ES2445170T3 - Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un antígeno procedente de Plasmodium falciparum, en combinación con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa procedente de corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que la dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición en una cantidad de entre 1 5 μg y 30 μg por dosis, para su uso como medicamento para seres humanos.

Description

Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina
Campo técnico
La presente invención se refiere a composiciones de vacunas mejoradas, a procedimientos para la fabricación de las mismas, y a su uso en medicina. En particular, la invención se refiere a composiciones de vacunas potenciadas con adyuvante en las que el adyuvante es una formulación liposómica, que comprende una saponina y un lipopolisacárido.
Antecedentes técnicos
Son siempre necesarias composiciones o vacunas nuevas con una inmunogenicidad mejorada. Como estrategia, se han usado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada por cualquier antígeno dado.
Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas superficiales principales y se encuentran exclusivamente en la lámina externa de la membrana exterior de bacterias gram-negativo. Los LPS impiden la destrucción de las bacterias por complementos del suero y células fagocíticas, y están implicados en la adherencia para la colonización. Los LPS son un grupo de moléculas complejas estructuralmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Dalton de tamaño y consisten en tres regiones unidas de forma covalente:
(i)
una cadena de polisacárido O-específica (antígeno O) en la región externa
(ii)
una región central de oligosacárido del núcleo
(iii) lípido A - la región más interna que sirve como anclaje hidrófobo, comprende unidades de disacárido de glucosamina que transportan ácidos grasos de cadena larga.
Se ha mostrado que las actividades biológicas de LPS, tales como toxicidad letal, pirogenicidad y adyuvancia, están relacionadas con el resto de lípido A. Por el contrario, la inmunogenicidad está asociada con el componente de polisacárido O-específico (antígeno O). Tanto los LPS como el lípido A se conocen desde hace tiempo por sus efectos adyuvantes fuertes, pero la alta toxicidad de estas moléculas ha impedido su uso en formulaciones de vacunas. Se ha hecho por lo tanto un esfuerzo significativo para reducir la toxicidad de los LPS o lípido A manteniendo al mismo tiempo su adyuvancia.
El mutante R595 de Salmonella minnesota se aisló en 1996 a partir de un cultivo de la cepa parental (lisa) (Luderitz y col. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374). En las colonias seleccionadas se exploró su susceptibilidad a lisis con un grupo de bacteriofagos, y sólo las colonias que presentaron un intervalo estrecho de sensibilidad (susceptibles a uno o dos bacteriófagos solamente) se seleccionaron para estudio adicional. Este esfuerzo condujo al aislamiento de una cepa mutante rugosa profunda que es defectuosa en la biosíntesis de LPS y se denomina S. minnesota R595.
En comparación con otros LPS, los producidos por el mutante S. minnesota R595 tienen una estructura relativamente sencilla.
(i)
no contienen región O-específica - una característica que es responsable de la deriva del fenotipo liso de tipo salvaje al fenotipo rugoso mutante y produce como resultado una pérdida de virulencia
(ii)
la región del núcleo es muy corta - esta característica aumenta la susceptibilidad de la cepa a una diversidad de productos químicos
(iii) el resto de lípido A está altamente acilado con hasta 7 ácidos grasos.
El 4’-monofosforil lípido A (MPL), que puede obtenerse por la hidrólisis ácida de LPS extraído de una cepa mutante rugosa profunda de bacterias gram-negativo, mantiene las propiedades adyuvantes de los LPS demostrando una toxicidad que está reducida en un factor de más de 1000 (como se mide por medio de dosis letal en huevos embrionarios de pollo) (Johnson y col. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl.: S512-S516). Los LPS se calientan a reflujo normalmente en soluciones ácidas minerales de concentración moderada (por ejemplo, HCl 0,1 M) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Este procedimiento produce desfosforilación en la posición 1, y
descarbohidratación en la posición 6’, produciendo MPL.
El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), que puede obtenerse por hidrólisis alcalina suave de MPL, tiene una toxicidad reducida adicional al tiempo que mantiene de nuevo la adyuvancia, véase el documento US 4.912.094 (Ribi Immunochemicals). La hidrólisis alcalina se realiza normalmnte en disolvente orgánico, tal como una mezcla de cloroformo/metanol, por medio de saturación con una solución acuosa de una base débil, tal como carbonato sódico 0,5 M a pH 10,5.
Se dispone de información adicional sobre la preparación de 3D-MPL, por ejemplo, en los documentos US 4.912.094 y WO02/078637 (Corixa Corporation).
Las saponinas de Quillaja son una mezcla de glicósidos de triterpeno extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria. Se han empleado ampliamente saponinas brutas como adyuvantes veterinarios. Quil-A es un extracto acuoso parcialmente purificado del material de saponina de Quillaja. QS21 es una fracción no tóxica purificada por HPLC de Quil A y su procedimiento de producción se describe (como QA21) en la Patente de Estados Unidos Nº
5.057.540.
A modo de ejemplo, se han desarrollado vacunas antigripales y vacunas contra el virus de papiloma humano (VPH) con adyuvantes.
El documento WO/33739 describe una composición de vacuna que comprende una saponina inmunológicamente activa y un estero.
Existe todavía necesidad de vacunas mejoradas.
Los adyuvantes que contienen combinaciones de un lipopolisacáridos y saponinas de Quillaja se han descrito anteriormente, por ejemplo en el documento EP0671948. Esta patente demostró una fuerte sinergia cuando se combinaba un lipopolisacárido (3D-MPL) con una saponina de Quillaja (QS21). Ahora se ha descubierto que pueden conseguirse buenas propiedades adyuvantes con combinaciones de lipopolisacárido y saponina de quillaja como inmunoestimulantes en una composición adyuvante incluso cuando los inmunoestimulantes están presentes en bajas cantidades en una dosis humana.
Declaración de la invención
La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno procedente de Plasmodium faciparum, en combinación con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa procedente de corted de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están presentes ambos en la composición en un nivel entre 1 !g y 30 !g por dosis, para su uso como medicamento humano.
De manera apropiada, el adyuvante de saponina en forma de un liposoma de acuerdo con la invención comprende una fracción activa de la saponina obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21, y un esterol, tal como colesterol, en una proporción saponina:esterol de 1:1 a 1:100 p/p.
En particular, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula T CD4. Como alternativa, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula B.
La invención también se refiere en la presente memoria al uso de un antígeno o antígenos de Plasmodium falciparum o a su preparación antigénica, y un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la fabricación de una composición inmunogénica para la prevención de infección por Plasmodium falciparum y/o enfermedad de malaria.
Se describe el uso de (a) un antígeno o su preparación antigénica, y (b) un adyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento en la preparación de una composición inmunogénica para inducir, en un ser humano, al menos una, o al menos dos, o todas de las siguientes: (i) una respuesta inmunitaria de células T CD4 mejorada frente a dicho antígeno o su preparación antigénica, (ii) una respuesta inmunitaria humoral mejorada frente a dicho antígeno o su preparación antigénica, (iii) una respuesta de células B de memoria mejorada frente a dicho antígeno o su preparación antigénica.
En particular dicho antígeno es un antígeno de malaria o su preparación antigénica, y dicho ser humano es un individuo o población inmunocomprometida, tal como un adulto de alto riesgo, un adulto anciano o un niño. También se describe el uso de un antígeno o su preparación antgénica y un adyuvante como se define en la presente memoria en la preparación de una composición inmunogénica para vacunación de un ser humano, en particular un adulto anciando, contra un patógeno del cual procede el antígeno o su composición inmunogénica. Específicamente dicho antígeno es un antígeno o antígenos de Plasmodium parasite o su preparación antigénica.
También se describe un procedimiento de vacunación que comprende el suministro de un antígeno o composición antigénica, en particular un antígeno de Plasmodium parasiteo o su preparación antigénica y un adyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento a un individuo o población que lo necesitan.
Como se divulga en la presente memoria, la composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria mejorada de células T CD4 frente a dicho antígeno o su preparación antigénica, y en particular es capaz de inducir además una respuesta inmunitaria humoral o una respuesta de células B de memoria mejorada o las dos, en comparación con la obtenida con el antígeno o composición antigénica que no contiene adyuvante. Específicamente dicha respuesta inmunitaria de células T CD4 implica la inducción de una respuesta auxiliar T CD4 con reactividad cruzada. Específicamente dicha respuesta inmunitaria humoral implica la inducción de una respuesta inmunitaria humoral de reactividad cruzada. También se describe un procedimiento o el uso como se ha definido anteriormente, para la protección frente a una infección o enfermedad por parte de un patógeno que es una variante del patógeno del cual procede el antígeno en la composición inmunogénica. Se describe de manera adicional un método o uso como se ha definido anteriormente para la protección frente a infecciones o una enfermedad provocada por un patógeno que comprende un antígeno que es una variante de ese antígeno en la composición inmunogénica. También se describe en la presente memoria el uso de un antígeno o su preparación antigénica en la fabricación de una composición inmunogénica para la re-vacunación de seres humanos previamente vacunados con una composición inmunogénica que comprende un antígeno o su preparación antigénica, en combinación con un adyuvante como se describe en la presente memoria.
También se divulga una composición usada para la revacunación que puede contener adicionalmente un adyuvante. La discripción se refiere de manera adicional a la composición inmunogénica para la revacunación que contiene un antígeno que comparte epitopos de célula T CD4 comunes con un antígeno o composición antigénica usado para una vacuación previa.
Se describen de manera adicional otros aspectos y ventajas de la presente invención en la siguiente descripción detallada de sus realizaciones preferidas.
Descripción de las figuras
Figura 1 - representación en diagrama de preparación de MPL.
Figura 2 - Respuesta humoral frente a diversas cepas de gripe después de la inmunización de hurones con formulaciones experimentales: Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación (GMT +/- IC95) antes y después de la sensibilización heteróloga (H1N1 A/Estocolmo/24/90), después de la inmunización (H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 y B/Shangdong/7/97) y después de prueba de provocación heteróloga (H3N2 A/Wyoming/3/2003).
Figura 3 - Estudio con hurones: valoración vírica en lavados nasales después de la estimulación (Día 42).
Figura 4 - Estudio con ratones: Respuesta humoral frenta a las tres cepas de vacuna antigripal después de la inmunización de ratones con formulaciones experimentales: Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación (GMT +/-IC95) 21 días después de la inmunización (H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Wyoming/3/2003 y B/Jiangsu/10/2003).
Figura 5 - Estudio con ratones: Respuesta inmunitaria mediada por células: Respuestas de células T CD4+ específicas de gripe el Día 7 después de la inmunización.
Figura 6 - Estudio con ratones: CMI para CD4 - Cepa combinada (todo doble) - Día 0 y Día 21.
Figura 7 - valores de GMT en los días 0 y 21 para anticuerpos HI.
Figura 8: Incidencia de síntomas locales y generales en seres humanos (total y relacionada con el grado 3) durante el periodo de seguimiento de 7 días después de la inmunización con formulaciones de virus de la gripe potenciadas con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 9: Respuestas humorales a VPH 16 y 18 L1 en ratones después de la inmunización con formulaciones de VPH potenciadas con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 10: Respuesta inmunitaria mediada por células en ratones: Tinción de Citoquina Intracelular - PSV16 y células T CD4+ 18 después de la inmunización con formulaciones de VPH potenciadas con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 11: Producción de células B de memoria específicas después de la inmunización con formulaciones de VPH potenciadas con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura12: Comparación preclínica de vacunas de S. pneumoniae potenciadas con adyuvante en ratones, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 13: Valoraciones de ELISA Anti-gB en Cobaya después de la inmunización con vacuna Gb potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 14: Valoraciones de neutralización Anti CMV en Cobaya después de la inmunización con vacuna Gb potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 15: Valoraciones de ELISA Anti-gB en Ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada con adyuvante.
Figura 16: Valoraciones de neutralización anti CMV en Ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada con adyuvante.
Figura 17: Estudio con ratones: Inmunidad Mediada por Células - Células CD4+ y CD8+ específicas para CMV después de la re-estimulación con una combinación de péptidos gB (7 días después de la segunda inmunización).
Figura 18: Estudio con ratones. Inmunidad Mediada por Células - Células CD4+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una combinación de péptidos gB (21 días después de la segunda inmunización).
Figura 19: Estudio con ratones. Inmunidad Mediada por Células - Células CD8+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una combinación de péptidos gB (21 días después de la segunda inmunización).
Figura 20: Valoraciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra proteína de Circumsporozoito CSP después de la inmunización con vacuna RTS,S potenciada con adyuvante en ratones; comparando adyuvantes que tienen inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 21: Valoraciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra antígeno de superficie de Hepatitis B (HB) después de la inmunización con vacuna RTS,S potenciada con adyuvante en ratones; comparando adyuvantes con inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 22: Expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para CSP después de la inmunización con una composición inmunogénica RTS, S potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes con inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 23: Expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para HB después de la inmunización con una composición inmunogénica RTS, S potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes con inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 24: Respuestas humorales en ratones después de la inmunización con vacuna antigripal dividida trivalente potenciada con adyuvante (A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu), inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 25: Respuesta inmunitaria mediada por células en ratones después de inmunización con vacuna antigripal trivalente potenciada con adyuvante (A/Nueva Caledonia,A/Wyoming, B/Jiangsu), inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 26: Resultados prclínicios en ratones de comparación del adyuvante para vacunas VZV gE con AS01 B o AS01 E.
Figura 27: valoraciones víricas de lavado nasal tras sensibilización y prueba de provocación con antígenos del virus de la gripe- inmunización con A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes, en hurones
Figura 28: control de la temperatura corporal en hurones tras sensibilización y prueba de provocación con antígenos de gripe. Inmunización con A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 29: Valoraciones anti HI para las cepas A en la formulación de vacuna trivalente tras inmunización y prueba de provocación con preparaciones de antígeno de la gripe. Inmunización con A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 30: Valoraciones anti HI para las cepas B/Jiangsu y de extracción usadas para la prueba de provocación tras inmunización y prueba de provocación con preparaciones de antígeno de gripe. Inmunización con A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Descripción detallada
Los presentes inventores han descubierto que una composición adyuvante que comprende una saponina presentada en forma de un liposoma, y un lipopolisacárido, donde cada inmunoestimulante está presente en una cantidad igual o menor de 30 !g por dosis humana puede mejorar las respuestas inmunitarias frente a una preparación antigénica, teniendo al mismo tiempo una reactogenicidad menor que algunas de las formulaciones de la técnica anterior donde los inmunoestimulantes estaban presentes en cantidades superiores por dosis humana.
Los presentes inventores han descubierto adicionalmente que una formulación antigripal que comprende un virus de la gripe o su preparación antigénica junto con un adyuvante que comprende una saponina presentada en forma de un liposoma, y opcional y adicionalmente con un derivado de lípido A tal como 3D-MPL, fue capaz de mejorar la respuesta inmunitaria de células T CD4 frente a dicho antígeno o composición antigénica en comparación con la obtenida con el virus o preparación antigénica del mismo sin adyuvante. Las formulaciones potenciadas con el adyuvante con saponina presente en forma de un liposoma se usan de manera ventajosa para inducir respuestas de células T CD4 anti-gripe capaces de detectar epítopos de gripe presentados por moléculas MHC de clase II. El presente solicitante ha descubierto que es eficaz dirigirse al sistema inmunitario mediado por células para aumentar la capacidad de respuesta frente a cepas de gripe homólogas y de extracción (después de la vacunación e infección).
Los inventores han descubierto que la composición adyuvante definida en el presente documento demuestra resultados de inmunogenicidad para la producción de anticuerpos y la frecuencia de pos-vacunación de CD4 con especificidad para la gripe que son equivalentes a, o a veces superiores, a los generados con vacuna sin adyuvante. Este efecto es en particular de valor para la población anciana y puede conseguirse con un adyuvante como el definido en el presente documento que contiene una dosis inferior de inmunoestimulantes. Además, los síntomas de reactogenicidad mostraron una tendencia a ser más elevados en el grupo que recibió la vacuna con adyuvante con la concentración más alta de inmunoestimulantes en comparación con el grupo que recibió la vacuna con adyuvante en la que los inmunoestimulantes están a una concentración inferior.
Estos descubrimientos pueden aplicarse a otras formas de los mismos antígenos, y a otros antígenos.
Adyuvante saponina
Una saponina particularmente adecuada para su uso en la presente invención es Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada del árbol de América del Sur Quillaja Saponaria Molina y por primera vez Dalsgaard y col. en 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, páginas 243-254) describieron que tenía actividad adyuvante. Los fragmentos purificados de Quil A se han aislado por HPLC, que mantiene su actividad adyuvante sin la toxicidad asociada a Quil A (documento EP 0 362 278), por ejemplo, QS7 y QS21 (también conocidos como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina natural obtenida de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce células T citotóxicas CD8+ (CTL), células Th1 y una respuesta de anticuerpos predominante de IgG2a y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.
En una forma adecuada de la presente invención, el adyuvante de saponina en la composición inmunogénica es un derivado de saponaria molina quil A, preferiblemente una fracción inmunológicamente activa de Quil A, tal como QS17 o QS-21, de manera apropiada QS-21. En una realización, las composiciones de la invención contienen la fracción de saponina inmunológicamente activa en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, las composiciones de la invención contienen QS21 en forma sustancialmente pura, es decir, la QS21 es al menos el 90% pura, por ejemplo al menos el 95% pura, o al menos el 98% pura.
En una realización específica, QS21 se proporciona en su composición menos reactogénica donde se inactiva con un esterol exógeno, tal como colesterol por ejemplo. Existen varias formas particulares de composiciones menos reactogénicas donde QS21 se inactiva con un colesterol exógeno. En una realización específica, la saponina/esterol está en forma de una estructura de liposoma (documento WO 96/33739, Ejemplo 1). En esta realización los liposomas contienen de manera apropiada un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, que es de manera apropiada no cristalina a temperatura ambiente, por ejemplo fosfatidilcolina de la yema del huevo, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) o dilauril fosfatidilcolina. Los liposomas también pueden contener un lípido cargado que aumenta la estabilidad de la estructura liposoma-QS21 para liposomas compuestos de lípidos saturados. En estos casos la cantidad de lípido cargado es de manera apropiada de 1-20% p/p, preferiblemente de 5-10%. La proporción de esterol a fosfolípidos es de 1-50% (mol/mol), de manera apropiada del 20-25%.
Los esteroles adecuados incluyen 1-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. En una realización particular, la composición inmunogénica comprende colesterol como esterol. Estos esteroles se conocen bien en la técnica, por ejemplo se describe colesterol en el Merck Index, 11a Edn., página 341, como un esterol de origen natural encontrado en la grasa animal.
Las composiciones inmunogénicas de la invención que comprenden QS21 y un esterol, colesterol en particular, muestran una reactogenicidad menor cuando se comparan con composiciones en las que el esterol está ausente, aunque se mantiene el efecto adyuvante. Los estudios de reactogenicidad pueden evaluarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO 96/33739. El esterol de acuerdo con la invención se escoge para que indique un esterol exógeno, es decir un esterol que no sea endógeno para el organismo del que se toma la preparación antigénica pero se añade a la preparación antigénica o posteriormente en el momento de la formulación. Normalmente, el esterol puede añadirse durante la formulación posterior de la preparación de antígeno con el adyuvante de saponina, usando, por ejemplo, la saponina en su forma inactivada con el esterol. De manera apropiada, el esterol exógeno se asocia al adyuvante de saponina como se describe en el documento WO 96/33739.
Cuando la fracción de saponina activa es QS21, la proporción de QS21:esterol será normalmente del orden de 1:100 a 1:1 (p/p), de manera apropiada entre 1:10 y 1:1 (p/p), y preferiblemente 1:5 a 1:1 (p/p). De manera apropiada está presente un exceso de esterol, siendo la proporción de QS21:esterol de al menos 1:2 (p/p). En una realización, la proporción de QS21:esterol es 1:5 (p/p). El esterol es de manera apropiada colesterol.
Otras saponinas útiles se obtienen a partir de las plantas Aesculus hippocastanum o Gyophilla struthium. Otras saponinas que se han descrito en la bibliografía incluyen Escina, que se ha descrito en el índice Merck (12a ed: entrada 3737) como una mezcla de saponinas que se encuentra en la semilla del castaño de indias, Lat: Aesculus hippocastanum. Su aislamiento se describe por medio de cromatografía y purificación (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), y por medio de resinas de intercambio iónico (Erbring y col., documento US 3.238.190). Las fracciones de escina se han purificado y y se ha demostrado que son biológicamente activas (Yoshikawa M, y col. (Chem Pharm Bull (Tokio) 1996 agosto; 44(8):1454-1464)). La Sapoalbina de Gypsophilla struthium (R. Vochten y col., 1968, J. Pharm.Belg., 42, 213-226) también se ha descrito con respecto a la producción de ISCOM, por ejemplo.
Un aspecto clave de la presente invención es el hecho de que la saponina inmunológicamente activa, que es preferiblemente QS21, se puede usar en cantidades inferiores a las que previamente se pensaba que eran útiles, de manera específica entre 1 y 30 µg, por dosis humana de la composición inmunogénica.
Por lo tanto, la invención proporciona una dosis humana de una composición inmunogénica que comprende saponina inmunológicamente activa, preferiblemente QS21, a una cantidad de 1 y 30 µg.
En una realización, una composición inmunogénica en un volumen que es adecuado para una dosis humana, en la que la dosis humana de la composición inmunogénica comprende QS21 en una cantidad de aproximadamente 25 µg, por ejemplo entre 20-30 µg, de manera apropiada entre 21-29 µg o entre 22 y 28 µg o entre 23 y 27 µg o entre 24 y 26 µg, o 25 µg.
En otra realización, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende QS21 en una cantidad de aproximadamente 10 µg por, por ejemplo, entre 5 y 15 µg, de manera apropiada entre 6 y 14 µg, por ejemplo entre 7 y 13 µg, o entre 8 y 12 µg,o entre 9 y 11 µg, o 10 µg.
En una realización adicional, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende QS21 que está presente en una cantidad de aproximadamente 5 µg, por ejemplo entre 1 y 9 µg, o entre 2 y 8 µg o de manera apropiada entre 3 y 7 µg o 4 y 6 µg, o 5 µg.
Una cantidad adecuada de QS21 es por ejemplo cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, µg (p/v) por dosis humana de la composición inmunogénica.
Con la expresión “dosis humana” se quiere decir una dosis que está en un volumen adecuado para uso humano. Generalmente, está entre 0,3 y 1,5 ml. En una realización, una dosis humana es 0,5 ml. En una realización adicional, una dosis humana es mayor de 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, una dosis humana está entre 1 ml y 1,5 ml. La invención se caracteriza porque cada dosis humana contiene 30 µg o menos, por ejemplo entre 1 y 30 µg, de QS21.
La invención describe una composición adyuvante que comprende 1 y 30 µg de QS21. Normalmente, dicha composición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana. Cuando el adyuvante está en forma líquida para combinarse con una forma líquida de una composición antigénica, la composición de adyuvante estará en un volumen apropiado para dosis humana que es aproximadamente la mitad del volumen final pretendido para la dosis humana, por ejemplo un volumen de 360 !l para un dosis humana pretendida de 0,7 ml, o un volumne de 250 !l para una dosis humana pretendida de 0,5 ml. Se diluye la composición de adyuvante cuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis final de vacuna humana. el volumen final de dicha dosis por supuesto varía dependiendo del volumen incial de la composición de adyuvante y el volumen de la composición de antígeno añadido a la composición de adyuvante. Alternativamente, el adyuvante líquido se usa para reconstituir una composición de antígeno liofilizado. En dichos casos, el volumen apropiado para la dosis humana de la composición de adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. Se añade la composición de adyuvante líquido al vial que contiene la composición de antígeno liofilizada. La dosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml. En una realización particular la dosis humana es de 0,5 ml, en esta realización la composición de vacuna de la invención comprenderá una cantidad de QS21 entre 1 y 30 µg, por 0,5 ml de dosis humana.
La dosis de QS21 es de manera apropiada capaz de potenciar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno en un ser humano. En particular una cantidad adecuada de QS21 es la que mejora el potencial inmunológico de la composición en comparación con la composición sin adyuvante, o en comparación con la composición con adyuvante con otra cantidad de QS21, al tiempo que es aceptable desde el punto ve vista de un perfil de reactogenicidad.
Adyuvante 3D-MPL
La composición comprende de manera adicional un adyuvante adicional que es un lipopolisacárido, de manera apropiada un derivado no tóxico de lípido A, particularmente monofosforil lípido A o más particularmente monofosforil lípido A 3-desacilado (3D-MPL).
3D-MPL se comercializa con el nombre MPL por GlaxoSmithKline Biologicals N.A. y se menciona en todo el documento como MPL o 3D-MPL. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.436.727; 4.877.611;
4.866.034 y 4.912.094. 3D-MPL promueve principalmente las respuestas de células T CD4+ con un fenotipo IFN-g (Th1). 3D-MPL puede producirse de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento GB 2 220 211 A. Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Preferiblemente en las composiciones de la presente invención se usa 3D-MPL de partícula pequeña. 3D-MPL de partícula pequeña tiene un tamaño de partícula tal que puede filtrarse a esterilidad a través de un filtro de 0,22 !m. Dichas preparaciones se describen en el documento WO 94/21292.
Un aspecto clave de la presente invención es el hecho de que el lipopolisacárido, que es preferiblemente 3D-MPL, puede usarse a cantidades inferiores a las que previamente se pensaba que eran útiles, de manera específica entre 1 y 30 µg, por dosis humana de la composición inmunogénica.
En la presente memoria se describe una dosis humana de una composición inmunogénica que comprende lipopolisacárido, preferiblemente 3D-MPL, en una cantidad de 1 y 30 µg.
En una realización, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL en una cantidad de aproximadamente 20 - 30 µg, de manera apropiada entre 21 - 29 µg o entre 22 y 28 µg o entre 23 y 27 µg o entre 24 y 26 µg, o 25 µg.
En otra realización, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL en una cantidad de aproximadamente 10 µg, por ejemplo entre 5 y 15 µg, de manera apropiada entre 6 y 14 µg, por ejemplo entre 7 y 13 µg o entre 8 y 12 µg o entre 9 y 11 µg, o 10µg.
En una realización adicional, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL en una cantidad de aproximadamente 5 µg, por ejemplo entre 1 y 9 µg, o entre 2 y 8 µg o de manera apropiada entre 3 y 7 µg o 4 y 6 µg, o 5 µg.
Una cantidad adecuada de 3D-MPL es por ejemplo cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, µg (p/v) por dosis humana de la composición inmunogénica.
En una realización, el volumen de la dosis humana es de 0,5 ml. En una realización adicional, la composición inmunogénica está en un volumen apropiado para una dosis humana cuyo volumen es mayor que 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, la dosis humana está entre 1 ml y 1,5 ml. En un ejemplo, cada dosis humana contiene entre 1 y 30 µg o menos 3D-MPL.
Normalmente, una composición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana. Cuando el adyuvante está en forma líquida para combinarse con una forma líquida de una composición antigénica, la composición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana que es aproximadamente la mitad del volumen final pretendido de la dosis humana, por ejemplo un volumen de 360 µl para una dosis humana pretendida de 0,7 ml o un volumen de 250 µl para una dosis humana pretendida de 0,5 ml. La composición adyuvante se diluye cuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis human final de la composición inmunogénica. El volumen final de dicha dosis por supuesto variará dependiendo del volumen inicial de la composición adyuvante y del volumen de la composición de antígeno añadido a la composición adyuvante. Alternativamente, la composición adyuvante líquida se usa para reconstituir una composición antigénica liofilizada. En tal caso, el volumen adecuado de dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composición adyuvante líquida se añade al vial que contiene la composición antigénica liofilizada. La dosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml. En una realización particular la dosis humana es 0,5 ml, en esta realización la composición de vacuna de la invención comprenderá un nivel de 3D-MPL entre 1 y 30 µg por 0,5 ml de dosis humana.
La dosis de 3D-MPL es adecuada para permitir la mejora de una respuesta immunitaria a un antígeno en un ser humano. En particular una cantidad adecuada de 3D - MPL es la que mejora el potencial inmunológico de la composición en comparación con la composición no adyuvada, o en comparación con la composición adyuvada con otra cantidad de MPL, mientras que es aceptable a partir de un perfil de reactogenicidad.
Las composiciones adecuadas de la invención son aquellas en las que los liposomas se preparan inicialmente sin MLP (como se describe en el documento WO 96/33739), y después se añade MPL, de manera adecuada en forma de partículas pequeñas por debajo de 100 nm o partículas que son susceptibles de filtración estéril a través de membrana de 0,22 μm. Por lo tanto, MPL no está presente dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL exterior). Las composiciones en las que MLP no está presente dentro de la membrana de vesícula (conocido como MPL interior) también forman un aspecto de la invención. El antígeno puede estar presente dentro de la membrana de la vesícula o presente fuera de la membrana de la vesícula. Los antígenos solubles adecuados están fuera y los antígenos hidrófobos o lipídicos están presentes bien dentro o bien fuera de la membrana.
La composición inmunogénica de la invención comprende tanto un lipopolisacárido como una saponina inmunológicamente activa. En una realización específica de la invención, el lipopolisacárido es 3D-MPL y la saponina inmunológicamente activa es QS21. Se describe en la presente memoria una composición de adyuvante que consiste esencialmente en un lipopolisacárido y una saponina inmunológicamente activa en una formulación lipsómica. De manera apropiada en un ejemplo, la composición de adyuvante consiste esencialmente en 3D-MPL y QS21, opcionalmente con esterol que es preferiblemente colesterol.
En otro ejemplo, la composición adyuvante comprende una formulación liposómica de lipopolisacárido y saponina inmunológicamente activa en combinación con uno o más inmunoestimulantes o adyuvantes adicionales. De manera adecuada el lipopolisacárido es 3D -MPL y la saponina inmunológicamente activa es QS21.
En una realización específica, QS21 y 3D -MPL están presentes en la misma concentración final por dosis humana de la composición inmunogénica. En un aspecto de esta realización, una dosis humana de composición inmunogénica comprende una cantidad final de 25 µg de 3D - MPL y 25 µg de QS21. En una realización adicional, una dosis humana de composición inmunogénica comprende una cantidad final de 10 µg de cada uno de 3D - MPL y QS21. En una realización específica adicional, se proporciona una composición de adyuvante que tiene un volumen de 250 !l y comprende una cantidad de 25 !g de 3D -MPL y 25 !g de QS21, o 10 !g de cada uno de MPL y QS21.
Las composiciones de la presente invención pueden comprender antígenos o preparaciones antigénicas derivados de Plasmodium falciparum. Por ejemplo, los posibles antígenos de Plasmodium falciparum incluyen proteína de circumsporozoíto (proteína CS), RTS,S MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMA1 y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la parte C-terminal de la proteína de circumsporozoíto (CS) de P. falciparum ligada mediante cuatro aminoácidos de la parte presS2 del antígeno de superficie de la hepatitis B al antígeno de superficie
(S) del virus de la hepatitis B. Se da a conocer su estructura completa en la solicitud de patente internacional nº PCT/EP92/02591, publicada con el número WO 93/10152, que reivindica prioridad de la solicitud de patente del Reino Unido nº 9124390.7. Cuando se expresa en levadura, RTS se produce en forma de una partícula de lipoproteína, y cuando se coexpresa con el antígeno S de HBV, produce una partícula mixta conocida como RTS,S. Se describen los antígenos TRAP en la solicitud de patente internacional nº PCT/GB89/00895, publicada como WO 90/01496. Es una realización preferida de la presente invención una vacuna de malaria en la que la preparación antigénica comprenda una combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. Otros antígenos de Plasmodia que son probablemente candidatos para ser componentes de una vacuna de malaria multietapa son MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. faciparum y sus análogos en Plasmodium spp. Una realización de la presente invención es una composición que comprende proteína RTS,S o CS o un fragmento de la misma tal como la porción CS de RTS,S en combinación con uno o más antígenos de malaria adicionales, que pueden seleccionarse por ejemplo entre el grupo constituido por MSP1, MSP3, AMA1, LSA1 o LSA3. Los antígenos posibles de P vivax incluyen proteína de circumsporozoíto (proteína CS) y proteína de unión al antígeno Duffy y fragmentos de la misma tales como PvRII (véase, por ejemplo, el documento WO02/12292).
Propiedades inmunogénicas de la composición inmunogénica usada para la vacunación de la presente invención
En la presente invención, la composición inmunogénica es, preferentemente, capaz de inducir una respuesta inmunitaria mejorada de las células T CD4 frente a al menos uno de los antígeno(s) de componente(s) o composición antigénica en comparación con la respuesta inmunitaria mejorada de las células T CD4 obtenida con la correspondiente composición que no está adyuvada, es decir que no contiene ningún adyuvante exógeno (en la
presente memoria descriptiva también denominada “composición sencilla”).
Por “respuesta inmunitaria mejorada de las células T CD4“ se entiende una respuesta de las células CD4 en un mamífero tras la administración de la composición inmunogénica adyuvada mayor que la obtenida tras la administración de la misma composición sin adyuvante.
La respuesta inmunitaria mejorada de las células T CD4 puede evaluarse midiendo el número de células que producen cualquiera de las siguientes citoquinas:
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células que producen al menos dos citoquinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa)
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células que producen al menos CD40L y otra citoquina (IL-2, TNFa, IFNy)
•
células que producen al menos IL-2 y otra citoquina (CD-40, TNFa, IFNy)
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células que producen al menos IFNy y otra citoquina (IL-2, TNFa,CD40L)
•
células que producen al menos TNFa y otra citoquina (IL-2, CD40L, IFNy)
Habrá una respuesta inmunitaria mejorada de las células T CD4 cuando las células productoras de alguna de las citoquinas anteriores se encuentren en una cantidad mayor después de la administración de la composición adyuvada en comparación con la administración de la composición sin adyuvar. Normalmente, se cumplirán al menos una, preferentemente dos, de las cinco condiciones mencionadas anteriormente en la presente memoria. En una realización particular, las células productoras de las cuatro citoquinas estarán presentes en una cantidad superior en el grupo adyuvado en comparación con el grupo no adyuvado.
En otra realización, la administración de dicha composición inmunogénica induce una respuesta mejorada de las células de memoria B en pacientes a los que se ha administrado la composición inmunogénica adyuvada en comparación con la respuesta de células de memoria B inducida en individuos inmunizados con la composición no adyuvada. Con una respuesta mejorada de células de memoria B se pretende hacer referencia a un incremento de la frecuencia de los linfocitos B de sangre periférica capaces de diferenciarse en células plasmáticas secretoras de anticuerpos tras el encuentro con el antígeno, tal y como se puede medir a través de la estimulación de la diferenciación in vitro.
En otra forma de realización, la administración de dicha composición inmunogénica induce una respuesta humoral mejorada en pacientes a los que se ha administrado la composición inmunogénica adyuvada en comparación con la respuesta humoral inducida en individuos inmunizados con la composición no adyuvada. Dicha respuesta inmunitaria humoral se puede medir de acuerdo con alguno de los procedimientos detallados en el Ejemplo de Referencia 1, y especialmente en las secciones I.1 (I.1.1), I.2 (I.2.1) and I.3 (I.3.5.2).
En una realización específica, la administración de dicha composición inmunogénica adyuvada induce al menos dos de las siguientes respuestas: (i) una respuesta inmunitaria mejorada de las células T CD4, (ii) una respuesta mejorada de células memoria B, (iii) una respuesta humoral mejorada, frente a al menos uno de los antígeno(s) de componente(s) o composición antigénica en comparación con cualquiera de las respuestas inmunitarias obtenidas con la correspondiente composición no adyuvada, es decir que no contiene ningún adyuvante exógeno (en la
presente memoria descriptiva también denominada “composición sencilla”).
En otra realización más específica, la vacunación con la composición de la primera vacunación, adyuvada, no posee ningún impacto mensurable sobre la respuesta de las células CD8.
Medio de vacunación
Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar por cualquier vía de la administración adecuada, tal como intradérmica, mucosal, por ejemplo intranasal, oral, intramuscular o subcutánea. En la técnica se conocen bien otras vías de administración.
Para la composición inmunogénica adyuvada se prefriere la vía de administración intramuscular.
La administración intradérmica es otra vía adecuada. Para la administración intradérmica se puede usar cualquier dispositivo adecuado, por ejemplo dispositivos de agujas cortas tales como los descritos en los documentos US 4,886,499, US5,190,521, US 5,328,483, US 5,527,288, US 4,270,537, US 5,015,235, US 5,141,496, US 5,417,662. Las vacunas intradérmicas también pueden administrarse a través de dispositivos que limitan la longitud de la penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los descritos en los documentos WO99/34850 y EP1092444, y sus equivalentes funcionales. También son adecuados los dispositivos de inyección a chorro, que administran vacunas líquidas en la dermis a través de un inyector de chorro líquido o de una aguja que perfora el estrato córneo y produce un chorro que alcanza la dermis. Los dispositivos de inyección de chorro se describen, por ejemplo, en los documentos US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520, 639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 y WO 97/13537. También son adecuados los dispositivos de administración balística de polvo/partículas que usan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a través de las capas externas de la piel y hacia la dermis. Adicionalmente, se pueden usar jeringas convencionales en el método manthoux clásico de administración intradérmica.
Otra vía de administración adecuada es la vía subcutánea. Para la administración subcutánea se puede usar cualquier dispositivo adecuado, por ejemplo una aguja clásica. Preferentemente, se usa un servicio de inyector a chorro sin aguja, tal como el publicado en los documentos WO 01/05453, WO 01/05452, WO 01/05451, WO 01/32243, WO 01/41840, WO 01/41839, WO 01/47585, WO 01/56637, WO 01/58512, WO 01/64269, WO 01/78810, WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/34317. Más preferentemente, dicho dispositivo está precargado con la formulación de vacuna líquida.
Como alternativa, la vacuna se administra por vía intranasal. Normalmente, la vacuna se administra localmente en el área nasofaríngea, preferentemente sin que sea inhalada a los pulmones. Es deseable usar un dispositivo de administración intranasal que administra la formulación de la vacuna en el área nasofaríngea, sin entrar, o sustancialmente sin entrar, en los pulmones.
Los dispositivos preferidos para la administración intranasal de las vacunas de acuerdo con la invención son dispositivos de aerosol. Los dispositivos de aerosol nasal adecuados disponibles comercialmente incluyen AccusprayTM (Becton Dickinson). Los nebulizadores producen un aerosol muy fino que puede ser inhalado con facilidad hacia el inteiror de los pulmones y, por tanto, no alcanza de forma eficaz la mucosa nasal. Por tanto, no se prefieren los nebulizadores.
Los dispositivos de aerosol preferidos para uso intranasal son los dispositivos para los que el funcionamiento del dispositivo no depende de la presión aplicada por el usuario. Estos dispositivos se conocen como dispositivos de umbral de presión. El líquido sale por la boquilla únicamente cuando se aplica una presión umbral. Estos dispositivos facilitan la obtención de un aerosol con un tamaño de gota regular. En la técnica se conocen los dispositivos de umbral de presión para su uso en la presente invención y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 91/13281 y EP 311 863 B y EP 516 636. Tales dispositivos están disponibles comercialmente en Pfeiffer GmbH y también se han descrito en Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999.
Los dispositivos intranasales preferidos producen gotas (medidas usando agua como líquido) en el intervalo de 1 a 200 !m, preferentemente de 10 a 120 !m. Por debajo de 10 !m, existe un riesgo de inhalación, por lo que es deseable no tener más de aproximadamente 5% de las gotas por debajo de 10 !m. Las gotas por encima de 120 !m, no se dispersan tan bien como las gotas más pequeñas, por lo que es deseable que no más de aproximadamente el 5% de las gotas supere los 120 !m. .
La administración de dos dosis es otra característica de un sistema de administración intranasal para su uso con las vacunas de acuerdo con la invención. Los dispositivos bidosis contienen dos subdosis de una dosis individual de la vacuna, una subdosis para administrar en cada fosa nasal. En general, las dos subdosis están presentes en una cámara individual y la construcción del dispositivo permite la administración eficaz de una única subdosis cada vez. Como alternativa, se puede usar un dispositivo monodosis para administrar las vacunas de acuerdo con la invención.
Como alternativa, la vía de vacunación epidérmica o transdérmica también se contempla en la presente invención.
Poblaciones a vacunar
La población diana a vacunar puede ser seres humanos inmunocomprometidos. En general, los seres humanos inmunocomprometidos son bastante menos susceptibles de responder a un antígeno, en comparación con adultos sanos.
Regímenes de vacunación, dosificación y criterios adicionales de eficacia
De manera apropiada, las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la presente invención son una dosis inyectable estándar de 0,5 ml en la mayoría de los casos. De manera apropiada, el volumen de la dosis de la vacuna estará entre 0,5 ml y 1 ml, en particular un volumen de dosis de vacuna estándar de 0,5 ml o 0,7 ml.
Existe un procedimiento para diseñar una vacuna para las enfermedades que se sabe que se curan o tratan mediante activación de células T CD4+, que comprende
1) seleccionar un antígeno que contenga epítopos de CD4+, y
2) combinar dicho antígeno con un adyuvante de saponina en forma de liposoma como se ha definido anteriormente en la presente memoria, donde dicha vacuna tras la administración en dicho mamífero es capaz de inducir una respuesta mejorada de células T CD4 en dicho mamífero.
Para evitar las dudas en los términos “que comprende”, “comprender” y “comprende”, los inventores pretenden en la presente memoria descriptiva que sean opcionalmente sustituibles por los términos “que consiste en”, “consistir enquot;, “consiste en”, respectivamente en cada caso.
La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes:
El Ejemplo de Referencia I describe procedimientos de lectura inmunológicos usados en estudios con ratones, hurones y seres humanos.
El Ejemplo de Referencia II describe una preparación del adyuvante liposómico MPL/QS21.
El Ejemplo de Referencia III describe una evaluación preclínica de vacunas antigripales adyuvadas y no adyuvadas en hurones.
El Ejemplo de Referencia IV muestra una evaluación preclínica de vacunas antigripales adyuvadas y no adyuvadas en ratones C57Bl/6 no expuestos y sensibilizados.
El Ejemplo de Referencia V describe una comparación de vacunas antigripales adyuvadas con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes en ratones.
El Ejemplo de Referencia VI describe una comparación de vacunas antigripales adyuvadas con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes en seres humanos ancianos.
El Ejemplo de Referencia VII describe una evaluación preclínica de vacunas de VPH adyuvadas en ratones.
El Ejemplo de Referencia VIII describe una evaluación preclínica de composiciones inmunogénicas frente a citomegalovirus adyuvadas y no adyuvadas.
El Ejemplo 1 describe la evaluación preclínica de una composición de vacuna de RTS,S adyuvada con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes.
El Ejemplo 2 describe la evaluación clínica de una vacuna RTS,S adyuvada con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes.
Ejemplo de Referencia I – Procedimientos de lectura inmunológica
I.1. Procedimientos en ratones
I.1.1. Prueba de Inhibición de la Hemaglutinación
Procedimiento de ensayo
Se determinaron las valoraciones de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe usando el enesyo de inhibición de hemaglutinación (IH). El principio del ensayo de IH se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por parte de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros inactivados con calor se trataron previamente con caolín y RBC de pollo para eliminar los inhibidores no específicos. Tras el pretratamiento, se incubaron diluciones de dos veces de suero con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos de pollo y se clasificó la inhibición de la aglutinación. Los títulos se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se clasificó como una valoración igual a 10.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron en las valoraciones de de IH posteriores a la vacunación usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
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Transformación logarítmica de datos
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Ensayo de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos
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Ensayo de Cochran para verificar la homogeneidad de la varianza entre las diferentes poblaciones(grupos)
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Análisis de dos vías de la varianza realizado en los grupos
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Ensayo de Tukey HSD para comparaciones múltiples
I.1.2. Tinción intracelular de citoquinas
Esta técnica permite una cuantificación de linfocitos T específicos de antígeno sobre la base de la producción de citoquinas: las células T efectoras y/o las células T de memoria-efectoras producen IFN-γ y/o las células T de memoria centrales producen IL-2. Las PBMC se recogen el día 7 después de la inmunización.
Las células linfoides se re-estimulan in vitro en presencia de un inhibidor de la secreción (Brefeldina):
Estas células se procesan a continuación mediante procedimiento convencional de inmunofluorescencia usando anticuerpos fluorescentes (CD4, CD8, IFN-γ yIL-2). Los resultados se expresan en forma de frecuencia de células positivas de citoquinas en las células T CD4/CD8. La tinción intracelular de las citoquinas de las células T se realizó en las PBMC 7 días después de la segunda inmunización. Se recogió sangre de ratones y se agrupó en medio heparinizado RPMI + Ad. Para la sangre, se estratificaron las suspensiones de RPMI + Ad en un gradiente de linfocito-mamífero de acuerdo con el protocolo recomendado (centrífuga 20 min a 2500 rpm a TA). Se retiraron las células mononucleares en la interfase, se lavaron 2 veces en RPMI + Ad y se ajustaron las suspensiones de PBMC a 2 x 106 células/ml en RPMI con 5% de suero bovino fetal.
La estimulación antigénica in vitro de las PBMC se llevó a cabo a una concentración final de 1 x 106 células/ml (en FACS de tubo) con Flu trivalente dividido en µesferas (5 µg de HA/cepa) o Fl completo (1 µg de HA/cepa) y después se incubó 2 horas a 37 ºC con la adición de anti-CD28 y anti-CD49d (1 µg/ml para ambos).
La adición de ambos anticuerpos aumentó la proliferación y la producción de citoquinas por parte de las células T y NK activadas y puede proporcionar una señal coestimuladora para la inducción de LTC.
Además, las PBMC también se estimularon durante la noche con Flu trivalente dividida (30 µg de HA/cepa) o Fl completo (5 µg de HA/cepa) en pulsos de BMDC (1 x 105 células/ml), que se prepararon mediante pulsos de BMDC con Flu dividido (60 µg de HA/cepa) o FI trivalente con Flu completo (10 µg de HA/cepa) durante 6 horas a 37 ºC. Tras la etapa de reestimulación antigénica, las PBMC se incuban O.N. a 37ºC en presencia de Brefeldina (1µg/ml) a 37ºC para inhibir la secreción de citoquina.
La tinción de IFN-γ/IL-2/CD4/CD8 se realizó del siguiente modo: se lavarn las suspensiones celulares, se resuspendieron en 50 µl de PBS con 1% de FCS que contenía 2% de reactivo de bloqueo Fc (1/50; 2.4G2). Tras 10 min de incubación a 4ºC, se añadieron 50 µl de una mezcla de anti-CD4-PE (2/50) y anti-CD8-perCp (3/50) y se incubó durante 30 min a 4ºC. Tras lavar con PBS y 1% de FCS, las células se permeabilizaron mediante resuspensión en 200 µl de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) y se incubaron 20 min a 4ºC. A continuación, se lavaron las células con Perm Wash (Kit BD) y se resuspendieron con 50 µl de una mezcla de anti-IFN-γ APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluida en Perm Wash. Tras una incubación como mínimo de 2 horas y como máximo durante toda la noche a 4ºC, las células se lavaron con Perm Wash y se resuspendieron en PBS con 1% de FCS + 1% de paraformaldehído. El análisis de la muestra se realizó con FACS. Las células vivas se agruparon (FSC/SSC) y la adquisición se realizó en ~ 50.000 sucesos (linfocitos) o 35.000 sucesos en células T CD4+. Se calcularon los porcentajes de IFN-γ + o IL2+ en poblaciones agrupadas de CD4+ and CD8+.
I.2. Procedimientos en hurones
I.2.1. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IH)
Procedimiento del ensayo
Se determinaron las valoreaciones de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe usando el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IH). El principio del ensayo de IH se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por medio de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros se trataron primero con una solución al 25% de neuraminidasa (RDE) y se inactivaron con calor para eliminar los inhibidores inespecíficos. Tras el pretratamiento, se incubaron diluciones de dos veces de suero con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos de pollo y se clasificó la inhibición de la aglutinación usando gotas para la lectura. Se expresaron las valoraciones como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se clasificó como una valoración igual a 5.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con valoraciones de IH (día 41 antes de la prueba de provocación) usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
■
Transformación logarítmica de los datos.
■
Ensayo de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos.
■
Ensayo de Cochran para verificar la homogeneidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos).
■
Ensayo para la interacción de ANOVA de una vía.
■
Ensayo de Tukey HSD para comparaciones múltiples
I.2.2. Lavados nasales
Los lavados nasales se realizaron mediante la administración de 5 ml de PBS en ambas fosas nasales en animales despiertos. El inóculo se recogió en una placa de Petri y se introdujo en recipientes de muestras en hielo seco.
Valoración vírica en lavados nasales
Todas las muestras nasales primero se filtraron en esterilidad a través de filtros Spin X (Costar) para retirar toda contaminación bacteriana. Se transfirieron 50 µl de diluciones seriadas de 10 veces de lavados nasales se transfirieron a placas de microvaloración que contenían 50 µl de medio (10 pocillos/dilución). A continuación se añadieron 100µl de células MDCK (2,4 x 105 células/ml) a cada pocillo y se incubó a 35ºC durante 5-7 días. Tras 6-7 días de incubación, el medio de cultivo se retiró suavemente y se añadieron 100 µl de un medio con /20 WST-1 y se incubó durante otras 18 horas.
La intensidad del colorante de amarillo formazán producido tras la reducción de WST-1 mediante células viables es proporcional al número de células viables presente en el pocillo al final del ensayo de valoración vírica y se cuantifica midiendo la absorbancia de cada pocillo a la longitud de onda adecuada (450 nanómetros). El valor de corte se define como la DO media de las células control no infectadas, - 0,3 DO (0,3 DO corresponde a una desviación estándar de +/- 3 de la DO de las células control no infectadas). Una puntuación positiva se define cuando la DO es lt; del valor de corte y, en contraste, una puntuación negativa se define cuando la DO es gt; del valor de corte. Se determinaron las valoreaciones de diseminación vírica mediante “Reed y Muench” y se expresaron en forma de DICT50/ml.
I.3. Ensayos para evaluar la respuesta inmunitaria en seres humanos
I.3.1. Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación
Se determinó la respuesta inmunitaria midiendo los anticuerpos de IH usando el procedimiento descrito por el Centro colaborador de la OMS para gripe, Centros de Control de Enfermedades (Collaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control), Atlanta, EE.UU. (1991).
Las mediciones del título de anticuerpos se realizaron en muestras de suero congeladas y descongeladas con un microprocedimiento normalizado y validado exhaustivamente usando 4 unidades inhibidoras de la hemaglutinación (4 UIH) de los antígenos adecuados y una suspensión al 0,5% de eritrocitos de ave de corral. Los inhibidores de suero no específicos se retiraron mediante tratamiento con calor y enzima destructora del receptor.
Los sueros obtenidos se evaluaron para determinar los niveles de anticuerpos de IH. Comenzando con una dilución inicial de 1:10, se preparó una serie de diluciones (por un factor de 2) hasta una dilución final de 1:20480. Se tomó el criterio de valoración como la dilución más elevada que mostró una inhibición completa (100%) de la hemaglutinación. Todos los análisis se realizaron por duplicado.
I.3.2. Ensayo de Inhibición de la Neuraminidasa
El ensayo se realizó en placas de microvaloración revestidas con fetuina. Se preparó una serie de dilución de 2 veces del antisuero y se mezcló con una cantidad normalizada de H3N2, H1N1 del virus de la gripe A o el virus de la gripe B. La prueba se basó en la actividad biológica de la neuraminidasa que enzimáticamente libera ácido neuramínico a partir de la fetuina. Tras la escisión del ácido neuramínico terminal se descubrió ß-D-galactosa-Nacetil-galactosamina. Se añadió, a los pocillos, aglutinina de cacahuete de Arachis hypogaea marcada con peroxidasa de rábano (HRP), que se une de forma específica a las estructuras de galactosa. La cantidad de aglutinina unida se puede detectar y cuantificar en una reacción de sustrato con tetra-metilbenzidina (TMB), Como valoración de IN se indicó la dilución de anticuerpos más elevada que todavía inhibía la actividad de neuraminidasa viral en al menos un 50%.
I.3.3. Ensahyos de Anticuerpos de Neutralización
Las mediciones de los anticuerpos de neutralización se llevaron a cabo en muestras de suero congeladas y descongeladas. Se determinó la neutralización de virus por parte de los anticuerpos presentes en el suero se determinó en un ensayo de microneutralización. Los sueros se usaron sin posterior tratamiento en el ensayo. Cada suero se sometió a ensayo por triplicado. Se mezcló una cantidad normalizada de virus con diluciones seriadas de suero y se incubó para permitir la unión de los anticuerpos al virus. A continuación se añadió una suspensión celular que contenía una cantidad definida de células MDCK a la mezcla de virus y antisuero y se incubó a 33 ºC. Tras el periodo de incubación, la replicación se visualizó mediante hemaglutinación de eritrocitos de pollo. La valoración de neutralización de 50% de un suero se calculó mediante el procedimiento de Reed and Muench.
I.3.4. La inmunidad mediada por células se evaluó mediante Citometría de Flujo de Citoquinas (CFC)
Las células T DC4 y CD8 de sangre periférica específicas del antígeno se pueden reestimular in vitro para producir IL-2, CD40L, TNF-alfa e IFN si se incuban con su correspondiente antígeno. Por consiguiente, las células T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar por medio de citometría de flujo siguiendo el marcaje con inmunofluorescencia convencional del fenotipo celular, así como la producción de citoquinas intracelulares. En el presente estudio, como antígeno para reestimular las células T específicas de la gripe, se usó el antígeno de la vacuna antigripal así como péptidos derivados de proteínas específicas de la gripe. Los resultados se expresaron en forma de una frecuencia de células T CD4 o CD8 positivas para citoquina(s) dentro de la subpoblación de células T CD4 o CD8.
I.3.5. Procedimientos estadísticos
I.3.5.1. Criterios de valoración principales
•
Porcentaje, intensidad y relación con respecto a la vacunación de los signos y síntomas locales y generales solicitados durante un periodo de seguimiento de 7 días (es decir, día de la vacunación y 6 días posteriores) después de la vacunación y globales.
•
Porcentaje, intensidad y relación con respecto a la vacunación de los signos y síntomas locales y generales no solicitados durante un periodo de seguimiento de 21 días (es decir, día de la vacunación y 20 días posteriores) después de la vacunación y globales.
•
Existencia de acontecimientos adversos serios durante el estudio completo.
I.3.5.2. Criterios de valoración secundarios
Para la respuesta inmunitaria humoral:
Variables observadas:
•
En los días 0 y 21: valoraciones de anticuerpos de inhibición de la hemoaglutinación (HI) y NI en suero, sometidos a ensayo por separado frente a cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).
•
En los días 0 y 21: valoraciones de anticuerpos de neutralización sometidos a ensayo por separado frente a cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna.
Variables derivadas (con intervalos de confianza de 95%):
•
Valoraciones en media geométrica (GMT) de anticuerpos HI en suero con intervalos de confianza de 95% (95% CI) antes y después de la vacunación.
•
Tasas de seroconversión* con 95% CI el día 21.
•
Factores de conversión** con 95% CI en el día 21.
•
Tasas de seroprotección*** con 95% CI en el día 21.
•
Valores d eGMT de anticuerpo NI en suero (con intervalos de confianza del 95%) en todos los momentos puntuales.
* La tasa de seroconversión se define como el porcentaje de vacunados que tienen al menos un aumento de 4 veces en las valoraciones de HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna.
** El factor de conversión se define como el número de veces de aumento de GMT HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna.
*** La tasa de protección se define como el porcentaje de vacunados con un valoración de HI en suero = 40 después de la vacunación (para cada cepa de vacuna) que se acepta habitualmente como indicador de protección.
Para la respuesta inmunitaria mediada por células (CMI)
Variable observada
En los días 0 y 21: frecuencia de células T CD4/CD8 positivas a citoquinas por 106 en diferentes ensayos. Cada ensayo cuantifica la respuesta de células T CD4/CD8 a:
•
Antígeno peptídico (pf) de la gripe (es preciso aportar/explicar la naturaleza y origen precisos de estos antígenos)
•
Antígeno de la gripe dividido (sf)
•
Antígeno de la gripe completo (wf).
Variables derivadas:
•
células que producen al menos dos citoquinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa)
•
células que producen al menos CD40L y otra citoquina (IL-2, TNFa, IFNy)
•
células que producen al menos IL-2 y otra citoquina (CD40L, TNFa, IFNy)
•
células que producen al menos IFNy y otra citoquina (IL-2, TNFa, CD40L)
•
células que producen al menos TNFa y otra citoquina (IL-2, CD40L, IFNy)
I.3.5.3. Análisis de Inmunogenicidad
El análisis de inmunogenicidad se basó en la cohorte vacunada total. Para cada grupo de tratamiento, se calcularon los siguientes parámetros (con intervalos de confianza del 95%):
•
Valoraciones en media geométrica (GMT) de valoraciones de anticuerpo HI y NI en los días 0 y 21.
•
Valoraciones en media geométrica (GMT) de valoraciones de anticuerpo de neutralización en los días 0 y 21.
•
Factores de conversión en el día 21.
•
Tasas de seroconversión (SC) en el día 21 definidas como el porcentaje de vacunados que tienen al menos un aumento de 4 veces en las valoraciones de HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0.
•
Tasas de protección en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados con una valoración de HI en suero =
1:40.
•
Se resumió la frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 que segregan en respuesta (estadística descriptiva) para cada grupo de vacunación, en cada momento puntual (Día 0, Día 21) y para cada antígeno (de la gripe peptídico (pf), gripe dividida (sf) y de la gripe completa (wf)).
•
Estadística descriptiva en la diferencia individual entre respuestas en momentos puntuales (posterior-anterior) para cada grupo de vacunación y cada antígeno (pf, sf y wf) en cada uno de los 5 diferentes ensayos.
•
Se usó un ensayo no paramétrico (ensayo de Kruskall-Wallis) para comparar las diferencias de localización entre los 3 grupos y se calculó el valor p estadístico para cada antígeno en cada uno de los 5 ensayos diferentes. Todos los ensayos de significancia tuvieron dos extremos. Los valores p menores o iguales a 0,05 se consideraron como estadísticamente significativos.
Ejemplo de Referencia II - Preparación del adyuvante liposómico MPL/QS21
II.3 Preparación de suspensión líquida de MPL
Se prepara la carga líquida de MPL (como se usa en todo el documento es una abreviatura de 3D-MPL, es decir, monofosforil lípido 3-O-desacilado) a partir de 3D-MPL en polvo liofilizado. La carga líquida de MPL es una dispersión acuosa concentrada estable (alrededor de 1 mg/ml) de materia prima, que está listo para su uso para una formulación de vacuna o adyuvante. Se proporciona una representación esquemática del procedimiento de preparación en la Figura 1.
Para un tamaño de lote máximo de 12 g, se lleva a cabo la preparación de carga líquida de MPL en recipientes de vidrio estériles. La dispersión de MPL consta de las siguientes etapas:
-
se suspende el polvo de MPL en agua para inyección
-
se disgrega cualquier agregado grande por medio de calentamiento (tratamiento térmico)
-
se reduce el tamaño de partícula entre 100 nm y 200 nm por medio de microfluidización
-
se prefiltra la preparación en una unidad de prefiltración de Sartoclean, 0,8/0,65 µm
-
se filtra de forma estéril la preparación a temperatura ambiente (unidad P Sartobran, 0,22 µm).
Se liofiliza el polvo de MPL por microfluidización dando como resultado una dispersión acuosa coloidal estable (partículas de MPL de un tamaño susceptibie de filtración estéril). El polvo liofilizado de MPL se dispersa en agua para inyección con el fin de obtener una suspensión gruesa de 10 mg/ml. La suspensión posteriormente experimenta un tratamiento térmico con agitación. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se inicia el procedimiento de microfluidización para disminuir el tamaño de partícula. La microfluidización se realiza usando un aparato Microfluidics M110EH, haciendo circular de forma continua la dispersión a través de una cámara de interacción de microfluidización, a una presión definida durante una cantidad mínima de pases (cantidad de ciclos: nmin).La duración de la microfluidización, que representa la cantidad de ciclos, se calcula en base al caudal medido y el volumen de dispersión. En un equipo dado a una presión dada, el caudal resultante puede variar de una cámara de interacción a otra, y durante todo el ciclo de vida de una cámara de interacción particular. En el presente ejemplo, la cámara de interacción usada es de tipo F20Y Microfluidics. Como la eficacia de la microfluidización está ligadad a la presión acoplada -caudal, el tiempo de procesado puede variar de un lote a otro. El tiempo necesario para 1 ciclo se calcula en base al caudal. El caudal a considerar es el caudal medido con agua para inyección justo antes de la introducción de MPL en el aparato. Un ciclo se define como el tiempo (en minutos) necesario para que el volumen total de MPL pase una vez a través del aparato. El tiempo necesario para obtener n ciclos se calcula del siguiente modo:
n x cantidad de MPL a tratar (ml)/caudal (ml/min)
La cantidad de ciclos, por tanto, se adapta en consecuencia. La cantidad mínima de ciclos a realizar (nmin) se describe para el equipo preferido y las cámaras de interacción usadas. La cantidad total de ciclos a procesar se determina por medio del resultado de una medición del tamaño de partícula realizada después de nmin ciclos. Se define un límite del tamaño de partícula (dlim) en base a los datos históricos. La medición se realiza por medio de la técnica de espectroscopía de correlación de fotones (PCS), y dlim se expresa como un resultado unimodal (Zmedio). En este límite, la microfluidización puede detenerse después de nmin ciclos. Por encima de este límite, la microfluidización continúa hasta que se obtiene una reducción del tamaño satisfactoria, para un máximo de otros 50 ciclos.
Si la filtración no tiene lugar inmediatamente después de la microfluidización, el MPL dispersado se almacena de +2 a +8ºC en espera de la transferencia al área de filtración.
Después de la microfluidización, la dispersión se diluye con agua para inyección, y se filtra en condiciones estériles a través de un filtro de 0,22 µm con flujo laminar. La concentración final de MPL es 1 mg/ml ((0,80-1,20 mg/ml).
II.2 Preparación de MPL/QS21 adyuvante liposómico
Este adyuvante, llamado AS01, comprende 3D-MPL y QS21 en una forma inactivada con colesterol, y se preparó como se describe en el documento WO 96/33739. En particular el adyuvante AS01 se preparó esencialmente como en el Ejemplo 1.1 del documento WO 96/33739. El adyuvante AS01B comprende: liposomas, que a su vez comprenden dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), colesterol y 3D MPL [en una cantidad de 1000!g DOPC, 250 !g colesterol y 50 !g 3D-MPL, cada valor dado aproximadamente por dosis de vacuna], QS21 [50 !g/dosis], tampón fosfato NaCl y agua hasta un volumen de 0,5 ml.
El adyuvante AS01E comprende los mismos ingredientes que AS01B pero a una concentración menor en una cantidad de 500 µg DOPC, 125 µg colesterol, 25 µg 3D-MPL y 25 µg QS21, tampón fosfato NaCl y agua hasta un volumen de 0,5 ml.
En el procedimiento de producción de liposomas que contienen MPL la DOPC (Dioleil fosfatidilcolina), colesterol y MPL se disuelven en etanol. Se forma una película lipídica mediante evaporación de disolvente al vacío. Se añade solución salina tamponada con fosfato (Na2HPO4 9 mM, KH2PO4 41 mM, NaCl 100 mM) a pH 6,1 y la mezcla se somete a prehomogeneización seguida de homogeneización a alta presión a 15.000 psi (aproximadamente 15 a 20 ciclos). Esto conduce a la producción de liposomas que se filtran de forma estéril a través de una membrana de 0,22 !m en un área aséptica (clase 100). El producto estéril se distribuye después en recipientes de vidrio estériles y se almacena en una habitación fría (+2 a +8°C).
De esta manera los liposomas producidos contienen MPL en la membrana (la realización “MPL in” del documento WO 96/33739).
QS21 se añade en solución acuosa a la concentración deseada.
Ejemplo de Referencia III - Evaluación preclínica de vacunas antigripales adyuvadas y no adyuvadas en hurones
III.1. Fundamento y objetivos
La infección por gripe en el modelo de hurón mimetiza estrechamente la gripe de seres humanos, con respecto a la sensibilidad a infección y la respuesta clínica.
El hurón es extremadamente sensible a infección con virus de gripe tanto A como B sin adaptación anterior a cepas víricas. Por lo tanto, proporciona un excelente sistema de modelo para estudios de protección conferida por vacunas antigripales administradas.
Este estudio investigó la eficacia de diversas vacunas divididas trivalentes, adyuvadas o no, para reducir los síntomas de enfermedad (temperatura corporal) y diseminación viral en secreciones nasales de hurones sometidas a prueba de provocación con cepas homólogas.
El objetivo de este experimento fue demostrar la eficacia de una vacuna antigripal con adyuvante en comparación con la vacuna sencilla (no adyuvada).
Los criterios de valoración fueron:
1) criterio de valoración principal: reducción de la diseminación vírica en lavados nasales después de la prueba de provocación homóloga:
2) criterios de valoración secundarios: análisis de la respuesta humoral por valoraciones de HI.
III.2. Diseño experimental
III.2.1. Tratamiento/grupo (Tabla 1)
Se obtuvieron hurones hembra (Mustela putorius furo) con edad de 14-20 semanas de MISAY Consultancy (Hampshire, UK). Se estimularon los hurones en el día 0 con la cepa heterosubtípica H1N1 A/Estocolmo/24/90 (4 Log TCID50/ml). En el día 21, se inyectó a los hurones por vía intramuscular una dosis humana completa (dosis de vacuna de 500 !g, 15 !g de HA/cepa) de una combinación de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 y B/Shangdong/7/97. Los hurones después se sometieron a prueba de provocación en el día 42 por vía intranasal con una cepa heterosubtípica H3N2 A/Wyoming/3/2003 (4,5 Log TCID50/ml).
Tabla 1
Grupo
Antígeno(s) + dosificación Formulación + dosificación Comentarios (programa/día/pr ueba de provocación) In/Re Otros tratamientos
1
Sencilla trivalente HD completo: 15 !g de HA/cepa IM; Día 21 In Estimulación con H1N1 (A/Estocolmo/24/90) Día 0
2
trivalente/ MPL-QS21 en liposomas HD completo: 15 !g de HA/cepa IM; Día 21 In Estimulación con H1N1 (A/Estocolmo/24/90) Día 0
6 hurones/grupo. In/Re = Individuo/agrupación
III.2.2. Preparación de las formulaciones de vacuna (Tabla 2)
Formulación 1: Formulación sencilla trivalente dividida (no adyuvada):
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que tienen en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua
15 para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 17,5 !g de la cepa B con agitación durante 10 minutos entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos a temperatura ambiente y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación 2: Gripe trivalente dividida adyuvada con MPL/QS21 en liposomas:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene
20 Tween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que tienen en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 17,5 !g de la cepa B con agitación durante 10 minutos entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Se añade una premezcla del llamado “DQS21-MPLin a la formulación que se agita después durante un mínimo de 15 minutos. La premezcla de DQS21-MPLin es una mezcla de liposomas (formada por DOPC 40mg/ml, colesterol 10mg/ml, MPL
25 2mg/ml) y el inmunoestimulante QS21. Esta premezcla se incuba durante un mínimo de 15 minutos antes de la adición a la mezcla trivalente dividida. La concentración de MPL y QS21 en la formulación final es 50 µg por 500 µl. La formulación se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Observación: En cada formulación, se añade PBS concentrado 10 veces hasta alcanzar isotonicidad y se concentra 1 vez en el volumen final. El volumen de H2O se calcula para alcanzar el volumen objetivo.
Tabla 2: Composición final de las formulaciones 1 y 2 (Formulaciones preparadas con cepas divididas (para 500 µl))
Formulación
Antígeno Tween 80 Triton X-100 VES DOPC Colesterol MPL QS21
1
H1N1:15 µg H3N2: 15 µg B: 17,5 µg 375 µg 55 µg 50 µg 50 µg - - -
2
H1N1:15 µg H3N2: 15 µg B: 17,5 µg 375 µg 55 µg 50 µg 1 mg 250 µg 50 µg 50 µg
III.2.3. Lecturas (Tabla 3)
Tabla 3
Lectura
Momento de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de análisis
Diseminación vírica
D+1 a D+7 Después de la prueba de provocación Lavados nasales Valoración
Anticuerpos anti-HI (valoraciones de de HI)
Antes, después de la estimulación, después de la prueba de provocación Sueros Ensayo de inhibición de hemoaglutinación
III.3. Resultados
En las Figuras 1 y 2 se proporciona una representación esquemática.
III.3.1. Inmunidad humoral (Figura 1).
Se detectó la actividad de inhibición de hemoaglutinación frente a las cepas de vacuna contra H3N2 (cepa de
10 vacuna A/Panamá/2007/99 y cepa de estimulación A/Wyoming/3/2003) en sueros de 6 animales por grupo en el Día 17 después de la estimulación heteróloga intranasal y en el Día 21 después de la inmunización y Día 13 Después de la prueba de provocación.
Se determinaron las valoraciones de anticuerpos anti-hemaglutinina para las tres cepas víricas de gripe usando el ensayo de inhibición de la hemoaglutinación (HI) como se detalla en el Ejemplo de Referencia I.2.1. Las
15 conclusiones son las siguientes:
•
Para las dos cepas de A/H3N2 y para todos los grupos, se observó un refuerzo de las valoraciones de HI en todos los grupos vacunados después de la inmunización.
•
Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, se observaron valoraciones de HI anti
A/Panamá/2007/99 estadísticamente significativas mayores cuando la vacuna trivalente dividida se 20 potenciaba con MPL/QS21 en liposomas en comparación con la vacuna trivalente dividida sencilla.
• Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, solamente la trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas fue capaz de aumentar de forma significativa las valoraciones de HI a la cepa heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reactividad cruzada antes de la prueba de provocación con esta cepa de extracción).
25 • Después de la prueba de provocación con A/Wyoming3/2003, se observó un aumento significativo de las valoraciones de HI anti-A/Wyoming/3/2003 para trivalente dividida sencilla y trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas.
• Para cepas A/Nueva Caledonia/20/99 y B/Shangdong/7/97, se observaron valoraciones de HI
estadísitcamente significativaos mayores cuando la trivalente dividida se potenciaba con MPL/QS21 en 30 liposomas en comparación con la vacuna trivalente dividida sencilla.
III.3.2. Diseminación vírica (Figura 3).
Se realizó la valoración vírica de lavados nasales en 6 animales por grupo como se detalla en el Ejemplo de Referencia I.2.3. Los lavados nasales se realizaron mediante administración de 5 ml de PBS en ambas fosas nasales en animales despiertos. La inoculación se recogió en una placa de Petri y se colocó en recipientes de muestra a -80°C.
•
Dos días después de la prueba de provocación, se observó diseminación vírica estadísticamente significativa menor con Trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas en comparación con Trivalente dividida sencilla.
•
El día 49 (7 días después de la prueba de provocación), no se detectaron virus en los lavados nasales.
III.3.3. Conclusión del experimento
Se observaron respuestas humorales mayores (valoraciones de HI) con Trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas en comparación con la Trivalente dividida sencilla para las 4 cepas.
Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, solamente la trivalente divida potenciada con MPL/QS21 en liposomas fue capaz de aumentar de forma significativa las valoraciones de HI a la cepa heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reactividad cruzada antes de la prueba de provocación con esta cepa).
MPL/QS21 en formulaciones de liposomas mostró beneficio adicional en términos de eficacia protectora en hurones (diseminación vírica menor después de prueba de provocación heteróloga). La reacción cruzada observada después de la inmunización con Trivalente dividida MPL/QS21 en liposomas contra la cepa de extracción usada para la prueba de provocación parecía estar correlacionada con el efecto de protección observado en estos hurones.
Ejemplo de Referencia IV - Evaluación preclínica de vacunas antigripales adyuvadas y no adyuvadas en ratones C57Bl/6 estimulados
IV.1. Diseño experimental y objetivo
Se usaron ratones C57BI/6 estimulados con cepas heterólogas se usaron para este experimento.
El propósito era comparar las respuestas inmunitarias humorales (valoraciones de HI) y CMI (ICS, tinción de citoquina intracelular) inducidas por una vacuna trivalente dividida de GlaxoSmithKline disponible en el mercado (FluarixTM) frente a una Vacuna de subunidad trivalente (vacuna AgrippalTM de Chiron) así como la respuesta CMI obtenida con estas vacunas potenciadas con liposomas que contenían 3D-MPL en solitario, DQS21 (QS21 en liposomas, es decir, QS21 destoxificado) en solitario o MPL/QS21 en liposomas. En el ejemplo siguiente, se prepararon formulaciones a partir de las monocargas divididas hasta alcanzar la misma composición que en la vacuna Fluarix y no a partir de las dosis de Fluarix disponible en el mercado. Las formulaciones obtenidas se denominaron “Similares a Fluarix”.
IV.1.1. Tratamiento/grupo
Se obtuvieron ratones C57Bl/6 de 6-8 semanas de edad de Harlan Horst, Países Bajos. Los ratones se estimularon en el día 0 con cepas heterosubtípicas (5 µg HA completa inactivada H1N1 A/Pekín/262/95, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shangdong/7/97). En el día 28 se inyecto por vía intramuscular 1,5 µg de HA Trivalente dividida (A/Nueva Caledonia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) sencilla o adyuvada (véase grupos en Tablas 4 a 6 a continuación) a los ratones.
Tabla 4
Gr
Antígeno / Formulación otro tratamiento
1
Trivalente dividida* / Sencilla (no adyuvada) = Similar a Fluarix Estimulación heteróloga D0
2
Trivalente dividida* / liposomas que contienen 3D-MPL Estimulación heteróloga D0
3
Trivalente dividida* / DQS21 Estimulación heteróloga D0
4
Trivalente dividida* / MPL/QS21 en liposomas Estimulación heteróloga D0
5
Aggripal TM (subunidad) Estimulación heteróloga D0
6
Aggripal TM (subunidad) / liposomas que contienen 3D-MPL Estimulación heteróloga D0
Tabla 4 (continuación)
Gr
Antígeno / Formulación otro tratamiento
7
Aggripal TM (subunidad) / DQS21 Estimulación heteróloga D0
8
Aggripal TM (subunidad) / MPL/QS21 en liposomas Estimulación heteróloga D0
9
PBS Estimulación heteróloga D0
* Similar a Fluarix. 16 ratones/grupo
IV.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna
Formulación para el grupo 1:
Se añaden PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que tienen en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa B con 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 2:
Se añaden PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que tienen en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa B con 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Se añaden liposomas que contienen 3D-MPL concentrado (preparado a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml) para alcanzar una concentración final de MPL de 50 µg por dosis. La formulación se agita después un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 3:
Se añaden PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que tienen en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa B con 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Después se añade una premezcla preparada a partir de liposomas (preparada a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml) y QS21 denominada “DQS21” hasta alcanzar una concentración de QS21 de 50 μg por dosis. Esta mezcla previa se incuba al menos durante 15 minutos antes de la adición a la mezcla trivalente dividida. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 4:
Se añaden PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que tienen en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa B con 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Después se añade una mezcla preparada a partir de liposomas que contienen 3D-MPL (preparada a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml) y QS21 hasta alcanzar concentraciones de QS21 y MPL 50 µg por dosis. Esta mezcla se incuba al menos durante 15 minutos antes de la adición a la mezcla trivalente dividida. La
denominada formulación “trivalente dividida MPL/QS21 en liposomas” se agita durante un mínimo de 15 minutos y
se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Observación: en los grupos 1 a 4, se añade PBS concentrado 10 veces hasta alcanzar isotonicidad y se concentra 1 vez en el volumen final. El volumen de H2O se calcula para alcanzar el volumen diana.
Formulación para el grupo 5:
Se mezcla una dosis de AggripalTM con un volumen igual de PBS mod pH 7,4. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 6:
Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añaden después en agitación liposomas que contienen 3D-MPL (formados por 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de colesterol, 2 mg/ml 3D-MPL) hasta alcanzar el equivalente de 50 !g de MPL por dosis. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
Observación: Se añade PBS para alcanzar la isotonicidad en el volumen final. Aggripal es la mitad del volumen de la formulación.
5 Formulación para el grupo 7:
Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añade después en agitación una premezcla de liposomas (formada por 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de colesterol) y QS21 denominado “DQS21” hasta alcanzar el equivalente de 50 !g de QS21. Esta premezcla se incuba durante al menos 15 minutos antes de la adición. La formulación se agita mínimo 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
10 Observación: Se añade PBS para alcanzar la isotonicidad en el volumen final. Aggripal es la mitad del volumen de la formulación.
Formulación para el grupo 8:
Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añade después en agitación a la formulación una premezcla llamada de “DQS21-MPLin”. La premezcla de DQS21-MPLin es una mezcla de liposomas (formados por 40 mg/ml
15 de DOPC, 10 mg/ml de colesterol, 2 mg/ml de MPL) y el inmunoestimulante QS21. Esta premezcla se incuba durante al menos 15 minutos antes de la adición de la mezcla de Aggripal/PBS. La cantidad de MPL y QS21 en la formulación es 50 !g cada uno. La formulación se agita mínimo 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
Observación: Se añade PBS para alcanzar la isotonicidad en el volumen final. Aggripal es la mitad del volumen de la 20 formulación.
Tabla 5: Composición final de las formulaciones 1 a 4 preparadas con cepas divididas (para 1 ml)
Grupo
Antígeno Tween 80 Triton X-100 VES DOPC Colesterol MPL QS21
1
H1N1: 15 !g H3N2: 15 !g B: 17.5 !g 750 !g 110 !g 100 !g _ _ _ _
2
Idéntico a 1 Idéntico a 1 11 !g 100 !g 1 mg 250 !g 50 !g -
3
Idéntico a 1 Idéntico a 1 110 !g 100 !g 1 mg 250 !g - 50 !g
4
Idéntico a 1 Idéntico a 1 110 !g 100 !g 1 mg 250 !g 50 !g 50 !g
Tabla 6: Composición final de las formulaciones 5 a 8 preparadas con vacuna Aggripal™ (1 ml)
Grupo
Antígeno DOPC Colesterol MPL QS21
5
1 dosis de vacuna Aggripal _ _ _ _
6
Idéntico a 5 1 mg 250 !g 50 !g -
7
Idéntico a 5 1 mg 250 !g - 50 !g
8
Idéntico a 5 1 mg 250 !g 50 !g 50 !g
IV.1.3. Lecturas (Tabla 7)
Tabla 7
Lectura
Momento de tiempo Tipo de muestra In/Po Procedimiento de análisis
Anticuerpos anti-HI (valoraciones de HI)
Día 21 Postinmunización (Día 49) Suero In Ensayo de inhibición de la hemaglutinación
CD4,CD8, IL-2, IFN-y (FACS)
Día 7 Postinmunización (Día 35) PBL Po Tinción de citoquinas intracelulares (ICS)
In= Individual / Po= combinación
IV. 2. Resultados
5 IV.2.1.Respuesta humoral (valoraciones de HI 21 días post-inmunización)
Respuestas humorales por medio de valoraciones de HI - Figura 4
Se detectó la actividad de inhibición de la hemaglutinación contra las tres cepas de la vacuna (A/Nueva Caledonia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) en el suero de 8 animales por grupo en el día 21 postinmunización.
10 • En comparación con ratones inmunizados con PBS, se observó un aumento en las valoraciones de HI después de inmunización con todos los candidatos de vacuna antigripal analizados para las tres cepas (vacuna dividida trivalente o de trivalente de subunidades).
• Para las tres cepas, se observaron valoraciones de HI estadísticamente significativas más elevadas en ratones inmunizados con la trivalente divididad potenciada con DQS21 sola o MPL/QS21 en liposomas
15 comparados con ratones inmunizados con la trivalente dividida sencilla de gripe o potenciada con liposomas que contenían 3D-MPL solo. La clasificación de la respuesta humoral fue como sigue: (MPL/QS21 en liposomas = DQS21 solo) gt; (liposomas que contenían 3D-MPL solo = sencilla) gt; PBS.
• Para las tres cepas, se observaron valoraciones HI estadísticamente significativas más elevadas en ratones inmunizados con subunidades de trivalente potenciada con DQS21 solo, liposomas que
20 contenían·3D-MPL solo o MPL/QS21 en liposomas en comparación con ratones inmunizados con la trivalente dividida sencilla. La clasificación de la respuesta humoral fue como sigue: (MPL/QS21 en liposomas = DQS21 solo = Liposomas que contenían 3D-MPL solo) gt; Sencilla gt; PBS.
• La trivalente dividida y trivalente de subunidades inducían valoraciones de HI similares cuando las formulaciones no estaban potenciadas o se potenciaron con DQS21 solo o MPL/QS21 en liposomas.
25 IV.2.2.Respuesta inmunitaria mediada por células (ICS el 7º día después de la inmunización).
Respuestas de células T CD4 - Figura 5
Se recogieron las PBMC de 8 ratones por grupo el 7º día después de la inmunización y se analizaron en 4 conjuntos de 2 ratones/grupo.
En términos de células T CD4+ totales específicas del virus completo de la gripe (que expresan IL-2, IFN-y y ambas 30 citoquinas):
•
Cualquiera que sea la formulación, se observaron respuestas de células T CD4+ idénticas entre las vacunas trivalente dividida y de trivalente de subunidades.
•
Se observaron respuestas de células T CD4+ más elevadas para las formulaciones trivalentes (dividida
o de subunidades) potenciadas con MPL/QS21 en liposomas en comparación con formulaciones
35 trivalentes (dividida o de subunidades) sencillas o potenciadas con liposomas que contenían 3D-MPL solo o DQS21 solo.
• Para la respuesta celular inducida por una formulación trivalente (dividida o de subunidades), existe un efecto sinérgico de liposomas que contienen 3D-MPL + DQS21 en comparación con DQS21 solo o liposomas que contienen 3D-MPL solo.
• La clasificación para la respuesta celular fue como sigue: MPL/QS21 en liposomas gt; (liposomas que 5 contienen 3D-MPL solo = DQS21 solo = sencilla = PBS).
IV.3. Resumen de resultados y conclusiones
• Para las tres cepas, se observaron valoraciones de HI estadísticamente significativas más elevadas en ratones inmunizados con formulaciones trivalentes (dividida o de subunidades) potenciadas con DQS21 solo o MPL/QS21 en liposomas en comparación con ratones inmunizados con formulaciones
10 trivalentes (dividida o de subunidades) sencillas. Los liposomas que contenían 3D-MPL solo parecían inducir respuesta humoral más elevada cuando se formuló con trivalente de subunidades que con la trivalente dividida.
• Cualquiera que sea la formulación, se obtuvieron respuestas de células T CD4+ similares para la trivalente dividida (Fluarix) y trivalente de subunidades (Aggripal).
15 • Las formulaciones trivalentes (dividida o de subunidades) potenciadas con MPL/QS21 en liposomas inducían respuestas de células T CD4+ más elevadas en comparación con formulaciones trivalentes (dividida o de subunidades) sencillas o potenciadas con liposomas que contenían 3D-MPL solo o QS21 en liposomas (DQS21) solo.
Ejemplo de Referencia V - Comparación preclínica de una vacuna que contiene una preparación de antígeno
20 de la gripe dividida potenciada con 3D-MPL/QS21 en una formulación liposómica (3D-MPL a dos concentraciones diferentes).
V.1 - Ratones.
V.1.1 - Diseño experimental y objetivo.
Se usaron para este experimento ratones C57B1/6 sensibilizados con cepas heterólogas. El propósito era analizar
25 las respuestas inmunitarias humorales (valoraciones de HI) y CMI (ICS, tinción de citoquinas intracelulares) inducidas por una vacuna trivalente dividida disponible en el mercado en GlaxoSmithKline (FluarixTM) en forma no potenciada, y cuando se potenció con liposomas que contenían dos concentraciones diferentes de 3D-MPL y QS21.
V.1.2 Tratamiento/Grupo
Se obtuvieron ratones hembra C57B1/6 de 8 semanas de edad de Harlan Horst, Países Bajos. Los ratones se
30 sensibilizaron de forma intranasal en el día 0 con cepas heterosubtípicas (A/Beijing/262/95 inactivada completa, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shandong/7/97). En el día 28, se les inyectó a los ratones de forma intramuscular la trivalente dividida (A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu) sencilla o potenciada con dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes en formulaciones liposómicas (véase los grupos en la tabla 8 a continuación).
Tabla 8 Tabla 8 (continuación)
Grupo
Antígeno(s) + dosificación Formulación + dosificación Otros tratamientos
1
Trivalente dividida de gripe -1,5 !g/cepa/50 !l Sencilla Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
2
Trivalente dividida de gripe -1,5 !g/cepa/50 !l Liposomas que contienen 50 !g de 3D-MPL por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
3
Trivalente dividida de gripe -1,5 !g/cepa/50 !l 50 !g de DQS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
Grupo
Antígeno(s) + dosificación Formulación + dosificación Otros tratamientos
4
Trivalente dividida de gripe -1,5 !g/cepa/50 !l 25 !g de MPL y QS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
5
Trivalente dividida de gripe -1,5 !g/cepa/50 !l 50 !g de MPL y QS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
6
PBS Ninguno Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
Las formulaciones se prepararon como en el ejemplo IV.
V.1.3 - Resultados
Respuestas humorales por medio de valoraciones de HI - Figura 24.
5 Se detectó la actividad de inhibición de la hemaglutinación frente a las tres cepas de vacuna en el suero de 9 animales/grupo en el día 21 después de la inmunización.
•
En comparación con ratones inmunizados con PBS, se observó un aumento en las valoraciones de HI después de inmunización con todos los candidatos de vacuna antigripal analizados para las tres cepas.
•
Para las tres cepas, se observaron valoraciones de HI estadísticamente significativas más elevadas en
10 ratones inmunizados con la trivalente dividida potenciada con MPL y QS21 a cualquier concentración en comparación con ratones inmunizados con la trivalente dividida sencilla de gripe (valor p máx. = 0,03).
• No se observó diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos de adyuvantes liposómicos.
15 Respuesta inmunitaria mediada por células (ICS en el día 7 después de la inmunización) - Figure 25.
Se recogieron las PBMC de 9 ratones/grupo 7 días después de la inmunización y se analizaron en tres conjuntos de 3 ratones/grupo. En términos de células T CD4+ específicas del virus de la gripe completo que expresan IL-2, IFN-y
o ambas citoquinas:
Como se puede ver en la figura 25 las respuestas específicas de células T CD4+ IFN-y más elevadas se
20 obtuvieron después de la inmunización con la trivalente dividida potenciada con la concentración más alta de inmunoestimulantes. Sin embargo, las respuestas de células T IL2 e IL2+ IFN-y fueron similares entre las dos concentraciones de inmunoestimulantes.
Ejemplo de Referencia VI - Ensayo clínico en una población anciana por encima de 65 años con una vacuna que contiene una preparación de antígeno de gripe dividida potenciada con MPL/QS21 en una formulación 25 liposómica (3D-MPL a dos concentraciones diferentes).
VI.1. Diseño del estudio y objetivos
Un estudio de fase I/II abierto, aleatorizado, para demostrar la no inferioridad en términos de respuesta inmunitaria mediada por células de las vacunas candidatas de la gripe de GlaxoSmithKline Biologicals que contienen diversos adyuvantes administradas a una población anciana (65 años de edad y mayor) en comparación con Fluarix™
30 (conocida como a-Rix™ en Bélgica) administrada en adultos (18-40 años).
Se asignaron cuatro grupos paralelos:
•
75 adultos (18-40 años de edad) en un grupo de control que recibieron una dosis de Fluarix™ (grupo de Fluarix)
•
200 sujetos ancianos (65 años de edad y mayores) aleatorizados 3:3:2 en tres grupos:
-
Un grupo con 75 sujetos que recibió la vacuna antigripal potenciada con AS01B
-
Un grupo con 75 sujetos que recibió la vacuna antigripal potenciada con AS01E
-
Grupo de gripe de referencia con 50 sujetos que recibió una dosis de Fluarix™
Objetivo principal
El objetivo principal es demostrar la no inferioridad 21 días después de la vacunación de las vacunas potenciadas de la gripe administradas a sujetos ancianos (65 años de edad y mayores) en comparación con Fluarix™ administrado en adultos (18-40 años de edad) en términos de frecuencia de linfocitos T CDR específicos de la gripe que producen al menos dos citoquinas diferentes (CD40L, IL-2, TNF-a, IFN-y).
Objetivos secundarios
Los objetivos secundarios son:
1) Evaluar la seguridad y reactogenicidad de la vacunación con las vacunas antigripales candidatas potenciadas durante 21 días posteriores a la administración intramuscular de la vacuna en sujetos ancianos (65 años de edad y mayores). Se usa Fluarix™ como referencia.
2) Evaluar la respuesta inmunitaria humoral (valoración anti-hemaglutinina) 21, 90 y 180 días después de la vacunación con vacunas candidatas de la gripe potenciadas. Se usa Fluarix™ como referencia.
Objetivo terciario
El objetivo terciario es evaluar la respuesta inmunitaria mediada por células (producción de IFN-y, IL-2, CD40L, y TNF-a y respuesta de células B de memoria) 21, 90 y 180 días después de la vacunación con las vacunas antigripales potenciadas. Se usa Fluarix™ como referencia.
VI.2. Composición de vacuna y administración
Se han usado dos adyuvantes diferentes:
1.
AS01B, un adyuvante basado en liposomas que contiene 50 !g MPL y QS21
2.
AS01E, una formulación de AS01B diluida dos veces.
Control: dosis completa de Fluarix™ por medio de administración IM.
Todas las vacunas están destinadas a administración intramuscular. Las cepas usadas en las cinco vacunas son las que había recomendado la OMS para la temporada 2005-2006 en el hemisferio norte, es decir, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Nueva York/7/2004 (H3N2) y B/Jiangsu/10/2003.
Los tres antígenos de viriones divididos inactivados (volúmenes monovalentes) usados en la formulación de la vacuna antigripal candidata potenciada, son exactamente los mismos que los ingredientes activos usados en la formulación comercial de la vacuna antigripal inactivada de viriones divididos Fluarix™/a-Rix™ -GSK Bio’s comercial. Proceden de virus sometidos a proliferación en huevos. Las cepas de la gripe son las recomendadas para la temporada 2005/2006, tal y como se usan en la formulación de la Fluarix™/a-Rix™ 2005/2006 comercial.
Las cepas usadas en las tres vacunas son las recomendadas por la OMS para la temporada 2005/2006 en el hemisferio norte, es decir
•
A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116
•
A/Nueva York/55/2004 (H3N2) NYMC X-157
•
B/Jiangsu/10/2003
Como Fluarix™/a-Rix™, la vacuna potenciada contiene 15 !g de hemaglutinina (HA) de cada cepa del virus de la gripe por dosis.
VI.2.1.Descripción de los lotes de vacunas potenciadas con AS01B
La vacuna antigripal candidata potenciada con AS01B es una vacuna de 2 componentes formada por antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados presentados en un vial de vidrio que contiene el adyuvante AS01B. En el momento de la inyección, se extrae el contenido del adyuvante del vial y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar, se extrae el contenido con la jeringa y la aguja se sustituye por una aguja intramuscular. La aguja usada se sustituye por una
aguja intramuscular y el volumen se corrige hasta 1 ml. Una dosis de la vacuna antigripal candidata potenciada con AS01B reconstituida corresponde a 1 ml. La vacuna antigripal candidata potenciada con AS01B es una vacuna sin conservantes.
VI.2.2.Composición del lote clínico potenciado con AS01B Una dosis de la vacuna antigripal potenciada con AS01B corresponde a 1 ml. Su composición se da en la Tabla 8. Contiene 15 !g de HA de cada cepa del virus de la gripe como en la vacuna FluarixTM/a-Rix® registrada.
Tabla 8 - Composición (componentes de gripe y adyuvantes) de la vacuna antigripal candidata potenciada con AS01B reconstituida
Componente
Cantidad por dosis Referencia analítica
INGREDIENTES ACTIVOS
Viriones divididos inactivados -A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 -A/Nueva York/55/2004 (H3N2) NYMC X-157 -B/Jiangsu/10/2003
15 !g HA 15 !g HA 15 !g HA Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158
ADYUVANTE AS01B
-Liposomas • dioleil fosfatidilcolina (DOPC) • Colesterol • MPL
1000 !g 250 !g 50 !g GSK Bio 3217 Ph. Eur. 0993 GSK Bio 2972
-QS21
50 µg GSK Bio 3034
10 VI.2.3.Procedimiento de producción del lote de vacuna potenciada con AS01B
La fabricación de la vacuna antigripal potenciada con AS01B consiste en tres etapas principales:
•
Formulación del volumen final trivalente (concentrada 2x) sin adyuvante y carga en el recipiente del antígeno
•
Preparación del adyuvante AS01B
15 • Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01B.
Formulación del volumen final trivalente sin adyuvante y carga en el recipiente del antígeno
Los volúmenes de los tres volúmenes monovalentes se basan en la medida del contenido en HA de cada volumen monovalente antes de la formulación y en un volumen objetivo de 1320 ml. Se diluyen en agua para inyección solución salina tamponada con fosfato concentrado PO4 Na/K2 (80 !l/dosis) y una premezcla de Tween 80, Triton X20 100 e hidrogenosuccinato de a-tocoferilo. Los tres monovolúmenes concentrados (A/Nueva Caledonia/20/99 IVR116, A/Nueva York/55/2004 NYMC X-157, B/Jiangsu/10/2003) se diluyen después sucesivamente en la solución resultante de solución salina tamponada con fosfato / Tween 80 -Triton X-100 -hidrogenosuccinato de a-tocoferilo (pH 7,8, NaCl 81 mM, KCl 1,56 mM, Na2HPO4 4,79 mM, KH2PO4 0,87 mM, NaH2PO4 7,2 mM, K2HPO4 72,8 mM, 750 µg/ml de Tween 80, 110 µg/ml de Triton X-100 y 100 µg/ml de hidrogenosuccinato de a-tocoferilo) para tener
25 una concentración final de 30 !g de HA de cepas A (H1N1 y H3N2) por ml de volumen final trivalente (15 !g de HA/cepa A/500 !l de volumen final trivalente) y 35 !g de HA de cepa B (17,5 !g de HA/cepa B/500 !l de volumen final trivalente). Entre la adición de cada volumen monovalente, la mezcla se agita durante 10-30 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición del último volumen monovalente y 15-30 minutos de agitación, se comprueba el pH y se ajusta a 7,65 � 0,25 con HCl o NaOH.
30 El volumen final trivalente de antígenos se introduce de forma aséptica en viales de vidrio tipo I (Ph. Eur.) estériles de 3 ml. Cada vial contiene un volumen de 600 !l (500 !l + 100 !l de sobrecarga).
Preparación del volumen de adyuvante AS01B e introducción en el recipiente del adyuvante
El adyuvante AS01B se prepara mezclando los dos componentes: QS21 y liposomas que contienen MPL. La preparación de cada uno de estos componentes se resume a continuación. QS21 es un glicósido de triterpeno, obtenido de la corteza del árbol Quillaja saponaria, y lo produce Aquila Worchester, MA, USA (ahora Antigenics).
QS21 se proporciona a GSK Bio como un polvo liofilizado. La preparación de QS21 en GSK Bio consiste en la suspensión del polvo de QS21 en agua para inyección a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml, ajuste del pH a pH 6,0 ± 0,2 y filtración estéril. El volumen líquido de QS21 se almacena a -20ºC en recipientes de polietileno.
MPL es el 4’-monofosforil lípido A 3-O-desacilado obtenido por hidrólisis ácida y básica secuencial del lipopolisacárido de la cepa Re595 de Salmonella minnesota. Se produce en GSK Biologicals, Hamilton, Montana. El volumen de MPL se suministra en forma de sal de trietilamina liofilizada (TEA).
En el procedimiento de producción de liposomas que contienen MPL, se disuelven DOPC (dioleil fosfatidilcolina), colesterol y MPL en etanol. Se forma una película lipídica por medio de evaporación del disolvente al vacío. Se añade solución salina tamponada con fosfato formada por Na2HPO4 9 mM, KH2PO4 41 mM, NaCl 100 mM a pH 6,1 y la mezcla se somete a prehomogeneización seguida de homogeneización a presión elevada a 102 MPa (15.000 psi) (+/- 20 ciclos). Esto conduce a la producción de liposomas, que se filtran de forma estéril a través de una membrana de 0,22 !m en un área aséptica (clase 100). El producto estéril se distribuye después en recipientes de vidrio estériles y se almacena en la habitación refrigerada (de +2 a +8ºC).
La preparación de volumen estéril de liposomas se mezcla con la solución de volumen de QS21 estéril. Después de 30 minutos de agitación, la mezcla se añade a una mezcla de agua para inyección y fosfato 500 mM, NaCl 1 M pH 6,1 cuando se diluye 10 veces. Se calcula la cantidad de fosfato 500 mM, NaCl 1 M pH 6,1 cuando se diluye 10 veces, para alcanzar la isotonicidad en el volumen final. Se comprueba el pH. El adyuvante se filtra después de forma estéril (0,22 !m) y se distribuye de forma aséptica en viales. Los viales se almacenan de +2 a +8ºC.
El diluyente AS01B es un líquido incoloro opalescente, libre de partículas extrañas, presente en un vial estéril de vidrio tipo I. El llenado objetivo para cada vial es 0,7 ml para cumplir la especificación (� 0,5ml).
Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01B
En el momento de la inyección, se extrae el contenido del vial que contiene el adyuvante y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar, el contenido se extrae con una jeringa y se sustituye la aguja por una aguja intramuscular, y el volumen se corrige a 1 ml. Una dosis de vacuna antigripal candidata potenciada con AS01B reconstituida corresponde a 1 ml.
VI.2.4.Descripción de los lotes de vacunas potenciadas con AS01E
La vacuna antigripal candidata potenciada con AS01E es una vacuna de tres componentes formada por antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados presentada en un vial de vidrio, un vial de vidrio que contiene el adyuvante AS01B y un vial de vidrio que contiene el diluyente (solución de cloruro sódico para inyección) para la dilución dos veces de AS01B.
Para preparar el adyuvante AS01E el contenido del vial del diluyente se extrae con una jeringa y se inyecta en el vial que contiene el adyuvante AS01B, seguido de mezcla. En el momento de la inyección, se extraen 600 !l de adyuvante AS01E con una jeringa del vial de AS01 E y se inyectan en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar, se retira el contenido con la jeringa y la aguja se reemplaza por una aguja intramuscular. Una dosis de vacuna antigripal candidata potenciada con AS01B corresponde a 1 ml.
La vacuna antigripal candidata potenciada con AS01E es una vacuna sin conservantes.
VI.2.5.Composición del lote clínico potenciado con AS01E
Una dosis de la vacuna antigripal potenciada con AS01E reconstituida corresponde a 1 ml. Su composición se presenta en la Tabla 9. Contiene 15 !g de cada cepa del virus de la gripe como en la vacuna FluarixTM/a-Rix® registrada.
Tabla 9 Composición (componentes de gripe y adyuvantes) de la vacuna antigripal candidata potenciada con AS01E
Componente
Cantidad por dosis Referencia analítica
INGREDIENTES ACTIVOS
Viriones divididos inactivados -A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 -A/Nueva York/55/2004 (H3N2) NYMC X-157 -B/Jiangsu/10/2003
15 !g HA 15 !g HA 15 !g HA Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158
ADYUVANTE AS01B
-Liposomas • dioleil fosfatidilcolina (DOPC) • Colesterol • MPL
500 !g 125 !g 25 !g GSK Bio 3217 Ph. Eur. 0993 GSK Bio 2972
-QS21
25 µg GSK Bio 3034
VI.2.6.Procedimiento de producción del lote de vacuna potenciada con AS01E 5 La fabricación de la vacuna antigripal potenciada con AS01B consiste en tres etapas principales:
•
Formulación del volumen final trivalente (concentrada 2x) sin adyuvante en introducción en el recipiente del antígeno
•
Preparación del adyuvante AS01B
• Preparación del adyuvante AS01 E seguido de reconstitución extemporánea de la vacuna del virus 10 dividida potenciada con AS01E.
Formulación del volumen final trivalente sin adyuvante e introducción en el recipiente del antígeno
Se hace referencia a la sección V.2.3 para la vacuna antigripal potenciada con AS01 B.
Preparación del volumen de adyuvante AS01B en introducción en el recipiente del adyuvante
Se hace referencia a la sección V.2.3 para la vacuna antigripal potenciada con AS01 B.
15 Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01E
Para preparar el adyuvante AS01 E se extrae el contenido del vial del diluyente con una jeringa y se inyecta en el vial que contiene el adyuvante AS01 B, seguido de mezcla. En el momento de la inyección, se extraen 600 !l de adyuvante AS01E con una jeringa del vial de AS01E y se inyectan en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar, se extrae el contenido con la jeringa y la aguja
20 se sustituye por una aguja intramuscular. Una dosis de vacuna antigripal candidata potenciada con AS01 E corresponde a 1 ml.
Cuatro visitas programadas por sujeto: en los días 0, 21, 90 y 180, recogiéndose muestras de sangre en cada visita para evaluar la inmunogenicidad.
Programa de vacunación: una inyección de vacuna antigripal en el día 0.
25 VI.2.7 Ensayos inmunológicos
Hemaglutinación- Ensayo de inhibición Se determina la respuesta inmunitaria midiendo los anticuerpos de inhibición de hematoaglutinación (IH) usando el procedimiento descrito por el Centro colaborador de la OMS para la gripe, Centros de Control de Enfermedades, Atlanta, EE.UU. (1991). Las mediciones de valoración de anticuerpos se realizaron en muestras de suero congeladas y descongeladas con un microprocedimiento normalizado y validado exhaustivamente usando 4 unidades inhibidoras de la hemaglutinación (4 UIH) de los antígenos adecuados y una suspensión al 0,5% de eritrocitos de ave de corral. Los inhibidores séricos no específicos se retiraron mediante tratamiento con calor y enzima destructora del receptor. Los sueros obtenidos se evaluaron para determinar los niveles de anticuerpos de IH. Comenzando con una dilución inicial de 1:10, se preparó una serie de diluciones (por un factor de 2) hasta una dilución final de 1:20480. Como criterio de valoración se tomó la etapa de dilución más elevada que mostró una inhibición completa (100%) de la hemaglutinación. Todos los análisis se realizaron por duplicado.
Citometría de flujo de citoquinas (CFC) usada para evaluar las frecuencia de los linfocitos cd4 o CD8 positivos frente a citoquina(s).
Las células T DC4 y CD8 de sangre periférica específicas del antígeno se pueden reestimular in vitro para producir CD40L, IL-2, TNF-a e IFN-y si se incuban con su correspondiente antígeno. En consecuencia, las células T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar por medio de citometría de flujo tras marcaje con inmunofluorescencia convencional del fenotipo celular, así como la producción de citoquinas intracelulares. En el presente estudio, se usaron antígenos de la vacuna antigripal como antígenos para re-estimular las células T específicas de gripe. Los resultados se expresaron en forma de una frecuencia de células T CD4 o CD8 positivas para citoquina(s) dentro de la subpoblación de células T CD4 o CD8.
ELISPOT usado para evaluar la frecuencia de las células B de memoria
La tecnología Elispot de célulasB permite la cuantificación de las células B de memoria específicas para un antígeno dado. Las células B de memoria se pueden inducir para diferenciarse en células plasmáticas, in vitro tras el cultivo de CpG durante 5 días. Las células plasmáticas específicas de antígeno generadas in vitro se pueden por tanto enumerar usando el ensayo de elispot de células B. Brevemente, las células plasmáticas generadas in vitro se incuban en placas de cultivo recvestidas con antígeno. Las células plasmáticas específicas del antígeno formarán manchas anticuerpo/antígeno, que se pueden detectar mediante un procedimiento inmunoenzimático convencional. En el presente estudio, se usan las cepas de la vacuna antigripal, o inmunoglobulina anti-humana, para revestir las placas de cultivo con el fin de enumerar las células plasmáticas secretoras de IgG o anti-gripe, respectivamente. Los resultados se expresan con frecuencia de plasma específico de antígeno en un millón de células plasmáticas productoras de IgG.
Caracterización Exploratoria de los PBMC
Se puede realizar la expresión de marcadores seleccionados de superficie/activación (es decir, CD4, CD8, CD45RO, CD45 RA, CD28, CD27 o algún KIR). La función de los linfocitos T inducidos por la vacuna se puede abordar mediante el análisis de marcadores dirigidos (es decir, CCR7, CXCR5) de citoquinas (citoquinas de T colaborador 1
o de T colaborador 2) o mediante análisis de la expresión de factores asociados con funciones reguladoras como Foxp3, CTLA-2 o TGF-1. En particular, se puede analizar la población CD8+CD28-u otras poblaciones de células T reguladoras en relación con las respuestas humoral, de células B y T, al antígeno de la vacuna.
VI.3. Resultados de inmunogenicidad
VI.3.1. Criterios de valoración y resultados de CMI
Con el fin de caracterizar la respuesta de CMI después de la vacunación con las vacunas antigripales adyuvadas, se reestimularon los linfocitos T CD4 y CD8 in vitro usando antígenos procedentes de las tres cepas de vacuna (usadas individualmente o combinadas). Se enumeraron los linfocitos T CD4/CD8 específicos de la gripe por medio de citometría de flujo de acuerdo con el marcaje por inmunofluorescencia convencional de producción de citoquinas intracelulares (IL-2, IFN-y, TNF-a y CD40L).
Evaluación del criterio de valoración principal.
En el día 21: respuesta de CMI en todos los sujetos con respecto a la frecuencia del linfocito T CD4 específico de la gripe por 106 en ensayos que producen al menos dos citoquinas diferentes (IL-2, IFN-y, TNF-a y CD40L).
Para la evaluación de respuesta de CMI, se analiza la frecuencia del CD4 específico de la gripe como sigue:
Usando el enfoque de no inferioridad, se alcanzó la no inferioridad de al menos una vacuna antigripal candidata adyuvada administrada a ancianos 65 años de edad- el grupo denominado ancianos Flu o ELD Flu) en comparación con los que recibieron FluarixTM (administrada a adultos de 18-40 años de edad, grupo denominado Jóvenes Flu o Flu YNG) cuando el límite superior del intervalo de confianza bilateral 98,75% en el índice de la media geométrica (GM) entre el grupo de FluarixTM (18-40 años) y el grupo con la vacuna antigripal candidata adyuvada (grupo 65 años) en términos de frecuencia de células T CD4 específicas de la gripe productoras de al menos dos citoquinas el día 21) fue inferior a 2,0.
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Se computaron las proporciones GM de Cl de 98,75 %, 21 días despúes de la vacunación, usando un modelo de análisis de covarianza (ACNCPVA) sobre la transformación de las frecuencias en logaritmo de base 10. El modelo ANCOVA incluye el grupo de� vacuna en forma de efecto fijo (FluarixTM (18-40 años) frente a la vacuna antigripal candidata adyuvada ( 65 años) y la frecuencia de pre-vacunación como regresor. La proporción de GM y su CI de
5 98,75% se derivan como transformación exponencial de contraste del grupo correspondiente en el modelo. El CI de 98,75% para la GM ajustada se obtiene por medio de transformación exponencial de CI de 98,75% para la media del ajuste por mínimos cuadrados del grupo del modelo ANCOVA anterior.
Resultados – Análisis Inferencial (Tabla 10)
En la Tabla 10 se presentan las proporciones de GM y GM ajustada (con su CI de 98,75%) de linfocito T CD4
10 específico de la gripe que produce al menos dos citoquinas (IL-2, IFN-y, TNF-a y CD40L) en el día 21, después de reestimulación in vitro con “antígenos combinados II”. Para cada vacuna antigripal adyuvada, el límite superior de CI de 98,75% de dos lados de la proporción de GM es bastante inferior al límite clínico de 2,0. Esto muestra la no inferioridad de ambas vacunas antigripales adyuvadas administradas a sujetos mayores en comparación con la vacuna Fluarix™ administrada en adultos de edades entre 18 y 40 años en términos de frecuencia pos-vacunación
15 de CD4 específico de la gripe.
Tabla 10 Proporción de GM ajustada de células T CD4 específicas de gripe que produce al menos dos citoquinas tras reestimulación con antígenas de vacuna combinada, Día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad)
Proporción GM (Flu YNG / AS01B )
Flu YNG
AS01B 98,8% CI
N
GM N GM Valor LL UL
74
2844,8 71 2725,6 1,04 0,79 1,38
Proporción GM (Flu YNG / AS01E )
Flu YNG
AS01E 98.8% CI
N
GM N GM Valor LL UL
74
2879,6 74 2697,0 1,07 0,79 1,44
20 GM ajustada = media geométrica de anticuerpos ajustada para valoración de línea base; N = Número de sujetos con resultados disponibles de pre-y pos-vacunación; CI al 98,8% = Intervalo de confianza de 98,8% para la proporción de GM ajustada (Modelo Ancova: ajuste para línea base); LL = Límite inferior, UL = Límite superior; Fuente de datos = Apéndice tabla IIIA
Resultados – Análisis descriptivo (Figura 6)
25 Las principales observaciones fueron: 1) Antes de la vacunación la respuesta de CMI es superior en adultos jóvenes que en ancianos 2) Después de la vacunación:
-
hubo un efecto de refuerzo de la vacuna antigripal sobre la respuesta de CMI en adultos jóvenes (18-40 años)
30 - la respuesta de CMI en ancianos que habían recibido la vacuna antigripal acompañada de adyuvante es comparable con la respuesta de CMI de adultos jóvenes.
La diferencia entre pre- y pos-vacunación en respuestas de linfocitos T CD4 para todas las citoquinas investigadas (IL-2, CD40L, TNF-a y IFN-y) fue significativamente más elevada con las vacunas adyuvadas en comparación con Fluarix™ (18-40 años) para todas las pruebas.
Análisis del objetivo terciario:
Con el fin de evaluar el criterio de valoración terciario, se midieron la frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 específicos de la gripe y células B de la memoria en los días 0, 21, 90 y 180.
•
Se resumió la frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 específicos de la gripe con citoquinas positivas (estadísticas 5 descriptivas) para cada grupo de vacunación en los días 0 y 21, para cada antígeno.
• Se usó una prueba no paramétrica (ensayo de Wilcoxon) para comparar la ubicación de diferencia entre los dos grupos (vacuna antigripal acompañada de adyuvante frente a Fluarix™) y se calcula el valor p estadístico para cada antígeno en cada ensayo diferente.
•
La estadística descriptiva en diferencia individual entre las respuestas del día 21/día 0 (Pos-/Pre-vacunación) 10 se calcula para cada grupo de vacunación y cada antígeno en cada ensayo diferente.
• Se usa un ensayo no paramétrico (ensayo de Wilcoxon) para comparar la diferencia individual (Pos-/Pre
vacunación) y se calculará el valor p estadístico para cada antígeno en cada ensayo diferente. En la Tabla 11 se presentan los valores p del ensayo de Wilcoxon usados para comparar la diferencia en la frecuencia de linfocitos T CD4 específicos de la gripe.
15 Resultados -Evaluación del criterio de valoración terciario (Tabla 11) Las conclusiones principales son:
• Las frecuencias de GM pre-vacunación de CD4 específicos de la gripe fueron similares en todos los grupos de sujetos ancianos, pero superiores en los adultos de edades entre 18 y 40 años.
•
En sujetos ancianos, la frecuencia pos-vacunación (día 21) de linfocitos T CD4 específicos de la gripe fue 20 significativamente más elevada tras vacunación con vacunas adyuvadas que con FluarixTM.
• La frecuencia de post-vacunación de linfocitos T CD4 específicos de gripe permaneció más baja en sujetos ancianos vacunados con vacunas AS01 B o AS01 E que en adultos de edada entre 18 y 40 años vacunados con FlurixTM.
•
La frecuencia de GM pre-vacunación y pos-vacunación en célula T CD8 específica de la gripe fue 25 esencialmente similar en todos los grupos.
Tabla11 Estadística inferencial: valores p de las pruebas de Kruskal-Wallis para células T CD4 en cada momento (Cohorte ATP para Inmunogenicidad)
Descripción prueba
Valor p
AS01B frente a Flu YNG
AS01E frente a Flu YNG
día 0
día 21 día 0 día 21
TODOS DOBLES
lt;0,0001 0,0070 lt;0,0001 0,0025
CD4OL
lt;0,0001 0,0056 lt;0,0001 0,0015
IFNy
lt;0,0001 0,0009 lt;0,0001 0,0006
IL2
lt;0,0001 0,0029 lt;0,0001 0,0021
TFNa
lt;0,0001 0,0295 lt;0,0001 0,0378
Tabla 11 (continuación)
AS01B frente a Flu ELD
AS01E frente a Flu ELD
día 0
día 21 día 0 día 21
TODOS DOBLES
0,6165 0,0004 0,8744 0,0018
CD4OL
0,7560 0,0005 0,9504 0,0021
IFNy
0,9936 0,0008 0,9835 0,0029
IL2
0,6702 0,0011 0,7855 0,0023
TFNa
0,5450 0,0022 0,6688 0,0040
Resultados -Evaluación de los criterios de valoración de respuesta inmunitaria Humoral Variables observadas:
En los días 0, 21, 90 y 180: valoraciones de anticuerpos de inhibición de la hemoaglutinación (HI) en suero, sometidas a ensayo por separado frente a cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).
El valor de corte para el anticuerpo por HI frente a todos los antígenos de vacuna se definió por parte del laboratorio antes del análisis (y es igual a 1:10). Un sujeto seronegativo es un sujeto cuya valoración de anticuerpo es inferior al valor de corte. Un sujeto seropositivo es un sujeto cuya valoración de anticuerpo es superior o igual al valor de corte. A la valoración de anticuerpo inferior al corte del ensayo se le proporciona un valor arbitrario de la mitad del corte.
Los siguientes parámetros se calculan en base a las valoraciones de anticuerpos por HI:
•
Media geométrica de las valoraciones (GMT) del anticuerpo por HI en los días 0 y 21, calculada tomando el anti-logaritmo de la media de las transformaciones del logaritmo de valoración.
•
Factores de seroconversión (SF) en el día 21 definidos como el número de veces de aumento en GMT de HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0.
•
Tasas de seroconversión (SC) en el día 21 definidas como el porcentaje de vacunas bien con una valoración de HI de pre-vacunación lt;1:10 y una valoración de pos-vacunación 1:40, o bien una valoración de pre-vacunación a 1:10 y un aumento mínimo de cuatro veces en la valoración pos-vacunación.
•
Tasas de seroprotección (SPR) en el día 21 definidas como el porcentaje de vacunas con una valoración de HI en suero 1:40.
El CI de 95% para GM se obtiene dentro de cada grupo por separado. El CI de 95% para la media del logaritmo de valoración se obtiene en primer lugar suponiendo que los logaritmos de valoración se distribuyen normalmente con varianza desconocida. Después el CI de 95% para GM se obtiene por medio de transformación exponencial del CI de 95% para la media de la valoración logarítmica.
El resultado serológico ausente para la medida de un anticuerpo particular no se sustituye. Por tanto, un sujeto sin resultado serológico en un momento dado no contribuye al análisis del ensayo en ese momento.
Resultados de respuesta inmunitaria humoral (Figura 7 y Tabla 12)
Las GMT pre-vacunación de anticuerpos por HI para las 3 cepas de vacuna estaban dentro del mismo intervalo en los 4 grupos de tratamiento. Después de la vacunación, existe un claro impacto de los 2 adyuvantes que aumentan la respuesta humoral en ancianos, en comparación con Fluarix convencional en la misma población (Figura 7, mostrada a escala lineal, pero obviamente se observa el mismo impacto que cuando se muestra en escala logartímica).
Las GMT son
•
significativamente superiores para H1N1 para AS01E
•
significativamente superiores para H3N2 para ambos adyuvantes.
•
no se observaron diferencias significativas en términos de los valores de GMT de pos-vacunación entre los dos grupos de sujetos que había recibido las vacunas adyuvadas.
Veinte días después de la vacunación, los sujetos de Fluarix (18-40 años) tuvieron una respuesta HI superior para las cepas Nueva Caledonia y B/Jangsu.
5 Como se muestra en la Tabla 12, las vacunas antigripales adyuvadas sobrepasaron los requisitos de las autoridades europeas para el registro anual de vacunas antigripales de virión dividido [“Note for Guidance on Harmonization of Requirments for Influenza Vaccines for ther inmunological assessment of the annual strain changes” (CPMP/BWP/214/96)] en sujetos de edades superiores a 60 años.
Después de la vacunación, se produjo una diferencia estadística con respecto a tasas de seroprotección de 10 anticuerpos de HI entre el grupo de Fluarix ( 65 años) y
• Flu/AS01B y Flu/AS01E para cepa A/H1N1/ Nueva Caledonia
Para cada cepa de vacuna, las tasas de seroprotección para los 2 grupos de vacuna antigripal adyuvada están en el mismo intervalo en comparación con el grupo Fluarix (18-40 años).
Para cada cepa de vacuna, las tasas de seroconversión para los 2 grupos de vacuna antigripal adyuvada están en el 15 mismo intervalo en comparación con el grupo Fluarix (18-40 años), excepto para la cepa Nueva Caledonia.
Tabla 12 Tasas de seroprotección, tasas de seroconversión y factores de conversión en el día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad)
Cepas
Grupo N Tasa de seroprotección (valoración de HI 40) % % Tasa seroconversión ( aumento cuatro veces) [95 % de IC] % Factor de conversión [IC de 95%] %
Norma UE (gt;60 años)
gt;60% gt;30% gt;2,0
Norma UE (lt; 60 años)
gt; 70% gt; 40% gt; 2,5
A/Nueva Caledonia (H1N1)
Flu Jov 75 100 [95,20-100] 77,3 [66,2-86,2] 35,1 [21,9-56,4]
Flu Anc
49 71,4 [56,74-83,42] 30,6 [18,3-45,4] 3,7 [2,4-5,7]
FluAS01B
75 97,3 [90,70-99,68] 48,0[36,5-59,8] 4,5 [3,3-6,1]
FluAS01E
75 93,3 [85,12-97,80] 52,0 [40,2-63,7] 5,0 [3,6-6,9]
A/Nueva York (H3N2)
Flu Jov 75 93,3 [85,12-97,80] 76,0 [64,7-85,1] 9,2 [7,1-11,8]
Flu Anc
49 81,6 [67,98-91,24] 69,4 [54,6-81,7] 8,2 [5,7-11,8]
FluAS01B
75 96,0 [88,75-99,17] 85,3 [75,3-92,4] 13,1 [10,0-17,1]
FluAS01E
75 93,3 [85,12-97,80] 80,0 [69,2-88,4] 14,5 [10,4-20,2]
B/Jiangsu (B)
Flu Jov 75 100 [95,20-100] 81,3 [70,7-89,5] 13,9 [10,1-19,1]
Flu Anc
49 93,9 [83,13-98,72] 44,9 [30,7-59,8] 4,3 [3,0-6,1]
FluAS01B
75 100 [95,20-100] 65,3 [53,5-76,0] 5,2 [4,2-6,5]
FluAS01E
75 97,3 [90,70-99,68] 70,7 [59,0-80,6] 6,7 [5,1-8,9]
N= número total de sujeto; %= Porcentaje de sujetos con valoración en el día 21 dentro del intervalo específico; CI =
intervalo de confianza
20 VI.3.2. Conclusiones de immunogenicidad
• La frecuencia pre-vacunación de CD4 específico de la gripe fue significativamente inferior en ancianos en
comparación con adultos de edades entre 18 y 40 años. Después de la vacunación con Fluarix™, la frecuencia
pos-vacunación (día 21) permaneció inferior en adultos ancianos en comparación con los jóvenes. Por el contrario, se demostró la no inferioridad con respecto a la frecuencia de frecuencia pos-vacunación de CD4
25 específico de la gripe después de la vacunación con vacunas adyuvadas de sujetos ancianos en comparación con la vacuación con Fluarix™ en adultos con edades entre 18 y 40 años.
• En lo que se refiere a la respuesta inmunitaria humoral con respecto a la respuesta de anticuerpo por HI, todas las vacunas antigripales cumplieron los requisitos de las autoridades europeas para el registro anual de vacunas antigripales inactivadas [“Note for Guidance on Harmonization of Requirments for Influenza Vaccines for ther
30 inmunological assessment of the annual strain changes” (CPMP/BWP/214/96)]. En adultos ancianos, las vacunas adyuvadas mediaron al menos una tendencia de respuesta inmunitaria humoral a la hemaglutinina de la gripe mayor que Fluarix™. En la Tabla 13 se resume la diferencia significativa entre la respuesta inmunitaria humoral frente a cada cepa de vacuna mediada en sujetos anciandos por medio de vacunas adyuvadas en comparación con Fluarix™. En comparación con adultos de edades entre 18 y 40 años vacunados con
35 Fluarix™, los sujetos ancianos vacunados con las vacunas adyuvadas mostraron una tendencia valores más eleevados de GTM de pos-vacunación y factor de seroconversión en el día 21 frente a la cepa A/Nueva York.
Tabla 13 Cepas de gripe para las cuales se observó una respuesta inmunitaria humoral más elevada (basada en no solpamiento de IC de 95 %) en sujetos ancianos vacunados con diferentes vacunas adyuvadas en comparación con Fluarix en la misma población.
Post-vac GMT
Factor de Seroconversión Tasa de Seroproteccción Tasa de Seroconversión
FluAS01B
A/ Nueva York A/Nueva Caledonia
FluAS01E
A/ Nueva Caledonia A/ Nueva York A/ Nueva Caledonia
Post-vac GMT= Media geométrica de la valoración en la post -vacunación.
5 VI.4 Conclusiones de reactogenicidad
VI.4.1. Registro de episodios adversos (AE)
Se registraron los síntomas solicitados (véase la tabla 14) que se producen durante un período de seguimiento de 7 días (día de vacunación y 6 días posteriores). También se registraron los síntomas no solicitados que se producen durante el período de seguimiento de 21 días (día de vacunación y 20 + 3 días posteriores). La intensidad de los
10 AEs siguientes se determinó como se describe en la Tabla 15.
Tabla 14 Episodios adversos locales/generales solicitados
AEs locales solicitados
AEs generales solicitados
Dolor en el sitio de la inyección Enrojecimiento en el sitio de la inyección Hinchazón en el sitio de la inyección Hematoma
Fatiga Fiebre Migraña Dolor muscular Temblor Dolor articular en el brazo de la inyección Dolor articular en otras localizaciones
N.B. Se registró la temperatura por la tarde. Las mediciones de temperatura adicional se deben realizar en otros momentos del día, se registró la temperatura más alta..

Tabla 15 Escalas de intensidad para los síntomas solicitados en adultos
Episodio adverso
Grado de intensidad Parámetro
Dolor en el sitio de la inyección
0 Ausente
1
cuando se toca
2
cuando se mueve el miembro
3
evita la actividad normal
Enrojecimiento en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Hinchazón en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Hematoma en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Fiebre*
Temperatura de registro en °C / °F
Migraña
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Fatiga
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Dolor articular en el sitio de inyección y otras localizaciones
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Dolor muscular
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Temblor
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
*Fiebre se define como la temperatura de la axila 37,5°C (99,5°F)
La intensidad máxima del enrojecimiento/hinchazón del sitio de inyección local se puntúa como sigue:
0 es 0 mm; 1 es gt; 0- ≤ 20 mm; 2 es gt; 20 -≤ 50 mm; 3 es gt; 50 mm.
La intensidad máxima de fiebre se puntúa como sigue:
1 es gt;37,5 - � 38.0°C; 2 es gt; 38,0 - � 39,0°C; 3 es gt; 39,0
El investigador hace una evaluación de la intensidad de los otros AEs, es decir, síntomas no solicitados, que incluyen SAEs reseñados durante el estudio. La evaluación se basa en el juicio clínico del investigador. La intensidad de cada uno de los registros de AE se asigna a una de las siguientes categorías:
1 (suave) = Un valor de AE que se tolera fácilmente por parte del sujeto, provocando malestar míinimo y que no interfiere con la actividad diaria;
2 (moderado) = Un valor de AE que es suficientemente molesto para interferir con la actividad diaria normal;
3 (grave) = Un valor de AE que evita la actividad diaria normal (en adultos/adolescentes, tal valor de AE evitaría la asistencia al trabajo/colegio y requeriría de la administración de terapia correctora).
VI.4.2. Registro de episodios adversos (AE)
En los sujetos ancianos, la reactogenicidad observada con vacunas adyuvadas, en términos de síntomas tanto locales como generales, fue más elevada que con Fluarix™. No solamente la incidencia sino también la intensidad de síntomas se incrementaron después de la vacunación con vacunas adyuvadas (Figura 8). Los síntomas de grado 3 muestran una tendencia a ser más alta en el grupo que recibió la vacuna adyuvada con la concentración de los inmunoestimulantes más alta (MPL, QS21) en comparación con el grupo que recibió la vacuna adyuvada en el que los inmunoestimulantes están a una concentración menor. Sin embargo, en todos los casos, los síntomas se resuelvieron de forma rápida.
Ejemplo de Referencia VII: Evaluación pre-clínica evaluation de las vacunas VPH adyuvadas en ratones.
Este estudio usó una composición antigénica bivalente de virus de papiloma humano (VPH), combinando partículas de tipo virus (VLPs) formadas a partir de L1 de VPH 16 y L1 de VPH 18 como antígeno. El objetivo del estudio era comparar la eficiencia de esta preparación antigénica cuando se formula con AS01B y una dilución 1/5 de AS01B, evaluada de manera comparativa frente al adyuvante actual encontrado en la vacuna anticáncer cervical de GSK, AS04 (MPL sobre alumbre).
VII.1 - Vacunación
Se inyectaron formulaciones de vacuna compuestas por VPH16/18 L1 (2 !g o 0,5µg cada una) derivadas de procedimiento Hi-5 80/80L y formuladas con AS04 (50 µg MPL formuladas con alumbre o AS01B (50 µg QS21 - 50 µg MPL en 0,5 ml) 1/10 y 1/50 de dosis humana, a ratones (n = 12 por grupo) en los días 0 y 28. Debido a que los estudios se llevaron a cabo en ratones, se puede tomar la dosis humana de 1/10 como equivalente a la formulación humana de AS01 B, es decir. 50 µg de QS21 y 50 µg de MPL en 0,5ml y se puede tomar 1/50 para que sea una dilución 1/5 de la formulación humana AS01 B es decir: 10 µg de QS21 y 10 µg de MPL en 0,5 ml. Se tomaron muestras de sangre los días 14 y 45 después de la dosis II para someter a ensayo los anticuerpos específicos de tipo anti -L1 en suero individual. Se midió la tinción de citoquinas intracelulares los días 7 y 14 después de II en PBMC y el día 45 después de II usando células de bazo. Se midió la frecuencia de las células B de memoria específica de VLPs el día 45 después de II usando células de bazo.
VII.2 - Anti-VPH 16/18 L1 ELISA
La cuantificación de anticuerpos anti-VPH-16 y VPH-18 L1 se realizó mediante ELISA usando VPH-16 y VPH-18 L1 como revestimiento. Se diluyeron los antígenos a una concentración final de 0,5 µg/ml in PBS y se adsorbieron durante toda una noche a 4°C en los pocillos de placas de microvaloración de 96 pocillos (Maxisorp Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía albúmina sérica bovina al 1% (tampón de saturación). Se añadió suero diluido en tampón que contenía PBS + 0,1% de Tween 20 + 1% de BSA a las placas revestidas con VPH L1 y se incubó durante 1 hora 30 min a 37°C. Las placas se lavaron con cuatro veces con PBS. Se añadió 0,1% de Tween 20 e Ig anti -ratón conjugada a biotina (Dako, Reino Unido) diluida a 1/1000 en tampón de saturación, a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de la etapa de lavado, se añadió estreptavidina -peroxidasa de rábano picante (Dako, Reino Unido), diluido 1/3000 en tampón de saturación durante un tiempo adicional de 30 min a 37°C. Las placas se lavaron como se ha indicado anteriormente y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con una solución de 0,04% de o-fenilendiamina (Sigma) 0,03% de H2O2 en 0,1% de Tween 0, tampón citrato 0,05 M a pH 4,5. La reacción se detuvo con 2N H2SO4 y se leyó a 492/620 nm. Se calcularon las valoraciones de ELISA a partir de una referencia de SoftMaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en EU/ml.
VII.3 - Tinción de citoquinas intracelulares (ICS)
La tinción de citoquinas intracelulares de las células T se realizó sobre PBL los días 7 y 14 después de II y sobre las células de bazo el día 45 después de la segunda inmunización. Se recogieron PBMCs (1 combinación/grupo) o células de bazo (4 combinaciones de 3 órganos por grupo) se recogieron de los ratones. La estimulación de antígenos in vitro de células de bazo se llevó a cabo a una concentración final de 5 106 células /ml (microplaca de 96 pocillos) con VLP 16 ó 18 (5 µg/ml) + anticuerpos CD49d CD28 (1 µg/ml) y después se incubó 3H a 37°C. Después de la etapa de reestimulación de antígenos, se incubaron las células durante toda una noche en presencia de Brefeldin (1 µg/ml) a 37°C para inhibir la secreción de citoquinas. La tinción de células se realizó como sigue: se lavaron suspensiones celulares, se resuspendieron en 50 µl de PBS 1% FCS que contenía 2% Fc de reactivo de bloqueo (1/50; 2.4G2). Después de 10 minutos de incubación a 4°C, se añadieron 50 µl de una mezcla de anti-CD4-APC (1/50) y anti-CD8 perCp (1/50) y se incubó 30 min a 4°C. Después de lavar en PBS 1% FCS, las células se permeabilizaron por medio de resuspensión en 200 µl de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) y se incubó durante 20 min a 4°C. Después las células se lavaron con Perm Wash (Kit BD) y se resuspendió con 50 µl de anti-IFγ APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluidos en PermWash. Después de 2H de incubación a 4°C, las células se lavaron con Perm Wash y se resuspendieron en PBS 1% FCS + 1% paraformaldehído. El análisis de muestras se realizó mediante FACS. Se activaron las células vivas (FSC/SSC) y se realizó una adquisición en ~ 20,000 casos (linfocitos). Se calcularon los porcentajes de IFγ + o IL2+ se calcularon sobre poblaciones activadas por CD4+ y CD8+.
VII.4 -Memoria de células B
Cuarenta y cinco días después de la segunda inmunización, se sacrificaron los ratones, se separaron las células del bazo mediante un gradiente de linfoprep (Cedarlane). Después se resuspendieron las células B en medio RPMI 1640 (Gibco) que contenía aditivos (piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM, Pen/Strep, Glutamina y 1-2 mercaptoetanol), 5% de suero de ternera fetal, 50 U/ml rhIL-2 (eBioscience) y 3 µg/ml de CpG. Se cultivaron las células durante cinco días a una concentración final de 106 células/ml, en 5 ml de placas de fondo redondo de 6 pocillos. Después de una etapa de activación con etanol, se revistieron las placas de nitrocelulosa (Multiscreen-IP; Millipore) con 10 µg/ml de VLPs o con Ig Goat anti-ratón (GAM; Sigma) diluido 1/200 in PBS. Después de una etapa de saturación con medio completo, se añadieron 100 µl de 2,106 células/ml a las placas revestidas con VLPs y se añadieron 100 µl de 106 y 5.105 células/ml a las placas de GAM. Después de un tiempo de incubación de 2 hrs a 37°C, se almacenaron las placas durante toda una noche a 4°C. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS 0,1% Tween 20 y anti-ratón Ig Biot diluido 1/200 en PBS 1% BSA 5% FCS (tampon de dilución), se distribuyeron las placas y se incubó durante 2 horas a 37°C. Después de la etapa de lavado, se añadió Extravidina HRP (Sigma) diluida 1/550 en tampón de dilución durante 1 hora adicional a 37°C. Se lavaron las placas como se ha indicado anteriormente y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con una solución de AEC (Sigma). La reacción se detiene enjuagando las placas suavemente con agua del grifo. Cuando las placas están secas, se leen con KS-400.
VII.5 - Análisis estadístico
Se compararon los medios de formulación usando un análisis de varianza de una vía (ANOVA 1). El análisis se llevó a cabo sobre los datos transformados de log10 con fines de normalización. Cuando se detectó una diferencia significativa entre los medios de procedimiento (valor de p ≤ 0,05), se llevaron a cabo comparaciones acertadas por pares entre las medias a un nivel significativo de 0,05 (ensayo de comparación múltiple de Student - Newman -Keuls).
VII.6 – resultados
Se inmunizaron los ratones como se ha indicado anteriormente VII.1. Se usaron los siguientes grupos
Grupos
Antígeno Adyuvante Dilución de adyuvante
1
VPH 16 -18 L1 2 μg AS04 1/10 dosis humana (equivalente a 50 μg de MPL por 0,5 ml HD)
2
VPH 16 -18 L1 0,5μg AS04 1/50 dosis humana (equivalente a 10 μg MPL por 0,5 ml de HD)
3
VPH 16 -18 L1 2 μg AS04 1/10 dosis humana (equivalente a 50 μg de MPL por 0,5 ml de HD)
4
VPH 16-18 L1 0,5μg AS04 1/50 dosis humana (equivalente a 10 μg de MPL por 0,5 ml de HD)
5
VPH 16 -18 L1 2μg AS01B 1/10 dosis humana (equivalente a 50 μg de MPL por 0,5 ml de HD)
6
VPH 16 -18 L1 0,5 μg AS01B 1/50 human dose (equivalente a 10 μg de MPL por 0.5ml HD)
Grupos
Antígeno Adyuvante Dilución de adyuvante
7
VPH 16-18 L1 2μg AS01B 1/10 dosis humana (equivalente a 50 μg de MPL por 0,5ml de HD)
8
VPH 16-18 L1 0,5μg AS01B 1/50 dosis humana (equivalente a 10 μg de MPL por 0,5ml HD)
VII.6.1 - Respuestas humorales
No se observó intervalo de dosis significativo par las dos dosis sometidas a ensayo de antígeno con cada dilución de adyuvantes para cada una de las valoraciones de anticuerpo anti VPH 16-L1 o valoraciones de anticuerpo anti VPH 18-L1 (figura 9).
No se observó intervalo de dosis significativo par las dos dosis sometidas a ensayo de cada adyuvante a cualquier dosis de antígeno para las valoraciones de anticuerpo anti VPH 16-L1.
Cuando se miran las valoraciones de anticuerpo anti VPH 18-L1, se observa un ligero incremento en la valoración según AS01 B (1/10 HD) en comparación con AS01 B (1/50 HD) como se mide el día 14 después de II (intervalo de
dosis 2,5 veces, valor de p = 0,0035), sin embargo este intervalo se observó solamente para 2 μg de antígeno y no para 0,5 μg de antígeno (valor de p = 0,0867). El día 45 después de II, no se observó ningún intervalo de dosis significativo para las dos dosis sometidas a ensayo de cada adyuvante con cualquier dosis de antígeno.
VII.6.2 - Respuestas celulares
Tinción de citoquinas intracelulares
No se observó ningún efecto de intervalo de dosis para las dos dosis sometidas a ensayo de antígenos cualquiera que sea la dosis de adyuvante para VPH 18-L1. Se obtuvieron frecuencias similares de CD4+ T células específicas de VLP16 con dos dosis sometidas a ensayo de antígenos con dosis diferentes de adyuvantes. (Figura10).
Se observó un ligero efecto de dosificación (2,6 veces, valor de p = 0,0009 para VPH 18-L1, 2 veces, valor de p = 0,0187 para VPH 16-L1) para AS01 B (1/10 HD) en comparación con AS01 B (1/50 HD), sin embargo se observó
este intervalo solamente para 2μg de antígeno y no para 0,5 μg de antígeno.
Células de memoria B específicas
No se observó ningún efecto de intervalo de dosis de antígeno para las dos dosis sometidas a ensayo de antígenos cualquiera que sea la dosis de adyuvante para VPH 16 o 18 L1 (figura 11).
No se observó ningún efecto de intervalo de dosis de adyuvante para las dos dosis sometidas a ensayo de adyuvantes cualquiera que sea la dosis de antígeno para VPH 17 o 18 L1.
Como se puede observar a partir de los resultados anteriores, una dilución 1/5 dilución de AS01 B produce una formulación que tiene eficacia equivalente en las composiciones inmunogénicas frente a la propia AS01B.
Ejemplo de Referenca VIII: Evaluación preclínica de vacunas de S. pneumoniae adyuvadas en ratones.
La vacuna antineumococos usada en este estudio fue una vacuna conjugada de neumococos adyuvada 11-valente (11PCV/AS) que consiste en una mezcla de 11 conjugados de polisacárido de pneumococo adyuvados con AS01 B
o AS01E. Los conjugados consisten en polisacáridos purificados de serotipos de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F, cada uno de ellos conjugado individualmente a una proteína portadora, o bien un toxoide de difteria (DT), toxoide de tétanos (TT) o proteína D de H. influenzae (PD). Las vacunas se presentan como un polvo secado por congelación para reconstitución con uno de los adyuvantes líquidos.
Se produce 11PCV/AS como se muestra a continuación:
Las condiciones de activación y acoplamiento son específicas para cada polisacárido. Se proporcionan en la tabla siguiente. Se disolvió el polisacárido calibrado (excepto para PS5, 6B and 23F) en NaCl 2M o en agua para inyección (WFI). La concentración óptima de polisacárido se evaluó para todos los serotipos. Todos los serotipos excepto el serotipo 18C se conjugaron directamente a la proteína portadora como se detalla más adelante.
A partir de una solución madre de 100 mg/ml en acetonitrilo o solución de acetonitrilo/agua 50%/50%, se añadió CDAP (relación CDAP/PS 0,75 mg/mg PS) a la solución de polisacárido. 1,5 minutos después, se añadió NaOH de 0,2M - 0,3M de para obtener el pH de activación específica. La activación del polisacárido se realizó a este pH durante 3 minutos a 25ºC. La proteína purificada (proteína D o DT) (la cantidad depende de la relación inicial de PS/proteína portadora) se añadió al polisacárido activado y la reacción de acoplamiento se realizó al pH específico durante hasta 2 horas (dependiendo del serotipo) bajo regulación de pH. Con el fin de inactivar los grupos éster de cianato sin reaccionar, se añadió después una solución 2M de glicina a la mezcla. Se ajustó el pH al pH de inactivación (pH 9,0). La solución se agitó durante 30 minutos a 25ºC y después durante toda una noche a 2 - 8 °C con agitación lenta continua.
Preparación de 18C:
Se ligó 18C a la proteína portadora mediante un enlace - dihidrazida de ácido adípido (ADH). Se microfluidificó el serotipo 18C de polisacárido antes de la conjugación.
Derivatización del toxoide de tétano con EDAC
Para la derivatización del toxoide de tétanos, se diluyó TT a 25 mg/ml en NaCl 0,2M y se añadió el espaciador ADH con el fin de alcanzar una concentración final de 0.2 M. Cuando se completó la disolución del espaciador, se ajustó el pH hasta 6,2. Posteriormente, se añadió EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) hasta alcanzar una concentración final de 0,02M y se agitó la mezcla durante 1 hora bajo regulación de pH. La reacción de condensación se detuvo incrementando el pH hasta 9,0 durante al menos 30 minutos a 25ºC. Posteriormente se sometió a diafiltración TT derivatizada (membrana10 kDa CO) con el fin de retirar el reactivo ADH y EDAC residual.
La cantidad a granel de TTAH se filtró finalmente de forma estéril hasta la etapa de acoplamiento y se almacenó a 70°C.
Acoplamiento químico de TTAH a PS 18C
Los detalles de los parámetros de conjugación se pueden encontrar en la Tabla 1. Se diluyeron 2 gramos de PS micofluidificado en la concentración definida de agua y se ajustaron hasta 2 M de NaCl mediante la adición de NaCl en polvo.
Se añadió una solución de CDAP (100 mg/ml recién preparado 50/50 v/v acetonitrilo/WFI) para alcanzar la proporción apropiada de CDAP/PS.
El pH se incrementó hasta el pH de activación 9,0 mediante la adición de NaOH 0,3 M y se estabilizó a este pH hasta la adición de TTAH.
Después de 3 minutos, se añadió TTAH derivatizado (20 mg/ml en NaCl 0,2 M) hasta alcanzar una proporción de TTAH /PS de 2; se reguló el pH hasta el pH de acoplamiento de 9,0. Se dejó la solución una hora bajo regulación de pH.
Para la inactivación, se añadió una solución de glicina 2M a la mezcla PS/TTAH/CDAP.
Se ajustó el pH hasta el pH de inactivación (pH 9,0).
La solución se agitó durante 30 minutos a 25ºC, y después se dejó durante toda una noche a 2 - 8 ºC con agitación lenta continua.
Purificación de los conjugados:
Se purificaron los conjugados mediante filtración de gel usando una columna de filtración de gel Sephacryl 500HR equilibrada con NaCl 0,15M (S500HR para 18C) para retirar las moléculas pequeñas (incluyendo DMAP) y PS y proteína no conjugadas. Basándose en los diferentes tamaños moleculares de los componentes de reacción, los conjugados PS-PD, PS-TT o PS-DT se eluyen primero, seguidos de PS libre, después de PD libre o DT libre y finalmente DMAP y otras sales (NaCl, glicina).
Las fracciones que contienen los conjugados se detectan mediante UV280 nm. Se agrupan las fracciones de acuerdo con su Kd, se filtran de manera estéril (0,22 !m) y se almacenan a +2 - 8°C. Se determinaron las proporciones de PS/Proteína en las preparaciones de conjugados.
Condiciones específicas de activación/acoplamiento/inactivación de conjugados de PS S. pneumoniae -Proteína D/TT/DT
Serotipo
1 μfluido 3 (µ fluido) 4 μfluido 5 6B 7F μfluido
conc. (mg/ml) de PS
2,5 3,0 2,5 7,1 5,0 5,0
disolución de PS
WFI NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M
conc. (mg/ml) de PD
10,0 5,0 10,0 5,0 5,0 10,0
Proporción inicial de PS/PD (p/p)
1,5/1 1/1 1,5/1 1/1 1,1/1 1,2/1
conc. de CDAP (mg/mg PS)
0,50 0,75 0,50 0,79 0,83 0,75
pHa=pHc=pHq
9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,5
Serotipo
9V μfluido 14 μfluido 18C μfluido 19F μfluido 23F
conc, (mg/ml) de PS
5,0 5,0 4,5 9,0 2,38
disolución de PS
NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M
conc, (mg/ml) de proteína portadora
10,0 10,0 20,0 (TT) 20,0 (DT) 5,0
Serotipo
9V μfluido 14 μfluido 18C μfluido 19F μfluido 23F
Proporción inicial de proteína portadora/PS (p/p)
1,2/1 1,2/1 2/1 1,5/1 1/1
conc. (mg/mg PS) de CDAP
0,50 0,75 0,75 1,5 0,79
pHa=pHc=pHq
9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Los 11 conjugados se mezclan después, y se mezcla la preparación antigénica final con el adyuvante apropiado antes de la inmunización.
Se inmunizaron IM grupos de 40 ratones hembras Balb/c de cuatro semanas de edad los días 0, 14 y 28 con 0,1μg de conjugados de Ps 11-valentes formulados bien con AS01 B o bien con AS01E. Se dosificaron anticuerpos Anti-PS IgG mediante ELISA en los sueros recogidos el día 42.
Como se puede observar en la figura 12, se observaron respuestas comparables entre la formulación AS01 E diluida comparada con la formulación AS01 B excepto para PS 14, donde se observó una respuesta más elevada con AS01B, y PS 19F donde se observó una mayor respuesta con AS01E.
Ejemplo de Referencia IX: Evaluación preclínica de las composiciones inmunogénicas de citomegalovirus adyuvadas y no adyuvadas.
IX.1: Cobayas.
IX.1.1 Elisa anti-gB
La cuantificación de anticuerpos anti-gB se realizó mediante ELISA usando gB como un antígeno de revestimiento.
Se diluyó el antígeno a una concentración final de 4 μg/ml en PBS y se incubaron 100 μl durante toda una noche a 4 0C en placas de microvaloración de 96 pocillos. Después las placas se saturaron durante 1 hora a 37 0C con 200 μl de PBS que contenía albúmina sérica bovina al 1%. Se añadieron diluciones seriadas dos veces (100 μl/pocillo) y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37 0C. Las placas se lavaron 4 veces con PBS 0,1% de Tween 20 y se añadieron a cada pocillo 100 μl de IgG de peroxidasa de rábano picante anti-cobaya (Dako, Reino Unido) y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37 0C. Se lavaron las placas 4 veces con PBS 0,.1% de Tween 20 y 1 vez con agua agua. Después se incubaron durante 20 minutos a 22 0C con 100 μl de una solución de o-fenilendiamina (Sigma) en tampón citrato 0,1 M pH 4,2. Esta reacción se detuvo con 100 μl de H2SO4 2N y se leyó a 490/620 nm. Las valoraciones de Elisa se determinaron mediante interpolación de los valores de la DO a partir de una referencia de muestra de SoftMaxPr. Las valoraciones se expresaron en EU/ml.
Se realizaron análisis estadísticos 14 días después de los datos de 2 Elisa usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de varianza se puede describir brevemente como sigue:
1) Transformación logarítmica de los datos
2) Ensayo Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad
3) Ensayo de Cochran con el fin de verificar la homogeneidad de la varianza entre poblaciones diferentes (grupos)
4) Análisis de varianza de los datos seleccionados (una vía)
5) Ensayo de Tuckey-HSD para comparación múltiple.
IX.1.2 – Ensayo de Neutralización
Antes del ensayo, se distribuyeron células MRC5 (10000 células/200 μl de medio MEM) en microplacas de 96 pocillos y se incubó durante 3 días a 37ºC con CO2. Se realizaron diluciones de dos veces de suero inactivado (30 minutos a 56ºC) y se incubó con 100 μl de disolución vírica (800/ml) durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, se inocularon 100 μl de mezcla de suero/virus en microplacas de 96 pocillos que contenían monocapa de MRC5. Las placas se centrifugaron a 2000 RPM durante 1 hora a 35ºC. Después de una incubación a 37ºC, las placas se fijaron con una disolución de acetona al 80% (20 minutos a -20ºC). La disolución de acetona se descartó y las células positivas para CMV se detectaron usando un antígeno temprano anti-inmediato monoclonal específico durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y se añadió Ig antirratón conjugada con biotina y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante una adición de 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces y se incubó durante 10 minutos con una disolución de True-blue. Las señales de color específico se registraron mediante examen al microscopio. Las valoraciones de neutralización se expresaron como la inversa de la dilución más alta de suero que proporciona un 50% de reducción de células CMV positivas en comparación con un control de virus (CMV más células sin suero).
IX.1.3 – Protocolos de Inmunización
Se inmunizaron 4 grupos. Cada grupo contenía 8 conejillos de Indias Hartley Clr:(ha) hembras de 5-8 semanas de edad, excepto para un grupo de control (grupo 4) que contenía sólo 4 sujetos. Los sujetos se inmunizaron IM a 0 y 28 días. Las muestras de suero se recogieron 28 días después de la primera inmunización y 14 días después de la segunda inmunización. Se llevaron a cabo ensayos de ELISA como se ha descrito anteriormente en suero tomado a 28 tras I y 14 tras II. Los ensayos de neutralización se llevaron a cabo como se describe anteriormente a 14 tras II. Los grupos fueron los siguientes:
Grupo
Antígeno Coadyuvante
1
gB NaCl
2
gB AS01B
3
gB AS01E
4
NaCl NaCl
Se preparó el antígeno como se muestra a continuación: el antígeno de vacuna se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) como gB**, una quimera truncada que contiene secuencias de péptido procedentes de gD de glicoproteína de virus de Herpes Simple 2 (VHS 2) en un extremo N y C. El gB** se trunca en su dominio terminal-C que contiene la secuencia de anclaje de membrana y, por tanto, se segrega en el interior del sobrenadante del cultivo.
Para los primeros tres grupos, se inyectaron intramuscularmente 15 !g de gB** formado en 500 !l de bien PBS, AS01 B o bien AS01 E (preparado como en el Ejemplo de Referencia II.2 anterior). En el grupo 4, solo se administró PBS por vía intramuscular.
X.1.4 – resultados
Como se puede ver en la figura 13, se observaron valoraciones de anti-gB ELISA significativamente mayores para los dos grupos adyuvados en comparación gB sencillo (8 y 5,5 veces más elevado para gB y AS01 B y gb/AS01E respectivamente). Las valoraciones de anticuerpo tras la dosis II fueron muy ligeramente mayores (1,5 veces) en el grupo gB/AS01B en comparación con el grupo gB/AS01 E.
Comparación múltiple: Tuckey – HSD
Grupo
Casos Media Sencillo AS01E AS01B
Sencillo
8 4,7917 ** **
AS01E
8 5,5293 **
AS01B
8 5,6942 **
Sencillo lt;AS01E = AS01 B Con respecto a las valoraciones de neutralización (figura 14):
•
No se observaron anticuerpos de neutralización específicos en el grupo de gB sencillo
•
Se detectaron anticuerpos de neutralización específicos en ambos grupos adyuvados
•
Se observaron niveles similares de anticuerpos de neutralización en ambos grupos adyuvados.
IX.2 – Ratones
IX.2.1 – ELISA anti gB
Se llevó a cabo la cuantificación de anticuerpos anti-gB mediante ELISA usando gB como un antígeno de revestimiento. El antígeno se diluyó a una concentración final de 1 μg/ml en PBS y se incubaron 100 μl durante toda una noche a 4ºC en placas de microvaloración de 96 pocillos. Las placas se saturaron durante 1 hora a 37ºC con 200 μl de PBS que contenían 1% de suero de albúmina bovina. Se añadieron diluciones seriadas de dos veces de sueros (100 μl/pocillo) y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con Tween 20 al 0,1% en PBS y se añadieron 100 μl de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante a cada pocillo durante unos 30 minutos adicionales a 37 0C. Las placas se lavaron 4 veces con Tween 20 al 0,1% en PBS y 1 vez con agua. Después de incubaron durante 10 minutos a 22 0C con 100 μl de tetra-metil-bencidina al 75% en tampón citrato 0,1 M a pH 5,8. Esta reacción se detuvo con 100 μl de H2SO4 0,4 N y se leyó a 450/620 nm. Se determinaron valoraciones de ELISA mediante interpolación de valores de DO a partir de una referencia de muestra mediante SoftMaxPro. Las valoraciones se expresaron en UE/ml.
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo en los días 14 tras 2 datos de ELISA usando UNISTAT. El protocolo se aplicó para análisis de varianza se puede describir brevemente como sigue:
1) Transformación logarítmica de los datos
2) Ensayo de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad
3) Ensayo de Cochran con el fin de verificar la homogeneidad de la varianza entre diferentes poblaciones (grupos)
4) Análisis de varianza en datos seleccionados (una vía)
5) Ensayo de Tuckey-HSD para comparación múltiple.
IX.2.2 – Ensayo de Neutralización
Antes del ensayo, se distribuyeron células MRC5 (10000 células/200 μl de medio MEM) en microplacas de 96 pocillos y se incubó durante 3 días a 37ºC con 5 % de CO2. Se incubaron diluciones de dos veces (60 μl) de sueros inactivados (30 minutos a 56ºC) con 60 μl de disolución vírica (800IPU/ml) durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, se inocularon 100 μl de mezcla de sueros/virus en microplacas de 96 pocillos que contenían células MRC5. Las placas de centrifugaron a 2000 RPM durante 1 hora a 35ºC. Después de una incubación a 37ºC durante la noche, las placas se fijaron con una disolución de acetona al 80% (20 minutos a -20ºC). La disolución de acetona se descartó y se detectaron las células positivas para CMV usando un antígeno I (IE-I) temprano antiinmediato monoclonal específico durante 1 hora a 37ºC. Las placas de lavaron 3 veces con PBS y se añadió Ig antiratón conjugada con biotina y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante una adición de 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces y se incubaron durante 10 minutos con una disolución de True-blue. Las señales de color específico se registraron mediante examen al microscopio. Las valoraciones de neutralización se expresaron como la inversa de la dilución más elevada de suero que proporciona un 50% de reducción de células CMV positivas en comparación con un control de virus (CMV más células sin suero).
IX.2.3 – Tinción de citoquina Intracelular
La detección intracelular de citoquinas de células T se llevó a cabo en PBL en días 7 y 21 después de la segunda inmunización. Se recogieron PBL de ratones y se combinaron (1 combinación por grupo). Se llevó a cabo una estimulación de linfocitos (concentración final de 10*7 células/ml) bien con una combinación de péptido que cubre la secuencia CMV o bine con la proteína gB. Se incubó mezcla de PBL/antígeno 2 horas a 37ºC. Se incubaron después células durante toda la noche en presencia de Brefelding (1 μg/ml) a 37ºC para inhibir la secreción de citoquinas.
La tinción celular se llevó a cabo como sigue: se lavaron las suspensiones celulares, se resuspendieron en 50 μl de PBS 1& FCS que contenía reactivo bloqueante de Fc al 2%. Después de 10 minutos de incubación a 4ºC, se añadieron 50 μl de una mezcla de anti-CD4 PE y anti-CD8 perCp y se incubó 30 minutos a 4ºC. Después de una etapa de lavado en FCS al 1% en PBS, las membranas celulares se permeabilizaron mediante resuspensión en 200 μl de Cytofix=Cytoperm (estuche de Beckton Dickinson) y se incubaron 20 minutos a 4ºC. Las células se lavaron
después con PermWash (estuche de BD) y se resuspendieron con 50 μl de un APC anti-IFN-gamma + FITC anti-IL-2 diluidas en PermWash. Después de 2 horas de incubación a 4ºC, las células se resuspendieron en FCS al 1% en PBS + paraformaldehído al 1%.
El análisis de muestras se llevó a cabo mediante FACS. Las células vivas se controlaron y la adquisición se llevó a cabo en +/- 20000 eventos. Los porcentajes de IFNg+ o IL2+ se calcularon en poblaciones CD4+ y CD8+ controladas.
IX.2.4 – Protocolos de Inmunización
Se inmunizaron 4 grupos. Cada grupo contenía 12 ratones C57Bl/6 hembra de 4–10 semanas de edad.
Grupo
Antígeno Coadyuvante
1
gB NaCl
2
gB AS01B
3
gB AS01E
4
NaCl NaCl
Se preparó el antígeno como se muestra a continuación: el antígeno de vacuna se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) como gB**, una quimera truncada que contiene secuencias de péptido procedentes de gD de glicoproteína de virus de Herpes Simple 2 (VHS 2) en un extremo N y C. El gB** se trunca en su dominio terminal-C que contiene la secuencia de anclaje de membrana y, por tanto, se segrega en el interior del sobrenadante del cultivo.
Para cada grupo, se preparó gB** a una concentración de 1,5 !g/dosis hasta en 625 !l de PBS o coadyuvante AS01 B o AS01 E (preparado como en el ejemplo de Referencia II.2 anterior que tenía una concentración de 100 !l de inmunoestimulantes por ml o 50 !l de inmunoestimulantes por ml respectivamente). Se inyectaron intramuscularmente 50 !l (es decir, 1,/10 de una dosis humana de 0,5 ml). Se inyecto disolución salina a un grupo de control de ratones. Se llevaron a cabo las inyecciones en los días 0 y 28. Se recogieron muestras de suero 14 días después de las segundas inyecciones para los ensayos de ELISA y de neutralización. Se recogieron los PBL 7 días y 21 días depsués de las segundas inyecciones para ICS.
IX.2.5 – resultados
Valoraciones ELISA Anti–gB (figura 15).
Se observó un nivel de muy débil a indetectable de anticuerpos anti-gB en el grupo gB no adyuvado. Sin embargo, se observó una respuesta de anticuerpos elevada (de 65 y 66 veces más elevada) en ambos grupos coadyuvantes, AS01B y AS01E, respectivamente. No hubo significancia estadística entre el grupo AS01 B y el AS01E.
Comparación múltiple: Tuckey – HSD
Grupo
Casos Media Sencillo AS01E AS01B
Sencillo
12 2,1132 ** **
AS01E
12 3,9317 **
AS01B
12 3,9375 **
Sencillolt;AS01E = AS01B
Valoraciones de neutralización anti-CMV (figura 16)
Se observaron valoraciones de neutralización anti-gB significativamente más elevadas para los dos grupos adyuvados en comparación con el grupo gB sencillo. No se observó diferencia significativa en valoraciones de anticuerpos de neutralización entre las formulaciones AS01 B y AS01 E.
Inmunidad Mediada por células.
Debido al nivel muy bajo de respuesta observado después de reestimulación de muestras 7 tras II, no se pudo hacer discriminación entre grupos y no se pudo observar respuesta concluyente para estimulación de CD4 y CD8 (figura 17). Estas respuestas de bajas a indetectables se debieron probablemente a una cuestión técnica durante la preparación de muestras. Sin embargo, se pudieron ver respuestas 21 días tras la segunda inyección. Los datos de CD4 (figura 18) no muestran diferencia después de reestimulación mediante gB (5 μg/ml) o péptidos (2 μg/ml o 4 μg/ml). Un perfil de citoquinas similar se observa para AS01E y AS01B. No se puede ver respuesta concluyente para estimulación de CD8 (figura 19).
Estos experimentos muestran que para otra composición antigénica y en dos organismos diferentes, un coadyuvante que tiene niveles más bajos de inmunoestimulantes es inmunológicamente tan eficaz como aquel que tiene niveles más elevados.
Ejemplo 1: Evaluación Preclínica de Vacuna RTS,S Adyuvada
X.1 - Formulación
La composición antigénica, RTS, S se produce en Saccharomyces cerevisiae y consta de dos proteínas, RTS y S, que se ensambal intracelular y espontáneamente para dar lugar a estructuras particuladas poliméricas mixtas que se estima que contienen, cada una en promedio, 100 polipéptidos. RTS es una cadena polipeptídica híbrida de 51 kDa y 424 aminoácidos constituida por 189 aminoácidos procedentes de un antígeno de superficie de esporozoitos de la cepa NF53 del parásito de la malaria P. falciparum (el antígeno CSP, aminoácidos 207 a 395), condensada al extremo aminoterminal de la proteína S del virus de la hepatitis B. S es un polipéptido de 24 kDa (de 226 aminoácidos de largo) correspondiente al antígeno de superficie del virus de hepatitis B. El microgránulo de antígeno liofilizado contiene aproximadamente 50 μg (cuando se diseña para formularse en 0,5 ml con AS01 B) o 25 μg (cuando se diseña para formularse en 0,5 ml con AS01E) de antígeno.
Se prepararon AS01B y AS01E mezclando los diversos componentes (PBS, liposomas, MPL y QS21) en un tanque, y agitando en condiciones asépticas. El producto se filtró después de forma estéril antes de introducirse en viales o jeringuillas. El coadyuvante líquido se almacenó a una tempetatura de +2ºC hasta +8ºC antes de usarse para reconstituir el microgránulo de antígeno liofilizado.
X.2 – Experimentos con ratones
Se llevaron a cabo dos experimentos en ratones que se dirigen a comparar las respuestas inmunitarias específicas a RTS,S inducidas por RTS,S/AS01B en comparación con RTS,S formulada con AS01E. En cada experimento, se inmunizaron ratones C57Bl/6 (10 ratones/grupo) intramuscularmente tres veces cada dos semanas con 10, 5 ó 2,5 μg de RTS,S formulada con coadyuvantes AS01B o AS01E. Como controles, se inmunizaron dos grupos bien con AS01B o bien con AS01E solo. Se evaluaron las respuestas de anticuerpos específicas para HB y CS, para cada ratón mediante ELISA 15 días después de la tercera inmunización. Se calcularon la media geométrica de las valoraciones de anticuerpos y sus intervalos de 95% de confianza para todos los ratones que recibieron el mismo tratamiento en ambos experimentos. Los análisis estadísticos para evaluar efecto coadyuvante y efectos de dosis de antígeno se llevaron a cabo en datos almacenados de ambos experimentos. Las respuestas de células T específicas CD4 y células T específicas CD8 se midieron mediante citometría de flujo 7 días después de las inmunizaciones segunda y tercera en combinaciones de células sanguíneas de 5 ratones por grupo. Así se generaron dos valores para cada grupo en cada experimento.
Respuesta inmunitaria humoral
Como se muestra en las figuras 20 y 21, ambos coadyuvantes AS01B y AS01E inducen respuestas de anticuerpo comparables intensas frente a CSP y HBs.
Un análisis de ANOVA de tres vías de anti-CSP GMT mostró que no hubo diferencias significativas entre AS01 B y AS01E para las dosis de 5 ó 2,5 μg de RTS,S.
Para la dosis de 10 μg, se encontró que el coadyuvante de AS01 B inducía valoraciones anti-CS más elevada que AS01 E y la proporción de GMT “grupo AS01 B/grupo AS01E” fue de 1,93 (IC de 95%: 1,33–2,79; p = 0,001)
Respuesta inmunitaria específica mediada por células
Las figuras 22 y 23 muestran los niveles de células T CD4 y CD8 específicas para CSP y HB que expresan IL-2 y/o IFN gamma.
La respuesta CD4 específica para CSP tiende a ser mayor con AS01 B en comparación con AS01E después de tres inmunizaciones mientras que la respuesta de las células T CD8 con AS01E es equivalentes o mejor que con AS01
B.
La respuesta CD4 específica para HBs tiende a ser mayor con AS01B en comparación con AS01E después de tres inmunizaciones excepto para las dosis más bajas de RTS,S donde los niveles de células T CD4 son comparables entre los dos coadyuvantes. Las respuestas de células T CD8 específicas de HB inducidas por RTS,S formuladas con AS01E son equivalentes o mejores que las respuestas inducidas mediante RTS,S formuladas con AS01B.
Se piensa que estas diferencias están dentro de la variabilidad esperada de ensayos de inmunología celular.
La evaluación preclínica de la vacuna RTS,S/AS01E en ratones reveló un perfil de seguridad aceptable, similar al de RTS,S/AS01B.
Ejemplo 2: Evaluación clínica de RTS,S/AS01E.
Se prepararon las formulaciones como en el ejemplo 1 anterior. Se usa sacarosa como un excipiente en el microgránulo de antígeno liofilizado. Como en el ejemplo 1, el coadyuvante líquido se usa para reconstituir el antígeno liofilizado. Se preparón AS01 E como se describe en el ejemplo de referencia II.2, y se almacenó a +2 hasta +8ºC hasta que fue necesario para reconstitución.
Se está llevando a cabo actualmente un estudio bienmascarado aleatorizado de fase II sobre la seguridad e inmunogenicidad de la RTS,S coadyuvada con AS01 E, en niños de 18 meses a 4 años de edad en Gabón. El calendario de vacunación es un calendario de vacunación de 0, 1, 2 – meses. Los objetivos son los siguientes para RTS,S/AS01E cuando se administra en forma de 3 dosis, intramuscularmente, en un calendario de vacunación de 0, 1, 2 – meses a niños de 18 meses a 4 años de edad que viven en un área endémica de malaria:
Coprincipal
-
para evaluar la seguridad hasta un mes tras la dosis 3.
-
para demostrar la no inferioridad a una emulsión de aceite en agua de vacuna de RTS, S adyuvada en términos de respuesta de anticuerpos anti-CS un mes después de la dosis 3.
Secundario
-
para evaluar reactogenicidad hasta un mes después de la dosis 3.
-
para demostrar la no inferioridad de una emulsión de aceite en agua de vacuna RTS, S adyuvada en términos de respuesta de anticuerpos anti-HB un mes después de la dosis 3.
-
para describir seroprotección frente a hepatitis B hasta un mes después de la dosis 3
-
para describir la respuesta anti-CS hasta un mes después de la dosis 3 Terciario
-
Seguridad entre de 1 mes después de la dosis 3 hasta 12 meses después de la dosis 3
-
Respuesta inmunitaria humoral a antígeno de CS a 12 meses después de la dosis 3
-
Respuesta inmunitaria humoral a antígeno HB a 12 meses después de la dosis 3 Exploratorio
-
para evaluar respuesta inmunitaria mediada por células T a antígeno CS hasta 12 meses después de la dosis 3
-
para evaluar respuesta inmunitaria de memoria de células B a antígeno CS hasta 12 meses después de la dosis 3
-
para describir la respuesta anti-CS hasta un mes después de la dosis 3 de acuerdo con el estado de inmunización de HBV documentado en la detección.
Se enrolaron 180 sujetos, se proporcionó a 90 de ellos una vacuna adyuvada con una emulsión de aceite en agua, previamente validada de forma apropiada, de adyuvante (denominada quot;controlquot; en las tablas siguientes) y se proporcionó a 90 de ellos una vacuna adyuvada con AS01 E. Se evaluaron los niños sanos de sexo masculino y femenino de 18 meses a 4 años de edad. Las vacunas se administraron por vía IM al deltoide izquierdo.
Incidencia y naturaleza de los síntomas (solicitados y no solicitados) notificados durante el periodo de 7 días después de la vacunación (días 0-6) tras cada dosis y global(cohorte de vacunados totales)
Cualquier síntoma
Síntomas generales Síntomas locales
IC del 95 %
IC del 95 %
IC del 95 %
Grupo
N n % LL UL N n % LL UL N n % LL UL
Dosis 1
Gr 1 90 40 44,4 34,0 55,3 90 23 25,6 16,9 35,8 90 20 22,2 14,1 32,2
Gr 2
90 47 52,2 41,4 62,9 90 26 28,9 19,8 39,4 90 32 35,6 25,7 46,3
Dosis 2
Gr 1 88 50 56,8 45,8 67,3 88 36 40,9 30,5 51,9 88 35 39,8 29,5 50,8
Gr 2
87 53 60,9 49,9 71,2 87 39 44,8 34,1 55,9 87 34 39,1 28,8 50,1
Dosis 3
Gr 1 83 78 94,0 86,5 98,0 83 34 41,0 30,3 52,3 83 76 91,6 83,4 96,5
Gr 2
85 82 96,5 90,0 99,3 85 50 58,8 47,6 69,4 85 79 92,9 85,3 97,4
Global/Dosis
Gr 1 261 168 64,4 58,2 70,2 261 93 35,6 29,8 41,8 261 131 50,2 44,0 56,4
Gr 2
262 182 69,5 63,5 75,0 262 115 43,9 37,8 50,1 262 145 55,3 49,1 61,5
Global/Sujeto
Gr 1 90 87 96,7 90,6 99,3 90 60 66,7 55,9 76,3 90 83 92,2 84,6 96,8
Gr 2
90 85 94,4 87,5 98,2 90 70 77,8 67,8 85,9 90 84 93,3 86,1 97,5
Gr, 1= RTS, S, AS01E Gr. 2= controlLL= límite inferiorUL=límite superiorPara cada dosis y global/sujeto:N= número de sujetos con al menos una dosis administradan/%= número/porcentaje de sujetos que presentan al menos un tipo de síntoma cualquiera que sea la vacuna de estudio administradaPara cada global/dosis:N= número de dosis administradasn/%= número/porcentaje de dosis seguidas de al menos un tipo de síntoma cualquiera que sea la vacuna de estudio administradaIC de 95 %= intervalo de confianza del 95 % exacto, LL= límite inferior, UL= límite superior
Estos datos demuestran que una vacuna RTS,S adyuvada con AS01E proporcionó resultados de reactogeneicidad aceptables en una población pediátrica cuando se comparó con una formulación control.
Las respuestas serológicas se midieron evaluando las respuestas de los anticuerpos a HB y a repeticiones de CSP (anti R32LR). El suero para la determinación de anticuerpos se recogió en la detección, los días 60 y 90 (en la
5 segunda vacunación y tercera vacunación). Los niveles de anticuperos frente a CS se midieron mediante ELISA convencional usando antígeno R32LS adsorbido en placa con un anticuerpo de referencia convencional como control de acuerdo con los PNT del laboratorio. Los resultados se indican en UE/ml.
Los anticuerpos frente al antígeno de superficie de la hepatitis B se midieron usando un inmunoensayo ELISA disponible comercialmente (estuche de ensayo AUSAB EIA de Abbott) o equivalente de acuerdo con las
10 instrucciones del ensayo. Los resultados se indican en mUI/ml.
Tasas de seropositividad y GMC para anticuerpos anti-CS (cohorte de vacunados totales)
gt;= 0,5 ELU/ml
GMC
IC de 95 %
IC de 95 %
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LL UL valor LL UL Mín Máx
Anti-CS
Gr 1 DETECCIÓN 89 0 0,0 0,0 4,1 0.3 0.3 0.3 lt;0,5 lt;0,5
PII (D60)
78 78 100 95,4 100 81,9 64,9 103,2 4,6 568,6
PIII (D90)
75 75 100 95,2 100 215,6 178,8 259,9 14,3 1922,3
GR. 2
DETECCIÓN 90 1 1,1 0,0 6,0 0,3 0,2 0,3 lt;0,5 0,5
PII (D60)
78 78 100 95,4 100 56,9 45,7 70,9 3,6 2380,9
PIII (D90)
80 80 100 95,5 100 164,8 134,1 202,6 6,3 2093,6
Gr, 1= RTS, S, AS01E Gr. 2= control GMC= media geométrica de la concentración de anticuerpo calculada en todos los sujetos N= número de sujetos resultados disponibles n/%= número/porcentaje de sujetos con concentración dentro del intervalo especificado IC de 95 % = intervalo de confianza del 95 %; LL= límite inferior; UL=límite superiorMÍN/MÁX= Mínimo/Máximo
Tasas de seropositividad y GMC para anticuerpos anti-HB (cohorte de vacunados totales)
gt;= 010 ELU/ml
GMC
IC de 95 %
IC de 95 %
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LL UL valor LL UL Mín Máx
Anti-HB
Gr 1 DETECCIÓN 89 43 48,3 37,6 59,2 40,8 23,3 71,4 lt;10,0 46421,6
PII (D60)
78 77 98,7 93,1 100 8936,4 4684,2 17048,7 lt;10,0 161536 7
PIII (D90)
75 75 100 95,2 100 24527,7 15316,5 39278,5 21,1 169430 6
GR. 2
DETECCIÓN 90 37 41,1 30,8 52,0 20,0 12,8 31,0 lt;10,0 30796,4
PII (D60)
78 77 98,7 93,1 100 3640,0 1963,1 6749,3 lt;10,0 1508114
PIII (D90)
80 80 100 95,5 100 19485,0 13511,3 28099,9 178,6 1103974
Gr, 1= RTS, S, AS01E Gr. 2= controlGMC= media geométrica de la concentración de anticuerpo calculada en todos los sujetosN= número de sujetos resultados disponiblesn/%= número/porcentaje de sujetos con concentración dentro del intervalo especificadoIC de 95% = intervalo de confianza del 95 %; LL= límite inferior; UL=límite superiorMÍN/MÁX= Mínimo/Máximo
Estos datos demuestran que una formulación de vacuna RTSS adyuvada con AS01E proporcionó respuestas humorales aceptables en una población pediátrica cuando se comparó con un control validado.
Ejemplo de Referencia X: Evaluación preclínica del virus de varicela zóster con AS01B en comparación con AS01E
La vacuna candidata está formada por una proteína truncada de la cubierta del VZV, gE, producida en células CHO.
Para este estudio, se sensibilizaron ratones C57BL/6 (n= 48) con una dosis humana (DH) de Varilrix (-4log ufp/dosis) administrada por vía subcutánea. Cinco semanas después de la sensibilización con Varilrix, los ratones se dividieron en 5 grupos de 12 ratones a los que se inyectó por vía intramuscular (tibias) los días 0 y 28, 5 !g de gE sola, 5 !g de gE + AS01E* (1/10 DH) o , 5 !g de gE + AS01B (1/10 DH). En el grupo control de ratones (solo sensibilizados) se inyectó solución salina (NaCl 0,9 %). Las respuestas inmunitarias se evaluaron en los días 14 y/o 30 después de la segunda vacunación. Se evaluaron los niveles de anticuerpos totales específicos de gE y la frecuencia de las células T CD4 y CD8 productoras de citoquinas (IL2/IFN).
Respuestas de anticuerpos específicos de gE:
Se realizó un ELISA para detectar y cuantificar los anticuerpos específicos de gE en los sueros de los ratones usando la proteína gE como el antígeno de revestimiento. Las valoraciones de ELISA se definieron con el recíproco de la dilución del suero que produjo una medida de absorbancia (densidad óptica) igual al 50 % del valor de absorbancia máximo. Las valoraciones de ELISA se calcularon mediante análisis de regresión.
Los datos demuestran que gE AS01 E y gE AS01 B inducían niveles similares de anticuerpos específicos de gE (valores p gt; 0,05). Ambas formulaciones indujeron respuestas significativamente mayores en comparación con el antígeno gE solo (10-13 veces, valores p lt; 0,05) los días 14 y 30 tras II (Figura 26).
14 días después II
IC de 95 % 30 días después II IC de 95 %
Grupo
GMT (UE/ml) LL UL GMT (UE/ml) LL UL
gE
12067 5960 24433 3832 911 16115
gE /AS01 E
125934 95504 166059 50439 38071 66825
gE /AS01 B
131728 88112 196934 47589 36158 62635
Varilrix
34 11 105 33 10 102
Respuestas CD4 y CD8 específicas de gE
La producción de citoquinas se evaluó en las células CD4 y CD8 usando una técnica de tinción de citoquinas intracelulares. Las células del bazo se aislaron de cada grupo de 12 ratones a los 30 días de II y se combinaron en 4 grupos de 3 bazos. Las células del bazo (1 x 106) se incubaron durante 2 horas en presencia de péptidos gE (63 péptidos) extendiendo la proteína gE completa (péptidos de 20 aa/solapamiento de 10 aa) y después se incubó durante la noche en presencia de brefeldina. Después, las células se tiñeron con AcMo fluorescente específico de la superficie celular de CD4/CD8 y siguiendo la permeabilización de citoquinas intracelulares IL-2 e IFNy.
Como se muestra en las figuras 26, aunque las dos formulaciones gE AS01B como gE AS01E inducían perfiles similares de citoquinas (IL2/IFNy), la formulación gE AS01 B inducía una magnitud mayor de células productoras de citoquinas CD4 y CD8 (2 veces, pgt; 0,05 para CD4, 3,6 veces, p gt; 0,05 para CD8). Debido a la variabilidad inesperadamente alta de las respuestas de células T, la potencia para detectar una diferencia significativa entre las dosis de adyuvante fue muy limitada (lt; 50 %). Es importante el hecho de que la gE formulada con AS01 B o AS01 E inducía células T CD4 productoras de citoquinas de una magnitud significativamente mayor (13,3 veces, plt; 0,05) en comparación con gE sola. También se indujeron niveles mayores de células CD8 por parte de gE formulada con AS01 B o AS01 E (3,8 veces, pgt; 0,05) en comparación con el antígeno gE solo.
Ejemplo de Referencia XI: Evaluación preclínica de AS01 B frente a AS01E en un modelo de gripe en hurones
Procedimientos y materiales
Se obtuvieron hurones hembra (Mustela putorius furo) con edad de 4-6 meses de MISAY Consultancy (Hampshire, UK). Los hurones se sensibilizaron en el día 0 con la cepa heterosubtípica H1N1 A/Estocolmo/24/90 (4 Log TCID50/ml), 250 !l administración por vía intranasal. En el día 21, se inyectó por vía intramuscular una dosis humana completa (dosis de vacuna de 1000 !g, 15 !g de HA/cepa A, 17,5 µg cepa B) de una combinación de H1N1 A/Nueva Caledonia C/20/99 (15 !g/ml), H3N2 A/Wyoming/3/2003 (15 !g/ml) y B/Jiangsu/10/2003 (17,5 !g/ml) a los hurones. Los hurones después se someterion a prueba de provocación en el día 42 por vía intranasal con 250 !l de una cepa heterosubtípica Wh.A/NY/55/04 (4,51 Log TCID50/ml).
Las vacunaciones el día 21 fueron con la formulación trivalente sencilla (“sencilla” en las tablas siguientes) o con la formulación trivalente adyuvada con AS01B (“AS01 B” en las tablas siguientes) o AS01 E (“AS01 E” en las tablas siguientes). Las formuaciones se prepararon como se indica en el ejemplo 3 anterior.
Monitorización de la temperatura corporal:
Las temperaturas individuales se monitorizaron durante el periodo de prueba de provocación y se evaluaron usando implantes de telemetría que registraron cada temperatura individual de cada animal cada 15 minutos antes y después de la prueba de provocación. Todos los implantes se comprobaron y se realizó una nueva calibración mediante DSI antes de la colocación en la cavidad intraperitoneal. Todos los animales fueron colocados individualmente en una jaula durante estas mediciones.
Las temperaturas se registraron cada 15 minutos, 6 días antes de la sensibilización hasta 4 días después de la sensibilización, así como 3 días antes de la prueba de provocación hasta 7 días después de la prueba de provocación.
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Procedimiento de ensayo
Las valoraciones de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IH). El principio del ensayo de IH se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. En primer lugar, se trataron los sueros inactivados con calor con una disolución de neuraminidas de 25 % (RDE) y se inactivaron con calor para retirar los inhibidores no específicos. Tras el pretratamiento, se incubaron diluciones de dos veces de suero con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos de pollo y se clasificó la inhibición de la aglutinación usando desgarros para lectura. Las valoraciones se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se clasificó como un título igual a 5.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron en las valoraciones de IH posteriores a la vacunación usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
•
Transformación logarítmica de los datos.
•
Ensayo de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos.
•
Ensayo de Cochran para verificar la homogeneicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos).
•
Análisis de la varianza de una vía realizado en los grupos.
•
Ensayo de Tukey HSD para comparaciones múltiples.
Valoración vírica en lavados nasales
Todas las muestras nasales primero se filtraron de forma estéril a través de filtros Spin X (Costar) para retirar cualquiera contaminación bacteriana. Se transfirieron 50 µl de diluciones seriadas de diez veces de lavados nasales a placas de microvaloración que contenían 50 µl de medio (10 pocillos/dilución). A continuación se añadieron 100µl de células MDCK (2,4 x 105 células/ml) a cada pocillo y se incubaron a 35ºC durante 6-7 días. Tras 6-7 días de incubación, el medio de cultivo se retira suavemente y se añaden 100 µl de un medio que contiene 1/20 WST-1 y se
incuban durante otras 18 horas. La intensidad del pigmento amarillo formazán producido tras la reducción de WST-1 mediante células viables es proporcional al número de células viables presentes en el pocillo al final del ensayo de valoración vírica y se cuantifica midiendo la absorbancia de cada pocillo a la longitud de onda adecuada (450 nanómetros). El valor de corte se define como la DO media de las células control no infectadas - 0,3 DO (0,3 DO corresponde a una desviación estándar de +/- 3 de la DO de las células control no infectadas). Una puntuación positiva se define cuando la DO es lt; del valor de corte y, por el contrario, una puntuación negativa se define cuando la DO es gt; del valor de corte. Las valoraciones de diseminación vírica se determinaron mediante “Reed y Muench” y se expresaron en forma de DICT50/ml..
Ensayo de linfoproliferación
Los PBMC se recolectaron mediante centrifugación en gradiente de densidad (20 min a 2500 rpm y 4 ºC) en disolución de mamíferos de linfocitos de Ficoll Cedarlane. Los PBMC se resuspendieron en 5 ml de medio de cultivo (RPMI/añadir a 4 ºC) y 10 % de suero normal de huron. Los aditivos estaban formados por piruvato sódico 100 mM, aminoácidos no esenciales MEM, penicilina/estreptomicina, glutamina y de 12-mercaptoetanol concentrado x 1000. Los PMBC recién aislados se usaron inmediatamente para los ensayos de proliferación in vitro. Las céluals se colocaron en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos a 2 a 105 células/pocillo y se cultivaron con diferentes concentraciones de antígeno (0,1 a 1 !g HA de virus inactivado completo) durante de 44 a 96 horas y, después, se marcaron con pulsos con 0,5 !Cl de timidina[3H] . Se estimó la incorporación del radiomarcaje de 4 a 16 h después mediante espectroscopia de emisión 1.
Resultados
Carga vírica en los lavados nasales tras la exposición.
Los lavados nasales se recogieron 2 días antes de la sensibilización (sensibilización= día 0), 1, 2 y 7 días después de la sensibilización, además de 4 días antes de la prueba de provocacaión (prueba de provocación = día 42) y durante un periodo de 7 días tras la prueba de provocación.
Grupo
-2 0 +1 +2 +7 39 42 43 44 45 47 49
Sencillo
0,82 1,84 5,35 1,85 0,8 1,82 5,77 4,44 1,97 0,9
AS01E
0,82 2,11 5,83 1,65 0,8 1,62 4,93 4,15 2,4 0,85
AS01B
0,82 2,26 5,38 1,91 0,82 1,74 2,25 1,89 1,350 0,9
Véase los resultados en la figura 27.
Diseminación vírica tras la inmunización.
Se observó un pico de diseminación vírica en todos los hurones 2 días después de la sensibilización. 7 días después de la sensibilización sólo se observó una carga viral residual en todos los grupos.
Diseminación vírica tras la prueba de provocación
El pico de diseminación vírica se observó 24 horas después de la prueba de provocación.
La valoración vírica 3 días después de la prueba de provocación mostró valoraciones víricas elevadas (sin protección) en los hurones inmunizados con la trivalente sencilla dividida. Se observó una reducción de la diseminación vírica en hurones inmunizados con S01E trivalente sencilla dividida menor que la observada con la trivalente dividida adyuvada con AS01B.
Control de la temperatura:
La temperatura corporal se monitorizó desde 6 días antes de la sensibilización (sensibilización = día 0) hasta 4 días después de la sensibilización, además de 3 días antes de la prueba de provocación hasta 7 días después de la prueba de provocación (prueba de provocación = día 42). Las mediciones se tomaron cada 15 minutos y se realizó la media calculada en el momento del medio día para cada grupo. Los resultados se pueden ver en la figura 28 .
Después de sensibilización
La temperatura corporal monitorizada antes, durante y después de la sensibilización mostró un incremento de la temperatura en todos los grupos.
Después de la prueba de provocación
La interpretación de la monitorización de la temperatura corporal es difícil. Se observó un ligero incremento de la temperatura corporal tras la prueba de provocación en hurones inmunizados con trivalente sencilla dividida y trivalente dividida con AS01 E, pero no con trivalente divididad con AS01 B. La puntuación siguiente se obtuvo por medio del número de hurones con un incremento de la temperatura corporal gt; 0,4 ºC.
5 Incremento en la temperatura después de la prueba de provocación
Trivalente sencilla: 5/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,7, +0,8)
Trivalente AS01B 0/8
Trivalente AS01E 6/8 ((+0,4, +0,4, +0,5, +0,5, +0,9, +1,6)
Esta lectura es menos consistente que otras lecturas usadas en hurones.
10 Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación (HI)
Las muestras de suero se recogieron 4 días antes de la sensibilización, 17 días después de la sensibilización, 21 días de la inmunización y 13 días después de la prueba de provocación. Los resultados se pueden ver en las figuras 29 y 30. Para las tres cepas de vacuna, se observaron valoraciones de HI estadísticamente signficativas mayores en hurones inmunizados con la trivalente dividida adyuvada con AS01B o AS01 E en comparación con la trivalente
15 dividida sencilla. No se observaron diferencias entre los dos grupos adyuvados. En comparación con otros grupos, se observaron valoraciones de HI de reacción cruzada estadísticamente signficativas más elevadas con respecto a A/New York H3N2 (cepa de prueba de provocación) tras la inmunización de los hurones con vacunas divididas trivalentes adyuvadas con AS01 B.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición inmunogénica que comprende un antígeno procedente de Plasmodium falciparum, en combinación con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa procedente de corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que la dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición en una cantidad de entre 1 !g y 30 !g por dosis, para su uso como medicamento para seres humanos.
  2. 2.
    La compopsición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, para la prevención de infección por Plasmodium falciparum y/o enfermedad de malaria.
  3. 3.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21.
  4. 4.
    La compopsición inmunogéncia para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha composición de adyuvante además comprende un esterol, en la que la proporción de saponina : esterol es de 1: 1 a 1:100 p/p.
  5. 5.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 en la que dicho esterol es colesterol.
  6. 6.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho lipopolisacárido es un derivado no tóxico de un lípido A.
  7. 7.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicho derivado de lípido A es 3D-MPL.
  8. 8.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho 3D-MPL está presente en una cantidad de 20-30 !g por dosis.
  9. 9.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en la que la saponina es QS21 y QS21 está presente en una cantidad de 20-30 !g por dosis.
  10. 10.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que a) la saponina es QS21 y el lipopolisacárido es 3D-MPL, y b) la composición comprende 25 !g de cada uno de QS21 y 3D-MPL por dosis.
  11. 11.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que el antígeno procedente de Plasmodium falciparum es la proteína de circumsporozoito (proteína CS).
  12. 12.
    La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que el antígeno procedente de Plasmodium falciparum es RTS,S.
    Figura 1 – Preparación de MPL
    MPL® en polvo
    ↓
    Suspensión (10 mg/ml)
    ↓
    Tratamiento térmico
    ↓
    Enfriamiento
    ↓
    Microfluidización
    ↓
    Dilución a 2 mg/ml
    ↓ Pre-filtración sobre 0,65 μm ↓ Filtración sobre 0,2 μm ↓
    Dilución a 1 mg/ml
    ↓
    Almacenamiento a +2/+8ºC
    Figura 2 – Naturaleza inmunitaria humoral frente a diferentes cepas de gripe tras la inmunización de hurones con formulaciones experimentales (Ensayo de Inhibición de Hematoaglutinación (GMT +/- IC95)) Figura 3 – Estudio con hurones - Valoración vírica en lavados nasales tras prueba de provocación (Día 42)
    Figura 4 – Estudio con ratones - respuesto humoral frente a tres cepas de vacunas antigripales tras inmunización de ratones con formulaciones experimentales: Ensayo de Inhibición de Hematoaglutinación (GMT +/- IC95) 21 después de la inmunización
    Figura 5 – Estudio con ratones - respuesta inmunitaria mediada por células: respuestas de células T CD4+ específicas de gripe en el Dia 7 después de la inmunización
    % de síntomas reseñados (con IC 95%)
    100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
    Figura 8- Incidencia de síntomas locales y generales (totales y relacionados con grado 3) reseñados durante el período de FU de 7 días
    Flu YNGRel. de grado 3Flu ELD
    Rel. de grado 3AS01B
    Rel. de grado 3AS01E
    Rel. de grado 3
    Flu YNGRel. de grado 3 Flu ELDRel. de grado 3AS01BRel. de grado 3AS01E
    Rel. de grado 3
    Grupo de vacuna
    Figura 9: Respuestas humorales a VPH 18 y 18 L1 Figura 10: Tinción de citoquinas intracelulares -células VLP 16 y CD4+
    Figura 17: Naturaleza inmunitaria mediada por células -células CD8+ y CD4+ específicas de CMV tras reestimulación con una combinación de péptidos gB (7 días tras la segunda inmunización)
    Figura 18: Naturaleza inmunitaria mediada por células - células CD4+ específicas de CMV tras reestimulación con dos dosificacioness diferentes de una combinación de péptidos gB (21 días tras la segunda inmunización)
    Figura 19: Naturaleza inmunitaria mediada por células - células CD8+ específicas de CMV tras reestimulación con dos dosificacioness diferentes de una combinación de péptidos gB (21 días tras la segunda inmunización)
    Figura 20: Valoraciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) frente a proteína de circumsporozoito CSP tras inmunización con vacuna RTS, S adyuvada en ratones
    NOTA: Los resultados se presentan como media geométrica de las valoraciones Ab anti-CSP procedentes de grupos de ratones de dos experimentos y sus límites de confianza de 95 %.
    Figura 23: Expresión ex vivo de IL-2 y/o gramma IFN por medio de células T CD4 y T CD8 específicas de HBs
    Figura 25: Respuesta inmuntaria mediada por células en ratones tras inmunización con vacuna anti-gripal trivalente adyuvada (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes)
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11583578B2 (en) 2017-04-28 2023-02-21 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Plasmodium falciparum recombinanr xiexumapoeozoite protein compositions and method for vaccine delivery

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ569168A (en) 2005-12-22 2012-02-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Streptococcus pneumoniae polysaccharide conjugate vaccine comprising 19F-DT conjugate
CA2657989A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-21 Novartis Ag Adjuvant-sparing multi-dose influenza vaccination regimen
KR101579947B1 (ko) 2007-06-26 2015-12-28 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신
EP2034022A1 (en) 2007-09-10 2009-03-11 Universite Libre De Bruxelles Leukotriene B4 binding soluble lipocalin receptor from ixodes ricinus
EP2045263A1 (en) 2007-10-02 2009-04-08 Universite Libre De Bruxelles Identification and molecular characterisation of salivary metalloproteases expressed in the tick salivary glands
SG188813A1 (en) * 2007-12-24 2013-04-30 Id Biomedical Corp Quebec Recombinant rsv antigens
PE20110992A1 (es) 2009-02-17 2012-02-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica que comprende un antigeno del virus del dengue
GB0910046D0 (en) * 2009-06-10 2009-07-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel compositions
JP5758385B2 (ja) * 2009-06-19 2015-08-05 アイジェン インコーポレーテッド 子宮頸がんワクチン
AU2010264688A1 (en) 2009-06-24 2012-01-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Recombinant RSV antigens
KR20120093811A (ko) 2009-06-24 2012-08-23 아이디 바이오메디컬 코포레이션 오브 퀘벡 백신
HRP20220756T1 (hr) 2009-07-15 2022-09-02 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteinski pripravci rsv f i postupci za izradu istih
AU2010335970B2 (en) * 2009-12-22 2016-11-03 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic compositions
CN101791401B (zh) * 2009-12-31 2012-04-18 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鱼用浸泡疫苗多组合佐剂及其应用和使用方法
BR112012018669A2 (pt) 2010-01-27 2017-09-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Proteína rv3616c modificada, uso de uma proteína rv3616c modificada, polinucleotídeo, uso de um polinucleotídeo, composição farmacêutica, composição imunogênica, proteína de fusão, e, polipeptídeo.
JP2017071615A (ja) * 2010-10-27 2017-04-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 神経障害を治療するための免疫原性組成物及び方法
GB201101331D0 (en) * 2011-01-26 2011-03-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions and uses
MX339058B (es) * 2011-05-17 2016-05-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna contra streptococcus pneumoniae.
GB201116248D0 (en) * 2011-09-20 2011-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Liposome production using isopropanol
CN113876945A (zh) * 2011-10-06 2022-01-04 免疫疫苗技术有限公司 包括激活或增加tlr2活性的佐剂的脂质体组合物及其应用
GB201213364D0 (en) 2012-07-27 2012-09-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
PL3421051T3 (pl) * 2012-08-16 2020-10-05 Pfizer Inc. Sposoby glikokoniugacji i kompozycje
LT2928489T (lt) * 2012-12-05 2019-04-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Imunogeninė kompozicija
BE1022008B1 (fr) * 2013-08-05 2016-02-03 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions immunogenes combinees
CN105555308A (zh) 2013-10-03 2016-05-04 日东电工株式会社 粘膜疫苗组合物
RU2016109368A (ru) * 2013-10-03 2017-11-10 Нитто Денко Корпорейшн Мукозальная вакцинная композиция
TW201601750A (zh) * 2013-10-03 2016-01-16 Nitto Denko Corp 注射疫苗組合物
CN105530954A (zh) * 2013-10-03 2016-04-27 日东电工株式会社 鼻粘膜疫苗组合物
GB201318862D0 (en) * 2013-10-25 2013-12-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Calcium fluoride compositions
AU2015236106A1 (en) * 2014-03-25 2016-10-20 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Non-toxic adjuvant formulation comprising a monophosphoryl lipid a (MPLA)-containing liposome composition and a saponin
GB201405921D0 (en) * 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CN107106675A (zh) * 2014-12-18 2017-08-29 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗接种
EP3242883A4 (en) 2015-01-06 2018-10-17 ImmunoVaccine Technologies Inc. Lipid a mimics, methods of preparation, and uses thereof
KR20200038339A (ko) * 2015-09-10 2020-04-10 인벤트프라이즈 엘엘씨 다가 vlp 접합체
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
SG11201803594TA (en) 2015-11-06 2018-05-30 Adjuvance Technologies Inc Triterpene saponin analogues
GB201522068D0 (en) * 2015-12-15 2016-01-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Dried composition
BE1024160B9 (fr) 2015-12-22 2017-12-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Formulation immunogène
CN105770887A (zh) * 2016-03-04 2016-07-20 邓招红 一种用于hbv疫苗的佐剂及其制备方法
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
WO2018104313A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel process
KR102650073B1 (ko) 2017-01-31 2024-03-20 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19f 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN111315406A (zh) * 2017-09-08 2020-06-19 传染病研究所 包括皂苷的脂质体调配物及其使用方法
CA3075822A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Adjuvance Technologies, Inc. Triterpene saponin analogues
BR112020010790A2 (pt) * 2017-12-01 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. purificação da saponina
CA3083059A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Saponin extraction
WO2019175147A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccines against intra-abdominal infections
TWI820099B (zh) * 2018-03-28 2023-11-01 台灣浩鼎生技股份有限公司 新穎皂素佐劑及其評估方法
US11389519B2 (en) * 2018-06-11 2022-07-19 Inventprise, Llc Virus-like particle conjugates
EP3849521A1 (en) 2018-09-14 2021-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticle vaccine adjuvant and methods of use thereof
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
WO2020154595A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom
KR102574882B1 (ko) 2019-03-18 2023-09-04 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 대장균 o-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트의 생성 방법, 이의 조성물 및 이의 사용 방법
AR118388A1 (es) 2019-03-18 2021-09-29 Janssen Pharmaceuticals Inc Bioconjugados de antígenos-polisacáridos de e. coli, métodos de producción y métodos de utilización de los mismos
US20220273789A1 (en) 2019-07-21 2022-09-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Therapeutic viral vaccine
EP3777884A1 (en) 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CA3155424A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Staphylococcus peptides and methods of use
WO2021115410A1 (zh) * 2019-12-13 2021-06-17 南京远大赛威信生物医药有限公司 免疫刺激组合物及其用途
WO2021122551A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa S. aureus antigens and compositions thereof
WO2021144369A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Fimh mutant, compositions therewith and use thereof
JP2023516904A (ja) * 2020-02-14 2023-04-21 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー Ｈｐｖワクチン
US20230128815A1 (en) * 2020-03-23 2023-04-27 Adjuvance Technologies, Inc. Adjuvant compounds, salt forms, and formulations
BR112022020660A2 (pt) * 2020-05-05 2022-11-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dispositivo de mistura microfluídica e métodos de uso
US20230234992A1 (en) 2020-06-05 2023-07-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
TWI810589B (zh) 2020-06-21 2023-08-01 美商輝瑞股份有限公司 人巨細胞病毒糖蛋白Ｂ（ｇＢ）多肽
JP2023544250A (ja) * 2020-09-10 2023-10-23 ザ ロチェスター ジェネラル ホスピタル インフルエンザ菌ワクチン及びその使用方法
PE20231385A1 (es) 2020-09-17 2023-09-12 Janssen Pharmaceuticals Inc Composiciones de vacunas multivalentes y usos de las mismas
CA3199937A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Sanofi Pasteur Liposomes containing tlr4 agonist, preparation and uses thereof
GB2600468A (en) 2020-10-30 2022-05-04 Excivion Ltd Adjuvant composition
CN116888140A (zh) 2021-01-12 2023-10-13 杨森制药公司 FimH突变体、其组合物及其用途
EP4032547A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Hsv1 fce derived fragements for the treatment of hsv
JP2024514074A (ja) 2021-04-01 2024-03-28 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド Ｅ．ｃｏｌｉ ｏ１８バイオコンジュゲートの産生
WO2023020994A1 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023023152A1 (en) * 2021-08-19 2023-02-23 Merck Sharp & Dohme Llc Thermostable lipid nanoparticle and methods of use thereof
US20230190920A1 (en) 2021-12-19 2023-06-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for long-lasting germinal center responses to a priming immunization
WO2023154960A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pan-pneumovirus vaccine compositions and methods of use thereof
WO2023175454A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Pfizer Inc. Methods for producing an adjuvant
CN116162173B (zh) * 2022-10-28 2024-06-04 安徽农业大学 一种GnRH6-CRM197重组蛋白去势疫苗及制备方法
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations

Family Cites Families (191)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US666843A (en) * 1900-07-02 1901-01-29 Eastman Kodak Co Spirit-level.
US3238190A (en) 1963-10-23 1966-03-01 Madaus & Co K G Fa Dr Aescin recovery
DE2921961C2 (de) 1979-05-30 1986-02-06 Santrade Ltd., Luzern/Lucerne Bohreinheit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
US4270537A (en) 1979-11-19 1981-06-02 Romaine Richard A Automatic hypodermic syringe
DD155875A1 (de) 1980-12-31 1982-07-14 Willy Nordheim Verfahren zur herstellung eines ballaststoffarmen inaktivierten influenzaimpfstoffes
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
DD211444A3 (de) 1982-08-19 1984-07-11 Saechsisches Serumwerk Verfahren zur herstellung von influenza-impfstoffen
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
DD300833A7 (de) 1985-10-28 1992-08-13 Saechsische Landesgewerbefoerd Verfahren zur herstellung von inaktivierten influenza-vollvirusimpfstoffen
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
US6222020B1 (en) 1987-01-07 2001-04-24 Imperial Cancer Research Technology Limited Antigens derived from the core protein of the human mammary epithelial mucin
WO1988005054A1 (en) 1987-01-07 1988-07-14 Imperial Cancer Research Technology Limited Probe
GB8704027D0 (en) 1987-02-20 1987-03-25 Owen Mumford Ltd Syringe needle combination
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
WO1988009797A1 (en) 1987-06-05 1988-12-15 The United States Of America, As Represented By Th Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
EP1088830A3 (en) 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
DE3734306A1 (de) * 1987-10-10 1989-04-27 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien
US4963484A (en) 1988-01-29 1990-10-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Genetically engineered polypeptides with determinants of the human DF3 breast carcinoma-associated antigen
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
FR2638359A1 (fr) 1988-11-03 1990-05-04 Tino Dalto Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau
EP0449856B1 (en) 1988-12-16 2001-09-12 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
GB8913737D0 (en) 1989-06-15 1989-08-02 Univ Birmingham A novel anti-allergy treatment
DK0414374T3 (da) 1989-07-25 1998-03-09 Smithkline Beecham Biolog Hidtil ukendte antigener og fremgangsmåder til fremstilling deraf
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
DE4005528C2 (de) 1990-02-22 1998-01-15 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
US5190521A (en) 1990-08-22 1993-03-02 Tecnol Medical Products, Inc. Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin
US5527288A (en) 1990-12-13 1996-06-18 Elan Medical Technologies Limited Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
ATE168132T1 (de) 1991-02-15 1998-07-15 Uab Research Foundation Strukturgen von pneumokokken-protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
GB9113809D0 (en) 1991-06-26 1991-08-14 Cancer Res Campaign Tech Papillomavirus l2 protein
AU651727B2 (en) 1991-07-19 1994-07-28 Csl Limited Papilloma virus vaccine
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
SE9102652D0 (sv) 1991-09-13 1991-09-13 Kabi Pharmacia Ab Injection needle arrangement
EP0614465B1 (en) 1991-11-16 1999-03-17 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. HYBRID PROTEIN BETWEEN CS FROM PLASMODIUM AND HBsAG
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
DE122007000098I1 (de) 1992-06-25 2008-03-27 Papillomavirus vakzine
ES2108278T3 (es) * 1992-06-25 1997-12-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna con coadyuvantes.
DE69232265T2 (de) 1992-06-25 2002-08-08 City Of Hope, Duarte Induktion von cytolytischen t-lymphocyten mit polypeptiden des cytomegalievirus
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
PT1618888E (pt) 1993-03-09 2011-04-08 Univ Rochester Produção de proteína da cápside de vírus de papiloma humano e partículas semelhantes a vírus
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
WO1994021292A1 (en) 1993-03-23 1994-09-29 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a
ES2185658T3 (es) 1993-05-18 2003-05-01 Univ Ohio State Res Found Vacuna para la otitis media.
US5744144A (en) 1993-07-30 1998-04-28 University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
EP0720485B1 (en) 1993-09-22 2003-11-19 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
BE1007535A3 (nl) 1993-09-24 1995-07-25 Innovative Sputtering Tech Gelaagde metaalstructuur.
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
GB9409962D0 (en) 1994-05-18 1994-07-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
CA2202090C (en) 1994-10-07 2012-04-17 Lutz Gissmann Papilloma virus-like particles, fusion proteins as well as processes for their production
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
WO1996026277A1 (en) 1995-02-24 1996-08-29 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
IL117459A (en) 1995-03-22 2005-11-20 Merck & Co Inc Dna encoding human papillomavirus type 18
US20030219453A1 (en) * 1998-03-19 2003-11-27 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Vaccines
US20010053365A1 (en) * 1995-04-25 2001-12-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines
GB9620795D0 (en) * 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5688267A (en) * 1995-05-01 1997-11-18 Ep Technologies, Inc. Systems and methods for sensing multiple temperature conditions during tissue ablation
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5668267A (en) 1995-05-31 1997-09-16 Washington University Polynucleotides encoding mammaglobin, a mammary-specific breast cancer protein
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
KR19990022742A (ko) 1995-06-07 1999-03-25 샤르레 아. 테시에르 스트렙토코커스 속 유래의 hsp70 계열의 쇼크 단백질
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5997881A (en) 1995-11-22 1999-12-07 University Of Maryland, Baltimore Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
DE69735715T2 (de) 1996-05-01 2007-03-29 The Rockefeller University Cholin-bindendes Protein, welches als gegen Pneumokokken gerichtetes Vakzin verwendet wird
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
JP2000514308A (ja) 1996-08-16 2000-10-31 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
EP0942983B2 (en) 1996-10-31 2014-09-10 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines
CA2269636A1 (en) 1996-11-12 1998-05-22 The Regents Of The University Of Minnesota C3 binding protein of streptococcus pneumoniae
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
WO1998033923A1 (en) 1997-01-30 1998-08-06 Imperial College Of Science, Technology & Medicine MUTANT msbB or htrB GENES
DE69831222T2 (de) 1997-02-25 2006-07-13 Corixa Corp., Seattle Verbindungen zur immundiagnose von prostatakrebs und deren verwendung
JP3036686B2 (ja) 1997-02-27 2000-04-24 政夫 高橋 冠状動脈のバイパス手術に用いる血管吻合部の止血保持装置
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
PL190237B1 (pl) * 1997-04-01 2005-11-30 Corixa Corp Kompozycja adiuwantowa, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji adiuwantowej oraz zastosowanie
ZA982968B (en) 1997-04-09 1998-10-27 Corixa Corp Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
US6130043A (en) 1997-05-02 2000-10-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
ATE380867T1 (de) 1997-06-03 2007-12-15 Sanofi Pasteur Ltd Lactoferrinrezeptorgen von moraxella
GB9712347D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
KR100619350B1 (ko) 1997-07-21 2006-09-05 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물
US5928215A (en) * 1997-08-14 1999-07-27 Becton, Dickinson And Acompany Syringe filling and delivery device
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1009382B1 (en) * 1997-09-05 2003-06-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
ATE333501T1 (de) 1997-09-05 2006-08-15 Medimmune Inc Methode zur in vitro auseinander- und wiederzusammensetzung von papillomavirus virus- ähnlichen tielchen (vlps)
CN1291233A (zh) 1997-09-24 2001-04-11 美国明尼苏达州大学 来自肺炎链球菌之人类补体c3降解蛋白酶
CA2305643A1 (en) 1997-09-26 1999-04-22 Corixa Corporation Murine model for human carcinoma
WO1999033869A2 (en) 1997-12-24 1999-07-08 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of breast cancer and methods for their use
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
SI1659178T1 (sl) 1998-02-05 2010-07-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Postopek za čiščenje ali proizvodnjo MAGE proteina
US20020039584A1 (en) 1998-02-20 2002-04-04 Medigene Ag Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
ATE461709T1 (de) 1998-04-07 2010-04-15 Medimmune Llc Choline-bindende proteine derivate aus pneumokoken als impfstoff
WO1999051188A2 (en) 1998-04-07 1999-10-14 St. Jude Children's Research Hospital A polypeptide comprising the amino acid of an n-terminal choline binding protein a truncate, vaccine derived therefrom and uses thereof
IL138809A0 (en) 1998-04-07 2001-10-31 Corixa Corp Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and pharmaceutical compositions containing the same
JP2002511266A (ja) 1998-04-15 2002-04-16 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ 腫瘍関連核酸及びその使用
JP2002516251A (ja) 1998-04-23 2002-06-04 ユーエイビー リサーチ ファンデーション 肺炎球菌表面プロテインＣ（ＰｓｐＣ）のエピトープ領域およびその菌株選択、ならびにそのための使用法
GB9809683D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9810285D0 (en) 1998-05-13 1998-07-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
JP4503177B2 (ja) 1998-06-03 2010-07-14 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）由来のＢＡＳＢ０２７タンパク質およびＢＡＳＢ０２７遺伝子、抗原、抗体、ならびに使用
GB9812163D0 (en) 1998-06-05 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9812440D0 (en) 1998-06-09 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
IL140845A0 (en) 1998-07-14 2002-02-10 Corixa Corp Compositions for therapy and diagnosis of prostate cancer
GB9820002D0 (en) 1998-09-14 1998-11-04 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
IL142017A0 (en) 1998-09-24 2002-03-10 Univ Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
GB2359228A (en) 1998-11-17 2001-08-15 Schlumberger Technology Corp Transmitting information over a communication link
AU2027400A (en) 1998-11-19 2000-06-05 St. Jude Children's Research Hospital Identification and characterization of novel pneumococcal choline binding proteins, cbpg and cbpd, and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU776828B2 (en) 1998-12-21 2004-09-23 Medimmune, Llc Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
ES2348708T3 (es) 1999-01-29 2010-12-13 Corixa Corporation Proteinas de fusion de her-2/neu.
GB9904559D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
WO2000052165A2 (en) 1999-03-04 2000-09-08 Corixa Corporation Compositions and methods for breast cancer therapy and diagnosis
DE60038166T2 (de) * 1999-03-19 2009-03-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A., Rixensart Impfstoff gegen bakterielle antigene
US6245568B1 (en) 1999-03-26 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Human papilloma virus vaccine with disassembled and reassembled virus-like particles
DK1187629T3 (da) 1999-04-19 2005-01-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Adjuvanssammensætning omfattende saponin og et immunostimulerende oligonucleotid
ATE325620T1 (de) 1999-06-10 2006-06-15 Medimmune Inc Streptococcus pneumoniae proteine und impfstoffe
FR2796291B1 (fr) 1999-07-16 2001-09-21 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille munie d'un systeme de declenchement piezo-electrique
FR2796289B1 (fr) 1999-07-16 2001-08-10 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille avec injecteur a elements superposes
FR2796290B1 (fr) 1999-07-16 2001-09-14 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille fonctionnant avec un generateur d'onde de choc a travers une paroi
GB9917977D0 (en) 1999-07-30 1999-09-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918038D0 (en) 1999-07-30 1999-09-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918302D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918208D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US6139179A (en) 1999-09-03 2000-10-31 Davis-Standard Corporation Extruder screw having multi-channeled barrier section
GB9921147D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
FR2800619B1 (fr) 1999-11-05 2002-02-08 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille avec un moyen de poussee temporairement retenu
FR2802103B1 (fr) 1999-12-08 2003-10-03 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant avec entrainement du principe actif par effet tube a choc
FR2802102B1 (fr) 1999-12-08 2002-07-12 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un tube d'ejection a section constante
FR2802820B1 (fr) * 1999-12-27 2002-10-18 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant par effet tube a choc, avec maintien prealable du principe actif sur le cote
FR2804329B1 (fr) 2000-02-02 2002-12-13 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un opercule contenant le principe actif
FR2804869B1 (fr) * 2000-02-11 2002-05-17 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille pour l'injection d'un liquide contenu dans une ampoule pre-remplie
FR2805749B1 (fr) * 2000-03-01 2002-05-17 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille a deux niveaux de vitesse d'injection
FR2807946B1 (fr) 2000-04-19 2002-06-07 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant avec un chargement pyrotechnique bicomposition
FR2809626B1 (fr) 2000-05-30 2003-03-07 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille avec membrane d'isolation d'un ejecteur multiconduit
NZ553554A (en) 2000-06-20 2008-11-28 Id Biomedical Corp Streptococcus antigens
FR2810554B1 (fr) 2000-06-22 2003-05-16 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un reservoir modulable
FR2812202B1 (fr) * 2000-07-28 2002-09-13 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant par mise en compression du reservoir contenant le principe actif liquide
GB0019375D0 (en) 2000-08-07 2000-09-27 Int Centre Genetic Eng & Bio Method of polypeptide renaturation
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB0025577D0 (en) * 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
FR2815544B1 (fr) * 2000-10-23 2003-02-14 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille securisee a architecture compacte
WO2002067983A1 (en) 2001-02-23 2002-09-06 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel vaccine
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
TWI228420B (en) 2001-05-30 2005-03-01 Smithkline Beecham Pharma Gmbh Novel vaccine composition
GB0123580D0 (en) * 2001-10-01 2001-11-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP2005519990A (ja) * 2001-10-12 2005-07-07 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション イミダゾキノリン化合物を用いて免疫応答を増強するための方法および産物
US7262024B2 (en) 2001-12-20 2007-08-28 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US7026465B2 (en) 2002-02-15 2006-04-11 Corixa Corporation Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis
JP2005532067A (ja) * 2002-07-03 2005-10-27 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 刺激性免疫応答用の核酸組成物
WO2005117958A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant
GB0504436D0 (en) * 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
BRPI0609547A2 (pt) 2005-03-31 2011-10-18 Glaxosmithkline Biolog Sa composição, uso de uma composição, método para o tratamento ou prevenção de infecção por chlamydia, uso de uma ou mais proteìnas de chlamydia, de fragmentos imunogênicos das mesmas ou de polinucleotìdeos codificando os mesmos, método para o tratamento ou prevenção de infecção por chlamydia, e, método para a determinação prévia de infecção por chlamydia em um indivìduo
CA2606092A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
CN106390108B (zh) 2005-04-29 2020-09-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于预防或治疗结核分枝杆菌感染的新方法
EP1881844A2 (en) * 2005-05-19 2008-01-30 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine composition comprising b-subunit of e.coli heat labile toxin and an antigen and an adjuvant

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11583578B2 (en) 2017-04-28 2023-02-21 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Plasmodium falciparum recombinanr xiexumapoeozoite protein compositions and method for vaccine delivery

Also Published As

Publication number Publication date
KR101363879B1 (ko) 2014-02-21
AR058543A1 (es) 2008-02-13
CY1112589T1 (el) 2016-02-10
EP2364722B1 (en) 2013-11-13
EP2364722A1 (en) 2011-09-14
NZ596870A (en) 2013-06-28
DK2364720T3 (da) 2014-06-10
US10143745B2 (en) 2018-12-04
CA2633008C (en) 2019-04-30
HRP20120136T1 (hr) 2012-03-31
CN102631670A (zh) 2012-08-15
MA30023B1 (fr) 2008-12-01
TWI457133B (zh) 2014-10-21
BRPI0619795B1 (pt) 2019-09-10
KR20080079312A (ko) 2008-08-29
SG170127A1 (en) 2011-04-29
HK1157219A1 (en) 2012-06-29
EA200801307A1 (ru) 2008-12-30
EP2364720B1 (en) 2014-05-07
EP2364720A1 (en) 2011-09-14
HK1118477A1 (en) 2009-02-13
CN103861100A (zh) 2014-06-18
PL2364720T3 (pl) 2014-09-30
SG10201405533TA (en) 2014-11-27
PL1959992T3 (pl) 2012-06-29
CN103405764A (zh) 2013-11-27
EA014353B1 (ru) 2010-10-29
EA201001189A1 (ru) 2011-02-28
EA018860B1 (ru) 2013-11-29
WO2007068907A2 (en) 2007-06-21
EP2364723A1 (en) 2011-09-14
EP1959992A2 (en) 2008-08-27
NO20082472L (no) 2008-09-10
HRP20140484T1 (hr) 2014-07-04
US20170065715A1 (en) 2017-03-09
JP2013056927A (ja) 2013-03-28
AU2006325377B2 (en) 2012-02-02
JP5461015B2 (ja) 2014-04-02
WO2007068907A3 (en) 2007-08-09
AU2006325377A1 (en) 2007-06-21
DK1959992T3 (da) 2012-04-23
ATE542543T1 (de) 2012-02-15
PT2364720E (pt) 2014-06-24
IL229521A0 (en) 2013-12-31
BRPI0619795B8 (pt) 2021-05-25
CY1115308T1 (el) 2017-01-04
EP2364721A1 (en) 2011-09-14
ES2444623T3 (es) 2014-02-26
IL191703A (en) 2013-12-31
US20110206758A1 (en) 2011-08-25
EP1959992B1 (en) 2012-01-25
CR10101A (es) 2008-09-22
DK2364724T3 (da) 2013-11-11
US10039823B2 (en) 2018-08-07
EP2364724A1 (en) 2011-09-14
EP2364724B1 (en) 2013-09-18
PT1959992E (pt) 2012-03-06
IL191703A0 (en) 2008-12-29
CR10118A (es) 2008-08-21
BRPI0619795A2 (pt) 2011-10-18
PL2364724T3 (pl) 2014-02-28
ES2378471T3 (es) 2012-04-12
CY1114864T1 (el) 2016-12-14
PT2364724E (pt) 2013-12-09
TW200730189A (en) 2007-08-16
EP2364721B1 (en) 2013-11-20
NZ568825A (en) 2012-01-12
ES2451573T3 (es) 2014-03-27
SI1959992T1 (sl) 2012-04-30
JP2009519309A (ja) 2009-05-14
EP2364723B1 (en) 2014-01-15
CA2633008A1 (en) 2007-06-21
ES2479165T3 (es) 2014-07-23
ES2436645T3 (es) 2014-01-03
SI2364720T1 (sl) 2014-07-31
US20080279926A1 (en) 2008-11-13
MY145943A (en) 2012-05-31
HRP20131057T1 (hr) 2013-12-06
SI2364724T1 (sl) 2013-12-31
PE20071098A1 (es) 2007-11-07

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