C端恒定区和高变区可以来自任何合适来源的鞭毛蛋白，且这些区域可以来自相同的生物，或者可以分别来自不同的生物。
在本申请中，术语“T细胞和/或B细胞介导的免疫反应”通常是指细胞介导免疫反应（Cell-mediated immunity），其可包括T细胞介导的免疫反应和/或B细胞介导的免疫反应。所述T细胞介导的免疫反应通过激活T细胞（例如CD4+细胞和/或CD8+细胞），释放淋巴因子，从而杀灭抗原。在本申请中，术语“B细胞介导的免疫反应”通常是指通过B细胞产生抗体来达到保护目的的免疫反应。在某些情况下，当受到抗原感染时，抗原可以被非特异性的免疫细胞（例如抗原呈递细胞）呈递给B细胞，从而使B细胞活化。活化的B细胞可产生针对该抗原的抗体，从而特异性地结合该抗原，阻止抗原进一步感染正常细胞。同时，活化的B细胞还可以与巨噬细胞结合，从而促进巨噬细胞吞噬该抗原。
在本申请中，术语“疫苗”通常是指用各类免疫原（例如，病原体或抗原多肽片段等）制作的、用于预防接种和/或治疗与该免疫原直接或间接相关的疾病或病症的生物制品。
在本申请中，术语“SARS-CoV”通常是指SARS冠状病毒，即严重急性呼吸道综合征冠状病毒（英文全称为Severe acute respiratory syndrome coronavirus），其属于冠状病毒科（Coronaviridae）乙型冠状病毒属（Betacoronavirus）沙贝病毒亚属（Sarbecovirus）。
在本申请中，术语“SARS-CoV类病毒”通常是指严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒，即 Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，其是冠状病毒科乙型冠状病毒属的一个种。SARS-CoV类病毒也可称为SARS冠状病毒或SARS相关冠状病毒。
在本申请中，术语“SARS-CoV-2”通常是指严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型，英文全称为Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2。SARS-CoV-2属于冠状病毒科（Coronaviridae）乙型冠状病毒属（Betacoronavirus）沙贝病毒亚属（Sarbecovirus）。SARS-CoV-2是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒。
在本申请中，术语“重症急性呼吸综合征（SARS）”通常是指由SARS-CoV引发的疾病。SARS 通常以肌肉疼痛、头痛和发烧的全身症状为特征，并于2-14天内出现咳嗽、呼吸困难和肺炎等呼吸道症状。
在本申请中，术语“新型冠状病毒肺炎（COVID-19）”通常是指2019冠状病毒病（英文全称为 coronavirus disease 2019），其是由SARS-CoV-2引发的疾病。大多数 COVID-19患者的表现以下呼吸道症状为主，常见临床表现包括发热、四肢乏力、干咳等症状。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”或“分离的核酸”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物（例如，可以获得本申请所述的SARS-CoV-2 抗原多肽）。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常是指下述多肽分子，其中一种多肽（例如本申请的SARS-CoV-2抗原多肽）的氨基酸序列直接或间接地（例如通过连接子）与另一种异源多肽的氨基酸序列相融合（例如，通过肽键）。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5%-10%的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。
发明详述
SARS-CoV-2抗原多肽
一方面，本申请提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白可以包括SARS-CoV-2抗原多肽。所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域I和B细胞表位热点区域II中的至少一个表位，所述B细胞表位热点区域I可以包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述B细胞表位热点区域II可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的SARS-CoV-2抗原多肽可以包括氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的B细胞表位热点区域中的至少1个（例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个）B细胞表位；和/或，在本申请中，所述分离的SARS-CoV-2抗原多肽可以包括氨基酸序列SEQ ID NO:2所示的B细胞表位热点区域中的至少1个（例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个）B细胞表位。
在本申请中，所述至少1个B细胞表位的氨基酸序列之间可以存在重叠。在本申请中，所述至少1个B细胞表位的氨基酸序列之间可以不存在重叠和/或交叉。
例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域I中的氨基酸序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的两个B细胞表位。
例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域II中的氨基酸序列如SEQ ID NO:19-22和28中任一项所示的B细胞表位中的至少1个（例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个）。
例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域II中的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的B细胞表位和氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的B细胞表位；或者，可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的B细胞表位和氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的B细胞表位；或者，可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的B细胞表位和氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示的B细胞表位；或者，可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示的B细胞表位和氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示的B细胞表位。
例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域II中的氨基酸序列如SEQ ID NO:19-21中所示的3个B细胞表位；例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域II中的氨基酸序列如SEQ ID NO:20-22中所示的3个B细胞表位。例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域II中的氨基酸序列如SEQ ID NO:21、22和28中所示的3个B细胞表位。
又例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域II中的氨基酸序列如SEQ ID NO:19-22所示的4个B细胞表位；又例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域II中的氨基酸序列如SEQ ID NO:20-22和28所示的4个B细胞表位。
又例如，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以包含B细胞表位热点区域II中的氨基酸序列如SEQ ID NO:19-22和28中的5个B细胞表位。
例如，在本申请中，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽可包含氨基酸序列SEQ IDNO: 1所示的B细胞表位热点区域。
例如，在本申请中，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽可包含氨基酸序列SEQ IDNO: 2所示的B细胞表位热点区域。
在本申请中，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽可以由氨基酸序列SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示的B细胞表位热点区域中的B细胞表位组成。
例如，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中所示的1个B细胞表位，且可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:19-22和28中任一项所示的B细胞表位中的至少1个（例如至少2个、至少3个或至少4个）。
在某些情形中，所述B细胞表位热点区域I可以为SARS-CoV-2受体结合结构域RBD。例如，所述SARS-CoV-2受体结合结构域RBD可以包含SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽中的B细胞表位热点区域I可以在B细胞表位热点区域II的C端。或者，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽中的B细胞表位热点区域I可以在B细胞表位热点区域II的N端。
本申请所述SARS-CoV-2抗原多肽还可以包含氨基酸序列SEQ ID NO:3所示的T细胞表位热点区域中的至少1个（例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个）T细胞表位。
在本申请中，所述至少1个T细胞表位的氨基酸序列之间可以存在重叠。在本申请中，所述至少1个T细胞表位的氨基酸序列之间可以不存在重叠和/或交叉。
例如，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽可以包含所述T细胞表位热点区域中的氨基酸序列如SEQ ID NO:23-27中任一项所示的T细胞表位中的至少1个（例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个）。
例如，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽可以包含所述T细胞表位热点区域中的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的T细胞表位和氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的T细胞表位；或者，可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的T细胞表位和氨基酸序列如SEQ IDNO:25所示的T细胞表位；或者，可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的T细胞表位和氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的T细胞表位；或者，可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的T细胞表位和氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示的T细胞表位。
又例如，所述的分离的SARS-CoV-2抗原多肽可以包含所述T细胞表位热点区域中的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23-27中任一项所示的T细胞表位中的3个；又例如，可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 23-27中任一项所示的T细胞表位中的4个；又例如，可以包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO: 23-27所示的5个T细胞表位。
在本申请中，所述的SARS-CoV-2抗原多肽可以包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3所示的T细胞表位热点区域。所述的SARS-CoV-2抗原多肽可以包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26所示的T细胞表位。
在某些情形中，所述T细胞表位热点区域可以位于所述B细胞表位的N端。在某些情形中，所述T细胞表位热点区域可以位于所述B细胞表位的C端。
在某些情形中，本申请所述的SARS-CoV-2抗原多肽，从N端至C端，可以依次包含所述B细胞表位热点区域II、所述B细胞表位热点区域I和所述T细胞表位。在某些情形中，所述B细胞表位热点区域I的N端可以与所述B细胞表位热点区域II的C端可操作连接，所述T细胞表位热点区域的N端可以与所述B细胞表位热点区域I的C端可操作连接。
在某些情形中，本申请所述的SARS-CoV-2抗原多肽，从N端至C端，可以依次包含所述B细胞表位热点区域I和所述T细胞表位。在某些情形中，所述T细胞表位热点区域的N端可以与所述B细胞表位热点区域I的C端可操作连接。
在本申请中，所述融合蛋白还可以包含CD4+细胞表位。在本申请中，利用所述CD4+细胞表位可以进一步促进T细胞激活，进而促进T细胞介导的免疫反应。
在本申请中，所述CD4+细胞表位可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述CD4+细胞表位可以位于所述SARS-CoV-2抗原多肽的N端。在某些情形中，所述CD4+细胞表位的C端可以与所述B细胞表位热点区域I的N端可操作连接。
在某些情形中，所述CD4+细胞表位可以位于所述SARS-CoV-2抗原多肽的C端。在某些情形中，所述CD4+细胞表位的N端可以与所述T细胞表位热点区域的C端可操作连接。
在某些情形中，本申请所述的SARS-CoV-2抗原多肽，从N端至C端，可以依次包含所述B细胞表位热点区域II、所述B细胞表位热点区域I、所述T细胞表位热点区域和所述CD4+细胞表位。在某些情形中，所述B细胞表位热点区域I的N端可以与所述B细胞表位热点区域II的C端可操作连接，所述T细胞表位热点区域的N端可以与所述B细胞表位热点区域I的C端可操作连接，所述CD4+细胞表位的N端可以与所述T细胞表位热点区域的C端可操作连接。
在某些情形中，本申请所述的SARS-CoV-2抗原多肽，从N端至C端，可以依次包含所述B细胞表位热点区域II、所述B细胞表位热点区域I、所述T细胞表位热点区域和所述CD4+细胞表位。在某些情形中，所述T细胞表位热点区域的N端可以与所述B细胞表位热点区域I的C端可操作连接，所述CD4+细胞表位的C端可以与所述B细胞表位热点区域I的N端可操作连接。
鞭毛蛋白
本申请所述的融合蛋白可以包含鞭毛蛋白或其片段。本申请所述的鞭毛蛋白可以来自沙门氏菌、伤寒杆菌和/或丝状杆菌。在某些情形中，所述鞭毛蛋白或其片段可以包含鞭毛蛋白的N端恒定区和鞭毛蛋白的C端恒定区。可以对天然的鞭毛蛋白的N端恒定区和/或C端恒定区加以修饰，以增强安全性和/或免疫应答。在某些情形中，鞭毛蛋白的C端恒定区和N端恒定区可包含TLR5识别位点并且能够激活TLR5途径。在某些情形中，鞭毛蛋白N端恒定区和/或C端恒定区可包含全长的恒定区，或者可以仅包含恒定区的一个或两个片段。
在某些情形中，本申请所述鞭毛蛋白的N端恒定区可以包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述鞭毛蛋白的C端恒定区可以包含SEQ ID NO: 7-8中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的鞭毛蛋白的N端恒定区和鞭毛蛋白的C端恒定区可以不直接连接在一起。
融合蛋白
在本申请所述的融合蛋白中，所述SARS-CoV-2抗原多肽可以位于所述鞭毛蛋白的N端恒定区和所述鞭毛蛋白的C端恒定区之间，结构可参见图1。本申请所述SARS-CoV-2抗原多肽的N端可以与所述鞭毛蛋白的N端恒定区的C端可操作连接；且所述SARS-CoV-2抗原多肽的C端可以与所述鞭毛蛋白的C端恒定区的N端可操作连接。
在本申请中，从N端至C端，所述的融合蛋白可以依次包含所述鞭毛蛋白的N端恒定区、所述SARS-CoV-2抗原多肽和所述鞭毛蛋白的C端恒定区。
例如，所述融合蛋白自N端至C端，可依次包含鞭毛蛋白的N端恒定区、B细胞表位热点区域II、所述B细胞表位热点区域I和鞭毛蛋白的C端恒定区。
例如，所述融合蛋白自N端至C端，可依次包含鞭毛蛋白的N端恒定区、B细胞表位热点区域II、所述B细胞表位热点区域I、所述T细胞表位热点区域和鞭毛蛋白的C端恒定区。
例如，所述融合蛋白自N端至C端，可依次包含鞭毛蛋白的N端恒定区、B细胞表位热点区域II、所述B细胞表位热点区域I、所述T细胞表位热点区域、所述CD4+细胞表位和鞭毛蛋白的C端恒定区，如图2A所示。
例如，所述融合蛋白自N端至C端，可依次包含鞭毛蛋白的N端恒定区、所述B细胞表位热点区域I和鞭毛蛋白的C端恒定区。
例如，所述融合蛋白自N端至C端，可依次包含鞭毛蛋白的N端恒定区、所述B细胞表位热点区域I、所述T细胞表位热点区域和鞭毛蛋白的C端恒定区。
例如，所述融合蛋白自N端至C端，可依次包含鞭毛蛋白的N端恒定区、所述CD4+细胞表位、所述B细胞表位热点区域I、所述T细胞表位热点区域和鞭毛蛋白的C端恒定区，如图2B所示。
例如，所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 9-12中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白能够激活源自哺乳动物的T细胞和/或B细胞介导的免疫反应。
在某些情形中，所述SARS-CoV-2抗原多肽和所述鞭毛蛋白或其片段偶联。
在本申请中，所述B细胞表位热点区域I、所述B细胞表位热点区域II、T细胞表位热点区域、所述CD4+细胞表位、所述SARS-CoV-2受体结合结构域RBD、所述鞭毛蛋白的N端恒定区、所述鞭毛蛋白的C端恒定区、细胞表位和/或所述融合蛋白，不仅包括上述各自的氨基酸序列，还可以包括各自的氨基酸序列的变异体。
在本申请中，所述氨基酸序列的变异体可包含：1）与相应氨基酸序列（例如 SEQID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQID NO: 7-8、SEQ ID NO: 17-27和/或SEQ ID NO: 9-12中任一项所示的氨基酸序列）具有至少 80%（例如，至少 85%，至少 90%，至少 91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少 100%）序列同源性的氨基酸序列；和/或，
2）在相应氨基酸序列（例如 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ IDNO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7-8、SEQ ID NO: 17-27和/或SEQ IDNO: 9-12中任一项所示的氨基酸序列）中经过取代、缺失或添加一个或几个（例如，1-2个，1-3个，1-4个，1-5个，1-6个，1-7个，1-8个，1-9个，1-10个，1-11个，1-12个或更多）氨基酸而获得的氨基酸序列。
在本申请中，术语“同源性”通常是指两个或更多个多核苷酸序列间或者两个或更多个多肽序列间的序列相似性或可互换性。当使用计算机程序或软件（例如，EmbossNeedle 或BestFit）来确定不同氨基酸序列间的序列同一性、相似性或同源性时，可使用默认的参数设置。也可以选择适当的记分矩阵，例如blosum45或blosum80，来优化同一性、相似性或同源性分数。在某些实施方式中，同源的多核苷酸包括下述多核苷酸：其能够在严紧条件下与对照多核苷酸序列杂交并且与对照多核苷酸序列相比具有至少60%、至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%甚至至少100%序列同一性。同源的多肽可以是下述多肽：当在优化条件下进行序列比对时，其与对照多肽序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、甚至至少100%的序列同一性。
为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign（DNASTAR）软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，所述氨基酸的取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。经取代后的所述SARS-CoV-2抗原多肽和/或所述融合蛋白仍能够被SARS-CoV抗体或SARS-CoV-2抗体所识别和/或结合。
例如，所述氨基酸取代可以为非保守取代。所述非保守取代可包括以非保守的形式改变目标蛋白或多肽中的氨基酸残基，例如将具有某种侧链大小或某种特性（例如，亲水性）的氨基酸残基变为具有不同侧链大小或不同特性（例如，疏水性）的氨基酸残基。
所述氨基酸取代也可以为保守取代。所述保守取代可包括以保守的形式改变目标蛋白或多肽中的氨基酸残基，例如将具有某种侧链大小或某种特性（例如，亲水性）的氨基酸残基变为具有相同或相似侧链大小或者相同或相似特性（例如，仍为亲水性）的氨基酸残基。这样的保守取代通常不会对所产生的蛋白质的结构或功能带来很大影响。在本申请中，作为所述SARS-CoV-2抗原多肽、所述鞭毛蛋白的C端恒定区、所述鞭毛蛋白的N段恒定区和/或所述融合单边的氨基酸序列变体可包括不显著改变蛋白质结构或其功能的保守氨基酸取代。
作为示例，下述各组中每组内各氨基酸间的相互取代在本申请中可被认为是保守取代：具有非极性侧链的氨基酸组：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
不带电荷、具有极性侧链的氨基酸组：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。
负电荷、具有极性侧链的氨基酸组：天冬氨酸和谷氨酸。
带正电荷的碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
带苯基的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
核酸分子、载体、药物组合物
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，所述核酸分子可以编码所述的融合蛋白。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：i）在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应（PCR）扩增产生的，（ii）通过克隆重组产生的，（iii）纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者（iv）合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述SARS-CoV-2抗原多肽、所述鞭毛蛋白或其片段和/或所述融合蛋白的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸 PCR，具体操作可参见 Sambrook 等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube 等人 Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York N.Y.，1993。
另一方面，本申请提供了载体，所述载体可以包含所述的分离的核酸分子。例如，所述载体可以包含所述SARS-CoV-2抗原多肽、所述鞭毛蛋白或其片段和/或所述融合蛋白的核酸分子。
此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子（如CMV），其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白（如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶）基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。在某些实施方式中，所述载体可以为表达载体。
在本申请中，所述的载体可以包括病毒载体。例如，所述载体可以为AAV载体。
在某些情况下，所述载体可以包括细菌载体，例如，所述载体可以为pQE70、pQE60和pQE_9，pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540或pRIT5。
在某些情况下，所述载体可以包括真核载体，例如，所述载体可以为pFastBaclpWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG、pSVK3、pBPV、pMSG或pSVL。
另一方面，本申请提供了细胞，所述细胞包含所述的分离的核酸分子，和/或所述的载体。
在本申请中，所述细胞可以表达本申请所述SARS-CoV-2抗原多肽、所述鞭毛蛋白或其片段和/或所述融合蛋白。
另一方面，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或，所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
所述药物组合物还可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，可按照本领域的常规技术手段将所述药物组合物与可药用载体或稀释剂以及任何其他已知的辅剂和赋形剂配制在一起，例如按照 Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第十九版，Gennaro 编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995 中公开的技术进行操作。
所述药物组合物可以用于在体内（例如，生物体内，如动物体内或人体内）或体外（例如分离的细胞或组织中）产生免疫活性物质。所述免疫活性物质可包括SARS-CoV抗体或SARS-CoV-2抗体。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以用于预防和/或治疗SARS-CoV类病毒引起的疾病（例如，重症急性呼吸综合征（SARS）和/或新型冠状病毒肺炎（COVID-19））。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。
例如，本申请所述的药物组合物可以为适于口服给药的形式，如片剂，胶囊剂，丸剂，粉剂，缓释制剂，溶液剂，混悬剂，或者用于肠胃外注射，如无菌溶液剂，混悬剂或乳剂，或者用于软膏或乳膏局部给药或作为栓剂直肠给药。所述药物组合物可以是适合精确剂量单次给药的单位剂量形式。所述药物组合物可以进一步包含常规的药物载体或赋形剂。此外，所述药物组合物可以包括其他药物或药剂、载体、佐剂等。
本申请所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述融合蛋白。所述预防和/或治疗有效量是能够产生免疫活性物质（例如，特异性于SARS-COV类病毒的抗体，如SARS-COV-2抗体），和/或能够治疗或减缓疾病（例如重症急性呼吸综合征（SARS）和/或新型冠状病毒肺炎（COVID-19））的发展或进展。所述剂量的具体量/浓度可以根据施用方法和患者需要而变化，并且可以基于例如患者体积，粘度和/或体重等来确定。应当理解的是，基于特定患者，制剂和/或疾病的状况，本领域技术人员（例如，医生或药剂师）可以方便地调整这些特定剂量。
另一方面，本申请提供了免疫原性组合物，其包含所述的SARS-CoV-2抗原多肽和鞭毛蛋白或其片段。
可以通过化学合成或重组表达、纯化等方法制备本申请所述的融合蛋白，随后可将所述融合蛋白与一种或多种其它SARS-COV类病毒的抗原和/或药学上可接受的佐剂进行混合而制备所述组合物。例如，所述融合蛋白或其它SARS-COV类病毒的抗原可与一种或多种糖脂类似物相组合或结合，以增强其免疫效果。这些组合物可被用于免疫（例如，通过肌内或肠胃外施用）受试者（例如，动物或人，如鼠类、兔类、羊类等）。所述组合物中也可包含一种或多种药学上可接受的佐剂，例如缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
方法和用途
另一方面，本申请提供了制备所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在能够产生所述融合蛋白的条件下，培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋白在用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗SARS-CoV类病毒引起的疾病。
在某些情形中，所述SARS-CoV类病毒可以选自下组：SARS-CoV、SARS-CoV-2及其突变体。
在某些情形中，所述疾病包括重症急性呼吸综合征（SARS）和/或新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。
另一方面，本申请提供了产生SARS-CoV-2抗体的方法，所述方法包括施用所述的融合蛋白。在本申请中，施用所述融合蛋白后，可以产生体内T细胞和/或B细胞介导的所述免疫反应，从而产生针对SARS-CoV-2的抗体，和/或直接杀灭SARS-CoV-2。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1 基于鞭毛蛋白融合蛋白构建融合蛋白
构建融合蛋白，自N端至C端依次为：鞭毛蛋白flagellin（FliC）N端恒定区（第1-176位氨基酸，SEQ ID NO: 6），B细胞表位热点区域II（B2，SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 28重叠），SARS-CoV-2受体结合结构域RBD（包含有B1片段，SEQ ID NO: 5），T细胞表位（SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25重叠），panT（泛HLA-DR结合表位/辅助T细胞表位，即CD4+细胞表位，SEQ ID NO: 4），和鞭毛蛋白FliC C端恒定区（第403-495位氨基酸，SEQ ID NO: 7）。其中，鞭毛蛋白为分子内佐剂，与SARS-CoV-2抗原共同构成重组疫苗,获得的融合蛋白称为SC2V7（氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，具体结构如图2A所示）。
构建融合蛋白，自N端至C端依次为：鞭毛蛋白flagellin（FliC）N端恒定区（第1-176位氨基酸，SEQ ID NO: 6），panT（泛HLA-DR结合表位/辅助T细胞表位，即CD4+细胞表位，SEQ ID NO: 4）， SARS-CoV-2受体结合结构域RBD（包含有B1片段，SEQ ID NO: 5），T细胞表位（SEQ ID NO: 26），和鞭毛蛋白FliC C端恒定区（第403-495位氨基酸，SEQ ID NO: 7）。其中，鞭毛蛋白为分子内佐剂，与SARS-CoV-2抗原共同构成重组疫苗，获得的融合蛋白称为SC2V8（氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，具体结构如图2B所示）。
编码SC2V7和SC2V8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示。
此外，将鞭毛蛋白flagellin（FliC）C端恒定区由包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列的片段替换为包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的片段，构建不含完整C端的融合蛋白SC2V7-1（SEQ ID NO: 11）和SC2V8-1（SEQ ID NO: 12），编码SC2V7-1和SC2V8-1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示。
实施例2 融合蛋白表达验证
由苏州金唯智生物科技有限公司合成编码SC2V7和SC2V8的核酸序列，插入至pET21a表达载体（购自EMD Biosciences）的Nde I和Pst I之间，得到表达载体。将表达载体转化大肠杆菌 BL21-Gold（DE3），并于LB 培养基（包含 100µg/ml 氨苄）37℃下培养过夜。将转化后的大肠杆菌在 TB 培养基（包含 100µg/ml 氨苄）大规模表达，在 DO595 为 2.0-2.5 时，加入1mM的IPTG（购自生工生物工程（上海）股份有限公司）诱导，37℃，培养4小时。收集上述培养后的细菌，高压破碎，细菌裂解液42℃加热过夜，离心收集沉淀，沉淀重悬在0.2-0.25M硫酸铵溶液中，4℃，2小时，并缓慢搅拌。离心，将沉淀用PBS-吐温缓冲液（10 mMNa2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4 and 0.25% Tween20）重悬，缓慢搅拌过夜。再离心，得的沉淀用3-3.5M 尿素（PBS，20%甘油，PH9.0）缓冲液重悬，4℃，过夜。上排阻柱（HiLoad 26/60 Superdex 200 pg SECcolumn），柱子用3-3.5M 尿素（PBS，20%甘油，pH 9.0）缓冲液平衡，收集融合蛋白。常温透析过夜重聚，透析液为50 mMTris–HCl, 800 mM NaCl （pH 7.0）。重聚的融合蛋白进一步用 0.5M 的硫酸铵溶液浓缩纯化，离心后，沉淀用 PBS-吐温缓冲液重悬，然后用 PBS 缓冲液透析。
获得纯化的融合蛋白SC2V7与SC2V8，IPTG诱导后收获的菌液及超声收集样品经15% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的1×TBST室温封闭1h；加入抗-His标签抗体或抗SARS-CoV S蛋白RBD的抗体（Sino Biological, cat#40150-T62-COV2），室温孵育1h；1× TBST洗涤 3 次，每次5min；加入HRP 标记的兔抗鼠IgG（1:10000 稀释，购自美国 Santa Cruz 公司），室温孵育1h； 1×TBST洗涤3次，每次5min，1×TBS 洗涤 2 次，每次5min。ECL 显色，线底片曝光分析结果。结果如图3和图4所示，SC2V7（图3）与SC2V8（图4）蛋白表达成功且成分单一。
实施例3 融合蛋白RBD构象验证
1）正确折叠的RBD结构域将能与其受体ACE2相互作用，以此为原理对重组疫苗中RBD构象进行验证。根据实施例2的方法获得重组疫苗蛋白，将ACE2蛋白（Sino biological,Cat: 10108-H08H）包被至ELISA微孔板中，清洗后加入封闭液封闭，再将重组疫苗蛋白SC2V7或SC2V8加入微孔板中孵育，清洗后加入抗anti-RBD抗体（Sino biological, Cat:40150-T62-COV2）孵育，清洗后再加入二抗（Jackson ImmunoResearch,Cat:111-035-003）孵育，最后清洗加入反应底物孵育适当时间后终止反应，读取各孔数据对结果进行分析。结果显示，融合蛋白SC2V7和SC2V8均可与微孔板中包被的ACE2相互作用（图5）。
2）正确折叠的RBD结构域诱导动物产生相应抗体，该抗体能正确识别新冠病毒（SARS-CoV-2）S1蛋白，以此对重组疫苗中RBD构象进行验证。
免疫正常的C57小鼠：6-8周龄C57小鼠接种实施例2中制备的融合蛋白（SC2V7和SC2V8）。第一周，免疫剂量为25µg/只，后两周减半。免疫部分均为后腿肌肉注射。连续三周免疫后，小鼠处死采血并分离血清。
免疫血清分离：小鼠眼球摘除或心脏采血，于室温下静置1h，待血液凝固。凝固血液于3000rpm离心10min，小心取出上清即为血清。血清分装后于-20℃保存。
配制100mM碳酸盐包被缓冲液，将SARS-CoV-2病毒S蛋白稀释至20μg/ml，并包被至ELISA微孔板中，室温孵育2h。弃去包被上清，PBS清洗2遍后，小心去除孔板中液体，加入封闭液封闭，室温孵育2h。PBS清洗2次后，加入封闭液稀释过的免疫血清，室温孵育2h。PBS清洗4次，加入适当浓度的二抗，室温孵育1h。PBS清洗2次后，加入反应底物，室温孵育10-20min，加入等体积终止液终止反应。读取各样品孔的吸光度数据，分析结果。
结果如图6所示，重组疫苗蛋白SC2V8（本申请所述的融合蛋白）免疫小鼠后的免疫血清可正确识别新冠病毒S蛋白（SARS-CoV-2）。
实施例4 融合蛋白诱导机体产生抗毒血清
1）疫苗免疫后机体产生的血清可识别病毒抗原。按照实施例3的方法用实施例2获得的融合蛋白SC2V8对C57小鼠进行免疫，分离免疫血清。将SARS-CoV-2病毒S蛋白包被至ELISA微孔板中，清洗后加入封闭液封闭，再将1：100稀释的免疫血清加入微孔板中孵育，清洗后分别加入抗-小鼠IgA和/或IgM和/或IgG二抗孵育(abcab, Cat:ab6006)，最后清洗加入反应底物孵育适当时间后终止反应，读取各孔数据并对结果进行分析，确认疫苗免疫血清可正确识别结合SARS-CoV-2的S蛋白，结果如图7所示，其中，IN为鼻腔接种疫苗，SC为皮下接种疫苗）。
2）疫苗免疫后机体产生的血清可阻断病毒对细胞的侵染。获得实施例2的重组疫苗蛋白，与佐剂等体积混合后免疫C57小鼠，一周后加强免疫，并在一周后取小鼠外周血，分离血清备用。体外培养表达ACE2受体的细胞系Vero E6细胞，分别加入1：100稀释的免疫前小鼠血清或不同个体的免疫后血清（样本1、样本2和样本3）。制备带有报告基因的新冠病毒假病毒颗粒，加入上述培养体系中，培养一段时间后更换新鲜培养基正常培养，检测各组细胞中报告基因的表达情况，确认免疫后血清对假病毒感染的剂量依赖性阻断效果。结果如图8显示，其中样品1和样品2是SC2V7免疫后血清，样品3是SC2V8免疫后血清，NC是免疫前血清，ACE-Fc是阳性对照。结果显示来自不同个体的免疫后血清均能抑制假病毒感染Vero E6细胞，且抑制率在20%-80%之间。
3）疫苗免疫后机体产生的血清，与病毒感染痊愈病人血清相比可识别相同的表位。按照实施例3的方法用实施例2获得的融合蛋白对C57小鼠进行免疫，分离免疫血清。将痊愈病人血清适当稀释后与1：100稀释的小鼠免疫血清共孵育，再将混合物加入包被了SARS-CoV-2 S蛋白的ELISA微孔板中孵育，清洗后加入适量辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG 二抗(Beyotime, Cat:A0201)，再清洗加入反应底物孵育适当时间后终止反应，读取各孔数据并对结果进行分析，检测小鼠免疫血清对痊愈病人血清病毒识别的竞争抑制能力。结果如图9所示，其中，IN为鼻腔接种疫苗，SC为皮下接种疫苗，阳性对照为不加阻断血清的对照组，结果显示免疫接种后的小鼠血清与痊愈病人血清竞争结合SARS CoV2 的RBD蛋白。
实施例5 融合蛋白诱导机体产生特异的细胞免疫反应
T细胞免疫反应依赖于TCR与MHC-多肽复合物的相互作用，为检测重组疫苗被递呈与激活T细胞的能力，需使用hHLA转基因小鼠（如HLA-A02，HLA-A03等）进行细胞免疫的相关检测。使用T2细胞负载重组疫苗蛋白中T细胞表位热点区域中的HLA-A02限制性表位多肽，将负载了多肽的T2细胞与分离得的T细胞共培养，培养适当时间后检测T细胞的活化状态，用ELISPOT技术检测培养体系中相关细胞因子的分泌水平，确认本申请中重组疫苗蛋白诱导机体产生特异的细胞免疫应答能力。
1）按照实施例2的方法表达获得重组疫苗蛋白，免疫6-8周龄的HLA-A02转基因的C57小鼠。第一周，免疫剂量为25µg/只，后两周减半。免疫部位均为后腿肌肉注射。眼球取血处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏，无菌操作。在60mm培养皿中放入5mL EZ-Sep™ Mouse 1X淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上。然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中，然后覆盖上大约1mL的1640培养基。2200rpm离心20分钟。离心结束后淋巴细胞漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。吸出淋巴细胞层，加入PBS/10mL 1640培养基洗涤一次，1500rpm离心8分钟。弃上清液，加入PBS/10mL无血清1640培养基重悬，1200rpm离心8分钟，弃上清，获得T细胞。
2）T细胞应答检测（ELISPOT），操作如下。
A、包被抗体（无菌环境）：1、用去离子水配制PH7.4无菌PBS稀释包被抗体IFN-γ（1μg/μLAN18）到15μg/mL；2、用酒精预湿润膜：PVDFMSIP类15μL 35%酒精每孔最多1分钟；3、用200μL/孔无菌水洗5次；4、加入100μL/孔稀释好的抗体4-8°C过夜。
B、孵育细胞（无菌环境）：1、吸出抗体，用200μL/孔无菌PBS，洗板5次；2、加入200μL/孔含10%胎牛血清的培养基，室温预孵育至少30分钟；3、吸出培养基，加入200μL抗原和含培养基的细胞悬液；4、在37℃，5%CO2，孵育12-48h。
C、斑点检测：（1）裂解细胞（低渗法裂解细胞）：倾倒孔内的细胞及培养基，200μL/孔加入冰冷的去离子水，4℃冰箱孵育10min。（2）洗涤：每孔加入200μLPBS，浸泡 1min后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干；（3）用含0.5%胎牛血清的PBS（PBS-0.5%FCS）稀释抗体1mg/ml IFN-γ-II（R4-6A2）到1μg/ml（1:1000），每孔加100 μL，室温孵育2h。（4）洗涤：每孔加入200μLPBS，浸泡1 min后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。（5）用PBS-0.5%FCS稀释Streptavidin-ALP（1:1000），每孔加100μL，室温孵育1h。（6）洗涤：每孔加入200μL PBS，浸泡1 min后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。（7）显色：每孔加入稀释好的酶作用物（BCIP/NBT：需过滤）100μL，室温25℃静置25min显色，避光。（8）斑点生成到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置30min，让膜自然晾干。（9）将ELISpot板置于Biosys Bioreader自动读板仪，斑点计数，做统计分析。（10）在暗环境室温保存板子。
结果如图10所示，本申请所述的融合蛋白能够活化T细胞分泌IFN-γ。
序列表
<110> 苏州茂行生物科技有限公司
<120> 疫苗融合蛋白
<130> 0131-PA-011
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位热点区域I
<400> 1
Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe
1 5 10 15
Asn Ala Thr
<210> 2
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位热点区域II
<400> 2
Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val
1 5 10 15
Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser
20 25 30
Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg
35 40 45
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T细胞表位热点区域
<400> 3
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
1 5 10 15
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr
20 25
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD4+细胞表位（panT）
<400> 4
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD
<400> 5
Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe
1 5 10 15
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
20 25 30
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe
35 40 45
Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu
50 55 60
Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu
65 70 75 80
Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn
85 90 95
Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser
100 105 110
Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg
115 120 125
Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr
130 135 140
Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe
145 150 155 160
Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly
165 170 175
Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
180 185 190
His Ala Pro
195
<210> 6
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FliC N端恒定区
<400> 6
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln
165 170 175
<210> 7
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FliC C端恒定区完整序列
<400> 7
Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn
20 25 30
Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala
35 40 45
Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met
50 55 60
Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln
65 70 75 80
Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg
85 90
<210> 8
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FliC C端恒定区删除45个氨基酸的序列
<400> 8
Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn
20 25 30
Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala
35 40 45
<210> 9
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SC2V7（含完整C端）
<400> 9
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln
165 170 175
Arg Arg Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu
180 185 190
Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu
195 200 205
Ile Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Arg Phe Pro Asn
210 215 220
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
225 230 235 240
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
245 250 255
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
260 265 270
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
275 280 285
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
290 295 300
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
305 310 315 320
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
325 330 335
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
340 345 350
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
355 360 365
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
370 375 380
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
385 390 395 400
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Gly Gly Gly Arg Arg Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala
420 425 430
Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Arg Arg Ala Lys Phe
435 440 445
Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Arg Arg Thr Thr Thr Glu
450 455 460
Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu
465 470 475 480
Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr
485 490 495
Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala Arg Ser Arg Ile
500 505 510
Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln
515 520 525
Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val
530 535 540
Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg His His His His His His
545 550 555
<210> 10
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SC2V8（含完整C端）
<400> 10
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln
165 170 175
Arg Arg Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Arg
180 185 190
Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
195 200 205
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
210 215 220
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
225 230 235 240
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
245 250 255
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
260 265 270
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
275 280 285
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
290 295 300
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
305 310 315 320
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
325 330 335
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
340 345 350
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
355 360 365
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
370 375 380
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Arg Arg Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Arg Arg Thr
405 410 415
Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val
420 425 430
Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser
435 440 445
Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala Arg
450 455 460
Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser
465 470 475 480
Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala
485 490 495
Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg His His His His
500 505 510
His His
<210> 11
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SC2V7（不含完整C端）
<400> 11
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln
165 170 175
Arg Arg Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu
180 185 190
Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu
195 200 205
Ile Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Arg Phe Pro Asn
210 215 220
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
225 230 235 240
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
245 250 255
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
260 265 270
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
275 280 285
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
290 295 300
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
305 310 315 320
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
325 330 335
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
340 345 350
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
355 360 365
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
370 375 380
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
385 390 395 400
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Gly Gly Gly Arg Arg Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala
420 425 430
Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Arg Arg Ala Lys Phe
435 440 445
Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Arg Arg Thr Thr Thr Glu
450 455 460
Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu
465 470 475 480
Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr
485 490 495
Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala His His His His
500 505 510
His His
<210> 12
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SC2V8（不含完整C端）
<400> 12
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln
165 170 175
Arg Arg Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Arg
180 185 190
Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
195 200 205
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
210 215 220
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
225 230 235 240
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
245 250 255
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
260 265 270
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
275 280 285
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
290 295 300
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
305 310 315 320
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
325 330 335
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
340 345 350
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
355 360 365
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
370 375 380
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Arg Arg Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Arg Arg Thr
405 410 415
Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val
420 425 430
Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser
435 440 445
Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala His
450 455 460
His His His His His
465
<210> 13
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SC2V7（含完整C端）DNA序列
<400> 13
atggcacagg ttattaacac gaacagcctg agcctgctga cgcagaacaa cctgaacaaa 60
agccagagcg ccctgggtac cgcaattgaa cgtctgagct ccggtctgcg tattaacagc 120
gcaaaagatg atgcagcagg tcaggcaatt gccaatcgct ttaccgccaa tattaaaggt 180
ctgacccagg caagtcgtaa tgcaaatgat ggtatttcta ttgcccagac gaccgaaggt 240
gcactgaatg aaatcaataa taatctgcag cgcgttcgtg aactggcagt gcagagtgct 300
aacagcacaa acagccagag cgatctggat agcattcagg cagaaattac ccagcgtctg 360
aacgaaattg atcgcgtgtc aggtcagaca cagtttaatg gtgtgaaagt tctggcacag 420
gataacaccc tgaccattca ggtcggtgca aacgatggtg aaaccattga tattgatctg 480
aaacagatta acagccagac actgggcctg gataccctga atgtgcagcg tcgtgaagca 540
gaagttcaga ttgatcgtct gattaccggc cgtctgcaga gcctgcagac ctatgtaacc 600
cagcagctga ttcgtgcagc agaaatccgt cgccgtggtg gtggtagtgg tggtggtgtt 660
cgttttccga atattactaa cctgtgtcct tttggtgaag tttttaatgc cacccgtttt 720
gcaagcgttt atgcatggaa tcgtaaacgt attagtaatt gtgttgcgga ttatagtgtt 780
ctgtataata gcgccagctt ttctaccttt aaatgttatg gtgtgagtcc gactaaactg 840
aacgatctgt gttttaccaa tgtgtatgca gatagctttg ttattcgtgg tgatgaagtt 900
cgtcagattg caccgggtca gaccggtaaa attgcagatt ataattataa actgcctgat 960
gattttaccg gttgtgtaat tgcctggaat tcaaataatc tggatagcaa agtgggtggt 1020
aattataatt atctgtatcg cctgtttcgt aaaagcaatc tgaaaccgtt tgaacgtgat 1080
attagcacgg aaatttatca ggcgggcagc accccgtgta atggtgttga aggttttaat 1140
tgttattttc ctctgcagtc atacggtttt cagccgacca acggtgttgg ttatcagccg 1200
tatcgcgtgg ttgttctgag ttttgaactg ctgcatgcac cgggtggcgg ttctggtggt 1260
ggccgtcgtg cccagtttgc cccgagtgca tctgcgtttt ttggtatgtc tcgtattggt 1320
atggaagttc gtcgtgcaaa atttgttgca gcatggaccc tgaaagcagc tgcgcgtcgt 1380
accaccaccg aaaatccgct gcagaaaatt gatgccgcgc tggcccaggt tgatacactg 1440
cgtagtgatc tgggtgcagt tcagaatcgt tttaatagcg caattaccaa tctgggtaat 1500
accgttaata acctgaccag cgcacgtagc cgtattgaag atagcgatta tgcaactgaa 1560
gtgagcaata tgagccgtgc acagattctg cagcaggcag gcaccagcgt tctggcacag 1620
gcgaaccagg ttccacagaa cgttctgagc ctgctgcgtc atcatcatca tcatcat 1677
<210> 14
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SC2V8（含完整C端）DNA序列
<400> 14
atggcacagg ttattaacac gaacagcctg agcctgctga cgcagaacaa cctgaacaaa 60
agccagagcg ccctgggtac cgcaattgaa cgtctgagct ccggtctgcg tattaacagc 120
gcaaaagatg atgcagcagg tcaggcaatt gccaatcgct ttaccgccaa tattaaaggt 180
ctgacccagg caagtcgtaa tgcaaatgat ggtatttcta ttgcccagac gaccgaaggt 240
gcactgaatg aaatcaataa taatctgcag cgcgttcgtg aactggcagt gcagagtgct 300
aacagcacaa acagccagag cgatctggat agcattcagg cagaaattac ccagcgtctg 360
aacgaaattg atcgcgtgtc aggtcagaca cagtttaatg gtgtgaaagt tctggcacag 420
gataacaccc tgaccattca ggtcggtgca aacgatggtg aaaccattga tattgatctg 480
aaacagatta acagccagac actgggcctg gataccctga atgtgcagcg tcgtgcaaaa 540
tttgttgctg catggacact gaaagctgca gcacgtcgtg gtggcggttc cggtggtggc 600
gttcgctttc cgaatatcac taatctgtgt ccgtttggtg aagtgtttaa tgcaacccgt 660
tttgcaagtg tttatgcatg gaatcgtaaa cgtattagta attgtgttgc agattatagc 720
gttctgtata attccgcaag ctttagcacc tttaaatgtt atggtgtgag tccgaccaaa 780
ctgaatgatc tgtgttttac caatgtttat gcagatagct ttgttattcg tggtgatgaa 840
gttcgtcaga ttgcaccggg tcagaccggt aaaattgccg attataatta taaactgccg 900
gatgatttta ccggttgtgt tattgcctgg aattcaaata atctggatag caaagtgggt 960
ggtaattata attatctgta tcgtctgttt cgcaaaagca atctgaaacc gtttgaacgt 1020
gatattagca cagaaattta tcaggccggt agcacaccgt gtaatggtgt tgaaggtttt 1080
aattgctatt ttcctctgca gagctatggt tttcagccga ccaatggtgt tggttatcag 1140
ccgtatcgcg tggttgttct gagttttgaa ctgctgcatg caccgggtgg cggttctggt 1200
ggtggtcgtc gtggtatgtc acgtattggt atggaagttc gtcgtaccac aaccgaaaat 1260
ccgctgcaga aaattgatgc agccctggcc caggttgata ccctgcgtag tgatctgggt 1320
gcagtgcaga atcgctttaa tagcgcaatt accaatctgg gtaataccgt taataacctg 1380
actagcgcgc gtagccgtat tgaagatagc gattatgcaa ccgaagttag caatatgagt 1440
cgtgcacaga ttctgcagca ggcaggcacc agcgttctgg cacaggcaaa ccaggttcca 1500
cagaatgttc tgagcctgct gcgtcatcat catcatcatc at 1542
<210> 15
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SC2V7（不含完整C端）DNA序列
<400> 15
atggcacagg ttattaacac gaacagcctg agcctgctga cgcagaacaa cctgaacaaa 60
agccagagcg ccctgggtac cgcaattgaa cgtctgagct ccggtctgcg tattaacagc 120
gcaaaagatg atgcagcagg tcaggcaatt gccaatcgct ttaccgccaa tattaaaggt 180
ctgacccagg caagtcgtaa tgcaaatgat ggtatttcta ttgcccagac gaccgaaggt 240
gcactgaatg aaatcaataa taatctgcag cgcgttcgtg aactggcagt gcagagtgct 300
aacagcacaa acagccagag cgatctggat agcattcagg cagaaattac ccagcgtctg 360
aacgaaattg atcgcgtgtc aggtcagaca cagtttaatg gtgtgaaagt tctggcacag 420
gataacaccc tgaccattca ggtcggtgca aacgatggtg aaaccattga tattgatctg 480
aaacagatta acagccagac actgggcctg gataccctga atgtgcagcg tcgtgaagca 540
gaagttcaga ttgatcgtct gattaccggc cgtctgcaga gcctgcagac ctatgtaacc 600
cagcagctga ttcgtgcagc agaaatccgt cgccgtggtg gtggtagtgg tggtggtgtt 660
cgttttccga atattactaa cctgtgtcct tttggtgaag tttttaatgc cacccgtttt 720
gcaagcgttt atgcatggaa tcgtaaacgt attagtaatt gtgttgcgga ttatagtgtt 780
ctgtataata gcgccagctt ttctaccttt aaatgttatg gtgtgagtcc gactaaactg 840
aacgatctgt gttttaccaa tgtgtatgca gatagctttg ttattcgtgg tgatgaagtt 900
cgtcagattg caccgggtca gaccggtaaa attgcagatt ataattataa actgcctgat 960
gattttaccg gttgtgtaat tgcctggaat tcaaataatc tggatagcaa agtgggtggt 1020
aattataatt atctgtatcg cctgtttcgt aaaagcaatc tgaaaccgtt tgaacgtgat 1080
attagcacgg aaatttatca ggcgggcagc accccgtgta atggtgttga aggttttaat 1140
tgttattttc ctctgcagtc atacggtttt cagccgacca acggtgttgg ttatcagccg 1200
tatcgcgtgg ttgttctgag ttttgaactg ctgcatgcac cgggtggcgg ttctggtggt 1260
ggccgtcgtg cccagtttgc cccgagtgca tctgcgtttt ttggtatgtc tcgtattggt 1320
atggaagttc gtcgtgcaaa atttgttgca gcatggaccc tgaaagcagc tgcgcgtcgt 1380
accaccaccg aaaatccgct gcagaaaatt gatgccgcgc tggcccaggt tgatacactg 1440
cgtagtgatc tgggtgcagt tcagaatcgt tttaatagcg caattaccaa tctgggtaat 1500
accgttaata acctgaccag cgcacatcat catcatcatc at 1542
<210> 16
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SC2V8（不含完整C端）DNA序列
<400> 16
atggcacagg ttattaacac gaacagcctg agcctgctga cgcagaacaa cctgaacaaa 60
agccagagcg ccctgggtac cgcaattgaa cgtctgagct ccggtctgcg tattaacagc 120
gcaaaagatg atgcagcagg tcaggcaatt gccaatcgct ttaccgccaa tattaaaggt 180
ctgacccagg caagtcgtaa tgcaaatgat ggtatttcta ttgcccagac gaccgaaggt 240
gcactgaatg aaatcaataa taatctgcag cgcgttcgtg aactggcagt gcagagtgct 300
aacagcacaa acagccagag cgatctggat agcattcagg cagaaattac ccagcgtctg 360
aacgaaattg atcgcgtgtc aggtcagaca cagtttaatg gtgtgaaagt tctggcacag 420
gataacaccc tgaccattca ggtcggtgca aacgatggtg aaaccattga tattgatctg 480
aaacagatta acagccagac actgggcctg gataccctga atgtgcagcg tcgtgcaaaa 540
tttgttgctg catggacact gaaagctgca gcacgtcgtg gtggcggttc cggtggtggc 600
gttcgctttc cgaatatcac taatctgtgt ccgtttggtg aagtgtttaa tgcaacccgt 660
tttgcaagtg tttatgcatg gaatcgtaaa cgtattagta attgtgttgc agattatagc 720
gttctgtata attccgcaag ctttagcacc tttaaatgtt atggtgtgag tccgaccaaa 780
ctgaatgatc tgtgttttac caatgtttat gcagatagct ttgttattcg tggtgatgaa 840
gttcgtcaga ttgcaccggg tcagaccggt aaaattgccg attataatta taaactgccg 900
gatgatttta ccggttgtgt tattgcctgg aattcaaata atctggatag caaagtgggt 960
ggtaattata attatctgta tcgtctgttt cgcaaaagca atctgaaacc gtttgaacgt 1020
gatattagca cagaaattta tcaggccggt agcacaccgt gtaatggtgt tgaaggtttt 1080
aattgctatt ttcctctgca gagctatggt tttcagccga ccaatggtgt tggttatcag 1140
ccgtatcgcg tggttgttct gagttttgaa ctgctgcatg caccgggtgg cggttctggt 1200
ggtggtcgtc gtggtatgtc acgtattggt atggaagttc gtcgtaccac aaccgaaaat 1260
ccgctgcaga aaattgatgc agccctggcc caggttgata ccctgcgtag tgatctgggt 1320
gcagtgcaga atcgctttaa tagcgcaatt accaatctgg gtaataccgt taataacctg 1380
actagcgcgc atcatcatca tcatcat 1407
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位I-1
<400> 17
Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe
1 5 10 15
Asn
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位I-2
<400> 18
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位II-1
<400> 19
Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val
1 5 10 15
Glu
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位II-2
<400> 20
Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg
1 5 10 15
Leu
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位II-3
<400> 21
Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser
1 5 10 15
Leu
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位II-4
<400> 22
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
1 5 10 15
Gln
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T细胞表位1
<400> 23
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg
1 5 10 15
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T细胞表位2
<400> 24
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
1 5 10 15
Gly Met
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T细胞表位3
<400> 25
Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Trp
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T细胞表位4
<400> 26
Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T细胞表位5
<400> 27
Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B细胞表位II-5
<400> 28
Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile
1 5 10 15
Arg

Claims (10)

1.融合蛋白，其包括鞭毛蛋白的N端恒定区、SARS-CoV-2抗原多肽、T细胞表位、氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示的CD4+细胞表位和鞭毛蛋白的C端恒定区，
其中所述SARS-CoV-2抗原多肽包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的B细胞表位热点区域I，所述T细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，或者，所述T细胞表位的氨基酸序列为SEQ ID NO：24和26重叠，
且，其中所述SARS-CoV-2抗原多肽、所述T细胞表位和所述CD4+细胞表位位于所述鞭毛蛋白的N端恒定区和所述鞭毛蛋白的C端恒定区之间。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述SARS-CoV-2抗原多肽还包含B细胞表位热点区域II中的B细胞表位，所述B细胞表位的氨基酸序列为SEQ ID NO: 21、22和28重叠。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述鞭毛蛋白的N端恒定区包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述鞭毛蛋白的C端恒定区包含SEQ ID NO:7-8中任一所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO: 9-12中任一所示的氨基酸序列。
6.分离的核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白。
7.载体，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子。
8.细胞，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子，和/或权利要求7所述的载体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，以及任选地药学上可接受的载体。
10.权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒引起的疾病。
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