KR20090064412A

KR20090064412A - 면역 반응을 유발 또는 유도하는 방법

Info

Publication number: KR20090064412A
Application number: KR1020097006683A
Authority: KR
Inventors: 스털링 존 에드워즈; 마틴 존 피어스; 장-피에르 이브 쉐링크; 필립 서튼
Original assignee: 씨에스엘 리미티드; 더 유니버시티 오브 멜버른
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2007-08-31
Publication date: 2009-06-18
Also published as: EP2066341A1; EP2066341A4; CA2662164A1; CN101522213A; EP2066341B1; JP5265545B2; AU2007291887A1; DK2066341T3; US20090324642A1; JP2010501595A; ES2547855T3; AU2007291887B2; WO2008025095A1; US9150619B2; NZ575141A

Abstract

인간 또는 동물 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위한 방법으로서, 항원 및 보조제를 포함하는 조성물을 상기 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 폐내 경로에 의해 피험체에 투여되는 것인 방법이다.

면역 반응 유도, 항원, 폐내 투여

Description

면역 반응을 유발 또는 유도하는 방법{METHOD OF ELICITING OR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE}

본 발명은 피험체, 특히 인간 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 특히 비침(needle-less) 투여 경로를 이용한 방법으로, 피하 또는 근육내 경로와 같은 백신 투여를 위한 보다 전통적인 주사경로에 대한 대안을 제공한다.

수년동안, 사(non-living) 백신 항원을 전달하기 위한 수단으로서 기도를 이용한 다양한 시도가 있어왔다. 이 경로는 백신 용인성("주사바늘 공포증" 회피)과 관련하여, 점막 면역 시스템의 일관성을 가정한 경우, 먼 점막 자리에서의 반응을 유도할 가능성과 국소 면역 반응을 유도할 기회의 장점을 제공하는 것으로 보인다. 인간과 동물에서 비강내 경로에 의해 백신을 전달하는 것에 대해서도 많은 시도가 있어 왔다. 지금까지의 결과는 면역 유도와 항원 흡수(uptake)를 확보하기 위해 이 경로는 특별한 전달 기술의 사용 및/또는 매우 많은 항원의 복용량을 필요로 한다는 것을 나타낸다. 유사하게, 폐내 또는 폐 경로를 통한 백신의 전달은 면역반응을 최적화하기 위해, 지금까지 마이크로캡슐화(microencapsulation)와 같이 특별화된 전달 기술을 일반적으로 요구하여 왔다(예를 들어, Oya Alpa et al., 2005 참조).

본 발명에 앞선 연구에서, 발명자들은 비강내 경로에 의한 백신의 전달은 매우 비효율적이며, 심지어 고용량의 용량에서도 저조한 국소 면역을 유도한다는 것을 관찰하였다. 따라서, 발명자들은 "주사바늘 공포증"을 회피하는 장점을 유지하면서, 대안적인 백신 투여 경로를 연구하여 왔다.

놀랍게도, 본 발명자들은 면역 반응을 유도하는 수단으로서, 비강내 경로에 의한 것보다 폐로 백신을 전달하는 것의 우수성을 입증하였다. 연구자들은 또한 폐를 통해 보조제가 함께 전달될 때, 극소량의 항원을 이용해도 강한 전신 면역 반응이 유도될 수 있음을 입증하였다. 특히, 본 발명자들은 항원과 보조제가 조합된 직(straightforward) 백신 조성물이 특별한 흡수 기술에 대한 필요없이 폐내 전달에 대한 강한 전신 면역 반응을 유도하는 것을 확인하였다. 특히, 폐내 전달은 폐 점막 면역 반응을 야기하고, 이는 극소량의 항원이 폐를 통해 보조제와 함께 전달되는 경우일지라도, 통상의 비경구 면역에 의해 유도되는 것보다 100배(10Ox) 클 수 있다.

Griffith 등(1997)은 수산화알루미늄과 함께 리포솜(liposome) 또는 PBS 중에서 제제화된 리신 톡소이드(toxoid)의 기관내 전달을 기술하고 있다. 리포솜 제제화된 군은 최상의 보호능을 보여준다; 수산화 알루미늄은 보호능이 PBS 보다 개선되지 않았다. WO 2005/110379호는 미립자 말라리아 백신의 폐 전달을 기술하고 있다. 제제는 미립자 제제로서 전달되고, 항원의 지속 방출이 가능하였다.

이전의 공개문헌(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지의 임의 내용에 대해, 본 명세서에서 언급된 내용들은, 이전의 공개문헌(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지된 내용이 본 기술분야에서 통상적인 상식을 가진 자로 하여금 본 명세서와 관련된 내용을 시도하도록 인식 또는 승인 또는 어떠한 형태의 제안으로 여겨지지 않으며, 여겨져서는 않는다.

본문에 이와 다른 언급이 없는 한, 다음의 본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 및/또는 "포함하는" 또는 "포함되는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 언급된 정수들 또는 단계들을 내포하는 것으로 이해되나, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.

발명의 개요

본 발명은 인간 또는 동물 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위한 방법을 제공하는 것으로서, 상기 피험체에 항원 및 보조제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 이때 조성물은 폐내 또는 폐 경로에 의해 피험체에 투여된다.

바람직하게는 본 조성물은 폐 내 또는 폐 투여에 적합하게 제제화된다.

다른 양태에서, 본 발명은 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위해, 인간 또는 동물 피험체에 폐내 또는 폐 투여에 있어서, 또는 이를 위한 약제의 제조에 있어서, 항원 및 보조제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 폐내 또는 폐 경로에 의해 인간 또는 동물 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위한 제제를 제공하며, 상기 제제는 항원 및 보조제를 포함하는 조성물이다.

도면의 간단한 설명

도 2, 3, 4, 6, 9 및 10에서,

수평 막대 = 평균값

오픈 막대 = 값의 중앙 50%

수직 선 = 10 및 90 퍼센트

도 1은 폐 상부와 폐 하부(또는 심부)에 대응하는 영역을 나타내는 양의 폐의 그림이다(Nickel 등, 1979에서 변형한 폐 그림).

도 2 및 3은 초기 실험에서 얻은 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 양 그룹을 인플루엔자 바이러스 항원(인플루엔자 항원) 단독 또는 100㎍ ISCOMATRIX^TM보조제(IMX = ISCOMATRIX^TM 보조제)와 함께 제제화된 항원을 3주 간격으로, 피하(s/c) 또는 폐내(폐) 경로로 3회 투약하여 면역화하였다. 혈액(혈청) 및 폐(기관지-폐포 세척(BAL)) 샘플은 첫번째 투약 1주일 전, 첫번째 투약 2주 후, 두번째 및 세번째 투약 1주일 후에 얻었다.

도 2는 15㎍ 인플루엔자 바이러스 항원 단독으로 이루어진 제제(최근 입수가능한 인플루엔자 백신의 1가 용량의 등가량) 및 100㎍ ISCOMATRIX^TM 보조제와 함께 제제화된 감소된 양의 인플루엔자 항원으로 이루어진 제제의 1, 2, 및 3회 투약(1°, 2° 및 3°) 후의 항체 반응[효소 면역분석(EIA)로 인플루엔자-특이적 종말점 역가]을 보여준다. IgG와 IgA 모두에 대한 분석은 혈청 및 BAL(폐) 샘플에서 수행되었다.

(* Mann-Whitney 분석을 이용한, 유의차)

도 3은 ISCOMATRIX^TM 보조제가 있는 경우와 없는 경우 극소량의 인플루엔자 항원으로 피하 및 폐 내 경로에 의해 면역화가 수행되는 경우에서, 도 2와 동일한 면역화 및 샘플 스케줄 및 분석 방법을 이용한 항체 반응을 보여준다.

(#, *, ^, §,

는 Mann-Whitney 분석을 이용한, 유의차)

도 4, 6, 7, 9, 10의 통계 분석은 데이타를 로그값으로 전환한 후, SPSS 소프트웨어 버전 13을 이용하여, Dunnett's post-hoc 분석을 수반하는 분산 분석(ANOVA)에 의해 군을 비교하였다.

도 4는 폐 상부 또는 폐 하부(도 1)로 전달되는 ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍과 함께 제제화된 인플루엔자 항원 0.04㎍를 3회 투약 면역화한 후, 양 그룹에서의 항체 반응을 보여준다. 혈청과 BAL(폐) 샘플을 세번째 투약 1주일 후 수집하였다.

도 5는 단백질을 NHS-활성화된 HP 컬럼에 커플링된 gB-특이적 58-15 단일클론 항체의 친화성 컬럼상에서 정제한 후, 정제된 사이토메갈로바이러스(CMV) ΔgB 단백질의 쿠마시 염색된 SDS 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔이다. 레인 1 내지 4는 4개의 다른 친화성 정제 런으로부터 정제된 ΔgB를 보여준다.

도 6은 피하 또는 폐내 경로로 전달된 ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍와 함께 제제화된 CMV ΔgB의 3회 투약한 후, 8마리 양 그룹에서의 CMV ΔgB-특이적 항체 반응을 보여준다. 혈청 및 BAL에서의 항체 반응을 분석하고, ΔgB-특이적 EIA를 이용하여 IgG와 IgA에 대한 종말점 역가를 측정하였다. 그래프는 첫번째 투약(1차 후) 2주일 후, 및 두번째 투약(2차 후)와 세번째 투약(3차 후) 1주일 후의 항체 반응을 보여준다.

(*ANOVA을 이용한, 유의차)

도 7은 도 6과 동일한 양 그룹에서부터 각각의 양의 CMV에 대한 개별적인 퍼센트 중화(neutralisation) 역가를 보여준다. ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍와 함께 제제화된 CMV ΔgB 첫번째 투약 1주일 전(면역 전), 첫번째 투약 2주 후(두번째) 및 두번째 투약(두번째)과 세번째 투약 1주일 후(세번째), 혈액에서 얻은 혈청 샘플에 대해 CMV 중화 활성을 분석하였다. 각 원점(circular point)은 후보 투약시점에서 수집된 각각의 양 혈청에 대한 중화도 퍼센트이다. 제제의 2 및 3 투약 후 혈청 CMV-중화 역가는 폐내 및 피하 전달에 대해서 면역 전 혈청보다 상당히 증가하였다.

(*ANOVA을 이용한, 유의차)

도 8은 ΔgB 단백질과 함께 배양한 후 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 시험관내 재자극(restimultaion)의 결과를 보여준다. ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍와 함께 제제화된 CMV ΔgB의 3 복용량을 투여한 1주일 후, PBMC는 실시예 7에서와 동일한 양의 말초 혈액으로부터 수집되었다. ΔgB로 한 자극 후, 세포 증식은 세포내로 혼입되는 삼중수소 티미딘(tritiated thymidine)의 분석으로 측정하였다. 자극 인덱스(SI)는 대조군 비자극된 세포내로 혼입되는 삼중수소(tritium)에 대하여 ΔgB으로 자극된 세포내로 혼입되는 삼중수소의 비율로 계산되었다. SI≥4는 양성의 증식 반응인 것으로 간주되었다.

도 9는 다양한 보조제로 제제화된 인플루엔자 항원으로 면역화한, 양의 그룹(보조제 없는 Flu 그룹 중 4 마리; 보조제 그룹의 각각 7 마리)에서의 항체 반응을 보여준다. 면역화 및 샘플링 스케줄 및 분석 과정은 도 1에서와 동일하다.

(* ANOVA을 이용한, 유의차)

도 10은 도 9에서와 같은 양의 동일한 군에 대하여 혈구 응집 억제 분석(HAI) 결과를 보여준다. 각 샘플에 대한 HAI 역가는 칠면조 적혈구(turkey red cell)에서의 종말점 억제에 의해 측정되었다.

(* ANOVA을 이용한, 유의차)

일 양태에서, 본 발명은 인간 또는 동물 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하는 방법을 제공하며, 이는 상기 피험체에 항원과 보조제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 이 때 조성물은 폐 내 경로에 의해 피험체에 투여된다.

바람직하게는, 상기 피험체는 인간이나, 본 발명의 방법은 가축 동물(예를 들어, 양, 소 또는 말), 실험실 실험 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아피그), 반려 동물(예를 들어, 개 또는 고양이) 또는 야생 동물과 같은 동물 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하는 데까지도 확장된다.

본 명세서에 사용된, 조성물의 "폐 내" 또는 "폐" 전달에 관한 언급은 조성물의 활성 성분(즉, 항원과 보조제)이 폐 및/또는 점막 면역 시스템의 모세관 시스템과 접촉될 수 있는, 폐의 점막 표면으로 조성물이 전달되는 것을 나타낸다. 이 용어들은 조성물의 "폐 심부" 또는 "폐 하부" 전달, 즉, 폐의 기관지 심부, 세기관지 및/또는 폐포로의 조성물의 전달을 포함한다.

바람직하게는, 본 명세서에 따르면, 항원과 보조제를 포함하는 조성물은 네뷸라이저(nebuliser) 또는 유사한 장치를 이용하여 전달되는 에어로졸 또는 건조 분말과 함께, 에어로졸 또는 건조 분말 형태로 피험체의 폐(들)내로 투여된다. 약학적으로 활성 생성물의 폐내 또는 폐 전달용 표준 장치 또는 제품은 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다.

위에서 기술한 바와 같이, 다른 양태에서, 본 발명은 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위해, 인간 또는 동물 피험체에게 폐내 투여에 있어서 또는 이를 위한 약제의 제조에 있어서 항원과 보조제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 폐내 경로에 의해 인간 또는 동물 피험체에서 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위한 제제를 제공하며, 상기 제제는 항원 및 보조제를 포함하는 조성물이다.

바람직하게 본 발명에 따라 투여되는 항원은 인플루엔자, 폐렴 클라미디아균(Chlamydia pneumoniae), 호흡기 세포융합 바이러스, 폐렴구균(pneumococci) 등과 같은 폐 병원체에 대해 면역반응을 유발하거나 유도할 항원이다. 그러나 다른 점막 자리의 병원체, 예를 들어, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 살모넬라(Salmonella), 이. 콜리(E. coli), 콜레라, HIV, 성 매개 질환 병원체등을 포함하는 다른 병원체에 대해 면역 반응을 유발하거나 유도하도록 항원이 선택될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 발명에 따라 투여되는 항원은 피험체 고 용인성(high recipient acceptability)의 장점("주사바늘 공포증" 회피와 투여의 용이성)을 갖는다. 특히, 이는 강한 점막 반응과 면역 반응을 유도하는데, 이는 전신 면역 반응에 대한 의존도를 비롯하여 모든 백신접종에 유용할 것임을 나타내주는 것이다.

항원은 종양 특이적 또는 종양 관련성 항원일 수도 있다. 바람직하게는 종양은 점막 자리와 관련된 종양이다. 점막 자리와 관련된 종양은 폐 종양, 위장관 종양, 및 생식관 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

항원은 전체 세포 불활성 박테리아 또는 이의 서브유닛, 전체 불활성 바이러스 또는 이의 서브유닛, 단백질 또는 펩타이드, 당단백질, 탄수화물, 강글리오시드, 다당류, 지질다당류 또는 리포펩타이드를 포함하나 이에 제한되지 않는 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있거나 유도할 수 있는 임의의 화합물일 수도 있거나; 또는 이들의 임의의 조합일 수도 있다.

또한 바람직하게는 보조제는 면역자극 보조제(immunostimulating adjuvant)이며, 더욱 바람직하게는, 사포닌계 보조제, 보다 더욱 바람직하게는 ISCOMATRIX^TM보조제와 같은 면역자극 복합체(또는 ISCOM^TM)이다. 그러나, 본 발명은 또한 면역자극 보조제를, 개별적으로 또는 다른 보조제, 예를 들어, 리포솜, MF59와 같은 수중유(oil in water) 보조제, 수산화알루미늄과 알루미늄 인산과 같은 알루미늄 염 보조제, 지질 A와 단일인산화 지질 A(MPL)와 같은 지질다당류 보조제, CpG 올리고뉴클레오티드 보조제와 같은, 올리고뉴클레오티드 보조제, 및 콜레라 독소와 같은 점막 보조제를 포함하는 면역자극 복합체와 같은 다른 보조제와의 조합 사용을 포함한다. 적절한 면역자극 보조제는 [Cox and Coulter, 1997]의 실시예에의 방법에 기술되어 있다.

본 발명의 조성물은 존재하는 많은 기술 및 개발 단계의 기술 중 어느 하나를 이용하여 폐로 전달될 수 있다. 약물이나 단백질 제제를 폐로 전달할 수 있는 기계 장치의 많은 예가 존재하며, 네뷸라이저와 에어로졸 장치가 천식 치료에 수년간 사용되어 왔다(Gonda, 2000 참조). 전형적으로 본 장치들은 경구 흡입에 의해 폐로 물질을 전달시킨 장치이다. 당해 분야에서 최근의 진보는 3M사(Shoyele and Slowey, 2006)와 Inhale Therapeutics Systems, Inc. (Kuo and Lechuga-Ballesteros, 2003)에서 제조한 것들을 포함한다.

본 발명에 따르면, 조성물은 면역학적 유효량으로 인간 또는 동물 피험체에 투여된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 면역학적 유효량은 치료될 특정 상태의 진행 또는 발병, 이들 모두를 정지하거나 이들의 진행을 억제, 발병을 지연하거나 소정의 면역 반응을 얻기 위해 적어도 부분적으로 필요한 양을 의미한다. 이 양은 치료받을 개인의 건강 상태와 신체 상태, 치료받을 개인의 분류종, 개인의 면역 적격성, 요구되는 보호 정도, 백신 제제, 의료 상태의 평가 및 기타 관련 인자에 따라 달라진다. 이 양은 반복적인 시도를 통해 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위에 해당할 것으로 예상된다.

그러나, 본 발명의 특히 중요한 장점은 항원과 보조제를 포함하는 백신 조성물의 폐내 투여가 항원에 대한 전체 반응 및 점막 반응을 유발할 뿐만 아니라, 또한 이러한 전신 반응과 점막 반응을 유발하거나 유도하는데 필요한 항원량의 주된 감소 가능성을 야기한다는 점이다. 또한, 본 발명에 따른 백신 조성물의 효과적인 폐내 투여는 점막 자리에서의 백신의 흡수를 증강시키기 위한, 마이크로캡슐화 또는 점막 부착성 또는 다른 기술과 같은 복합 전달 시스템이 필요없게 된다는 것이다.

더 나아가, 상당히 향상된 점막 항체 반응의 유도는 폐내 면역화가 점막 감염에 대하여 백신 효율을 증강시킬 수 있고 면역화/감염 환자로부터의 병원체 전파를 잠재적으로 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

특히, 점막 항체는 인플루엔자 챌린지(challenge)에 대한 향상된 보호 면역능에 있어서 가치가 높을 수 있다. 최근 WHO 자문 보고서(Cassetti et al., 2006)에서는 "마우스 모델에서, 점막 IgA가 챌린지에 대한 보호와 관련 있으며, 인간에서 약독화된 인플루엔자 생백신의 연구에서, 점막 IgA의 존재는 인공 감염 바이러스 발산의 감소와 관련있다"고 보고하였다. 점막 IgA는 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 보호시 역할을 담당하며, 더 많은 연구에서 점막 면역 반응을 유도하는 백신의 능력을 평가하여야 한다는 것으로 결론내려졌다.

따라서, 본 발명의 폐 내 전달 경로는 다른 감염에 대해 백신이 잠재적인 가치가 있으며, 일차 전신 항체 반응을 요구하는 백신의 대안적인 전달 경로를 제공한다.

더 나아가, 본 발명에 따라 투여되는 항원은 강한 세포 면역 반응을 유도한다. 폐내 경로를 통해 전달되는 보조제와 항원은 항원에 대한 반응에서 특이적으로 증식되는 말초 혈액 세포의 생산을 자극한다. 이들 세포는 항체 반응을 증가시키고, 바이러스 감염 세포의 사멸과 같은, 효과기 역할을 수행하는 기능을 갖는 T 세포의 두 CD4+ 및 CD8+ 분류 모두에 속한다. 항체 반응에 덧붙여, 세포 면역 반응을 유도하는 능력은 감염성 제제, 특히 HIV, 헤르페스바이러스, 및 마이코박테리아, 클라미디아 및 리스테리아균과 같은 라이프사이클 중 세포내 상(intracellular phase)을 포함하는 박테리아에 대한 백신화에 있어 잠재적인 가치가 있다.

본 발명의 추가적인 특징은 다음의 실시예에 더욱 구체적으로 기술된다. 그러나, 이 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐, 상기 기술된 발명의 상세한 설명에 제한을 가하는 것으로 이해되지 않아야 한다.

실시예 1

배경기술

본 발명의 배경기술에 의해, 본 발명자들은 캐뉼러를 꽂은 양 모델에서 백신 전달의 유형을 실험하였다. 캐뉼레이션(cannulation)은 보다 구체적인 연구를 위해 림프 노드의 국소적인 배수 유출(outflow)를 가능하게 한다. 이 작업은 백신 모델로 ISCOMATRIX^TM 보조제 인플루엔자 바이러스 백신을 이용하여 양에서 수행되었다. 이 작업으로부터 얻은 주요한 사항은 비강내 전달은 고용량의 항원에서조차도 매우 비효율적이며, 저조한 국소 면역을 유도한다는 점이다.

이러한 사항들은 캐뉼러를 꽂지 않은 양에서 폐내 경로, 한 폐엽 심부로 백신을 전달함으로써 백신 전달의 결과를 연구하도록 본 프로젝트의 방향을 신속히 변경하도록 해주었다.

실험 방법:

혈액 수집

양들을 제어하여, 10mL 시린지와 18G 바늘침을 이용하여 경정맥으로부터 혈액 10mL을 수집하였다.

면역화(immunisation)

이 연구에 사용된 인플루엔자 항원은 수크로오스 농도구배(sucrose gradient)로 정제된 A/New Caledonia 20/99 H1N1 바이러스이며, 이는 불활성화되고, 세정제로 파괴하였다(Coulter et al., 1998). 항원 농도는 헤마글루티닌(haemagglutinin) 함량에 기초하여, 단일 방사 면역확산(single radial immunodiffusion)에 의해 측정되었다. GMP 등급 ISCOMATRIX^TM 보조제는 이전에 기술된 방법(Pearse and Drane, 2005)에 따라 CSL Limited에 의해 제조되었다. 면역화 이전에, 백신 제제는 ISCOMATRIX^TM 보조제와 적절한 양의 항원을 혼합하여 제조하였다.

폐내 면역화의 경우, 양들을 하네스(harness)로 제어하고, 왼쪽 콧구멍을 통 해 왼쪽 폐의 미엽(caudal lobe)으로 기관지경(bronchoscope)을 삽입하였다. 이후 백신 제제를 총 부피 5mL로 주입한 후, 공기 10mL를 주입하여, 완전히 전달하였다.

피하 면역화의 경우, 백신 제제는 1mL 시린지와 25G 바늘침을 이용하여 안쪽 허벅다리에 총 부피 200㎕로 전달하였다.

기관지폐포 세척(BAL) 수집

기관지폐포 세척(BAL) 샘플의 수집의 경우, 백신화의 경우와 마찬가지로, 기관지경을 제어한 양내로 삽입하고, PBS(인산-완충 식염수 pH 7.2) 10mL를 기관지경에 부착된 시린지를 이용하여 폐 엽으로 전달하였다. 이후 동일한 시린지를 이용하여 기관지경을 통해 BAL 액을 빼내는데 사용하였다.

ELA에 의한 항체 반응 평가

2개씩 준비한 BAL 및 혈청 샘플중의 항인플루엔자 항체를 EIA(효소 면역분석)으로 평가하였다. 요약하면, 96 웰 Maxisorp 평편한 바닥 플레이트(NUNC, Roskilde, Denmark)을 탄산완충제 pH 9.6 중 10㎕/ml의 인플루엔자 항원 50㎕로 밤새 코팅하였다. 이후 플레이트를 2개씩 준비한 샘플의 희석액 5개 중 1개에 100㎕를 가하기 전에, 1% 카제인 나트륨으로 차단하였다. 특이적 항 인플루엔자 항체의 결합을 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horse radish peroxidase)와 컨쥬게이트된 래빗 항-양(rabbit anti-sheep) 총 Ig(Dako, Denmark), 또는 항-소/양 IgA(Serotec, Oxford) 후 래빗 항 마우스 호스 래디쉬 퍼옥시다아제(Dako)를 이용하여 검출하였다. 색상은 TMB 기질의 첨가(Zymed, San Francisco)에 의해 발색되었고, 2M H₂SO₄의 첨가로 중단되었다. 450nm에서 광학 밀도는 Bio-Tek ELx800 플레이트 리더로 측정하였고, 항체 종말점 역가를 계산하였다.

혈구 응집 억제 활성(Haemagglutination Inhibition Activity)의 평가

ELISA에 의해 항원-특이적 항체 반응을 보이는 혈청과 BAL 샘플에 대해서는 혈구 응집 억제 활성(HAI)도 실험하였다. 이 분석은 인플루엔자 바이러스에 의한 적혈구 세포 응집의 억제를 측정하여, 기능성 항체의 역가를 측정한다. 샘플들은 칠면조 적혈구 세포를 이용하여 난에서 성장된 A/New Caledonia/20/99 바이러스 (H1N1)에 대한 HAI를 테스트하였다. HAI 역가는 적혈구 세포의 인플루엔자 응집을 억제하는 종말점 희석에 의해 측정되었다. HAI 분석은 호주, 멜버른의 세계보건기구의 독감연구 및 샘플 공동연구센터(WHO Collaborating Centre for Reference and Research on influenza))에서 수행되었다.

말초 혈액 단핵 세포의 시험관내 항원 재자극(restimulation)

시린지와 18G 바늘침을 이용하여 경정맥에서 수집한 혈액 샘플(50mL)을 5000U/mL 헤파린 100㎕을 함유하는 50mL 튜브내에 담았다. 이후 세포들을 연속하여 20분동안 800g에서 원심분리하고, 연막(buffy coat)은 15mL 튜브내로 수집하고, PBS을 이용하여 8mL로 희석하였다. 전달 피펫(transfer pippet)을 이용하여, Ficoll-paque 3.5mL을 세포 현탁액 하층부에 가하고, 샘플을 연속하여 30분동안 1000g로 원심분리하였다. 이후 말초 혈액 단핵 세포를 Ficoll-PBS 계면에서 수집하고, PBS 중에서 세척하고, 완전 배지(10% FCS, L-글루타민, 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100㎍/mL)과 50μM의 2-메르캅토에탄올이 공급된 Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 5 x 10⁶/mL으로 재현탁하였다.

항원 재자극 분석의 경우, 세포(5xlO⁵/웰) 100㎕을 96-웰 조직 배양 플레이트로 분취하고, 여기에 배지 단독, 또는 10 또는 20㎍/mL A/New Caledonia 인플루엔자 항원을 함유하는 배지 100㎕를 3개씩 반복하여 가하였다(최종 농도 5 또는 10㎍/mL 항원). 37℃의 습식 배양기내에서 5일동안 배양한 후, 모든 웰을 24시간동안 1μCi 삼중수소 티미딘(tritiated thymidine) 20㎕로 펄스하였다. 이후 세포들을 Packard Harvester를 이용하여 유리 섬유 필터위로 모아, 마이크로신트 신틸레이션 리퀴드의 카세트내로 위치시키고, 자동 마이크로플레이트 신틸레이션 계수기를 이용하여 β-방사선을 측정하였다.

폐 상부 및 폐 하부에 대한 면역화 평가

폐 하부로의 전달에의 대안으로서, 폐 상부로의 전달에 의한 면역화 효과의 평가는 하기 기술한 바에 따라 수행하였다. (Nickel et al., 1979) 에 의한 도 1은 폐 상부 및 폐 하부로의 전달용으로 사용되는 양 폐의 자리를 보여준다.

'폐 상부'로 전달되는 백신 - 백신은 광섬유(fibre-optic) 기관지경을 이용하여 폐 상부내로 전달된다. 백신은 주 기관 분기(bifurcation)을 1cm 지난, 주 기관지내로 도입되었다.

'폐 하부'로 전달되는 백신 - 백신은 광섬유 기관지경을 이용하여, 꼬리 폐(cadual lung)내의 심부로 전달된다. 백신은 주 기관 분기를 10cm 지난, 미(cadual) 기관지가 미 분절 기관지와 합쳐지는 곳으로 도입되었다.

면역화, 혈액, BAL 수집 및 ELISA 분석은 다른 실험에서 기술된 바와 동일하게 수행되었다. 양들은 ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍와 함께 인플루엔자 항원 0.04㎍을 3회 투약 받았다.

결과:

폐내 경로를 통한 면역화에 의한 항체 유도

3개의 개별 실험에서, 양들은 폐내 경로를 통해 면역화되었다. 혈액은 1°투약 2주 후, 2°투약 1주 후와 3°투약 1주후에 채취되었다.

실험 1 양들은 ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍와 함께 항원 1, 5, 또는 15㎍ 으로 면역화되었다. 3주로 나누어, 세차례 면역화하였다. 혈청 샘플은 개시전 및 각 면역화 후에 수집하였다.

폐내 전달된 보조제 인플루엔자 항원 1㎍은 15㎍과 동일한 효과를 가짐에 대한 놀라운 발견 후, 두번째 실험은 항원 복용량의 추가 감소를 실험하였다.

실험 2 양들은 ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍와 함께 항원 0.04, 0.2, 1, 5 또는 15㎍으로 면역화하였다. 3주로 나누어, 세차례 면역화가 이루어졌다. 혈청 샘플은 개시전과 각각의 면역화 후에 수집하 였다.

이들 실험들은, 모든 항원 용량, 심지어 0.04㎍ 항원과 같이 낮은 용량에서도 피험체 동물에서 상당한 항체 반응을 유도함을 보여준다. 소량의 항원 복용량은 한차례 투약 후 매우 적은 항체를 유도하였다. 그러나, 투여 동물에서의 면역은 2 및 3회 투약 후 많은 항원량과 동일하였다. 이들 항체 반응은 기능성 혈구 응집 억제(HAI)를 포함하였다.

ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍와 함께 항원 0.04㎍으로 폐내 면역화된 양에서 혈청 IgG 및 IgA 레벨은 항원 15㎍ 단독(최근 백신 복용량)으로 피하 면역화한 후 얻은 레벨과 동일하였다. 소량의 폐내 면역화는 고용량으로 피하 주사에 의해 유도된 면역보다 우수하고, 폐(BAL-기관지 폐포 세척)에서 특이적인 IgA과 IgA의 매우 좋은 레벨을 얻었다.

실험 3 세번째 실험은 (i) 소량의 항원으로 상당한 면역을 유도하기 위 해 보조제의 필요성, (ii) 폐내 전달된 소량의 항원 복용 량(0.04㎍)과 피하 전달된 소량과 직접 비교, (iii) 더욱 소량 의 항원량(0.008㎍ 항원)을 실험하여 평가하였다.

세번째 실험:

(a) 첫 두 경우에서 관찰을 반복하였다;

(b) 보조제가 극소량의 항원에 대한 면역 유도에 필수적임을 입증하였다;

(c) 폐내 전달되는 보조화된 소량의 항원은 피하로 전달되는 현재 백신 복용량 또는 동일한 소량의 항원 백신과 비교시 유사한 혈청 항체를 유도하고, 우수한 폐 항체를 유도함을 발견하였다;

(d) 피하 주사된 보조화된 극소량의 항원의 2회 초과 투약은 세번째 투약 후 혈청 항체가 감소됨에 따라, 내성 또는 억제 효과를 유도하는 것으로 보인다. 이 억제는 폐 전달 후에서는 일어나지 않았다;

(e) ISCOMATRIX^TM 보조제와 항원 0.04㎍에 유도된 것 미만일 지라도, 100㎍의 ISCOMATRIX^TM 보조제와 함께 투여되는 심지어 0.008㎍ 항원으로 한 폐내 면역화에서조차도 상당한 항체 유도가 발견되었다;

실험 1 내지 3에 대한 조합 데이터를 도 2 및 표 1에 요약하였다.

실험 3에 대한 데이터를 표 2와 도 3에 나타냈다.

도 1 및 2에서:

수평 막대 = 중간 값

오픈 막대 = 값의 중앙 50%

수직 선 = 10 내지 90 퍼센트.

IMX = ISCOMATRIX^TM 보조제

막대는 상술한 바와 같이, 첫번째(1°), 두번째(2°) 및 세번째(°) 면역화 후, 인플루엔자 특이적 종말점 항체 역가를 보여준다.

도 1에서: * 15㎍ s/c 그룹보다 상당히 높음 (Mann-Whitney; p<03).

도 2에서 :

# 15㎍ s/c 그룹보다 상당히 낮음(Mann-Whitney; p<0.01).

* 15㎍ s/c 그룹보다 상당히 높음(Mann-Whitney; p<0.038).

^ 동일한 경로를 경유하여 전달된 비보조화 백신보다 상당히 높음 (Mann- Whitney; p<0.038)

폐내, 피하 전달된 동일한 백신보다 상당히 높음(Mann- Whitney; p<0.021).

실험 4 이 실험은 이전 실험에서 사용된 폐 하부로의 전달과 비교시, 폐 상부로 보조화된 인플루엔자 항원의 전달의 효율성을 평가하 였다. 8마리 양의 두 그룹은 폐 상부 또는 폐 하부로 3회, 인플 루엔자 항원 0.04㎍과 ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍를 함유하는 제 제를 투여받고, 혈청과 BAL 항체 반응을 EIA로 측정하였다(도 4).

이 결과는 상부 폐의 전달이 혈청과 BAL 반응을 유도함에도 불구하고, 세차례 투약이 혈청과 BAL 모두에서 상당히 좋은 반응을 보이며, IgG와 IgA는 폐 하부 전달에 의해 유도되는 것을 나타낸다.

요약:

ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍와 인플루엔자 바이러스 항원에 의한 폐내 면역화 는 HAI 활성을 갖는 전신 및 점막 (BAL) 항체 반응의 유도에 있어서 매우 효과적임을 입증하였다.

강한 혈청 항체 반응은 극소량의 항원(ISCOMATRIX^TM 보조제와 인플루엔자0.04㎍)에서도 관찰되었다. 이들 반응은 15㎍의 인플루엔자 항원 단독(현 백신용량)으로 피하 주사투여(s/c)에 의해 유도되는 것보다 훨씬 강하며, ISCOMATRIX^TM 보조제와 인플루엔자 0.04㎍에 의해 피하투여에 의해 유도된 것과 일치하였다.

ISCOMATRIX^TM 보조제와 인플루엔자 0.04㎍의 폐내 전달에 의해 유도된 점막 항체 반응은 피하 ISCOMATRIX^TM 보조제와 인플루엔자 항원 0.04㎍ 또는 피하 인플루엔자 항원 15㎍와 비교시 상당히 증가하였다. 후자중 어느것도 검출가능한 점막(폐) 반응은 유도되지 않았다.

실시예 2.

폐 내 경로를 경유한 백신화에 의한 세포 면역 유도

양들은 인플루엔자 항원 0.04㎍ 단독 또는 인플루엔자 0.04㎍ + ISCOMATRIX^TM 보조제 100㎍로 4회 폐 내 면역화하였다. 마지막 면역화 1주일 후, 말초 혈액을 수집하고, 단핵 세포를 배지 단독(음성 대조군), 또는 5 또는 10㎍의 인플루엔자 항원(재자극됨)으로 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 5일 후, 웰을 24시간 동안 삼중수소 티민으로 펄스하였다. 이후 세포 증식을 계수하기 위해 방사능을 측정하였다. 자극 인덱스(Stimulation Index)를 재자극 그룹의 평균 분당수(cpm)를 배지 단독 대조군의 평균 cpm으로 나누어 계산하였다.

세포 증식 연구 결과를 표 3에 나타냈다. 양들을 항원 단독으로 폐내 백신화한 경우, 말초 혈액에서 증식 반응은 검출되지 않았다. 그러나 이러한 반응은 ISCOMATRIX^TM 보조제와 항원을 면역화받은 양에서 검출되었다. 이들 데이타는, 폐 백신 전달 후 보조제가 말초 순환에서 세포 증식성 메모리 반응을 유도하는데 필요하다는 것을 나타낸다.

실시예 3.

폐내 경로에 의한 투여를 위한 마이크로유동 수중유 보조제를 갖는 항원 제제

적절한 농도(0.01 내지 500㎍ 범위의 단일 복용량이 되도록 하는 최종 항원 농도를 유발하기 위한 농도)의 항원을 PBS pH 7.2, 0.05% 아지드화 나트륨 중 5% v/v 스쿠알란, 0.5% v/v Tween 80, 0.5% v/v Span 85와 혼합한다. 이후 이 혼합물을 19-20,000 평방인치 당 파운드(psi)의 압력에서 고압 마이크로유동화(microfluidisation)하였다. 마이크로유동화를 추가적으로 7번 반복한다. 제제는 상기 기술된 방법에 의해 폐내 경로를 통해 전달한다.

실시예 4.

ISCOMATRIX ^TM 보조제와 제제화된 재조합 사이토메가바이러스(cytomegalovirus) gB 항원으로 폐내 경로를 통한 면역화에 의해 유도된 전신 면역 및 점막 면역

ISCOMATRIX^TM 보조제와 인플루엔자 항원에 의한 관찰을 확인하고 확보하기 위해, 재조합 바이러스 항원의 폐내 전달에 의해 유도된 면역 반응을 시험한 양에서 연구를 수행하였다. ISCOMATRIX^TM 보조제와 제제화된 사이토메갈로바이러스 gB 당단백질(CMV gB)의 절두형(truncated form)은 폐내 및 피하 경로로 전달되고, EIA에 의해 혈청과 폐에서의 항체 반응을 평가하였다. 또한, 기능성 항체의 유도는 혈청내의 CMV 중화 항체의 분석으로 평가하였다. T 세포 반응을 유도하기 위해 폐내 전달된 제제의 활성은 말초 혈액 단핵 세포의 gB-특이적 세포 증식을 평가하여 실험하였다.

실험 방법

절단된 재조합 인간 CMV gB 단백질(AgB) 생산

1. AgB 단백질을 암호화 하는 DNA를 함유하는 플라스미드의 생성

단백질의 트랜스멤브레인 영역이 제거되도록 조작된 CMV gB의 절두형을 암호화하는 DNA는 호주, 브리즈번, 퀸즐랜드 의학 연구소(Queensland Institute of Medical Research)의 부교수 Rajiv Khanna가 제공해 주었다. 이 DNA는 프레임에 융 합된 gB의 외형질과 세포질 도메인(NCBI P06473)과 조직 플라스미노겐 활성자(Tissue Plasminogen Activator (TPA))의 신호 서열을 함유하는 단백질을 암호화한다. 또한, DNA는 발현된 단백질의 분열을 막기 위한, 아미노산 460/461 주변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드에서 점 돌연변이되었다. DNA는 KpnI/NotI 단편으로써, pCEP4 벡터 (Invitrogen)내로 클론화되었다. 생성된 플라스미드(pCEP4ΔgB)는 E.coli에서 증폭되었고, 정제된 플라스미드는 Qiagen Maxi Kit를 이용하여 준비하였다.

2. 포유동물 세포에서의 ΔgB 단백질의 발현

37℃의 쉐이크 플라스크내에서 FreeStyle^TM 발현 배지 (Invitrogen)에서 성장시킨 FreeStyle^TM293-F 세포의 배양을 293펙틴 형질감염 시약(Invitrogen)을 이용하여 pCEP4ΔgB로 형질감염시켰다. 배양액 중 Hygromycin B를 이용한 선별중에서, 단백질 ΔgB의 분비 발현은 세포 상청액 샘플의 SDS-PAGE 겔 분석으로 측정하였다. 세포 배양 상청액을 채취하고, 2500rpm의 원심분리로 정화한 후, 크로마토그래피 이전에 0.45㎛ 필터를 통과시켰다.

3. ΔgB 단백질의 정제

ΔgB 단백질은 gB 특이적 단일클론성 항체 58-15로 포획하는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다(Singh and Compton, 2000). 항체는 Prosep-A (Millipore) 단백질 A 컬럼에서 정제되었다. ΔgB 단백질의 정제의 경우, 정제된 항체를 평형 완충제(0.2M NaHCO₃/0.5M NaCl, pH 8.3)중 HiTrap NHS-활성 HP 컬럼 (Pharmacia-Amersham)에 커플링하였다. 정제된 세포 배양 상청액을 10OmM Borate/15OmM NaCl pH 8.5로 1:1 희석시켰다. 희석된 상청액을 HiTrap 컬럼에 가하고, 평형 완충제로 평형화시켜, 0.1M 글라이신-HCl pH 2.5 후 평형 완충제로 우선 용출하고, 이번에는 0.15M 수산화암모늄 pH 10.5로 다시 용출하였다. 용출된 분획을 3M Tris pH 8 또는 1M 글라이신 pH 2.5를 이용하여 중화시켰다. 단백질 순도는 쿠마시-염색 SDS-PAGE 겔 전기영동분석으로 실험하였다(도 5). 단백질 농도는 280nM에서 OD를 측정하여 산출하였다.

양을 AgB으로 한 면역화

혈액 수집

방법은 실시예 1에 기술한 방법과 동일하다.

면역화

양 그룹을 ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 ΔgB 단백질로 면역화하였다(표 4). 사이토메갈로바이러스로부터 얻은 ΔgB 단백질은 기술된 바와 동일하게 준비하였다.

모든 양들은 3회 백신 투약받았으며, 혈액 수집 스케쥴을 포함한 구체적인 사항은 실시예 1에 기술하였다.

BAL 수집

BAL 샘플의 수집은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수행하였다.

EIA에 의한 항체 반응 평가

양 IgG와 IgA의 검출 방법은 다음의 예외사항을 제외하고는, 실시예 1과 유사하다. 플레이트(96 웰)을 PBS 중 2㎍/mL 정제된 ΔgB 단백질을 웰당 lOO㎕로 밤새 코팅하였다. 결합된 양 IgG는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제(Southern Biotech)와 컨쥬게이트된 래빗 항-양 IgG(H+L)으로 검출하였다. IgG 및 IgA TMB 퍼옥시다아제 기질들은 각각 KPL Kirkegaard와 Perry Laboratories의 것이다. 반응은 웰 당 50㎕ 0.5M H₂SO₄의 첨가에 의해 중단되었다.

CMV에 대한 기능 활성의 평가

기능성 혈청 항체를 유도하는 백신의 능력(capacity)은 MRC-5 세포의 재조합 인간 사이토메갈로바이러스 감염에 기초한 중화 분석을 이용하여 평가하였다. 분석은 그린 형광성 단백질을 발하는 재조합 CMV Ad169wt86 EGFP을 이용하여, 호주, 브리즈번, 퀸즐랜드 의학 연구소(Queensland Institute of Medical Research) 부교수 Rajiv Khanna와 연구진들에 의해 수행되었다. 혈청 희석액에 Adl69wt86-EGFP을 노출한 후, 인간 섬유아세포(fibroblasts)을 감염시키는 바이러스의 활성은 유세포 측정법(flow cytometry(FACS))을 이용하여 형광성 세포 핵 퍼센트를 정량하여 평가하였다. 과정을 아래 기술하였다:

1. 양에서 얻은 혈청을 30분동안 56℃에서 배양하였다.

2. 양에서 얻은 혈청(순수, 및 lOO㎕ DMEM 중 2배 및 4배 희석액)을 96 웰 트레이에 배분하였다.

3. 25㎕ (2.5 x 10⁴ PFU) Adl69wt86-EGFP 바이러스를 각 혈청 샘플에 가하였다.

4. 혈청/바이러스 샘플을 공기 중 7% CO₂에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다.

5. 미리, 공기 중 7% CO₂의 37℃에서 배양시킨 10% 태아 소 혈청(DMEM-1O)를 갖는 DMEM에서 성장시킨 MRC-5 세포를 함유하는 48 웰 평편한 바닥 트레이를 준비하고, 사용시, 80-90% 컨플루언시(confluency)에 도달하였다.

6. 세포 배양 배지를 MRC-5 세포로부터 제거하였다. 이후 각 바이러스/혈청 샘플 50㎕을 MRC-5 세포를 함유하는 48-웰 평편한 바닥 트레이의 대응 웰에 옮기고, 50㎕ DMEM을 가하고, 48 웰 트레이를 미묘한 진동으로, 37℃의 공기 중 7% CO₂에서 2시간동안 배양하였다.

7. 48 웰 트레이로부터 접종원(inoculum)을 흡입하고,웰을 DMEM-10으로 세 차례 세척한 후, 각 웰에 DMEM-10 500㎕를 가하고, 공기 중 7% CO₂의 37℃에서 배양하였다.

8. 다음날, 세포 배지와 세포(트립신 사용)을 48웰 트레이에서부터 채취하고, 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다.

9. 펠렛을 PBS 중에 재현탁시키고, 다시 원심분리하여 펠렛화하였다.

10. 펠렛을 1mg/mL의 7-아미노 악티노마이신 D(7-Aminoctinmycin D) 0.2㎕을 함유하는 저장성 완충제 lOO㎕(0.1% 구연산나트륨, 0.1% (v/v) Triton X-100) 중에서 강하게 재현탁하고, 실온의 암실에서 20분동안 방치한다.

11. 각 펠렛 샘플을 FACS 분석에 적합한 튜브에 옮기고, 1% 파라포름알데히드를 함유하는 lOO㎕ PBS를 가하였다. 혼합물을 FACS 분석 전 30분동안 얼음위에 두었다.

12. 샘플을 Becton Dickinson FACSCanto 로 분석하고, 샘플 중 형광성 핵의 퍼센트를 정량화하였다.

13. 각 샘플의 중화도 퍼센트는 다음 식을 이용하여 계산하였다:

% 중화도 = [형광성 핵의 퍼센트(혈청 첨가 없음) - 형광성 핵의 퍼센트(혈청 샘플) / 형광성 핵의 퍼센트(혈청 첨가 없음)] x 100.

말초 혈액 단핵 세포의 시험관내 항원 재자극

시린지와 18G 바늘을 이용하여 경정맥으로부터 얻은 혈액 샘플(50mL)을 5000U/mL 헤파린 100 ㎕ 을 함유하는 50mL 튜브내로 위치시켰다. 이후 세포를 연속 하여 20분 동안 800g에서 원심분리하고, 연막을 15mL 튜브로 수집하고, PBS가 포함된 8mL로 희석하였다. 전달 피펫을 이용하여, Ficoll-paque 3.5mL을 세포 현탁액 바닥에 가하였고, 샘플을 연속하여 30분 동안 1000g에서 원심분리하였다. 이후 말초혈액 단핵 세포는 Ficoll-PBS 계면에서 수집하고, PBS 중에서 세척하고, 완전 배지(10% FCS, L-글루타민, 페니실린(100U/mL), 스트렙토마이신(100㎍/mL) 및 50μM 2-메르캅토에탄올이 공급된 Dulbecco's Modified Eagles Medium) 5x10⁶/mL에 재현탁시켰다.

항원 재자극 분석에서, 세포 100 ㎕ (5xlO⁵/웰)을 96 웰 조직 배양 플레이트에 분취하고, 여기에 배지 단독, 또는 5, 10, 20 또는 40㎍/mL의 gB 단백질를 함유하는 배지(최종 농도 2.5, 5, 10 or 20 ㎍/mL) 100㎕를 3개로 반복하여 가하였다. 37℃의 습식 배양기에서 5일간 배양하고, 모든 웰을 24시간동안 1μCi 삼중수소 티미딘 20㎕로 펄스하였다. 이후 세포를 Packard Harvester를 이용한 유리 섬유 필터로 채취하고, 마이크로신트 신틸레이션 리퀴드의 카세트에 위치시킨 후, 자동 마이크로플레이트 신틸레이션 계수기를 이용하여 β-방사능을 측정하였다.

결과

ISCOMATRIX ^TM 보조제로 제제화된 재조합 CMV ΔgB 항원으로 폐내 및 피하 면역화한 후의 면역 반응

양들은 ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 CMV ΔgB 항원을 3주 간격으로 피하 또는 폐내로 3회 투약받았다. 혈청 및 BAL 샘플을 첫번째 투약 1주일 전, 첫번째 투약 2주 후, 두번째와 세번째 투약 1주 후에 수집하였다. 항체 EIA 데이타의 경우, 면역전 항체 역가를 공제하였다.

ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 ΔgB의 실험 결과(도 6)는 ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 소량의 인플루엔자 항원(0.04㎍)을 이용한 실시예 2에서 보여지는 것과 상당히 유사하고, 이 때 폐내 후의 혈청 IgG 과 IgA 반응은 3회 투약후 피하 전달의 반응과 동일하였다. 그러나, 인플루엔자 항원 제제에서 얻은 결과와 달리, 폐내 경로에 의해 전달된 ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 ΔgB는 단지 2회 투약 후의 피하 전달에 대하여 동일한 혈청 IgG와 IgA을 유도하였고, 1회 투약후의 반응을 실험한 경우, 상당히 높은 혈청 IgG가 유도되었다(도 6a 및 b).

폐의 항체 반응의 경우, ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 ΔgB의 면역화 후의 반응은 ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 소량의 인플루엔자 항원에서의 관찰과 동일하였다. ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 ΔgB는 동일 제제의 피하 전달과 비교할 때, 3회 투약 후 폐에서 상당히 높은 항체 반응을 유도하였다(도 6c 및 d).

기능성 항체 유도의 경우, 혈청에서의 CMV 중화 분석에 대한 결과는 혈청 IgG 반응에 대한 EIA에서 얻은 결과와 일치하였다(도 7). ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 ΔgB의 폐내 전달과 피하 전달에 의해 유도된 항체 반응의 중화는 면역 전 혈청에서보다 상당히 높았다. 중화 반응은 3회 투약 후 더욱 증가하였다. ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 항원이 폐내와 피하 경로에 의해 전달되는 경우, 결과는 혈청 중 항체 중성화 유도와 동등함을 나타냈다.

ΔgB의 말초 혈액 단핵 세포의 재자극의 분석에 따른 결과(도 8)는, 폐내 또는 피하 경로로 전달되는 ISCOMATRIX^TM 보조제로 제제화된 항원이 2회 내지 3회 투약후의 T 세포 반응을 유도하는 것을 나타냈다(4히 초과의 자극 인덱스). 전달의 두 경로는 동등한 T 세포 반응을 유도하였다.

실시예 5

다른 보조제 기술로, 폐내 경로를 통한 백신화에 의해 유도된 전신 및 점막 면역

이 연구는 ISCOMATRIX^TM 보조제외의 다른 보조제가 폐내 경로에 의해 전달될 때, 항원 특이적 점막 항체 반응 및 전신 항체 반응을 유도할 수 있는지를 실험하기 위해 수행하였다. 양 그룹은 여러 대안적인 보조제로 제제화된 인플루엔자 항원의 폐내 면역화시키고, 반응을 ISCOMATRIX^TM 보조제 제제와 비교하였다(표 5).

실험 방법

보조제 제제의 제조

A: 리포솜은 다음 방법에 의해 제조되었다.

완충액:

IR 완충제: 0.14M NaCl, 3mM KCl, 8mM Na₂HPO₄, 0.05mM CaCl₂.2H₂O, 1.5mM KH₂PO₄ pH7.2

IVD 완충제: 0.14M NaCl, 3.5mM Na₂HPO₄, 1.4mM NaH₂PO₄.2H₂O pH7.2

1. 11.4mg/mL 콜레스테롤, 12.4mg/mL 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC) 및 Mega1O의 용액을 IR 완충제(Chol/DPPC)중에서 제조하였다.

2. Chol/DPPC은 IVD 완충제의 첨가하여 30분에 걸쳐 점차적으로 1/40으로 희석하였다.

3. 희석 용액을 ST 200 Diafiltration Cartridge (Nephral)을 이용하여 40℃에서 한외여과(ultrafiltration)하여, 원 희석 부피의 1/40으로 농축하였다.

4. 농축 용액을 IVD 완충제 25 부피로 한외여과하여 세척하였다.

5. Chol/DPPC 용액은 추가 한외여과하여 2 배 농축하였다.

6. 지질 압출전에, Chol/DPPC를 1시간 이상, 40℃에서 배양하였다.

7. 과정 전반에 42℃로 유지되는, 1OmL Thermobarrel 압출기가 갖추어진 지질 압출기(T.001 Northern Lipids Inc., 캐나다)를 이용하여 Chol/DPPC로부터 리포솜을 압출하였다.

8. 압출은 0.1㎛ PC 디스크 필터를 통하여, 1400-200OkPa 압력을 이용하여 Chol/DPPC의 1OmL 라트(lot)에서 수행하였다.

9. 본 과정은 Chol/DPPC 용액 모두가 본 시스템을 10회 통과할 때까지 반복하였다.

10. 생성된 리포솜의 콜레스테롤과 DPPC 함량을 측정하였고, 크기와 균일성을 측정하기 위해 음성 염색을 이용하여 전자 현미경으로 관찰하였다.

B. MPL의 제조

지질 A 단일인산화(MPL)(Sigma L6895)은 2mg/mL의 DMSO (Sigma D2650)중에 재현탁하여, 사용될 때까지 4℃에서 유지하였다.

C. CpG의 제조

CpG(Sigma-Genosys 1062 4856-011)을 10mM Tris/lmM EDTA pH8에서 재현탁하고, 사용할때까지 4℃로 유지하였다.

D. 보조제 제제의 제조

모든 보조제 제제는 인플루엔자 항원 첨가전, 희석제로서 PBS를 이용하여 관 련 성분을 혼합하여 제조하였다(표 5). 이 후, 리포솜을 함유하는 제제를 1/8 인치 프로브를 이용한 4로 세팅된 VirSonic 소니케이터로 초음파처리하였다. 제제를 2회, 30초 간격으로 5초 초음파 처리하였고, 모두 얼음위에서 이루어졌다.

면역화

양의 그룹을 표 5에서 기술된 인플루엔자 항원과 보조제 제제로 면역화하고, 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 혈액을 채취하였다.

BAL 수집

BAL샘플의 수집은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수행되었다.

ELISA에 의한 항체 반응 평가

혈청과 BAL 샘플 중 인플루엔자 항원에 대한 항체 반응의 분석은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수행되었다.

혈구응집 억제 활성의 평가

혈청과 BAL 샘플에서 HAI 활성의 분석은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수행되었다.

결과

다양한 보조제와 인플루엔자 항원 제제에 의한 폐내 백신화후의 면역 반응의 평가

양들은 3주 간격으로 3회 투약받았다. 혈청과 폐(BAL) 샘플은 첫번째 투약 전과 2주후, 두번째와 세번째 투약 1주일 후에 수집되었다. 항체 ELISA 데이터의 경우, 면역 전 항체 역가를 공제하였다.

실험의 결과는 항원과 조합되고, 폐내 경로에 의해 전달된 경우, 상이한 보조제 제제가 항체 반응을 유도하는 능력이 다양하다는 것을 보여준다(도 9 및 10).

모든 보조제는 혈청에서의 항체 유도에 있어서, 항원 단독과 비교시, 다소의 장점을 갖는다. ISCOMATRIX^TM 보조제를 함유하는 제제는 혈청과 BAL 모두에서 3회 투약후 항원 단독보다 상당히 우수한 반응을 유도하였고, 혈청 IgG의 경우, 2회 투약후 우수한 반응을 유도하였다. 특히 데이터는 2회 투약 후 혈청과 3회 투약후 BAL에서 ISCOMATRIX^TM 보조제 제제 모두에 의해 기능성 항체(HAI)의 유도를 보여주었다(도 10). 데이타(도 9)는 MPL의 첨가 내지 ISCOMATRIX^TM 보조제 제제의 효과를 시사하며, 항원과 MPL에 ISCOMATRIX^TM 보조제를 함유하는 제제로 면역화된 양에서 보조제 단독에 비해, 각각 1회 및 2회 투약후 발생한 혈청 IgG와 IgA 항체에서 상당히 증가하였다.

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Claims

인간 또는 동물 피험체에서 면역 반응을 유발 또는 유도하는 방법으로서, 이는 항원 및 보조제(adjuvant)를 포함하는 조성물을 상기 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 폐내경로에 의해 피험체에 투여되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 조성물은 폐내 투여용으로 제제화된 것인 방법.
제2항에 있어서, 조성물은 에어로졸 또는 건조분말형인 것인 방법.
제1항에 있어서, 조성물은 경구 흡입에 의해 피험체에 전달되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 조성물은 피험체의 폐 하부(lower lung)로 전달되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 조성물은 면역자극 보조제를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 조성물은 사포닌계 보조제, 리포솜, 수중유(oil in water) 보조제, 알루미늄 염 보조제, 지질다당류(lipopolysaccharide) 보조제, 올리고뉴클레오티드 보조제 및 점막 보조제로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 보조제를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 조성물은 면역자극 복합체를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 조성물은 ISCOMATRIX^TM 보조제를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 조성물은 다른 면역자극 보조제와 조합된 면역자극 복합체를 포함하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 조성물은 지질 다당류 보조제와 조합된 면역자극 복합체를 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 조성물은 단일인산화 지질 A(monophosphoryl lipid A(MPL))와 조합된 ISCOMATRIX^TM 보조제를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항원은 점막 병원체에 대한 면역 반응을 유발 또는 유도하는 항원인 것인 방법.
제13항에 있어서, 점막 병원체는 인플루엔자 바이러스, 폐렴 클라미디아 균(Chlamydia pneumoniae), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus) 또는 폐렴구균(pneumococci)인 것인 방법.
제1항에 있어서, 항원은 비점막 자리의 병원체에 대한 면역 반응을 유발 또는 유도하는 항원인 것인 방법.
제15항에 있어서, 병원체는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori); 살모넬라(Salmonella), 이. 콜리(E. coli), 콜레라, HIV 또는 성 매개 질환균인 것인 방법.
제1항에 있어서, 항원은 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원인 것인 방법.
제17항에 있어서, 종양은 점막 자리에 관련된 것인 방법.
제18항에 있어서, 종양은 폐 종양, 위장관 종양 또는 생식관 종양인 것인 방법.
인간 또는 동물 피험체에서 면역 반응을 유발 또는 유도하기 위해, 피험체로의 폐내 투여에 있어서, 또는 이를 위한 약제의 제조에 있어서, 보조제와 항원을 포함하는 조성물의 용도.
폐내 경로에 의해 인간 또는 동물 피험체에서 면역 반응을 유발 또는 유도하기 위한 제제로서, 상기 제제는 항원 및 보조제를 포함하는 것인 제제.