JP2002531135A - クラミジア感染に対する２段階免疫感作法 - Google Patents
クラミジア感染に対する２段階免疫感作法Info
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Abstract
(57)【要約】
クラミジア蛋白をコードする核酸を有する弱毒細菌の初回投与と、それに続くＩＳＣＯＭでのクラミジア蛋白投与によって、クラミジア菌株による感染に対して宿主を免疫感作する。この方法によって、高レベルの保護を行うことができるようになる。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は免疫学の分野に関するものであり、詳細にはクラミジア属細菌の感染
、特にトラコーマクラミジアの感染によって生じる疾患に対して宿主を保護する
ためのワクチン接種法に関するものである。
、特にトラコーマクラミジアの感染によって生じる疾患に対して宿主を保護する
ためのワクチン接種法に関するものである。
【０００２】 （発明の背景） トラコーマクラミジアは、クラミジア目クラミジア属の菌である。トラコーマ
クラミジアは結膜および生殖管の上皮に感染し、トラコーマや各種性病（ＳＴＤ
）を起こし、それぞれ失明や不妊に至る場合がある。トラコーマクラミジアには
１５種類の血清型があり、そのうちのＡ、ＢおよびＣがトラコーマの病原菌であ
り、血清型Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫがクラミジアＳＴＤの最も一般
的な病原菌である。トラコーマクラミジア感染は世界全体で流行している。トラ
コーマは、発展途上国での予防可能な失明の第１位の原因であり、世界中で６億
人がトラコーマを患い、１０００万人もの人々がその疾患によって失明している
と推定されている。米国では、トラコーマクラミジアが原因のＳＴＤが年間３０
０万例と推計されている。
クラミジアは結膜および生殖管の上皮に感染し、トラコーマや各種性病（ＳＴＤ
）を起こし、それぞれ失明や不妊に至る場合がある。トラコーマクラミジアには
１５種類の血清型があり、そのうちのＡ、ＢおよびＣがトラコーマの病原菌であ
り、血清型Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫがクラミジアＳＴＤの最も一般
的な病原菌である。トラコーマクラミジア感染は世界全体で流行している。トラ
コーマは、発展途上国での予防可能な失明の第１位の原因であり、世界中で６億
人がトラコーマを患い、１０００万人もの人々がその疾患によって失明している
と推定されている。米国では、トラコーマクラミジアが原因のＳＴＤが年間３０
０万例と推計されている。
【０００３】 トラコーマの病因には、繰り返し眼球感染およびクラミジア抗原に対する有害
な過敏反応発生が関与する（参考文献１〜４−本明細書を通じて、各種文献につ
いて括弧を付して言及することで、本発明が関係する技術分野の状況をより詳細
に説明する。各引用についての詳細な書誌情報は本明細書の末尾にある。これら
参考文献の開示内容は、引用によって本開示に組み込まれるものとする）。得ら
れている証拠は、分泌ＩｇＡおよび細胞介在免疫応答の両方が保護の重要な要素
であるという仮説を裏付けるものである。霊長類モデルでの眼球感染は、涙中で
のＩｇＡの急速かつ持続的な産生を誘発するが、涙中でのＩｇＧの存在は一時的
であって、結膜炎症のピーク期間に相当している（参考文献５）。ヒトより下等
な霊長類モデルでの実験的な眼球感染後の保護免疫は同型であり、眼球攻撃に対
する抵抗は、涙中の血清型特異的抗体の存在と相関している（参考文献１、２、
６）。感染ヒトからの涙は、フクロウザル眼球における同種トラコーマ血清型の
感染性を中和したが、異種のものは中和せず（参考文献７）、抗トラコーマ抗体
による受動的体液免疫感作は保護効果はなかった（参考文献８）。いくつかの系
統の証拠から、クラミジア感染からの保護またはそれのクリアランスにおける細
胞介在応答の重要性が示されている。Ｂ−細胞欠乏マウスは感染を解消すること
ができるが、ヌードマウスは持続的に感染状態となる。少なくともいくつかのク
ラミジア特異的Ｔ細胞系またはクローンの養子移入によって持続的に感染したヌ
ードマウスを治癒させることができ、その抗クラミジア活性は恐らくは、Ｔ細胞
がインターフェロン−γを分泌する能力の関数である（参考文献９〜１６）。
な過敏反応発生が関与する（参考文献１〜４−本明細書を通じて、各種文献につ
いて括弧を付して言及することで、本発明が関係する技術分野の状況をより詳細
に説明する。各引用についての詳細な書誌情報は本明細書の末尾にある。これら
参考文献の開示内容は、引用によって本開示に組み込まれるものとする）。得ら
れている証拠は、分泌ＩｇＡおよび細胞介在免疫応答の両方が保護の重要な要素
であるという仮説を裏付けるものである。霊長類モデルでの眼球感染は、涙中で
のＩｇＡの急速かつ持続的な産生を誘発するが、涙中でのＩｇＧの存在は一時的
であって、結膜炎症のピーク期間に相当している（参考文献５）。ヒトより下等
な霊長類モデルでの実験的な眼球感染後の保護免疫は同型であり、眼球攻撃に対
する抵抗は、涙中の血清型特異的抗体の存在と相関している（参考文献１、２、
６）。感染ヒトからの涙は、フクロウザル眼球における同種トラコーマ血清型の
感染性を中和したが、異種のものは中和せず（参考文献７）、抗トラコーマ抗体
による受動的体液免疫感作は保護効果はなかった（参考文献８）。いくつかの系
統の証拠から、クラミジア感染からの保護またはそれのクリアランスにおける細
胞介在応答の重要性が示されている。Ｂ−細胞欠乏マウスは感染を解消すること
ができるが、ヌードマウスは持続的に感染状態となる。少なくともいくつかのク
ラミジア特異的Ｔ細胞系またはクローンの養子移入によって持続的に感染したヌ
ードマウスを治癒させることができ、その抗クラミジア活性は恐らくは、Ｔ細胞
がインターフェロン−γを分泌する能力の関数である（参考文献９〜１６）。
【０００４】 トラコーマに対する全細胞ワクチン開発に向けた過去の努力は実際には、ワク
チン感作によって疾患を強化してきた（参考文献１、２）。感作は、トラコーマ
クラミジアの全ての血清型に存在する５７ｋＤストレス応答蛋白（ＳＲＰ）（Ｈ
ＳＰ６０）に対して誘発されることが確認されている。５７ｋＤ ＳＲＰに対す
る繰り返し曝露によって過敏反応遅延が生じて、それが原因でクラミジア感染に
共通に関連する慢性炎症が生じる場合がある。そこで、宿主感作を起こさず、強
力かつ持続的な粘膜中和抗体反応および強力な細胞免疫応答を誘発することがで
きる免疫原性物が有用であると考えられる（参考文献１７）。
チン感作によって疾患を強化してきた（参考文献１、２）。感作は、トラコーマ
クラミジアの全ての血清型に存在する５７ｋＤストレス応答蛋白（ＳＲＰ）（Ｈ
ＳＰ６０）に対して誘発されることが確認されている。５７ｋＤ ＳＲＰに対す
る繰り返し曝露によって過敏反応遅延が生じて、それが原因でクラミジア感染に
共通に関連する慢性炎症が生じる場合がある。そこで、宿主感作を起こさず、強
力かつ持続的な粘膜中和抗体反応および強力な細胞免疫応答を誘発することがで
きる免疫原性物が有用であると考えられる（参考文献１７）。
【０００５】 ワクチン開発に向けた最も有望な候補抗原は、クラミジア主要外膜蛋白（ＭＯ
ＭＰ）である（参考文献１８〜２０）。他の表面蛋白および表面リポ多糖類も免
疫原性であるが、それらが誘発する抗体が保護効果を有するという所見は得られ
ていない（参考文献２１、３３）。主要な表面蛋白であるＭＯＭＰは、大きさが
約４０ｋＤａの内在膜蛋白であり、それはＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称され
る４つの可変領域（ＶＤ）を除いて、血清型を通じてかなり保存されている。４
種類全てのＶＤの配列が、１５の血清型について決定されている（参考文献２３
、２４）。クラミジア感染性を中和することができる抗体はＭＯＭＰを認識する
（参考文献２５、２６、２７、２８）。ＭＯＭＰ特異的中和性モノクローナル抗
体が結合するエピトープが、いくつかの血清型についてマッピングされており（
参考文献２１、２２、２９、３０、３１、３２、３３）、合成ワクチンもしくは
サブユニットワクチンの開発に向けた重要な目標となっている。結合部位は、血
清型によって決まるＶＤ ＩまたはＩＩ内にある６〜８個のアミノ酸の連続配列
である。ＭＯＭＰエピトープを有するサブユニット免疫原（例：単離ＭＯＭＰま
たは合成ペプチド類）は、完全なクラミジアを認識できる抗体を誘発することが
できる（参考文献２５）。しかしながら、従来投与されていたサブユニット免疫
原は、粘膜免疫性誘発剤としては弱い。クラミジア抗原を、それの免疫原性を高
め、体液および細胞介在の両方の免疫応答を誘発するような形で、クラミジア抗
原を製剤することが有用であると考えられる。
ＭＰ）である（参考文献１８〜２０）。他の表面蛋白および表面リポ多糖類も免
疫原性であるが、それらが誘発する抗体が保護効果を有するという所見は得られ
ていない（参考文献２１、３３）。主要な表面蛋白であるＭＯＭＰは、大きさが
約４０ｋＤａの内在膜蛋白であり、それはＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと称され
る４つの可変領域（ＶＤ）を除いて、血清型を通じてかなり保存されている。４
種類全てのＶＤの配列が、１５の血清型について決定されている（参考文献２３
、２４）。クラミジア感染性を中和することができる抗体はＭＯＭＰを認識する
（参考文献２５、２６、２７、２８）。ＭＯＭＰ特異的中和性モノクローナル抗
体が結合するエピトープが、いくつかの血清型についてマッピングされており（
参考文献２１、２２、２９、３０、３１、３２、３３）、合成ワクチンもしくは
サブユニットワクチンの開発に向けた重要な目標となっている。結合部位は、血
清型によって決まるＶＤ ＩまたはＩＩ内にある６〜８個のアミノ酸の連続配列
である。ＭＯＭＰエピトープを有するサブユニット免疫原（例：単離ＭＯＭＰま
たは合成ペプチド類）は、完全なクラミジアを認識できる抗体を誘発することが
できる（参考文献２５）。しかしながら、従来投与されていたサブユニット免疫
原は、粘膜免疫性誘発剤としては弱い。クラミジア抗原を、それの免疫原性を高
め、体液および細胞介在の両方の免疫応答を誘発するような形で、クラミジア抗
原を製剤することが有用であると考えられる。
【０００６】 免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）は、サポニン類（またはサポニン誘導体）、コ
レステロールおよび不飽和脂肪酸類の混合物から形成される籠型構造である。Ｉ
ＳＣＯＭの構成要素は疎水性相互作用によって一体となっており、その結果、性
質上疎水性である蛋白（例：ＭＯＭＰ）または疎水性残基を露出または付加する
ような処理をされた蛋白を、それが形成する通りにＩＳＣＯＭ中に効果的に組み
入れることができる（参考文献３４、３５、３６）。
レステロールおよび不飽和脂肪酸類の混合物から形成される籠型構造である。Ｉ
ＳＣＯＭの構成要素は疎水性相互作用によって一体となっており、その結果、性
質上疎水性である蛋白（例：ＭＯＭＰ）または疎水性残基を露出または付加する
ような処理をされた蛋白を、それが形成する通りにＩＳＣＯＭ中に効果的に組み
入れることができる（参考文献３４、３５、３６）。
【０００７】 トラコーマクラミジアは自然には、眼球および生殖管の粘膜表面に感染する。
局所抗体および局所細胞免疫応答が、粘膜感染からの保護の重要な要素である。
従って、クラミジアワクチンが、細胞要素および抗体要素の両方を含む粘膜免疫
応答を誘発することが有用であると考えられる。
局所抗体および局所細胞免疫応答が、粘膜感染からの保護の重要な要素である。
従って、クラミジアワクチンが、細胞要素および抗体要素の両方を含む粘膜免疫
応答を誘発することが有用であると考えられる。
【０００８】 ＤＮＡ免疫感作は、感染症に対する保護的免疫を発生させるアプローチである
（参考文献３７）。蛋白もしくはペプチドに基づくサブユニットワクチンとは異
なり、ＤＮＡ免疫感作は、宿主細胞による異種蛋白の発現を介して保護免疫を提
供することで、ウィルス感染または細胞内病原による感染時に起こるものに比較
的類似した形での免疫系への抗原の提供を可能とするものである（参考文献３８
）。この方法はかなりの関心を集めたが、奏功する免疫が一貫して誘発されたの
はウィルス疾患におけるＤＮＡ免疫感作によるものであった（参考文献３９）。
非ウィルス系病原体の場合には結果はさらに変動しており、それは病原体の性質
、選択される免疫抗原ならびに免疫感作の経路における違いを反映したものであ
ると考えられる（参考文献４０）。ＤＮＡ予防接種のさらなる開発は、基礎とな
る免疫機序の解明と既存のワクチン開発戦略が奏功していない他の感染症へのそ
れの利用拡大によって決まるであろう。
（参考文献３７）。蛋白もしくはペプチドに基づくサブユニットワクチンとは異
なり、ＤＮＡ免疫感作は、宿主細胞による異種蛋白の発現を介して保護免疫を提
供することで、ウィルス感染または細胞内病原による感染時に起こるものに比較
的類似した形での免疫系への抗原の提供を可能とするものである（参考文献３８
）。この方法はかなりの関心を集めたが、奏功する免疫が一貫して誘発されたの
はウィルス疾患におけるＤＮＡ免疫感作によるものであった（参考文献３９）。
非ウィルス系病原体の場合には結果はさらに変動しており、それは病原体の性質
、選択される免疫抗原ならびに免疫感作の経路における違いを反映したものであ
ると考えられる（参考文献４０）。ＤＮＡ予防接種のさらなる開発は、基礎とな
る免疫機序の解明と既存のワクチン開発戦略が奏功していない他の感染症へのそ
れの利用拡大によって決まるであろう。
【０００９】 最近、遺伝的免疫感作のためのプラスミドＤＮＡの投与に関して、弱毒細菌、
特にネズミチフス菌の使用が報告されている（参考文献４１、４２）。この種の
投与は、粘膜免疫応答などの特異的免疫応答を誘発する細胞種に対してＤＮＡを
投与するという利点をさらに提供するものである。この種の予防接種はまた、多
くの安全なサルモネラの弱毒株が容易に得られることから安全であって、コスト
効果が高いという利点をも提供する。
特にネズミチフス菌の使用が報告されている（参考文献４１、４２）。この種の
投与は、粘膜免疫応答などの特異的免疫応答を誘発する細胞種に対してＤＮＡを
投与するという利点をさらに提供するものである。この種の予防接種はまた、多
くの安全なサルモネラの弱毒株が容易に得られることから安全であって、コスト
効果が高いという利点をも提供する。
【００１０】 ＥＰ０１９２０３３および米国特許５７７０７１４には、 転写プロモーター、 それらへの添付資料Ａにある配列からの少なくとも２７塩基対の長さのＭＯＭ
Ｐポリヌクレオチドを含むトラコーマクラミジアＭＯＭＰポリペプチドをコード
するＤＮＡ分子、 転写調節要素がトラコーマクラミジアから誘導されない転写ターミネーター という効果的に連結された要素を有するトラコーマクラミジアＭＯＭＰポリペプ
チドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現のためのＤＮＡ構成物の提供が記載されている
。この先行技術では、そのような構築物を用いたＤＮＡ免疫感作の実施に関して
は、開示も示唆もされていない。
Ｐポリヌクレオチドを含むトラコーマクラミジアＭＯＭＰポリペプチドをコード
するＤＮＡ分子、 転写調節要素がトラコーマクラミジアから誘導されない転写ターミネーター という効果的に連結された要素を有するトラコーマクラミジアＭＯＭＰポリペプ
チドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現のためのＤＮＡ構成物の提供が記載されている
。この先行技術では、そのような構築物を用いたＤＮＡ免疫感作の実施に関して
は、開示も示唆もされていない。
【００１１】 １９９６年７月１１日出願で（ＷＯ９８／０２５４６）、マニトバ（Ｍａｎｉ
ｔｏｂａ）大学に譲渡された同時係属の米国特許出願０８／８９３３８１号（引
用によって本明細書に含まれる）には、クラミジア菌株の主要な外膜蛋白（ＭＯ
ＭＰ）に対する保護免疫応答の宿主における発生のために宿主に対してｉｎ ｖ
ｉｖｏ投与する免疫原性組成物であって、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を発生させる
ＭＯＭＰもしくはＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列および宿主におけ
るＭＯＭＰもしくはＭＯＭＰ断片の発現のためのヌクレオチド配列に効果的に結
合したプロモーター配列を有する非複製ベクター；ならびに医薬的に許容される
それ用の担体を含む組成物について記載されている。
ｔｏｂａ）大学に譲渡された同時係属の米国特許出願０８／８９３３８１号（引
用によって本明細書に含まれる）には、クラミジア菌株の主要な外膜蛋白（ＭＯ
ＭＰ）に対する保護免疫応答の宿主における発生のために宿主に対してｉｎ ｖ
ｉｖｏ投与する免疫原性組成物であって、ＭＯＭＰ特異的免疫応答を発生させる
ＭＯＭＰもしくはＭＯＭＰ断片をコードするヌクレオチド配列および宿主におけ
るＭＯＭＰもしくはＭＯＭＰ断片の発現のためのヌクレオチド配列に効果的に結
合したプロモーター配列を有する非複製ベクター；ならびに医薬的に許容される
それ用の担体を含む組成物について記載されている。
【００１２】 １９９６年９月１６日出願で（ＷＯ９８／１０７８９）コノート・ラボラトリ
ーズ社（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に
譲渡された同時係属の米国特許出願０８／７１３２３６号（引用によって本明細
書に含まれる）には、トラコーマクラミジアなどがあり得るクラミジア菌株の主
要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）と免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）とを含む免疫原性組成
物について記載されている。
ーズ社（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に
譲渡された同時係属の米国特許出願０８／７１３２３６号（引用によって本明細
書に含まれる）には、トラコーマクラミジアなどがあり得るクラミジア菌株の主
要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）と免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）とを含む免疫原性組成
物について記載されている。
【００１３】 （発明の概要） 本発明は、クラミジア科の菌、特にトラコーマクラミジアの感染によって生じ
る疾患に対して保護を提供する新規な免疫感作戦略とそれに用いられる材料を提
供するものである。本発明で提供される免疫感作戦略によって、他の戦略より強
力な保護免疫応答が得られる。
る疾患に対して保護を提供する新規な免疫感作戦略とそれに用いられる材料を提
供するものである。本発明で提供される免疫感作戦略によって、他の戦略より強
力な保護免疫応答が得られる。
【００１４】 本発明の１態様によれば、クラミジアによる感染によって生じる疾患に対して
宿主を免疫感作する方法において、 最初に、サイトメガロウィルスプロモーターなどの真核発現要素に効果的に結
合した、クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生させる１以上の免疫保護誘発性ク
ラミジア蛋白またはそれの断片をコードする核酸配列を有する免疫上有効な量の
弱毒菌を宿主に投与する段階；ならびに その後に、最初の投与で用いたものと同じ１以上のクラミジア蛋白またはそれ
の免疫原性断片の、クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生させる免疫上有効な量
の１以上の精製クラミジア蛋白またはそれの断片を宿主に投与する段階 を有することを特徴とする方法が提供される。
宿主を免疫感作する方法において、 最初に、サイトメガロウィルスプロモーターなどの真核発現要素に効果的に結
合した、クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生させる１以上の免疫保護誘発性ク
ラミジア蛋白またはそれの断片をコードする核酸配列を有する免疫上有効な量の
弱毒菌を宿主に投与する段階；ならびに その後に、最初の投与で用いたものと同じ１以上のクラミジア蛋白またはそれ
の免疫原性断片の、クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生させる免疫上有効な量
の１以上の精製クラミジア蛋白またはそれの断片を宿主に投与する段階 を有することを特徴とする方法が提供される。
【００１５】 前記弱毒菌は、サルモネラまたはシゲラの弱毒菌であることができ、前記核酸
配列は、トラコーマクラミジアおよびヌモニアクラミジアなどのクラミジア菌株
からのＭＯＭＰ遺伝子またはそれの断片であることができる。前記ブースト性（
ｂｏｏｓｔｉｎｇ）蛋白は、トラコーマクラミジアおよびヌモニアクラミジアな
どのクラミジア菌株からのＭＯＭＰ蛋白またはそれの断片であることができる。
配列は、トラコーマクラミジアおよびヌモニアクラミジアなどのクラミジア菌株
からのＭＯＭＰ遺伝子またはそれの断片であることができる。前記ブースト性（
ｂｏｏｓｔｉｎｇ）蛋白は、トラコーマクラミジアおよびヌモニアクラミジアな
どのクラミジア菌株からのＭＯＭＰ蛋白またはそれの断片であることができる。
【００１６】 投与段階は、例えば経鼻投与によって、あるいは最初はＤＮＡの経鼻投与で次
にクラミジア蛋白の筋肉投与によって、粘膜表面に行うことができる。
にクラミジア蛋白の筋肉投与によって、粘膜表面に行うことができる。
【００１７】 本発明によって宿主で得られる免疫応答には好ましくは、生存クラミジアの攻
撃に対するクラミジア特異的蛋白の産生ならびに他の免疫感作法で得られるより
高い遅延型過敏（ＤＴＨ）応答および高ＩｇＧ2およびＩｇＧ1抗体応答のある免
疫原性向上などがある。
撃に対するクラミジア特異的蛋白の産生ならびに他の免疫感作法で得られるより
高い遅延型過敏（ＤＴＨ）応答および高ＩｇＧ2およびＩｇＧ1抗体応答のある免
疫原性向上などがある。
【００１８】 別の態様において本発明は、クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生する１以上
の免疫保護誘発性クラミジア蛋白またはそれの断片をコードする核酸分子を有す
る弱毒細菌株を含む。その細菌は好ましくは、ネズミチフス菌株などのサルモネ
ラ菌株である。本発明は、免疫原として使用される場合のそのような弱毒菌株に
、宿主への投与用の免疫原の製造におけるそのような弱毒菌株の使用に拡大され
るものである。
の免疫保護誘発性クラミジア蛋白またはそれの断片をコードする核酸分子を有す
る弱毒細菌株を含む。その細菌は好ましくは、ネズミチフス菌株などのサルモネ
ラ菌株である。本発明は、免疫原として使用される場合のそのような弱毒菌株に
、宿主への投与用の免疫原の製造におけるそのような弱毒菌株の使用に拡大され
るものである。
【００１９】 さらに別の態様において本発明は、クラミジア菌株によって生じる感染に対し
て宿主を免疫感作する方法において、 クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生する１以上の免疫保護誘発性クラミジア
蛋白またはそれの断片をコードする核酸分子を有する免疫上有効量の弱毒細菌株
を宿主に投与する段階を有することを特徴とする方法を提供する。本明細書に記
載のプライム−ブースト免疫感作プロトコールにおけるプライミングに関して本
明細書に記載のいずれの実施態様も、本発明のこの態様に適用される。
て宿主を免疫感作する方法において、 クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生する１以上の免疫保護誘発性クラミジア
蛋白またはそれの断片をコードする核酸分子を有する免疫上有効量の弱毒細菌株
を宿主に投与する段階を有することを特徴とする方法を提供する。本明細書に記
載のプライム−ブースト免疫感作プロトコールにおけるプライミングに関して本
明細書に記載のいずれの実施態様も、本発明のこの態様に適用される。
【００２０】 （図面の簡単な説明） 図１（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦを含む）は、筋肉投与（Ａ、ＢおよびＣ）
または経鼻投与（Ｄ、ＥおよびＦ）のいずれかでのＭＯＭＰ−ＤＮＡ投与の保護
結果を示す。
または経鼻投与（Ｄ、ＥおよびＦ）のいずれかでのＭＯＭＰ−ＤＮＡ投与の保護
結果を示す。
【００２１】 図２（Ａ、ＢおよびＣを含む）は、ＭＯＭＰ−ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ−３）でト
ランスフェクションされたサルモネラで免疫感作したマウスからの保護結果を示
す。
ランスフェクションされたサルモネラで免疫感作したマウスからの保護結果を示
す。
【００２２】 図３（Ａ、ＢおよびＣを含む）は、ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクションされ
たサルモネラで経鼻的に免疫感作され、次にＩＳＣＯＭに埋め込まれたＭＯＭＰ
で筋肉投与にてブーストされたマウスからの保護結果を示す。
たサルモネラで経鼻的に免疫感作され、次にＩＳＣＯＭに埋め込まれたＭＯＭＰ
で筋肉投与にてブーストされたマウスからの保護結果を示す。
【００２３】 図４（Ａ、ＢおよびＣを含む）は、サルモネラ搬送（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ）Ｄ
ＮＡ（ｐｃＤＮＡ３）で経鼻的にプライミングされ、ＭＯＭＰ−ＩＳＣＯＭ蛋白
で筋肉投与にてブーストされたマウスからのＤＴＨ応答（Ａ）ならびにＩｇＧ2a （Ｂ）およびＩｇＧ1（Ｃ）抗体応答を示す。データは抗体のｌｏｇ１０力価の
平均±標準誤差を表している。＊は、未投与群および１０8ＣＦＵのｐＭＯＭＰ
−サルモネラのみで免疫感作された群と比較した場合に、ｐ＜０．０５であるこ
とを表す。
ＮＡ（ｐｃＤＮＡ３）で経鼻的にプライミングされ、ＭＯＭＰ−ＩＳＣＯＭ蛋白
で筋肉投与にてブーストされたマウスからのＤＴＨ応答（Ａ）ならびにＩｇＧ2a （Ｂ）およびＩｇＧ1（Ｃ）抗体応答を示す。データは抗体のｌｏｇ１０力価の
平均±標準誤差を表している。＊は、未投与群および１０8ＣＦＵのｐＭＯＭＰ
−サルモネラのみで免疫感作された群と比較した場合に、ｐ＜０．０５であるこ
とを表す。
【００２４】 図５は、大きさが約６４ｋｂであるプラスミドｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰの要素
および構築を示す。
および構築を示す。
【００２５】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は、弱毒サルモネラによって搬送される真核発現要素に効果的に結合し
た、１以上のクラミジア蛋白またはそれの免疫原性断片をコードする核酸配列の
最初の投与ならびに前記クラミジアの同じ蛋白の１以上の蛋白またはそれの断片
の次に投与を有する免疫感作方法に関するものである。前記１以上の蛋白は、Ｍ
ＯＭＰなどのクラミジア蛋白を含むことができ、宿主への投与用にＩＳＣＯＭ中
に製剤することができる。前記１以上の蛋白は、組換え技術によって製造するこ
とができるか、あるいはクラミジア取得物から単離することができる。
た、１以上のクラミジア蛋白またはそれの免疫原性断片をコードする核酸配列の
最初の投与ならびに前記クラミジアの同じ蛋白の１以上の蛋白またはそれの断片
の次に投与を有する免疫感作方法に関するものである。前記１以上の蛋白は、Ｍ
ＯＭＰなどのクラミジア蛋白を含むことができ、宿主への投与用にＩＳＣＯＭ中
に製剤することができる。前記１以上の蛋白は、組換え技術によって製造するこ
とができるか、あるいはクラミジア取得物から単離することができる。
【００２６】 本発明を説明するため、天然マウス病原体であるトラコーマクラミジアマウス
肺炎株（ＭｏＰｎ）からＭＯＭＰ遺伝子およびＭＯＭＰ遺伝子断片を含むプラス
ミドＤＮＡを構築し、マウスでの実験ができるようにした。このモデルでの一次
感染によって、再感染に対する強力な保護免疫が誘発される。ヒト免疫感作の場
合、トラコーマクラミジアの血清型Ｃなどのヒト病原菌株を用いる。
肺炎株（ＭｏＰｎ）からＭＯＭＰ遺伝子およびＭＯＭＰ遺伝子断片を含むプラス
ミドＤＮＡを構築し、マウスでの実験ができるようにした。このモデルでの一次
感染によって、再感染に対する強力な保護免疫が誘発される。ヒト免疫感作の場
合、トラコーマクラミジアの血清型Ｃなどのヒト病原菌株を用いる。
【００２７】 サイトメガロウィルスプロモーターなどの好適なプロモーターを含む真核発現
ベクターであるｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）のようなＭＯＭＰ遺伝子または断片に関して、簡便なプラスミドベ
クターを用いることができる。ＭＯＭＰ遺伝子またはＭＯＭＰ遺伝子断片は、簡
便な方法でベクターに挿入することができる。その遺伝子または遺伝子断片は、
好適なプライマーを用いるＰＣＲによってトラコーマクラミジアゲノムＤＮＡか
ら増幅することができ、ＰＣＲ産物はベクターにクローニングする。得られるＭ
ＯＭＰ遺伝子保有プラスミドは、例えばエレクトロポレーションによって大腸菌
中にトランスフェクションして、そこでの複製を行わせることができる。大きさ
約５４ｋｂのＭＯＭＰ保有プラスミドｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰは、図５に示して
ある。プラスミドは、簡便な方法で大腸菌から抽出することができる。
ベクターであるｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）のようなＭＯＭＰ遺伝子または断片に関して、簡便なプラスミドベ
クターを用いることができる。ＭＯＭＰ遺伝子またはＭＯＭＰ遺伝子断片は、簡
便な方法でベクターに挿入することができる。その遺伝子または遺伝子断片は、
好適なプライマーを用いるＰＣＲによってトラコーマクラミジアゲノムＤＮＡか
ら増幅することができ、ＰＣＲ産物はベクターにクローニングする。得られるＭ
ＯＭＰ遺伝子保有プラスミドは、例えばエレクトロポレーションによって大腸菌
中にトランスフェクションして、そこでの複製を行わせることができる。大きさ
約５４ｋｂのＭＯＭＰ保有プラスミドｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰは、図５に示して
ある。プラスミドは、簡便な方法で大腸菌から抽出することができる。
【００２８】 ＭＯＭＰ遺伝子またはＭＯＭＰ遺伝子断片を有するプラスミドを用いて、エレ
クトロポレーションなどの標準的なプロトコールに従って弱毒サルモネラ菌をト
ランスフォームすることができる（参考文献４３）。
クトロポレーションなどの標準的なプロトコールに従って弱毒サルモネラ菌をト
ランスフォームすることができる（参考文献４３）。
【００２９】 前述のように、一次（プライミング）免疫感作は、サルモネラなどの弱毒菌ベ
クターの投与によって行うことができ、その場合にトランスフェクションされた
ＤＮＡはその細菌ベクターでは発現されない。一次ＤＮＡの発現は、前記細菌ベ
クターがマクロファージまたは樹状細胞などの適切な宿主細胞中にＤＮＡを放出
した時に行われる。宿主細胞が細菌ベクターを取り込んだ後は、アミノ酸やヌク
レオチドなどの必須栄養素を合成する能力がないために、栄養要求菌は数回の分
裂後に死ぬ。次に、感染宿主細胞の細胞質中にプラスミドＤＮＡが放出され、コ
ード遺伝子が宿主細胞で発現される。
クターの投与によって行うことができ、その場合にトランスフェクションされた
ＤＮＡはその細菌ベクターでは発現されない。一次ＤＮＡの発現は、前記細菌ベ
クターがマクロファージまたは樹状細胞などの適切な宿主細胞中にＤＮＡを放出
した時に行われる。宿主細胞が細菌ベクターを取り込んだ後は、アミノ酸やヌク
レオチドなどの必須栄養素を合成する能力がないために、栄養要求菌は数回の分
裂後に死ぬ。次に、感染宿主細胞の細胞質中にプラスミドＤＮＡが放出され、コ
ード遺伝子が宿主細胞で発現される。
【００３０】 ブースト免疫感作は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）中に組み込まれたクラミ
ジア蛋白または組換え産生クラミジア蛋白であることができる。クラミジア蛋白
はまた、クラミジア抽出物から抽出される単離天然クラミジア蛋白であることも
できる。
ジア蛋白または組換え産生クラミジア蛋白であることができる。クラミジア蛋白
はまた、クラミジア抽出物から抽出される単離天然クラミジア蛋白であることも
できる。
【００３１】 本発明の各種実施態様は、予防接種およびクラミジア感染治療の分野において
用途を有し得ることは、当業者には明らかである。そのような使用についてのさ
らなる考察を以下に示すが、本発明はそれによって限定されるものではない。
用途を有し得ることは、当業者には明らかである。そのような使用についてのさ
らなる考察を以下に示すが、本発明はそれによって限定されるものではない。
【００３２】 （実施例） 上記の開示内容は、本発明を概説するものである。以下の具体的な実施例を参
照することで、さらに完全な理解を得ることができる。これら実施例は、単に説
明を目的として記載されたものであって、本発明の範囲を限定するものではない
。状況から妥当であると示唆されたり、妥当となり得る場合には、形式における
変更および均等物の置換が想到される。本明細書では具体的な用語を用いている
が、そのような用語は説明上のものであって、本発明を限定するものではない。
照することで、さらに完全な理解を得ることができる。これら実施例は、単に説
明を目的として記載されたものであって、本発明の範囲を限定するものではない
。状況から妥当であると示唆されたり、妥当となり得る場合には、形式における
変更および均等物の置換が想到される。本明細書では具体的な用語を用いている
が、そのような用語は説明上のものであって、本発明を限定するものではない。
【００３３】 実施例１ 本実施例は、ＭＯＭＰ遺伝子を有するプラスミドベクターの製造を説明するも
のである。
のである。
【００３４】 前述の米国特許出願０８／８９３３８１号（ＷＯ９８／０２５４６）に記載の
方法に従ってｐＭＯＭＰ発現ベクターを得た。すなわち、ＭｏＰｎの成熟ＭＯＭ
ＰのＢａｍＨｌ部位、リボソーム結合部位、開始コドンおよびＮ−末端配列を含
む５’プライマー（ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧ
ＧＧＡＡＴＣＣＴ）（配列番号１）ならびにＭｏＰｎ ＭＯＭＰのＣ−末端配列
、Ｘｈｏｌ部位および終止コドンを含む３’プライマー（ＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧ
ＣＴＡＴＴＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣ）（配列番号２）を用いるポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）によって、トラコーマクラミジアマウス肺炎（ＭｏＰｎ）株
ゲノムＤＮＡからＭＯＭＰ遺伝子を増幅した。ＭＯＭＰリーダーペプチド遺伝子
配列のＤＮＡ配列は除外した。ＢａｍＨｌおよびＸｈｏｌによる消化後、ヒトサ
イトメガロウィルス主要中間初期エンハンサー領域（ＣＭＶプロモーター）の制
御下での転写によって、ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３真核ＩＩ選択可能発現ベクタ
ー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）中にクローニングした。１０
０μｇ／ｍＬのアンピリシンを含むＬＢ肉汁中で成長させた大腸菌ＤＨ５αＦ中
にエレクトロポレーションによって、ＭＯＭＰ遺伝子コードプラスミドを移し入
れた。ウィザード（商標）プラスマキシプレプ（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍａ
ｘｉｐｒｅｐ）ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ）によっ
てプラスミドを抽出した。報告の方法に従って、組換えＭＯＭＰ遺伝子の配列を
ＰＣＲ直接配列分析によって確認した（参考文献４４）。精製プラスミドＤＮＡ
を濃度１ｍｇ／ｍＬで生理食塩水に溶かした。ＤＮＡ濃度をＤＵ−６２分光光度
計（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によって２６０ｎｍで測定し
、プラスミドの大きさを臭化エチジウム染色アガロースゲル中でＤＮＡ標準と比
較した。
方法に従ってｐＭＯＭＰ発現ベクターを得た。すなわち、ＭｏＰｎの成熟ＭＯＭ
ＰのＢａｍＨｌ部位、リボソーム結合部位、開始コドンおよびＮ−末端配列を含
む５’プライマー（ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧ
ＧＧＡＡＴＣＣＴ）（配列番号１）ならびにＭｏＰｎ ＭＯＭＰのＣ−末端配列
、Ｘｈｏｌ部位および終止コドンを含む３’プライマー（ＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧ
ＣＴＡＴＴＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣ）（配列番号２）を用いるポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）によって、トラコーマクラミジアマウス肺炎（ＭｏＰｎ）株
ゲノムＤＮＡからＭＯＭＰ遺伝子を増幅した。ＭＯＭＰリーダーペプチド遺伝子
配列のＤＮＡ配列は除外した。ＢａｍＨｌおよびＸｈｏｌによる消化後、ヒトサ
イトメガロウィルス主要中間初期エンハンサー領域（ＣＭＶプロモーター）の制
御下での転写によって、ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３真核ＩＩ選択可能発現ベクタ
ー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）中にクローニングした。１０
０μｇ／ｍＬのアンピリシンを含むＬＢ肉汁中で成長させた大腸菌ＤＨ５αＦ中
にエレクトロポレーションによって、ＭＯＭＰ遺伝子コードプラスミドを移し入
れた。ウィザード（商標）プラスマキシプレプ（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍａ
ｘｉｐｒｅｐ）ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ）によっ
てプラスミドを抽出した。報告の方法に従って、組換えＭＯＭＰ遺伝子の配列を
ＰＣＲ直接配列分析によって確認した（参考文献４４）。精製プラスミドＤＮＡ
を濃度１ｍｇ／ｍＬで生理食塩水に溶かした。ＤＮＡ濃度をＤＵ−６２分光光度
計（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によって２６０ｎｍで測定し
、プラスミドの大きさを臭化エチジウム染色アガロースゲル中でＤＮＡ標準と比
較した。
【００３５】 プラスミドｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰを含むＭＯＭＰ遺伝子およびそれの構成要
素を図５に示してある。
素を図５に示してある。
【００３６】 実施例２ 本実施例は、マウスのＤＮＡ免疫感作を説明するものである。
【００３７】 トラコーマクラミジアマウス肺炎株（ＭｏＰｎ）によって誘発されたマウス肺
炎のモデルを用いた（参考文献４５）。ヒトにおける感染および疾患を生じるこ
とに制限されているほとんどのトラコーマクラミジア菌株とは異なり、ＭｏＰｎ
は天然マウス病原菌である。このモデルでの一次感染は再感染に対する強力な保
護免疫を誘発することが、これまでに明らかになっている。さらに感染のクリア
ランスは、ＣＤ４ Ｔｈ１リンパ球応答に関係し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提供に
よって決まる（参考文献４５）。
炎のモデルを用いた（参考文献４５）。ヒトにおける感染および疾患を生じるこ
とに制限されているほとんどのトラコーマクラミジア菌株とは異なり、ＭｏＰｎ
は天然マウス病原菌である。このモデルでの一次感染は再感染に対する強力な保
護免疫を誘発することが、これまでに明らかになっている。さらに感染のクリア
ランスは、ＣＤ４ Ｔｈ１リンパ球応答に関係し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原提供に
よって決まる（参考文献４５）。
【００３８】 ＭＯＭＰ−ＤＮＡの３種類の異なる濃度を筋肉投与または経鼻投与で投与して
比較した（図１）。結果は、裸出ＭＯＭＰ−ＤＮＡの粘膜投与に保護効果があり
、筋肉投与ＭＯＭＰ−ＤＮＡよりその効果が高いように思われることを明瞭に示
している。ＭＯＭＰ−ＤＮＡの経鼻投与を複数の実験で評価して、その再現性を
確認した。表１に示したように、ＭＯＭＰ−ＤＮＡの粘膜投与によって保護免疫
応答が誘発されたが、保護指数の大きさはかなり変動して、各種実験で０．５〜
４．１ｌｏｇ10保護の範囲であった。そのような変動性の原因は、予防接種され
た動物にＭｏＰｎの比較的高い接種原を負荷することで保護指数が低下したこと
から、裸出ＤＮＡ予防接種の免疫原性が制限されたためである可能性がある。粘
膜表面に投与された裸出ＤＮＡはまた、その動向が非常に多様であると考えられ
、一部は細胞外ヌクレアーゼによって分解され、一部は体細胞によって取り込ま
れる。
比較した（図１）。結果は、裸出ＭＯＭＰ−ＤＮＡの粘膜投与に保護効果があり
、筋肉投与ＭＯＭＰ−ＤＮＡよりその効果が高いように思われることを明瞭に示
している。ＭＯＭＰ−ＤＮＡの経鼻投与を複数の実験で評価して、その再現性を
確認した。表１に示したように、ＭＯＭＰ−ＤＮＡの粘膜投与によって保護免疫
応答が誘発されたが、保護指数の大きさはかなり変動して、各種実験で０．５〜
４．１ｌｏｇ10保護の範囲であった。そのような変動性の原因は、予防接種され
た動物にＭｏＰｎの比較的高い接種原を負荷することで保護指数が低下したこと
から、裸出ＤＮＡ予防接種の免疫原性が制限されたためである可能性がある。粘
膜表面に投与された裸出ＤＮＡはまた、その動向が非常に多様であると考えられ
、一部は細胞外ヌクレアーゼによって分解され、一部は体細胞によって取り込ま
れる。
【００３９】 実施例３ 本実施例は、弱毒サルモネラによるＤＮＡの搬送を説明するものである。
【００４０】 腸チフス菌株２２−４が参考文献４６に記載されている。そのような菌株をエ
レクトロポレーションによってｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰおよびｐｃＤＮＡ３でト
ランスフェクションした。プラスミドＤＮＡでトランスフェクションされたサル
モネラの弱毒株を、１００μｇ／ｍアンピリシンを含むルリア肉汁（ＬＢ）培地
中、振盪を行わずに３７℃で１６〜２５時間培養した。細菌を遠心によって回収
し、ＰＢＳ中に再度懸濁させた。各種濃度のサルモネラをＰＢＳで希釈し、同容
量の１０％重炭酸ナトリウムを加えて、直ちに免疫感作を行った。６〜８週齢の
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス５〜１０匹の群に５〜６時間水を摂取させないようにして
から免疫感作に供した。１００μＬ中約１０5〜１０10ＣＦＵの細菌を、給餌針
（Ｅｊａｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）によって摂取させた。２
週間の間隔を設けて４回の摂取を行った。
レクトロポレーションによってｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰおよびｐｃＤＮＡ３でト
ランスフェクションした。プラスミドＤＮＡでトランスフェクションされたサル
モネラの弱毒株を、１００μｇ／ｍアンピリシンを含むルリア肉汁（ＬＢ）培地
中、振盪を行わずに３７℃で１６〜２５時間培養した。細菌を遠心によって回収
し、ＰＢＳ中に再度懸濁させた。各種濃度のサルモネラをＰＢＳで希釈し、同容
量の１０％重炭酸ナトリウムを加えて、直ちに免疫感作を行った。６〜８週齢の
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス５〜１０匹の群に５〜６時間水を摂取させないようにして
から免疫感作に供した。１００μＬ中約１０5〜１０10ＣＦＵの細菌を、給餌針
（Ｅｊａｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）によって摂取させた。２
週間の間隔を設けて４回の摂取を行った。
【００４１】 図２に示したように、ＭＯＭＰ−ＤＮＡでトランスフェクションされたサルモ
ネラで免疫感作されたマウスは、ＭｏＰｎによる肺の攻撃に対して部分的に保護
された。ある粘膜表面（腸）での免疫感作は、遠位粘膜表面（肺）での攻撃感染
に対して保護を提供する。
ネラで免疫感作されたマウスは、ＭｏＰｎによる肺の攻撃に対して部分的に保護
された。ある粘膜表面（腸）での免疫感作は、遠位粘膜表面（肺）での攻撃感染
に対して保護を提供する。
【００４２】 実施例４ 本実施例は、マウスにおけるＤＮＡプライムおよび蛋白ブースト免疫感作計画
を説明するものである。
を説明するものである。
【００４３】 １０8ｃｆｕで投与した実施例３に記載の方法に従って得られたＭＯＭＰ−Ｄ
ＮＡトランスフェクションサルモネラを、２週間の間隔で４回経口免疫感作した
Ｂａｌｂ／ｃマウスの群間で、１０6ｃｆｕで投与したＭＯＭＰ−ＤＮＡトラン
スフェクションサルモネラと比較した。１０6ｃｆｕで免疫感作したマウスでは
、４回目の免疫感作時にＩＳＣＯＭ（１４）に埋め込まれた１μｇのＭｏＰｎ
ＭＯＭＰを筋肉投与することで、単一蛋白ブーストがあった。ＩＳＣＯＭ取得物
は、上記の米国特許出願０８／７１８２３６号（ＷＯ９８／１０７８９）に記載
の方法に従って得たものである。最終免疫感作から２週間後に、マウスに対して
、５０００ ＩＦＵのＭｏＰｎ ＥＢの経鼻投与による攻撃を行った。感染マウ
スを、感染から１０日目に屠殺した。感染後毎日、マウスを屠殺するまで体重測
定を行った（図３、Ａ）。そのマウスについては、実施例３に記載の方法に従っ
て蛋白ブーストを行わずに１０8ｃｆｕのサルモネラ投与を受けたマウスと比較
して、かなり良好な保護があった。感染後１０日での肺におけるクラミジアＥＢ
を、定量的組織培養によって分析した（図３、ＢおよびＣ）。図３Ｂにおいてデ
ータは、マウス５〜６匹の肺当たりのｌｏｇ10ＩＦＵの平均±標準誤差を示して
あり、図３Ｃは個々のマウスで認められた結果を示している。ＤＮＡプライミン
グされた蛋白ブーストマウスも、免疫原性の向上を示し、ＤＴＨ応答が大きくな
り（図４Ａ）、血清ＩｇＧ2およびＩｇＧ1抗体応答が強くなった（図４Ｂおよび
Ｃ）。最終免疫感作から２週間後に、免疫感作マウスから血清を採取した。Ｍｏ
Ｐｎ特異的ＩｇＧ2a（Ｂ）およびＩｇＧ1（Ｃ）抗体を、ＥＬＩＳＡによって調
べた。
ＮＡトランスフェクションサルモネラを、２週間の間隔で４回経口免疫感作した
Ｂａｌｂ／ｃマウスの群間で、１０6ｃｆｕで投与したＭＯＭＰ−ＤＮＡトラン
スフェクションサルモネラと比較した。１０6ｃｆｕで免疫感作したマウスでは
、４回目の免疫感作時にＩＳＣＯＭ（１４）に埋め込まれた１μｇのＭｏＰｎ
ＭＯＭＰを筋肉投与することで、単一蛋白ブーストがあった。ＩＳＣＯＭ取得物
は、上記の米国特許出願０８／７１８２３６号（ＷＯ９８／１０７８９）に記載
の方法に従って得たものである。最終免疫感作から２週間後に、マウスに対して
、５０００ ＩＦＵのＭｏＰｎ ＥＢの経鼻投与による攻撃を行った。感染マウ
スを、感染から１０日目に屠殺した。感染後毎日、マウスを屠殺するまで体重測
定を行った（図３、Ａ）。そのマウスについては、実施例３に記載の方法に従っ
て蛋白ブーストを行わずに１０8ｃｆｕのサルモネラ投与を受けたマウスと比較
して、かなり良好な保護があった。感染後１０日での肺におけるクラミジアＥＢ
を、定量的組織培養によって分析した（図３、ＢおよびＣ）。図３Ｂにおいてデ
ータは、マウス５〜６匹の肺当たりのｌｏｇ10ＩＦＵの平均±標準誤差を示して
あり、図３Ｃは個々のマウスで認められた結果を示している。ＤＮＡプライミン
グされた蛋白ブーストマウスも、免疫原性の向上を示し、ＤＴＨ応答が大きくな
り（図４Ａ）、血清ＩｇＧ2およびＩｇＧ1抗体応答が強くなった（図４Ｂおよび
Ｃ）。最終免疫感作から２週間後に、免疫感作マウスから血清を採取した。Ｍｏ
Ｐｎ特異的ＩｇＧ2a（Ｂ）およびＩｇＧ1（Ｃ）抗体を、ＥＬＩＳＡによって調
べた。
【００４４】 実施例５ 本実施例は、ＭｏＰｎ特異的遅発型過敏（ＤＴＨ）の測定について説明する。
【００４５】 ＤＴＨを評価するため、ＳＰＧ緩衝液２５中の紫外線（ＵＶ）殺菌ＭｏＰｎ
ＥＢ（２×１０5 ＩＦＵ）２５μＬをマウスの右後足蹠に注射し、等容量のＳ
ＰＧ緩衝液を対照として左後足蹠に注射した。足蹠腫脹を、ディラ（ｄｉｌａ）
−ゲージキャリパスを用いて注射から４８時間後および７２時間後に測定した。
２つの足蹠間での厚さの差をＤＴＨ応答の尺度として用いた。
ＥＢ（２×１０5 ＩＦＵ）２５μＬをマウスの右後足蹠に注射し、等容量のＳ
ＰＧ緩衝液を対照として左後足蹠に注射した。足蹠腫脹を、ディラ（ｄｉｌａ）
−ゲージキャリパスを用いて注射から４８時間後および７２時間後に測定した。
２つの足蹠間での厚さの差をＤＴＨ応答の尺度として用いた。
【００４６】 （開示の概要） 本開示を要約すると、本発明は、弱毒細菌によって保有されるＤＮＡを用いる
、クラミジア感染に対して宿主を免疫感作する方法ならびにそのような方法で用
いられる材料を提供する。本発明の範囲内で、変更を加えることは可能である。
、クラミジア感染に対して宿主を免疫感作する方法ならびにそのような方法で用
いられる材料を提供する。本発明の範囲内で、変更を加えることは可能である。
【００４７】
【表１】
【００４８】 文献リスト
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
【表５】
【図１】 筋肉投与（Ａ、ＢおよびＣ）または経鼻投与（Ｄ、ＥおよびＦ）のいずれかで
のＭＯＭＰ−ＤＮＡ投与の保護結果を示す図である。
のＭＯＭＰ−ＤＮＡ投与の保護結果を示す図である。
【図２】 ＭＯＭＰ−ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ−３）でトランスフェクションされたサルモネ
ラで免疫感作したマウスからの保護結果を示す図である。
ラで免疫感作したマウスからの保護結果を示す図である。
【図３】 ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクションされたサルモネラで経鼻的に免疫感作さ
れ、次にＩＳＣＯＭに埋め込まれたＭＯＭＰで筋肉投与にてブーストされたマウ
スからの保護結果を示す図である。
れ、次にＩＳＣＯＭに埋め込まれたＭＯＭＰで筋肉投与にてブーストされたマウ
スからの保護結果を示す図である。
【図４】 サルモネラ搬送ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３）で経鼻的にプライミングされ、ＭＯＭ
Ｐ−ＩＳＣＯＭ蛋白で筋肉投与にてブーストされたマウスからのＤＴＨ応答（Ａ
）ならびにＩｇＧ2a（Ｂ）およびＩｇＧ1（Ｃ）抗体応答を示す図である。
Ｐ−ＩＳＣＯＭ蛋白で筋肉投与にてブーストされたマウスからのＤＴＨ応答（Ａ
）ならびにＩｇＧ2a（Ｂ）およびＩｇＧ1（Ｃ）抗体応答を示す図である。
【図５】 大きさが約６４ｋｂであるプラスミドｐｃＤＮＡ３／ＭＯＭＰの要素および構
築を示す図である。
築を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 27/02 Ｃ１２Ｎ 1/21 31/04 Ａ６１Ｋ 35/74 Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｚ // Ａ６１Ｋ 35/74 35/76 (Ｃ１２Ｎ 1/21 35/76 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:42） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マーディン、アンドリュー、ディー． カナダ国 エル３エックス １ヴィ２ オ ンタリオ州 ニューマーケット ロウディ ス サークル 146 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA38 CA04 DA05 EA04 FA02 GA14 HA12 4B065 AA01Y AA46X AB01 AC14 CA24 CA45 4C084 AA02 BA03 CA04 DC50 MA56 MA59 ZA33 ZA81 ZB35 4C085 AA03 BA24 BA45 BB11 CC07 DD01 DD62 EE01 4C087 AA01 AA02 BC35 BC81 CA09 CA12 CA20 MA56 MA59 ZA33 ZA81 ZB35
Claims (40)
- 【請求項１】 クラミジア菌株によって生じる感染に対して宿主を免疫感作
する方法において、 最初に、クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生させる１以上の免疫保護誘発性
クラミジア蛋白またはそれの断片をコードする核酸分子を有する免疫上有効な量
の弱毒菌を宿主に投与する段階；ならびに その後に、最初の投与と同じ１以上のクラミジア蛋白の、クラミジア蛋白特異
的免疫応答を発生させる免疫上有効な量の１以上の精製クラミジア蛋白またはそ
れの断片を宿主に投与する段階 を有することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記免疫保護誘発クラミジア蛋白またはそれの断片が、クラ
ミジア菌株の主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記クラミジア菌株がヌモニアクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄ
ｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株である請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記クラミジア菌株がトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）株である請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記核酸分子が、該核酸分子ならびに前記宿主における前記
クラミジア蛋白または該蛋白の断片の発現のために前記核酸分子に効果的に結合
したプロモーター配列を有するベクターで提供される請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記核酸分子が、クラミジア菌株の全長主要外膜蛋白（ＭＯ
ＭＰ）をコードする請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記クラミジア菌株がヌモニアクラミジア株である請求項６
に記載の方法。 - 【請求項８】 前記クラミジア菌株がトラコーマクラミジア株である請求項
６に記載の方法。 - 【請求項９】 前記弱毒菌がサルモネラの弱毒株である請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１０】 前記プロモーターがサイトメガロウィルスプロモーターで
ある請求項５に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記ベクターがプラスミドベクターである請求項５に記載
の方法。 - 【請求項１２】 前記プラスミドベクターが、図５に示したｐｃＤＮＡ３／
ＭＯＭＰの識別特性を有する請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記後投与段階で使用される前記免疫保護誘発クラミジア
蛋白を、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）中に組み込んで投与する請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１４】 前記クラミジア蛋白または該蛋白の断片がクラミジア菌株
の主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）である請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記クラミジア菌株がヌモニアクラミジア株である請求項
１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記クラミジア菌株がトラコーマクラミジア株である請求
項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記第１の投与段階を粘膜表面に対して行う請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１８】 前記第１の投与段階を経鼻投与によって行い、前記第２の
投与段階を筋肉投与によって行う請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生させる１以上の免疫
保護誘発クラミジア蛋白または該蛋白の断片をコードする核酸分子を有する弱毒
細菌株。 - 【請求項２０】 前記クラミジア蛋白または該蛋白の断片がクラミジア菌株
の主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）である請求項１９に記載の弱毒菌株。 - 【請求項２１】 前記クラミジア菌株がヌモニアクラミジア株である請求項
２０に記載の弱毒菌株。 - 【請求項２２】 前記クラミジア菌株がトラコーマクラミジア株である請求
項２０に記載の弱毒菌株。 - 【請求項２３】 前記核酸分子が、該核酸分子ならびに前記宿主における前
記クラミジア蛋白または該蛋白の断片の発現のために前記核酸分子に効果的に結
合したプロモーター配列を有するベクターで提供される請求項１９に記載の弱毒
菌株。 - 【請求項２４】 前記プロモーターがサイトメガロウィルスプロモーターで
ある請求項２３に記載の弱毒菌株。 - 【請求項２５】 前記ベクターがプラスミドベクターである請求項２３に記
載の弱毒菌株。 - 【請求項２６】 前記プラスミドベクターが、図５に示したｐｃＤＮＡ３／
ＭＯＭＰの識別特性を有する請求項２５に記載の弱毒菌株。 - 【請求項２７】 前記弱毒菌がサルモネラの弱毒株である請求項１９に記載
の弱毒菌株。 - 【請求項２８】 前記サルモネラ弱毒株が腸チフス菌の弱毒株である請求項
２７に記載の弱毒菌株。 - 【請求項２９】 クラミジア菌株によって生じる感染に対して宿主を免疫感
作する方法において、 クラミジア蛋白特異的免疫応答を発生させる免疫上有効な量の１以上の免疫保
護誘発性クラミジア蛋白または該蛋白の断片をコードする核酸分子を有する弱毒
細菌を宿主に投与する段階を有することを特徴とする方法。 - 【請求項３０】 前記免疫保護誘発性クラミジア蛋白または該蛋白の断片が
、クラミジア菌株の主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）である請求項１９に記載の方法。 - 【請求項３１】 前記クラミジア菌株がヌモニアクラミジア株である請求項
３０に記載の方法。 - 【請求項３２】 前記クラミジア菌株がトラコーマクラミジア株である請求
項３０に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記核酸分子が、該核酸分子ならびに前記宿主における前
記クラミジア蛋白または該蛋白の断片の発現のために前記核酸分子に効果的に結
合したプロモーター配列を有するベクターで提供される請求項２９に記載の方法
。 - 【請求項３４】 前記プロモーターがサイトメガロウィルスプロモーターで
ある請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３５】 前記ベクターがプラスミドベクターである請求項３３に記
載の方法。 - 【請求項３６】 前記プラスミドベクターが、図５に示したｐｃＤＮＡ３／
ＭＯＭＰの識別特性を有する請求項３５に記載の方法。 - 【請求項３７】 前記弱毒菌がサルモネラの弱毒株である請求２９に記載の
方法。 - 【請求項３８】 前記サルモネラ弱毒株が腸チフス菌の弱毒株である請求項
３７に記載の方法。 - 【請求項３９】 前記投与を粘膜表面に対して行う請求項２９に記載の方法
。 - 【請求項４０】 前記投与を経鼻投与によって行う請求項３９に記載の方法
。
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