BR112012009239B1

BR112012009239B1 - Vacina e usos do adjuvante

Info

Publication number: BR112012009239B1
Application number: BR112012009239-1A
Authority: BR
Inventors: Mirta L. Coria; Andrés E.Ibañez; Guillermo H.Giambartolomei; Juliana Cassataro; Karina A.Pasquevich; Maria Victoria Delpino
Original assignee: Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Conicet); Inis Biotech Llc
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2010-10-18
Publication date: 2021-10-13
Also published as: US20120258145A1; ES2542973T3; EP2491946A1; WO2011048248A1; CN102711815B; CA2778359C; EP2491946B1; AR073907A1; CA2778359A1; MX2012004622A; US9511137B2; CN102711815A; EP2491946A4; DK2491946T3; BR112012009239A2

Abstract

adjuvante para vacinas, vacina, usos do adjuvante, vetores de expressão eucarióticos e células eucarióticas modificadas. adjuvante para vacinas que compreende um polipeptídeo de membrana externa bacteriana não lipidado (omp), no qual a bactérias pode ser do gênero brucella. o adjuvante pode ser um polipeptídeo modificado ou pode ser, por exemplo, o polipeptídeo omp19s ou o polipeptídeo omp16s, partes ou misturas dos dois. em uma modalidade preferida, o adjuvante é o polipeptídeo não lipidado incluído na seq id no: 1, ou partes da mesma. em uma modalidade preferida adicional, o adjuvante é o polipeptídeo não lipidado incluído na seq id no: 2 ou partes do mesmo.

Description

[001] O presente pedido de patente refere-se a um adjuvante para vacinas que compreendem o polipeptídeo de membrana externa bacteriana não lipidada (Omp), em que a bactéria pode ser do gênero Brucella. O adjuvante pode ser um polipeptídeo modificado; este pode ser, por exemplo, o polipeptídeo Omp19S ou partes disso, o polipeptídeo Omp16S ou partes disso, ou misturas de ambos. Em uma realização preferencial, o adjuvante é o polipeptídeo não lipidado que está compreendido em SEQ ID No: 1 ou partes disso. Em outra realização preferencial, o adjuvante é o polipeptídeo não lipidado que está compreendido em SEQ ID No: 2 ou partes disso.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Adjuvantes imunológicos são substâncias que quando incorporadas ao antígeno (Ag) ou administradas simultaneamente com o mesmo, induzem uma imunorresposta mais efetiva contra o antígeno. Estas podem ser usadas para aprimorar a imunorresposta contra um Ag de diversas maneiras: as mesmas podem aprimorar a magnitude da imunorresposta contra um Ag fraco; aumentar a taxa e a duração da imunorresposta, modular avidez de anticorpo (Ab); distribuição de isótipos ou de subclasse; estimular e modular a imunorresposta celular; promover a indução de imunorresposta local (por exemplo, mucosa); diminuir a quantidade de Ag necessário e reduzir o custo da vacina; ou as mesmas podem ajudar a evitar competência de Ag que existe em vacinas combinadas Singh e O’Hagan. Advances in vaccine adjuvants. Nat Biotechnol. 17 (11):1075 a 81. 1999).

[003] Através da história das vacinas, e desde o adjuvante completo de Freund (CFA) com base em uma emulsão micobacteriana com água e óleo, muitas ‘preparações foram testadas com sucesso maior ou menor. O adjuvante mais usado e permitido para uso humano é o alumínio, como sais de hidróxido ou fosfato. Outros adjuvantes consistem de componentes bacterianos tal como endotoxinas, partículas tais como lipossomas, emulsões de óleo tal como saponinas, e outras moléculas diferentes (Petrovsky e Aguilar. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol Cell Biol. 82 (5):488 a 96. 2004). A maioria dos adjuvantes usados historicamente, tal como sais de alumínio, preferencialmente estimular o imunorresposta de tipo 2 auxiliar T (Th) (Liljeqvist e Stahl. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. J Biotechnol. 73 (1):1 a 33. 1999), que aumenta a produção de Abs. No entanto, existem outras vacinas, tal como vacina BCG e adjuvantes que incorporam composto de óleo, que estimulam a imunorresposta de Th1 (Victoratos, Yiangou, Avramidis e Hadjipetrou. Regulation of cytokine gene expression by adjuvants in vivo. Clin Exp Immunol. 109 (3):569 a 78. 1997). A escolha do adjuvante para uma vacina deveria ser cuidadosamente selecionada no futuro, não apenas como uma função da quantidade de resposta, mas também da qualidade da resposta obtida. por outro lado, a metodologia de vacinação usada tradicionalmente (vacina intramuscular ou intradérmica em hidróxido de alumínio) tem sido útil para induzir imunorrespostas humorais sistêmicas mas geralmente falham ao induzir imunorresposta local e celular, tal como na mucosa (Moyle, McGeary, Blanchfield e Toth. Mucosal immunization: adjuvants and delivery systems. Curr Drug Deliv. 1 (4):385 a 96. 2004). Existe uma necessidade maior no projeto de vacinas capazes de induzir imunorrespostas fortes de tipo Th1 celular e célula T citóxica que podem prevenir infecções crônicas virais, infecções relacionadas a patógenos intracelulares ou câncer (vacinas terapêuticas) (Seder e Hill. Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity. Nature. 406 6797):793 a 8. 2000).

[004] Outras considerações importantes, (além de promover uma imunorresposta específica e independente contra o antígeno) estão relacionadas a características importantes para a substância a ser usada na prática clínica. formulações ótimas precisam ser seguras, estáveis, biodegradáveis, inertes e com baixo custo de fabricação. A lista de substâncias que satisfazem todos esses requerimentos é bem pequena, até o momento, os adjuvantes aprovados para o uso em humanos estão restritos a sais de alumínio, MF59 (uma emulsão de óleo em água), MLP (monofosforil-glicolipídeo), partículas virais (HBV e HPV), IRIV (proteolipossoma composto de fosfolipídeos, hemaglutinina do vírus influenza e um antígeno alvo determinado); e a subunidade B da toxina de cólera (Reed, Bertholet, Coler e Friede. New horizons in adjuvants for vaccine development. Trends Immunol. 30 (1):23 a 32. 2009). Os adjuvantes precisam não induzir reações adversas quando usados em vacinas profiláticas, embora certas reações sejam aceitas em vacinas terapêuticas. no campo da saúde veterinária, a eficácia é um elemento de grande importância e certos níveis de efeitos colaterais são tolerados (Sesardic. Regulatory considerations on new adjuvants and delivery systems. Vaccine. 24 Suppl 2 S2-86-7. 2006).

[005] Dado que a entrada principal para a maioria das infecções são as superfícies das mucosas, a capacidade de gerar imunidade de mucosa após a administração de um Ag pode fornecer uma defesa precoce contra esses patógenos. Lamentavelmente, após a administração de Ags pela via oral, existe a degradação no trato gastrointestinal, pouca absorção e baixa eficácia de longo prazo, portanto administrações repetidas e quantidades grandes de Ag são necessárias para estimular e manter a imunorresposta. Adicionalmente, foi observado que a tolerância imunológica aos Ags solúveis administrados através da via oral (Moyle et al. Mucosal immunization: adjuvants and delivery systems. Curr Drug Deliv. 1 (4):385 a 96. 2004). Os adjuvantes orais usados até o momento, tal como toxina de cólera (TC), por exemplo, mostrar sérios riscos após a administração (Fujihashi, Koga, van Ginkel, Hagiwara e McGhee. A dilemma for mucosal vaccination: efficacy versus toxicity using enterotoxin-based adjuvants. Vaccine. 20 (19-20):2431 a 8. 2002), então é muito importante nesse campo desenvolver adjuvantes mais seguros que permitem uma entrega eficiente dos Ags nas superfícies de mucosa, com indução subsequente de imunorresposta na mucosa.

[006] Em nível internacional, a lista de produtos com propriedades adjuvantes é continuamente maior; no entanto, apenas um número reduzido é usado na formulação de vacinas veterinárias e humanas (Aucouturier, Dupuis e Ganne. Adjuvants designed for veterinary and human vaccines. Vaccine. 19 (17- 19):2666-72. 2001; Petrovsky et al. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol Cell Biol. 82 (5):488 a 96. 2004). Por essa razão, é importante desenvolver adjuvantes eficientes que, ao mesmo tempo, sejam seguros para vacinas humanas e animais.

[007] Nos dias de hoje, a maioria dos adjuvantes capazes de induzir respostas de Th1 fortes são aqueles com base em emulsões de óleo, tal como o adjuvante de Freund incompleto (IFA), no entanto, os mesmos conferem reações adversas no sítio de injeção, tal como abscessos estéreis e granulomas. Em luz do disposto acima, o desenvolvimento de adjuvantes parenterais e de mucosa que induzem respostas de Th1 e CTL é altamente relevante.

[008] Na presente invenção, dois novos adjuvantes são fornecidos: Omp16S e Omp19S. Essas substâncias aumentam e/ou modulam as imunorrespostas contra Ags coadministrado, que favorecem o desenvolvimento de imunorrespostas de Th1, Th17 ou de tipo CTL.

BREVE DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[009] Um adjuvante para vacinas que compreende um polipeptídeo de membrana externa bacteriana não lipidada (Omp), em que a bactéria pode ser do gênero Brucella. O adjuvante pode ser um polipeptídeo modificado ou pode ser, por exemplo, o polipeptídeo Omp19S ou partes disso, ou o polipeptídeo Omp16S ou partes disso, ou misturas de ambos. Em uma realização preferencial, o adjuvante é o polipeptídeo não lipidado que está compreendido em SEQ ID No: 1 ou partes disso. Em outra realização preferencial, o adjuvante é o polipeptídeo não lipidado que está compreendido em SEQ ID No: 2 ou partes disso.

[010] É também fornecido neste uma vacina que compreende o adjuvante, pelo menos um polipeptídeo de membrana externa bacteriana não lipidado (Omp), e pelo menos um antígeno, em que a bactéria pode ser do gênero Brucella e em que a dita vacina pode ser administração em mucosa ou parenteral. O adjuvante de vacina pode ser um polipeptídeo modificado ou pode ser, por exemplo, o polipeptídeo Omp19S ou partes disso, ou o polipeptídeo Omp16S ou partes disso, ou misturas de ambos. Em uma realização preferencial, o adjuvante é o polipeptídeo não lipidado que está compreendido em SEQ ID No: 1 ou partes disso. Em outra realização preferencial, o adjuvante é o polipeptídeo não lipidado que está compreendido em SEQ ID No: 2 ou partes disso.

[011] O uso do adjuvante para a fabricação de uma vacina contra um patógeno é fornecido.

[012] O uso do adjuvante para a fabricação de uma vacina antitumor ou uma composição imunomoduladora é fornecido.

[013] Vetores de expressão são fornecidos para eucariontes, que compreendem as sequências SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 2.

[014] Células de eucarionte modificadas são fornecidas, que expressam as sequências SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 2.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[015] A Figura 1 mostra: 15% de gel de 15% poliacrilamida manchado com azul de Coomassie, no qual amostras de Omp19S e Omp16S purificados e esgotados de lipossacarídeo (LPS) foram semeadas. 20 μg de proteína total foram semeadas em todas as faixas. Omp19S degradado com proteinase K (Omp19SPK) também foi executada no mesmo gel, e foi usada em um controle em alguns experimentos.

[016] A Figura 2 mostra que a expressão da proteína α4β7 aumenta em linfonodos mesentéricos de animais BALB/c imunizados com Omp19S como adjuvante pela via oral. Os animais foram imunizados oralmente com: (i) ovalbumina bovina (OVA), (ii) Omp19S + OVA, ou (iii) toxina colérica (TC) + OVA. 2x106 células de linfonodos mesentéricos que correspondem a cada grupo de imunização foram identificadas com anticorpos (Abs) anti-CD4 (FITC), anti-CD8 (PE-Cy5.5) e anti-α4β7 (PE). Números de quadrante direito superior representam a frequência de células CD8+ (A) e CD4+ (B) T que expressam a proteína α4β7. A frequência de controle de isótipo foi subtraída em todos os casos. O n/grupo=5. Os dados são representativos de dois experimentos independentes.

[017] A Figura 3 mostra que Omp19S, quando administrado como um adjuvante oral, induz uma imunorresposta de célula T in vivo. A reação de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) foi determinada em resposta à inoculação de 20 μg OVA no coxim palmar de animais imunizados conforme descrito na Figura 2. As barras representam um coeficiente de aumento médio na pele do coxim palmar entre pata esquerda e direita com ± de erro padrão do meio (SEM) em 48 horas (A) e 72 horas (B), n/ grupo=5, que representam 2 experimentos com resultados similares.

[018] A Figura 4 mostra que Omp19S, quando administrado como adjuvante oral, induz um aumento na capacidade proliferativa de esplenócitos em resposta ao estímulo de antígeno. Os esplenócitos de animais imunizados conforme descrito na Figura 2 foram estimulados ou com 100 μg/ml de OVA ou sem antígeno. Células foram cultivadas com timidina 3H por 18 horas e a radioatividade incorporada foi medida. Os resultados são mostrados como índice de estímulo (S.I.) que representa esplenócito cpm estimulado por OVA/esplenócito cpm não estimulado. Um S.I.>2 é considerado positivo. Os valores representam o meio das determinações feita triplamente para 5 animais/grupo ± SEM.

[019] A Figura 5 mostra que Omp19S, quando administrado como um adjuvante oral, induz um imunorresposta celular com produção de citocina (IFN-y e IL-17) após estímulo antigênico. Os esplenócitos do baço de cada grupo imunizado conforme descrito na Figura 2 (n/grupo=5) foram estimulados in vitro com diferentes concentrações de OVA (100 μg/ml e 1000 μg/ml) ou o meio completo (RPMI). Os sobrenadantes da cultura foram colhidos 72 horas após o estímulo. As concentrações de citocina (A) Interferon (IFN-y), (B) IL-4, (C) IL-2, (D) IL-10 e (E) IL-17 (pg/ml) nos sobrenadantes da cultura foram determinados por ELISA. Os valores representam o meio das determinações realizadas duplamente para cada camundongo ± SEM, que representam 2 experimentos com resultados similares.

[020] A Figura 6 mostra que Omp19S, quando administrado como adjuvante oral, estimula a indução de células T específicas de CD4+ e CD8+ que produzem IFN-y. Os esplenócitos de animais imunizados por via oral com (i) OVA, (ii) Omp19S+OVA ou (iii) TC+OVA, foram estimulados ou com OVA323+A20J+OVA 500 μg/ml ou com meio de cultura completo (nenhum estímulo) por 18 horas e com Brefeldin A nas últimas 4 horas de cultura. Assim, as células foram manchadas com anti-CD4 (PE/Cy5) e anti-CD8 (Alexa Fluor 647) Abs específicas e subsequentemente fixadas, permeabilizadas e incubadas com um anti-IFN-y (PE) Ab ou controle de isótipo Ab (PE). Os números no quadrante superior direito representam a frequência de Células T de CD4+ (A) ou CD8+ (B) que expressam IFN-y. A frequência de controle de isótipo e da produção de IFN-y por células não estimuladas do mesmo grupo foram subtraídas em todos os casos. Dessa maneira, a porcentagem indicada corresponde à produção de IFN-y. Os dados específicos de OVA são representativos de dois experimentos independentes.

[021] A Figura 7 mostra que a expressão da proteína α4β7 aumenta em células T de linfonodos mesentéricos de animais BALB/c imunizados oralmente com Omp16S como adjuvante. Os grupos de animais foram imunizados por via oral com: (i) OVA, (ii) Omp16S+OVA, ou (iii) TC+OVA. 2x106 células de linfonodos mesentéricos que correspondem a cada grupo foram marcadas com anti-CD8 (PE-Cy5.5) e anti-α4β7 (PE). Os números no quadrante superior direito representam a frequência de células T de CD8+ que expressam o marcador α4β7. A porcentagem de controle de isótipo foi subtraída em todos os casos. n/grupo=5. Os dados são representativos de dois experimentos independentes.

[022] A Figura 8 mostra que Omp16S, quando administrado como adjuvante oral, induz uma imunorresposta celular T in vivo. A reação de DTH foi determinada em resposta à inoculação de 20 μg de OVA no coxim palmar direito de animais imunizados oralmente como na Figura 7. As barras representam o coeficiente de aumento médio da pele do coxim palmar entre pata esquerda e direita ± SEM em 48 horas (A) e 72 horas (B), n/ grupo=5, que representa 2 experimentos com resultados similares.

[023] A Figura 9 mostra que Omp19S, quando administrado como adjuvante nasal, induz a imunorresposta celular com produção de citocina (IFN- Y em resposta ao antígeno. Os camundongos C57BL/6 foram imunizados pela via nasal com: (i) OVA, (ii) Omp19S+OVA, ou (iii) TC+OVA. Os esplenócitos de cada grupo (n/grupo=5) imunizados conforme descrito na Figura 7 foram estimulados in vitro com 500 μg/ml de OVA ou de meio completo (RPMI). Os sobrenadantes da cultura foram colhidos 5 dias após o estímulo. As concentrações de citocina (A) IFN-Y, (B) IL-4 e (C) IL-10 (pg/ml) nos sobrenadantes da cultura foram determinados por ELISA. n/ grupo=5. Os valores representam o meio das determinações realizadas duplamente para cada camundongo ± SEM, que representam 2 experimentos com resultados similares.

[024] A Figura 10 mostra que Omp19S, quando administrado como adjuvante nasal, estimula a indução de células T CD4+ e CD8+ específicas que produzem IFN-y. Os esplenócitos de animais imunizados conforme descrito na Figura 9 foram cultivadas com 500 μg/ml de OVA257+MO5+OVA ou com o meio completo (sem estímulo, RPMI) por 18 horas. Assim, os mesmos foram tratados com Brefeldin A nas últimas 4 horas de cultura. Então, as células foram manchadas com Abs anti-CD4 (PE/Cy5) e anti-CD8 (Alexa Fluor 647) específicos. Subsequentemente, estas foram fixadas, permeabilizadas e incubadas com um Ab anti-IFN-y (PE). Os números no quadrante superior direito representam da frequência das células T CD4+ (A) ou CD8+ (B) que expressam IFN-y. A frequência de controle de isótipo e a produção de IFN-y por células não estimuladas do mesmo grupo foram subtraídas em todos os casos. Desta maneira, a porcentagem indicada corresponde à produção de IFN-y específico de OVA. Os dados são representativos de dois experimentos independentes.

[025] A Figura 11 mostra que Omp16S induz a imunorresposta celular com produção de citocina quando administrado como adjuvante nasal. Os animais foram imunizado pela via nasal com: (i) OVA, (ii) Omp16S+OVA, ou (iii) TC+OVA. Os esplenócitos de cada grupo imunizado (n/grupo=5) foram estimulados in vitro com 500 μg/ml de OVA ou meio completo (RPMI). Os sobrenadantes da cultura foram colhidos 5 dias após o estímulo. As concentrações de citocina (A) IFN-y, (B) IL-4 e (C) IL-10 (pg/ml) nos sobrenadantes da cultura foram determinados por ELISA. n/ grupo=5. Os valores representam o meio das determinações realizadas duplamente para cada camundongo ± SEM, que representam 2 experimentos com resultados similares.

[026] A Figura 12 mostra que Omp16S, quando administrado como adjuvante nasal, estimula a indução de células T CD4+ e CD8+ específicas que produzem IFN-y. Os esplenócitos de animais imunizados conforme descrito na Figura 11 foram cultivados ou com 500 μg/ml de OVA257+MO5+OVA ou meio completo por 18 horas. Então, os mesmos foram tratados com Brefeldin A nas últimas 4 horas de cultura. Então, as células foram manchadas com Abs anti- CD4 (PE/Cy5) e anti-CD8 (Alexa Fluor 647) específicos. Subsequentemente, estes foram fixados, permeabilizadas e incubadas com um Ab anti-IFN-y (PE). Os números no quadrante superior direito representam a frequência das células T CD4+ (A) ou CD8+ (B) que expressam IFN-y. A frequência de controle de isótipo e a produção de IFN-y por células não estimuladas do mesmo grupo foram subtraídas em todos os casos. Desta maneira, a porcentagem indicada corresponde à produção de IFN-y específico de OVA. Os dados são representativos de dois experimentos independentes.

[027] A Figura 13 mostra que a administração de Omp19S como adjuvante parenteral não tem efeito na magnitude da resposta humoral. As titulações de IgG anti-OVA foram determinadas em soro de camundongos BALB/c imunizados pela via subcutânea com (i) OVA, (ii) OVA+Omp19S e (iii) OVA+CFA e foram determinados por ELISA. n/grupo=5, os valores representam o meio das determinações feitas para cada camundongo ± SEM, que representa 2 experimentos com resultados similares.

[028] A Figura 14 mostra que a administração de Omp19S como adjuvante parenteral não tem efeito no perfil de isótipo de Abs induzidos. A razão de isótipo IgG1/IgG2a anti-OVA foi determinada no soro de animais imunizados conforme descrito na Figura 13. Os valores representam o meio das determinações realizadas para cada camundongo ± SEM. n/grupo=5, que representam 2 experimentos com resultados similares.

[029] A Figura 15 mostra que Omp19S como adjuvante parenteral não induz toxidade local no tecido subcutâneo de camundongos BALB/c após as imunizações conforme descrito na Figura 13. Uma granuloma no sítio de injeção (caixa) é observada no camundongo imunizado com CFA como adjuvante (A). Na direita, a mesma zona em um camundongo imunizado com Omp19S como um adjuvante subcutâneo é observada, com nenhum sinal de alteração no tecido (B).

[030] A Figura 16 mostra que Omp16S e Omp19S, quando administrados como adjuvantes parenterais, induzem uma imunorresposta celular T contra o antígeno in vivo. A reação de DTH foi determinada em resposta à provocação com 20 μg de OVA no coxim palmar direito de animais imunizados subcutaneamente com (i) OVA, (ii) OVA+Omp16S, (iii) OVA+Omp19S ou (iv) OVA+CFA conforme descrito na Figura 13. As barras representam o coeficiente de aumento médio da pele do coxim palmar entre pata esquerda e direita ± SEM em 48 horas (A) e 72 horas (B) após a provocação com OVA. n/ grupo=5, que representam 3 experimentos com resultados similares.

[031] A Figura 17 mostra que Omp19S, quando administrado como adjuvante parenteral, induz um aumento na proliferação de esplenócitos em resposta à Ag. A proliferação in vitro foi avaliada como uma resposta a diferentes doses de OVA nos esplenócitos de camundongos imunizados conforme descrito na Figura 13. Os Resultados foram expressos como índice de estímulo SI (OVA cpm / RPMI cpm). n/ grupo=5. Os valores representam o meio das determinações feito triplamente para cada camundongo ± SEM, que representa 2 experimentos com resultados similares.

[032] A Figura 18 mostra que Omp19S, quando administrado como adjuvante parenteral, induz uma imunorresposta celular com produção de citocina (IFN-y) após o estímulo antigênico. A produção de IFN-y por esplenócitos de camundongos imunizados conforme descrito na Figura 13, estimulados in vitro por 72 horas com diferentes concentrações de OVA ou do meio completo, foi determinada. n/ grupo=5. Os valores representam o meio das determinações realizadas duplamente para cada camundongo ± SEM, que representam 2 experimentos com resultados similares.

[033] A Figura 19 mostra que Omp19S, quando administrado como adjuvante parenteral, não induz um aumento na produção de IL-4 nem na de IL-10, em resposta ao antígeno. A produção de IL-4 (A) e de IL-10 (B) pelos esplenócitos de camundongos imunizados conforme descrito na Figura 13, estimulados in vitro por 72 horas com diferentes concentrações de OVA ou de meio completo (RPMI), foi avaliada. n/ grupo=5. Os valores representam o meio das determinações realizadas duplamente para cada camundongo ± SEM, que representam 2 experimentos com resultados similares.

[034] A Figura 20 mostra que Omp19S, quando administrado como adjuvante parenteral, induz uma imunorresposta celular com produção de IL-17 em resposta ao antígeno. A produção de IL-17 por esplenócitos de camundongos imunizados conforme descrito na Figura 13, estimulados in vitro por 72 horas com diferentes concentrações de OVA ou de meio completo (RPMI), foi determinada. n/ grupo=5. Os valores representam o meio das determinações realizadas duplamente para cada camundongo ± SEM, que representam 1 experimento.

[035] A Figura 21 mostra que o uso de Omp19S como um adjuvante por via parenteral aumenta a proliferação de células CD8+ específicas para OVA257-264. As células de camundongos OT-1 foram marcadas com éster de carboxifluoresceina succinimidila (CFSE) e transferidas de maneira intravenosa (i.v.) (10x106 de células/camundongo) para camundongos C57BL/6. Um dia após a transferência adotiva, os camundongos receptores C57BL/6 foram imunizados subcutaneamente (s.c.) com: (i) OVA, (ii) OVA+Omp19S, (iii) OVA+Omp19S degradados com proteinase K (Omp19SPK) ou (iv) OVA+LPS. A proliferação de células OT-1 CFSE+ em baço e linfonodos foi determinada 5 dias após a imunização por citometria de fluxo que analisa a diluição de fluorescência de CFSE. A porcentagem de células CD8+ que foram submetidas a mais do que uma divisão é mostrada, e representa resultados de 3 experimentos.

[036] A Figura 22 mostra que o uso de Omp19S como um adjuvante por via parenteral aumenta a produção intracelular de IFN-y na população de célula CD8+ específicas para OVA257-264. Os esplenócitos de animais imunizados conforme descrito na Figura 21 foram estimulados por 18 horas com: meio completo (RPMI), 500 μg/ml de OVA + 5 μg /ml peptídeo SIINFEKL + MO5, e tratados então com Brefeldin A por 6 horas. Então, as células foram manchadas com anticorpos anti-CD8 Alexa Fluor e anti- IFN-y PE. Os valores no quadrante superior direito representam a frequência de células CD8+ produtoras de IFN-y.

[037] Figura 23 mostra que a imunização com Omp16S ou Omp19S como adjuvantes induz uma imunorresposta citotóxica capaz de causar a liase em células de tumor que expressam o Ag. A atividade citotóxica dos esplenócitos de camundongos C57BL/6 imunizados com: (i) OVA, (ii) Omp16S+OVA, (iii) Omp19S+OVA, ou (iv) CFA+OVA, foi determinada. As células alvo (MO5 que expressam OVA ou B16 que não expressam OVA) marcadas com 51Cr foram incubadas com esplenócitos em uma razão de 50 esplenócitos: 1 célula alvo. Após 6 horas, cpm nos sobrenadantes foi medida e os resultados foram analisados de acordo com a porcentagem de lise específica.

[038] A Figura 24 mostra que a frequência de células CD4+ e CD8+ T que expressam α4β7 aumenta em linfonodos mesentéricos de camundongos BALB/c imunizados por via oral com Omp19S como adjuvante. Os animais foram imunizados oralmente com: (i) toxoide de tétano (TT), (ii) TT+Omp19S ou (iii) TT+TC. 2x106 células de linfonodos mesentéricos derivadas de cada grupo de imunizado foram manchados com anticorpos anti-CD4 (FITC), anti-CD8 (PE- Cy5.5) e anti-á4â7 (PE). Os números no quadrante superior direito representam a frequência de células T CD8+ (A) e CD4+ (B) que expressam o marcador α4β7. A frequência de controle de isótipo foi subtraída em todos os casos. n/grupo=5.

[039] A Figura 25 mostra em géis que as proteínas Omp16S e Omp19S são expressas corretamente em células eucariontes transfectadas com os plasmídeos de expressão eucarionte pCI-Omp16S ou pCI-Omp19S, respectivamente. A expressão de (A) Omp16S ou de (B) Omp19S foi estudada em células eucariontes (COS-7) transfectadas de modo transiente com os plasmídeos pCI-Omp16S ou pCI-Omp19S, respectivamente ou com o plasmídeo pCl como um controle. Após 24 ou 48 horas de cultura, a expressão de Omp16 ou Omp19 foi avaliada por Western blotting nos extratos de proteína das células transfectadas pelo uso de anticorpos anti-Omp16 ou anti-Omp19 específicos, respectivamente.

[040] A Figura 26 mostra que Omp19S inibe as proteases do estômago de camundongos BALB/c. Os sobrenadantes dos extratos do estômago foram incubados com BSA (proteína irrelevante), Omp19S, coquetel inibidor de protease mamífera (como um controle que possa inibir a atividade enzimática do estômago). A atividade enzimática foi medida pelo uso de caseína BODIPY FL ou OVA BODIPY FL como os substratos. O gráfico representa a porcentagem de atividade enzimática residual após cada tratamento, calculado mediante a consideração da atividade máxima do sobrenadante de extrato do estômago sobre a caseína BODIPY FL ou o substrato de OVA BODIPY FL, conforme apropriado. A capacidade fluorescente da caseína BODIPY FL ou substratos de OVA BODIPY FL, uma vez degradada, foi verificada mediante o tratamento desses substratos com PK (proteinase K).

[041] A Figura 27 mostra que Omp19S é capaz de inibir a degradação de antígenos eucarióticos (BSA, OVA) e bacterianos (BLS, SurA. DnaK) pelas proteases do estômago de camundongos BALB/c. Cada antígeno foi tratado com: (i) sobrenadante de extrato do estômago, (ii) sobrenadante de extrato do estômago e Omp19S, (iii) sobrenadante de extrato do estômago e coquetel inibidor de protease mamífera (como um controle que a atividade enzimática do estômago pode inibir). Essas misturas de reação foram sujeitas a uma eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato dodecila de sódio (SDS- PAGE) e subsequente manchamento com azul de Coomasie.

[042] A Figura 28 mostra a capacidade de Omp19S de inibir a degradação de antígenos pelas proteases do estômago in vivo, pelo uso como um modelo de antígeno a caseína BODIPY FL. Os camundongos BALB/c foram inoculados oralmente com: (i) NaHCO3 buffer (1M, pH8) (veículo), (ii) caseína BODIPY FL com Omp19S, (iii) caseína BODIPY FL com aprotinina (um inibidor de protease conhecido), iv) caseína BODIPY FL. O gráfico representa a porcentagem de atividade enzimática residual após cada tratamento, calculada considerando que a atividade máxima do sobrenadante de extrato do estômago de camundongos imunizados com caseína BODIPY FL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[043] Para os propósitos do presente pedido de patente, as frases “polipeptídeo Omp19S”, “proteína Omp19S” e “Omp19S” têm o mesmo significado e correspondem ao polipeptídeo Omp19S não lipidado.

[044] O termo Omp19S ou Omp16S se refere à sequência de polipeptídeo que pode corresponder a SEQ No. 1 ou a SEQ No. 2, respectivamente, que é obtida mediante a purificação de células, tecidos ou organismos que expressam isso, ou mediante síntese química.

[045] Para os propósitos do presente pedido de patente, as frases “polipeptídeo Omp16S”, “proteína Omp16S” e “Omp16S” têm o mesmo significado e correspondem ao polipeptídeo Omp16S não lipidado.

[046] No presente pedido de patente, o termo “imunogene” e “antígeno” têm o mesmo significado e são definidos como qualquer substância contra a qual, em um organismo imunocompetente, uma imunorresposta humoral ou celular pode ser induzida. De acordo com esse significado, o antígeno é um sinônimo de imunogene.

[047] Em uma realização preferencial, o polipeptídeo Omp19S foi clonado sem a sequência de consenso de lipidação em um vetor plasmídico. Pelo uso desse construto, células de E. coli competentes foram transformadas de modo a expressar e purificar o polipeptídeo não lipidado. A purificação foi executada pelo uso de uma resina de níquel-agarose. Os eluatos correspondentes foram semeados em um gel de poliacrilamida SDS (Figura 1). Subsequentemente, os eluatos com concentração similar foram agrupados em diferentes frações. Nessas frações, a identidade do polipeptídeo purificado foi confirmada mediante a execução de um Western blotting pelo uso de um anticorpo monoclonal contra Omp19.

[048] O polipeptídeo clonado foi sequenciado e sua sequência é mostrada em SEQ ID No: 1. Será evidente que as variações da dita sequência podem existir, todas as quais se enquadram no escopo da presente invenção. Por exemplo, os fragmentos disso, ou as adições ou deleções de fragmentos ou aminoácidos. Também abrangidos dentro do escopo da presente invenção estão os polipeptídeos não lipidados Omp19S obtidos de qualquer espécie Brucella.

[049] Em outra realização preferencial, o polipeptídeo Omp16S foi clonado sem a sequência de consenso de lipidação em um vetor plasmídico. Pelo uso desse construto, as células de E. coli competentes foram transformadas de modo a expressar e purificar o polipeptídeo não lipidado. A purificação foi executada pelo uso de uma resina de níquel-agarose. Os eluatos correspondentes foram semeados em um gel de poliacrilamida SDS (Figura 1). Subsequentemente, os eluatos com concentração similar foram agrupados em diferentes frações. Nessas frações, a identidade do polipeptídeo purificado foi confirmada mediante a execução de um Western blotting pelo uso de um anticorpo monoclonal contra Omp16S. O polipeptídeo clonado foi sequenciado e sua sequência é mostrada em SEQ ID No: 2. Será evidente que as variações da dita sequência podem existir, todas as quais se enquadram no escopo da presente invenção. Por exemplo, os fragmentos disso, ou adições ou deleções de fragmentos ou aminoácidos. Também abrangidos dentro do escopo da presente invenção estão os polipeptídeos não lipidados Omp16S obtidos de qualquer espécie Brucella.

[050] A partir da revelação dos presentes pedidos, se tornará óbvio que outros polipeptídeos Brucella Omp poderiam ser usados como adjuvantes, contanto que os mesmos estejam em uma forma não lipidada. A forma não lipidada pode ser obtida através de modificações no esqueleto peptídico, assim como por outros métodos conhecidos. Qualquer polipeptídeo Omp não lipidado é abrangido dentro do escopo da presente invenção.

ENSAIOS COM A UTILIZAÇÃO DE OMP19S OU OMP16S DE MUCOSA:

[051] A expressão de α4β7 em linfócitos CD4+ e CD8+ T de linfonodos mesentéricos a partir de animais imunizados oralmente com: (i) OVA (ovalbumina), (ii) Omp19S+OVA, ou (iii) toxina de cólera (TC) + OVA, foi avaliada.

[052] Os resultados indicaram que houve um aumento na frequência de linfócitos CD4+ e CD8+ T que expressam o marcador de migração de mucosa (lamina própria gastrointestinal) α4β7 nos linfonodos mesentéricos dos animais inoculados oralmente com Omp19S+OVA (7,7%; 12,16%) e TC+OVA (7,15%; 16,43%) como adjuvantes, quando comparado com a administração do antígeno sem o adjuvante OVA (0,74%; 1,64%) (Figura 2 A e B). Portanto, pode ser dito que Omp19S administrado oralmente induziria a migração dos linfócitos T efetores CD4+ e CD8+ para a mucosa intestinal.

[053] A resposta de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) é mediada por células T que migram para o sítio de injeção do antígeno, reconhece peptídeos derivados do antígeno nas células que apresentam antígeno (APCs) e liberam citocinas tal como IFN-y, que estimula o recrutamento de células do sistema imunológico inato causando edema e intumescimento. Então, com a finalidade de analisar a resposta T in vivo, a resposta DTH induzida por injeção OVA foi avaliada em camundongos imunizados oralmente com os adjuvantes da invenção. Para esse fim, 20 μg de OVA foram injetados no coxim palmar de uma das pernas dos camundongos imunizados e uma solução fisiológica foi injetada na outra perna como um controle. Os animais imunizados oralmente com OVA coadministrado com Omp19S apresentaram um aumento na pele do coxim palmar em relação aos animais imunizados com OVA sem adjuvante por 48 horas e 72 horas após a injeção de OVA (Figura 3 A e B). Esse aumento foi ligeiramente maior do que o induzido pela toxina de cólera como adjuvante administrado pela mesma via (Figura 3 A e B).

[054] Estes resultados mostram que o adjuvante Omp19S administrado oralmente seria capaz de induzir uma resposta celular in vivo que é similar ou maior do que a gerada por um adjuvante de mucosa experimental conhecido tal como a toxina de cólera. Omp19S como adjuvante da mucosa induziria uma resposta de célula T antiantígeno (OVA) in vivo.

[055] Com a finalidade de caracterizar a imunorresposta celular induzida, a capacidade de esplenócitos de animais imunizados para proliferar in vitro foi determinada em resposta ao estímulo antigênico. As células foram cultivadas na presença de diferentes concentrações de OVA ou de meio completo. Após 5 dias, um pulso de 3H-timidina foi fornecido por 18 horas e a radioatividade incorporada foi medida. Os resultados obtidos mostram que a coadministração oral de OVA e de adjuvante Omp19S induziu um aumento na resposta proliferativa específica de antígeno de células desses camundongos em comparação aos animais imunizados apenas com OVA (Figura 4). O estímulo com Concanavalin A (ConA, mitógeno de controle) causou um aumento significativo na proliferação de células. Pelo contrário, o uso de toxina de cólera como adjuvante não induziu um aumento na capacidade proliferativa de esplenócitos como uma resposta ao Ag. Esses resultados indicariam que o uso do adjuvante Omp19S oralmente teria um efeito na geração de uma resposta adaptativa eficiente evidenciada por um aumento na resposta proliferativa específica de antígeno das células T.

[056] Com base nos resultados de DTH e proliferação, uma resposta celular desenvolvida como uma resposta ao estímulo com o antígeno foi evidenciada.

[057] Subsequentemente, o perfil de resposta T desenvolvido em animais quando oralmente imunizados com o adjuvante da invenção foi caracterizado.

[058] Para a determinação do tipo de resposta de auxiliar T (Th) anti-OVA induzida por Omp19S como adjuvante, esplenócitos de camundongos imunizados foram cultivados na presença de concentrações diferentes de OVA ou meio completo por 72 horas e, então, o padrão das citocinas produzidas foi analisado no sobrenadante dessas células. Um ELISA de captura foi realizado com o uso de anticorpos monoclonais específicos para a detecção de IFN-y, IL- 2, IL-10, IL-4 e IL-17 nos sobrenadantes de cultura de esplenócitos estimulados e de controle.

[059] Os resultados indicam que as células de animais imunizados oralmente com de OVA+Omp19S produziram quantidades mais altas de IFN-y, IL-2 e IL-17 do que as células de animais controle (de OVA) e do que células de animais imunizados com de OVA+TC (Figura 5). Ademais, a secreção dessas citocinas foi antígeno-específica e dependente de dose.

[060] Por outro lado, os níveis de citocinas do perfil de Th2, como IL-4 e IL-10, eram similares aos níveis basais. Dessa forma, o uso de Omp19S como adjuvante pela via oral geraria uma resposta do tipo Th1 e Th17.

[061] De importância não é apenas a quantidade da resposta induzida que foi induzida por um adjuvante, mas também a qualidade dessa resposta. Dado que os linfócitos de camundongos coimunizados com Omp19S +de OVA liberaram IFN-y, a subpopulação de célula T CD4+ ou CD8+ que produz essa citocina foi avaliada. Com essa finalidade, a produção intracelular de IFN-y pelas células T CD4+ e CD8+ foi determinada.

[062] Com essa finalidade, um protocolo de incubação de 16 horas com diferentes estímulos foi realizado. Para estimular os linfócitos extraídos de baço de camundongo, peptídeo de OVA restrito a MHC de classe II para BALB/c (de OVA323), células que apresentam antígeno A20J e de OVA (500 μg/ml) foram usadas. Outros estímulos consistiram em meio completo (RPMI) como um controle negativo e Pma/ionomicina (um ativador policlonal de célula T) como um controle positivo. Na Figura 6, a produção de IFN-y em células T CD4+ pelos grupos de camundongo oralmente imunizados com de OVA, de OVA+Omp19S e de OVA+TC é mostrada.

[063] A imunização com Omp19S como adjuvante pela via oral induziu a produção de células T CD4+produtoras de IFN-y antígeno-específicas (2,13%) enquanto no grupo imunizado com TC como adjuvante não houve produção diferenciada em relação ao grupo imunizado com de OVA sem adjuvante (de OVA+TC 0,45% versus de OVA 0,41%) (Figura 6 A). Quanto aos linfócitos T CD8+ produtores de IFN-y, um leve aumento pode ser observado no grupo de OVA+Omp19S (0,77%), mas significativo em relação ao grupo imunizado com de OVA (0,37%) ou com de OVA+TC (0,55%) (Figura 6B).

[064] Resumindo, o uso de Omp19S como adjuvante oral induz (i) a migração de linfócitos T CD4+ e CD8+ para a mucosa gastrointestinal, (ii) uma resposta de célula T antígeno-específica in vivo, (iii) a liberação de citocinas Th1, Th17, assim como a proliferação de linfócitos como resposta ao Ag, e (iv) linfócitos T CD4+ e CD8+ produtores de IFN-y de memória. Essas células produtoras de IFN-y são indispensáveis para a geração de respostas imunológicas eficazes contra infecções por patógenos com uma fase intracelular em seus ciclos de vida, como vírus, bactérias, parasitas e fungos; ou tumores. O fato de que o adjuvante induz a produção dessa citocina pelos linfócitos T poderia ser benéfico para o desenvolvimento de vacinas contra esses tipos de doença. Todas essas qualidades são amplamente exigidas no campo de adjuvantes mucosais.

[065] A expressão de α4β7 em linfócitos T CD4+ e CD8+ de nós linfonodos mesentéricos obtidos a partir de animais imunizados oralmente com (i) de OVA, (ii) de OVA+Omp16S ou (iii) de OVA+TC também foi avaliada (Figura 7). Os resultados indicam que houve aumento na frequência de linfócitos T CD8+ que expressam o marcador de migração mucosal α4β7 em linfonodos mesentéricos desses animais oralmente imunizados com de OVA+Omp16S (4,35%) e de OVA+TC (16,43%), quando comparado à administração de antígeno sem adjuvante (de OVA, 1,64%). Esses resultados sugerem que Omp16S administrado pela via oral induz a migração dos linfócitos T CD8+ efetores à mucosa intestinal.

[066] Para analisar a resposta de célula T in vivo, a resposta de hipersensibilidade do tipo tardia induzida pela injeção de OVA foi avaliada em camundongos imunizados pela via oral. Aqueles animais imunizados oralmente com de OVA coadministrada com Omp16S como adjuvante apresentaram um aumento na pele do coxim plantar em relação àqueles animais imunizados com de OVA e sem adjuvante em 48 horas e 72 horas após a imunização com de OVA (Figura 8A e B). Esse aumento foi levemente mais alto que aquele induzido pela toxina da cólera administrada como adjuvante pela mesma via a 48 horas (Figura 8A). Portanto, Omp16S como adjuvante mucosal induz uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardio (DTH) antiantígeno (de OVA). Omp16S administrado pela via oral é capaz de induzir uma resposta de célula T in vivo similar àquela gerada com um adjuvante mucosal experimental conhecido, como a toxina da cólera.

[067] O uso de Omp16S como adjuvante pela via oral induziria (i) a migração de linfócitos T CD8+ para a mucosa gastrointestinal, (ii) uma resposta de célula T antígeno-específica in vivo.

[068] A administração nasal de Omp19S gera a produção de citocinas específicas de OVA em cultura de esplenócito de baço. Esplenócitos de animais imunizados nasalmente com de OVA+Omp19S produziram níveis mais altos de IFN-y em relação a animais imunizados com de OVA sem qualquer adjuvante (Figura 9A) como resposta ao antígeno de OVA. A administração de OVA+TC nasalmente induziu a níveis mais altos de IFN-y nos sobrenadantes da cultura de esplenócitos estimulados com de OVA. Por outro lado, o estímulo com de OVA não induziu a secreção de IL-4 nos esplenócitos derivados de qualquer um dos grupos estudados (Figura 9B). Quanto a IL-10, um leve aumento foi detectado em relação ao controle negativo, apenas no grupo imunizado com de OVA+TC (Figura 9C). Portanto, a administração de Omp19S como um adjuvante nasal induz uma resposta imunológica celular Th1 com produção de IFN-y.

[069] Considerando o perfil de citocina liberado por esplenócitos, avaliou-se se as células T CD4+ ou CD8+ foram responsáveis por essa produção. Com essa finalidade, uma medição de IFN-y intracelular 3 semanas após a última imunização foi realizada.

[070] A imunização com Omp19S como adjuvante nasal (Omp19S+de OVA) induziu a produção de células T CD4+ antígeno-específica produtoras de IFN-y (0,43%) enquanto a imunização com TC como adjuvante (TC+de OVA) não induziu uma produção diferente daquela do grupo imunizado com de OVA sem qualquer adjuvante (de OVA+TC 0,28% versus de OVA 0,23%) (Figura 10A). Quanto aos linfócitos T CD8+ produtores de IFN-y, pode-se observar um leve aumento no grupo de OVA+Omp19S (0,72%), mas significativo, se comparado ao grupo imunizado com de OVA (0,47%) ou com de OVA+TC (0,22%) (Figura 10B).

[071] Como um todo, esses resultados mostram que camundongos imunizados com Omp19S+de OVA pela via nasal apresentaram um aumento no percentual de linfócitos T CD4+, mas principalmente de linfócitos T CD8+ que produzem IFN-y anti-OVA. Essa produção foi mais alta que a do grupo de controle imunizado por de OVA pela mesma via sem adjuvantes e mesmo mais alta que o do grupo de controle com um adjuvante conhecido, como a toxina de cólera.

[072] A coadministração nasal de Omp16S induz a produção de citocinas como uma resposta ao Ag em culturas de célula do baço. Os resultados indicam que os esplenócitos de animais imunizados nasalmente com de OVA+Omp16S produziram níveis mais altos de IFN-y em relação aos animais de controle (de OVA) como uma resposta ao antígeno de OVA (Figura 11A). A coadministração de TC pela via nasal induziu níveis mais baixos de IFN-y nos sobrenadantes de cultura de esplenócitos estimulados com de OVA em relação ao grupo imunizado com de OVA+Omp16S. Por outro lado, o estímulo com de OVA não induziu a secreção de IL-4 nos esplenócitos de qualquer um dos grupos estudados em resposta ao antígeno (Figura 11B).

[073] Quanto a IL-10, um leve aumento foi detectado em relação ao controle negativo, apenas no grupo imunizado com de OVA+TC (Figura 11C). Portanto, Omp16S como adjuvante administrado pela via nasal gera uma resposta do tipo Th1.

[074] Em camundongos imunizados com de OVA+Omp16S pela via nasal, houve um aumento no percentual de linfócitos T CD4+, mas também de linfócitos T CD8+ anti-OVA produtores de IFN-y 3 semanas depois da última imunização. Essa produção foi mais alta que o grupo de controle de OVA imunizado pela mesma via sem adjuvante e mesmo mais alta que o grupo de controle de OVA+TC (Figuras 12A e B).

[075] A imunização com Omp16S como adjuvante nasal induziu a produção de células T CD4+ antígeno-específicas produtoras de IFN-y (0,97%) enquanto o grupo imunizado com TC como adjuvante não induziu uma produção diferente daquela do grupo imunizado com de OVA sem adjuvante (de OVA+TC 0,28% versus de OVA 0,23%). Entretanto, a indução em linfócitos T CD8+ foi ainda mais alta. Pode-se observar um aumento significativo no grupo de OVA+Omp16S (1,08%) em relação ao grupo imunizado com de OVA (0,47%) ou com de OVA+TC (0,22%) (Figuras 12A e B). Finalmente, esses resultados indicam que Omp16S como um adjuvante nasal incluem a produção de células T CD4+ e CD8+ de memória produtoras IFN-y em resposta ao antígeno (de OVA).

[076] O uso de Omp19S e Omp16S como adjuvantes pela via nasal induzem (i) a liberação de citocinas de Th1 como uma reação ao antígeno e (ii) linfócitos T CD4+ e CD8+antígeno-específicos produtores de IFN-y de memória.

[077] Essas células T produtoras de IFN-y são indispensáveis para a geração de imunorrespostas eficazes contra infecções por patógenos que têm uma fase intracelular em seus ciclos de vida (ou quando o patógeno é internalizado por macrófagos) como um vírus, bactérias, parasitas e fungos ou tumores. O fato de que os adjuvantes da invenção induzem a produção dessa citocina pelos linfócitos T poderia ser benéfico para o desenvolvimento de vacinas contra esses tipos de doenças.

[078] Como um todo, esses resultados mostram que a administração de Omp19S ou Omp16S como adjuvantes pelas vias oral ou nasal induz a produção de linfócitos T CD4+ e CD8+ de memória que, mediante o encontro com seu Ag específico, produziriam IFN-y, uma qualidade muito relevante para um imunomodulador ou adjuvante mucosal.

ENSAIOS QUE USAM OMP19S OU OMP16S PARENTERAL

[079] A resposta humoral foi estudada, determinando a titulação de imunoglobulinas IgG totais e o perfil de isótopos induzidos (IgG1 e IgG2a) contra de OVA quando coimunizados com Omp19S, se comparado com a imunização de OVA em solução fisiológica (SF) ou de OVA em CFA. As titulações de IgG total foram determinadas nos soros de animais obtidos 3 semanas após a última imunização nos diferentes grupos por ELISA indireto. Os resultados obtidos mostraram que não houve aumento significativo de anticorpos específicos em relação à imunização com de OVA sem adjuvante (Figura 13), o que indicaria que Omp19S não tem efeito sobre a magnitude da resposta humoral acionada, enquanto a imunização com o controle positivo de Adjuvante de Freund Completo (CFA) gera um aumento na produção de anticorpos específicos, conforme o esperado. Omp19S como adjuvante não tem efeito na magnitude da resposta humoral.

[080] Ao analisar o perfil de isótopos IgG anti-OVA nos animais imunizados, pode-se observar que a inoculação com de OVA apenas ou o uso de CFA como adjuvante induz a uma predominância forte de anticorpos IgG1, enquanto o uso de Omp19S como adjuvante não ocorre (razão de IgG1/IgG2a perto de um) (Figura 14). Sabe-se que uma imunorresposta do tipo Th1 é associada a uma predominância de anticorpo IgG2a sobre IgG1, enquanto, no caso de uma resposta Th2, essa razão é invertida (Crameri e Rhyner. Novel vaccines and adjuvants for allergen-specific immunotherapy. Curr Opin Immunol. 18 (6):761 a 8. 2006).

[081] Portanto, embora a imunização com Omp19S como adjuvante não pareça ter um efeito na magnitude da resposta humoral, a mesma tem um efeito no perfil de isótopos específicos induzidos, observando a diminuição na razão IgG1/IgG2a, que é associada à diminuição dos anticorpos IgG1 característica de uma resposta Th2. Essa inversão na predominância de IgG1 mostra que, ao usar Omp19S como adjuvante, a produção de anticorpos do tipo Th2 gerada pela imunização com de OVA é diminuída, esses resultados indicam que os adjuvantes da invenção podem ser usados para redirecionar respostas linfocíticas do tipo Th2 em direção a uma resposta do tipo Th1, esse efeito poderia servir para reverter as condições associadas a processos alérgicos ao redirecionar uma resposta específica de alérgeno Th2 em direção a uma resposta modulatória Th1.

[082] A reação local gerada quando camundongos BALB/c são inoculados subcutaneamente com de OVA junto com Omp19S ou CFA foi analisada. A toxicidade local foi determinada por alterações macroscópicas do tecido subcutâneo. Nos animais inoculados com Omp19S junto com o antígeno de OVA não há sinais de tecido de toxicidade no sítio de administração, dado que nenhuma alteração foi observada no tecido, quando comparada à zona não injetada.

[083] Enquanto nos animais inoculados com o adjuvante de Freund completo houve uma reação à granulomatose no sítio de inoculação, dada pela formação de granulomas macrofágicos característicos do uso desse adjuvante (Figura 15). CFA tem um mecanismo do tipo depósito de ação, insolubilizando o antígeno no sítio da injeção, o que favorece o acúmulo de macrófagos junto de outras células, o que forma os granulomas macrofágicos característicos, evidenciando sinais de toxicidade. O preparo de Omp19S usado em todas as imunizações é solúvel, portanto, não origina a formação de granulomas, o que sugere que um mecanismo de ação diferente daquele de CFA. A imunização com Omp19S como adjuvante não gera reações locais adversas no tecido subcutâneo.

[084] Para analisar a resposta de célula T in vivo, a resposta de DTH induzida pela injeção de OVA foi avaliada em camundongos subcutaneamente imunizados com: (i) de OVA, (ii) de OVA+Omp19S, (iii) de OVA+Omp16S, (iv) de OVA+CFA, ou (v) solução fisiológica (SF). Com essa finalidade, de OVA (20 μg) foi injetada no com palmar em uma das patas dos camundongos imunizados e SF foi injetada no coxim palmar da outra perna como um controle. Aqueles animais imunizados com de OVA +Omp19S ou +Omp16S apresentaram aumento na pele de coxim palmar em relação àqueles animais imunizados com de OVA sem adjuvante a 48 horas e 72 horas após a injeção de OVA (Figura 16). Como um todo, esses resultados mostram que Omp19S e Omp16S são capazes de induzir uma resposta de célula T in vivo similar àquela gerada com um adjuvante conhecido experimental, como CFA, mas sem os efeitos adversos mostrados por esse adjuvante poderoso.

[085] Para avaliar a imunorresposta celular induzida, a capacidade in vitro de proliferar dos esplenócitos derivados de animais como uma resposta ao antígeno foi determinada. Os esplenócitos foram cultivados na presença de concentrações diferentes de OVA ou meio completo. Após 5 dias, um pulso de 3H-timidina foi dado por 18 horas e a radioatividade incorporada foi medida. Os resultados mostram que a coadministração de OVA com Omp19S gera um aumento na resposta proliferativa de células a partir desses camundongos, em comparação com aquela a partir de animais imunizados apenas com de OVA (Figura 17). Ambos o estímulo com ConA (resultados não mostrados) e o controle positivo (CFA) produziram um aumento significativo na proliferação celular. Esses resultados indicam que o uso de Omp19S como adjuvante tem um efeito na geração de uma resposta adaptativa efetiva evidenciada pelo aumento na capacidade proliferativa de células T específicas.

[086] Para a determinação do tipo de resposta auxiliar T anti-OVA induzida por Omp19S como adjuvante administrado parenteralmente, os esplenócitos de camundongos imunizados foram cultivados na presença de concentrações diferentes de OVA ou meio completo por 72 horas e, depois, o padrão de citocinas secretadas no sobrenadante essas células foi analisado. ELISAs de captura foram realizados com o uso de anticorpos monoclonais específicos para a detecção de IFN-y, IL-10, IL-4 e IL-17 nos sobrenadantes de cultura de esplenócitos estimulados e de controle.

[087] Os resultados indicam que as células de animais imunizados com de OVA+Omp19S secretaram quantidades significativas de IFN-y em relação aos animais de controle (SF) e àqueles imunizados com de OVA em adjuvante (Figura 18), e a secreção dessa citocina foi antígeno-específica e dependente de dose. O controle positivo (CFA) também induziu a produção de níveis dessa citocina. Omp19S como adjuvante parenteral gera uma resposta do tipo Th1.

[088] Em contraste a isso, os níveis de IL-4 produzido não mostrou nenhuma diferença significativa nos vários grupos; embora houvesse um aumento de tal citocina em resposta ao estímulo com de OVA, se comparado com células do grupo de SF, os níveis estavam similares nos animais inoculados apenas com de OVA, de OVA+Omp19S e de OVA + CFA (Figura 19A). De modo similar, a produção de IL-10 em células de baço não apresenta diferenças entre os vários grupos, embora haja um aumento em relação ao grupo de SF em todos os casos (Figura 19B). Isso indicaria que a produção antígeno-específica de IL- 4 e IL-10 não resulta dos adjuvantes, sendo característica desse antígeno, em vez disso. O estímulo com o controle de mitógeno (ConA) produziu níveis significativos de todas as citocinas sob análise. Com base nesses resultados, o padrão de citocina mostrado sugere que a resposta provocada pela imunização com Omp19S como adjuvante corresponde ao perfil de Th1, havendo uma produção aumentada de IFN-y, mas não de IL-4 e IL-10.

[089] Células T produtoras de IFN-y antígeno-específicas são indispensáveis para gerar imunorrespostas eficazes contra infecções patógenas com alguma fase intracelular em seu ciclo de vida (ou quando o patógeno é internalizado por macrófagos) como vírus, bactérias, parasitas e fungos; ou tumores. O fato de o adjuvante induzir a produção dessas citocinas através de linfócitos T poderia ser benéfico para o desenvolvimento de vacinas contra tal tipo de doenças. Já que os adjuvantes da invenção induzem respostas Th1, eles podem ser usados em preparações de vacina contra tais patógenos.

[090] Após a análise da resposta de linfócitos de Th1 e Th2 e a caracterização adicional do tipo de imunorresposta, a contribuição de população de célula Th17 na resposta provocada foi avaliada. Para tais fins, os níveis de IL-17 produzido na resposta ao estímulo nos sobrenadantes de cultura foram medidos (Figura 20). Os resultados indicaram que após a imunização com Omp19S+de OVA, uma resposta de Th17 dependente de dose é gerada mediante o estímulo in vitro com o antígeno.

[091] A análise das imunorrespostas de células T CD8+ em animais normais é restrita pela baixa frequência de tais células que respondem a um epítopo particular. Camundongos transgênicos para o receptor T foram usados experimentalmente como uma fonte de células T com especificidade definida. Um dos modelos mais amplamente usados são camundongos transgênicos OT-1, em que as células T CD8+ expressam o receptor específico de T para o peptídeo de OVA SIINFEKL apresentado no contexto de moléculas coestimulatórias MHC I (H-2Kb) (Harmala, Ingulli, Curtsinger, Lucido, Schmidt, Weigel, Blazar, Mescher e Pennell. The adjuvant effects of Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70 result from the rapid and prolonged activation of antigen-specific CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 169 (10):5622 a 9. 2002).

[092] Tais camundongos foram usados para a análise in vivo de imunorresposta T adaptativa CD8+ contra o antígeno.

[093] Para caracterizar a resposta de T específica de CD8+ na presença ou ausência dos adjuvantes da invenção, células de linfonodo e baço manchadas com CFSE de camundongos OT-1 foram adotivas, transferidas intravenosamente para camundongos C57BL/6. Um dia depois da transferência adotiva, os camundongos foram inoculados s.c. com de OVA em conjunto com os adjuvantes Omp19S, Omp19S PK (Omp19S tratado com proteinase K), lipopolissacarídeo (LPS) ou SF. Depois de cinco dias, o número de célula OT-1 marcada com CFSE foi analisado no baço e a ocorreu a drenagem dos linfonodos de camundongos imunizados por citometria de fluxo.

[094] Em animais de controle inoculados com SF, porcentagens mais baixas de divisão celular de células específicas de CD8+ manchadas com CFSE foram observadas. Os animais imunizados com de OVA + adjuvante Omp19S mostraram uma razão mais alta de células que passam por mais que uma divisão, se comparado com os camundongos imunizados com de OVA sem adjuvante, em ambos o baço (Figura 21) e em linfonodos (Figura 21).

[095] No que concerne ao baço, o grupo imunizado com SF mostrou o valor de proliferação de (21,79%), enquanto no grupo imunizado com de OVA sem adjuvante, o percentual de células que dividiram (75,01%) era inferior do que no grupo de camundongos imunizados com Omp19S como adjuvante (86,44%). Um resultado similar foi encontrado para drenar células de linfonodos. Para controlar que o efeito na resposta resultasse efetivamente do adjuvante e não de algum contaminante não proteína, como LPS, os animais foram imunizados com o adjuvante em forma degradada. Observou-se que a imunização com o adjuvante degradou com níveis de proliferação induzidos por proteinase K similares à inoculação com de OVA sem qualquer adjuvante. Células OT-1 de animais imunizados com controle positivo (LPS) mostraram níveis de proliferação similares àqueles no grupo imunizado com Omp19S como adjuvante.

[096] Esses resultados indicaram que a imunização com Omp19S como adjuvante induz a ativação aumentada de células T CD8+ específicas de OVA aumentando, portanto, sua capacidade proliferativa, demonstrando a geração de imunorresposta T adaptativa de CD8+ eficiente contra o antígeno. uma resposta de célula T CD8+ antígeno-específica eficiente induzida pelo adjuvante da invenção, avaliou-se se essas células CD8+ eram capazes de induzir significativamente os níveis de IFN-y, característicos de uma resposta do tipo auxiliar 1 T. Para tal fim, os camundongos C57BL/6 foram imunizados com: (i) de OVA; (ii) de OVA + Omp19S, ou (iii) de OVA+ Omp19S PK por via s.c.. Sete dias depois, os baços foram removidos dos animais. Os esplenócitos foram estimulados com meio de cultura, 500μg/ml de OVA + 5 ug/ml de peptídeo SIINFEKL + APC MO5 ou Pma-Ionomicina e a produção de IFN-y intracelular foi medida por citometria de fluxo.

[097] A população de células T CD8+ produtoras de IFN-y era maior em camundongos imunizados com Omp19S como adjuvante de OVA (0,73%) em estímulo in vitro com de OVA, se comparado às células de animais imunizados apenas com de OVA, nos quais a frequência de células CD8+ produtoras de IFN-y (0,14%) era similar ao isótopo de controle. Esses resultados indicam que o polipeptídeo usado como adjuvante induz a diferenciação de células T CD8+ capazes de produzir IFN-y em resposta ao estímulo de antígeno (Figura 22). De fato, foi observado que na imunização de camundongos com a proteína degradada (Omp19S PK), a frequência das células que expressam tal citocina é similar à das células do grupo imunizado com de OVA sem adjuvante (0,15%); esse resultado confirma que o efeito adjuvante é derivado do polipeptídeo de adjuvante. Em todos os casos, os controles de isótopo mostraram valores similares.

[098] Esses resultados indicam que Omp19S é capaz de induzir a produção de linfócitos T CD8+ que secretam IFN-y em resposta ao antígeno. Essas células T CD8+ produtoras de IFN-y são indispensáveis para gerar imunorrespostas eficazes contra a infecção por patógenos com alguma fase intracelular sem seus ciclos de vida como vírus, bactérias, parasitas e fungos; ou tumores. O fato de que o adjuvante induz tal produção de citocina por linfócitos T pode ser benéfico para o desenvolvimento de vacinas contra tal tipo de doenças.

[099] Já que a ativação e produção de IFN-y por células CD8+ em resposta ao antígeno de OVA foi observada em camundongos imunizados com os adjuvantes da invenção, investigou-se, ainda, se após a imunização de animais com os adjuvantes da invenção células citotóxicas específicas de Ag foram induzidas. Para tais propósitos, camundongos C57BL/6 foram imunizados por via s.c., e 3 semanas depois, um ensaio in vitro de citotoxicidade foi conduzido, em que as células alvo (MO5 que expressa de OVA ou B16 que não expressa de OVA) foram marcadas com 51Cr e, então, incubadas com esplenócitos dos camundongos imunizados (células efetoras). A liberação de 51Cr por células alvo foi medida nos sobrenadantes. Conforme mostrado na Figura 23, os esplenócitos a partir de animais imunizados com Omp19S ou Omp16S como adjuvantes induziram um percentual mais alto de lise, se comparado a tais células do grupo imunizado com de OVA sem adjuvante. O adjuvante de Freund completo (CFA) foi usado como um controle positivo. Omp19S e Omp16S como adjuvantes induzem em esplenócitos a partir de camundongos imunizados uma resposta citotóxica maior que a resposta induzida pelo adjuvante CFA e sem sinais de alterações no tecido imunizado ou outros efeitos adversos.

[100] Os polipeptídeos Omp19S e Omp16S se provaram úteis em formulações de vacina que compreendem qualquer imunógeno ou antígeno cujo adjuvante seja pelo menos Omp19S e/ou Omp16S. Os polipeptídeos da invenção são adjuvantes úteis para gerar Th1, Th17 e respostas citotóxicas em mucosa pelo uso dos mesmos, ambos nasal e oralmente, e a via sistêmica após a administração parenteral.

[101] As imunorrespostas de célula T são consideradas protetoras contra patógenos e tumores. Os adjuvantes da invenção induzem respostas T produtoras de IFN-y quando administrados por vias parenteral e mucosal (nasal e oral), e, portanto, podem ser úteis em preparações de vacina contra infecção por patógenos com alguma fase intracelular em seu ciclo de vida (ou quando o patógeno é internalizado por macrófagos) como vírus, bactérias, parasitas e fungos; ou tumores. Também induzem citotoxicidade contra uma linhagem de célula tumoral que expressa o antígeno (MO5), e, portanto, poderia ser usada em vacinas contra tumores.

[102] Ademais, já que citocinas de Th1 normalmente inibem citocinas de Th2, pretende-se induzir respostas Th1 contra um alérgeno em vacinas antialérgicas, de modo a redirecionar uma resposta Th2 alérgeno- específica em direção a uma resposta Th1 modulatória. Os adjuvantes da invenção podem ser úteis na modulação da resposta a alérgenos.

[103] Evidência recente demonstrou um papel crítico de células T produtoras de IL-17 em proteção induzida por vacina em infecções por patógenos intracelulares e extracelulares. A geração de respostas Th1 e Th17 foi relatada em vacinas contra Bordetella pertussis, em que a população de células Th17 é importante par a eficácia da proteção. Também foi mostrado que IL-17 tem um papel importante na proteção contra Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis. O mecanismo proposto para a eficácia de vacinas que induzem a ativação de célula Th17 é pela regulação de quimiocinas. Nesse sentido, o uso de um adjuvante capaz de induzir a produção dessa citocina seria benéfico em vacinas contra tal tipo de patógenos.

[104] Finalmente, os adjuvantes da invenção poderiam ser usados como imunomoduladores ou ativadores de imunorrespostas em várias patologias em que a imunorresposta está envolvida.

[105] Conforme mostrado na Figura 24 e dado que a expressão de α4β7 direciona linfócitos a sítios mucosais efetores (lâmina própria intestinal), esses resultados mostram que Omp19S administrado oralmente como adjuvante de toxoide do tétano (TT) em uma formulação de vacina induz a migração de linfócitos T efetores de CD4+ e CD8+ para a mucosa intestinal (lâmina própria do intestino delgado).

[106] Os polipeptídeos de adjuvantes Omp16S e Omp19S também podem ser expressos in situ, sendo administrados como vetores para DNA ou RNA. Conforme mostrado na Figura 25, as proteínas de Omp16 e Omp19 são corretamente expressas após a transfecção de células eucariontes com plasmídeos pCI-Omp16S ou pCI-Omp19S, respectivamente. Esse resultado indica que tais proteínas podem ser produzidas por células eucariontes, administrando vetores de expressão a células eucariontes ou organismos maiores (vertebrados ou mamíferos) de modo que o adjuvante seja expresso in situ e exerça seu efeito.

[107] Caracterizando adicionalmente o mecanismo através do qual o efeito dos adjuvantes da presente invenção ocorre, os ensaios foram conduzidos onde os sobrenadantes e extrato de estômago foram coincubados com polipeptídeos de Omp19S e, então, caseína de BODIPY FL ou OVA de BODIPY FL foi acrescentada (antígenos marcados de maneira intramolecular de modo que não fluorescessem quando não degradados, mas se tornassem fluorescentes quando degradados) a 100 μl de tampão de NaHCO3. Observou- se que a presença do polipeptídeo Omp19S reduz a degradação do antígeno, efeito similar àquele observado quando se usa um coquetel inibidor de protease mamífera (como um controle de que a atividade enzimática do estômago pode ser inibida). Conforme mencionado acima, observa-se que a ação do adjuvante da presente invenção compreende, ainda, um mecanismo de inibição de ação de protease, levando, portanto, à meia vida de antígeno aumentada (Figura 26).

[108] Esses resultados indicam que a imunização que usa o adjuvante Omp19S, além da indução de uma imunorresposta mais alta, diminuem a degradação de antígeno, de modo que a quantidade de Ag administrada em vacinas para estimular e manter a imunorresposta pudesse ser diminuído.

[109] Ensaios adicionais realizados para analisar a ação inibitória de protease por polipeptídeos do adjuvante da presente invenção foram direcionados para a avaliação de se o polipeptídeo Omp19S é capaz de inibir a degradação de diferentes antígenos por proteases a partir do estômago de camundongos BALB/c, ambos eucariontes (BSA, OVA) e bacterianos (BLS, SurA, DnaK), sem limitações ao escopo da presente invenção. Cada antígeno foi tratado com: (i) sobrenadante de extrato de estômago; (ii) sobrenadante de extrato de estômago e Omp19S; (iii) sobrenadante de extrato de estômago e coquetel inibidor de protease mamífera (como um controle de que a atividade enzimática estomacal pode ser inibida). Essas misturas de reação foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida de sulfato de dodecila de sódio (SDS-PAGE) e, então, ao manchamento de azul de Coomassie (Figura 27). Esses ensaios demonstram que os polipeptídeos adjuvantes da presente invenção têm atividade inibitória de degradação de antígeno, ambos de origem eucarionte e bacteriana.

[110] Para testar a ação inibitória de degradação de antígeno por protease de estômago, um ensaio in vivo foi realizado, com o uso de caseína de BODIPY FL como um modelo de antígeno. camundongos BALB/c foram inoculados oralmente com: (i) tampão de NaHCO3 (1 M, pH8) (Veículo), (ii) caseína de BODIPY FL com Omp19S (iii) caseína de BODIPY FL com aprotinina (um inibidor de protease conhecido); (iv) caseína de BODIPY FL. Após um tempo de reação, os camundongos foram sacrificados e os extratos foram analisados por emissão de fluorescência, observando a inibição de degradação de antígeno por proteases de estômago in vivo (Figura 28).

[111] Com base nos diferentes ensaios em que a capacidade inibitória de degradação de antígeno por proteases de estômago foi determinada, pelo menos 30% do efeito inibitório da ação de tais proteases é observado, de preferência pelo menos 50%. Dentre proteases inibidas pela ação dos adjuvantes da presente invenção estão serina proteases, aspartil proteases, metaloproteases e cisteína proteases.

[112] Os polipeptídeos de adjuvante da presente invenção são ideais, já que a capacidade de inibir a destruição de Ag por proteases aumenta a meia vida do mesmo e melhora a indução de uma imunorresposta. Isso poderia significar que uma quantidade menor de Ag seria necessária para induzir a mesma imunorresposta, reduzindo, assim, os custos de vacinas.

[113] Portanto, é surpreendente que Omp16S e Omp19S atuem como adjuvantes altamente eficientes para antígenos que não são relacionados a antígenos de Brucella.

[114] Essa invenção é mais bem lustrada de acordo com os seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como uma limitação do escopo do mesmo. Em contraste, deve-se compreender com clareza que outras realizações, modificações e equivalentes dos mesmos possam ser aplicados, o que, mediante a leitura do presente relatório descritivo, pode ser sugerido por aqueles versados na técnica sem que se saia da essência da presente invenção e/ou âmbito das reivindicações anexados.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: CLONAGEM, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS OMP16S E OMP19S DE BRUCELLA ABORTUS

[115] O polipeptídeo Omp19S foi clonado sem a sequência de lipidação de consenso no vetor pET22+ com a adição de uma cauda de histidina na extremidade carboxila-terminal (Novagen, Madison, WI, EUA), conforme descrito em (Giambartolomei, Zwerdling, Cassataro, Bruno , Fossati e Philipp. Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key Mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus. J Immunol. 173 (7):4635 s 42. 2004). Com maiores detalhes, oligonucleotídeos específicos foram projetados contendo os sítios de restrição para as enzimas NdeI e XhoI na extremidade 5', e na região 3' do gene Omp19 sem a extremidade amino terminal correspondente à sequência de peptídeo de sinal e à cisteína amino terminal: Omp19 Senso: 5’CTGGCCATATGCAGAGCTCCCG3’ (SEQ ID No: 3) Antissenso: 5’AAACTCGAGGCGCGACAGCGTCAC3’ (SEQ ID No: 4)

[116] Na reação PCR, o DNA genômico de B. abortus 544 foi usado como modelo. O produto da reação de ligação foi usado para transformar bactérias competentes da cepa JM109 e DNA de plasmídeo foi purificado com o uso de um kit comercial (Promega).

[117] Com esse construto, as células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) foram transformadas e a expressão de proteína foi induzida com isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG). O extrato bacteriano foi sonicado e a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade com o uso de colunas de níquel (Qiagen, Alemanha), obtendo, assim, o polipeptídeo não lipidado purificado (Omp19S) (SEQ ID No: 1).

[118] O polipeptídeo Omp16S foi clonado sem a sequência de lipidação de consenso no vetor pET22+ com a adição de uma cauda de histidina na extremidade carboxila-terminal (Novagen, Madison, WI, EUA), conforme descrito em (Giambartolomei, et al. Lipoproteins, not lipopolysaccharide, are the key Mediators of the proinflammatory response elicited by heat-killed Brucella abortus. J Immunol. 173 (7):4635 a 42. 2004). Com maiores detalhes, oligonucleotídeos específicos foram projetados contendo os sítios de restrição para as enzimas NdeI e XhoI na extremidade 5', e na região 3' do gene Omp16 sem a extremidade amino terminal correspondente à sequência de peptídeo de sinal e à cisteína amino terminal: Omp16 Senso: 5’GTTGCCATATGGCGTCAAAGAA3’ (SEQ ID No: 5) Antissenso: 5TTGCCGCTCGAGCCGTCCGGCCCC3’ (SEQ ID No: 6)

[119] Na reação PCR, o DNA genômico de B. abortus 544 foi usado como modelo. O produto da reação de ligação foi usado para transformar bactérias competentes da cepa JM109 e DNA de plasmídeo foi purificado com o uso de um kit comercial (Promega).

[120] Com esse construto, as células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) foram transformadas e a expressão de proteína foi induzida com isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG). O extrato bacteriano foi sonicado e a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade com o uso de colunas de níquel (Qiagen, Alemanha), obtendo, assim, o polipeptídeo não lipidado purificado (Omp16S) (SEQ ID No: 2).

[121] Polipeptídeos não lipidados Omp19S e Omp16S foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida de sulfato de docecila de sódio (SDS-PAGE), seguida por manchamento de azul de Coomassie para monitorar os vários estágios de purificação. A identidade dos mesmos foi confirmada por Western Blot com o uso de um anticorpo monoclonal anti-Omp19 e outro anti-Omp16.

[122] Os possíveis traços de LPS que poderiam contaminar os polipeptídeos purificados foram removidos com o uso de resina de sefarose Polimixina B (Sigma-Aldrich). Então, um ensaio com o kit Limulus Amebocyte (Associates of Cape Cod, Woods Hole, MA, EUA) foi realizado para determinar a quantidade de LPS presente nos mesmos. Em todos os experimentos descritos nesse relatório descritivo, as preparações de polipeptídeos recombinantes purificados que contêm <0,25 U de endotoxina/μg de polipeptídeo foram usadas.

[123] A concentração de Omp19S e Omp16S foi avaliada com o uso do método de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL, EUA) com o uso de albumina de soro bovino (BSA) como um padrão. Os polipeptídeos purificados foram divididos e armazenados a -70°C até o uso.

EXEMPLO 2: ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ANIMAL COM O USO DE OMP19S E OMP16S COMO ADJUVANTE

[124] Ovalbumina (OVA) bovina purificada livre de LPS (Sigma- Aldrich) foi usada como antígeno modelo.

[125] Camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade da cepa BALB/c (H-2d) ou C57BL/6 (H-2b) foram usados. As mesmas foram obtidas a partir da Universidad Nacional de La Plata e foram mantidas em alojamentos de abrigo de animal do Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU). Receberam alimento e água ad libitum.

[126] Três tipos de imunização foram realizados: oral ,nasal e parenteral.

- IMUNIZAÇÃO ORAL

[127] Para a imunização oral, dois protocolos foram seguidos, em que a rotina de injeção de grupos diferentes de camundongos foi variada. Amas as rotinas de imunização testadas produziram resultados similares. ROTINA 1:

[128] Nessa primeira rotina, os camundongos BALB/c foram imunizados oralmente seis vezes nos dias 0, 7, 8, 14, 15 e 21 com (i) 100 μg de OVA; (ii) 100 μg de OVA + 100 μg Omp19S; (iii) 100 μg de OVA + 100 μg Omp16S; (iv) 100 μg de OVA + 10 μg de toxina de cólera (CT, Sigma) incorporada em tampão de NaHCO3 (1M, pH8). duas semanas depois da última imunização (dia 35), os camundongos foram sacrificados para avaliar a imunorresposta celular. ROTINA 2:

[129] Camundongos BALB/c foram imunizados oralmente seis vezes nos dias 1, 2, 3, 8, 9 e 10 com (i) 100 μg de OVA; (ii) 100 μg de OVA + 150 μg de Omp19S; (iii) 100 μg de OVA + 150 μg de Omp16S; (iv) 100 μg de OVA + 5 μg de toxina de cólera (CT, Sigma) incorporada em tampão de NaHCO3 (1M, pH8). Uma semana depois da última imunização (dia 17), um teste de reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) foi realizado, e três semanas depois da última imunização (dia 31), os animais foram sacrificados para avaliar a imunorresposta celular. IMUNIZAÇÃO NASAL:

[130] Os camundongos C57BL/6 foram imunizados nasalmente três vezes a cada 7 dias com (i) 50 μg de OVA; (ii) 50 μg de OVA + 10μg de Omp19S; (iii) 50 μg de OVA + 10 μg de Omp16S; (iv) 50 μg de OVA + 1 μg de toxina de cólera (CT, Sigma). 12,5μl foram injetados por narina. Três semanas depois da última imunização, os animais foram sacrificados para avaliar a imunorresposta celular.

[131] Os animais foram sangrados por via retro-orbital e os soros foram armazenados a s -20°C para detectar Abs específicos.

IMUNIZAÇÃO PARENTERAL

[132] Os animais foram imunizados através de via subcutânea (s.c) três vezes a cada 7 dias com (i) 100 μg de OVA; (ii) 100 μg de OVA + 100μg de Omp19S; (iii) 100 μg de OVA + 100 μl de CFA (Sigma-Aldrich) ou (iv) SF. Três semanas após a última imunização, os animais foram sangrados para obter os soros, e alguns deles (5 por grupo) foram sacrificados para avaliar a resposta celular e outros foram submetidos a DTH (5 por grupo).

EXEMPLO 3: TESTE PARA AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE DE OMP19S E OMP16S: RESPOSTA DE HIPERSENSIBILIDADE DO TIPO TARDIO (DTH)

[133] Sete dias após a última imunização, os camundongos foram inoculados por via intradérmica no coxim palmar direito com 20μg de OVA e com solução fisiológica (SF) no coxim palmar esquerdo. A resposta foi avaliada através da medição do coeficiente de aumento da pele do coxim palmar direito quando comparado ao esquerdo, com o uso de um calibre digital de 0,01 mm de precisão, 48 horas e 72 horas após a inoculação.

OBTENÇÃO DE ESPLENÓCITOS DE CAMUNDONGOS:

[134] Os camundongos foram anestesiados com éter, foram sangrados até atingir a palidez através do plexo retro-orbital e foram sacrificados por deslocamento cervical. Uma incisão adequada foi realizada, abrindo a cavidade peritoneal, para exteriorizar o baço, o qual foi extraído com fórceps e tesoura sob condições assépticas. O baço foi triturado em pequenos fragmentos com o uso de tesoura com ponta curvada. Uma quantidade de 3 ml de RPMI 1640 (Gibco) foi adicionada e foi homogeneizada. A suspensão foi levada até 8 ml e filtrada através de malha de aço para reter os resíduos celulares e de tecido. Então, foi lavada com RPMI 1640, e as células foram suspensas em meio de cultura completo (RPMI 1640 com a adição de 10% de soro bovino fetal (SFB, Gibco), 2mM de L-glutamina e piruvato, 25 mM de HEPES, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina).

OBTENÇÃO DE LINFÓCITOS DE NODOS LINFÁTICOS MESENTÉRICOS DE CAMUNDONGOS

[135] Os camundongos foram anestesiados com éter, foram sangrados até atingir a palidez através do plexo retro-orbital e foram sacrificados por deslocamento cervical. Uma incisão adequada foi realizada, abrindo a cavidade peritoneal, para exteriorizar os nodos linfáticos mesentéricos, os quais foram extraídos com fórceps e tesoura sob condições assépticas. Foram, então, incubados com colagenase (2,5 mg/ml) por 30 minutos. A colagenase foi, então, removida e os linfonodos foram triturados em pequenos fragmentos com o uso de tesoura com ponta curvada. Após a adição de 3 ml de RPMI 1640 (Gibco), a suspensão celular foi homogeneizada, levada a 8 ml e filtrada através de malha de aço para reter os resíduos celulares e de tecido. Então, foi lavada com RPMI 1640, e as células foram ressuspensas em meio de cultura completo (RPMI 1640 com a adição de 10% de soro bovino fetal (SFB, Gibco), 2mM de L-glutamina e piruvato, 25 mM de HEPES, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina).

CONTAGEM CELULAR VIÁVEL:

[136] Para determinar o número de células viáveis, o método de Exclusão do Azul de Tripano foi usado. Uma quantidade de 0,2% de solução de Azul de Tripano foi preparada em PBS. 50 μl da suspensão a ser contada foi obtida e 50 μl da solução de Azul de Tripano foi adicionada. Foi carregada em uma câmara de Neubauer e o número de células viáveis foi determinado por microscópio óptico.

ESTÍMULO CELULAR

[137] Os esplenócitos (4 x 106 células/ml) de camundongos imunizados foram cultivados na presença de OVA (100 e 1.000 μg/ml), meio completo ou mitógeno de controle (Concanavalin A, 5 μg/ml) em placas com 48 cavidades. As culturas foram realizadas em um forno a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por 72 horas para experimentos que usam células de camundongos BALB/c ou por 5 dias para experimentos que usam células de camundongos C57BL/6. Os sobrenadantes dessas células foram usados para determinação de citocina secretada por ELISA.

ELISA DE CAPTURA PARA DETECÇÃO DE CITOCINAS

[138] Os ELISAs de captura foram realizados com o uso de Abs monoclonais específicos para detectar IFN-y, IL-2, IL-10, IL-4 (OptEIATM, PharMingen, San Diego, USA) e IL-17 (Mouse IL-17 Quantikine, R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA) nos sobrenadantes de cultura de esplenócitos estimulados e de controle. O protocolo foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.

ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO IN VITRO

[139] Os esplenócitos de camundongos imunizados (2x105 células/ml) foram cultivados em triplicatas na presença de OVA (100 e 1.000 μg/ml), meio completo ou mitógeno de controle (Concanavalin A, 5 μg/ml) em placas com 96 cavidades. As culturas foram realizadas em um forno a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. Cinco dias depois, um pulso de timidina identificada com títrio (1 μCi/cavidade) foi adicionado e, 18 horas depois, as células foram colidas, e a incorporação de timidina radioativa (expressa em contagens por minuto: cpm) foi medida com um contador beta. Os resultados foram expressos como índice de estímulo SI (cpmOVA /cpmRPMI). Quanto um SI é >2, é considerado como significante.

DETERMINAÇÃO DE IFN-y INTRACELULAR EM LINFÓCITOS T CD4+ E CD8+: - CÉLULAS QUE APRESENTAM ANTÍGENO (APC) MO5 E A20J

[140] As células A20J foram cultivadas (linfoma de camundongo B, singênico para BALB/c, ATCC TIB208) em meio de cultura completo (RPMI 1640 com a adição de 10% de soro bovino fetal (SFB, Gibco), 2 mM de L- glutamina e piruvato, 25 mM de HEPES, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina) por dois dias. Essas células foram estimuladas com 10 μg/ml de OVA um dia antes do teste, doravante denominadas A20JOVA. Similarmente, as células MO5 (células de melanoma B16 singênicas para C57BL/6 e estavelmente transfectadas com um plasmídeo que expressa OVA) foram cultivadas a fim de usá-las como células que apresentam OVA, em meio completo suplementado com 1mg/ml de geneticina.

[141] A microscopia mostrou que o estado e o número de células eram otimizados para uso. Essas células foram tratadas com Mitocina C (25 μg/ml, Sigma) a 37°C por 30 minutos, lavadas 3 vezes com RPMI e suspensas em meio de cultura completo.

- ESPLENÓCITOS DE BAÇO DE CAMUNDONGO

[142] Os esplenócitos de camundongo agrupados de cada grupo de imunização foram cultivados em garrafas T25, em meio de cultura completo. No dia seguinte, foram cultivados em uma placa de 6 cavidades com 8x106 células/ml, em meio completo suplementado de 1 ml com recombinante IL-2 (10 U/ml). Subsequentemente, os estímulos listados abaixo foram adicionados.

- ESTÍMULOS

[143] Para cada grupo de camundongos imunizados, os seguintes estímulos foram conduzidos: (a) Controle negativo: meio de cultura completo com a adição de recombinante de camundongo IL-2 (10 U/ml) (PeproTech. Inc., Rocky Hill, USA) (b) Estímulos antigênicos i- No caso de animais BALB/c, 500 μg/ml de OVA + peptídeo de OVA restrito a MHC de classe II OVA323-339 KISQAVHAAHAEINEAGOVA (1μg/ml) + células A20JOVA tratadas com mitocina em uma razão de 25 esplenócitos: 1 APC foram usados, todos suspensos em 1 ml de meio de cultura completo suplementado com recombinante IL-2. ii- No caso de animais C57BL/6, 500 μg/ml de OVA + peptÍdeo257- 264 de OVA SIINFEKL restrito a MHC-I (0,5μg/ml) + células que apresentam MO5 em uma razão de 25 esplenócitos: 1 APC foram usados, todos suspensos em 1 ml de meio de cultura completo suplementado com recombinante IL-2. (c) Controle positivo, estímulo mitogênico. 20ng/ml de PMA + 0,75μg/ml de Iono, ambos suspensos em 1 ml de meio de cultura completo suplementado com recombinante IL-2.

[144] Após 18 horas de incubação com os diferentes estímulos, 10 μg/ml de Brefeldina A (Sigma) foram adicionados a cada estímulo de cavidade e incubados adicionalmente por 6 horas. Posteriormente, esplenócitos foram coletados e separados em dois tubos (um para controle de isótopo e um para manchamento com IFN-y) para manchamento subsequente com anticorpos para testes de citometria.

- SUBTIPOS CELULARES E MANCHAMENTO COM IFN-Y

[145] Os esplenócitos estimulados e de controle foram incubados por 30 minutos a 4°C com Abs monoclonais de camundongo anti-CD4 específicos marcados com PE-Cy5.5 e Ab de camundongo anti-CD8 marcado com Alexa Fluor 647 (BD Biosciences, San Jose, CA). Foram, então, lavados com PBS e subsequentemente fixados pelo tratamento por 20 minutos à temperatura ambiente com 4% de solução de paraformaldeído. Após a lavagem com PBS , as células foram permeabilizadas por tratamento com tampão de permeabilização (2% de saponina, 10% de SFB em PBS) por 30 minutos. As células então permeabilizadas foram centrifugadas a 600g por 5 minutos e tratadas com um Ab anti-IFN-y de camundongo específico marcado com PE por 30 minutos. Para todos os tratamentos, a marcação foi realizada em paralelo ao Abs marcado com os mesmos fluorocromos, porém, com especificidade irrelevante como controles de isótopo. Após a lavagem, as células foram suspensas em PBS e finalmente analisadas com o uso de um citômetro de fluxo (BD FACSCalibur) e do software FlowJo (versão 5.7.2)

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA α4β7 EM LINFÓCITOS DE LINFONODO MESENTÉRICO

[146] Após obter as células dos nodos linfáticos mesentéricos de acordo com o protocolo mencionado acima, os agrupamentos foram montados dependendo do grupo de imunização. As células 2x106 foram obtidas a partir de cada um desses, e foram tratadas com anti-CD4 de camundongo marcado com FITC, anti- CD8 de camundongo marcado com PE-Cy5.5 e anti-α4β7 de camundongo marcado com PE (BD Biosciences, San Jose, CA). Subsequentemente, as células foram fixadas em 100 μl de paraformaldeído a 4% e, então, analisadas por citômetro de fluxo (FACSCalibur BD) e software FlowJo (versão 5.7.2).

ENSAIO IMUNOSSORVENTE LIGADO A ENZIMA INDIRETO (ELISA) PARA DETECTAR ABS ESPECÍFICOS

[147] Para realizar o ELISA, placas de poliestireno (Maxisorp, NUNC, Dinamarca) foram usadas. As placas foram revestidas com 1μg de OVA por cavidade e bloqueadas com 200 μl de leite desnatado (Molico) a 3% em tampão de PBS. Então, as placas foram incubadas com diluições em série dos soros e reveladas com anti-IgG de camundongo conjugado com HRP. Para determinar os isótopos específicos, as placas foram incubadas com anticorpos específicos para isótopos de Ig de camundongo, IgG1 e IgG2a, conjugados com HRP (Santa Cruz). As incubações foram realizadas por 1 hora à temperatura ambiente. 1% de pó de leite desnatado, 0,05% de Tween em PBS foram usados como diluente para soros e foram conjugados. Após cada etapa de incubação, a placa foi lavada 3 vezes com 0,05% de PBS-Tween. O ELISA foi revelado com 2 mg/ml de ortofenilenodiamina e 0,03% de H2O2 em 0,1M de tampão de fosfato/citrato. A reação foi interrompida entre 15 e 30 minutos de incubação com 50 ml de H2SO4 4N. As densidades ópticas desenvolvidas foram determinadas a 492 nm em um leitor de microplaca Metertech ∑ 960. Para determinar a titulação do anticorpo, 20 soros de camundongos normais foram testados a uma diluição 1/100, estabelecendo o valor de corte como o valor médio da absorbância do mesmo mais três desvios padrão. O título de anticorpo foi calculado como a última diluição que foi maior do que o valor de corte.

ENSAIO DE CITOXICIDADE CÉLULAS ALVO

[148] As células MO5 foram usadas como alvo (células de melanoma B16 singênicas com C57BL/6 e estavelmente transfectadas com um plasmídeo que expressa OVA) cultivado em meio completo suplementado com 1mg/ml de geneticina. As células B16 foram usadas como controle (células de melanoma não transfectadas com plasmídeo de OVA).

CÉLULAS ESTIMULADORAS

[149] As células MO5 foram usadas como estímulo cultivado em meio completo suplementado com 1mg/ml de geneticina, as quais foram pré- incubadas com 10 μg de OVA por 18 horas e, então, tratadas com mitocina C (25 μg/ml) a 37°C por 30 minutos, lavadas 23 vezes com RPMI e suspensas em meio completo.

CÉLULAS EFETORAS

[150] Os esplenócitos de camundongos de controle e imunizados eram as células efetoras (2,5x107 células totais), previamente estimuladas por 5 dias com as células estimuladoras descritas (0,5x106 células) em meio completo + 10U/ml de recombinante IL-2.

IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS ALVO

[151] As células alvo foram incubadas com cromato de sódio radioativo em solução aquosa (51Cr, Amersham Biosciences) a uma taxa de 0,1mCi/1x106 células, por 1 hora em um banho de água a 37°C e, então, lavadas 3 vezes com RPMI.

ENSAIO

[152] As células alvo foram incubadas com diferentes quantidade de células efetoras (razão de 100:1, 50:1) por 6 horas em um forno a 37°C. Subsequentemente, 100 μl foram colhidos a partir dos sobrenadantes de cultura e radiação foi quantificada por um contador y (Clinigamma, LKB, Wallac, Turku, Finlândia). Os resultados obtidos foram convertidos em % de lise com o uso da seguinte fórmula:

Em que: x: amostra LE: liberação espontânea de células alvo quando incubadas sem células efetoras máx: liberação máxima, determinada ao incubar as células alvo com 1% de Triton X-100.

EXEMPLO 4: EXPERIMENTOS QUE MOSTRAM A ATIVIDADE DE ADJUVANTE OMP19S EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS

[153] Os camundongos de cepa OT-1, cujas células T CD8+ expressam o receptor de célula T específico para peptídeo de ovalbumina (OVA) SIINFEKL, foram usados como células T CD8+ antígeno-específicas doadoras. Esses camundongos foram adquiridos junto à Jackson Laboratory e trazidos para o país por Dr. Fernando Goldbaum, o qual ofereceu gentilmente a sua cepa. Os camundongos C57BL/6 singênicos adquiridos na Universidad Nacional de La Plata foram usados como receptores das células dos animais OT-1. Todos os camundongos receberam água e alimentos ad libitum e foram mantidos sob condições livres de patógeno.

[154] A ovalbumina (OVA) purificada e livre de LPS (Sigma- Aldrich) foi usada como antígeno modelo, conforme descrito no Exemplo 1. Em todos os experimentos descritos, as preparações de peptídeos recombinantes purificados que contêm <0,25 U de endotoxina/μg de peptídeo foram usados.

[155] Em alguns experimentos, o peptídeo foi digerido com proteinase K como um controle. Com essa finalidade, Omp19S foi tratado com proteinase K-agarose de tricirachium album (Sigma Aldrich) por 2 horas a 37°C seguindo as instruções do fabricante. Então, a resina foi centrifugada e os sobrenadantes foram incubados por 1 horas a 60°C com o propósito de inativar qualquer traço de enzima que pode ter sido solubilizado. Em seguida, a digestão foi verificada com o uso de SDS-PAGE e manchamento com azul de Coomasie subsequente. O peptídeo então tratado (Omp19S PK) foi usado como um controle do efeito adjuvante induzido pelo dito peptídeo.

TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE CÉLULAS DE CAMUNDONGOS OTI E IMUNIZAÇÃO

[156] As células T CD8+ OVA-específicas foram obtidas a partir do baço e os linfonodos de camundongos OT-1, os quais foram purificados por seleção negativa com o uso do kit de Enriquecimento de linfócito T CD8+ de camundongo (BD Imag) e, então, manchados com CFSE 5 μM a 37°C por 15 minutos. O succinimidil éster de carboxifluoresceína livre (CFSE) (Molecular Probes) foi resfriado através da adição de solução salina em tampão de fosfato (PBS) com 10% de SFB. Posteriormente, as células marcadas foram lavadas com PBS e ressuspensas em um volume de 0,1 ml. Então, as células foram injetadas de modo intravenoso (i.v.) nas veias laterais da cauda dos animais. Um dia depois, os animais foram inoculados subcutaneamente (s.c.) com: (i) 60 μg de OVA, (ii) 60 μg de OVA + 100 μg de Omp19S, (iii) 60 μg de OVA + 100 μg de Omp19S PK, (iv) 10 μg de OVA + LPS (Sigma Aldrich) como um controle, ou (v) PBS.

ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO IN VIVO

[157] Cinco dias após a imunização, os animais que recebem células de OT-1 foram sacrificados. O baço e os linfonodos drenantes (inguinal e axilar) foram extraídos e o número de células T CD8+ antígeno- específicas marcadas com CFSE foi determinado por citometria de fluxo (BD FACSAriaII). Os resultados foram analisados com o uso de software FlowJo (Versão 5.7.2).

EXEMPLO 5: OMP19S COMO ADJUVANTE EM FORMULAÇÕES DE VACINA

[158] 6 imunizações por meio de via oral foram realizadas com (i) 100 Lf de TT (toxoide tetânico), (ii) 100 Lf de TT + 150 μg de Omp19S, ou (iii) 100 Lf de TT + 5 μg de TC, de acordo com o seguinte esquema:

[159] Os camundongos foram sacrificados 3 semanas após a última imunização e a porcentagem de células T que expressam o marcador α4β7 foi analisada em nodos linfáticos mesentéricos.

EXEMPLO 6: CLONAGEM DE GENES CODIFICADORES OMP16S E OMP19SEM UM VETOR DE EXPRESSÃO EUCARIONTE PROJETO DE INICIADOR

[160] Os oligonucleotídeos iniciadores foram projetados a partir da sequência de nucleotídeos de Omp16 e Omp19 (Genbank Omp16: ACESSO L27996. Omp19: ACESSO L27997). Os iniciadores contêm sítios de restrição XhoI e XbaI (em negrito). Todos os “iniciadores” foram adicionados à sequência de Kozak eficiente conhecida para a transcrição em eucariontes (sublinhados na sequência). Omp16S: “Senso”: 5’ CTC CTC GAG ACC ACC ATG GCG TCA AAG AA 3’ (SEQ ID No: 7) “Antissenso”: 5’ TTG TCT AGA TTA CCG TCC GGC CCC GTT GA 3’ (SEQ ID No: 8) Omp19S: “Senso”: 5’ GGC ATT CTC GAG ACC ACC ATG CAG AGC TCC 3’ (SEQ ID No: 9) “Antissenso”: 5’ TTT TCT AGA TCA GCG CGA CAG CGT CAC 3’ (SEQ ID No: 10)

CLONAGEM

[161] Os genes de interesse foram ampliados por reação em cadeia de polimerase (PCR) com o uso dos iniciadores correspondentes com uma temperatura de anelamento de 55°C e com o uso de DNA genômico de Brucella como modelo. O vetor pCI-Neo (Promega) foi usado para clonagem de Omp16S e Omp19S. Esse vetor foi digerido com XhoI e XbaI e, então, foi purificado pelo método fenol: clorofórmio. Os produtos de ampliação das PCRs foram digeridos com as enzimas de restrição correspondentes. Todos os produtos de ampliação das PCRs foram repurificados por Wizard PCR Preps (Promega, Madison, WI. USA). As reações de ligação foram realizadas a 4°C de um dia para o outro na presença da enzima DNA T4 ligase (Promega), 1 μl de plasmídeo digerido (pCl) e 2 μl do inserto digerido correspondente. Então, células competentes de E. coli JM109 (Promega) foram transformadas com o uso do método CaCl2 com 5 μl da reação de ligação. As bactérias transformadas foram selecionadas, cultivadas a 37°C em placas LB com ampicilina (25 μg/ml). A fim de determinar as colônias que contêm o plasmídeo com o inserto adequado, uma triagem foi realizada com o uso do método de “PCR de colônia”.

EXPRESSÃO IN VITRO TRANSFECÇÃO TRANSIENTE DE CÉLULAS COS-7

[162] A fim de avaliar a expressão in vitro dos plasmídeos em células eucariontes, as células COS-7 (ATCC, CRL1651, Rockville, MD, USA) foram transfectadas com o uso do método de lipossomo com 2 μg dos construtos a seguir: vetor pCI-Omp16S, pCI-Omp19S ou pCI (como um controle) e 20 μl de Lipofectamina (Gibco BRL, Gaithersburg, MD. USA) seguindo o protocolo do fabricante.

EXPRESSÃO DE OMP16S OMP19S EM CÉLULAS COS-7

[163] A expressão dos plasmídeos foi avaliada 24 horas e 48 horas após a transfecção (expressão transiente) em extratos de proteína total. Essa foi analisada por Western Blot, com o uso de diferentes anticorpos monoclonais: anti- Omp16 ou anti-Omp19 e revelada com o uso de um kit ECL de quimioluminescência (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suécia)

EXEMPLO 7: INIBIÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA ESTOMACAL IN VITRO. ENSAIO FLUOROMÉTRICO SUBSTRATOS

[164] A ovalbumina Bovina BODIPY FL (OVA) e a Caseína BODIPY FL foram usadas como antígenos modelo. Ambos os antígenos são marcados intramolecularmente para que não fluoresçam quando não degradados, porém, fluoresçam quando degradados (Kit de Ensaio para Protease EnzChek® *fluorescência verde*, Molecular Probes).

[165] A cepa de camundongos fêmea com 6 a 8 semanas de idade BALB/c (H-2d) foi usada. Esses foram obtidos a partir do viveiro na Universidad Nacional de La Plata e foram mantidos no viveiro do Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU). Receberam água e alimento ad libitum.

OBTENÇÃO DE ESTÔMAGOS DE CAMUNDONGOS

[166] Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. Uma incisão adequada foi praticada, abrindo a cavidade peritoneal, para exteriorizar o estômago que foi extraído com fórceps e tesoura sob condições assépticas.

PROCESSAMENTO DE ESTÔMAGOS DE CAMUNDONGOS

[167] Os estômagos foram primeiramente desagregados com grampos e tesoura e as partes obtidas foram transferidas para um pote e embebido em tampão de NaHCO3 (1M, pH8) para completar a desagregação. Os extratos obtidos foram centrifugados a 10.000xg e os sobrenadantes foram usados para realizar o ensaio.

ENSAIO

[168] Controle negativo: Caseína BODIPY FL ou OVA BODIPY FL (10 μg/ml) em tampão de NaHCO3 (1M, pH8).

[169] Avaliação de atividade inibitória de Omp19S: os estômagos foram coincubados com Omp19S (100 μg/ml) por 30 minutos e, então, com Caseína BODIPY FL ou OVA BODIPY FL em 100 μl de tampão de NaHCO3.

[170] Outros controles: Autofluorescência estomacal: estômago em 100 μl de tampão de NaHCO3. Determinação de que a atividade enzimática estomacal pode degradar Caseína ou OVA: estômagos foram coincubado com Caseína BODIPY FL ou OVA BODIPY FL (10 μg/ml) em 100 μl de tampão de NaHCO3. Determinação de que a atividade enzimática estomacal pode ser inibida: estômagos foram coincubados com um coquetel de inibidor de proteases de mamíferos (Sigma) por 30 minutos e, então, com Caseína BODIPY FL ou OVA BODIPY FL (10 μg/ml) em 100 μl de tampão de NaHCO3. Controle positivo: Caseína BODIPY FL ou OVA BODIPY FL (10 μg/ml) em tampão de NaHCO3 (1M, pH8) tratadas com proteinase K (Sigma).

[171] A fim de avaliar os níveis de fluorescência, as misturas de reação foram transferidas para placas pretas/opacas com 96 cavidades (baixa autofluorescência) (Costar). A emissão de fluorescência foi analisada em um leitor placa Victor3, Perkin Elmer, Waltham, MA.

EXEMPLO 8: INIBIÇÃO DE DEGRADAÇÃO DE DIFERENTES ANTÍGENOS EUCARIONTES OU BACTERIANOS POR ENZIMAS ESTOMACAIS.

[172] Antígenos eucariontes: ovalbumina bovina (OVA), albumina de soro bovino (BSA)

[173] Antígenos bacterianos: lumazine sintase de Brucella recombinante (BLS), chaperona de Brucella recombinante (DnaK) e peptidil-prolil cis-trans isomerase (SurA) de Brucella recombinante.

ENSAIO

[174] As seguintes misturas de reação foram realizadas e incubadas por 1 hora a 37°C: (i) 5 μg de cada antígeno (OVA, BSA, BLS, DnaK ou SurA) (ii) 5 μg de cada antígeno (OVA, BSA, BLS, DnaK ou SurA) com 0,1 μg de sobrenadante de extrato estomacal. (iii) 5 μg de cada antígeno (OVA, BSA, BLS, DnaK ou SurA) com 0,1 μg de sobrenadante de extrato estomacal e 0,3 μg Omp19S. (iv) 5 μg de cada antígeno (OVA, BSA, BLS, DnaK ou SurA) com 0,1 μg de sobrenadante de extrato estomacal e coquetel de inibidor de proteases de mamíferos (Sigma).

[175] Após a incubação, cada mistura de reação foi submetida a uma eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e manchamento subsequente com azul de Coomasie.

EXEMPLO 9: COADMINISTRAÇÃO DE OMP19S INIBE A DEGRADAÇÃO DE ANTÍGENO POR PROTEASES ESTOMACAIS IN VIVO.

[176] A Caseína BODIPY FL (Kit de Ensaio com Protease EnzChek® *fluorescência verde*, Molecular Probes) foi usada como antígeno modelo.

[177] A cepa de camundongos fêmea com 6 a 8 semanas de idade BALB/c (H-2d) foi usada. Esses foram obtidos a partir do viveiro na Universidad Nacional de La Plata e foram mantidos no viveiro a partir do Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU). Receberam água e alimento ad libitum.

[178] As seguintes inoculações foram realizadas pela via oral: (i) Veículo: 200 μl de tampão de NaHCO3 (1M, pH8). (ii) 100 μg de Caseína BODIPY FL com 100 μg de Omp19S. (iii) 100 μg de Caseína BODIPY FL com 100 μg de aprotinina. (iv) Caseína BODIPY FL.

[179] Após 15 minutos após a inoculação, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical, e os estômagos foram extraídos e processados.

[180] Os sobrenadantes de extratos de estômagos obtidos foram transferidos para placas pretas/opacas com 96 cavidades (baixa autofluorescência) (Costar). A emissão de fluorescência foi realizada em um leitor de placa Victor3, Perkin Elmer, Waltham, MA.

Claims

1. VACINA, caracterizada por compreender um polipeptídeo de membrana externa bacteriana não lipidado (Omp) do gênero Brucella, selecionado a partir do polipeptídeo não lipidado Omp19S e do polipeptídeo não lipidado Omp16S e pelo menos um antígeno.

2. VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo polipeptídeo não lipidado Omp19S compreender a SEQ ID N° 1.

3. VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo polipeptídeo não lipidado Omp16S compreender a SEQ ID N° 2.

4. VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo antígeno ser um antígeno mucosal.

5. VACINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser selecionada a partir do grupo composto por vacinas mucosais e parenterais.

6. USO DO ADJUVANTE que compreende um polipeptídeo de membrana externa bacteriana não lipidado (Omp) do gênero Brucella, selecionado a partir do polipeptídeo não lipidado Omp19S e do polipeptídeo não lipidado Omp16S, caracterizado por ser para o preparo de uma vacina contra um patógeno.

7. USO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo patógeno ter pelo menos uma fase intracelular em seu ciclo de vida.

8. USO DO ADJUVANTE que compreende um polipeptídeo de membrana externa bacteriana não lipidado (Omp) do gênero Brucella, selecionado a partir do polipeptídeo não lipidado Omp19S e do polipeptídeo não lipidado Omp16S, caracterizado por ser para preparar uma vacina antitumoral.

9. USO DO ADJUVANTE que compreende um polipeptídeo de membrana externa bacteriana não lipidado (Omp) do gênero Brucella, selecionado a partir do polipeptídeo não lipidado Omp19S e do polipeptídeo não lipidado Omp16S, caracterizado por ser para preparar uma composição imunomodulatória.