CN102711815B - 用于疫苗的佐剂、包含所述佐剂的疫苗及其用途 - Google Patents
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Abstract
用于疫苗的佐剂，所述佐剂包括非脂化细菌外膜多肽（Omp），其中，所述细菌可为布鲁氏菌属细菌。所述佐剂可为经修饰的多肽或可为例如，Omp19S多肽或Omp16S多肽、或其部分、或二者的混合物。在优选的实施方式中，该佐剂为包括SEQ ID No:1或其部分的非脂化多肽。在另一优选的实施方式中，该佐剂为包括SEQ ID No:2或其部分的非脂化多肽。
Description
技术领域
本申请涉及用于疫苗的佐剂，所述佐剂包括非脂化细菌外膜多肽(Omp)，其中，所述细菌可为布鲁氏菌属(Brucella)细菌。所述佐剂可为经修饰的多肽；所述佐剂可为例如，Omp19S多肽或其部分、Omp16S多肽或其部分、或两者的混合物。在优选的实施方式中，该佐剂为包括SEQ ID No：1或其部分的非脂化多肽。在另一优选的实施方式中，该佐剂为包括SEQ ID No：2或其部分的非脂化多肽。
背景技术
免疫佐剂为被并入抗原(Ag)或与抗原同时给予、诱导针对该抗原更有效的免疫应答的物质。可将免疫佐剂用于以多种方式增强对Ag的免疫应答：免疫佐剂可增强针对弱Ag的免疫应答的强度；增进免疫应答的速率和持续时间；调节抗体(Ab)亲合力及同种型或亚类分布；刺激并调节细胞免疫应答；促进对局部免疫应答(例如粘膜)的诱导；减少必需Ag的量并降低疫苗成本；或者，免疫佐剂可帮助避免存在于联合疫苗中的Ag竞争(Singh和O’Hagan，Advances in vaccine adjuvants，Nat Biotechnol.17(11)：1075-81，1999)。
纵观整个疫苗史，从基于含有水和油的分枝杆菌乳剂的完全弗氏佐剂(CFA)起，已对许多制剂进行了测试并取得了或高或低的成功。用于人类的最常用且允许的佐剂为作为氢氧化物或磷酸盐的铝。其它佐剂由细菌组分(如内毒素)、颗粒(如脂质体)、油乳剂(如皂苷)以及其它不同的分子组成(Petrovsky和Aguilar，Vaccine adjuvants：current state and future trends，Immunol Cell Biol.82(5)：488-96，2004)。历史上使用过的大多数佐剂(如铝盐)优选刺激2型辅助性T细胞(Th)免疫应答(Lilj eqvist和Stahl，Production of recombinant subunit vaccines：protein immunogens，live delivery systems and nucleic acid vaccines，J Biotechnol.73(1)：1-33，1999)，增强抗体(Abs)的产生。然而，存在着其它刺激Th1免疫应答的疫苗(如BCG疫苗和并入佐剂的油混合物)(Victoratos， Yiangou，Avramidis和Ha djipetrou，Regulation of cytokine gene expres sion by adjuvants in vivo，Clin Exp Immunol，109(3)：569-78，1997)。将来应对疫苗佐剂进行精心选择：不仅在其对于应答量方面的功能、还应该在其对于所诱发应答的质量方面的功能进行精心选择。另一方面，传统上使用的接种方法学(处于氢氧化铝中的肌内疫苗或皮内疫苗)对诱导全身性体液免疫应答是有用的，但是通常不能够诱导细胞免疫应答和局部免疫应答(如粘膜中)(Moyle，McGeary，Blanchfield和Toth，Mucosal immunization：adjuvants and delivery systems，Curr Drug Deliv.1(4)：385-96，2004)。对于能够诱导强的细胞Th1型免疫应答和细胞毒性T细胞(TCL)免疫应答的疫苗设计存在着更大的需求，该疫苗可预防病毒慢性感染、与胞内病原体相关的感染、或癌症(治疗疫苗)(Seder和Hill，Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity，Nature，406(6797)：793-8，2000)。除了促进针对抗原的特异性的、有效的免疫应答外，其它重要的考虑事项与待用于临床实践中的物质的重要特征有关。最佳的配方必须是安全的、稳定的、生物可降解的、非活性的且生产成本低。满足所有这些要求的物质很少，到目前为止，获批用于人类的佐剂限于：铝盐、MF59(水包油乳剂)、MLP(单磷酰糖脂)、病毒颗粒(HBV和HPV)、IRIV(由磷脂、流感病毒血凝素和确定的靶抗原组成的脂蛋白体)；以及霍乱毒素的B亚基(Reed，Bertholet，Coler和Friede，New horizons in adjuvants for vaccine development，Trends Immunol，30(1)：23-32，2009)。尽管接受在治疗性疫苗中的一定反应，但是将佐剂用于预防性疫苗时，必须不能诱导不良反应。在兽医健康领域中，效力是极为重要的因素，可容忍一定水平的副作用(Sesardic，Regulatory considerations on new adjuvants and delivery systems，Vaccine，24 Suppl 2S2-86-7，2006)。
考虑到大多数感染的主要进入口是粘膜表面，在给予Ag后产生粘膜免疫力的能力可提供对这些病原体的早期防御。令人遗憾的是，通过口腔途径给予抗原后，在胃肠道中存在着降解，几乎没有吸收且长期效力低，因此，重复给予和大量的Ag对刺激和维持免疫应答是需要的。此外，已经观察到了对那些经由口腔途径给予的可溶性Ag的免疫耐受性(Moyle等，Mucosal immunization：adjuvants and delivery systems，Curr Drug Deliv.1(4)：385-96，2004)。例如，到目前为止所使用的口腔佐剂(如霍乱毒素(TC))在给予后显示出了严重的风险(Fujihashi，Koga，van Ginkel，Hagiwara和McGhee，A dilemma for mucosal vaccination：efficacy versus toxicity using enterotoxin-based adjuvants，Vaccine，20(19-20)：2431-8，2002)，因此在这一领域中，开发出允许将Ag有效递送至粘膜表面、随后在所述粘膜中诱导免疫应答的更安全的佐剂非常重要。
在国际水平上，具有佐剂性能的产品连续不断地增加；然而，只有较少数量的产品用于兽医和人类疫苗配方(Aucouturier，Dupuis和Ganne，Adjuvants designed for veterinary and human vaccines，19(17-19)：2666-72，2001；Petrovsky等，Vaccine adjuvants：current state and future trends，Immunol Cell Biol.82(5)：488-96，2004)。出于这个原因，开发出有效且同时对人类和动物疫苗来说安全的佐剂是很重要的。
现今，大多数能够诱导强Th1应答的佐剂都是基于油乳剂的佐剂(如不完全弗氏佐剂(IFA))，然而，这些佐剂在注射部位伴有不良反应(如无菌脓肿和肉芽肿)。根据前述，诱导Th1和CTL应答的胃肠外佐剂和粘膜佐剂的开发是高度相关的。
在本发明中，提供了两种新的佐剂：Omp16S和Omp19S。这些物质增强和/或调节了针对共同给予的Ag的免疫应答，有利于Th1型、Th17型或CTL型免疫应答的发展。
发明内容
一种用于疫苗的佐剂，所述佐剂包括非脂化细菌外膜多肽(Omp)，其中，所述细菌可为布鲁氏菌属细菌。所述佐剂可为经修饰的多肽；或者可为例如，Omp19S多肽或其部分、Omp16S多肽或其部分、或者两者的混合物。在优选的实施方式中，该佐剂为包括SEQ ID No：1或其部分的非脂化多肽。在另一优选的实施方式中，该佐剂为包括SEQ ID No：2或其部分的非脂化多肽。
本文还提供了包含所述佐剂(至少一种非脂化细菌外膜多肽(Omp))和至少一种抗原的疫苗，其中，所述细菌可为布鲁氏菌属细菌，并且所述疫苗可用于粘膜给予或胃肠外给予。所述疫苗佐剂可为经修饰的多肽； 或者可为例如，Omp19S多肽或其部分、Omp16S多肽或其部分、或者两者的混合物。在优选的实施方式中，该佐剂为包括SEQ ID No：1或其部分的非脂化多肽。在另一优选的实施方式中，该佐剂为包括SEQ ID No：2或其部分的非脂化多肽。
提供了佐剂用于制造针对病原体的疫苗的用途。
提供了佐剂用于制造抗肿瘤疫苗或免疫调节组合物的用途。
提供了真核表达载体，所述载体包含序列SEQ ID No：1或SEQ ID No：2。
提供了经修饰的真核细胞，所述细胞表达序列SEQ ID No：1或SEQID No：2。
附图说明
图1显示出：将经纯化且去脂多糖(LPS)的Omp19S和Omp16S上样至用考马斯蓝染色的15％聚丙烯酰胺凝胶，在所有泳道中加入总量为20μg的蛋白。此外，将经蛋白酶K降解的Omp19S(Omp19SPK)在同一凝胶中跑电泳，并且在某些实验中将Omp19SPK用作对照。
图2显示出在来自以Omp19S作为佐剂通过口腔途径免疫的BALB/c动物的肠系膜淋巴结中，α4β7蛋白的表达增高。用如下物质经口腔对动物进行免疫：(i)牛卵清蛋白(OVA)；(ii)Omp19S+OVA；或(iii)霍乱毒素(TC)+OVA。将对应于各免疫组的2×106个肠系膜淋巴结细胞用抗CD4(FITC)、抗CD8(PE-Cy5.5)和抗α4β7(PE)抗体(Abs)进行标记。右上象限处的数字表示表达α4β7蛋白的CD8+T细胞(图2A)和CD4+T细胞(图2B)的频率。在所有情况下均减去了同种型对照的频率。每组n＝5。数据是两次独立实验的代表。
图3显示出当作为口腔佐剂给予时，Omp19S诱导了体内T细胞免疫应答。将20μg OVA接种入经如图2中所述免疫的动物的爪垫中，对应答该接种的迟发型超敏反应(DTH)进行测定。柱表示在48h(图3A)和72h(图3B)时，左右脚爪之间的爪垫皮肤平均皱褶增厚量(mean fold increment)±平均标准误(SEM)，每组n＝5，表示具有类似结果的两次实验。
图4显示出当作为口腔佐剂给予时，Omp19S诱导了应答抗原刺激的脾细胞增殖能力的增强。用100μg/mL OVA或不用抗原对经如图2中所述免疫的动物的脾细胞进行刺激。将细胞与3H胸苷一起培养18h，测定引入的放射性。结果作为刺激指数(S.I.)示出，该刺激指数表示OVA-刺激的脾细胞每分钟的计数(Counts per minute，cpm)/未刺激的脾细胞cpm。将S.I.＞2视为阳性。各值表示每组5只动物的三次重复测定的平均值±SEM。
图5显示出当作为口腔佐剂给予时，在抗原刺激后，Omp19S诱导了细胞免疫应答和细胞因子(IFN-γ和IL-17)产生。用不同浓度的OVA(100μg/mL和1000μg/mL)或完全培养基(RPMI)在体外对经如图2中所述免疫的各组(每组n＝5)的脾脏脾细胞进行刺激。在刺激72h后，收集培养物上清液。通过ELISA对所述培养物上清液中的如下细胞因子的浓度(pg/mL)进行测定：干扰素(IFN-γ)(图5A)、IL-4(图5B)、IL-2(图5C)、IL-10(图5D)和IL-17(图5E)。各值表示各小鼠的两次重复测定的平均值±SEM，表示具有类似结果的2次试验。
图6显示出当作为口腔佐剂给予时，Omp19S刺激了对产IFN-γ的CD4+特异性T细胞和CD8+特异性T细胞的诱导作用。将通过口腔途径用(i)OVA；(ii)Omp19S+OVA；或(iii)TC+OVA免疫的动物的脾细胞用OVA323+A20J+OVA(500μg/mL)或用完全培养基(无刺激)刺激18h，并用布雷菲德菌素A(Brefeldin A)在培养的最后4h进行刺激。然后，将细胞用特异性抗CD4(PE/Cy5)和抗CD8(Alexa Fluor 647)Abs进行染色，随后进行固定、破膜，并与抗IFN-γ(PE)Ab或同种型对照Ab(PE)孵育。右上象限处的数字表示表达IFN-γ的CD4+T细胞(图6A)或CD8+T细胞(图6B)的频率。在所有情况下均减去了同种型对照的频率和同组未刺激细胞产生的IFN-γ。这样，所示百分比对应于产生的OVA特异性IFN-γ。数据是两次独立实验的代表。
图7显示出在来自以Omp16S作为佐剂经口腔免疫的BALB/c动物的肠系膜淋巴结的T细胞中，α4β7蛋由的表达增高。用如下物质通过口腔途径对各组动物进行免疫：(i)OVA；(ii)Omp16S+OVA；或(iii)TC+OVA。将对应于各组的2×106个肠系膜淋巴结细胞用抗CD8 （PE-Cy5.5）和抗α4β7（PE）抗体进行标记。右上象限处的数字表示表达α4β7标记物的CD8+T细胞的频率。在所有情况下均减去了同种型对照的百分比。每组n=5。数据是两次独立实验的代表。
图8显示出当作为口腔佐剂给予时，Omp16S诱导了体内T细胞免疫应答。将20μg OVA接种入经如图7中所述口腔免疫的动物的右爪垫，对应答该接种的DTH反应进行测定。柱表示在48h（图8A）和72h（图8B）时，左右脚爪之间的爪垫皮肤平均皱褶增厚量±SEM，每组n=5，表示具有类似结果的两次实验。
图9显示出当作为鼻腔佐剂给予时，Omp19S诱导了应答抗原的细胞免疫应答和细胞因子（IFN-γ）的产生。用如下物质通过鼻腔途径对C57BL/6小鼠进行免疫：（i）OVA；（ii）Omp19S+OVA；或（iii）TC+OVA。用500μg/mL OVA或完全培养基（RPMI）在体外对经如图7中所述免疫的各组（每组n=5）的脾细胞进行刺激。在刺激5天后，收集培养物上清液。通过ELISA对在培养物上清液中的下述细胞因子的浓度（pg/mL）进行测定：IFN-γ（图9A）、IL-4（图9B）和IL-10（图9C）。每组n=5。各值表示各小鼠两次重复测定的平均值±SEM，表示具有类似结果的两次实验。
图10显示出当作为鼻腔佐剂给予时，Omp19S刺激了对产IFN-γ的CD4+特异性T细胞和CD8+特异性T细胞的诱导作用。用OVA257+MO5+OVA（500μg/mL）或用完全培养基（无刺激，RPMI）对经如图9中所述免疫的动物的脾细胞培养18h。然后，在培养的最后4h，用布雷菲德菌素A对上述细胞进行处理。然后，将细胞用特异性抗CD4（PE/Cy5）和抗CD8（Alexa Fluor 647）Abs进行染色。随后对细胞进行固定、破膜，并与抗IFN-γ（PE）Ab孵育。右上象限处的数字表示表达IFN-γ的CD4+T细胞（图10A）或CD8+T细胞（图10B）的频率。在所有情况下均减去了同种型对照的频率和同组未刺激细胞产生的IFN-γ。这样，所示百分比对应于产生的OVA特异性IFN-γ。数据是两次独立实验的代表。
图11显示出当作为鼻腔佐剂给予时，Omp16S诱导了细胞免疫应答和细胞因子产生。用如下物质通过鼻腔途径对动物进行免疫：（i）OVA；（ii）Omp16S+OVA；或（iii）TC+OVA。用500μg/mL OVA或完全培养基(RPMI)在体外对各免疫组(每组n＝5)的脾细胞进行刺激。在刺激5天后收集培养物上清液。通过ELISA对培养物上清液中的下述细胞因子的浓度(pg/mL)进行测定：IFN-γ(图11A)、IL-4(图11B)和IL-10(图11C)。每组n＝5。各值表示各小鼠两次重复测定的平均值±SEM，表示具有类似结果的两次实验。
图12显示出当作为鼻腔佐剂给予时，Omp16S刺激了对产IFN-γ的CD4+特异性T细胞和CD8+特异性T细胞的诱导作用。用OVA257+MO5+OVA(500μg/mL)或完全培养基对经如图11中所述免疫的动物的脾细胞培养18h。然后，在培养的最后4h，用布雷菲德菌素A对上述细胞进行处理。然后，用特异性抗CD4(PE/Cy5)和抗CD8(Alexa Fluor 647)Abs对细胞进行染色。随后对细胞进行固定、破膜，并与抗IFN-γ(PE)Ab孵育。右上象限处的数字表示表达IFN-γ的CD4+T细胞(图12A)或CD8+T细胞(图12B)的频率。在所有情况下均减去了同种型对照的频率和同组未刺激细胞产生的IFN-γ。这样，所示百分比对应于产生的OVA特异性IFN-γ。数据是两次独立实验的代表。
图13显示出当作为胃肠外佐剂给予时，Omp19S对体液应答的强度没有影响。通过ELISA对来自用如下物质经皮下途径免疫的BALB/c小鼠血清中的抗OVA总IgG滴度进行测定：(i)OVA；(ii)OVA+Omp19S；和(iii)OVA+CFA。每组n＝5，各值表示各小鼠测定的平均值±SEM，表示具有类似结果的两次实验。
图14显示出当作为胃肠外佐剂给予时，Omp19S对经诱导的Abs的同种型谱有影响。对经如图13中所述免疫的动物血清中的抗OVA的IgG1/IgG2a同种型比值进行测定。各值表示各小鼠测定的平均值±SEM。每组n＝5，表示具有类似结果的两次实验。
图15显示出Omp19S作为胃肠外佐剂在如图13中所述免疫后的BALB/c小鼠的皮下组织中并未诱导局部毒性。在以CFA作为佐剂免疫的小鼠中观察到了注射部位(方框)的肉芽肿(图15A)。在右侧，对以Omp19S作为皮下佐剂免疫的小鼠中的同一区域进行观察，在组织中没有改变迹象(alteration signs)(图15B)。
图16显示出当作为胃肠外佐剂给予时，Omp16S和Omp19S在体内诱导了针对抗原的T细胞免疫应答。在用(i)OVA；(ii)OVA+Omp16S；(iii)OVA+Omp19S；或(iv)OVA+CFA如图13中所述的经皮下免疫的动物右爪垫中，注入20μgOVA进行激发，对应答该激发的DTH反应进行测定。柱表示在用OVA刺激48h(图16A)和72h(图16B)后，左右脚爪之间的爪垫皮肤平均皱褶增厚量±SEM。每组n＝5，表示具有类似结果的三次实验。
图17显示出当作为胃肠外佐剂给予时，Omp19S诱导了应答Ag刺激的脾细胞增殖的增强。在经如图13中所述免疫的小鼠的脾细胞中，评价作为对不同剂量OVA的应答的体外增殖。将结果表示为刺激指数SI(OVA cpm/RPMI cpm)。每组n＝5。各值表示各小鼠的三次重复测定的平均值±SEM，表示具有类似结果的两次实验。
图18显示出当作为胃肠外佐剂给予时，在抗原刺激后，Omp19S诱导了细胞免疫应答和细胞因子(IFN-γ)产生。用不同浓度的OVA或完全培养基在体外刺激72h，对经如图13中所述免疫的小鼠的脾细胞产生的IFN-γ进行测定。每组n＝5。各值表示各小鼠两次重复测定的平均值±SEM，表示具有类似结果的两次实验。
图19显示出当作为胃肠外佐剂给予时，Omp19S并未诱导应答抗原的IL-4和IL-10的产生的增加。用不同浓度的OVA或完全培养基(RPMI)在体外刺激72h，对经如图13中所述免疫的小鼠的脾细胞的IL-4(图19A)和IL-10(图19B)的产生进行评价。每组n＝5。各值表示各小鼠两次重复测定的平均值±SEM，表示具有类似结果的两次实验。
图20显示出当作为胃肠外佐剂给予时，Omp19S诱导了应答抗原的细胞免疫应答和IL-17的产生。用不同浓度的OVA或完全培养基(RPMI)在体外刺激72h，对经如图13中所述免疫的小鼠的脾细胞的IL-17的产生进行测定。每组n＝5。各值表示各小鼠两次重复测定的平均值±SEM，表示一次实验。
图21显示出将Omp19S作为佐剂通过胃肠外途径给予增加了OVA257-264特异性的CD8+细胞的增殖。将来自OT-1小鼠的细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行标记并经静脉内（i.v.）转移至C57BL/6小鼠（10×106个细胞/小鼠）。在过继转移（adoptive transfer）一天后，用如下物质对接受者C57BL/6小鼠经皮下（s.c）进行免疫：（i）OVA；（ii）OVA+Omp19S；（iii）OVA+用蛋白酶K降解的Omp19S（Omp19SPK）；或（iv）OVA+LPS。在免疫5天后，通过流式细胞术分析CFSE荧光的稀释度，对来自脾脏和淋巴结中的OT-1 CFSE+的细胞的增殖进行测定。示出了经历过一次以上分裂的CD8+细胞的百分比，表示三次实验的结果。
图22显示出将Omp19S作为佐剂通过胃肠外途径给予增强了OVA257-264特异性的CD8+细胞群中的IFN-γ的胞内产生。将来自经如图21中所述免疫的动物的脾细胞用如下物质刺激18h：完全培养基（RPMI）、OVA（500μg/mL）+SIINFEKL肽（5μg/mL）+MO5，然后用布雷菲德菌素A处理6h。然后，用抗CD8 Alexa Fluor和抗IFN-γPE抗体对细胞进行染色。右上象限处的值表示产IFN-γ的CD8+细胞的频率。
图23显示出以Omp16S或Omp19S作为佐剂的免疫诱导了能使表达Ag的肿瘤细胞裂解的细胞毒免疫应答。对来自用如下物质免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞的细胞毒活性进行测定：（i）OVA；（ii）Omp16S+OVA；（iii）Omp19S+OVA；或（iv）CFA+OVA。将标记有51Cr的靶细胞（表达OVA的MO5或不表达OVA的B16）以1个靶细胞:50个脾细胞的比例与脾细胞一起孵育。在6h后，对上清液中的cpm进行测定，根据特异的裂解百分比对结果进行分析。
图24显示出在以Omp19S作为佐剂通过口腔途径免疫的BALB/c小鼠的肠系膜淋巴结中，表达α4β7的CD4+T细胞和CD8+T细胞的频率增高。用如下物质经口腔对动物进行免疫：（i）破伤风类毒素（TT）；（ii）TT+Omp 19S；或（iii）TT+TC。用抗CD4（FITC）、抗CD8（PE-Cy5.5）和抗α4β7（PE）抗体对来源于各免疫组的2×106个肠系膜淋巴结细胞进行染色。右上象限处的数字表示表达α4β7标记物的CD8+T细胞（图24A）和CD4+T细胞（图24B）的频率。在所有情况下均减去了同种型对照的频率。每组n=5。
图25在凝胶中显示出，Omp16S和Omp19S蛋白分别在用真核表达质粒pCI-Omp16S或pCI-Omp19S转染的真核生物细胞中得以正确表达。在分别用质粒pCI-Omp16S或pCI-Omp19S瞬时转染的真核细胞(COS-7)中对Omp16S(图25A)或Omp19S(图25B)的表达进行研究，以用质粒pCI瞬时转染的真核细胞(COS-7)作为对照。在培养24h或48h后，分别利用特异的抗Omp16抗体或抗Omp19抗体，通过在来自转染的细胞的蛋白提取物中进行Western印迹来对Omp16或Omp19的表达进行评价。
图26显示出Omp19S抑制BALB/c小鼠的胃蛋白酶。将胃提取物的上清液与BSA(无关蛋白)、Omp19S、哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(作为胃酶活性可被抑制的对照)孵育。使用BODIPY FL酪蛋白或BODIPYFL OVA作为底物对酶活性进行测定。图表示在各处理后残留的酶活性的百分比，通过将胃提取物上清液对BODIPY FL酪蛋白或BODIPY FL OVA底物的活性看作最高活性计算得出所述百分比。通过用PK(蛋白酶K)处理这些底物来对BODIPY FL酪蛋白或BODIPY FL OVA底物的发荧光能力(一旦降解的话)进行检查。
图27显示出Omp 19S能够抑制BALB/c小鼠的胃蛋白酶对真核抗原(BSA、OVA)和细菌性抗原(BLS、SurA、DnaK)的降解。将各抗原用如下物质进行处理：(i)胃提取物上清液；(ii)胃提取物上清液和Omp19S；(iii)胃提取物上清液和哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(作为胃酶活性可被抑制的对照)。使这些反应混合物接受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和随后的考马斯蓝染色。
图28显示出Omp19S在体内抑制胃蛋白酶对抗原降解的能力，将BODIPY FL酪蛋白用作模式抗原。用如下物质经口腔对BALB/c小鼠进行接种：(i)NaHCO3缓冲液(1M，pH 8)(溶媒)；(ii)BODIPY FL酪蛋白和Omp19S、(iii)BODIPY FL酪蛋白和抑肽酶(已知的蛋白酶抑制剂)；(iv)BODIPY FL酪蛋白。图表示在各处理后残留的酶活性的百分比，通过把用BODIPY FL酪蛋白免疫的小鼠的胃提取物上清液作为最高活性计算得出所述百分比。
具体实施方式
本申请所述的短语“Omp19S多肽”、“Omp19S蛋白”和“Omp19S”具有相同的含义并对应于非脂化Omp19S多肽。
术语Omp19S或Omp16S是指可分别对应于SEQ No.1或SEQ No.2的多肽序列，通过从表达Omp19S或Omp16S的细胞、组织或生物体中纯化得到所述多肽或通过化学合成得到所述多肽。
本申请所述的短语“Omp16S多肽”、“Omp16S蛋白”和“Omp16S”具有相同的含义并对应于非脂化Omp16S多肽。
在本申请中，术语“免疫原”和“抗原”具有相同的含义，并将所述术语定义为在具有免疫能力的生物体中可诱导针对该物质的体液免疫应答或细胞免疫应答的任何物质。根据这一含义，抗原为免疫原的同义词。
在优选的实施方式中，将无脂化共有序列的Omp19S多肽克隆入质粒载体中。使用这一构建体转化大肠杆菌(E.coli)感受态细胞，从而表达和纯化非脂化多肽。使用镍琼脂糖树脂进行纯化。将相应的洗脱液上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶中(图1)。随后，将具有类似浓度的洗脱液合并入不同组分中。在这些组分中，通过使用抗Omp19的单克隆抗体进行Western印迹来对该经纯化的多肽进行确认。
对克隆的多肽进行测序并将其序列在SEQ ID No：1中示出。明显的是，所述序列可存在变化，所有变化均落入本发明的范围内。例如，所述序列的片段、或者片段或氨基酸的添加或缺失。从布鲁氏菌的任何种中获得的Omp19S非脂化多肽也涵盖在本发明的范围内。
在另一优选的实施方式中，将无脂化共有序列的Omp16S多肽克隆入质粒载体中。使用这一构建体转化大肠杆菌感受态细胞，从而表达和纯化非脂化多肽。使用镍琼脂糖树脂进行纯化。将相应的洗脱液上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶中(图1)。随后，将具有类似浓度的洗脱液合并入不同组分中。在这些组分中，通过使用抗Omp16S的单克隆抗体进行Western印迹来对该经纯化的多肽进行确认。对克隆的多肽进行测序并将其序列在SEQ ID No：2中示出。明显的是，所述序列可存在变化，所有变化均落入本发明的范围内。例如，所述序列的片段、或者片段或氨基 酸的添加或缺失。从布鲁氏菌的任何种中获得的Omp16S非脂化多肽也涵盖在本发明的范围内。
根据本申请的公开内容，明显的是，可将其他布鲁氏菌Omp多肽用作佐剂，将它们以非脂化形式提供。可通过肽骨架中的变化以及通过其它已知方法得到所述非脂化形式。任何非脂化Omp多肽均涵盖在本发明的范围内。
使用粘膜Omp19S或Omp16S进行的分析：
对来自用(i)OVA(卵清蛋白)；(ii)Omp19S+OVA；或(iii)霍乱毒素(TC)+OVA经口腔免疫的动物的肠系膜淋巴结的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中的α4β7表达进行评价。
结果表明，相比于给予抗原OVA而不给予佐剂(0.74％；1.64％)的情况，在以Omp19S和TC作为佐剂经口腔接种Omp19S+OVA(7.7％；12.16％)和TC+OVA(7.15％；16.43％)的动物的肠系膜淋巴结中表达粘膜迁移标记物(胃肠固有层)α4β7的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的频率增高(图2A和图2B)。因此，可以说口腔给予Omp19S将诱导CD4+效应T淋巴细胞和CD8+效应T淋巴细胞迁移至肠粘膜。
通过迁移到抗原注射部位、识别来源于抗原提呈细胞(APCs)上的抗原的肽并释放细胞因子(如IFN-γ)的T细胞介导迟发型超敏应答(DTH)，所述细胞因子刺激了引发水肿和肿胀的固有免疫系统的细胞募集。然后，为对体内T细胞应答进行分析，在用本发明佐剂经口腔免疫的小鼠中对通过OVA注射诱导的DTH应答进行评价。为此目的，将20μgOVA注射入经免疫小鼠的一条腿的爪垫中，在另外的腿中注射生理溶液作为对照。在OVA注射48h和72h后，相对于用OVA而未用佐剂免疫的动物，用与Omp19S共同给予的OVA经口腔免疫的动物的爪垫皮肤表现出增厚(图3A和图3B)。这一增高略高于将霍乱毒素作为佐剂经相同途径给予而诱导的增高(图3A和图3B)。
这些结果显示出经口腔给予的Omp19S佐剂将能诱导体内细胞应答，该细胞应答类似于或高于通过实验上已知的粘膜佐剂(如霍乱毒素)引起的细胞应答。Omp19S作为粘膜佐剂将诱导体内抗抗原(OVA)的T 细胞应答。
为了对所诱导的细胞免疫应答进行表征，对经免疫动物应答抗原刺激的脾细胞体外增殖能力进行测定。在不同浓度的OVA或完全培养基存在的情况下对细胞进行培养。在5天后给予18h的3H-胸苷脉冲，对引入的放射性进行测定。所得到的结果显示出，相比于仅用OVA免疫动物的细胞的抗原特异性增殖应答，经口腔共同给予OVA和Omp19S佐剂诱导了来自这些小鼠的细胞的抗原特异性增殖应答的增高(图4)。用刀豆蛋白A(ConA，对照丝裂原)进行刺激引起细胞增殖的明显增高。相反，使用霍乱毒素作为佐剂不会诱导作为对Ag应答的脾细胞增殖能力的增强。这些结果表明，经口腔使用Omp19S佐剂对引起有效的适应性应答有影响，所述影响通过T细胞的抗原特异性增殖应答的增高得以证明。
基于DTH和增殖结果，证实了作为对抗原刺激的应答而发展的细胞应答。
随后，对用本发明佐剂经口腔免疫的动物中发展的T细胞应答谱进行了表征。
为了确定通过Omp19S作为佐剂诱导的抗OVA辅助性T细胞(Th)应答的类型，在不同浓度的OVA或完全培养基存在的情况下，将来自经免疫小鼠的脾细胞培养72h，然后，在这些细胞的上清液中分析所产生的细胞因子的种类。使用特异性单克隆抗体进行捕获ELISA，以检测经刺激的脾细胞和对照脾细胞的培养物上清液中的IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4和IL-17。
结果表明，比起对照动物(OVA)的细胞和用OVA+TC免疫的动物的细胞，用OVA+Omp19S经口腔免疫的动物的细胞产生了更高量的IFN-γ、IL-2和IL-17(图5)。此外，这些细胞因子的分泌是抗原特异性和剂量依赖性的。
相反地，Th2谱(profile)细胞因子(如IL-4和IL-10)的水平类似于基底水平。这样，通过口腔途径使用Omp19S作为佐剂将引起Th1型和Th17型应答。
不仅是通过佐剂所诱导的诱导应答的量很重要，这一应答的质量也 很重要。考虑到用Omp19S+OVA共免疫的小鼠的淋巴细胞释放出IFN-γ，对产生这一细胞因子的CD4+T细胞或CD8+T细胞亚群进行评价。为此目的，测定了CD4+T细胞和CD8+T细胞的IFN-γ的胞内产量。
出于这一目的，执行了与不同刺激物一起孵育16h的方案。为了对从小鼠脾脏中提取的淋巴细胞进行刺激，使用了用于BALB/c的MHC II类限制性OVA肽(OVA323)、抗原提呈细胞A20J和OVA(500μg/mL)。其它刺激物由作为阴性对照的完全培养基(RPMI)和作为阳性对照的Pma/离子霉素(T细胞多克隆激活剂)组成。在图6中显示出了通过用OVA、OVA+Omp19S和OVA+TC经口腔免疫的各组小鼠的CD4+T细胞和CD8+T细胞中产生的IFN-γ。
以Omp19S作为佐剂通过口腔途径进行的免疫诱导了抗原特异性的产IFN-γ的CD4+T细胞的产生(2.13％)，而以TC作为佐剂免疫的组与用OVA而未用佐剂免疫的组没有不同(OVA+TC 0.45％vs OVA 0.41％)(图6A)。至于产IFN-γ的CD8+T淋巴细胞，在OVA+Omp19S的组中可观察到轻微的增高(0.77％)，但是相对于用OVA(0.37％)或用OVA+TC(0.55％)免疫的组来说很显著(图6B)。
总而言之，使用Omp19S作为口腔佐剂诱导了：(i)CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞迁移至胃肠粘膜；(ii)体内抗原特异性T细胞应答；(iii)作为对Ag应答的细胞因子Th1、Th17的释放以及淋巴细胞的增殖；和(iv)产IFN-γ的记忆性CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。这些产IFN-γ细胞对于产生针对感染(所述感染由在其生命周期中具有胞内期的病原体(如病毒、细菌、寄生虫和真菌)造成)或肿瘤的有效免疫应答来说是不可缺少的。所述佐剂诱导T淋巴细胞产生该细胞因子的事实对于开发针对该类疾病的疫苗可能是有益的。所有这些性质在粘膜佐剂领域中非常需要。
对用(i)OVA；(ii)OVA+Omp16S；或(iii)OVA+TC经口腔免疫的动物中得到的肠系膜淋巴结的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中的α4β7表达也进行了评价(图7)。结果表明，相比于给予抗原而不给予佐剂(OVA，1.64％)的情况，用OVA+Omp16S(4.35％)和OVA+TC(16.43％)经口腔免疫的动物的肠系膜淋巴结中的表达粘膜迁移标记物 α4β7的CD8+T淋巴细胞的频率增高。这些结果表明，通过口腔途径给予Omp16S诱导了效应CD8+T淋巴细胞迁移至肠粘膜。
为了对体内T细胞应答进行分析，在通过口腔途径免疫的小鼠中，对通过OVA注射诱导的迟发型超敏应答进行了评价。在用OVA免疫48h和72h后，相对于用OVA而未用佐剂免疫的动物，用与作为佐剂的Omp16S共同给予的OVA经口腔免疫的动物的爪垫皮肤表现出增厚(图8A和图8B)。在48h时，这一增高略高于通过相同途径给予的、作为佐剂的霍乱毒素诱导的增高(图8A)。因此，Omp16S作为粘膜佐剂诱导了抗抗原(OVA)的迟发型超敏(DTH)应答。通过口腔途径给予Omp16S能够诱导类似于实验上已知的粘膜佐剂(如霍乱毒素)引起的体内T细胞应答。
使用Omp16S作为佐剂通过口腔途径将诱导：(i)CD8+T淋巴细胞迁移至胃肠粘膜；(ii)体内抗原特异性T细胞应答。
鼻腔给予Omp19S引起了脾脏脾细胞培养物中的OVA特异性细胞因子的产生。相对于用OVA而未用任何佐剂免疫的动物，作为对抗原OVA的应答，来自用OVA+Omp19S经鼻腔免疫的动物的脾细胞产生较高水平的IFN-γ(图9A)。经鼻腔给予OVA+TC在用OVA刺激的脾细胞的培养物上清液中诱导了较高水平的IFN-γ。相反，在来源于任何研究组的脾细胞中，用OVA刺激都没有诱导IL-4的分泌(图9B)。至于IL-10，相对于阴性对照，仅在用OVA+TC免疫的组中检测到了轻微的增高(图9C)。因此，给予Omp19S作为鼻腔佐剂诱导了Th1细胞免疫应答和IFN-γ的产生。
考虑到脾细胞释放的细胞因子谱，评价了CD4+T细胞或CD8+T细胞是否是这一产生的原因。为此目的，在最后一次免疫3周后对胞内IFN-γ进行测定。
以Omp19S作为鼻腔佐剂(Omp19S+OVA)进行免疫诱导了产IFN-γ的抗原特异性CD4+T细胞的产生(0.43％)，而以TC作为佐剂(TC+OVA)免疫的组与用OVA而未用任何佐剂免疫的组相比，所诱导的产生并没有不同(OVA+TC 0.28％vs OVA 0.23％)(图10A)。至于产IFN-γ的CD8+T淋巴细胞，在OVA+Omp19S的组中可观察到轻微的增高（0.72%），但相比于用OVA免疫的组（0.47%）或用OVA+TC免疫的组（0.22%）来说很显著（图10B）。
总体上，这些结果显示出用Omp19S+OVA通过鼻腔途径免疫的小鼠表现出抗OVA的产IFN-γ的CD4+T淋巴细胞的百分比的增高，但主要增高的是抗OVA的产IFN-γ的CD8+T淋巴细胞。这一产生高于用OVA而未用佐剂通过相同途径进行免疫的对照组，甚至高于用已知佐剂（如霍乱毒素）的对照组。
作为对脾细胞培养物中Ag的应答，Omp16S的鼻腔共同给予诱导了细胞因子的产生。结果表明，作为对抗原OVA的应答，相对于对照动物（OVA），来自用OVA+Omp16S经鼻腔免疫的动物的脾细胞产生了更高水平的IFN-γ（图11A）。在用OVA刺激的脾细胞的培养物上清液中，相对于用OVA+Omp16S免疫的组，通过鼻腔途径共同给予TC诱导了较低水平的IFN-γ。相反，在任何研究组的脾细胞中用OVA刺激不会诱导应答抗原的IL-4的分泌（图11B）。
至于IL-10，相对于阴性对照，仅在用OVA+TC免疫的组中检测到了轻微的增高（图11C）。因此，将Omp16S作为佐剂通过鼻腔途径给予引起了Th1型应答。
在用OVA+Omp16S通过鼻腔途径免疫的小鼠中，在最后一次免疫3周后，抗OVA的产IFN-γ的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的百分比均增高。这一产生高于用OVA而未用佐剂通过相同的途径进行免疫的对照组，甚至高于对照组OVA+TC（图12A和图12B）。
用Omp16S作为鼻腔佐剂进行免疫诱导了产IFN-γ的抗原特异性CD4+T细胞的产生（0.97%），而以TC作为佐剂进行免疫的组比起用OVA而未用佐剂进行免疫的组所诱导的产生并没有不同（OVA+TC 0.28%vsOVA 0.23%）。然而，CD8+T淋巴细胞中的诱导甚至更高。相对于用OVA进行免疫的组（0.47%）或用OVA+TC进行免疫的组（0.22%），在OVA+Omp16S组中可观察到显著的增高（1.08%）（图12A和图12B）。最终，这些结果表明，Omp16S作为鼻腔佐剂诱导了对抗原（OVA）进 行应答的产IFN-γ的记忆性CD4+T细胞和CD8+T细胞的产生。
使用Omp19S和Omp16S作为佐剂通过鼻腔途径诱导了：(i)作为对抗原的应答的Th1细胞因子的释放；和(ii)产IFN-γ的抗原特异性的记忆性CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。
这些产IFN-γ的T细胞对于产生针对感染(所述感染由在其生命周期中具有胞内期(或者当病原体被巨噬细胞内化时)的病原体(如病毒、细菌、寄生虫和真菌)造成)或肿瘤的有效免疫应答来说是不可缺少的。本发明的佐剂诱导T淋巴细胞产生该细胞因子的事实对于开发针对该类疾病的疫苗可能是有益的。
总体上，这些结果显示出，将Omp19S或者Omp16S作为佐剂通过口腔或者鼻腔途径给予诱导了记忆性CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞(所述T淋巴细胞在遇到其特异性的Ag时将产生IFN-γ)的产生，这对于粘膜佐剂或免疫调节剂来说是非常相关的性质。
使用胃肠外Omp19S或Omp16S进行的分析：
对体液应答进行研究，当与Omp19S共免疫时，对针对OVA的总IgG免疫球蛋白的滴度和经诱导的同种型谱(IgG1和IgG2a)进行测定，并将其与生理溶液(SF)中的OVA或CFA中的OVA的免疫进行比较。通过间接ELISA对不同组在最后一次免疫3周后得到的动物血清中的总IgG滴度进行测定。所得结果显示出，相对于用OVA而未用佐剂进行的免疫，特异性抗体没有显著的增高(图13)，这表明Omp19S对所触发的体液应答的强度没有影响，而用阳性对照完全弗氏佐剂(CFA)进行的免疫不出所料地引起了特异性抗体产生的增高。Omp19S作为佐剂对体液应答的强度没有影响。
当对经免疫动物中的抗OVA IgG同种型谱进行分析时，可明白的是，单用OVA接种或使用CFA作为佐剂诱导了强优势的IgG1抗体，而使用Omp19S作为佐剂时，并未出现这一情况(IgG1/IgG2a的比例接近于1)(图14)。已知Th1型免疫应答与相对于IgG1而言的IgG2a抗体优势有关，而就Th2应答而言，这一比例是颠倒的(Crameri和Rhyner，Novel vaccines and adjuvants for allergen-specific immunotherapy，Curr Opin Immunol.18(6)：761-8，2006)。
因此，尽管以Omp19S作为佐剂进行的免疫似乎对体液应答的强度没有影响，但是该免疫对经诱导的特异性同种型谱有影响，观察到IgG1/IgG2a比例的降低，这与表征Th2应答的IgG1抗体的减少有关。IgG1优势的这一转变显示出，当使用Omp19S作为佐剂时，通过用OVA进行的免疫引起了Th2型抗体的产生减少，这些结果表明，可将本发明佐剂用来使Th2型淋巴细胞应答转换至Th1型应答，通过将Th2变应原特异性应答转换至Th1调节性应答，这一作用可用于转变与过敏性过程有关的条件。
对用OVA连同Omp19S或OVA连同CFA经皮下对BALB/c小鼠接种时引起的局部反应进行分析。根据皮下组织的肉眼改变确定局部毒性。考虑到与未注射区相比，在组织中没有观察到改变，在接种了Omp19S和OVA抗原的动物中，在给予部位没有组织毒性迹象(signs)。
在接种了完全弗氏佐剂的动物中，接种部位存在着肉芽肿反应，这是由作为使用该佐剂的特征的巨噬细胞肉芽肿的形成得出的(图15)。CFA具有贮存型(depot-type)作用机制，使抗原在注射部位不溶解，这有利于巨噬细胞和其它细胞的积聚，形成佐证毒性迹象的特征性巨噬细胞肉芽肿。用于所有免疫中的Omp19S制剂是可溶的，因此，它不会引起肉芽肿的形成，这显示了不同于CFA的作用机制。以Omp19S作为佐剂进行的免疫在皮下组织中不会引起不良的局部反应。
为了对体内T细胞应答进行分析，在用如下物质经皮下免疫的小鼠中对通过OVA注射诱导的DTH应答进行评价：(i)OVA；(ii)OVA+Omp19S；(iii)OVA+Omp16S；(iv)OVA+CFA；或(v)生理溶液(SF)。为此目的，将OVA(20μg)注射入经免疫小鼠的一条腿的爪垫中，并将SF注射入另一条腿的爪垫中作为对照。在OVA注射48h和72h后，相对于用OVA而未用佐剂进行免疫的动物，用OVA+Omp19S或OVA+Omp16S免疫的动物的爪垫皮肤表现出增厚(图16)。总体上，这些结果显示出Omp19S和Omp16S能够诱导类似于用实验上已知的佐剂(如CFA)产生的体内T细胞应答，而且这种强力佐剂没有显示出不良作用。
为了对所诱导的细胞免疫应答进行评价，对来源于动物的脾细胞的体外增殖能力(作为对抗原的应答)进行测定。在不同浓度的OVA或完全培养基存在的情况下，对脾细胞进行培养。5天后，给予18h的3H-胸苷脉冲并对所引入的放射性进行测定。结果显示出，与来自仅用OVA免疫的动物的增殖应答相比，共同给予OVA和Omp19S引起来自这些小鼠的细胞的增殖应答增高(图17)。用ConA(结果未示出)和阳性对照(CFA)进行的刺激均引起细胞增殖显著的增高。这些结果表明使用Omp19S作为佐剂对产生有效的适应性应答有作用，所述作用通过特异性T细胞增殖能力的增高得以证明。
为了确定通过Omp19S作为佐剂经胃肠外给予而诱导的抗OVA辅助性T细胞(Th)应答的类型，在不同浓度的OVA或完全培养基存在的情况下，将来自经免疫小鼠的脾细胞培养72h，然后，在这些细胞的上清液中对所分泌的细胞因子的种类进行分析。使用特异性单克隆抗体进行捕获ELISA，以检测经刺激的脾细胞和对照脾细胞的培养物上清液中的IFN-γ、IL-10、IL-4和IL-17。
结果表明，相对于对照动物(SF)和用OVA而未用佐剂进行免疫的动物，用OVA+Omp19S免疫的动物的细胞分泌了相当大量的IFN-γ(图18)，并且这一细胞因子的分泌是抗原特异性和剂量依赖性的。阳性对照(CFA)也诱导了这一细胞因子的产生水平。Omp19S作为胃肠外佐剂引起了Th1型应答。
与之相反的是，所产生的IL-4的水平显示出在不同组中没有显著差异；尽管与SF组细胞相比，在对OVA刺激的应答中存在着这类细胞因子的增高，但在仅用OVA、用OVA+Omp19S和用OVA+CFA接种的动物中水平相仿(图19A)。类似地，尽管在任何情况下相对于SF组存在着增高，但不同组间的脾细胞中产生的IL-10没有表现出不同(图19B)。这表明抗原特异性的IL-4和IL-10的产生并不是由佐剂引起的，而是该抗原的表征。用丝裂原对照(ConA)进行刺激产生了显著水平的所有分析中的细胞因子。基于这些结果，所示细胞因子种类表明通过以Omp19S作为佐剂进行免疫触发的应答对应于Th1谱，IFN-γ而非IL-4和IL-10的产生增高。
产IFN-γ的抗原特异性T细胞对于产生针对病原体(所述病原体在其生命周期中具有特定的胞内期(或者当该病原体被巨噬细胞内化时)，如病毒、细菌、寄生虫和真菌)感染或肿瘤的有效免疫应答来说是不可缺少的。该佐剂诱导T淋巴细胞产生这些细胞因子的事实对于开发针对该类疾病的疫苗可能是有益的。由于本发明的佐剂诱导Th1应答，可将它们用于针对该类病原体的疫苗制剂中。
在对Th1和Th2淋巴细胞的应答进行分析并进一步对免疫应答的类型进行表征后，对Th17细胞群在所触发的应答中的贡献进行评价。出于该目的，测定了在培养物上清液中的对刺激物进行应答中产生的IL-17的水平(图20)。结果表明，在用Omp19S+OVA进行免疫后，用该抗原进行体外刺激引起了剂量依赖性的Th17应答。
对正常动物中CD8+T细胞的免疫应答进行的分析受到了对特定表位进行应答的该类细胞的频率较低的限制。T细胞受体的转基因小鼠已被实验性地用作具有规定的特异性的T细胞的来源。最广泛使用的模型之一是OT-1转基因小鼠，其中，CD8+T细胞表达针对存在于MHC I共刺激分子(H-2Kb)中的OVA SIINFEKL肽的特异性T受体(Harmala，Ingulli，Curtsinger，Lucido，Schmidt，Weigel，Blazar，Mescher和Pennell，The adjuvant effects of Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70result from the rapid and prolonged activation of antigen-specific CD8+T cells in vivo，J Immunol.169(10)：5622-9，2002)。
将这类小鼠用于针对抗原的CD8+适应性T细胞免疫应答的体内分析。
为了对在存在或不存在本发明佐剂的情况下的特异性CD8+T细胞应答进行表征，将CFSE染色的来自于OT-1小鼠的脾脏细胞和淋巴结细胞经静脉内过继转移入C57BL/6小鼠。在过继转移一天后，用OVA联合佐剂Omp19S、Omp19S PK(用蛋白酶K处理过的Omp19S)、脂多糖(LPS)或SF经s.c.对小鼠进行接种。5天后，通过流式细胞术对经免疫的小鼠的脾和引流淋巴结中标记有CFSE的OT-1细胞的数目进行分析。
在用SF接种的对照动物中，观察到了用CFSE染色的特异性CD8+ 细胞的较低百分比的细胞分裂。与用OVA而未用佐剂免疫的小鼠相比，在脾脏(图21)和淋巴结中(图21)，用OVA+Omp19S佐剂免疫的动物均显示出较高比例的经历过一次以上分裂的细胞。
对于脾脏，用SF免疫的组显示出21.79％的增殖值，而在用无佐剂的OVA免疫的组中，分裂过的细胞的百分比(75.01％)比起在用Omp19S作为佐剂免疫的小鼠的组中的百分比(86.44％)要低。对于引流淋巴结细胞发现了类似的结果。为了控制所述应答由佐剂有效引起、而非由某些非蛋白污染物(如LPS)引起，用降解形式的佐剂对动物进行免疫。观察到用经蛋白酶K降解的佐剂进行免疫所诱导的增殖水平类似于用OVA而未用任何佐剂接种的水平。来自用阳性对照(LPS)免疫的动物的OT-1细胞显示出类似于用Omp19S作为佐剂免疫的组中的增殖水平。
这些结果表明，用Omp19S作为佐剂进行免疫诱导了增高的OVA-特异性CD8+T细胞的活化，由此增高了它们的增殖能力，表明引起了针对抗原的有效的CD8+适应性免疫T细胞应答。
在观察到存在着由本发明佐剂诱导的有效的抗原特异性CD8+T细胞应答后，对这些CD8+细胞是否能够诱导显著性水平的IFN-γ(辅助性T细胞1型应答的表征)进行了评价。出于该目的，用如下物质经s.c.途径对C57BL/6小鼠进行免疫：(i)OVA；(ii)OVA+Omp19S；或(iii)OVA+Omp19S PK。七天后，将脾脏从动物中移出。用培养基、500μg/mLOVA+5μg/mL SIINFEKL肽+APC MO5或Pma-离子霉素对脾细胞进行刺激，通过流式细胞术对产生的胞内IFN-γ进行测定。
相比于来自仅用OVA免疫的动物的细胞(其中，产IFN-γ的CD8+细胞的频率(0.14％)类似于同种型对照)，在以Omp19S作为OVA佐剂进行免疫并用OVA在体外刺激的小鼠体内的产IFN-γ的CD8+T细胞群更多(0.73％)。这些结果表明，用作佐剂的该多肽诱导了在对抗原刺激的应答中能够产生IFN-γ的CD8+T细胞的分化(图22)。事实上，观察到了用降解的蛋白(Omp19S PK)对小鼠进行免疫时，表达这类细胞因子的细胞的频率(0.15％)类似于来自用OVA而未用佐剂免疫的组的细胞的频率；这一结果证实了佐剂的作用源自于佐剂多肽。在所有情况下，同种型对照显示出了类似值。
这些结果表明，Omp19S能够诱导对抗原进行应答的分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞的产生。这些产IFN-γ的CD8+T细胞对于产生针对感染（所述感染由在其生命周期中具有一定胞内期的病原体（如病毒、细菌、寄生虫和真菌）造成）或肿瘤的有效免疫应答来说是不可缺少的。该佐剂诱导T淋巴细胞产生这类细胞因子的事实对开发针对该类疾病的疫苗可能是有益的。
由于在用本发明佐剂免疫的小鼠中观察到了对OVA抗原进行应答的CD8+细胞的活化和IFN-γ的产生，进一步研究了在用本发明佐剂对动物进行免疫后是否诱导了Ag特异性的细胞毒细胞。出于该目的，经s.c途径对C57BL/6小鼠进行免疫，3周以后进行体外细胞毒分析，其中，靶细胞（表达OVA的MO5或者不表达OVA的B16）用51Cr进行标记，然后与来自经免疫小鼠的脾细胞（效应细胞）孵育。在上清液中测定由靶细胞释放的51Cr。如图23中所示，相比于来自用OVA而未用佐剂免疫的组中的细胞，来自用Omp19S或Omp16S作为佐剂免疫的动物的脾细胞诱导了更高百分比的裂解。将完全弗氏佐剂（CFA）用作阳性对照。比起由佐剂CFA诱导的应答，Omp19S和Omp16S作为佐剂在来自经免疫小鼠的脾细胞中诱导了更强的细胞毒应答，并且在经过免疫的组织中无改变迹象，也未发现其它不良作用。
已经证明可将Omp19S和Omp16S多肽用于含有任何免疫原或抗原的疫苗配方中，其中，佐剂至少为Omp19S和/或Omp16S。本发明的多肽是产生Th1和细胞毒应答的有用佐剂，所述应答通过将所述多肽经鼻腔和经口腔使用而在粘膜中产生、或将所述多肽经胃肠外给予后在全身性途径中产生。
T细胞免疫应答被认为是可以抵御病原体和肿瘤的。当通过胃肠外和粘膜（鼻腔和口腔）途径给予时，本发明佐剂诱导了产IFN-γ的T细胞应答，并因此可被用于针对感染或肿瘤的疫苗制剂中，所述感染通过在其生命周期中具有胞内期（或者当该病原体被巨噬细胞内化时）的病原体（如病毒、细菌、寄生虫和真菌）造成。本发明佐剂还诱导了针对表达抗原的肿瘤细胞系（MO5）的细胞毒性，并因此可被用于针对肿瘤的疫苗中。
同时，由于Th1细胞因子通常抑制Th2细胞因子，意欲诱导针对抗过敏疫苗中的变应原的Th1应答，从而将变应原特异性Th2应答转换至调节性Th1应答。可将本发明佐剂用于调节对变应原的应答。
最近的证据已经证实了产生IL-17的T细胞在疫苗诱导的对胞内和胞外病原体的感染的防护作用中的关键角色。已经报道了针对百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的疫苗产生的Th1和Th17应答，其中，Th17细胞群对防护作用的有效性很重要。还显示出IL-17在对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的防护作用中扮演重要角色。针对诱导Th17细胞活化的疫苗的效力所提出的机制是通过对趋化因子进行调节。从这个意义上讲，使用能够诱导这一细胞因子产生的佐剂在针对该类病原体的疫苗中将会有益。
最后，可将本发明的佐剂用作涉及免疫应答的各种病理学中的免疫应答的激活剂或免疫调节剂。
如图24中所示，考虑到α4β7的表达将淋巴细胞引导至效应粘膜部位(肠固有层)，这些结果显示出，在疫苗配方中将Omp19S作为破伤风类毒素(TT)的佐剂经口腔给予，诱导了CD4+效应T淋巴细胞和CD8+效应T淋巴细胞迁移至肠粘膜(小肠固有层)。
Omp16S和Omp19S佐剂多肽也可作为DNA或RNA载体给予，从而原位表达。如图25中所示，在分别用pCI-Omp16S或pCI-Omp19S质粒对真核细胞进行转染后，Omp16和Omp19蛋白得以正确地表达。这一结果表明可通过真核细胞生产这类蛋白，将表达载体给予至真核细胞或更高等的生物体(脊椎动物或者哺乳动物)以使佐剂原位表达并发挥其作用。
进一步对本发明的佐剂发挥作用的机制进行表征，在将胃提取物上清液与Omp19S多肽共孵育，然后加入100μL NaHCO3缓冲液中的BODIPY FL酪蛋白或BODIPY FL OVA(分子内标记的抗原，从而使它们在未降解时不发荧光，而降解时开始发荧光)的情况下进行分析。观察到了多肽Omp19S的存在减少了抗原的降解，与使用哺乳动物蛋白酶 抑制剂混合物(作为胃酶活性可被抑制的对照)时观察到的作用类似。如上所述，观察到了本发明佐剂的作用进一步包括抑制蛋白酶作用的机制，由此使得抗原半衰期延长(图26)。
这些结果表明，使用Omp19S佐剂进行免疫，除诱导了较高的免疫应答外，还减少了抗原降解，从而使疫苗中所给予的用以刺激并维持免疫应答的Ag量可得以减少。
用于分析本发明佐剂多肽的蛋白酶抑制作用的额外实验的目的在于对如下方面进行评价，而不对本发明的范围加以限制：Omp19S多肽是否能够抑制来自BALB/c小鼠的胃的蛋白酶对不同抗原的降解，所述抗原为真核抗原(BSA、OVA)和细菌性抗原(BLS、SurA、DnaK)。将各抗原用如下物质进行处理：(i)胃提取物上清液；(ii)胃提取物上清液和Omp19S；(iii)胃提取物上清液和哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(作为胃酶活性可被抑制的对照)。使这些反应混合物经历十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和随后的考马斯蓝染色(图27)。这些分析证实了本发明的佐剂多肽具有对来自真核和细菌来源的抗原降解的抑制活性。
为了对抑制胃蛋白酶降解抗原的作用进行测试，使用BODIPY FL酪蛋白作为模式抗原进行体内分析。用如下物质对BALB/c小鼠进行接种：(i)NaHCO3缓冲液(1M，pH8)(溶媒)；(ii)BODIPY FL酪蛋白和Omp19S；(iii)BODIPY FL酪蛋白和抑肽酶(已知的蛋白酶抑制剂)；(iv)BODIPY FL酪蛋白。在反应一段时间后，将小鼠处死并通过荧光发射对提取物进行分析，观察体内抑制胃蛋白酶降解抗原的作用(图28)。
基于对抑制胃蛋白酶降解抗原的能力进行测定的不同分析，观察到了对这类蛋白酶作用的至少30％的抑制效果、优选至少50％的抑制效果。在通过本发明佐剂的作用所抑制的蛋白酶中，有丝氨酸蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶、金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
因为本发明的佐剂多肽抑制蛋白酶降解Ag的能力增加了Ag的半衰期，还改进了对免疫应答的诱导，本发明的佐剂多肽是理想的。这可能意味着诱导相同的免疫应答将需要较小量的Ag，因此降低了疫苗成本。
因此，令人惊讶的是，Omp16S和Omp19S充当了与布鲁氏菌抗原无关的抗原的高效佐剂。
下述实施例更好地示出了本发明，这些实施例不能视为对本发明范围的限制。与此相反，应清楚理解的是，可采用本领域技术人员阅读本申请文件时想到的其它实施方式、变化和等价物，而不会脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围。
实施例
实施例1：流产布鲁氏菌(Brucella abortus)Omp16S和Omp19S多肽的克隆、表达和表征
如以下文献中所述，将无共有脂化序列的Omp19S多肽克隆入在羧基端添加有组氨酸尾的pET22+载体(Novagen，Madison，WI，美国)中：Giambartolomei，Zwerdling，Cassataro，Bruno，Fossati和Philipp，Lipoproteins，not lipopolysaccharide，are the key Mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus，J Immunol.173(7)：4635-42，2004。更详细地，特异性寡聚核苷酸被设计成在5’端含有NdeI和XhoI酶的限制性酶切位点，并且Omp19基因的3’区域没有对应于信号肽序列的氨基末端和氨基末端的半胱氨酸：
Omp19
正义：5’CTGGCCATATGCAGAGCTCCCG3’(SEQ ID No：3)
反义：5’AAACTCGAGGCGCGACAGCGTCAC3’(SEQ ID No：4)
在PCR反应中，将来自流产布鲁氏菌544的基因组DNA用作模板。将连接反应的产物用于转化JM109菌株的感受态细菌，使用商购的试剂盒(Promega)对质粒DNA进行纯化。
用这一构建体对大肠杆菌BL21的感受态细胞(DE3)(Stratagene，La Jolla，CA，美国)进行转化，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。对细菌提取物进行声波处理，使用镍柱(Qiagen，德国)通过亲合层析对蛋白进行纯化，由此得到纯化的非脂化多肽(Omp19S)(SEQ ID No：1)。
如以下文献中所述，将无共有脂化序列的Omp16S多肽克隆入在羧基端添加有组氨酸尾的pET22+载体(Novagen，Madison，WI，美国)中：Giambartolomei等，Lipoproteins，not lipopolysaccharide，are the key Mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus，J Immunol.173(7)：4635-42，2004。更详细地，特异性寡聚核苷酸被设计成在5’端含有NdeI和XhoI酶的限制性酶切位点，并且Omp16基因的3’区域没有对应于信号肽序列的氨基末端和氨基末端的半胱氨酸：
Omp16
正义：5’GTTGCCATATGGCGTCAAAGAA3’(SEQ ID No：5)
反义：5′TTGCCGCTCGAGCCGTCCGGCCCC3’(SEQ ID No：6)
在PCR反应中，将来自流产布鲁氏菌544的基因组DNA用作模板。将连接反应的产物用于转化JM109菌株的感受态细菌，使用商购的试剂盒(Promega)对质粒DNA进行纯化。
用这一构建体对大肠杆菌BL21的感受态细胞(DE3)(Stratagene，La Jolla，CA，美国)进行转化，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。对细菌提取物进行声波处理，使用镍柱(Qiagen，德国)通过亲合层析对蛋白进行纯化，由此得到纯化的非脂化多肽(Omp16S)(SEQ ID No：2)。
使非脂化多肽Omp19S和Omp16S经历十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和随后的考马斯蓝染色，以对各纯化阶段进行监测。使用抗Omp19的单克隆抗体和另外的抗Omp16的单克隆抗体通过Western印迹对Omp19S和Omp16S进行确认。
使用多粘菌素B琼脂糖树脂(Sigma-Aldrich)去除能够污染经纯化多肽的可能的痕量LPS。然后，用Limulus Amebocyte试剂盒(Associates of Cape Cod，Woods Hole，MA)进行分析，以测定其中存在的LPS的量。在本申请描述的所有实验中，使用含有＜0.25U内毒素/μg多肽的经纯化重组多肽的制剂。
以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，使用二辛可宁酸法(Pierce， Rockford，IL）对Omp19S和Omp16S的浓度进行评价。将经纯化的多肽进行等分并储存在-70℃至使用。
实施例2：使用Omp19S和Omp16S作为佐剂的动物免疫分析：
将无LPS的经纯化牛卵清蛋白（OVA）（Sigma-Aldrich）用作模式抗原。
使用BALB/c（H-2d）或C57BL/6（H-2b）品系的6-8周龄雌性小鼠。从Universidad Nacional de La Plata处得到这些小鼠并将它们饲养在Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral（IDEHU）的动物饲养设施中。使它们自由采食食物和水。
进行了三种类型的免疫：口腔、鼻腔和胃肠外。
-口腔免疫：
对于口腔免疫，遵循了两种方案，其中，不同组小鼠的注射程序不同。所分析的两种免疫程序给出了类似的结果。
程序1：
在该第一种程序中，在第0天、第7天、第8天、第14天、第15天和第21天用放入（embedded in）NaHCO3缓冲液（1M，pH8）中的如下物质经口腔对BALB/c小鼠进行6次免疫：（i）100μg OVA；（ii）100μg OVA+100μg Omp19S；（iii）100μg OVA+100μg Omp16S；（iv）100μg OVA+10μg霍乱毒素（CT，Sigma）。在最后一次免疫两周后（第35天），将小鼠处死以对细胞免疫应答进行评价。
程序2：
在第1天、第2天、第3天、第8天、第9天和第10天用放入NaHCO3缓冲液（1M，pH8）中的如下物质经口腔对BALB/c小鼠进行6次免疫： （i）100μg OVA；（ii）100μg OVA+150μg Omp19S；（iii）100μg OVA+150μg Omp16S；（iv）100μg OVA+5μg霍乱毒素（CT，Sigma）。在最后一次免疫一周后（第17天），进行迟发型超敏（DTH）应答测试，在最后一次免疫三周后（第31天），将小鼠处死以对细胞免疫应答进行评价。
-鼻腔免疫：
用如下物质每7天经鼻腔对C57BL/6小鼠进行免疫，共免疫三次：（i）50μg OVA；（ii）50μg OVA+10μg Omp19S；（iii）50μg OVA+10μg Omp16S；（iv）50μg OVA+1μg霍乱毒素（CT，Sigma）。每鼻孔注射12.5μL。在最后一次免疫三周后，将动物处死以对细胞免疫应答进行评价。
通过眼窝后途径将动物放血并将血清储存在-20℃下以用于检测特异性Abs。
-胃肠外免疫：
用如下物质每7天经由皮下（s.c）途径对动物进行免疫，共免疫三次：（i）100μg OVA；（ii）100μg OVA+100μg Omp19S；（iii）100μg OVA+100μL CFA（Sigma-Aldrich）；或（iv）SF。在最后一次免疫三周后，将动物放血以得到血清，将这些动物中的一些（每组5只）处死以对细胞免疫应答进行评价，并使其它动物接受DTH（每组5只）。
实施例3：对Omp19S和Omp16S活性进行评价的测试
迟发型超敏应答（DTH）：
在最后一次免疫七天后，通过皮内途径将20μg OVA接种入小鼠的右爪垫并将生理溶液（SF）接种入左爪垫。在接种48h和72h后，通过使用精确度为0.01mm的数显卡尺测定相比于左爪垫的右爪垫皮肤增厚量来对应答进行评价。
得到小鼠脾细胞：
通过眼窝后静脉丛使乙醚麻醉的小鼠血液流尽，并通过颈椎脱位将小鼠处死。进行适当的剖腹术，打开腹膜腔，以将脾由腹中取出，在无菌条件下用镊子和剪刀将脾取出。使用弯头剪(curved tip scissors)将脾脏捣成小碎片。加入3mL RPMI 1640(Gibco)并将经处理的脾脏均质化，将悬浮液制成8mL，经由钢网过滤以截留细胞和组织碎片。然后，用RPMI 1640对其进行漂洗，并将细胞悬浮于完全培养基中(添加有10％胎牛血清(SFB，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺和丙酮酸盐、25mM HEPES、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640)。
得到来自小鼠肠系膜淋巴结的淋巴细胞：
通过眼窝后静脉丛使乙醚麻醉的小鼠血液流尽，并通过颈椎脱位将小鼠处死。进行适当的剖腹术，打开腹膜腔，以将肠系膜淋巴结由腹中取出，在无菌条件下用镊子和剪刀将肠系膜淋巴结取出。然后将肠系膜淋巴结与胶原酶(2.5mg/mL)孵育30min。然后去除胶原酶并使用弯头剪将淋巴结捣成小碎片。在加入3mL RPMI 1640(Gibco)后，将细胞悬液进行均质化，将悬浮液制成8mL，经由钢网过滤以截留细胞和组织碎片。然后，用RPMI 1640对其进行漂洗，并将细胞重悬于完全培养基中(添加有10％胎牛血清(SFB，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺和丙酮酸盐、25mM HEPES、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640)。
活细胞计数：
为测定活细胞的数目，使用了台盼蓝拒染法。在PBS中制备0.2％台盼蓝溶液。取出50μL待计数的悬浮液并加入50μL台盼蓝溶液。将上述溶液装入Neubauer计数池中，通过光学显微镜确定活细胞数目。
细胞刺激：
在OVA(100μg/mL和1000μg/mL)、完全培养基或对照丝裂原(刀豆蛋白A，5μg/mL)存在的情况下，将来自经免疫小鼠的脾细胞(4×106个细胞/mL)在48孔培养板中培养。对于使用来自BALB/c小鼠的细胞的实验，在温箱中于37℃、5％CO2气氛下培养72h，对于使用来自C57BL/6小鼠的细胞的实验，培养5天。利用来自这些细胞的上清液，通过ELISA对所分泌的细胞因子进行测定。
用于检测细胞因子的捕获ELISA：
使用特异性的单克隆Abs进行捕获ELISA，以检测经刺激的脾细胞 和对照脾细胞的培养物上清液中的IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4(OptEIATM，PharMingen，San Diego，美国)和IL-17(Mouse IL-17Quantikine，R&D Systems公司，Minneapolis，美国)。根据制造商说明书完成上述方案。
体外增殖分析：
在OVA(100μg/mL和1000μg/mL)、完全培养基或对照丝裂原(刀豆蛋白A，5μg/mL)存在的情况下，将来自经免疫小鼠的脾细胞(2×105个细胞/mL)以三个重复的方式在96孔培养板中进行培养。在温箱中于37℃、5％CO2气氛下进行培养。5天后，施加氚标记的胸苷脉冲(1μCi/孔)，18h后收集细胞，用β计数器对引入的放射性胸苷进行测定(表示为计数/分钟：cpm)。将结果表示为刺激指数SI(cpm OVA/cpm RPMI)。当SI＞2时，认为显著。
CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中的胞内IFN-γ的测定
-抗原提呈细胞(APC)MO5和A20J
使A20J细胞(小鼠B淋巴瘤，和BALB/c同系基因型，ATCC TIB208)在完全培养基(添加有10％胎牛血清(SFB，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺和丙酮酸盐、25mM HEPES、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640)中生长两天。在试验前一天，用10μg/mL OVA对这些细胞进行刺激，下文中称为A20JOVA。类似地，使MO5细胞(与C57BL/6为同系基因型的B16黑色素瘤细胞，并稳定地转染有OVA表达质粒)在补充有1mg/mL遗传霉素的完全培养基中生长以将它们用作OVA提呈细胞。
显微术显示出细胞的状态和数目是最适合使用的。将这些细胞用丝裂霉素C(25μg/mL，Sigma)于37℃下处理30min，用RPMI漂洗三次并悬浮于完全培养基中。
-来自小鼠脾脏的脾细胞
在T25瓶中，在完全培养基中培养来自各免疫组的混合的小鼠脾细胞。第二天，将它们在6孔培养板中以8×106个细胞/mL在1mL补充有重组IL-2(10U/mL)的完全培养基中培养。随后，加入下文所列的刺激物(stimuli)。
-刺激物
对于各组经免疫的小鼠，进行下述刺激：
(a)阴性对照：添加有小鼠重组IL-2(10U/mL)(PeproTech.Inc.，Rocky Hill，美国)的完全培养基；
(b)抗原刺激物；
i-就BALB/c动物而言，使用OVA(500μg/mL)+MHC II类限制性OVA肽OVA323-339 KISQAVHAAHAEINEAGOVA(1μg/mL)+用丝裂霉素处理过的A20JOVA(以25个脾细胞：1个APC的比例)，将所有上述物质悬浮于1mL补充有重组IL-2的完全培养基中。
ii-就C57BL/6动物而言，使用OVA(500μg/mL)+MHC-I类限制性OVA肽OVA257-264 SIINFEKL(0.5μg/mL)+MO5提呈细胞(以25个脾细胞：1个APC的比例)，将上述所有物质悬浮于1mL补充有重组IL-2的完全培养基中。
(c)阳性对照，促有丝分裂刺激。PMA 20ng/mL+Iono 0.75μg/mL，将二者悬浮于1mL补充有IL-2的完全培养基中。
在用不同的刺激物孵育18h后，向各孔刺激物中加入10μg/mL布雷菲德菌素A(Sigma)并再孵育6h。然后收集脾细胞，并将其分成两管(1管用于同种型对照，1管用于IFN-γ染色)以用于随后用抗体染色以进行血细胞计数测试。
-细胞亚型和IFN-γ染色
将标记有PE-Cy5.5的特异性抗CD4小鼠单克隆Abs和标记有Alexa Fluor 647的抗CD8小鼠Ab(BD Biosciences，San Jose，加利福尼亚)在4℃下与经刺激的脾细胞和对照脾细胞孵育30min。然后，将细胞用PBS进行漂洗，随后通过用4％多聚甲醛溶液于室温下处理20min来进行固定。在用PBS漂洗后，通过用破膜缓冲液(处于PBS中的2％皂苷、10％SFB)处理30min使细胞破膜。将由此破膜的细胞在600g下离心5min，并用标记有PE的特异性抗小鼠IFN-γAb处理30min。对于所有的处理，平行进行以下标记：将标记有相同荧光染料、但不具有相关特异 性的Abs作为同种型对照。在漂洗后，将细胞悬浮于PBS中，最后使用流式细胞仪(BD FACSCalibur)和FlowJo软件(版本5.7.2)进行分析。
对肠系膜淋巴结淋巴细胞上的α4β7蛋白进行测定：
根据上述方案得到来自肠系膜淋巴结的细胞后，根据免疫组组装细胞池。从各池中取出2×106个细胞，并用标记有FITC的抗小鼠CD4、标记有PE-Cy5.5的抗小鼠CD8和标记有PE的抗小鼠α4β7抗体(BD Biosciences，San Jose，加利福尼亚)进行处理。随后，将细胞固定于100μL 4％多聚甲醛中，然后通过流式细胞仪(FACSCalibur BD)和FlowJo软件(版本5.7.2)进行分析。
用于检测特异性Abs的间接酶联免疫吸附分析(ELISA)：
为进行ELISA，使用聚苯乙烯培养板(Maxisorp，NUNC，丹麦)。将培养板用1μgOVA/孔进行包被并用200μL处于PBS缓冲液中的3％脱脂奶(Molico)进行封闭。然后，将培养板用系列(serial)稀释的血清进行孵育，用缀合有HRP的抗小鼠IgG进行显色。为测定具体的同种型，将培养板用小鼠Ig同种型(IgG1和IgG2a)的缀合有HRP的特异性抗体(Santa Cruz)进行孵育。于室温下孵育1h。将处于PBS中的1％脱脂奶粉、0.05％Tween用作血清和缀合物的稀释剂。在各孵育步骤后，将培养板用0.05％PBS-Tween漂洗三次。用处于0.1M磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中的2mg/mL邻苯二胺和0.03％H2O2对ELISA进行显色。在孵育了15-30min时，用50mL H2SO4(4N)终止反应。在微板读数仪Metertech∑960中于492nm下测定所显色的光密度。为测定抗体滴度，对来自正常小鼠的稀释度为1/100的20份血清进行测试，将临界值(cut-off value)规定为所述血清样本吸光度的平均值加上三倍标准差。将抗体滴度计算为高于所述临界值的最终稀释度。
细胞毒性分析
靶细胞：
将MO5细胞(与C57BL/6为同系基因型的B16黑色素瘤细胞，并稳定地转染有OVA表达质粒)用作靶细胞，在补充有1mg/mL遗传霉素的完全培养基中培养。将B16细胞用作对照(未用OVA质粒转染的黑色 素瘤细胞)。
刺激细胞(Stimulator cells)：
将MO5细胞用作刺激细胞，在补充有1mg/mL遗传霉素的完全培养基中培养，该细胞用10μg OVA预孵育18h，然后用丝裂霉素C(25μg/mL)在37℃下处理30min，用RPMI漂洗23次并悬浮于完全培养基中。
效应细胞：
来自经免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞为效应细胞(总细胞数2.5×107个)，在添加有10U/mL重组IL-2的完全培养基中，用所述刺激细胞(0.5×106个细胞)预先刺激5天。
对靶细胞进行标记：
将处于水溶液中的放射性铬酸钠(51Cr，Amersham Biosciences)以0.1mCi/1×106个细胞的比率在37℃下于水浴中与靶细胞孵育1h，然后用RPMI漂洗三次。
分析：
使靶细胞与不同量的效应细胞(比例为100∶1、50∶1)在37℃下于温箱中孵育6h。随后，从培养物上清液中取100μL，并通过γ计数器(Clinigamma，LKB，Wallac，Turku，芬兰)对放射性进行定量。将所得的结果使用下式转化为裂解％：
其中，
×：样品；
LE：未与效应细胞孵育时靶细胞的自发释放；
max：对与1％Triton X-100孵育的靶细胞进行测定的最大释放。
实施例4：显示转基因小鼠中Omp19S佐剂活性的实验：
将OT-1品系小鼠用作抗原特异性CD8+T细胞的供体，该小鼠的CD8+T细胞表达卵清蛋白(OVA)肽SIINFEKL的特异性T细胞受体。 这些小鼠购自Jackson Laboratory，并由慷慨提供这一品系小鼠的Fernando Goldbaum博士带回国。将在Universidad Nacional de La Plata处得到的同系基因型的C57BL/6小鼠用作来自OT-1动物的细胞的受体。所有小鼠自由采食水和食物，并在无病原体的条件下进行饲养。
如实施例1中所述，将经纯化且无LPS的卵清蛋白(OVA)(Sigma-Aldrich)用作模式抗原。在全部所述实验中，使用含有＜0.25U内毒素/mg多肽的经纯化的重组多肽的制剂。
在某些实验中，将用蛋白酶K消化的多肽作为对照。为此目的，按照制造商的说明书，将Omp19S在37℃下用来自白色念球菌(tricirachium album)的蛋白酶K-琼脂糖(Sigma Aldrich)处理2h。然后，将树脂离心，并将上清液在60℃下孵育1h以使任何可能已经溶解的痕量酶失活。然后，使用SDS-PAGE和随后的考马斯蓝染色对消化作用进行检验。将由此处理的多肽(Omp19S PK)用作具有由所述多肽诱导的佐剂作用的对照。
OT-1小鼠细胞的过继转移和免疫：
从OT-1小鼠的脾脏和淋巴结处得到OVA特异性CD8+T细胞，将得到的细胞用小鼠CD8+T淋巴细胞富集试剂盒(BD Imag)通过阴性选择进行纯化，然后用5μM CFSE在37℃下染色15min。通过加入磷酸盐缓冲液盐水(PBS)(10％SFB)，冷却游离的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Molecular Probes)。随后，将经标记的细胞用PBS漂洗，并重悬为0.1mL体积。然后，将所述细胞经静脉内(i.v.)注射入动物的侧尾静脉中。一天后，用如下物质经皮下(s.c.)对动物进行接种：(i)OVA60μg；(ii)OVA 60μg+Omp19S 100μg；(iii)OVA 60μg+Omp19S PK 100μg；(iv)OVA+LPS(Sigma Aldrich)10μg作为对照；或(v)PBS。
体内增殖分析：
在免疫5天后，将接受了来自OT-1的细胞的动物处死。将脾脏和引流淋巴结(腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结)取出，通过流式细胞术(BDFACSAriaII)测定标记有CFSE的抗原特异性CD8+T细胞的数目。使用FlowJo软件(版本5.7.2)对结果进行分析。
实施例5：Omp19S作为疫苗配方中的佐剂：
根据下述方案用（i）100 Lf TT（破伤风类毒素）；（ii）100 Lf TT+150μg Omp 19S；或（iii）100 Lf TT+5μg TC经由口腔途径进行6次免疫：
在最后一次免疫3周后将小鼠处死，对肠系膜淋巴结中表达标记物α4β7的T细胞的百分比进行分析。
实施例6：将Omp16S和Omp19S编码基因克隆入真核生物表达载体中：
引物设计：
由Omp16和Omp19的核苷酸序列（Genbank Omp16：登录号L27996；Omp19：登录号L27997）来设计引物寡聚核苷酸。引物含有XhoI和XbaI限制性酶切位点（粗体）。所有的“引物”均添加了用于真核生物中的转录的已知的有效kozak序列（在序列中用下划线标出）。
Omp16S：
“正义”：5’CTC CTC GAG ACC ACC ATG GCG TCA AAG AA 3’（SEQ ID No:7）
“反义”：5’TTG TCT AGA TTA CCG TCC GGC CCC GTT GA 3’（SEQ ID No:8）
Omp19S：
“正义”：5’GGC ATT CTC GAG ACC ACC ATG CAG AGC TCC 3’（SEQ ID No:9）
“反义”：5’TTT TCT AGA TCA GCG CGA CAG CGT CAC 3’（SEQ ID No:10）
克隆：
使用具有55℃退火温度的相应引物、以布鲁氏菌基因组DNA作为模板通过聚合酶链式反应（PCR）对感兴趣的基因进行扩增。将载体pCI-Neo（Promega）用于Omp16S和Omp19S的克隆。用XhoI和XbaI消化该载体，然后通过苯酚:氯仿法进行纯化。将PCR扩增产物用相应的限制性酶进行消化。将所有PCR扩增产物通过Wizard PCR Preps(Promega，Madison，WI，美国)进行再纯化。在DNA T4连接酶(Promega)、1μL经消化的质粒(pCI)和2μL相应的经消化的插入片段存在的情况下，在4℃下使连接反应过夜进行。然后，使用CaCl2法，用5μL连接反应产物转化JM109大肠杆菌感受态细胞(Promega)。使转化后的细菌在37℃下于具有氨苄青霉素(25μg/mL)的LB培养板中生长，对其进行挑选。为了确认包含具有合适插入片段的质粒的菌落，使用“菌落PCR”法进行筛选。
体外表达：
COS-7细胞的瞬时转染
为了评价上述质粒在真核生物细胞中的体外表达，使用脂质体法，根据制造商的方案，用2μg下述构建体和20μL Lipofectamine(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，美国)对COS-7细胞(ATCC，CRL1651，Rockville，MD，美国)进行转染：pCI-Omp16S、pCI-Omp19S、或pCI载体(作为对照)。
Omp16S和Omp19S在COS-7细胞中的表达
在转染24h和48h后，在总蛋白提取物中对质粒的表达(瞬时表达)进行评价。通过使用不同单克隆抗体(抗Omp16或抗Omp19)进行Western印迹并使用化学发光ECL试剂盒(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)进行显色来分析所述表达。
实施例7：对胃酶活性的体外抑制
荧光法分析：
底物：
将BODIPY FL牛卵清蛋白(OVA)和BODIPY FL酪蛋白用作模式抗原。这两种抗原均被分子内标记，从而使它们在未降解时不发荧光，而在降解时发荧光( 蛋白酶分析试剂盒*绿色荧光*，Molecular Probes)。
使用6-8周龄的BALB/c(H-2d)品系雌性小鼠。这些小鼠从 Universidad Nacional de La Plata的动物饲养所处得到，并将这些小鼠在Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral(IDEHU)的动物饲养所中饲养。这些小鼠自由采食水和食物。
小鼠胃的获得
通过颈椎脱位将小鼠处死。进行合适的剖腹术，打开腹膜腔，从而在无菌条件下用镊子和剪刀将胃由腹中取出。
小鼠胃的处理
首先用夹钳和剪刀将胃剪碎，并将所得部分转移至陶器(potter)并放入NaHCO3缓冲液(1M，pH8)中以完全分散。将得到的提取物在10,000×g下离心，并将上清液用于进行检测。
分析：
阴性对照：处于NaHCO3缓冲液(1M，pH8)中的BODIPY FL酪蛋白或BODIPY FL OVA(10μg/mL)。
对Omp19S抑制活性的评价：将胃与Omp19S(100μg/mL)共孵育30min，然后用处于100μL NaHCO3缓冲液中的BODIPY FL酪蛋白或BODIPY FL OVA进行孵育。
其它对照：
胃自体荧光：处于100μL NaHCO3缓冲液中的胃。
对胃酶活性可降解酪蛋白或OVA进行的测定：将胃与处于100μLNaHCO3缓冲液中的BODIPY FL酪蛋白或BODIPY FL OVA(10μg/mL)共孵育。
对胃酶活性可被抑制进行的测定：将胃与哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)共孵育30min，然后用处于100μL NaHCO3缓冲液中的BODIPY FL酪蛋白或BODIPY FL OVA(10μg/mL)进行孵育。
阳性对照：处于NaHCO3缓冲液(1M，pH8)中的经蛋白酶K(Sigma)处理的BODIPY FL酪蛋白或BODIPY FL OVA(10μg/mL)。
为了对荧光水平进行评价，将反应混合物转移至96孔黑色/不透明 培养板(低的自体荧光)(Costar)。在MA读板仪(Victor3，Perkin Elmer，Waltham)中对荧光发射进行分析。
实施例8：对胃酶降解不同真核抗原或细菌性抗原的抑制
真核抗原：牛卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)；
细菌性抗原：重组布鲁氏菌2，4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)、重组布鲁氏菌分子伴侣(DnaK)和重组布鲁氏菌肽酰-脯氨酰顺-反异构酶(SurA)。
分析：
制备下述反应混合物并37℃下孵育1h：
(i)5μg各抗原(OVA、BSA、BLS、DnaK或SurA)；
(ii)5μg各抗原(OVA、BSA、BLS、DnaK或SurA)和0.1μg胃提取物上清液；
(iii)5μg各抗原(OVA、BSA、BLS、DnaK或SurA)和0.1μg胃提取物上清液及0.3μg Omp19S；
(iv)5μg各抗原(OVA、BSA、BLS、DnaK或SurA)和0.1μg胃提取物上清液及哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)。
在孵育后，使各反应混合物接受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和随后的考马斯蓝染色。
实施例9：Omp19S的共同给予在体内抑制胃蛋白酶对抗原的降解
将BODIPY FL酪蛋白( 蛋白酶检测试剂盒*绿色荧光*，Molecular probes)用作模式抗原。
使用6-8周龄的BALB/c(H-2d)品系雌性小鼠。这些小鼠从Universidad Nacional de La Plata的动物饲养所处得到，并将这些小鼠在Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral(IDEHU)的动物饲养所中饲养。这些小鼠自由采食水和食物。
通过口腔途径进行下述接种：
(i)溶媒：200μl NaHCO3缓冲液(1M，pH8)；
(ii)100μg BODIPY FL酪蛋白和100μg Ompl9S；
(iii)100μg BODIPY FL酪蛋白和100μg抑肽酶；
(iv)BODIPY FL酪蛋白。
在接种15min后，通过颈椎脱位将小鼠处死，取出胃并进行处理。
将所得的胃提取物上清液转移至96孔黑色/不透明培养板(低的自体荧光)(Costar)。在MA读板仪(Victor3，Perkin Elmer，Waltham)中进行荧光发射。
序列表
<110>CONICET
CONICET，CONICET
<120>用于疫苗的佐剂、包含所述佐剂的疫苗及其用途
<130>CONICET
<160>10
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>157
<212>PRT
<213>流产布鲁氏菌
<400>1
Met Gln Ser Ser Arg Leu Gly Asn Leu Asp Asn Val Ser Pro Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Ala Pro Val Asn Ala Val Pro Ala Gly Thr Val Gln Lys Gly
20 25 30
Asn Leu Asp Ser Pro Thr Gln Phe Pro Asn Ala Pro Ser Thr Asp Met
35 40 45
Ser Ala Gln Ser Gly Thr Gln Val Ala Ser Leu Pro Pro Ala Ser Ala
50 55 60
Pro Asp Leu Thr Pro Gly Ala Val Ala Gly Val Trp Asn Ala Ser Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gln Ser Cys Lys Ile Ala Thr Pro Gln Thr Lys Tyr Gly Gln
85 90 95
Gly Tyr Arg Ala Gly Pro Leu Arg Cys Pro Gly Glu Leu Ala Asn Leu
100 105 110
Ala Ser Trp Ala Val Asn Gly Lys Gln Leu Val Leu Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Gly Gly Thr Val Ala Ser Leu Tyr Ser Ser Gly Gln Gly Arg Phe Asp
130 135 140
Gly Gln Thr Thr Gly Gly Gln Ala Val Thr Leu Ser Arg
145 150 155
<210>2
<211>144
<212>PRT
<213>流产布鲁氏菌
<400>2
Met Ala Ser Lys Lys Asn Leu Pro Asn Asn Ala Gly Asp Leu Gly Leu
l 5 10 15
Gly Ala Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ser Ser Gln Asp Phe Thr Val Asn
20 25 30
Val Gly Asp Arg Ile Phe Phe Asp Leu Asp Ser Ser Leu Ile Arg Ala
35 40 45
Asp Ala Gln Gln Thr Leu Ser Lys Gln Ala Gln Trp Leu Gln Arg Tyr
50 55 60
Pro Gln Tyr Ser Ile Thr Ile Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr
65 70 75 80
Arg Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala Ala Ala Thr Arg
85 90 95
Asp Phe Leu Ala Ser Arg Gly Val Pro Thr Asn Arg Met Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Tyr Gly Asn Glu Arg Pro Val Ala Val Cys Asp Ala Asp Thr Cys
115 120 125
Trp Ser Gln Asn Arg Arg Ala Val Thr Val Leu Asn Gly Ala Gly Arg
130 135 140
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Omp19的正义引物
<400>3
ctggccatat gcagagctcc cg 22
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Omp19的反义引物
<400>4
aaactcgagg cgcgacagcg tcac 24
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Omp16的正义引物
<400>5
gttgccatat ggcgtcaaag aa 22
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Omp16的反义引物
<400>6
ttgccgctcg agccgtccgg cccc 24
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于Omp16真核克隆的正义引物
<400>7
ctcctcgaga ccaccatggc gtcaaagaa 29
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于Omp16真核克隆的反义引物
<400>8
ttgtctagat taccgtccgg ccccgttga 29
<210>9
<211>30
<212>DNA
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<220>
<223>用于Omp19真核克隆的正义引物
<400>9
ggcattctcg agaccaccat gcagagctcc 30
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于Omp19真核克隆的反义引物
<400>10
ttttctagat cagcgcgaca gcgtcac 27
Claims (13)
1.用于疫苗的佐剂，其特征在于，所述佐剂包括布鲁氏菌属细菌的非脂化细菌外膜多肽，所述布鲁氏菌属细菌的非脂化细菌外膜多肽选自非脂化Omp19S多肽或非脂化Omp16S多肽。
2.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述非脂化多肽包括SEQID No:1。
3.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述非脂化多肽包括SEQID No:2。
4.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述疫苗为选自于由粘膜疫苗和胃肠外疫苗组成的组中的疫苗。
5.疫苗，其特征在于，所述疫苗包含至少一种抗原和如权利要求1所述的佐剂，所述佐剂包括布鲁氏菌属细菌的非脂化细菌外膜多肽，所述布鲁氏菌属细菌的非脂化细菌外膜多肽选自非脂化Omp19S多肽或非脂化Omp16S多肽。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述非脂化多肽包括SEQID No:1。
7.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述非脂化多肽包括SEQID No:2。
8.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述抗原为粘膜抗原。
9.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗选自于由粘膜疫苗和胃肠外疫苗所组成的组。
10.如权利要求1所述的佐剂在制备针对病原体的疫苗中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述病原体选自于由病毒、细菌、寄生虫和真菌所组成的组。
12.如权利要求1所述的佐剂在制备抗肿瘤疫苗中的用途。
13.如权利要求1所述的佐剂在制备免疫调节组合物中的用途。
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