EA018860B1 - Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант - Google Patents
Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант Download PDFInfo
- Publication number
- EA018860B1 EA018860B1 EA201001189A EA201001189A EA018860B1 EA 018860 B1 EA018860 B1 EA 018860B1 EA 201001189 A EA201001189 A EA 201001189A EA 201001189 A EA201001189 A EA 201001189A EA 018860 B1 EA018860 B1 EA 018860B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- composition
- adjuvant
- vaccine
- influenza
- antigen
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 508
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title claims abstract description 360
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 title claims abstract description 65
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 title claims abstract description 63
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 233
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 310
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 310
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 310
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 107
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 96
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 144
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 142
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 60
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 54
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 30
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims description 25
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims description 25
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims description 25
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical class O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims description 10
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 8
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 6
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 claims description 5
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 134
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 121
- 241001092142 Molina Species 0.000 abstract 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 abstract 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 abstract 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 192
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 141
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 103
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 99
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 83
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 81
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 72
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 70
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 70
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 70
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 description 70
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 69
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 69
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 68
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 66
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 63
- 230000004044 response Effects 0.000 description 61
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 59
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 59
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 53
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 49
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 43
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 42
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 42
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 41
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 39
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 37
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 37
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 37
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 36
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 35
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 34
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 31
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 23
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 21
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 20
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 20
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 20
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 20
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 20
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 20
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 19
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 18
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 18
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 17
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 17
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 16
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 15
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 15
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 15
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 14
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 14
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 12
- -1 such as E7 Proteins 0.000 description 12
- 108091016312 choline binding proteins Proteins 0.000 description 11
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 10
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 10
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 10
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 9
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 9
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 9
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 9
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 9
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 8
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 8
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 8
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 7
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 6
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 5
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 5
- 235000009421 Myristica fragrans Nutrition 0.000 description 5
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 5
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 5
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 5
- 238000011869 Shapiro-Wilk test Methods 0.000 description 5
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 5
- 239000001115 mace Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 5
- 240000004507 Abelmoschus esculentus Species 0.000 description 4
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 4
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 3
- 241000270299 Boa Species 0.000 description 3
- 101100309570 Caenorhabditis elegans let-765 gene Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010065838 Middle ear inflammation Diseases 0.000 description 3
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 102100035181 Plastin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 101150078331 ama-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 3
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 3
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 108010049148 plastin Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 3
- 229940126581 whole-virion vaccine Drugs 0.000 description 3
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YIWGJFPJRAEKMK-UHFFFAOYSA-N 1-(2H-benzotriazol-5-yl)-3-methyl-8-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carbonyl]-1,3,8-triazaspiro[4.5]decane-2,4-dione Chemical compound CN1C(=O)N(c2ccc3n[nH]nc3c2)C2(CCN(CC2)C(=O)c2cnc(NCc3cccc(OC(F)(F)F)c3)nc2)C1=O YIWGJFPJRAEKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WFZFMHDDZRBTFH-CZEFNJPISA-N 2-[(e)-2-(5-carbamimidoyl-1-benzofuran-2-yl)ethenyl]-1-benzofuran-5-carboximidamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.NC(=N)C1=CC=C2OC(/C=C/C=3OC4=CC=C(C=C4C=3)C(=N)N)=CC2=C1 WFZFMHDDZRBTFH-CZEFNJPISA-N 0.000 description 2
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 2
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-3-carbazolamine Chemical compound NC1=CC=C2N(CC)C3=CC=CC=C3C2=C1 OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 2
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 2
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 102100021257 Beta-secretase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710164918 Choline-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- IELOKBJPULMYRW-NJQVLOCASA-N D-alpha-Tocopheryl Acid Succinate Chemical compound OC(=O)CCC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C IELOKBJPULMYRW-NJQVLOCASA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 206010018072 General signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 206010060891 General symptom Diseases 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 101000894895 Homo sapiens Beta-secretase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 2
- 102100034872 Kallikrein-4 Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 2
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101710203379 Outer membrane porin C Proteins 0.000 description 2
- 101710160101 Outer membrane protein C Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 2
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 2
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 2
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940099418 d- alpha-tocopherol succinate Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 2
- 229940011399 escin Drugs 0.000 description 2
- 229930186222 escin Natural products 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 2
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 102000022382 heparin binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091012216 heparin binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 2
- 108010024383 kallikrein 4 Proteins 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229960001226 live attenuated influenza Drugs 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 2
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 229940070741 purified protein derivative of tuberculin Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 229940031351 tetravalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJFVSSZAOYLHEE-UHFFFAOYSA-N 2,3-di(dodecanoyloxy)propyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCC IJFVSSZAOYLHEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJNWCIAPVGRBHO-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl-dimethyl-[(oxo-$l^{5}-phosphanylidyne)methyl]azanium Chemical group OCC[N+](C)(C)C#P=O NJNWCIAPVGRBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Substances OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 241000157282 Aesculus Species 0.000 description 1
- 101710105077 Agglutinin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001182632 Akko Species 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000605281 Anaplasma phagocytophilum Species 0.000 description 1
- 235000019737 Animal fat Nutrition 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 206010002869 Anxiety symptoms Diseases 0.000 description 1
- 101100214578 Arabidopsis thaliana 3MMP gene Proteins 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710131520 B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100026346 Brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 101800001542 Cholecystokinin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102400000887 Cholecystokinin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 241000511343 Chondrostoma nasus Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 101710116895 DNA-binding protein H-NS Proteins 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N Endothion Chemical compound COC1=COC(CSP(=O)(OC)OC)=CC1=O YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- 101100406392 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) omp26 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 101000766212 Homo sapiens Brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001095815 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RING2 Proteins 0.000 description 1
- 101100508103 Homo sapiens IDE gene Proteins 0.000 description 1
- 101001057193 Homo sapiens Membrane-associated guanylate kinase, WW and PDZ domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000904196 Homo sapiens Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Proteins 0.000 description 1
- 101000740048 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase BAP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 206010022061 Injection site erythema Diseases 0.000 description 1
- 206010022066 Injection site haematoma Diseases 0.000 description 1
- 206010053425 Injection site swelling Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101150043375 Krt39 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 101000740049 Latilactobacillus curvatus Bioactive peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000874268 Latilactobacillus curvatus Bioactive peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 101710155913 Major envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000596280 Metopa Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 229940125585 NDV-HXP-S Drugs 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100024019 Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- 206010035742 Pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 101710120463 Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710132617 Protein B1 Proteins 0.000 description 1
- 101710132701 Protein L1 Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101710201576 Putative membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101100453295 Rattus norvegicus Krt12 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 101710170630 Ribonucleoside-diphosphate reductase 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 101000999689 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 11) Transcriptional regulator ICP22 homolog Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000003639 Student–Newman–Keuls (SNK) method Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 102000057032 Tissue Kallikreins Human genes 0.000 description 1
- 108700022175 Tissue Kallikreins Proteins 0.000 description 1
- 102000010912 Transferrin-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062476 Transferrin-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 101150077399 UBP16 gene Proteins 0.000 description 1
- HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N UNPD88870 Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)=CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037587 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase BAP1 Human genes 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N Vitamin D2 Natural products C1CCC2(C)C(C(C)C=CC(C)C(C)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229940076810 beta sitosterol Drugs 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940032077 cervical cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000004643 cyanate ester Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005661 deetherification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 210000000852 deltoid muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960004132 diethyl ether Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004993 emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000249 enterotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002242 enterotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002061 ergocalciferol Drugs 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011832 ferret model Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010181 horse chestnut Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- ARRNBPCNZJXHRJ-UHFFFAOYSA-M hydron;tetrabutylazanium;phosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC ARRNBPCNZJXHRJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000011246 intracellular protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000003866 lung sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940041323 measles vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940047091 other immunostimulants in atc Drugs 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229940031999 pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940124733 pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960001973 pneumococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012899 standard injection Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 229940032091 stigmasterol Drugs 0.000 description 1
- HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N stigmasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N 0.000 description 1
- 235000016831 stigmasterol Nutrition 0.000 description 1
- BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N stigmasterol Natural products CCC(C=CC(C)C1CCCC2C3CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N taurodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229960000172 trivalent influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 208000009421 viral pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 1
- 235000001892 vitamin D2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011653 vitamin D2 Substances 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 150000003772 α-tocopherols Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
- A61K39/1045—Moraxella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10111—Atadenovirus, e.g. ovine adenovirus D
- C12N2710/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16771—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Согласно настоящему изобретению предложена доза для человека иммуногенной композиции, содержащей антиген или антигенный препарат в комбинации с адъювантом, содержащим иммунологически активную сапониновую фракцию, выделенную из коры Quillaja saponaria molina и представленную в форме липосомы, и липополисахарид, где указанная сапониновая фракция и указанный липополисахарид присутствуют в указанной дозе для человека на уровне ниже 30 мкг. Согласно настоящему изобретению также предложена адъювантная композиция в объеме, подходящем для дозы для человека, содержащая 1-30 мкг липополисахарида и 1-30 мкг иммунологически активной сапониновой фракции, представленной в форме липосомы.
Description
Область техники
Изобретение относится к улучшенным вакцинным композициям, способам их изготовления и их применению в медицине. В частности, данное изобретение относится к адъювантным вакцинным композициям, где адъювант представляет собой липосомную композицию, содержащую сапонин и липополисахарид. Кроме того, настоящее изобретение относится к противогриппозным вакцинным композициям и режимам вакцинации с целью иммунизации против заболевания гриппом.
Предшествующий уровень техники
Потребность в новых композициях или вакцинах с повышенной иммуногенностью существует всегда. В качестве одной из стратегий использовали адъюванты с целью изучения и усиления иммунного ответа, вызванного любым данным антигеном.
Липополисахариды (ГР8) представляют собой основную поверхностную молекулу и располагаются исключительно во внешнем слое наружной мембраны грамотрицательных бактерий. ГР8 препятствуют деструкции бактерий под действием сывороточных комплементов и фагоцитарных клеток и вовлечены в адгезию при колонизации. ГР8 представляют собой группу родственных по структуре сложных молекул приблизительно размером 10000 дальтон (Да) и состоят из трех ковалентно связанных областей:
(1) О-специфическая полисахаридная цепь (О-антиген) на внешней области;
(2) коровая олигосахаридная центральная область;
(3) липид А - лежащая глубоко внутри область, которая служит в качестве гидрофобного якоря, она содержит глюкозаминовые дисахаридные единицы, несущие жирные кислоты с длинной цепью.
Было показано, что биологические активности ГР8, такие как летальная токсичность, пирогенность и адъювантность, связаны с группировкой липида А. И наоборот, иммуногенность ассоциируется с Оспецифическим полисахаридным компонентом (О-антиген). Давно известно, что как ЬР8, так и липид А обладают сильными адъювантными эффектами, но высокая токсичность этих молекул мешает их применению в вакцинных композициях. Поэтому было сделано значительное усилие по снижению токсичности ГР8 или липида А с одновременным сохранением их адъювантности.
Мутант К595 8а1топе11а ιηίπποβοΐη был выделен в 1966 г. из культуры родительского гладкого штамма (БибегЦх е! а1. 1966 Апп. N. Υ. Асаб. 8с1. 133: 349-374). Отобранные колонии повергали скринингу на чувствительность к лизису набором фагов и для следующего исследования отбирали только те колонии, которые демонстрировали узкий диапазон чувствительности (чувствительны только к одному или двум фагам). Эта работа привела к выделению сильно шероховатого мутантного штамма, который оказался дефектен в отношении биосинтеза ЬР8 и был назван 8. Ш1ппево1а К595.
По сравнению с другими ЬР8 ЬР8, продуцируемые мутантом 8. 1шппе5о1а К595, имеют относительно простую структуру:
(1) они не содержат О-специфическую область - свойство, отвечающее за изменение от гладкого фенотипа дикого типа к мутантному шероховатому фенотипу и приводящее к потере вирулентности;
(2) коровая область является очень короткой - это свойство увеличивает чувствительность штамма к ряду химических реагентов;
(3) группировка липида А значительно ацилирована, до 7 жирных кислот включительно.
4'-Монофосфорил-липид А (МРЬ), который может быть получен кислотным гидролизом ЬР8, эстрагированного из сильно шероховатого мутантного штамма грамотрицательных бактерий, сохраняет адъювантные свойства ЬР8, демонстрируя токсичность, сниженную более чем в 1000 раз (что измерено с использованием летальной дозы на куриных эмбрионах) (1ойпвоп е! а1. 1987 Кеу. 1пГес1. Όίβ. 9 8ирр1.: 8512-8516). Обычно ЬР8 кипятят с обратным холодильником в растворах минеральной кислоты средней силы (например, 0,1 М НС1) в течение периода времени приблизительно 30 мин. Этот способ приводит к дефосфорилированию по положению 1, декарбоксилированию по положению 6' и получению МРЬ.
3-О-Деацилированный монофосфориллипид А (3Э-МРБ). который может быть получен мягким щелочным гидролизом МРЬ, обладает еще более сниженной токсичностью вновь с сохранением адъювантности, см. и8 4912094 (К1Ы 1штипосйет1са15). Щелочной гидролиз обычно проводят в органическом растворителе, таком как смесь хлороформ/метанол, путем насыщения водным раствором слабого основания, такого как 0,5 М карбонат натрия, при рН 10,5.
Дополнительная информация по получению 3Э-МРБ доступна, например, в И8 4912094 и \νϋ 02/078637 (Сопха Сотрогабоп).
Сапонины Ош11а)а представляют собой смесь тритерпеновых гликозидов, экстрагированных из коры дерева Ош11а)а варопайа. Неочищенные сапонины интенсивно применяют в качестве адъювантов в ветеринарии. 0ш1-А представляет собой частично очищенный водный экстракт содержащего сапонин Ош11а)а материала. 0821 представляет собой очищенную с использованием НРЬС нетоксичную фракцию 0ш1 А, и способ его получения описан (как для 0А21) в патенте США № 5057540.
В качестве примера были разработаны противогриппозные вакцины и вакцины против вируса папилломы человека (НРУ) с адъювантами.
Вирус гриппа является одним из наиболее распространенных в мире вирусов, поражающих как людей, так и домашний скот. Грипп приводит к экономическому бремени, заболеваемости и даже смертности, которые являются значительными.
- 1 018860
Вирус гриппа представляет собой заключенный в оболочку РНК-содержащий вирус с размером частицы приблизительно 125 нм в диаметре. По существу, он состоит из внутреннего нуклеокапсида или сердцевины из рибонуклеиновой кислоты (РНК), ассоциированной с нуклеопротеином, окруженного вирусной оболочкой с бислойной липидной структурой и внешними гликопротеинами. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из матриксных белков, а внешний слой - главным образом из липидного материала хозяина.
Вирус гриппа содержит два поверхностных антигена - гликопротеины нейраминидазу (ΝΑ) и гемагглютинин (НА), которые находятся в виде шипов длиной 10-12 нм на поверхности частиц. Эти поверхностные белки, в частности гемагглютинин, определяют антигенную специфичность подтипов вируса гриппа.
Эти поверхностные антигены постепенно, иногда быстро, подвергаются некоторым изменениям, приводящим к антигенному разнообразию вируса гриппа. Эти антигенные изменения, называемые дрейф и шифт, являются непредсказуемыми и могут оказывать сильное воздействие с иммунологической точки зрения, поскольку они в конечном счете приводят к появлению новых штаммов вируса гриппа, что позволяет вирусу ускользать от иммунной системы и вызывать хорошо известные, почти ежегодные эпидемии.
Штаммы вируса гриппа, которые каждый сезон подлежат включению в противогриппозную вакцину, определяются Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в содружестве с национальными службами здравоохранения и производителями вакцин.
НА представляет собой наиболее важный антиген в определении серологической специфичности разных штаммов вируса гриппа. Этот белок 75-80 кДа содержит многочисленные антигенные детерминанты, некоторые из которых находятся в участках, последовательности которых различаются у разных штаммов (штамм-специфические детерминанты), а другие - в участках, являющихся общими для многих молекул НА (общие детерминанты).
Вирусы гриппа являются причиной эпидемий почти каждую зиму с уровнями заболеваемости для вируса типа А или В до 40% в течение шестинедельного периода. Гриппозная инфекция вызывает различные болезненные состояния: от бессимптомной инфекции через слабую инфекцию верхних дыхательных путей до тяжелой вирусной пневмонии. Обычные эпидемии гриппа вызывают увеличение случаев пневмонии и заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствует увеличение частоты госпитализации или смертности. Тяжесть заболевания определяется главным образом возрастом реципиента, его иммунным статусом и местом инфекции.
Пожилые люди 65 лет и старше особенно уязвимы, с ними связывают 80-90% всех случаев ассоциированной с гриппом смерти в развитых странах. Индивидуумы с хроническими заболеваниями также скорее всего будут испытывать такие осложнения. Маленькие дети также могут страдать тяжелым заболеванием. Поэтому эти группы особенно нуждаются в защите. Кроме этих групп риска службы здравоохранения также рекомендуют вакцинировать здоровых взрослых людей, которые находятся в контакте с пожилыми людьми.
Вакцинация играет критическую роль в регулировании ежегодных эпидемий гриппа. Доступные в настоящее время противогриппозные вакцины представляют собой либо инактивированную, либо живую аттенуированную противогриппозную вакцину (Дц-вакцину). В состав инактивированных Ди-вакцин входят три возможные формы антигенного препарата: инактивированный цельный вирус, субвирионы, когда очищенные вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для солюбилизации липидной оболочки (так называемая сплит-вакцина), или очищенные НА и ΝΑ (субъединичная вакцина). Эти инактивированные вакцины вводят внутримышечно (в/м) или интраназально (и/н).
Противогриппозные вакцины всех видов обычно представляют собой трехвалентные вакцины. Как правило, они содержат антигены двух штаммов вируса гриппа А и одного штамма вируса гриппа В. Стандартная 0,5-мл инъекционная доза в большинстве случаев содержит 15 мкг антигенного компонента гемагглютинина из каждого штамма, как измерено простой радиальной иммунодиффузией (8КЭ) (1.М. \Уоой с1 а1.: Ап ппргоусй кшДс гай1а1 1ттипойТТикюп 1сс11пк|ис Тог 1Пс аккау оТ шПиспха йастадд1иДшп апйдсп: айар!аДоп Тог ро!спсу ййсттшайоп оТ 1пасДуа1сй \\!ю1с νίπικ апй кнЬипк уассшек. 1. Βΐο1. 81апй. 5 (1977) 237-247; 1.М. \Уоой с1 а1., 1п1етпаДопа1 со11аЬогаДуе к!лйу оТ К1пд1с гай1а1 йТТлкюп апй 1ттипое1сс1горДогек1к 1сс11пк|иск Тог 1Пс аккау оТ йастадд1ийшп апйдсп оТ тПиспха νίιυκ. 1. Вю1. 81апй. 9 (1981) 317330).
Доступные в настоящее время противогриппозные вакцины считаются безопасными для всех возрастных групп (Ис Эопа1о с! а1. 1999, Уассшс, 17, 3094-3101). Однако имеется мало указаний на то, что существующие противогриппозные вакцины работают у маленьких детей в возрасте до двух лет. Кроме того, приведенные в работах коэффициенты эффективности вакцин в предупреждении типичного подтвержденного гриппозного заболевания составляют 23-72% для пожилых людей, что значительно ниже коэффициентов эффективности 60-90%, приведенных для более молодых взрослых людей (Соуаей. 1994, 1. Ат. Мей. Аккос, 21, 166-1665; Сгокк, 1995, Апп. 1п!сгп. Мей. 123, 523-527). Показано, что эффективность противогриппозной вакцины коррелирует с сывороточными титрами антител, ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ), к данному вирусному штамму, и в нескольких исследованиях обнаружено, что
- 2 018860 более пожилые люди демонстрируют более низкие ΗΙ-титры после иммунизации вирусом гриппа, чем более молодые взрослые (Мигакко, 2002, Ехрепшеп1а1 дегоп!о1о§у, 37, 427-439).
Следовательно, все еще существует потребность в новых вакцинах с повышенной иммуногенностью. Композиция вакцинного антигена с высокоэффективными адъювантами представляет собой возможный подход к усилению иммунных ответов на субвирионные антигены.
Субъединичная противогриппозная вакцина с адъювантом МЕ59 в форме эмульсии типа масло-вводе имеется в продаже и продемонстрировала свою способность индуцировать более высокий титр антител, чем титр, полученный с использованием безадъювантной субъединичной вакцины (Эе Эопа1о е! а1. 1999, Уассше, 17, 3094-3101). Однако в более поздней публикации та же самая вакцина не продемонстрировала улучшенный профиль по сравнению с безадъювантной сплит-вакциной (Ршд-ВагЬега е! а1., 2004, Уаееше, 23, 283-289).
В порядке пояснения, во время межпандемических периодов циркулируют вирусы гриппа, которые родственны вирусам предшествующей эпидемии. Эти вирусы распространяются среди людей с разными уровнями иммунитета к инфекциям, полученного в предшествующий период жизни. Такая циркуляция в течение периода обычно 2-3 лет стимулирует отбор новых штаммов, которые изменились в достаточной степени для того, чтобы вновь вызвать эпидемию у населения в целом; этот процесс обозначается термином антигенный дрейф. Дрейфующие варианты могут оказывать разные воздействия в разных сообществах, регионах, странах или континентах в течение какого-либо одного года, однако через несколько лет их суммарное воздействие часто будет аналогичным. Другими словами, пандемия гриппа имеет место тогда, когда появляется новый вирус гриппа, против которого у человеческой популяции нет иммунитета. Обычные эпидемии гриппа вызывают увеличение случаев пневмонии и заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствует увеличение коэффициентов госпитализации или смертности. Пожилые люди или люди с хроническими заболеваниями почти наверняка будут подвержены таким осложнениям, а маленькие дети также могут страдать тяжелым заболеванием.
С непредсказуемыми интервалами возникают новые вирусы гриппа с подтипом ключевого поверхностного антигена, представляющего собой гемагглютинин, полностью отличающимся от подтипа в штаммах, циркулирующих в предыдущем сезоне. И здесь, полученные антигены могут отличаться на 2050% от соответствующего белка штаммов, которые ранее циркулировали среди людей. Это может приводить к ускользанию вируса от иммунитета населения и установлению пандемий. Это явление названо антигенным шифтом. Полагают, что, по меньшей мере, в прошлом пандемии происходили тогда, когда вирус гриппа из разных видов, как, например, птичий вирус гриппа или вирус гриппа свиньи, пересекал видовой барьер. Если такие вирусы обладают способностью распространяться от субъекта к субъекту, то они могут распространиться по всему миру в пределах от нескольких месяцев до года, что приводит к пандемии. Например, в 1957 г. (пандемия азиатского гриппа (Лиа Е1и)) вирусы подтипа Η2Ν2 вытеснили вирусы Η1Ν1, которые циркулировали в человеческой популяции, по меньшей мере, с 1918 г., когда впервые был выделен данный вирус. Н2 НА и N2 ΝΑ подвергались антигенному дрейфу в промежутке между 1957 и 1968 гг. до тех пор, пока НА не был вытеснен в 1968 г. (пандемия гонгконгского гриппа (Нопд-Копд Е1и)) в результате появления подтипа вируса гриппа Η3Ν2, после чего N2 ΝΑ продолжал дрейфовать вместе с Н3 НА ^акаДша е! а1., 1991, Ер1бешю1. 1пТес1. 106, 383-395).
Свойствами штамма вируса гриппа, которые делают его способным вызывать вспышку пандемии, являются следующие: он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином штаммов, циркулирующих в настоящий момент, что может сопровождаться или не сопровождаться изменением в подтипе нейраминидазы; он обладает способностью передаваться горизонтально в человеческой популяции; и он является патогенным для людей. Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не проявлялся в человеческой популяции в течение продолжительного периода времени, возможно, в течение нескольких десятилетий, как, например, Н2. Или же он может представлять собой гемагглютинин, не циркулировавший в человеческой популяции раньше, например, Н5, Н9, Н7 или Н6, которые обнаружены у птиц. В любом случае большинство, или по меньшей мере большая часть популяции, или даже вся популяция раньше не сталкивалась с данным антигеном и является иммунологически наивной по отношению к нему.
Папилломавирусы представляют собой небольшие ДНК-содержащие онкогенные вирусы, обладающие высокой видовой специфичностью. К настоящему времени описано более 100 индивидуальных генотипов папилломавирусов человека (ПРУ). Как правило, ΗΡν специфичны либо к поверхности кожи (например, ΗΡν-1 и -2), либо к поверхностям слизистых оболочек (например, ΗΡν-6 и -11), и обычно вызывают образование доброкачественных опухолей (бородавок), которые существуют в течение нескольких месяцев или лет. Такие доброкачественные опухоли могут причинять беспокойство индивидуумам, однако, за некоторыми исключениями, они не представляют угрозы для жизни.
Некоторые ΗΡν также ассоциированы с видами рака. Очень сильной положительной связью между ΗΡν и раком человека является связь, существующая между ΗΡν-16 и ΗΡν-18 и цервикальной карциномой. Цервикальный рак представляет собой самое распространенное злокачественное новообразование в развивающихся странах, и каждый год в мире регистрируется приблизительно 500000 новых случаев. В настоящее время технически возможно активно бороться с первичными инфекциями ΗΡν-16 и даже с
- 3 018860 установленными видами НРУ-16-содержащего рака, используя вакцины. Для обзора перспектив профилактической и терапевтической вакцинации против НРУ-16 см. Сакоп 1., Сйп. 1тшипо1йег., 1994, 1(4), 293-306, и Надепекее М.Е., [пГесНопк ίη МебШпе, 1997, 14(7), 555-556, 559-564.
Несмотря на наличие небольших вариаций, все описанные геномы НРУ имеют по меньшей мере восемь ранних генов, от Е1 до Е8, и два поздних гена Ь1 и Ь2. В дополнение к этому, расположенный выше по течению регуляторный участок содержит регуляторные последовательности, которые, повидимому, контролируют большинство транскрипционных событий генома НРУ.
Вакцины на основе Ь1 НРУ раскрыты в АО 94/00152, АО 94/20137, АО 93/02184 и АО 94/05792. Такая вакцина может содержать антиген Ь1 в виде мономера, капсомера или вирусоподобной частицы (УЬР). Способы получения УЪР хорошо известны в данной области техники и включают подходы разборки-сборки УЪР для достижения повышенной гомогенности, например, как описано в АО 9913056 и И8 6245568. Такие частицы дополнительно могут содержать белки Ь2. Вакцины на основе Ь2 описаны, например, в АО 93/00436. Другие подходы к созданию вакцин против НРУ основаны на использовании ранних белков, таких как Е7, или слитых белков, таких как Б2-Е7.
Все еще имеется потребность в улучшенных вакцинах, особенно в случае гриппа и при конкретных пандемиях вируса гриппа и для пожилого населения или в случае НРУ-вакцин.
Адъюванты, содержащие комбинации липополисахарида и сапонинов 0ш11а_)а, были описаны ранее, например в ЕР 0671948. В этом патенте продемонстрирован сильный синергизм, когда липополисахарид (3Э-МРБ) был скомбинирован с сапонином Ош11а)а (0821). В настоящее время обнаружено, что хорошие адъювантные свойства могут быть достигнуты при использовании комбинаций липополисахарида и сапонина 0ш11а_)а в качестве иммуностимуляторов в адъювантной композиции, даже если эти иммуностимуляторы присутствуют в низком количестве в дозе для человека.
Краткое изложение сущности изобретения
В первом аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген или его антигенный препарат в комбинации с адъювантной композицией, содержащей иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры 0ш11а_)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарид.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат в комбинации с сапониновым адъювантом, представленным в форме липосомы. В конкретном воплощении этого аспекта иммуногенная композиция дополнительно содержит производное липида А, такое как 30-МРБ.
Подходящим образом сапониновый адъювант в форме липосомы согласно изобретению содержит активную фракцию сапонина, полученного из коры 0ш11а_)а каропапа тойпа, такую как 0821, и стерин, такой как холестерин, в соотношении сапонин:стерин от 1:1 до 1:100 мас./мас.
В частности, указанная иммуногенная композиция содержит антиген с 0Ό4 Т-клеточным эпитопом. Альтернативно, указанная иммуногенная композиция содержит антиген с В-клеточным эпитопом.
Изобретение также относится к применению вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры 0ш11а_)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида, в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных вирусом гриппа.
Изобретение также относится к применению антигена или антигенов вируса папилломы человека или их антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида, в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных вирусом папилломы человека.
Изобретение также относится к применению цитомегаловирусного антигена или антигенов либо их антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида, в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения цитомегаловирусной инфекции и/или заболевания.
Изобретение также относится к применению антигена или антигенов 81гер1ососспк рпеитошае либо их антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида, в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных 81гер1ососспк рпеитошае.
Изобретение также относится к применению антигена или антигенов Р1акшо6шш ГаШрагит либо их антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа, представленную в форме липосомы, и липополисахарида, в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных Р1акто6шт ГаШрагит.
Изобретение также относится к применению антигена или антигенов вируса ветряной оспы либо его антигенного препарата и адъюванта, содержащего иммунологически активную сапониновую фрак
- 4 018860 цию, полученную из коры Цш11а)а каропапа шо1ша, представленную в форме липосомы, и липополисахарида, в изготовлении иммуногенной композиции для предупреждения инфекции и/или заболевания, вызванных вирусом ветряной оспы.
В другом аспекте предложено применение (а) антигена или его антигенного препарата и (б) адъюванта, как он определен выше, в изготовлении иммуногенной композиции для индуцирования у человека по меньшей мере одного, или по меньшей мере двух, или всех показателей из следующего: (1) усиленного СБ4 Т-клеточного иммунного ответа против указанного антигена или его антигенного препарата, (2) усиленного гуморального иммунного ответа против указанного антигена или его антигенного препарата, (3) усиленного ответа В-клеток памяти против указанного антигена или его антигенного препарата.
В частности, указанным антигеном является антиген или антигенный препарат вируса гриппа, НРУ, цитомегаловируса (СМУ), вируса ветряной оспы (νζν), 8!гер!ососси5 рпеишошае или малярии, а указанным человеком является индивидум или популяция с ослабленным иммунитетом, такие как взрослый человек из группы с высоким риском, пожилой человек или ребенок в возрасте менее двух лет. В конкретном воплощении предложено применение антигена или его антигенного препарата и адъюванта, который определен в данном описании, в изготовлении иммуногенной композиции для вакцинации человека, в частности пожилого человека, против патогена, из которого происходит антиген в данной иммуногенной композиции. Конкретно, указанным антигеном является антиген или антигены либо антигенный препарат вируса гриппа, вируса папилломы человека, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, 8!гер!ососси5 рпеишошае, Р1а8шо6шш рагакйе.
Кроме того, предложен способ вакцинации, включающий доставку антигена или антигенной композиции, в частности антигена или антигенного препарата вируса гриппа или НРУ, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, 8!гер!ососси5 рпеишошае, Р1а8шо6шш рагакйе, и адъюванта, который определен выше, индивидууму или популяции, нуждающимся в этом.
В конкретном воплощении иммуногенная композиция способна индуцировать усиленный СБ4 Тклеточный иммунный ответ против указанного антигена или его антигенного препарата и, в частности, также способна индуцировать либо гуморальный иммунный ответ, либо усиленный ответ В-клеток памяти или оба ответа по сравнению с ответом, полученным с безадъювантным(ой) антигеном или антигенной композицией. Конкретно, указанный СБ4 Т-клеточный иммунный ответ включает индукцию перекрестно-реактивного СБ4 Т-хелперного ответа. Конкретно, указанный гуморальный иммунный ответ включает индукцию перекрестно-реактивного гуморального иммунного ответа.
В другом воплощении предложены способ или применение, как определено выше, для защиты против инфекции или заболевания, вызываемых патогеном, представляющим собой вариант патогена, из которого происходит антиген в иммуногенной композиции. В другом воплощении предложены способ или применение, как определено выше, для защиты против инфекций или заболевания, вызываемых патогеном, содержащим антиген, являющийся вариантом того антигена в иммуногенной композиции. В конкретном воплощении предложено применение антигена, в частности, вируса гриппа или НРУ, или его антигенного препарата, в изготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных иммуногенной композицией, содержащей антиген, в частности, вирус гриппа или НРУ, или его антигенный препарат, в комбинации с адъювантом, который приведен в данном описании. В конкретном воплощении композиция, используемая для ревакцинации, может дополнительно содержать адъювант. В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации содержит антиген, который имеет общие СБ4 Т-клеточные эпитопы с антигеном или антигенной композицией, используемыми для предшествующей вакцинации. Конкретно, иммуногенная композиция для ревакцинации содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие СБ4 Т-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или антигенным препаратом этого вируса, используемыми для первой вакцинации.
В одном из аспектов проводят ревакцинацию субъектов, которые были вакцинированы против вируса гриппа предыдущего сезона. Обычно ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первой вакцинации, предпочтительно через 8-14 месяцев, более предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев. В другом аспекте проводят ревакцинацию субъектов, которые были вакцинированы композицией, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, где по меньшей мере один штамм ассоциирован со вспышкой пандемии или может быть связан с пандемией.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа в изготовлении иммуногенной композиции, которая определена в данном описании, для защиты против инфекции вирусом гриппа, вызванной вариантным штаммом вируса гриппа.
Изобретение также относится к способу вакцинации, включающему доставку вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта, как определено в данном описании.
В другом аспекте предложен способ вакцинации отдельного человека или человеческой популяции с ослабленным иммунитетом, таких как взрослые люди из группы с высоким риском или пожилые люди, включающий введение противогриппозной иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат в комбинации с адъювантом, как определено в данном описании.
- 5 018860
В еще одном воплощении изобретения предложен способ ревакцинации людей, ранее вакцинированных противогриппозной иммуногенной композицией, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат по меньшей мере из одного из штаммов вируса гриппа в комбинации с адъювантом, как определено в данном описании, включающий введение указанному человеку иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, как с адъювантом, так и без адъюванта. Изобретение также относится к способу изготовления иммуногенной композиции, включающему комбинирование сапонинового адъюванта в форме липосомы с вирусом гриппа или его антигенным препаратом и возможно с 3И-МРЬ.
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения описаны далее в следующем подробном описании его предпочтительных воплощений.
Описание графических материалов
Фиг. 1 - схематическое представление получения препарата МРЬ.
Фиг. 2 - гуморальный ответ против различных штаммов вируса гриппа после иммунизации хорьков исследуемыми композициями: тест на ингибирование гемагглютинации (СМТ (средние геометрические титры) ± ДИ 95) до и после гетерологичного примирования (Η1Ν1 А/81оскко1т/24/90), после иммунизации (Η1Ν1 Α/Νο\ν Са1ебоп1а/20/99, Η3Ν2 А/Рапата/2007/99 и В/8каидбоид/7/97) и после гетерологичного контрольного заражения (Η3Ν2 АЖуотшд/3/2003).
Фиг. 3 - исследование на хорьках: титрование вирусов в назальных смывах после контрольного заражения (42-е сутки).
Фиг. 4 - исследование на мышах: гуморальный ответ против трех вакцинных штаммов вируса гриппа после иммунизации мышей исследуемыми композициями: тест на ингибирование гемагглютинации (ОМТ ± ДИ 95) через 21 сутки после иммунизации (Η1Ν1 Α/№\ν Са1ебоша/20/99, Η3Ν2 АЖуот1ид/3/2003 и В/Лаид8и/10/2003).
Фиг. 5 - исследование на мышах: клеточно-опосредованный иммунный ответ: Ии-специфичные ответы СИ4+ Т-клеток на 7-е сутки после иммунизации.
Фиг. 6 - исследование на мышах: СМ1 для СИ4 ответа согласно тесту все по два на пул антигенов на 0-е и 21-е сутки.
Фиг. 7 - ОМТ на 0-е и 21-е сутки для ΗΙ-антител.
Фиг. 8 - частота встречаемости местных и общих симптомов у людей (общих и с оценкой 3), наблюдаемая в течение 7-дневного периода контрольного наблюдения после иммунизации адъювантными противогриппозными композициями; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 9 - гуморальные ответы на Ь1 ИРУ 16 и 18 у мышей после иммунизации адъювантными ИРУкомпозициями; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 10 - клеточно-опосредованный иммунный ответ у мышей: окрашивание внутриклеточных цитокинов - СИ4+ Т-клетки УЪР16 и 18 после иммунизации адъювантными ВРУ-композициями; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 11 - продуцирование специфических В-клеток памяти после иммунизации адъювантными КРУ-композициями; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 12 - доклинические результаты сравнения адъювантных вакцин на основе 8. риеитошае на мышах; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 13 - анти-дВ ЕЬ18А-титры после иммунизации морских свинок адъювантной вакциной на основе дВ; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 14 - титры анти-СМУ-нейтрализующих антител после иммунизации морских свинок адъювантной вакциной на основе дВ; сравнение адъювантов, имеющих две разные концентрации иммуностимуляторов.
Фиг. 15 - анти-дВ ЕЬ18А-титры после иммунизации мышей адъювантной вакциной на основе дВ.
Фиг. 16 - титры анти-СМУ-нейтрализующих антител после иммунизации мышей адъювантной вакциной на основе дВ.
Фиг. 17 - исследование на мышах: клеточно-опосредованный иммунитет - СМУ-специфические СИ4+ и СИ8+ клетки после повторной стимуляции пулом дВ пептидов (через 7 суток после второй иммунизации).
Фиг. 18 - исследование на мышах: клеточно-опосредованный иммунитет - СМУ-специфические СИ4+ клетки после повторной стимуляции двумя разными дозировками пула дВ пептидов (через 21 сутки после второй иммунизации).
Фиг. 19 - исследование на мышах: клеточно-опосредованный иммунитет - СМУ-специфические СИ8+ клетки после повторной стимуляции двумя разными дозировками пула дВ пептидов (через 21 сутки после второй иммунизации).
Фиг. 20 - средние геометрические титры (ОМТ) антител к циркумспорозоитному белку (С8Р) после иммунизации мышей адъювантной вакциной на основе ВТ8,8; сравнение адъювантов, имеющих иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
- 6 018860
Фиг. 21 - средние геометрические титры (СМТ)антител против поверхностного антигена вируса гепатита В (НВк) после иммунизации мышей адъювантной вакциной на основе КТ8,8; сравнение адъювантов с иммуностимуляторами в двух разных концентрациях.
Фиг. 22 - экспрессия ех νίνο 1Ь-2 (интерлейкин-2) и/или 1РМ(интерферон)-гамма С8Рспецифическими СЭ4 и СЭ8 Т-клетками после иммунизации адъювантной иммуногенной композицией на основе К.Т8,8; сравнение адъювантов с иммуностимуляторами в двух разных концентрациях.
Фиг. 23 - экспрессия ех νίνο 1Ь-2 и/или ΙΡΝ-гамма НВк-специфическими СЭ4 и СЭ8 Т-клетками после иммунизации адъювантной иммуногенной композицией на основе КТ8,8; сравнение адъювантов с иммуностимуляторами в двух разных концентрациях.
Фиг. 24 - гуморальные ответы у мышей после иммунизации адъювантной трехвалентной противогриппозной сплит-вакциной (А/Νον Са1ебоша, ЛАУуотшд. В/Лапдки); иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 25 - клеточно-опосредованный иммунный ответ у мышей после иммунизации адъювантной трехвалентной противогриппозной вакциной (Α/Νο\ν Са1ебоша, ЛАУуотшд. В/Лапдки); иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 26 - доклинические результаты сравнения на мышах вакцин на основе дЕ νζν с адъювантом Л801В или Л801Е.
Фиг. 27 - титры вирусов в назальных смывах у хорьков после примирования и контрольного заражения антигенами вируса гриппа - иммунизация либо простой, либо адъювантной композициями Λ/№\ν Са1ебоп1а, ЛАУуотшд. В/Лапдки, содержащими иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 28 - мониторинг температуры тела у хорьков после примирования и контрольного заражения антигенами вируса гриппа. Иммунизация либо простой, либо адъювантной композициями .А/Νον Са1ебоша. А/^уотшд, В/Лапдки, содержащими иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 29 - анти-Н1-титры для штаммов А в трехвалентной вакцинной композиции после иммунизации и контрольного заражения антигенными препаратами вируса гриппа. Иммунизация либо простой, либо адъювантной композициями Α/№\ν Са1ебоша, А/^уошшд, В/Лапдки, содержащими иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Фиг. 30 - анти-Н1-титры для В/Лапдки и дрейфующего штамма, используемого для контрольного заражения, после иммунизации и контрольного заражения антигенными препаратами вируса гриппа. Иммунизация либо простой, либо адъювантной композициями Α/№\ν Са1ебоша, А/^уошшд, В/Лаидки, содержащими иммуностимуляторы в двух разных концентрациях.
Подробное описание
Авторы настоящего изобретения открыли, что адъювантная композиция, содержащая сапонин, представленный в форме липосомы, и липополисахарид, в которой каждый иммуностимулятор представлен на уровне, равном или ниже 30 мкг на дозу для человека, может усилить иммунные ответы на антигенный препарат, в то же самое время имея более низкую реактогенность, чем некоторые композиции предшествующего уровня техники, в которых иммуностимуляторы были представлены в более высоких уровнях на дозу для человека.
Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что противогриппозная композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом, содержащим сапонин, представленный в форме липосомы, и возможно дополнительно с производным липида А, таким как 3Ό-ΜΡΕ, способна усиливать СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ против указанного антигена или антигенной композиции по сравнению с таковым, полученным с использованием безадъювантного вируса или его антигенного препарата. Композиции с сапонином в качестве адъюванта, представленным в форме липосомы, предпочтительно используют для индукции СЭ4 Т-клеточных ответов против вируса гриппа, способных определять эпитопы вируса гриппа, представленные молекулами класса II МНС (главный комплекс гистосовместимости). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в качестве мишени эффективно воздействовать на клеточно-опосредованную иммунную систему для того, чтобы усилить иммунный ответ против гомологичных и дрейфующих штаммов вируса гриппа (после вакцинации и инфекции).
Конкретным воплощением настоящего изобретения является то, что композиции для применения в настоящем изобретении могут быть способны обеспечить у людей улучшенную серопротекцию против гриппа после ревакцинации, как оценено по числу субъектов-людей, удовлетворяющих коррелятам защиты для гриппа. Кроме того, другим конкретным воплощением является то, что композиция для применения в настоящем изобретении также будет способна индуцировать более высокий ответ В-клеток памяти после первой вакцинации субъекта-человека, и более высокий гуморальный ответ после ревакцинации по сравнению с безадъювантной композицией.
Адъювантные противогриппозные композиции согласно изобретению имеют несколько преимуществ:
1) повышенную иммуногенность: они позволят восстановить слабый иммунный ответ у пожилых людей (в возрасте старше 50 лет, обычно в возрасте старше 65 лет) до уровней, наблюдаемых у молодых людей (антительные и/или Т-клеточные ответы);
- 7 018860
2) улучшенный профиль перекрестного иммунитета: увеличенный перекрестный иммунитет против вариантных (дрейфующих) штаммов вируса гриппа;
3) они также позволят уменьшить дозировку антигена для получения аналогичного ответа, тем самым гарантируя увеличенный потенциал в чрезвычайных обстоятельствах (пандемии, например).
В другом аспекте изобретения авторы изобретения открыли, что адъювантная композиция, которая определена в данном описании, демонстрирует результаты по иммуногенности как в отношении продуцирования антител, так и в отношении частоты встречаемости после вакцинации специфичных к вирусу гриппа СЭ4, которые эквивалентны или иногда превышают результаты, полученные с применением безадъювантной вакцины. Этот эффект особенно ценен для пожилого населения и может быть достигнут при применении адъюванта, который определен в данном описании, содержащего пониженную дозу иммуностимуляторов. В дополнение к этому, показано, что симптомы реактогенности показали тенденцию к увеличению в группе получавших вакцину, дополненную адъювантом с самой высокой концентрацией иммуностимуляторов, по сравнению с группой получавших адъювантную вакцину, в которой иммуностимуляторы представлены в более низкой концентрации.
Эти полученные данные могут быть применены к другим формам тех же антигенов и к другим антигенам.
Сапониновый адъювант
Адъювантная композиция по изобретению содержит сапониновый адъювант, представленный в форме липосомы.
Особенно подходящим сапонином для применения в настоящем изобретении является Οιιίΐ А и его производные. Οιιίΐ А представляет собой препарат сапонина, выделенный из южно-американского дерева Ош11а)а заропайа шо1ша, и впервые был описан ЭаКдаагб и др. в 1974 г. (8аропш абщуаШз, АтсЫу. £ит 6|С дезат1е У1гиз£огзсйипд, Уо1. 44, 8ргшдег Уег1ад, Всг1ш р. 243-254) как обладающий адъювантной активностью. Очищенные фрагменты Цш1 А были выделены с помощью НРЬС (высокоэффективная жидкостная хроматография), что сохраняет адъювантную активность без токсичности, связанной с Ош1 А (ЕР 0362278), например 087 и 0821 (также известные как ЦА7 и ЦА21). 08-21 является природным сапонином из коры 0ш11а)а заропапа шо1ша, который индуцирует СЭ8+ цитотоксические Т-клетки (СТЬ), ТЫ-клетки и преобладающий 1дО2а антительный ответ, и является предпочтительным сапонином в контексте настоящего изобретения.
В подходящем воплощении настоящего изобретения сапониновый адъювант в иммуногенной композиции представляет собой производное с.|ш1 А заропапа шо1ша, предпочтительно иммунологически активную фракцию 0ш1 А, такую как 08-17 или 08-21, наиболее подходит 08-21. В одном из воплощений композиции по изобретению содержат иммунологически активную сапониновую фракцию, по существу, в чистой форме. Предпочтительно композиции по изобретению содержат 0821, по существу, в чистой форме, иначе говоря, чистота 0821 составляет по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%.
В конкретном воплощении 0821 предложен в своей менее реактогенной композиции, где он блокирован экзогенным стерином, таким как, например, холестерин. Существует несколько конкретных форм менее реактогенных композиций, где 0821 блокирован экзогенным холестерином. В конкретном воплощении сапонин/стерин находится в форме липосомной структуры (\УО 96/33739, пример 1). В этом воплощении липосомы соответственно содержат нейтральный липид, например фосфатидилхолин, который соответственно не является кристаллическим при комнатной температуре, например фосфатидилхолин яичного желтка, диолеоилфосфатидилхолин (ЭОРС) или дилаурил-фосфатидилхолин. Липосомы также могут содержать заряженный липид, который увеличивает стабильность структуры липосома0821 для липосом, составленных из насыщенных липидов. В этих случаях количество заряженного липида составляет соответственно 1-20% мас./мас., предпочтительно 5-10%. Соотношение стерина и фосфолипида составляет 1-50% (моль/моль), наиболее подходит 20-25%.
Подходящие стерины включают β-ситостерин, стигмастерин, эргостерин, эргокальциферол и холестерин. В одном конкретном воплощении адъювантная композиция в качестве стерина содержит холестерин. Такие стерины хорошо известны в данной области, например, холестерин описан в Мегск 1п6ех,
11-е издание, с. 341, как стерин природного происхождения, обнаруженный в животном жире.
Адъювантные композиции по изобретению, содержащие 0821 и стерин, в частности холестерин, демонстрируют пониженную реактогенность при сравнении с композициями, в которых стерин отсутствует, при сохранении адъювантного эффекта. Исследования реактогенности могут быть проведены согласно способам, описанным в \УО 96/33739. Используемый согласно изобретению стерин означает экзогенный стерин, т.е. стерин, который не является эндогенным для организма, из которого готовят антигенный препарат, а его добавляют к антигенному препарату или позже в момент изготовления композиции. Обычно стерин может быть добавлен в процессе последующего изготовления композиции антигенного препарата с сапониновым адъювантом, путем использования, например, сапонина в форме, блокированной стерином. Соответственно, экзогенный стерин приводят в ассоциацию с сапониновым адъювантом, как описано в \УО 96/33739.
Когда активной сапониновой фракцией является 0821, соотношение О821:стерин обычно будет со
- 8 018860 ставлять порядка 1:100-1:1 (мас./мас.), соответственно 1:10-1:1 (мас./мас.) и предпочтительно 1:5-1:1 (мас./мас.). Соответственно имеется избыток стерина, при этом соотношение ОБ21:стерин составляет по меньшей мере 1:2 (мас./мас.). В одном из воплощений соотношение О821:стерин равно 1:5 (мас./мас.). Удобно, когда стерином является холестерин.
Другие полезные сапонины выделены из растений Лс5си1и5 Ырросайаииш или СуорЫНа δίπιΐΐιίιιιη. Другие сапонины, описанные в литературе, включают эсцин (ексш), который был описан в Мегск шбех (12-е изд.: входной номер 3737) в виде смеси сапонинов, представленных в семенах дерева конского каштана обыкновенного, латинское название: Ле8си1и8 Ырросайаииш. Описано его выделение с использованием хроматографии и очистки (Егеб1ег, АгхпетШ1е1-Еог5с11. 4, 213 (1953)) и с использованием ионообменных смол (ЕгЬпид и др., И8 3238190). Фракции эсцина были очищены и показана их биологическая активность (УокЫка^а М., е1 а1. (Сйеш. Рйатш. Ви11. (Токуо), 1996, Аид; 44(8): 1454-1464)). Сапоалбин (§ароа1Ьш) из Сур§орЫ11а йтиШшш (В. УосЫеп е1 а1., 1968, 1. Рйатш. Ве1д., 42, 213-226) также был описан, например, в связи с образованием 18СОМ (иммуностимулирующий комплекс).
Ключевым аспектом настоящего изобретения является то, что иммунологически активный сапонин, предпочтительно представляющий собой 0821, может быть использован в более низких количествах, чем полагали ранее для оказания полезного действия, целесообразно ниже 30 мкг, например от 1 до 30 мкг, на дозу иммуногенной композиции для человека.
Следовательно, согласно изобретению предложена доза иммуногенной композиции для человека, содержащей иммунологически активный сапонин, предпочтительно 0821, на уровне 30 мкг или меньше, например, от 1 до 30 мкг.
В одном из воплощений иммуногенная композиция представлена в объеме, подходящем для дозы для человека, при этом доза иммуногенной композиции для человека содержит 0821 на уровне приблизительно 25 мкг, например 20-30 мкг, соответственно 21-29 мкг, или 22-28 мкг, или 23-27 мкг, или 24-26 мкг, или 25 мкг. В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 0821 на уровне приблизительно 10 мкг, например 5-15 мкг, соответственно 6-14 мкг, например 7-13 мкг, или 8-12 мкг, или 9-11 мкг, или 10 мкг.
В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 0821 на уровне приблизительно 5 мкг, например 1-9 мкг, или 2-8 мкг или соответственно, 3-7 мкг, или 4-6 мкг, или 5 мкг.
Подходящее количество 0821 составляет, например, любое количество из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мкг (мас./об.) на дозу иммуногенной композиции для человека.
Под термином доза для человека (или человеческая доза) понимают дозу, которая представлена в объеме, подходящем для применения человеку. Обычно он составляет от 0,3 до 1,5 мл. В одном из воплощений доза для человека равна 0,5 мл. В другом воплощении доза для человека составляет выше 0,5 мл, например 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1 мл. В другом воплощении доза для человека составляет от 1 мл до 1,5 мл. Изобретение характеризуется тем, что каждая доза для человека содержит 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, Р821.
Согласно изобретению также предложена адъювантная композиция, содержащая 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, 0821. Обычно такая адъювантная композиция будет представлена в объеме, подходящем для дозы для человека. Когда для комбинирования с жидкой формой антигенной композиции адъювант находится в жидкой форме, композиция адъювантов будет содержаться в объеме, подходящем для дозы для человека, составляющем приблизительно половину от предполагаемого конечного объема дозы для человека, например, объем 360 мкл для предполагаемой дозы для человека 0,7 мл или объем 250 мкл для предполагаемой дозы для человека 0,5 мл. Композиция адъювантов разбавляется при комбинировании с антигенной композицией с получением конечной дозы вакцины для человека. Конечный объем такой дозы несомненно будет варьировать в зависимости от первоначального объема композиции адъювантов и объема антигенной композиции, добавленной к композиции адъювантов. В альтернативном воплощении жидкий адъювант используется для повторного растворения лиофилизованной антигенной композиции. В этом воплощении объем композиции адъювантов, подходящий для дозы для человека, приблизительно равен конечному объему дозы для человека. Жидкую композицию адъювантов добавляют во флакон, содержащий лиофилизованную антигенную композицию. Конечная доза для человека может варьировать от 0,5 до 1,5 мл. В конкретном воплощении доза для человека равна 0,5 мл, в этом воплощении вакцинная композиция по изобретению будет содержать 0821 на уровне, равном или ниже 30 мкг, например 1-30 мкг, в дозе для человека 0,5 мл, кроме того в этом воплощении композиция адъювантов по изобретению будет содержать 0821 на уровне, равном или ниже 30 мкг, например 1-30 мкг, на 250 мкл композиции адъювантов или на 500 мкл композиции адъювантов в зависимости от того, предназначена ли композиция адъювантов для комбинирования с жидкой или лиофилизованной антигенной композицией соответственно.
Конкретно, при комбинировании с антигеном вируса гриппа, 0821 может быть использован, например, в количестве 1-100 мкг (мас./об.) на дозу композиции, предпочтительно в количестве 10-50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Подходящее количество 0821 равно, например, любому количеству из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
- 9 018860
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Более предпочтительно количество 0821 варьирует от 25 до 75 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Обычно доза композиции будет изменяться в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мл. Типичная вакцинная доза составляет 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1 мл. В предпочтительном воплощении конечная концентрация 50 мкг 0821 содержится в 1 мл вакцинной композиции или 25 мкг на 0,5 мл вакцинной дозы. В других предпочтительных воплощениях конечная концентрация 35,7 мкг или 71,4 мкг 0821 содержится в 1 мл вакцинной композиции. Конкретно, объем вакцинной дозы 0,5 мл содержит 25 мкг или 50 мкг 0821 на дозу.
Доза 0821 соответственно способна усиливать иммунный ответ на антиген у человека. В частности, подходящим количеством 0821 является такое, которое улучшает иммунологический потенциал композиции по сравнению с безадъювантной композицией или по сравнению с композицией, дополненной другим количеством адъюванта 0821, оставаясь при этом приемлемым с точки зрения профиля реактогенности.
Адъювант 3Ό-ΜΡΤ
Кроме того, композиция содержит дополнительный адъювант, представляющий собой липополисахарид, подходящим образом нетоксичное производное липида А, в частности монофосфориллипид А или более конкретно, 3-деацилированный монофосфориллипид Α (3Ό-ΜΡΤ).
3Ό-ΜΡΤ продается под наименованием МРЬ фирмой С1ахо8шййК1те ΒίοΙοβίοαΙδ Ν.Α. и во всем документе обозначается как МРЬ или 3Ό-ΜΡΤ. См., например, патенты США № 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094. 3Ό-ΜΡΤ стимулирует главным образом СЭ4+ Т-клеточные ответы с фенотипом ΙΡΝ-γ (ТЫ). 3Ό-ΜΡΤ может быть получен согласно способам, раскрытым в СВ 2220211 А. С химической точки зрения это смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используют небольшие частицы 3Ό-ΜΡΤ. Небольшие частицы 3Ό-ΜΡΤ имеют такой размер частиц, что их можно подвергать стерилизации фильтрованием через фильтр 0,22 мкм. Такие способы получения описаны в АО 94/21292.
Ключевым аспектом настоящего изобретения является то, что липополисахарид, предпочтительно представляющий собой 3Ό-ΜΡΤ, может быть использован в более низких количествах, чем полагали ранее для оказания полезного действия, соответственно, на уровне 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, на дозу иммуногенной композиции для человека.
Соответственно, согласно изобретению предложена доза иммуногенной композиции для человека, содержащая липополисахарид, предпочтительно 3Ό-ΜΡΤ, на уровне 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг.
В одном из воплощений доза иммуногенной композиции для человека содержит 3Ό-ΜΡΤ на уровне приблизительно 25 мкг, например 20-30 мкг, соответственно 21-29 мкг, или 22-28 мкг, или 23-27 мкг, или 24-26 мкг, или 25 мкг.
В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 3Ό-ΜΡΤ на уровне приблизительно 10 мкг, например 5-15 мкг, соответственно 6-14 мкг, например, 7-13 мкг, или 8-12 мкг, или 9-11 мкг, или 10 мкг.
В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит 3Ό-ΜΡΤ на уровне приблизительно 5 мкг, например 1-9 мкг, или 2-8 мкг или, соответственно, 3-7 мкг, или 4-6 мкг, или 5 мкг.
Подходящее количество 3Ό-ΜΡΤ равно, например, любому количеству из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мкг (мас./об.) на дозу иммуногенной композиции для человека.
В одном из воплощений объем дозы для человека равен 0,5 мл. В другом воплощении иммуногенная композиция представлена в объеме, подходящем для дозы для человека, который превышает 0,5 мл, например 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1 мл. В другом воплощении доза для человека составляет от 1 до 1,5 мл. Изобретение характеризуется тем, что каждая доза для человека содержит 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, 3Ό-ΜΡΤ.
Согласно изобретению также предложена композиция адъювантов, содержащая 30 мкг или меньше, например 1-30 мкг, 3Ό-ΜΡΤ. Обычно такая композиция адъювантов будет содержаться в объеме, подходящем для дозы для человека. Когда для комбинирования с жидкой формой антигенной композиции адъювант находится в жидкой форме, композиция адъювантов будет содержаться в объеме, подходящем для дозы для человека, составляющем приблизительно половину от предполагаемого конечного объема дозы для человека, например, объем 360 мкл для предполагаемой дозы для человека 0,7 мл, или объем 250 мкл для предполагаемой дозы для человека 0,5 мл. Композиция адъювантов разбавляется при комбинировании с антигенной композицией с получением конечной дозы иммуногенной композиции для человека. Конечный объем такой дозы несомненно будет варьировать в зависимости от первоначального объема композиции адъювантов и объема антигенной композиции, добавленной к композиции адъювантов. В альтернативном воплощении жидкая композиция адъювантов используется для растворения лиофилизованной антигенной композиции. В этом воплощении объем композиции адъювантов, подходящий для дозы для человека, приблизительно равен конечному объему дозы для человека. Жидкую компози
- 10 018860 цию адъювантов добавляют во флакон, содержащий лиофилизованную антигенную композицию. Конечная доза для человека может варьировать от 0,5 до 1,5 мл. В конкретном воплощении доза для человека составляет 0,5 мл, в этом воплощении вакцинная композиция по изобретению будет содержать уровень 3Ό-ΜΡΕ, равный или ниже 30 мкг, например 1-30 мкг, на 0,5 мл дозы для человека, кроме того, в этом воплощении композиция адъювантов по изобретению будет содержать уровень 3Ό-ΜΡΕ, равный или ниже 30 мкг, например 1-30 мкг, на 250 мкл композиции адъювантов, или на 500 мкл композиции адъювантов, в зависимости от того, предназначена ли композиция адъювантов для комбинирования с жидкой или лиофилизованной антигенной композицией соответственно.
Когда иммуногенная композиция содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, композиция адъювантов, содержащая сапонин в форме липосомы, возможно дополнительно содержит производное липида А, в частности, монофосфориллипид А или, более конкретно, 3Ό-ΜΡΕ. В этом воплощении 3ΌМРЬ может быть использован, например, в количестве 1-100 мкг (мас./об.) на дозу композиции, предпочтительно в количестве 10-50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Подходящее количество 3Ό-ΜΡΕ равно, например, любому количеству из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Более предпочтительно количество 3Ό-ΜΡΕ варьирует от 25 до 75 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Обычно доза композиции будет изменяться в диапазоне от приблизительно 0,5 мл до приблизительно 1 мл. Типичная вакцинная доза составляет 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1 мл. В одном из воплощений конечная концентрация 50 мкг 3Ό-ΜΡΕ содержится в 1 мл вакцинной композиции, или 25 мкг в 0,5 мл вакцинной дозы. В другом воплощении конечная концентрация 35,7 мкг или 71,4 мкг 3Ό-ΜΡΕ содержится в 1 мл вакцинной композиции. Конкретно, объем вакцинной дозы 0,5 мл содержит 25 мкг или 50 мкг 3Ό-ΜΡΕ на дозу.
Доза 3Ό-ΜΡΕ приемлемым образом способна усиливать иммунный ответ на антиген у человека. В частности, подходящим количеством 3Ό-ΜΡΕ является такое, которое улучшает иммунологический потенциал композиции по сравнению с безадъювантной композицией или по сравнению с композицией, дополненной другим количеством адъюванта ΜΡΕ, оставаясь при этом приемлемым с точки зрения профиля реактогенности.
Подходящими композициями по изобретению являются такие, где липосомы первоначально получают без ΜΡΕ (как описано в \УО 96/33739) и затем добавляют ΜΡΕ, приемлемо в виде небольших частиц с размером менее 100 нм или в виде частиц, которые допускают их стерилизацию фильтрованием через мембрану 0,22 мкм. Поэтому ΜΡΕ не содержится внутри мембраны везикул (известен как наружный ΜΡΕ (ΜΡΕ оиГ)). Композиции, в которых ΜΡΕ содержится внутри мембраны везикул (известный как внутренний ΜΡΕ (ΜΡΕ ίη)), также образуют аспект изобретения. Антиген может содержаться внутри мембраны везикул или содержаться снаружи мембраны везикул. Соответственно, растворимые антигены находятся снаружи, а гидрофобные или липидизированные антигены содержатся либо внутри, либо снаружи мембраны.
В одном из воплощений композиция адъювантов по изобретению содержит как липополисахарид, так и иммунологически активный сапонин. В конкретном воплощении изобретения липополисахаридом является 3Ό-ΜΡΕ, а иммунологически активным сапонином является 0821. В другом воплощении изобретения композиция адъювантов состоит по существу из липополисахарида и иммунологически активного сапонина в липосомной композиции. Соответственно, в одной форме этого воплощения композиция адъювантов состоит по существу из 3Ό-ΜΡΕ и 0821. возможно со стерином, которым предпочтительно является холестерин.
В другом воплощении изобретения композиция адъювантов содержит в липосомной композиции липополисахарид и иммунологически активный сапонин в комбинации с одним или более чем одним другим иммуностимулятором или адъювантом. Соответственно, в одной форме этого воплощения липополисахаридом является 3Ό-ΜΡΕ, а иммунологически активным сапонином является 0821.
В конкретном воплощении 0821 и 3Ό-ΜΡΕ находятся в одной и той же конечной концентрации на дозу иммуногенной композиции для человека. В одном аспекте этого воплощения доза иммуногенной композиции для человека содержит конечный уровень 25 мкг 3Ό-ΜΡΕ и 25 мкг 0821. В другом воплощении доза иммуногенной композиции для человека содержит конечный уровень по 10 мкг каждого из ΜΡΕ и 0821. В другом конкретном воплощении предложена композиция адъювантов, имеющая объем 250 мкл и содержащая уровень 25 мкг 3Ό-ΜΡΕ и 25 мкг Р821 или по 10 мкг каждого из ΜΡΕ и Р821.
Антигены, которые могут быть использованы с композициями адъювантов по настоящему изобретению, включают вирусные, паразитические, бактериальные или опухолеассоциированные антигены, например, вирус гриппа или его антигенный препарат для применения согласно настоящему изобретению, который может представлять собой расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат этого расщепленного вируса. В альтернативном воплощении препарат вируса гриппа может содержать другой тип антигена инактивированного вируса гриппа, такого как инактивированный цельный вирус, или очищенные НА и ΝΑ (субъединичная вакцина), или виросому вируса гриппа. В еще одном воплощении вирус гриппа может представлять собой препарат живого аттенуированного вируса гриппа.
Расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат этого расщепленного вируса для примене
- 11 018860 ния согласно настоящему изобретению представляет собой приемлемым образом инактивированный вирусный препарат, в котором вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для солюбилизации липидной оболочки. Расщепленный вирус или антигенные препараты такого расщепленного вируса соответственно приготавливают путем фрагментации цельного вируса гриппа, либо инфекционного, либо инактивированного, с использованием солюбилизирующих концентраций органических растворителей или детергентов и последующего удаления всего или основного количества солюбилизирующего агента и некоторого количества или большей части вирусного липидного материала. Под антигенным препаратом такого расщепленного вируса понимают препарат расщепленного вируса, который возможно подвергался некоторой очистке по сравнению с расщепленным вирусом, при этом сохранив большинство антигенных свойств компонентов расщепленного вируса. Например, при получении на куриных эмбрионах расщепленный вирус может быть очищен от загрязняющих яичных белков, или при получении в клеточной культуре расщепленный вирус может быть очищен от примесей клеток хозяина. Антигенный препарат расщепленного вируса может содержать антигенные компоненты более чем одного вирусного штамма. Вакцины, содержащие расщепленный вирус (так называемые противогриппозные сплит-вакцины) или антигенные препараты расщепленного вируса, обычно содержат остаточные матриксные белки и нуклеопротеины, и иногда липиды, а также мембранные оболочечные белки.
Такие противовирусные сплит-вакцины обычно будут содержать большинство или все вирусные структурные белки, хотя нет необходимости в тех же пропорциях, в которых они присутствуют в цельном вирусе.
Альтернативно, вирус гриппа может быть в форме цельновирионной вакцины. Это может служить доказательством преимущества над вакциной на основе расщепленного вируса в пандемической ситуации, поскольку снимает сомнения относительно возможности успешного получения расщепленной противовирусной вакцины для нового штамма вируса гриппа. Что касается некоторых штаммов, то традиционные детергенты, используемые для получения расщепленного вируса, могут повреждать вирус и делать его непригодным для применения. И хотя всегда имеется возможность использования разных детергентов и/или разработки другого способа получения сплит-вакцин, для этого необходимо время, которого может быть не достаточно в пандемической ситуации. В дополнение к большей уверенности при использовани подхода с применением цельного вируса также имеется более значительная способность к продуцированию такой вакцины по сравнению с расщепленным вирусом, поскольку значительные количества антигена теряются в процессе дополнительных стадий очистки, необходимых для изготовления подходящей сплит-вакцины.
В другом воплощении препарат вируса гриппа находится в форме очищенной субъединичной противогриппозной вакцины. Субъединичные противогриппозные вакцины обычно содержат два основных оболочечных белка НА и ΝΑ и могут иметь дополнительное преимущество над цельновирионными вакцинами, поскольку они обычно менее реактогенны, в частности, для молодых вакцинируемых субъектов. Субъединичные вакцины могут быть получены либо рекомбинантно, либо очищены из разрушенных вирусных частиц.
В другом воплощении препарат вируса гриппа находится в форме виросомы. Виросомы представляют собой сферические однослойные везикулы, которые содержат функциональные вирусные оболочечные гликопротеины НА и ΝΑ в аутентичной конформации, интеркалированные в фосфолипидную бислойную мембрану виросом.
Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат может быть получен из куриных эмбрионов или тканевых культур.
Например, антиген вируса гриппа или его антигенные препараты по изобретению могут быть получены традиционным способом с использованием яиц с развивающимся эмбрионом посредством выращивания вируса гриппа в яйцах и очистки собранной аллантоисной жидкости. Яйца могут быть собраны в больших количествах в короткий срок. Альтернативно, они могут быть получены с помощью любого из новых способов производства с использованием клеток или клеточной культуры для выращивания вируса или экспрессии рекомбинантных поверхностных антигенов вируса гриппа. Подходящие клеточные субстраты для выращивания вируса включают в себя, например, клетки почки собаки, такие как МОСК или клетки из клона МОСК, МОСК-подобные клетки, клетки почки обезьяны, такие как АСМК-клетки (клетки почки африканской зеленой мартышки), включая клетки Уето, подходящие линии клеток свиньи или любой другой тип клеток млекопитающих, подходящих для продуцирования вируса гриппа с целью изготовления вакцин. Подходящие клеточные субстраты также включают в себя человеческие клетки, например, клетки МКС-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничены клеточными линиями; например, также включены первичные клетки, такие как эмбриональные фибробласты кур и линии клеток птиц.
Антиген вируса гриппа или его антигенный препарат может быть получен любым из множества коммерчески используемых способов, например с помощью способа с расщеплением вируса гриппа (сплит-Ди-способа), описанного в патентах № ΏΏ 300833 и ЭЭ 211444, включенных в данное описание посредством ссылки. Традиционно сплит-Ди получали, используя обработку растворителем/детергентом, таким как три-н-бутил-фосфат или диэтиловый эфир в комбинации с Т\геепт™ (известную как Твин
- 12 018860 эфирное расщепление), и этот способ все еще используют в некоторых производственных установках. Другие используемые в настоящее время расщепляющие агенты включают в себя детергенты, или протеолитические ферменты, или соли желчных кислот, например дезоксихолат натрия, как описано в патенте № ΌΌ 155875, включенном в данное описание посредством ссылки. Детергенты, которые могут быть использованы в качестве расщепляющих агентов, включают в себя катионные детергенты, например цетилтриметиламмония бромид (СТАВ), другие ионные детергенты, например лаурилсульфат, тауродезоксихолат, или неионные детергенты, которые описаны выше, включая Тритон Х-100 (например, в способе, описанном в Ииа е! а1., 2000, Вю1од1сак, 28, 95-103) и Тритон N-101 или комбинации любых двух или более детергентов.
Способ приготовления сплит-вакцины может включать множество разных стадий фильтрации и/или других стадий разделения, таких как стадии ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, зонального центрифугирования и хроматографии (например, ионообменной), в разнообразных комбинациях и возможно стадию инактивации, например, с помощью нагревания, формальдегида или рпропиолактона или УФ, которая может быть проведена до или после расщепления. Способ расщепления может быть осуществлен в виде периодического, непрерывного или полунепрерывного способа. Предпочтительный способ расщепления и способ очистки иммуногенной сплит-композиции описан в \\'О 02/097072.
Предпочтительные сплит-Ди-вакцинные антигенные препараты по изобретению содержат остаточное количество Твина 80 и/или Тритона Х-100, остающееся после процесса производства, хотя их можно добавить или довести их концентрацию после приготовления расщепленного антигена. Предпочтительно, когда присутствуют и Твин 80, и Тритон Х-100. Предпочтительные диапазоны конечных концентраций этих неионных поверхностно-активных веществ в вакцинной дозе составляют:
Твин 80: 0,01-1%, более предпочтительно приблизительно 0,1% (об./об.);
Тритон Х-100: 0,001-0,1 (% мас./об.), более предпочтительно 0,005-0,02% (мас./об.).
В конкретном воплощении конечная концентрация Твина 80 варьирует от 0,025 до 0,09% (мас./об.). В другом конкретном воплощении антиген предложен в виде 2-кратной концентрированной смеси, в которой концентрация Твина 80 варьирует от 0,025 до 0,2% (мас./об.) и которую необходимо в два раза разбавлять после приготовления конечной композиции с адъювантом (или с буфером в контрольной композиции).
В другом конкретном воплощении конечная концентрация Тритона Х-100 варьирует от 0,004 до 0,017% (мас./об.). В другом конкретном воплощении антиген предложен в виде в 2 раза более концентрированной смеси, концентрация Тритона Х-100 в которой варьирует от 0,005 до 0,034% (мас./об.) и которую необходимо разбавить в два раза для приготовления конечной композиции с адъювантом (или с буфером в контрольной композиции).
Предпочтительно препарат вируса гриппа приготавливают в присутствии низкого уровня тиомерсала или предпочтительно в отсутствие тиомерсала. Предпочтительно полученный препарат вируса гриппа стабилен в отсутствие ртутьорганических консервантов, в частности, препарат не содержит никакого остаточного тиомерсала. Препарат вируса гриппа, в частности, содержит антиген гемагглютинин, стабилизированный в отсутствие тиомерсала или при низких уровнях тиомерсала (обычно 5 мкг/мл или меньше). Конкретно, стабилизацию штамма вируса гриппа В осуществляют, используя производное альфатокоферола, такое как альфа-токоферола сукцинат (также известный как витамина Е сукцинат, т.е. УЕ8). Такие препараты и способы их приготовления раскрыты в \УО 02/097072.
Предпочтительная композиция содержит три инактивированных расщепленных вирионных антигена, приготовленных из рекомендованных ВОЗ штаммов вируса гриппа соответствующего сезона.
Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант по изобретению содержатся в одном и том же контейнере. Это называют как прием одного флакона. Предпочтительно, такой флакон представляет собой предварительно заполненный шприц. В альтернативном воплощении вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант по изобретению содержатся в отдельных контейнерах или флаконах и быстро смешиваются до или во время введения субъекту. Это называют как прием двух флаконов. Например, когда вакцина представляет собой 2-компонентную вакцину с общим объемом дозы 0,7 мл, концентрированные антигены (например, концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены) находятся в одном флаконе (335 мкл) (контейнер для антигенов), а предварительно заполненный шприц содержит адъювант (360 мкл) (контейнер для адъювантов). В момент инъекции содержимое флакона, содержащего концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены, извлекают из данного флакона с помощью шприца, содержащего адъювант, с последующим легким перемешиванием содержимого шприца. Перед инъекцией использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции и объем доводят до 530 мкл. В этом примере одна доза восстановленной адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 530 мкл.
В одном аспекте изобретения, касающемся поливалентной композиции, по меньшей мере один штамм вируса гриппа в указанной поливалентной иммуногенной композиции, которая определена в данном описании, ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической
- 13 018860 вспышкой. Такой штамм также может быть назван ниже в тексте как пандемические штаммы. В частности, когда вакцина является поливалентной вакциной, такой как двухвалентная, или трехвалентная, или четырехвалентная вакцина, по меньшей мере один штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. Подходящие штаммы представляют собой Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7 и Η2Ν2, но не ограничиваются этим.
Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат удобным образом является поливалентным, например, двухвалентным, или трехвалентным, или четырехвалентным. Предпочтительно, вирус гриппа или его антигенный препарат является трехвалентным или четырехвалентным, имея антиген от трех разных штаммов вируса гриппа, при этом по меньшей мере один штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой.
Свойствами штамма вируса гриппа, которые делают его способным вызывать пандемическую вспышку, являются следующие: он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином штаммов, циркулирующих в настоящий момент; он обладает способностью передаваться горизонтально в человеческой популяции; и он является патогенным для людей. Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не проявлялся в человеческой популяции в течение продолжительного периода времени, возможно, в течение нескольких десятилетий, такой как Н2. Или же он может представлять собой гемагглютинин, не циркулировавший в человеческой популяции раньше, например, Н5, Н9, Н7 или Н6, которые обнаружены у птиц. В любом случае большинство, или по меньшей мере большая часть популяции, или даже вся популяция раньше не сталкивалась с данным антигеном и является иммунологически наивной по отношению к нему.
Обычно некоторые группы имеют повышенный риск заражения гриппом в пандемической ситуации. Особенно восприимчивы пожилые люди, хронически больные люди и маленькие дети, однако многие молодые и явно здоровые люди также находятся в группе риска. Что касается вируса гриппа Н2, то часть популяции, рожденная после 1968 г., имеет повышенный риск. Для этих групп важно получить эффективную защиту как можно более быстро и простым способом.
Другой группой людей, которые находятся в группе повышенного риска, являются путешественники. Сейчас люди путешествуют больше, чем когда-либо раньше, а регионы, где появляется большинство новых вирусов, Китай и Юго-Восточная Азия, стали популярными местами для путешествий в последние годы. Такое изменение в характере путешествий дает возможность новым вирусам передаваться по всему земному шару за несколько недель, а не месяцев или лет.
Таким образом, для этих групп людей существует особая необходимость в вакцинации с целью защиты против гриппа в пандемической ситуации или возможной пандемической ситуации. Подходящие штаммы представляют собой: Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7 и Η2Ν2, но не ограничиваются этим.
Возможно композиция может содержать более трех валентностей, например три непандемических штамма плюс пандемический штамм. Альтернативно композиция может содержать три пандемических штамма. Предпочтительно композиция содержит три пандемических штамма.
Кроме того, примерами антигенов для иммуногенной композиции по изобретению являются стрептококковые антигены, например антигены стрептококка группы А или стрептококка группы В, но наиболее предпочтительно 81тер1ососси5 риеитошае. Наиболее предпочтительно используют по меньшей мере один белковый и/или по меньшей мере один сахаридный антиген. По меньшей мере один белковый антиген §1гер1ососси5 риеитошае наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из пневмолизина, РкрА или его вариантов с делецией трансмембранных областей, РкрС или его вариантов с делецией трансмембранных областей, РкаА или его вариантов с делецией трансмембранных областей, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, СЬрА или его вариантов с делецией трансмембранных областей, РЫА, РЫИ, РЫВ, РЫБ, 8ркА, Ьу1В, Ьу1С, Ьу1А, 8р125, 8р101, 8р128, 8р130 и 8р133 или их иммунологически функционального эквивалента (например, слитых доменов вышеупомянутых белков, таких как, например, слитые белки Р11ЮЕ. описанные в \УО 01/98334 и \УО 03/54007).
Некоторые композиции описаны в \УО 00/56359, \УО 02/22167 и \УО 02/22168 (включены в данное описание посредством ссылки).
Антиген может содержать капсульные сахаридные антигены (предпочтительно конъюгированные с белком-носителем), где сахариды (наиболее предпочтительно полисахариды) получены по меньшей мере из четырех серотипов пневмококков. В одном воплощении эти четыре серотипа включают 6В, 14, 19Р и 23Р. В другом воплощении по меньшей мере 7 серотипов включены в композицию, например, серотипы, полученные из серотипов 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В другом воплощении по меньшей мере 10 серотипов включены в композицию, например композиция в одном из воплощений включает в себя капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р (предпочтительно конъюгированные с белком-носителем). В другом воплощении иммуногенная композиция содержит капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В предпочтительном воплощении изобретения включены по меньшей мере 13 сахаридных антигенов (предпочтительно конъюгированные с белком-носителем), хотя согласно изобретению также рассматриваются дополнительные сахаридные антигены, например, 23-валентные (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р).
- 14 018860
Несмотря на то что вышеупомянутые сахариды предпочтительно представлены в своей полноразмерной, нативной полисахаридной форме, следует понимать, что также могут быть использованы меньшие по размеру полисахариды, которые все еще являются иммуногенными (см., например, ЕР 497524 и 497525), при необходимости связанные с белком-носителем.
Для предупреждения/облегчения пневмонии у пожилого (старше 55 лет) населения и воспаления среднего уха у младенцев (до 18 месяцев включительно) и детей (обычно от 18 месяцев до 5 лет) предпочтительное воплощение изобретения заключается в комбинировании поливалентного сахарида 81гер1ососси5 риеитошае, как он описан в данном изобретении, с белком 8!тер!ососси8 риеитошае, предпочтительно выбранным из группы перечисленных выше белков. Комбинацию пневмококковых белков также можно предпочтительно использовать, как описано ниже.
Пневмококковые белки.
Антигены 8!гер!ососси8 риеитошае предпочтительно выбраны из группы, состоящей из белка семейства полигистидиновых триад (РЫ), белка Ьу!-семейства, холин-связывающего белка, белков, имеющих мотив ЬРХТО (где X представляет собой любую аминокислоту), белков, имеющих мотив сигнальной последовательности II типа ЬХХС (где X представляет собой любую аминокислоту), и белков, имеющих мотив сигнальной последовательности I типа. Предпочтительными примерами среди этих категорий (или мотивов) являются следующие белки (либо их укороченный или иммунологически функциональный эквивалент).
РЫ (полигистидиновые триады) семейство содержит белки РЫА, РЫВ, РЫЭ и РН1Е. Это семейство характеризуется липидизированной последовательностью, двумя доменами, разделенными пролинобогащенным участком, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно вовлеченными в связывание металла или нуклеозида либо ферментативную активность, (3-5)-участками с двойной спиралью, консервативным Ν-концом и гетерогенным С-концом. Оно присутствует во всех тестируемых штаммах пневмококков. Гомологичные белки также были обнаружены у других стрептококков и №188епа. Предпочтительные члены данного семейства включают РЫА, РЫВ и РЫЭ. Более предпочтительно, РЫА или РЫЭ. Однако понятно, что термины РЫ А, В, Ό и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных ниже ссылках, а также к их существующим в природе (и искусственным) вариантам, имеющим гомологию последовательностей, которая по меньшей мере на 90% идентична белкам из ссылок; предпочтительно она идентична по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно идентична на 97%.
Что касается белков РЫ, то РЫА раскрыт в АО 98/18930, где он также обозначен как 8р36. Как указано выше, он является белком семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС.
РШЭ раскрыт в АО 00/37105, где он также обозначен как 8р036Э. Как указано выше, он также является белком семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. РЫ® раскрыт в АО 00/37105, где он также обозначен как 8р036В. Другим членом РЫВ-семейства является С3деградирующий полипептид, который раскрыт в АО 00/17370. Это также белок семейства полигистидиновых триад и он имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. Предпочтительным иммунологически функциональным эквивалентом является белок 8р42, раскрытый в АО 98/18930. Укороченный РЫВ (приблизительно 79 кДа) раскрыт в АО 99/15675, который также считается членом РЫ!Х-семейства.
РШЕ раскрыт в АО 00/30299 и обозначен как ВУЧ-3.
8р§А представляет собой холин-связывающий белок (СЬр), раскрытый в АО 98/39450.
Ьу!-семейство представляет собой мембраносвязанные белки, ассоциированные с лизисом клеток. Ν-концевой домен содержит холин-связывающий домен(домены), однако Ьу!-семейство не имеет всех признаков, обнаруженных у семейства холин-связывающих белков (СЬр), указанного ниже, и таким образом для настоящего изобретения Ьу!-семейство считается отличающимся от СЬр-семейства. В противоположность СЬр-семейству, С-концевой домен содержит каталитический домен белков Ьу!-семейства. Это семейство включает в себя Бу1А, В и С. Что касается Ьу!-семейства, то Бу1А раскрыт в Коиба е! а1., Еиг. 1. ВюсЫет., 164: 621-624 (1987). Ьу® раскрыт в АО 98/18930, где он также обозначен как 8р46. Ьу!С также раскрыт в АО 98/18930, где он также обозначен как 8р91. Предпочтительным членом этого семейства является Ьу!С.
Другим предпочтительным воплощением являются усеченные структуры Ьу!-семейства (в частности Ьу!А), где Ьу! определен выше, а усеченные структуры относятся к белкам, у которых отсутствует 50% холин-связывающего участка или более. Предпочтительно у таких белков отсутствует весь холин-связывающий участок.
8р125 является примером пневмококкового поверхностного белка с якорным мотивом к клеточной стенке ЬРХТО (где Х представляет собой любую аминокислоту). Обнаружено, что любой белок из этого класса пневмококковых поверхностных белков с таким мотивом полезен в контексте данного изобретения и, следовательно, считается дополнительным белком по изобретению. Сам 8р125 раскрыт в АО 98/18930 и также известен как Ζιιη® -цинк-содержащая металлопротеиназа.
8р101 раскрыт в АО 98/06734 (где он имеет ссылочный № у85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью I типа.
- 15 018860
8р133 раскрыт в ЭДО 98/06734 (где он имеет ссылочный № у85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью Ι типа.
8р128 и 8р130 раскрыты в ЭДО 00/76540.
Белки, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно выбраны из группы ΡΙιΐΩ. Ρ111Α и ΡΗίΕ. или комбинации 2 или всех 3 этих белков (т.е. ΡΙιίΑ+Ω, Α+Е, Ό+Е или Α+Ό+Е).
Другие пневмококковые белковые антигены, которые могут быть включены, представляют собой один или более из группы, состоящей из пневмолизина (также обозначенного как Ρ1ν; предпочтительно подвергнутого детоксикации путем химической обработки или мутации) [ЭДО 96/05859, ЭДО 90/06951, ЭДО 99/03884], ΡδπΑ и его вариантов с делецией трансмембранных областей (Веггу & Ρа!оη, 1п1ес1. 1ттип., 1996, Эес, 64(12): 5255-62), ΡίψΑ и его вариантов с делецией трансмембранных областей (И8 5804193, ЭДО 92/14488, ЭДО 99/53940), Ρφί.’ и его вариантов с делецией трансмембранных областей (ЭДО 97/09994, ЭДО 99/53940), члена семейства холин-связывающих белков (СЬр) [например, СЬрΑ и его вариантов с делецией трансмембранных областей (ЭДО 97/41151; ЭДО 99/51266)], глицеральдегид-3фосфат-дегидрогеназы (1п1ес1. 1ттип. 1996, 64: 3544), Η8Ρ70 (белок теплового шока) (ЭДО 96/40928), РсрА (8апс11ех-Веа1о е! а1., ЕЕМ8 М1сгоЫо1. Ьей., 1998, 164: 207-14), М-подобного белка (8В заявка на патент № ЕР 0837130) и адгезина 18627 (8В заявка на патент № ЕР 0834568). Настоящее изобретение также охватывает иммунологически функциональные эквиваленты или усеченные структуры таких белков (как определено выше).
Что касается семейства холин-связывающих белков, то члены этого семейства первоначально были идентифицированы как пневмококковые белки, которые можно было очистить холин-аффинной хроматографией. Все холин-связывающие белки связаны нековалентными связями с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты клеточной стенки и мембраносвязанной липотейхоевой кислоты. В своей структуре они имеют несколько участков, общих для всего семейства, хотя точная природа белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) может варьировать. В общем случае холинсвязывающие белки содержат Ν-концевой участок (Ν), консервативные повторяющиеся участки (Р1 и/или Р2), пролин-обогащенный участок (Р) и консервативный холин-связывающий участок (С), составленный из множественных повторов, который составляет приблизительно половину белка. Используемый в данной заявке термин семейство холин-связывающих белков (СЬр) относится к белкам, выбранным из группы, состоящей из холин-связывающих белков, которые идентифицированы в ЭДО 97/41151, Ρ^Α, 8]}^, ΡφΟ СЬрХ СЬрЭ и СЬрС. СЬрΑ раскрыт в ЭДО 97/41151. СЬрЭ и СЬрС раскрыты в ЭДО 00/29434. 1ЬрС раскрыт в ЭДО 97/09994. ΡΛΑ раскрыт в ЭДО 98/21337. Предпочтительно, холинсвязывающие белки выбраны из группы, состоящей из СЬрΑ, ΡΛΑ, 8р5Α и ΡφΟ
Когда СЬр является дополнительно используемым белком, он может представлять собой усеченный СЬр, где СЬр определен выше, а усеченный относится к белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка (С) или более. Предпочтительно, у таких белков отсутствует весь холинсвязывающий участок. Более предпочтительно, когда у таких усеченных белков отсутствуют (1) холинсвязывающий участок, а также (2) часть Ν-концевой половины данного белка, при этом остается по меньшей мере один повторяющийся участок (К1 или Р2). Еще более предпочтительно, когда усеченная структура имеет 2 повторяющихся участка (К1 и Р2). Примерами таких предпочтительных воплощений являются ΝΚ1χΒ2, Κ1χΚ2, ΝΚ1χΒ2Ρ и Κ1χΒ2Ρ, как проиллюстрировано в ЭДО 99/51266 или ЭДО99/51188, однако другие холин-связывающие белки, у которых отсутствует аналогичный холинсвязывающий участок, также считаются входящими в объем данного изобретения.
Кроме того, в композициях по изобретению могут быть использованы химерные белки (или слитые структуры) - усеченный СЬр-усеченный Ьу!. Предпочтительно они содержат ΝΡ1χΡ2 (или Ρ1χΡ2, или ΝΚ1χΚ2Ρ, или Κ1χΒ2Ρ) СЬр и С-концевую часть (С!егт, т.е. в которой отсутствуют холин-связывающие домены) Ьу! (например, Ьу!СС!егт или 8р91С!егт). Более предпочтительно, СЬр выбран из группы, состоящей из СЬрЛ, ΡΛΑ, 8ркЛ и ΡφΟ Еще более предпочтительно, когда он представляет собой СЬрЛ. Предпочтительно, когда Ьу! представляет собой Ьу!С (также обозначенный как 8р91).
Также может быть использован усеченный ΡφΑ или ΡδπΑ, у которого отсутствует холинсвязывающий домен (С) и который экспрессируется в виде белка, слитого с Ьу!. Предпочтительно, когда Ьу! представляет собой Ьу!С.
В пневмококковой композиции можно комбинировать разные пневмококковые белки по изобретению. Предпочтительно, когда белки комбинации по изобретению выбраны из 2 или более (3 или 4) разных категорий, таких как белки, имеющие мотив сигнальной последовательности II типа ЬХХС (где X представляет собой любую аминокислоту, например, полигистидин-триадного (ΡΗΙ) семейства), холинсвязывающие белки (СЬр), белки, имеющие мотив сигнальной последовательности I типа (например, 8р101), белки, имеющие мотив ΒΡΧΤΟ (где X представляет собой любую аминокислоту, например, 8р128, 8р130), токсины (например, Ρ1ν) и т.д. Предпочтительными примерами среди этих категорий (или мотивов) являются белки, упомянутые выше, или их иммунологически функциональные эквиваленты. Токсин + Ρ111, токсин + СЬр, Ρ111 + СЬр и токсин + Ρ111 + СЬр являются предпочтительными комбинациями категорий.
- 16 018860
Предпочтительные полезные комбинации включают РЫБ + ΝΚ1χΚ2, химерные или слитые белки РЫБ + NΚ1xΚ2-§р91Сΐе^ш, РЫБ + Р1у, РЫБ + 8р128, РЫБ + РкаА, РЫБ + РкрА, РЫА + ΝΚ1χΚ2, химерные или слитые белки РЫА + NΚ1χΚ2-§р91Сΐе^ш, РЫА + Р1у, РЫА + 8р128, РЫА + РкаА, РЫА + РкрА, ΝΚ1χΚ2 + Ьу!С, ΝΚ1χΚ2 + РкрА, ΝΚ1χΚ2 + РкаА, ΝΚ1χΚ2 + 8р128, Κ1χΚ2 + Ьу!С, Κ1χΚ2 + РкрА, Κ1χΚ2 + РкаА, Κ1χΚ2 + 8р128, Κ1χΚ2 + РЫБ, Κ1χΚ2 + РЫА, но не ограничиваются этим. Предпочтительно, когда ΝΚ1χΚ2 (или Κ1χΚ2) происходит из СЬрА или РкрС. Более предпочтительно, когда он происходит из СЬрА.
Особенно предпочтительная комбинация пневмококковых белков содержит Р1у (либо его усеченный или иммунологически функциональный эквивалент) + РЫБ (либо его усеченный или иммунологически функциональный эквивалент), возможно с ΝΚ1χΚ2 (или Κ1χΚ2, или NΚ1χΚ2Р, или Κ1χΚ2Р). Предпочтительно, когда ΝΚ1χΚ2 (или Κ1χΚ2, или NΚ1χΚ2Р, или Κ1χΚ2Р) происходит из СЬрА или РкрС. Более предпочтительно, когда он происходит из СЬрА.
Антиген может представлять собой пневмококковый сахаридный конъюгат, содержащий полисахаридные антигены, происходящие из по меньшей мере четырех серотипов, предпочтительно по меньшей мере семи серотипов, более предпочтительно по меньшей мере десяти серотипов, и по меньшей мере одного, но предпочтительно 2, 3 или 4 белков §!гер!ососсик рпеишошае, предпочтительно выбранных из группы белков, описанных выше. Предпочтительно, когда один из белков представляет собой РЫБ (или его иммунологически функциональный эквивалент) и/или Р1у (или его иммунологически функциональный эквивалент).
Проблема, связанная с полисахаридным подходом к вакцинации, заключается в том, что полисахариды рег ке являются слабыми иммуногенами. Для преодоления этой проблемы сахариды можно конъюгировать с белковыми носителями, которые обеспечивают фоновый Т-клеточный хелперный ответ. Поэтому предпочтительно, чтобы используемые в данном изобретении сахариды были связаны с таким белковым носителем. Примеры таких носителей, которые в настоящее время обычно используют для получения сахаридных иммуногенов, включают дифтерийные и столбнячные анатоксины (БТ, БТ СКМ197 и ТТ, соответственно), гемоцианин лимфы улитки (КЬН), ОМРС (белок С наружной мембраны) из Ν. шеЫпдШбЫ и очищенное белковое производное туберкулина (РРБ).
Предпочтительным носителем для иммуногенных композиций (или вакцин) на основе пневмококковых сахаридов является белок Б НаешорЫ1ик тПиепхае (ЕР 594610-В) или его фрагменты. Фрагменты, подходящие для применения, включают фрагменты, охватывающие Т-хелперные эпитопы. В частности, фрагмент белка Б будет предпочтительно содержать Ν-концевую часть, составляющую 1/3 данного белка. Носитель белок Б полезен в качестве носителя в композициях, где конъюгировано много пневмококковых сахаридных антигенов. Предпочтительно, один или более пневмококковых сахаридов в комбинации могут быть конъюгированы на белке Б.
Другим предпочтительным носителем для пневмококкового сахарида является сам пневмококковый белок (который определен выше в разделе Пневмококковые белки по изобретению).
Сахарид может быть связан с белком-носителем любым известным способом (например, по Ь1кЫ!е, патент США № 4372945, и по Агшог и др., патент США № 4474757). Конъюгирование предпочтительно осуществляют с использованием СБАР (тетрафторборат 1-циано-4-(диметиламино)пиридиния) (№О 95/08348).
Предпочтительно, когда соотношение белок:сахарид (масса:масса) в конъюгатах составляет 0,3:11:1, более предпочтительно 0,6:1-0,8:1 и наиболее предпочтительно приблизительно 0,7:1.
Особенно предпочтительные композиции по изобретению содержат один или более конъюгированных пневмококковых сахаридов и один или более пневмококковых белков по изобретению.
Кроме того, пневмококковые сахариды и белки можно стабильно хранить в виде нерасфасованных компонентов, адсорбированных на фосфате алюминия в жидкой форме.
В другом аспекте изобретения вакцинная композиция может содержать антиген цитомегаловируса человека (НСМУ). НСМУ является ДНК-содержащим вирусом человека, принадлежащим семейству герпесвирусов, и он представляет собой основную причину врожденных дефектов у новорожденных и также является причиной серьезных медицинских состояний у пациентов с ослабленным иммунитетом. Клиническое заболевание вызывает ряд симптомов, включая лихорадку, гепатит, пневмонит и инфекционный мононуклеоз.
В одном из воплощений антиген НСМУ представляет собой химерный слитый белок или его иммуногенное производное, содержащее участок гликопротеина НСМУ, слитого с участком гликопротеина Н8У (вируса простого герпеса). Гликопротеином НСМУ обычно является (белок) дВ, а гликопротеином Н8У - обычно дБ, в частности, дБ типа 2 (дБ2) Н8У. Слияние обычно происходит между аминокислотой в Ν-концевой части участка белка дВ НСМУ и аминокислотой на С-концевой части белка дБ Н8У. В обоих белковых компонентах слитого белка, как в дВ НСМУ, так и в дБ Н8У, может отсутствовать мембрано-якорный домен.
Участок белка дВ НСМУ может содержать нерасщепляемую форму дВ НСМУ. Соответственно этого достигают путем изменения одной или более аминокислот в сайте расщепления белка, например
- 17 018860 путем замены Агд458 и Агд459 на С1и и Тйг, соответственно. Участок белка Н8У может содержать сигнальную последовательность дР2 (аминокислоты 1-25) и возможно аминокислоты 26-52 дР2 и/или последовательность из дР2, представляющую собой РЕО8АЕБЕОРЕО или ее функциональные эквиваленты, которые могут быть короче или длиннее. К слитому белку могут быть добавлены другие последовательности из др Н8У, например, на С-конце белка дВ НСМУ.
В одном из воплощений слитый белок содержит аминокислоты 1-52 белка дР2 Н8У, слитого с остатками 28-685 белка дВ НСМУ. Слитый таким образом белок обозначен как дВ685* НСМУ. В другом воплощении аминокислотная последовательность РВР8АЬЬЕРРЕР, происходящая из внутренней последовательности др2, может быть включена в С-концевую часть белка дВ685* НСМУ с получением белка, обозначенного дВ685** НСМУ. Эти специфические слитые белки описаны более подробно в νθ 95/31555.
Другим иммуногеном, подходящим для применения в качестве вакцины на основе НСМУ, является рр65, матриксный белок НСМУ, который описан в νθ 94/00150 (Сйу оГ Норе).
В другом воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции содержат антиген или антигенный препарат, полученный из вируса папилломы человека (НРУ), который считается ответственным за генитальные бородавки (НРУ 6 или НРУ 11 и другие) и/или вирусов НРУ, ответственных за цервикальный рак (НРУ16, НРУ18 и другие).
В одном из воплощений формы профилактических или терапевтических композиций против генитальных бородавок содержат частицы или капсомеры Ь1 и слитые белки, содержащие один или более антигенов, выбранных из белков Е1, Е2, Е5, Е6, Е7, Ь1 и Ь2 НРУ.
В одном из воплощений формы слитого белка представляют собой Ь2Е7, как раскрыто в νθ 96/26277, и белок Р(1/3)-Е7, раскрытый в СВ 9717953.5 (РСТ/ЕР98/05285).
Предпочтительные профилактические или терапевтические композиции против цервикальных инфекции или рака, вызванных НРУ, могут содержать антигены НРУ 16 или 18. Например, мономеры антигена Ь1 или Ь2, либо антигены Ь1 или Ь2, представленные вместе в виде вирусоподобной частицы (УЪР), либо сам белок Ь1, представленный один в УЪР или капсомерной структуре. Такие антигены, вирусоподобные частицы и капсомер известны рег ве. См., например, νθ 94/00152, νθ 94/20137, νθ 94/05792 и νθ 93/02184.
Дополнительные ранние белки, такие как, например, Е7, Е2 или предпочтительно Е5, могут быть включены сами по себе или в виде слитых белков; особенно предпочтительные воплощения включают УЪР-содержащие слитые белки Ь1Е7 (νθ 96/11272).
В одном из воплощений антигены НРУ 16 содержат ранние белки Е6 или Е7 в слитой форме с носителем белком Ό с образованием слияний белок Р-(Е6 или Е7) НРУ 16 или их комбинации; или комбинаций Е6 или Е7 с Ь2 (νθ 96/26277).
Альтернативно, ранние белки Е6 и Е7 НРУ 16 или 18 могут быть представлены в одной молекуле, предпочтительно в виде слияния: белок Р-Е6/Е7. Такая композиция возможно может содержать либо один, либо оба белка Е6 и Е7 НРУ 18, предпочтительно в форме слитого белка: белок Р-Е6 или белок ΌЕ7, или слитого белка: белок Р-Е6/Е7.
Композиция по настоящему изобретению дополнительно может содержать антигены из других штаммов НРУ, предпочтительно из НРУ 31 или 33.
Онкогенные штаммы НРУ включают НРУ 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68. Таким образом, композиция по настоящему изобретению может содержать антигены из одного или более таких штаммов НРУ в дополнение к НРУ16 и/или НРУ18.
УЪР или капсомеры Ь1 НРУ, полезные в изобретении, могут содержать полноразмерный Ь1 или иммуногенный фрагмент Ь1 или состоять из них. Если УЪР или капсомер содержит иммуногенный фрагмент Ь1 или состоит из него, то подходящие иммуногенные фрагменты Ь1 НРУ включают усеченные структуры Ь1, мутанты Ь1, полученные в результате делеций, замен или вставок. Такие иммуногенные фрагменты, соответственно, способны усиливать иммунный ответ, который способен распознавать белок Ь1, например вирусоподобную частицу, из того штамма НРУ, из которого белок Ь1 получен.
Подходящие иммуногенные фрагменты Ь1 включают усеченные белки Ь1. В одном аспекте усечение удаляет сигнал ядерной локализации. В другом аспекте усечение представляет собой С-концевое усечение. В следующем аспекте С-концевое усечение удаляет немногим более 50 аминокислот, например немногим более 40 аминокислот. Если Ь1 происходит из НРУ 16, то в другом аспекте С-концевое усечение удаляет 34 аминокислоты из Ь1 НРУ 16. Если Ь1 происходит из НРУ 18, то в другом аспекте Сконцевое усечение удаляет 35 аминокислот из Ь1 НРУ 18.
Подходящие усеченные последовательности Ь1 НРУ 16 и 18 приведены в νθ 06/114312.
Кроме того, последовательность НРУ 16 может представлять собой последовательность, раскрытую в νθ 9405792 или И8 6649167, например, соответственным образом усеченную. Подходящие усеченные структуры усечены по положению, эквивалентному обсужденному выше, как оценено путем сравнения последовательностей.
Альтернативная последовательность НРУ 18 раскрыта в νθ 9629413, которая может быть соответственным образом усечена. Подходящие усеченные структуры усечены по положению, эквивалентному
- 18 018860 описанному выше, как оценено путем сравнения последовательностей.
Другие последовательности ΗΡν 16 и ΗΡν 18 хорошо известны в данной области техники и могут подходить для применения в настоящем изобретении.
Если белок Ь1 происходит из другого штамма ΗΡν, могут быть использованы С-концевые усечения, соответствующие таковым, приготовленным для ΗΡν 16 и ΗΡν 18, на основании выравниваний последовательностей ДНК или белков. Подходящие усечения белков Ь1 ΗΡν 31 и 45 приведены в АО 06/114312.
Кроме того, могут быть приготовлены подходящие усеченные структуры из, например, ΗΡν 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68, в одном аспекте, путем удаления С-концевых участков белка Ь1, эквивалентных описанным выше, как оценено путем выравнивания последовательностей.
Белок Ь1 или его иммуногенный фрагмент по изобретению возможно может быть в форме слитого белка, как, например, слитая конструкция белка Ь1 с Ь2 или ранним белком.
Белок Ь1 ΗΡν существует, соответственно, в форме капсомера или вирусоподобной частицы (ΥΕΡ). В одном аспекте в настоящем изобретении могут быть использованы νΕΡ ΗΡν. ΥΕΡ ΗΡν и способы приготовления ΥΕΡ хорошо известны в данной области техники. ΥΕΡ обычно конструируют из вирусных структурных белков Ь1 и возможно Ь2, см., например АО 9420137, И8 5985610, АО 9611272, И8 6599508В1, и8 6361778В1, ЕР 595935. Любая подходящая ΥΕΡ ΗΡν, которая обеспечивает перекрестный иммунитет, такая как ΥΕΡ на основе Ь1 или Ь1 + Ь2, может быть использована в настоящем изобретении.
Предпочтительно ΥΕΡ представляет собой только Ы-νΕΡ.
Композиция по изобретению может содержать комбинацию Ы-νΕΡ ΗΡν 16 и Ы-νΕΡ ΗΡν 18, или комбинацию Ы-νΕΡ ΗΡν из ΗΡν 16, 18, 31 и 45, или более многочисленные комбинации, и включает в себя Ы-νΕΡ ΗΡν 16 и 18 или ΗΡν 16, 18, 31 и 45, или более многочисленные комбинации, где Ы является возможно усеченным, как описано в данном изобретении.
В конкретном воплощении изобретения с антигенами ΗΡν 16 и/или 18 используют один или более дополнительных антигенов из типов ΗΡν, вызывающих рак, которые выбраны из следующих типов ΗΡν: ΗΡν 31, 45, 33, 58 и 52. Как описано в данном изобретении, антиген в каждом случае может представлять собой Ы, например, в форме Ы-νΕΡ или капсомеров. Таким образом, антигены ΗΡν для использования в композициях, способах и применениях, описанных в данном изобретении, могут содержать Ы-νΕΡ или капсомеры из ΗΡν 16, 18, 31, 45, 33, 58 и 52 или состоять из них. Ы-νΕΡ могут представлять собой только Ы-νΕΡ или быть в комбинации с другим антигеном, как, например, Ь2 в ΥΕΡ на основе Ы + Ь2. Белок Ы может быть соответственно усеченным, как описано в данном изобретении.
Образование ΥΕΡ можно оценить с использованием стандартных методик, таких как, например, электронная микроскопия и динамическое лазерное светорассеяние.
ΥΕΡ может содержать полноразмерный белок Ы. В одном аспекте белок Ы, используемый для образования ΥΕΡ, представляет собой усеченный белок Ы, как описано выше.
ΥΕΡ могут быть приготовлены в любом подходящем клеточном субстрате, таком как дрожжевые клетки или клетки насекомых, например в бакуловирусной экспрессирующей системе, и методики приготовления νΕΡ хорошо известны в данной области техники, как, например, АО 9913056, И8 6416945 В1, и8 6261765 В1 и И8 6245568 и приведенные там ссылки, полное содержание которых тем самым включено посредством ссылки.
νΕΡ могут быть приготовлены с использованием методик разборки и сборки, что может обеспечить получение более стабильных и/или гомогенных νΕΡ на основе папилломавируса. Например, в Μοί',’αΓίΙιν е! а1., 1998, ОиапШабге Э^а^етЫу апб КеаккетЫу о£ Иитап Ρаρ^11отаν^^и8 Туре 11 νίπΐδ 11ке ΡαΠίο^δ ίη νίίτο, ί. νίΓθ1θβ.ν 72(1): 33-41, описывается разборка и сборка νΕΡ на основе рекомбинантных Ы ΗΡν 11, очищенных из клеток насекомых с целью получения гомогенного препарата νΕΡ. В АО 9913056 и И8 6245568 также описываются процессы разборки/сборки для приготовления ΥΕΡ на основе ΗΡν.
В одном аспекте ΥΕΡ на основе ΗΡν получают, как описано в АО 9913056 или И8 6245568.
Композиции по настоящему изобретению могут содержать антигены или антигенные препараты, полученные из паразитов, вызывающих малярию, таких как Ρ1;·ΐ5ΐηο6ίιιιη £а1с1рагит или Ρ1;·ΐ5ΐηο6ίιιιη угуах. Например, возможные антигены, происходящие из Ρ1а8тοб^ит £а1с1рагит, включают циркумспорозоитный белок (С8 белок), КТ8,8, Μ8Ρ1, Μ8Ρ3, Ь8А1, Ь8А3, АМА1 и ΤΚΑΡ. ЕТ8 представляет собой гибридный белок, содержащий по существу всю С-концевую часть циркумспорозоитного (С8) белка из Ρ. £а1с1рагит, присоединенную посредством четырех аминокислот рге82-части поверхностного антигена вируса гепатита В к поверхностному (8)-антигену вируса гепатита В (ИВУ). Его полная структура раскрыта в международной заявке на патент № РСТ/ЕР92/02591, опубликованной под № АО 93/10152, утверждающей приоритет заявки на патент Великобритании № 9124390.7. При экспрессии в дрожжах КТ8 продуцируется в виде липопротеиновой частицы, а при совместной экспрессии с 8-антигеном из ΗВV продуцируется комбинированная частица, известная как КТ8,8. Антигены ΒΕΑΡ описаны в международной заявке на патент № ΡСΤ/СВ89/00895, опубликованной под № АО 90/01496. Предпочтительным воплощением настоящего изобретения является вакцина против малярии, где антигенная композиция
- 19 018860 содержит комбинацию антигенов ВТ8,8 и ТВАР. Другие плазмодийные антигены, являющиеся вероятными кандидатами в компоненты поливалентной вакцины против малярии, представляют собой М8Р1, АМА1, М8Р3, ЕВА, бЬИВР, ВАР1, ВАР2, секвестрин (кедиекйш), РГЕМР1, РГ332, Ь8А1, Ь8А3, 8ТАВР, 8АБ8А, РГЕХР1, РГк25, РГк28, РБ827/25, РГк16, РГк48/45, РГк230 из Р. Гасрагит и их аналоги в видах Р1акто61ит. Одно воплощение настоящего изобретения представляет собой композицию, содержащую белок ВТ8,8 или С8 или его фрагмент, такой как часть С8 в ВТ8,8, в комбинации с одним или более дополнительными малярийными антигенами, которые могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из МР81, М8Р3, АМА1, Ь8А1 или Ь8А3. Возможные антигены из Р. У1уах включают циркумспорозоитный белок (С8 белок) и белок, связывающий антиген Даффи (ЭиГГу), и его фрагменты, как, например, РуВП (см., например, АО 02/12292).
Другие возможные антигены, которые могут быть использованы в иммуногенных композициях по настоящему изобретению, включают стрептококковые антигены, как, например, из стрептококка группы А или стрептококка группы В. Другие антигены соответственно происходят из ВИЧ-1 (такие как антиген Б4 или его фрагменты либо дад или его фрагменты, например, р24, 1а1, пеГ, др120 или др160 или фрагменты любого из них), герпесвирусов человека, такие как дЭ или его производные или немедленный ранний белок, например 1СР27 из Н8У1 или Н8У2, цитомегаловируса ((в особенности человека) (такие как дВ или его производные)), ротавируса (включая живые аттенуированные вирусы), вируса ЭпштейнаБарра (такие как др350 или его производные), вируса ветряной оспы (такие как др1, II и 1Е63), или из вируса гепатита, такого как вирус гепатита В (например, поверхностный антиген вируса гепатита В или его производное), вирус гепатита А, вирус гепатита С и вирус гепатита Е, или из других вирусных патогенов, таких как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (В8У) (такие белки, как Б, Ν, М и О или их производные), вирус парагриппа, вирус кори, вирус паротита, вирусы папилломы человека (например, НРУ6, 11, 16, 18), флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки, вирус денге, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита) или вирус гриппа (цельный живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный на куриных эмбрионах или клетках МОСК, или цельные Г1и-виросомы (как описано в В. О1иск, Уассше, 1992, 10, 915-920), или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как белки НА, Ν₽, NА или М либо их комбинации); или происходят из бактериальных патогенов, таких как №1ккепа крр., включая Ν. допоггйеа и Ν. тепшдйШк (например, капсульные сахариды и их конъюгаты, трансферрин-связывающие белки, лактоферрин-связывающие белки, Р11С, адгезины); 8. руодепек (например, М белки или их фрагменты, протеаза С5А, липотейхоевые кислоты), 8. ада1асйае, 8. ти!апк; Н. бисгеуд Могахе11а крр., включая М. са1аггйаНк, также известный как Вгапйате11а са1аггйаНк (например, высоко- и низкомолекулярные адгезины и инвазины); Вог6е1е11а крр., включая В. рейиккш (например, пертактин, коклюшный токсин или его производные, филаментозный гемагглютинин, аденилатциклаза, фимбрии), В. рагарейиккш и В. ЬгопсЫкерйса; МусоЬас1епит крр., включая М. 1иЬегси1ок1к (например, Е8АТ6, антиген 85А, -В или -С), М. Ьоу1к, М. 1ергае, М. аукни, М. рагаШЬегси1ок1к, М. ктедтайк; Ьедюпе11а крр., включая Ь. рпеиторййа; ЕксйейсЫа крр., включая энтеротоксичный штамм Е. сой (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, термостабильный токсин или его производные), энтерогеморрагический штамм Е. сой, энтеропатогенный штамм Е. сой (например, шигаподобный токсин или его производные); У1Ьпо крр., включая У. сйо1ега (например, холерный экзотоксин или его производные); 8Ыде11а крр., включая 8. коппед 8. 6укеп1епае, 8. Дехпегй; Уегкйиа крр., включая Υ. еШегосоййса (например, белок Уор), Υ. рекйк, Υ. ркеи6о1иЬегси1ок1к; Сашру1оЬас1ег крр., включая С. )ещш (например, токсины, адгезины и инвазины) и С. сой; 8а1топе11а крр., включая 8. 1урйг 8. рага!урЫ, 8. сйо1егаекшк, 8. еШегШФк; Ык1епа крр., включая Ь. топосуЮдепек; НейсоЬас1ег крр., включая Н. ру1оп (например, уреаза, каталаза, вакуолизирующий токсин); Ркеиботопак крр., включая Р. аегидшока; 81арйу1ососсик крр., включая 8. аигеик, 8. ерИегтМш; Еп!егососсик крр., включая Е. Гаесайк, Е. Гаесшт; С1ок1п6йип крр., включая С. 1е1ап1 (например, столбнячный токсин и его производное), С. ЬоШйпиш (например, ботулинический токсин и его производное), С. бЖсйе (например, клостридические токсины А или В и их производные); ВасШик крр., включая В. аШйгаак (например, ботулинический токсин и его производные); СогупеЬас1епшп крр., включая С. ШрЫйепае (например, дифтерийный токсин и его производные); Воггейа крр., включая В. Ьигдбойеп (например, ОкрА, ОкрС, ЭЬрА, ЭЬрВ), В. дайпй (например, ОкрА, ОкрС, ЭЬрА, ЭЬрВ), В. а&е1й (например, ОкрА, ОкрС, ЭЬрА, ЭЬрВ), В. апбегкопи (например, ОкрА, ОкрС, ЭЬрА, ЭЬрВ), В. йегтки; ЕйгйсЫа крр., включая Е. есци, и агент гранулоцитарного эрлихиоза человека; Вюкейыа крр., включая В. пскейкп; Сй1ату61а крр., включая С. йасйотаБк (например, МОМР (основной белок наружной мембраны), гепарин-связывающие белки), С. рпеитошае (например, МОМР, гепарин-связывающие белки), С. ркШаск ЬерЮкрйа крр., включая Ь. ш!еггодапк; Тгеропета крр., включая Т. раШбит (например, редкие белки наружной мембраны), Т. 6епйсо1а, Т. йуобукейепае; или происходят из паразитов, таких как Р1акто6йип крр., включая Р. ГаШрагит; Тохор1акта крр., включая Т. допбй (например, 8АО2, 8АО8, Тд34); ЕгИатоеЬа крр., включая Е. 1пк1о1уйса; ВаЬеыа крр., включая В. ткгой; Тгурапокота крр., включая Т. сги/ί; ШагЛа крр., включая О. 1атЬйа; йекйташа крр., включая Ь. та)ог, Рпеитосукйк крр., включая Р. саппй; Тпсйотопак крр., включая Т. уадшайк; 8сй1кок1ота крр., включая 8. тапкош; или происходят из дрожжей, таких как СапбИа крр., включая С. а1Ысапк; СгурЮсоссик крр., включая С. пеоГогтапк.
- 20 018860
Другие предпочтительные специфические антигены М. !иЬетси1оз1з представляют собой, например, ТЬ Ка12, ТЬ Н9, ТЬ Ка35, ТЬ38-1, ЕШ 14, ОР\\ МТ1, МБЬ, тТТС2 и ЙТСС1 (№0 99/51748), М!Ь72Е и М72. Белки М. !иЬетси1оз1з также включают слитые белки и их варианты, где по меньшей мере два, предпочтительно три полипептида М. !иЬегси1оз1з слиты в белок большего размера. Предпочтительные слияния включают Ка12-ТЬН9-Ка35, Ειύ14-ϋΡν-^, ^ΡV-МТI-МБ^, Ε^а14-^ΡV-МТI-МБ^-тТСС2, ЕгБ14Ι)Ρν-\1ΊΊ-\151.. ^ΡV-МТI-МБ^-тТСС2, ТЬΗ9-^ΡV-МТI (№0 99/51748). Конкретная последовательность Ка12-ТЬй9-Ка35, которая может быть упомянута, определена как БЕС ГО N0: 6 в №0 2006/117240, вместе с вариантами, в которых Бег 704 этой последовательности мутирован до аминокислоты, отличающейся от серина, например до А1а, и их производными, включающими Ν-концевую НДз-метку соответствующей длины (например, БЕС ГО N0: 2 или 4 в №0 2006/117240).
Типичные антигены СЫатуШа ер., например С. !тасйотаБз, выбраны из СТ858, СТ089, СТ875, МОМР, СТ622, РтрО (предполагаемый мембранный белок Ό), РтрС и их фрагментов, Б№1В и иммуногенных фрагментов любого из них (таких как РтрОрБ и РтрСрБ) и их комбинаций. Предпочтительные комбинации антигенов включают в себя СТ858, СТ089 и СТ875. Конкретные последовательности и комбинации, которые могут быть использованы, описаны в №0 2006/104890.
Предпочтительные бактериальные композиции содержат антигены, происходящие из Наеторййиз зрр., включая Н. тПиепхае типа В (например, РКР (полирибозил-рибитол-фосфатный капсульный полисахарид) и его конъюгаты), нетипируемый штамм Н. тПиеп/ае, например, ОМР26 (белок наружной мембраны 26), высокомолекулярные адгезины, Р5, Р6, белок Ό и липопротеин Ό, и фимбрин и фимбриновые пептиды (патент США № 5843464) или их многокопийные варианты или слитые белки.
Производные поверхностного антигена вируса гепатита В хорошо известны в данной области и включают, среди прочего, такие Б-антигены как РгеБ1, РгеБ2, описанные в заявках на европейский патент ЕР-А-414374; ЕР-А-0304578 и ЕР 198-474. В одном предпочтительном аспекте вакцинная композиция по изобретению содержит антиген ВИЧ-1, представляющий собой др120„ особенно когда он экспрессирован в клетках СНО (клетки яичника китайского хомячка). В другом воплощении композиция по изобретению содержит дО2!, который определен выше.
Данные композиции также могут содержать противоопухолевый антиген и быть полезными для иммунотерапевтического лечения видов рака. Например, антиген может представлять собой антигены отторжения опухоли для таких видов рака, как рак предстательной железы, молочной железы, колоректальный рак, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак почки или меланома. Типичные антигены включают МАСЕ 1, 3 и МАСЕ 4 или другие антигены МАСЕ (меланомные антигены), как, например, раскрытые в №0 99/40188, РКАМЕ (ртеДетепБа1 апБдеп оД те1апота; предпочтительный антиген меланомы), ВАСЕ (В-меланомный антиген), Баде (Ь-меланомный антиген) (также известный как ΝΥ Еоз 1), БАСЕ (загсота апБдеп; антиген саркомы) и НАСЕ (йеНсазе апБдеп; геликазный антиген) (№0 99/53061) или САСЕ (С-меланомный антиген) (КоЬЬтз апБ Ка\\'акатД 1996, Сиггеп! 0р1шопз ш 1ттипо1оду, 8, рр. 628-636; Vап Беп ЕупБе е! а1., 1п!егпаБопа1 1оигпа1 оД СБпДса1 & ЬаЬогаДогу Кезеагсй (представлен на рассмотрение, 1997); Соггеа1е е! а1. (1997), 1оигпа1 оД №1йопа1 Сапсег ДпзБДиДе, 89, р. 293). В действительности, эти антигены экспрессируются в широком диапазоне типов опухолей, таких как меланома, карцинома легкого, саркома и карцинома мочевого пузыря.
Антигены МАСЕ для применения в настоящем изобретении могут быть экспрессированы в виде слитого белка с энхансером экспрессии или иммунологическим партнером слияния. В частности, белок МАСЕ может быть слит с белком О НаеторйБиз Б1Диепхае В или его липидизированным производным. В частности, партнер слияния может содержать первую 1/3 белка О. Такие конструкции раскрыты в №0 99/40188.
Другие опухолеспецифические антигены включают КБА (йитап аБепосагстота-аззосДа!еБ апйдеп; антиген, ассоциированный с аденокарциномой человека) (СА733) опухолеспецифические ганглиозиды, такие как СМ2 и СМ3 или их конъюгаты с белками-носителями, но не ограничиваются этим; или указанный антиген может представлять собой сам пептидный гормон, такой как полноразмерный гонадотропин-рилизинг-гормон (СпКН, №0 95/20600), короткий пептид, состоящий из 10 аминокислотных остатков, полезный в лечении многих видов рака или в иммунологической кастрации.
В предпочтительном воплощении используют простатические антигены, такие как простатический специфический антиген (РБА), РАР (простатическая кислая фосфатаза), РБСА (ргоз!азе з!еат се11 апБдеп; антиген простатных стволовых клеток) (ΡNΑБ, 95(4), 1735-1740, 1998), РБМА (ргоз!а!е зресШс тетЬгапе апБдеп; мембранный антиген предстательной железы) или антиген, известный как простаза.
Простаза представляет собой специфическую для предстательной железы сериновую протеазу (трипсиноподобную), состоящую из 254 аминокислот, с консервативной для сериновых протеаз каталитической триадой Н-О-Б и аминоконцевой препропептидной последовательностью, указывающей на возможную секреторную функцию (Р. №1зоп, Ьц Сап, С. Еетдцзоп, Р. Мозз, К. СеБпаз, Ь. НооБ & К. №апБ, Мо1еси1аг с1опДпд апБ сйатас!епзаБоп оД ргоз!азе, ап апБтодеп-тедц1а!еБ зеппе рго!еазе \\Бй ргоз!а!е тез!т1с!еБ ехртеззюп, в Ргос. №111. АсаБ. Бст ИБА (1999) 96, 3114-3119). Описан предполагаемый сайт гликозилирования. Предсказанная структура очень близка по структуре к другим известным сериновым протеазам, показывая, что зрелый полипептид сворачивается в единичный домен. Зрелый белок состоит
- 21 018860 из 224 аминокислот с одним эпитопом А2, который, как показано, подвергается природному процессингу.
Нуклеотидная последовательность простазы и выведенные полипептидная последовательность и гомологи описаны Еетдизоп и др. (Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 1999, 96, 3114-3119) и в международных заявках на патент № \¥О 98/12302 (и также в соответствующем выданном патенте США 5955306), \УО 98/20117 (и также в соответствующих выданных патентах США 5840871 и США 5786148) (простата-специфический калликреин) и \УО 00/04149 (Р703Р).
Согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие простазные белковые слитые структуры на основе белка простазы и его фрагментов и гомологов (производные). Такие производные подходят для применения их в терапевтических вакцинных композициях, подходящих для лечения опухолей предстательной железы. Обычно фрагмент будет содержать по меньшей мере 20, предпочтительно 50, более предпочтительно 100 смежных аминокислот, как раскрыто в приведенных выше в качестве ссылки патенте и заявках на патент.
Другой предпочтительный антиген предстательной железы известен как Р5018, последовательность ГО NО 113 из \¥О 98/37814. Его иммуногенные фрагменты и части, содержащие по меньшей мере 20, предпочтительно 50, более предпочтительно 100 смежных аминокислот, раскрыты в приведенной выше в качестве ссылки заявке на патент. См., например, Р8108 (\УО 98/50567).
Другие антигены предстательной железы известны из \¥О 98/37418 и \УО 004149. Еще один представляет собой 8ТЕАР (8ΐχ (таизтетЬтапе еркйе11а1 апйдеп о£ рго51а1е; шестой трансмембранный антиген простаты) ^ΝΑδ, 96, 14523-14528, 7-12, 1999).
Другие опухолеспецифические антигены, полезные в контексте настоящего изобретения, включают: Р1и-1 (1. Вю1. Сйет., 274 (22), 15633-15645, 1999), ΗΑδΗ-1 (йитап асйае1е-8си1е йото1од-1), НазН-2, Спр1о (8а1отоп е! а1., Вюаззауз, 199, 21, 61-70, патент США № 5654140), криптин (спрбп) (патент США № 5981215). Кроме того, антигены, особенно подходящие для терапии рака, также включают тирозиназу и сурвивин (8ИГУ1УШ).
Пептиды на основе муцина, такие как Мис1, см., например, в И8 5744144, И8 5827666, \УО 8805054, И8 4963484. Конкретно рассматриваются происходящие из Мис 1 пептиды, содержащие по меньшей мере одну повторяющуюся единицу пептида Мис 1, предпочтительно по меньшей мере два таких повтора, которая распознается антителом 8М3 (И8 6054438). Другие пептиды, происходящие из муцина, включают пептид из Мис 5.
Антиген по изобретению может представлять собой антиген рака молочной железы, такой как йег 2/№и, маммаглобин (патент США № 5668267), или антиген, раскрытый в \УО 0052165, \УО 99/33869, \УО 99/19479, \УО 98/45328. Антигены Нег 2 пей раскрыты, среди прочего, в патенте США № 5801005. Предпочтительно, Нег 2 пей содержит целый внеклеточный домен (содержащий приблизительно с 1 по 645 аминокислоту) или его фрагменты и по меньшей мере иммуногенную часть или целый внутриклеточный домен, содержащий приблизительно 580 С-концевых аминокислот. В частности, внутриклеточная часть должна содержать домен фосфорилирования или его фрагменты. Такие конструкции раскрыты в \УО 00/44899. Особенно предпочтительная конструкция известна как ЕСГО РО, другая известна как ЕСГО РО, см. \УО 00/44899. Нег 2 пей, который использован в данном описании, может происходить из крысы, мыши или человека.
Данные композиции могут содержать антигены, ассоциированные с опухолеподдерживающими механизмами (например, ангиогенезом, опухолевой инвазией), например бе 2, УЕСР (сосудистый эндотелиальный фактор роста).
Можно предвидеть, что в композициях по настоящему изобретению могут быть использованы антигены, происходящие из Воттейа зр.. Например, антигены могут включать нуклеиновую кислоту, антиген, происходящий из патогена, или антигенные препараты, рекомбинантно полученные белок или пептиды и химерные слитые белки. В частности, антиген представляет собой ОзрА. ОзрА может представлять собой полностью зрелый белок в липидизированной форме как в клетке-хозяине (Е. сой), обозначенный как Ыро-ОзрА, или его нелипидизированное производное. Такие нелипидизированные производные включают нелипидизированный слитый белок №1-ОзрА, который имеет первые 81 Ν-концевую аминокислоту неструктурного белка (N81) вируса гриппа и полный белок ОзрА, а другой МОР(мурамилдипептид)-ОзрА, представляющий собой нелипидизированную форму ОзрА, несущую 3 дополнительных Ν-концевых аминокислоты.
Композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики или терапии аллергии. Такие вакцины будут содержать аллерген-специфические (например, Эег р1) и аллергеннеспецифические антигены (например, пептиды, происходящие из 1дЕ человека, включая 81ап\тог111 декапептид (ЕР 0477231 В1), но не ограничиваясь этим).
Композиции по настоящему изобретению также могут быть использованы для профилактики или терапии хронических расстройств, отличных от аллергии, рака или инфекционных заболеваний. Такими хроническими расстройствами являются такие заболевания, как атеросклероз и болезнь Альцгеймера.
Композиции по настоящему изобретению, в частности, подходят для иммунотерапевтического лечения таких заболеваний, таких как хронические состояния и виды рака, а также для терапии хрониче
- 22 018860 ских инфекций. Соответственно, композиции по настоящему изобретению особенно подходят для иммунотерапии инфекционных заболеваний, таких как туберкулез (ТВ), вирусные инфекции СПИД и гепатит В (НерВ).
Кроме того, что касается СПИДа, предложен способ лечения индивидуума, чувствительного к СПИДу или страдающего от него. Этот способ включает введение вакцины по настоящему изобретению индивидууму, тем самым уменьшая снижение СИ4+ Т-клеток, вызываемое последующей ВИЧинфекцией, или замедляя либо останавливая снижение количества СИ4+ Т-клеток у индивидуума, уже инфицированного ВИЧ.
Другие антигены включают в себя бактериальные (предпочтительно капсульные) сахариды, отличные от (или в дополнение к) таких пневмококковых антигенов, описанных выше. Полисахаридные антигены удобно хранить в жидкой нерасфасованной форме, адсорбированной на фосфате алюминия, следовательно, напрямую создавать вакцинные композиции по изобретению путем смешивания указанной жидкой нерасфасованной формы с адъювантом по изобретению экстемпорально. Предпочтительно, чтобы другие бактериальные сахариды были выбраны из группы, состоящей из капсульного сахарида Ν. тешпдШШз серогруппы А (ΜβηΆ), капсульного сахарида Ν. тешпщНШз серогруппы С (Μοηί.’), капсульного сахарида Ν. тешпщЦШз серогруппы Υ (ΜеηΥ), капсульного сахарида Ν. тешпщНШз серогруппы ^У-135 ^еп^), капсульного сахарида группы I стрептококков группы В, капсульного сахарида группы II стрептококков группы В, капсульного сахарида группы III стрептококков группы В, капсульного сахарида группы IV стрептококков группы В, капсульного сахарида группы V стрептококков группы В, капсульного сахарида 5 типа 81арку1ососсиз аигеиз, капсульного сахарида 8 типа 81арку1ососсиз аигеиз, V сахарида из 8а1топе11а 1ур1и, Ν. тешпщНШз ΕΡ8, Μ. са1аггИа118 ΕΡ8 и Н. тПиепхае ΕΡ8. Под ΕΡ8 понимают либо нативный липополисахарид (или липоолигосахарид), либо липополисахарид, в котором липидная часть А была подвергнута детоксикации любым из множества известных способов (см., например, \¥О 97/18837 или \УО 98/33923), либо любую молекулу, содержащую О-полисахарид, происходящий из указанного ΕΡ8. Под Ν. тешпдШШз ΕΡ8 понимают один или более из 12 известных иммунотипов (Ь1, Ь2, Ь3, Ь4, Ь5, Ь6, Ь7, Ь8, Ь9, Ь10, Ь11 или Ь12).
Особенно предпочтительными комбинациями являются композиции, содержащие: 1) конъюгированный Н1Ь, конъюгированный ΜеηΑ и конъюгированный ΜеηС; 2) конъюгированный Н1Ь, конъюгированный ΜеηΥ и конъюгированный ΜеηС; 3) конъюгированный Н1Ь и конъюгированный ΜеηС; и 4) конъюгированный ΜеηΑ, конъюгированный ΜеηС, конъюгированный ΜеηΥ и конъюгированный Μеη\V-135. Количество Ρ8 в каждом из приведенных выше конъюгатов может составлять 5 или 10 мкг каждого на 0,5 мл дозы для человека. Предпочтительно, Н1Ь, ΜеηΑ, ΜеηС, Μеη\V-135 и ΜеηΥ представляют собой ТТ-конъюгаты.
Проблема, связанная с полисахаридным подходом к вакцинации, заключается в том, что полисахариды рег зе являются слабыми иммуногенами. Для преодоления этой проблемы сахариды по изобретению можно конъюгировать с белковыми носителями, которые обеспечивают фоновый Т-клеточный хелперный ответ. Поэтому предпочтительно, чтобы используемые в данном изобретении сахариды были связаны с таким белковым носителем. Примеры таких носителей, которые в настоящее время обычно используют для получения сахаридных иммуногенов, включают дифтерийные и столбнячные анатоксины (ИТ, СΚΜ197 из ИТ и ТТ соответственно), гемоцианин лимфы улитки (КИН), белок И из НаеторЫ1из тПиепхае (ЕР 59461 О-В), ОМРС из Ν. тептщНШз и очищенное белковое производное туберкулина очищенный от белка туберкулин (ΡΡΠ).
Сахарид может быть связан с белком-носителем любым известным способом (например, по Е|к1Ше, патент США № 4372945, и по Агтог и др., патент США № 4474757). Конъюгирование предпочтительно осуществляют с использованием ί'ΌΛΡ (\УО 95/08348).
Предпочтительно, когда соотношение белок:сахарид (масса:масса) в конъюгатах составляет 0,3:11:1, более предпочтительно 0,6:1-0,8:1 и наиболее предпочтительно приблизительно 0,7:1.
В настоящее изобретение включены комбинации антигенов, которые обеспечивают защиту против пневмококка и другого патогена. Многие педиатрические вакцины в настоящее время дают в виде комбинированной вакцины с тем, чтобы уменьшить количество инъекций, которые должен получить ребенок. Таким образом, что касается педиатрических вакцин, то другие антигены из других патогенов могут быть приготовлены вместе с пневмококковыми вакцинами по изобретению. Например, вакцины по изобретению могут быть приготовлены вместе (или введены по отдельности, но в одно и то же время) с хорошо известной трехвалентной комбинированной вакциной, содержащей дифтерийный анатоксин (ИТ), столбнячный анатоксин (ТТ) и коклюшные компоненты [обычно подвергнутый детоксикации коклюшный анатоксин (РТ) и филаментозный гемагглютинин (ЕНА) возможно с пертактином (ΡΒΝ) и/или агглютинином 1+2], например, с имеющейся в продаже вакциной INЕАNΚIX-^ТΡа™ (8тН11ККпеВеескат Вю1ощса1з), которая содержит антигены ИТ, ТТ, РТ, ЕНА и ΡΒΝ, или с цельным клеточным коклюшным компонентом, например, который поставляется на рынок фирмой 8тйЬК1теВеескат Вю1одюа1з 8.А. под названием Тгкапп.х™. Комбинированная вакцина также может содержать другой антиген, такой как поверхностный антиген гепатита В (НВзАд), антигены вируса полиомиелита (напри
- 23 018860 мер, трехвалентный инактивированный вирус полиомиелита - ΙΡν), белки наружной мембраны Могахе11а са!аггйа118, белки нетипируемого штамма НаеторШик тПиепхае, белки В наружной мембраны Ν. шешпдй1й1к.
Примерами предпочтительных белковых антигенов Могахе11а са1агг11а1А которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения воспаления среднего уха), являются: ОМР106 [АО 97/41731 (Ап!ех) и АО 96/34960 (РМС)]; ОМР21; ЬЬрА и/или ЬЬрВ |АО 98/55606 (РМС)]; ТЬрА и/или ТЬрВ |АО 97/13785 и АО 97/32980 (РМС)]; СорВ [Не1тшеп М.Е., е! а1. (1993) 1п£ес!. 1тшип., 61: 2003-2010]; ИкрА1 и/или ИкрА2 [АО 93/03761 (Университет Техаса)]; ОтрСЭ; НакК (РСТ/ЕР99/03824); РИС) (РСТ/ЕР99/03823); ОМР85 (РСТ/ЕР00/01468); 11ро06 (ОБ 9917977.2); 11ро10 (ОБ 9918208.1); Кро11 (ОВ 9918302.2); Лро18 (ОВ 9918038.2); Р6 (РСТ/ЕР99/03038); Ό15 (РСТ/ЕР99/03822); Отр1А1 (РСТ/ЕР99/06781); Н1у3 (РСТ/ЕР99/03257); и ОтрЕ. Примеры антигенов нетипируемых штаммов НаеторЫ1ик тПиеи/ае, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения воспаления среднего уха), включают в себя: белок фимбрин [(И8 5766608 - О1ло 81а1е Кекеагск Роипйайоп)] и слитые конструкции, содержащие его пептиды [например, ЬВ1(£)-пептидные слитые конструкции; И8 5843464 (О8И) или АО 99/64067]; ОМР26 [АО 97/01638 (Сойеск)]; Р6 [ЕР 281673 (Государственный университет Нью-Йорка)]; ТЬрА и/или ТЬрВ; Н1а; Нк£; Нт47; Н1£; Нт\\'1; Нт™2; Пип®; Нт«4; Нар; Ό15 (АО 94/12641); белок Ό (ЕР 594610); Р2 и Р5 (АО 94/26304).
Другие рассматриваемые комбинации представляют собой пневмококковый сахарид и белок по изобретению в комбинации с вирусными антигенами, например, из вируса гриппа (аттенуированного, расщепленного или субъединичного [например, поверхностные гликопротеины нейраминидаза ^А) и гемагглютинин (НА). См., например, С1а1оирка I. е! а1., Еиг. 1оигпа1 С1т. МюгоЬюк 1п£ес!. ЭА 1996, 15: 121-127], из Κδν (например, антигены Ρ и О или слияния Ρ/О, см., например, 8сНт1б1 А.С. е! а1., 1. νΐΐΌ1., Мау 2001, р. 4594-4603), из РГУ3 (вирус парагриппа 3) (например, белки ΚΝ и Ρ, см. 8с1шиб1 е! а1., выше), вируса ветряной оспы (например, аттенуированного; гликопротеины Ι-ν и т.д.) и из любого (или всех) компонента(ов) ММК (вакцина против кори, эпидемического паротита, краснухи).
Предпочтительная комбинированная педиатрическая вакцина, рассматриваемая в настоящем изобретении для повсеместного лечения или предупреждения воспаления среднего уха, содержит один или более сахаридных антигенов 8!тер!ососсик рпеитошае (предпочтительно конъюгированных с белком Ό), один или более пневмококковых белков (предпочтительно таких, которые описаны выше) и один или более экспонированных на поверхности антигенов Могахе11а са!атгйа11к и/или нетипируемого штамма НаеторШик тПиепхае. Белок Ό может быть предпочтительно использован в качестве белкового носителя для пневмококковых сахаридов (которые упомянуты выше), и поскольку он сам является иммуногеном, способным продуцировать опосредованную В-клетками защиту против нетипируемого штамма Н. тПиепхае (п!Н1). Антигены Могахе11а са!атгйа11к или нетипируемого штамма НаеторШик тПиепхае могут быть включены в вакцину в субъединичной форме или могут быть добавлены в виде антигенов, представленных на поверхности везикул (пузырьков) наружной мембраны, приготовленных из бактерий.
Иммуногенные свойства иммуногенной композиции, используемой для вакцинации по настоящему изобретению
В настоящем изобретении имуногенная композиция предпочтительно способна индуцировать усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ против по меньшей мере одного из составляющих антигенов или антигенной композиции по сравнению с СЭ4 Т-клеточным иммунным ответом, полученным при использовании соответствующей композиции, которая является безадъювантной, т.е. не содержит какого-либо экзогенного адъюванта (обозначенной в данном описании также как простая композиция). В конкретном воплощении, когда иммуногенная композиция представляет собой композицию на основе вируса гриппа и когда препарат противогриппозной вакцины происходит из нескольких штаммов вируса гриппа, один из которых является пандемическим штаммом, указанный усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ направлен против пандемического штамма вируса гриппа.
Под усиленным СЭ4 Т-клеточным иммунным ответом подразумевают, что более высокий СЭ4ответ получают у млекопитающего после введения адъювантной иммуногенной композиции по сравнению с иммунным ответом, полученным после введения такой же композиции без адъюванта. Например, более высокий СЭ4 Т-клеточный ответ получают у пациента-человека после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом по изобретению, по сравнению с ответом, индуцированным после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, который является безадъювантным. Такая композиция будет преимущественно использоваться для индуцирования СЭ4 Т-клеточного ответа против вируса гриппа, способного определять эпитопы вируса гриппа, представленные молекулами класса II МНС.
В частности, но не исключительно, указанный усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ получают у иммунологически непримированного пациента, т.е. пациента, который является серонегативным в отношении указанного вируса гриппа или антигена. Эта серонегативность может быть следствием того, что указанный пациент никогда не сталкивался с таким вирусом или антигеном (так называемый наивный пациент) или, альтернативно, не давал реакции на указанный антиген после встречи с ним. В конкретном аспекте указанный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ получают у субъекта с ослабленным
- 24 018860 иммунитетом, такого как пожилой человек, обычно в возрасте 65 лет или старше, или взрослый человек моложе 65 лет с высоким риском медицинского состояния (взрослый человек из группы с высоким риском), или ребенок в возрасте менее двух лет.
Усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ можно оценить путем измерения количества клеток, продуцирующих любой из следующих цитокинов:
клеток, продуцирующих по меньшей мере два разных цитокина (СО40Ь, 1Ь-2, ΙΕΝγ, ΤΝΕα (фактор некроза опухоли));
клеток, продуцирующих, по меньшей мере, СО40Ь и другой цитокин (1Ь-2, ΤΝΕα, ΙΕΝγ); клеток, продуцирующих, по меньшей мере, 1Ь-2 и другой цитокин (СО40Ь, ΤΝΕα, ΙΕΝγ); клеток, продуцирующих, по меньшей мере, ΙΕΝγ и другой цитокин (1Ь-2, ΤΝΕα, СО40Ь); клеток, продуцирующих, по меньшей мере, ΤΝΕα и другой цитокин (Ш-2, СО40Ь, ΙΕΝγ).
Усиленным ί.Ό4 Т-клеточным иммунным ответом считается такой ответ, когда количество клеток, продуцирующих любой из вышеупомянутых цитокинов, будет более высоким после введения адъювантной композиции по сравнению с введением безадъювантной композиции. Обычно будут выполнены по меньшей мере одно, предпочтительно два из пяти условий, упомянутых в данном описании выше. В конкретном воплощении клетки, продуцирующие все четыре цитокина, будут представлены в большем количестве в адъювантной группе по сравнению с безадъювантной группой.
Усиленный ί.Ό4 Т-клеточный иммунный ответ, обусловленный адъювантной противогриппозной композицией по настоящему изобретению, в идеальном случае может быть получен после однократного введения. Подход с использованием однократной дозы будет чрезвычайно подходящим, например, в ситуации быстро развивающейся эпидемии. В некоторых случаях, особенно для пожилого населения или в случае маленьких детей (в возрасте младше 9 лет), которых первый раз вакцинируют против гриппа или в случае пандемии, полезным может быть введение двух доз одинаковой композиции в течение сезона. Вторую дозу указанной одинаковой композиции (рассматриваемой еще как композиция для первой вакцинации) можно вводить во время действия первичного иммунного ответа и через адекватный промежуток времени. Обычно вторую дозу такой композиции дают через несколько недель или приблизительно 1 месяц, например 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель или 6 недель после первой дозы, чтобы помочь примировать иммунную систему неотвечающих или слабо отвечающих индивидуумов.
В другом воплощении введение указанной иммуногенной композиции индуцирует усиленный ответ В-клеток памяти у пациентов, которым введена адъювантная иммуногенная композиция, по сравнению с ответом В-клеток памяти, индуцированным у индивидуумов, иммунизированных безадъювантной композицией. Подразумевается, что усиленный ответ В-клеток памяти означает увеличенную частоту встречаемости В-лимфоцитов периферической крови, способных к дифференцировке в антителосекретирующие плазматические клетки после встречи с антигеном, как измерено посредством стимуляции дифференцировки 1п уйго.
В другом воплощении введение указанной иммуногенной композиции индуцирует усиленный гуморальный ответ у пациентов, которым введена адъювантная иммуногенная композиция, по сравнению с гуморальным ответом, индуцированным у индивидуумов, иммунизированных безадъювантной композицией. Указанный гуморальный иммунный ответ может быть измерен согласно любой из методик, приведенных подробно в примере Ι, и особенно в разделах Ι.1 (1.1.1), Ι.2 (1.2.1) и Ι.3 (Ι.3.5.2). Если иммуногенная композиция представляет собой композицию по основе вируса гриппа, конкретный указанный гуморальный ответ получают против гомологичных и гетерологичных штаммов. В частности, указанный гетерологичный гуморальный иммунный ответ означает гуморальный ответ между штаммами вируса гриппа и обозначается как перекрестно-реактивный гуморальный иммунный ответ. Указанный перекрестно-реактивный гуморальный иммунный ответ включает индукцию ответа против штамма вируса гриппа, представляющего собой вариант (дрейфующий штамм) штамма вируса гриппа, используемого для вакцинации. Пример такого ответа проиллюстрирован в примере ΙΙΙ.3.1 и на фиг. 2.
В конкретном воплощении введение указанной адъювантной иммуногенной композиции индуцирует по меньшей мере два из следующих ответов: (1) усиленный ί.Ό4 Т-клеточный иммунный ответ, (2) усиленный ответ В-клеток памяти, (3) усиленный гуморальный ответ, против по меньшей мере одного из компонентов многокомпонентного антигена(ов) или антигенной композиции по сравнению с тем и другим иммунным ответом, полученным при использовании соответствующей композиции, которая является безадъювантной, т.е. не содержит какого-либо экзогенного адъюванта (обозначенной в данном описании также как простая композиция).
В еще одном конкретном воплощении вакцинация композицией для первой вакцинации, адъювантной, не оказывает измеримого воздействия на С'О8-ответ.
Конкретным воплощением изобретения является то, что композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат, изготовленный с сапониновым адъювантом, представленным в форме липосомы, в частности сапонин 0821 в блокированной холестерином форме, эффективна в стимулировании Тклеточных ответов у человеческой популяции с ослабленным иммунитетом. В одном из воплощений указанный адъювант дополнительно содержит 3О-МРЬ. В частности, введение однократной дозы имму
- 25 018860 ногенной композиции для первой вакцинации, как описано в данном изобретении, способно обеспечить улучшенную серопротекцию, как оценено посредством коррелятов защиты для противогриппозных вакцин после ревакцинации пожилого населения против гриппа по сравнению с вакцинацией безадъювантной противогриппозной вакциной. Заявленная адъювантная композиция также способна индуцировать усиленный ί.Ό4 Т-клеточный иммунный ответ против вируса гриппа по сравнению с ответом, полученным при использовании безадъювантной композиции. Это наблюдение может быть связано с повышенной реактивностью после вакцинации или инфекции по отношению к антигенной стимуляции вирусом гриппа. Кроме того, это также может быть связано с перекрестной реактивностью, т.е. более высокой способностью отвечать на вариантные штаммы вируса гриппа. Такой усиленный ответ может быть особенно полезен для человеческой популяции с ослабленным иммунитетом, такой как пожилое население (в возрасте 65 лет и старше) и, в частности, пожилое население из группы с высоким риском. Это может приводить к снижению коэффициента общей заболеваемости и смертности и предупреждению неотложной госпитализации в случае пневмонии и других гриппозоподобных заболеваний. Это также может быть полезно для детской популяции (в возрасте менее 5 лет, предпочтительно менее 2 лет). Кроме того, это позволяет индуцировать ί.Ό4 Т-клеточный ответ, который является более стабильным во времени, например, все еще присутствует через 1 год после первой вакцинации, по сравнению с ответом, индуцированным безадъювантной композицией.
В конкретном аспекте ί.Ό4 Т-клеточный иммунный ответ, такой как усиленный СЭ4 Т-клеточный иммунный ответ, полученный у непримированного субъекта, включает индукцию перекрестнореактивного ί.Ό4 Т-хелперного ответа. В частности, увеличивается количество перекрестно-реактивных ί.Ό4 Т-клеток. Под перекрестно-реактивным СЭ4-ответом понимают распознавание СЭ4 Т-клетками общих эпитопов среди штаммов вируса гриппа.
Обычно доступные противогриппозные вакцины эффективны только против инфицирующих штаммов вируса гриппа, имеющих гемагглютинины с похожими антигенными характеристиками. Если инфицирующий (циркулирующий) вирус гриппа был подвергнут минорным изменениям (таким как точечная мутация или накопление точечных мутаций, приводящее к аминокислотным изменениям, например, в поверхностных гликопротеинах, в частности гемагглютинине (антигенный дрейфующий вариант вирусного штамма)), то вакцина все еще может обеспечивать некоторую защиту, хотя она может обеспечивать только ограниченную защиту, поскольку вновь созданные варианты могут ускользать от иммунитета, индуцированного предшествующей инфекцией вируса гриппа или вакцинацией. Антигенный дрейф ответственен за ежегодные эпидемии, которые происходят в течение периодов времени между пандемиями (^11еу & 8ке11е1, 1987, Апп. Веу. Вюскет. 56, 365-394). Индукция перекрестно-реактивных СЭ4 Т-клеток дает дополнительное преимущество для композиции по изобретению в том, что она может также обеспечивать перекрестную защиту, другими словами, защиту против гетерологичных инфекций, т.е. инфекций, вызываемых циркулирующим штаммом вируса гриппа, который является вариантом (например, дрейфующим) штамма вируса гриппа, содержащегося в иммуногенной композиции. Это может иметь преимущество, когда циркулирующий штамм трудно культивировать на куриных эмбрионах или продуцировать в клеточной культуре, что делает использование дрейфующего штамма рабочей альтернативой. Это также может иметь преимущество в случаях, когда субъект получал первую и вторую вакцинацию с интервалом в несколько месяцев или год и когда штамм вируса гриппа в иммуногенной композиции, используемой для второй иммунизации, представляет собой дрейфующий вариантный штамм штамма, используемого в композиции, используемой для первой вакцинации.
Следовательно, адъювантная противогриппозная иммуногенная композиция, которая определена в данном описании, имеет большую способность индуцировать серопротекцию и перекрестно-реактивные ί.Ό4 Т-клетки у вакцинируемых пожилых субъектов. Это свойство может быть связано с повышенной способностью отвечать на вариантный штамм штамма, присутствующего в иммуногенной композиции. Это может служить доказательством важного преимущества в пандемической ситуации. Например, поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция, содержащая какой-либо из штаммов Н5, Н2, Н9, Н7 или Н6 или несколько штаммов из них, может обеспечивать повышенную способность отвечать на пандемический вариант, т.е. дрейфующий штамм указанного пандемического штамма(ов), либо после следующей далее вакцинации указанным дрейфующим штаммом, либо после инфекции указанным дрейфующим штаммом.
Детекция перекрестно-реактивных ί.Ό4 Т-клеток после вакцинации противогриппозной вакциной
СЭ4 Т-клетки, которые способны распознавать как гомологичные, так и дрейфующие штаммы вируса гриппа, названы в настоящем документе перекрестно-реактивными. Адъювантные противогриппозные композиции, описанные в данном изобретении, способны демонстрировать гетеросубтипическую перекрестную реактивность, поскольку наблюдается перекрестная реактивность против дрейфующих штаммов вируса гриппа. Как указано выше, способность пандемической вакцинной композиции быть эффективной против дрейфующих пандемических штаммов может служить доказательством важности этого свойства в случае пандемий.
Согласно вышеприведенным наблюдениям у человека идентифицированы ί.Ό4 Т-клеточные эпитопы, общие для разных штаммов вируса гриппа (6е16ег С. е1 а1. 1998, 1п1. 1ттипо1. 10(2): 211-22; Се16ег
- 26 018860
С.М. е1 а1. 1996, 1. Упо1., 70(7): 4787-90; Се1бег С.М. е1 а1. 1995, 1. Упо1., 1995, 69(12): 7497-506).
В конкретном воплощении адъювантная композиция может приносить дополнительную пользу, обеспечивая лучшую защиту против циркулирующих штаммов, подвергнутых более значительному изменению (такому как генетическая рекомбинация, например, между двумя разными видами) в гемагглютинине (антигенный шифт), против которых доступные в настоящее время вакцины не эффективны.
Ревакцинация и композиция, использованная для ревакцинации (бустерная композиция)
В одном из воплощений изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата в изготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных иммуногенной композицией, заявленной в данном описании.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата из первого пандемического штамма вируса гриппа в изготовлении адъювантной иммуногенной композиции, как определено в данном описании, для защиты против инфекции вирусом гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, являющимся вариантом указанного первого штамма вируса гриппа.
В другом аспекте изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата в изготовлении противогриппозной иммуногенной композиции для ревакцинации людей, ранее вакцинированных адъювантной противогриппозной композицией, заявленной в данном описании, или адъювантной противогриппозной композицией, содержащей вариантный штамм вируса гриппа, при этом адъювант является таким, как он определен в данном описании.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ вакцинации человеческой популяции или отдельного человека против одного штамма вируса гриппа с последующей ревакцинацией указанного человека или популяции против вариантного штамма вируса гриппа, включающий введение указанному человеку (1) первой композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат из первого штамма вируса гриппа и адъювант, как определено в данном описании, и (2) второй иммуногенной композиции, содержащей вариантный штамм вируса гриппа указанного первого штамма вируса гриппа. В конкретном воплощении указанный первый штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. В другом конкретном воплощении указанный вариантный штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. В частности, ревакцинацию осуществляют с использованием противогриппозной композиции, содержащей по меньшей мере один штамм, который является циркулирующим пандемическим штаммом. Как примирующая композиция, так и бустерная композиция могут быть поливалентными, т.е. могут содержать по меньшей мере два штамма вируса гриппа. Если композиция(и) является (являются) поливалентной(ыми), то по меньшей мере один штамм ассоциирован с вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. Обычно ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первой(ых) вакцинации(й), предпочтительно через 8-14 месяцев, более предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев.
Иммуногенная композиция для ревакцинации (бустерная композиция) может содержать любой тип антигенного препарата, либо инактивированный, либо живой аттенуированный. Она может содержать один и тот же тип антигенного препарата, например расщепленный вирус гриппа или его антигенный препарат, или представлять собой цельновирионную вакцину или вакцину на основе очищенных НА и ΝΑ (субъединичную), что и иммуногенная композиция, используемая для первой вакцинации. Альтернативно, бустерная композиция может содержать другой тип антигена вируса гриппа, отличающийся от используемого для первой вакцинации. Предпочтительно используют расщепленный вирус. Бустерная композиция может быть адъювантной или безадъювантной. Безадъювантная бустерная композиция может представлять собой Е1иапх™/а-К1х®/1пйи8р1й®, которую вводят внутримышечно. Данная композиция содержит три инактивированных расщепленных вирионных антигена, приготовленных из рекомендованных ВОЗ штаммов вируса гриппа соответствующего сезона.
Бустерная композиция может быть адъювантной или безадъювантной. В конкретном воплощении бустерная композиция содержит сапониновый адъювант, который определен в данном описании.
В конкретном воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации (также называемая в данном описании ниже бустерная композиция) содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие СЭ4 Т-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Считается, что общий ί.Ό4 Т-клеточный эпитоп означает пептиды/последовательности/эпитопы из разных антигенов, которые могут распознаваться одной и той же СЭ4-клеткой (см. примеры описанных эпитопов в: СеИег С. е1 а1., 1998, Ιηΐ. 1шшипо1. 10(2): 211-22; Се1бег С.М. е1 а1., 1996, I. Уйо1. 70(7): 4787-90; Се1бег С.М. е1 а1., 1995, I. У1го1. 69(12): 7497-506).
В одном из воплощений изобретения бустерная композиция представляет собой одновалентную противогриппозную композицию, содержащую штамм вируса гриппа, который ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть ассоциирован с пандемической вспышкой. В частности, указанный штамм в бустерной композиции представляет собой циркулирующий пандемический штамм. Подходящими штаммами являются: Η5Ν1, Η9Ν2, Η7Ν7 и Η2Ν2, но не ограничиваются этим. Указанный штамм может быть тем же, или одним из, что и присутствующие в композиции, используемой для первой вак
- 27 018860 цинации.
В альтернативном воплощении указанный штамм может представлять собой вариантный штамм, т.е. дрейфующий штамм, штамма, присутствующего в композиции, используемой для первой вакцинации. В другом конкретном воплощении бустерная композиция представляет собой поливалентную противогриппозную вакцину. В частности, если бустерная композиция является поливалентной вакциной, такой как двухвалентная, трехвалентная или четырехвалентная вакцина, то по меньшей мере один штамм ассоциирован с пандемической вспышкой или может быть связан с пандемической вспышкой. В конкретном воплощении два или более штамма в бустерной композиции являются пандемическими штаммами. В другом конкретном воплощении по меньшей мере один пандемический штамм в бустерной композиции представляет собой штамм того же типа или является одним из них, что и присутствующие в композиции, используемой для первой вакцинации. В альтернативном воплощении по меньшей мере один штамм может представлять собой вариантный штамм, т.е. дрейфующий штамм, по меньшей мере одного пандемического штамма, присутствующего в композиции, используемой для первой вакцинации. В частности, по меньшей мере один штамм в бустерной композиции является циркулирующим пандемическим штаммом. Бустерная композиция может быть или не быть адъювантной.
Обычно бустерную композицию, если ее используют, применяют на следующий сезон гриппа, например приблизительно через один год после первой иммуногенной композиции. Бустерную композицию также можно использовать каждый последующий год (третья, четвертая, пятая вакцинация и т.д.). Бустерная композиция может быть такой же, как и композиция, используемая для первой вакцинации. Удобно, когда бустерная композиция содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который является вариантным штаммом вируса гриппа, используемого для первой вакцинации. В частности, штаммы вируса гриппа или их антигенный препарат выбирают в соответствии с эталонным веществом, распределяемым Всемирной организацией здравоохранения, так что они адаптированы к штамму вируса гриппа, который циркулирует в год ревакцинации.
Антиген вируса гриппа или антигенная композиция, используемые при ревакцинации, предпочтительно содержат адъювант, соответственно, как описано выше. Адъювантом может быть сапонин, представленный в форме липосомы, как описано в данном изобретении выше, который является предпочтительным, возможно содержащим дополнительный адъювант, такой как ЗЭ-МРЬ.
В одном аспекте ревакцинация индуцирует любое одно, предпочтительно два или все, из следующего: (1) усиленный СЭ4-ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата, или (2) усиленный ответ В-клеток памяти, или (3) усиленный гуморальный ответ по сравнению с эквивалентным ответом, индуцированным после первой вакцинации с применением безадъювантного вируса гриппа или его антигенного препарата. Предпочтительно, когда иммунологический ответ(ы), индуцированный после ревакцинации с применением адъювантного вируса гриппа или его антигенного препарата, как определено в данном описании, оказывается (оказываются) выше соответствующего ответа, индуцированного после ревакцинации безадъювантной композицией. Предпочтительно, когда иммунологические ответы, индуцированные после ревакцинации с применением безадъювантного, предпочтительно расщепленного, вируса гриппа, выше у популяции, первый раз вакцинированной адъювантной композицией вируса гриппа, предпочтительно расщепленного, по сравнению с соответствующим ответом у популяции, первый раз вакцинированной безадъювантной композицией расщепленного вируса гриппа, предпочтительно расщепленного.
В конкретном воплощении ревакцинация субъектов бустерной композицией, содержащей вирус гриппа и сапониновый адъювант в форме липосомы, как определено в данном описании выше, показывает более высокие титры антител по сравнению с соответствующими значениями в группе людей, первый раз вакцинированных безадъювантной композицией и ревакцинируемых безадъювантной композицией. Эффект адъюванта на усиление антительного ответа на ревакцинацию особенно важен для пожилого населения, у которого, как известно, имеется низкий ответ на вакцинацию или инфекцию вирусом гриппа. Связанная с адъювантной композицией польза также была отмечена в отношении усиления СЭ4 Тклеточного ответа после ревакцинации.
Конкретно, адъювантная композиция по изобретению способна индуцировать лучшую перекрестную реактивность против дрейфующего штамма (штамм вируса гриппа из следующего сезона гриппа) по сравнению с защитой, обеспечиваемой контрольной вакциной. Указанная перекрестная реактивность демонстрирует более продолжительную персистенцию по сравнению с полученной с применением безадъювантной композиции. Эффект адъюванта в повышении перекрестной реактивности против дрейфующего штамма важен в пандемической ситуации.
В другом воплощении изобретение относится к режиму вакцинации, согласно которому первую вакцинацию осуществляют противогриппозной композицией, предпочтительно композицией расщепленного вируса гриппа, содержащей по меньшей мере один штамм вируса гриппа, который потенциально мог бы вызвать вспышку пандемии, а ревакцинацию осуществляют циркулирующим штаммом, или пандемическим штаммом, или классическим штаммом.
- 28 018860
СИ4-эпитоп в НА
Этот антигенный дрейф главным образом свойственен эпитопным участкам вирусных поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы ^А). Известно, что любое различие в СЭ4- и Вклеточных эпитопах среди разных штаммов вируса гриппа, используемое вирусом для ускользания от адаптивного ответа иммунной системы хозяина, будет играть важную роль в вакцинации против гриппа, и это действительно имеет место.
У человека идентифицированы СИ4 Т-клеточные эпитопы, общие для разных штаммов вируса гриппа (см., например: ОеИет С. е! а1., 1998, Ιηΐ. 1ттипо1. 10(2): 211-22; Ое1бет С.М. е! а1., 1996, I. У1го1. 70(7): 4787-90; и ОеИег С.М. е! а1., 1995, I. У1го1., 69(12): 7497-506).
В конкретном воплощении ревакцинацию осуществляют путем использования бустерной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие СИ4 Т-клеточные эпитопы с антигеном вируса гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Таким образом, данное изобретение относится к применению иммуногенной композиции, содержащей пандемический вирус гриппа или его антигенный препарат и сапонин в форме липосомы, в частности 0821 в форме, подвергнутой детоксикации холестерином, возможно с 3П-МРЬ, в изготовлении компонента мультидозовой вакцины для первой вакцинации, причем мультидозовая вакцина дополнительно содержит в виде повторной иммунизирующей дозы вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие СИ4 Т-клеточные эпитопы с антигеном пандемического вируса гриппа или антигенным препаратом этого вируса, присутствующим в дозе, введенной при первой вакцинации.
Способы вакцинации
Иммуногенные композиции по изобретению можно вводить любым подходящим способом доставки, таким как интрадермальный, через слизистые, например интраназальный, пероральный, внутримышечный или подкожный. Другие способы доставки хорошо известны в данной области.
Для адъювантной иммуногенной композиции предпочтительным является внутримышечный способ доставки.
Интрадермальная доставка представляет собой другой подходящий способ. Для интрадермальной доставки может быть использовано любое подходящее устройство, например устройства с короткой иглой, такие как устройства, описанные в И8 4886499, И8 5190521, И8 5328483, И8 5527288, И8 4270537, и8 5015235, и8 5141496, И8 5417662. Интрадермальные вакцины также можно вводить посредством устройств, ограничивающих эффективную длину проникновения иглы внутрь кожи, таких как устройства, описанные в АО 99/34850 и ЕР 1092444, которые включены в данное описание посредством ссылки, и их функциональных эквивалентов. Кроме того, подходят устройства с безыгольным впрыскиванием, с помощью которых доставляют жидкие вакцины в дерму посредством безыгольного инжектора для жидкостей или посредством иглы, которой прокалывают роговичный слой и создают струю, достигающую дерму. Устройства с безыгольным впрыскиванием описаны, например, в И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, и8 4940460, АО 97/37705 и АО 97/13537. Кроме того, подходят баллистические устройства для доставки порошков/частиц, в которых используется сжатый газ для ускорения прохождения вакцины в порошковой форме через внешние слои кожи в дерму. Кроме того, в классическом способе интрадермального введения манту могут быть использованы традиционные шприцы.
Другим подходящим способом введения является подкожный способ. Любое подходящее устройство может быть использовано для подкожной доставки, например классическая игла. Предпочтительно используют действие безыгольного инжектора, как, например, опубликовано в АО 01/05453, АО 01/05452, АО 01/05451, АО 01/32243, АО 01/41840, АО 01/41839, АО 01/47585, АО 01/56637, АО 01/58512, АО 01/64269, АО 01/78810, АО 01/91835, АО 01/97884, АО 02/09796, АО 02/34317. Более предпочтительно, когда указанное устройство предварительно заполнено жидкой вакцинной композицией.
Альтернативно, вакцину вводят интраназально. Обычно вакцину вводят местно в носоглоточную область, предпочтительно без осуществления распыления в легкие. Желательно использовать устройство для интраназальной доставки, которое доставляет вакцинную композицию в носоглоточную область, без или по существу без ее проникновения в легкие.
Предпочтительными устройствами для интраназального введения вакцин по изобретению являются распылительные устройства. Подходящие имеющиеся в продаже назальные распылительные устройства включают Ассикргау™ (Вес!оп Июкшкоп). Небулайзеры продуцируют очень мелкий аэрозоль, который может легко вдыхаться в легкие, и, следовательно, он не достигнет эффективно слизистых оболочек носа. Следовательно, небулайзеры не являются предпочтительными.
Предпочтительными распылительными устройствами для интраназального применения являются устройства, эффективность которых не зависит от давления, прилагаемого пользователем. Эти устройства известны как устройства с пороговым давлением. Жидкость высвобождается из сопла только тогда, когда приложено пороговое давление. Эти устройства позволяют легче достичь получения аэрозоля с регулярным размером капелек. Устройства с пороговым давлением, подходящие для применения в на
- 29 018860 стоящем изобретении, известны в данной области техники и описаны, например, в νθ 91/13281 и ЕР 311863 В и ЕР 516636, которые включены в данное описание посредством ссылки. Такие устройства имеются в продаже от фирмы РГеШег СтЬН и также описаны в Воттег, К. Рйагтасеийса1 Тесйпо1оду Еигоре, 8ер! 1999.
Предпочтительные интраназальные устройства продуцируют капельки (измеренные с использованием воды в качестве жидкой фазы) в диапазоне 1-200 мкм, предпочтительно 10-120 мкм. Ниже 10 мкм существует риск вдохнуть их, следовательно, желательно иметь не более чем приблизительно 5% капелек менее 10 мкм. Капельки более 120 мкм не разбрызгиваются так же хорошо, как более мелкие капельки, поэтому желательно иметь не более чем приблизительно 5% капелек, превышающих 120 мкм.
Доставка двойной дозы представляет собой дополнительный предпочтительный признак системы интраназальной доставки для применения с вакцинами по изобретению. Устройства для двойного дозирования содержат две субдозы разовой вакцинной дозы, по одной субдозе для введения в каждую ноздрю. Обычно две субдозы находятся в одном отсеке, и конструкция устройства позволяет осуществлять эффективную доставку одной субдозы в данный момент времени. Альтернативно, для введения вакцины по изобретению может быть использовано монодозирующее устройство.
Альтернативно, в настоящее изобретение также включен способ эпидермальной или трансдермальной вакцинации.
В конкретном аспекте настоящего изобретения адъювантная иммуногенная композиция для первого введения может быть введена внутримышечно, а бустерная композиция, либо адъювантная, либо нет, может быть введена другим способом, например интрадермальным, подкожным или интраназальным. В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция, содержащая конкретный антиген вируса гриппа или его антигенный препарат для первого введения, может содержать стандартное количество НА, составляющее 15 мкг на штамм вируса гриппа, а бустерная противогриппозная композиция может содержать низкую дозу НА, т.е. менее 15 мкг, и в зависимости от способа введения может быть введена в меньшем объеме.
Популяции для вакцинирования
Целевой популяцией для вакцинирования может быть человек с ослабленным иммунитетом. Люди с ослабленным иммунитетом обычно обладают меньшей способностью отвечать на антиген, в частности на антиген вируса гриппа, по сравнению со здоровыми взрослыми.
Предпочтительно, когда целевой популяцией является популяция, не примированная против гриппа, либо являющаяся наивной (например, в отношении пандемического штамма), либо ранее не дававшая реакции на инфекцию или вакцинацию вирусом гриппа. Предпочтительно, когда целевой популяцией являются пожилые люди, соответственно, в возрасте 65 лет и старше, более молодые взрослые люди из группы высокого риска (т.е. в возрасте от 18 до 64 лет), как, например, люди, работающие в лечебнопрофилактических учреждениях, или молодые взрослые люди с таким фактором риска, как сердечнососудистое и легочное заболевание, или диабет. Другой целевой популяцией являются все дети в возрасте 6 месяцев и старше, особенно дети в возрасте 6-23 месяцев, которые демонстрируют относительно высокий коэффициент госпитализации, связанной с гриппом. Предпочтительно, когда целевой популяцией являются пожилые люди в возрасте старше 65 лет.
Режимы, дозирование и дополнительные критерии эффективности вакцинации
Соответственно в большинстве случаев иммуногенные композиции по настоящему изобретению представляют собой стандартную инъекционную дозу 0,5 мл, и в случае противогриппозной композиции она содержит 15 мкг антигенного компонента гемагглютинина из каждого штамма вируса гриппа, как измерено простой радиальной иммунодиффузией (8ΚΌ) (1.М. Vооά е! а1., 1. Вю1. 81апб. 5 (1977), 237-247; 1.М. Vооά е! а1., 1. Вю1. 81апб. 9 (1981), 317-330). Соответственно, объем вакцинной дозы будет составлять от 0,5 до 1 мл, в частности стандартный объем вакцинной дозы 0,5 или 0,7 мл. В случае противогриппозных вакцин небольшую корректировку объема дозы можно проводить стандартным образом в зависимости от концентрации НА в первоначальном нерасфасованном образце.
Соответственно, указанная иммуногенная композиция содержит низкую дозу антигена НА, например, любую из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 мкг НА на штамм вируса гриппа.
Предпочтительно, чтобы вакцинная доза по изобретению, в особенности низкая вакцинная доза, могла быть представлена в меньшем объеме, чем традиционные инъекционные сплит-йц-вакцины, который обычно составляет приблизительно 0,5, 0,7 или 1 мл на дозу. Дозы малого объема по изобретению составляют предпочтительно ниже 500 мкл, более предпочтительно ниже 300 мкл и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 200 мкл или меньше на дозу.
Таким образом, предпочтительная вакцинная доза малого объема, соответствующая одному аспекту изобретения, представляет собой дозу, содержащую низкую дозу антигена в малом объеме, например, приблизительно 15 мкг, или приблизительно 7,5 мкг НА, или приблизительно 3,0 мкг НА (на штамм) в объеме приблизительно 200 мкл.
Лекарственное средство против гриппа по изобретению предпочтительно удовлетворяет конкретным международным критериям для вакцин.
Для определения эффективности противогриппозных вакцин приняты международные стандарты.
- 30 018860
Официальные критерии Европейского Союза (ЕС) для эффективной вакцины против гриппа приведены ниже в таблице. Теоретически, чтобы удовлетворять требованиям Европейского Союза, противогриппозная вакцина должна удовлетворять только одному из критериев, приведенных в этой таблице, для всех штаммов вируса гриппа, включенных в вакцину. Композиции по настоящему изобретению соответственно удовлетворяют по меньшей мере одному из таких критериев.
Однако на практике будет необходимо, чтобы все штаммы удовлетворяли по меньшей мере двум или всем трем критериям, в частности, что касается новой вакцины, такой как новая вакцина для доставки посредством другого способа. В некоторых случаях может быть достаточно двух критериев. Например, может быть приемлемо, чтобы двум из трех критериев удовлетворяли все штаммы, в то время как третьему критерию удовлетворяли несколько, но не все штаммы (например, два из трех штаммов). Требования для взрослого населения (18-60 лет) и пожилого населения (старше 60 лет) различны.
18-60 лет | Старше 60 лет | |
Уровень сероконверсии* | > 40% | > 30% |
Фактор конверсии** | >2,5 | >2,0 |
Уровень защиты*** | > 70% | > 60% |
* Уровень сероконверсии определяют как процент вакцинированных субъектов, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров ингибирования гемагглютинина (ΗΙ) после вакцинации для каждого вакцинного штамма.
** Для каждого вакцинного штамма фактор конверсии определяют как кратность увеличения сывороточных средних геометрических титров (СМ^ ΗΙ после вакцинации.
*** Уровень защиты определяют как процент вакцинированных с сывороточным ΗΙ-титром > 1:40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма) и обычно принимают как показатель защиты.
В следующем аспекте согласно изобретению предложен способ создания вакцины против заболеваний, о которых известно, что их можно лечить посредством СО4+ Т-клеточной активации, включающий:
1) выбор антигена, содержащего СО4+ эпитопы, и
2) объединение указанного антигена с сапониновым адъювантом в форме липосомы, как определено в данном описании выше, где указанная вакцина после введения указанному млекопитающему способна индуцировать усиленный СО4 Т-клеточный ответ у указанного млекопитающего.
Содержание всех ссылок в настоящей заявке, включая заявки на патент и выданные патенты, включено в данное описание во всей полноте посредством ссылки.
Во избежание неясности, авторы изобретения подразумевают, что термины содержащие, содержат и содержит в данном описании возможно заменять в каждом случае соответственно на термины состоящий из, состоят из и состоит из.
Данное изобретение далее будет описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
В примере Ι описаны способы иммунологического считывания, используемые в исследованиях на мышах, хорьках и людях.
В примере ΙΙ описано приготовление липосомного адъюванта МРЬ/0821.
В примере ΙΙΙ показана доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на хорьках.
В примере ГУ показана доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на наивных и примированных С57ВЕ6 мышах.
В примере V показано сравнение адъювантной противогриппозной вакцины с 3О-МРЬ в двух разных концентрациях на мышах.
В примере VI показано сравнение адъювантной противогриппозной вакцины с 3О-МРЬ в двух разных концентрациях на пожилых людях.
В примере УН показана доклиническая оценка адъювантной вакцины НРУ на мышах.
В примере УШ показана доклиническая оценка адъювантных и безадъювантных иммуногенных композиций против цитомегаловируса.
В примере ΙΧ показана доклиническая оценка адъювантной вакцинной композиции на основе ΚΤδ,δ с 3О-МРЬ в двух разных концентрациях.
В примере X показана клиническая оценка адъювантной вакцины на основе ΚΤδ,δ с 3О-МРЬ в двух разных концентрациях.
- 31 018860
Пример I. Способы иммунологического считывания.
11. Методы на мышах.
Г1.1. Тест на ингибирование гемагглютинации.
Методика тестирования.
Определяли титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа, используя тест на ингибирование гемагглютинации (Ш). Принцип Ш-теста основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Инактивированные нагреванием образцы сыворотки предварительно обрабатывали каолином и КВС цыпленка для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 единицами гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали полное ингибирование гемагглютинации. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:20, недетектируемый уровень оценивали как титр, равный 10.
Статистический анализ.
Статистический анализ осуществляли для Ш-титров после вакцинации, используя и№8ТАТ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
критерий Шапиро-Уилка (8Ыар1то-Айк) для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения групп;
критерий Кохрейна (СосЫгаи) с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
двусторонний дисперсионный анализ, выполненный на группах;
ЮЭ-критерий Тьюки для множественных сравнений.
Г1.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов.
Эта методика позволяет осуществить количественное определение антиген-специфических Тлимфоцитов на основе продуцирования ими цитокинов: эффекторные Т-клетки и/или эффекторные Тклетки памяти продуцируют ΓΕΝ-γ и/или центральные Т-клетки памяти продуцируют Ш-2. На 7-е сутки после иммунизации собирают РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови).
Лимфоидные клетки повторно стимулируют 1и уйто в присутствии ингибитора секреции (брефелдина). Эти клетки затем подвергают традиционной иммунофлуоресцентной процедуре с использованием флуоресцентных антител (к СЭ4, СЭ8, ΣΕΝ-γ и Ш-2). Результаты выражают как частоту встречаемости цитокин-позитивных клеток среди СЭ4/СЭ8 Т-клеток. Внутриклеточное окрашивание цитокинов Тклеток осуществляли на РВМС через 7 суток после второй иммунизации. Осуществляли забор крови от мышей и объединяли в гепаринизированной среде КРМI (Ко§^е11 Рагк Метопа1 ИъкЦПе) + Абб (добавки). Что касается крови, суспензии РВЬ (лимфоциты периферической крови), разведенные КРМI + Абб, наслаивали на градиент Ьутрйо1у!е-Матта1 согласно рекомендованному протоколу (центрифугирование 20 мин при 2500 об/мин и комнатной температуре). Мононуклеарные клетки с границы раздела фаз удаляли, промывали 2х в КРМI + Абб, и РВМС-суспензии доводили до 2χ 106 клеток/мл, используя КРМI с 5% фетальной телячьей сыворотки (ЕС8).
Антигенную стимуляцию 1и уйто РВМС осуществляли в конечной концентрации 1 χ 106 клеток/мл (пробирка для ЕАС8) с использованием трехвалентной расщепленной Е1и-вакцины на микрогранулах (5 мкг НА/штамм) или цельного И (АЫо1е И) (1 мкг НА/штамм) и затем инкубировали 2 ч при 37°С с добавлением анти-СО28 и анти-СЭ49б (1 мкг/мл в обоих случаях).
Добавление этих двух антител усиливало пролиферацию и продуцирование цитокинов под действием активированных Т- и ΝΚ-клеток и могло дать совместный стимулирующий сигнал для индуцирования СТЬ.
В дополнение к этому, РВМС также стимулировали в течение ночи с использованием ВМОС (1 χ 105 клеток/мл), импульсно обработанных трехвалентной сплит-Е1и-вакциной (30 мкг НА/штамм) или АЫо1е И (5 мкг НА/штамм), которые приготавливали посредством импульсной обработки ВМОС расщепленной Р1и-вакциной (Р1и-сплит) (60 мкг/НА штамм) или трехвалентной Е1и АЫо1е И (10 мкг НА/штамм) в течение 6 ч при 37°С. После стадии повторной антигенной стимуляции РВМС инкубируют в течение ночи при 37°С в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) для ингибирования секреции цитокинов.
Окрашивание на ШгЫ^/Ш-2/СП4/СП8 осуществляли следующим образом. Клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкл РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 1% ЕС8, содержащего 2% Ес-блокирующего реагента (1/50; 2.4О2). После 10 мин инкубации при 4°С добавляли 50 мкл смеси анти-СО4-РЕ (2/50) и анти-СО8 регСр (3/50) и инкубировали 30 мин при 4°С. После промывки в РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 1% ЕС8 клетки подвергали пермеабилизации путем ресуспендирования в 200 мкл Су1оПх-Су1орепп (набор от ВО (Веск!ои Пюкткои)) и инкубировали 20 мин при 4°С. Клетки затем промывали, используя Регт АакЫ (набор от ВО), и ресуспендировали с использованием 50 мкл смеси антиЛЕЫ^-АРС (аллофикоцианин) (1/50) +
- 32 018860 (флуоресцеинизотиоцианат) (1/50), разведенных в Ρе^т ЭДаЛ. После инкубации минимум 2 ч, максимум в течение ночи при 4°С, клетки промывали Ρе^т ЭДаЛ и ресуспендировали в ΡВ8 с 1% ЕС8 + 1% параформальдегида. Анализ образцов осуществляли с использованием ЕЛС8 (Диоге8сепсе-асбуа!еб се11 койег, клеточный сортер с активацией флуоресценцией). Живые клетки сортировали (Е8С/88С (прямое и угловое светорассеяние)) и сбор данных осуществляли приблизительно на 50000 событий (лимфоцитов) или 35000 событий на СЭ4+ Т-клетках. Проценты ΙΡΝ-γ+ или 1Ь2+ рассчитывали на отсортированных популяциях СЭ4+ и СЭ8+.
Ι.2. Методы с использованием хорьков.
1.2.1. Тест на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ).
Методика тестирования.
Определяли титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа, используя тест на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ). Принцип ΗΙ-теста основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (ВВС) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Образцы сыворотки первоначально обрабатывали 25%-ным раствором нейраминидазы (ВОЕ) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 единицами гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации, используя отверстия для прочтения. Титры выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали полное ингибирование гемагглютинации. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, недетектируемый уровень оценивали как титр, равный 5.
Статистический анализ.
Статистический анализ осуществляли для ΗΙ-титров (41-е сутки до контрольного заражения), используя υΝΙ8ΤΑΤ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
критерий Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения в группах;
критерий Кохрейна с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
критерий взаимодействия одностороннего ΑΝΌνΑ (дисперсионного анализа);
ЖЭ-критерий Тьюки для множественных сравнений.
Ι.2.2. Назальные смывы.
Назальные смывы получали путем введения 5 мл ΡВ8 в обе ноздри бодрствующим животным. Инокулят собирали в чашку Петри и помещали в контейнеры для образцов на сухом льду.
Титрование вирусов в назальных смывах.
Все назальные образцы сначала подвергали стерилизации фильтрованием через фильтры 8рт X (Сойаг) для удаления любого бактериального загрязнения. По 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных смывов переносили в титрационные микропланшеты, содержащие по 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл клеток МОСК (2,4χ105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С в течение 5-7 суток. Через 6-7 суток инкубации культуральную среду осторожно удаляют, добавляют по 100 мкл 1/20 ЭД8Т-1-содержащей среды и инкубируют в течение еще 18 ч.
Интенсивность желтого формазанового красителя, образующегося в результате восстановления ЭД8Т-1 жизнеспособными клетками, пропорциональна количеству находящихся в лунке жизнеспособных клеток по окончании анализа титрования вирусов и определяется количественно путем измерения поглощения в каждой лунке на соответствующей длине волны (450 нм). Начало отсчета определяют как среднее значение ОЭ (оптическая плотность) для неинфицированных контрольных клеток - 0,3 ОЭ (0,3 ОЭ соответствует ± 3 8(Эеу (стандартное отклонение) ОЭ для неинфицированных контрольных клеток). Положительный балл определяют, когда ОЭ находится ниже начала отсчета, и, наоборот, отрицательный балл определяют, когда ОЭ находится выше начала отсчета. Титры вирусного шеддинга определяли согласно Вееб апб Миепсй и выражали в виде 1од ТСШ50(доза заражения 50% культуры ткани)/мл.
Ι.3. Анализы оценки иммунного ответа у людей.
Ι.3.1. Анализ ингибирования гемагглютинации.
Иммунный ответ определяли путем измерения ΗΙ-антител, используя способ, описанный Центром ВОЗ по совместному изучению гриппа (ЭДΗО Со11аЬога!шд Сеп!ге 1ог тПиепха), Центрами по контролю заболеваемости, Атланта, США (1991).
Измерение титров антител осуществляли на размороженных образцах сыворотки с помощью стандартизированного и комплексно утвержденного микрометода с использованием 4 единиц ингибирования гемагглютинации (4 ΗΙυ) соответствующих антигенов и 0,5%-ной суспензии куриных эритроцитов. Неспецифические сывороточные ингибиторы удаляли тепловой обработкой и обработкой разрушающим рецепторы ферментом.
- 33 018860
Полученные образцы сыворотки оценивали по уровням Н1-антител. Начиная с исходного разведения 1:10, приготавливали серии разведений (в 2 раза) до конечного разведения включительно, составляющего 1:20480. За конечную точку титрования принимали наибольшее разведение, при котором наблюдали полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы осуществляли в двух повторах.
1.3.2. Анализ ингибирования нейраминидазы.
Анализ осуществляли в сенсибилизированных фетуином титрационных микропланшетах. Приготавливали серии 2-кратных разведений антисыворотки и смешивали со стандартизированным количеством вируса гриппа А Н3№, Н1М или вируса гриппа В. Тест основан на биологической активности нейраминидазы, которая ферментативно высвобождает нейраминовую кислоту из фетуина. После отщепления концевой нейраминовой кислоты в-О-галактоза-Ы-ацетил-галактозамин становится доступным. В лунки добавляли меченый пероксидазой хрена (НКР) агглютинин из арахиса АгасЫк Ыуродаеа, который специфически связывается с галактозными структурами. Количество связанного агглютинина может быть определено и количественно измерено в реакции с субстратом пероксидазы тетра-метилбензидином (ТМВ). Наибольшее разведение антител, которое все еще ингибирует активность вирусной нейраминидазы по меньшей мере на 50%, указывали как ΝΙ-титр.
Ι.3.3. Анализ нейтрализующих антител.
Измерения нейтрализующих антител осуществляли на размороженных образцах сыворотки. Нейтрализацию вируса содержащимися в сыворотке антителами определяли в микроанализе нейтрализации. В данном анализе использовали сыворотки без дополнительной обработки. Каждую сыворотку тестировали в трех повторах. Стандартизированное количество вируса смешивали с последовательными разведениями сыворотки и инкубировали для обеспечения связывания антител с вирусом. Далее к смеси вируса и антисыворотки добавляли клеточную суспензию, содержащую определенное количество клеток МБСК, и инкубировали при 33°С. По окончании периода инкубации репликацию вируса визуализировали, используя гемагглютинацию эритроцитов цыпленка. Титр сыворотки, соответствующий 50%-ной нейтрализации, рассчитывали по методу Кееб и МиепсЫ.
Ι.3.4. Клеточно-опосредованный иммунитет оценивали с использованием проточной цитометрии цитокинов (СРС).
Антиген-специфические СБ4 и СБ8 Т-клетки периферической крови могут быть повторно стимулированы ш νίΙΐΌ к продуцированию 1Ь-2, СБ40Ь, ΤΝΡ-альфа и ΙΡΝ, если их инкубировать с их соответствующим антигеном. В результате количество антиген-специфических СБ4 и СБ8 Т-клеток можно подсчитать с помощью проточной цитометрии с использованием традиционного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также продуцирования внутриклеточных цитокинов. В настоящем исследовании в качестве антигена для повторной стимуляции специфических к вирусу гриппа Т-клеток использовали антиген вакцинного вируса гриппа, а также пептиды конкретного белка вируса гриппа. Результаты выражали в виде частоты встречаемости цитокин-позитивных СБ4 или СБ8 Т-клеток в СБ4 или СБ8 Т-клеточной субпопуляции.
Ι.3.5. Статистические методы.
1.3.5.1. Первичные конечные точки.
Процент, интенсивность и связь с вакцинацией указанных местных и общих признаков и симптомов в течение 7 суток периода контрольного наблюдения (т.е. в день вакцинации и в течение 6 последующих суток) после вакцинации и в целом.
Процент, интенсивность и связь с вакцинацией непредусмотренных местных и общих признаков и симптомов в течение 21 суток периода контрольного наблюдения (т.е. в день вакцинации и в течение 20 последующих суток) после вакцинации и в целом.
Случаи серьезных неблагоприятных событий в течение всего исследования.
Ι.3.5.2. Вторичные конечные точки.
В отношении гуморального иммунного ответа.
Наблюдаемые переменные:
на 0-е и 21-е сутки: титры сывороточных ингибирующих гемагглютинацию (Ш) антител и ΝΙантител, тестируемые по отдельности против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (анти-НШ1-, анти-ЖЮ- и анти-В-антитела);
на 0-е и 21-е сутки: титры нейтрализующих антител, тестируемых отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине.
Вторичные переменные (с доверительными интервалами 95%):
средние геометрические титры (СМТ) сывороточных Ш-антител с доверительными интервалами 95% (ДИ 95%) до и после вакцинации;
уровни сероконверсии* с ДИ 95% на 21-е сутки;
факторы конверсии** с ДИ 95% на 21-е сутки;
уровни серопротекции*** с ДИ 95% на 21-е сутки;
СМТ сывороточных М-антител (с доверительными интервалами 95%) для всех временных точек.
* Уровень сероконверсии, определенный как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных Ш-титров на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутка
- 34 018860 ми, для каждого вакцинного штамма.
** Фактор конверсии, определенный как кратное увеличение сывороточных СМТ ΗΙ на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками, для каждого вакцинного штамма.
*** Уровень защиты, определенный как процент вакцинированных с сывороточным ΗΙ-титром, равным 40, после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), который обычно принимают в качестве показателя защиты.
В отношении клеточно-опосредованного иммунного (СМ1) ответа
Наблюдаемая переменная.
На 0-е и 21-е сутки: частота встречаемости цитокин-позитивных СЭ4/СЭ8-клеток на 106 в разных тестах.
В каждом тесте количественно определяли ответ СЭ4/СЭ8 Т-клеток на:
пептидный антиген вируса гриппа (ρί) (точная природа и происхождение этих антигенов нуждается в представлении/объяснении);
антиген расщепленного вируса гриппа (§Т);
антиген цельного вируса гриппа (\\Т).
Вторичные переменные:
клетки, продуцирующие по меньшей мере два разных цитокина (СЭ40Ь, 1Ь-2, ΙΕΝγ, ΤΝΡα);
клетки, продуцирующие по меньшей мере СЭ40Ь и другой цитокин (1Ь-2, ΤΝΡα, ΙΕΝγ);
клетки, продуцирующие по меньшей мере 1Ь-2 и другой цитокин (СЭ40Ь, ΤΝΡα, ΙΕΝγ);
клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΕΝγ и другой цитокин (1Ь-2, ΤΝΡα, СЭ40Ь);
клетки, продуцирующие по меньшей мере ΤΝΕα и другой цитокин (Ιί-Σ, СЭ40Ь, ΙΕΝγ).
Ι.3.5.3. Анализ иммуногенности.
Анализ иммуногенности осуществляли для всей группы вакцинированных. Для каждой подвергаемой обработке группы подсчитывали следующие параметры (с доверительными интервалами 95%):
средние геометрические титры (ΟΜΤ) ΗΙ- и ΝΙ-антител на 0-е и 21-е сутки;
средние геометрические титры (ΟΜΤ) нейтрализующих антител на 0-е и 21-е сутки;
факторы конверсии на 21-е сутки;
уровни сероконверсии (8С) на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных ΗΙ-титров на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками;
уровни защиты на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных с сывороточным ΗΙтитром, равным 1:40;
частоту встречаемости СЭ4/СЭ8 Т-лимфоцитов, секретируемых в ответ, суммировали (описательная статистика) для каждой вакцинированной группы, для каждой временной точки (0-е сутки, 21-е сутки) и для каждого антигена (пептид вируса гриппа (ρί), расщепленный вирус гриппа (ί) и цельный вирус гриппа (\\Т));
описательную статистику индивидуального различия между ответами во временные точки после и до (Ро81-Рге) для каждой вакцинированной группы и каждого антигена (ρί, ί и \\Т) в каждом из 5 разных тестов;
для сравнения обнаруженных различий между 3 группами использовали непараметрический критерий (критерий Краскела-Уоллиса (Кги8ка11-^а1118)) и статистическое значение р рассчитывали для каждого антигена в каждом из 5 разных тестов. Все критерии значимости были двусторонними. Значения р, меньшие или равные 0,05, считали статистически значимыми.
Пример ΙΙ. Приготовление МРЬ/р§21-содержащего липосомного адъюванта.
ΙΙ.1. Приготовление жидкой суспензии МРЬ.
Партию жидкого МРЬ (как использовано во всем документе, это сокращенный вариант для 3ΌМРЬ, т.е. 3-О-деацилированного монофосфориллипида А) приготавливают из лиофилизованного порошка 3Э-МРН Жидкий МРЬ представляет собой стабильную концентрированную (приблизительно 1 мг/мл) водную дисперсию неочищенного вещества, которое готово к применению в вакцинной или адъювантной композиции. Схематическое представление способа приготовления приведено на фиг. 1.
Для максимального размера партии 12 г приготовление партии жидкого МРЬ осуществляют в стерильных стеклянных контейнерах. Процесс диспергирования МРЬ состоит из следующих стадий:
суспендировать порошок МРЬ в воде для инъекций;
провести дезагрегацию любых больших агрегатов путем нагревания (термической обработки); уменьшить размер частиц до диапазона от 100 до 200 нм посредством микрофлюидизации;
провести предварительную фильтрацию препарата на модуле для предварительной фильтрации 8аг1ос1еан, 0,8/0,65 мкм;
провести стерилизацию фильтрованием препарата при комнатной температуре (модуль ЗайоЬгаи Р; 0,22 мкм).
Порошок МРЬ лиофилизуют посредством микрофлюидизации, получая стабильную коллоидную
- 35 018860 водную дисперсию (размер частиц МРЬ допускает стерильную фильтрацию). Лиофилизованный порошок МРЬ диспергируют в воде для инъекций с целью получения грубой суспензии 10 мг/мл. Затем суспензию подвергают термической обработке при перемешивании. После охлаждения до комнатной температуры начинают процесс микрофлюидизации для уменьшения размера частиц. Микрофлюидизацию осуществляют, используя установку Мюгойшбюз М110ЕН, посредством непрерывной циркуляции дисперсии через камеру для микрофлюидизационных взаимодействий, при определенном давлении для минимального количества проходов (количество циклов: пт1п). Продолжительность микрофлюидизации, представленную количеством циклов, рассчитывают на основе измеренной скорости потока и объема дисперсии. На данном оборудовании при указанном давлении полученная скорость потока может варьировать от одной камеры взаимодействия к другой и на протяжении срока службы конкретной камеры взаимодействия. В представленном примере используемая камера взаимодействия имеет тип Ε20Υ М1сго£1ш61С8. Поскольку эффективность микрофлюидизации связана с парой давление - скорость потока, продолжительность процесса может меняться от одной партии к другой. Время, необходимое для 1 цикла, рассчитывают на основе скорости потока. Нужно иметь в виду, что скорость потока представляет собой скорость потока, измеренную с использованием воды для инъекций непосредственно перед введением МРЬ в установку. Один цикл определяют как время (в минутах), необходимое для одного прохождения суммарного объема МРЬ через установку. Время, необходимое для получения п циклов, рассчитывают следующим образом:
пх количество МРЬ для обработки (мл)/скорость потока (мл/мин).
Таким образом, в соответствии с этим подбирают количество циклов. Минимальное количество циклов выполнения (пт1п) описано для предпочтительных используемых оборудования и камер взаимодействия. Общее количество циклов работы определяют по результату измерения размеров частиц, выполненного после пт1п циклов. На основе литературных данных определяют предельный размер частиц (611т). Измерение осуществляют посредством методики фотонно-корреляционной спектроскопии (РС8) и 611т выражают в виде одномодального результата (2атегаде). Если получено значение ниже этого предела, то микрофлюидизация может быть остановлена после пт1п циклов. Выше этого предела микрофлюидизацию продолжают до тех пор, пока не будет получено удовлетворительное уменьшение размера, в течение максимум 50 следующих циклов.
Если фильтрацию не осуществляют непосредственно после микрофлюидизации, то диспергированный МРЬ хранят при температуре от 2 до 8°С, ожидая передачи на участок для фильтрации.
После микрофлюидизации дисперсию разбавляют водой для инъекций и подвергают стерилизации фильтрованием через фильтр 0,22 мкм в ламинарном потоке. Конечная концентрация МРЬ равна 1 мг/мл (0,80-1,20 мг/мл).
ΙΙ.2. Приготовление МРЬ/Ц821-содержащего липосомного адъюванта.
Этот адъювант, называемый А801, содержит 30-МРЬ и 0821 в блокированной холестерином форме, и его приготавливали, как описано в АО 96/33739, которая включена в данное описание посредством ссылки. В частности, адъювант А801 приготавливали, по существу, как в примере Ι.1 из АО 96/33739. Адъювант А801В содержит липосомы, которые, в свою очередь, содержат диолеоилфосфатидилхолин (ООРС), холестерин и 30-МРЬ [в количестве 1000 мкг ЭОРС, 250 мкг холестерина и 50 мкг 30-МРЬ; каждое значение приведено приблизительно на одну вакцинную дозу], 0821 [50 мкг/доза], фосфатный буфер с №1С1 и воду до объема 0,5 мл. Адъювант А801Е содержит те же ингредиенты, что и А801В, но в более низкой концентрации в количестве 500 мкг ЭОРС, 125 мкг холестерина, 25 мкг 30-МРЬ и 25 мкг Ц821, в фосфатном буфере с ЫаС1 и воде до объема 0,5 мл.
В процессе образования липосом, содержащих МРЬ, ЭОРС (диолеилфосфатидилхолин), холестерин и МРЬ растворяют в этаноле. После выпаривания растворителя под вакуумом образуется липидная пленка. Добавляют забуференный фосфатом физиологический раствор (9 мМ Ыа2НРО4, 41 мМ КН2РО4, 100 мМ №1С1) при рН 6,1 и смесь подвергают предварительной гомогенизации, затем гомогенизации высокого давления при 15000 фунт-сила/кв.дюйм (103 МПа) (приблизительно 15-20 циклов). В результате этого получаются липосомы, которые подвергают стерилизации фильтрованием через мембрану 0,22 мкм на стерильном (класс 100) участке. Стерильный продукт затем распределяют по стерильным стеклянным контейнерам и хранят в холодной комнате (от 2 до 8°С).
Полученные таким образом липосомы содержат МРЬ внутри мембраны (воплощение МРЬ 1п из АО 96/33739).
0821 добавляют в водный раствор до желаемой концентрации.
Пример ΙΙΙ. Доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на хорьках.
ΙΙΙ.1. Обоснование и задачи.
Грипп в модели хорьков близко имитирует грипп у людей, это касается как чувствительности к инфекции, так и клинического ответа.
Хорек весьма чувствителен к инфекции как вирусом гриппа А, так и В без предварительной адаптации вирусных штаммов. Следовательно, это дает превосходную модельную систему для исследований защиты, обеспечиваемой посредством вводимых противогриппозных вакцин.
- 36 018860
В этом исследовании изучали эффективность различных трехвалентных сплит-вакцин, адъювантных или безадъювантных, в отношении облегчения симптомов заболевания (температура тела) и выделения вируса в составе назальных секретов хорьков, подвергшихся контрольному заражению гомологичными штаммами.
Задача этого эксперимента заключалась в том, чтобы продемонстрировать эффективность адъювантной противогриппозной вакцины по сравнению с обычной (безадъювантной) вакциной.
Определяли такие конечные точки:
1) первичную конечную точку: уменьшение выделения вируса в составе назальных смывов после гомологичного контрольного заражения;
2) второстепенные конечные точки: анализ гуморального ответа по ΗΙ-титрам.
ΙΙΙ.2. План эксперимента.
ΙΙΙ.2.1. Обработка/группа (табл. 1).
Самок хорьков (Μιΐδ^Ει ри!огш8 Гиго) в возрасте 14-20 недель получали от ΜΙ8ΑΥ СопыШапсу (БатрзЫге, иК). Хорьков примировали на 0-е сутки гетеросубтипическим штаммом Η1Ν1 Α/8ιοск1ю1т/24/90 (4 1од ТСГО50/мл). На 21-е сутки хорькам посредством внутримышечной инъекции вводили полную человеческую дозу (ΗΌ) (500 мкг вакцинной дозы, 15 мкг НА/штамм) комбинации Η1Ν1 Α/Νον Са1ебоша/20/99, Η3Ν2 Α/Ρаηата/2007/99 и В/8йапдбопд/7/97. Затем осуществляли контрольное заражение хорьков на 42-е сутки через интраназальный путь гетеросубтипическим штаммом Η3Ν2 Α/Ауοт^пд/3/2003 (4,5 1од ТСН),./мл).
Таблица 1
Труппа | Антиген(ы) + дозировка | Композиция + дозировка | Примечания (режим/путь /заражение) | Ιη/Ρο | Другие обработки |
1 | Т рехвалентная Простая | Полная Ηϋ: 15 мкг НА/штамм | в/м; 21-е сутки | Ιη | Примирование Η1Ν1 (А/51оскЬо1т/24 /90) на 0-е сутки |
2 | Т рехвалентная СМРЫ2521 в липосомах | Полная Ηϋ: 15 мкг НА/штамм | в/м; 21-е сутки | Ιη | Примирование Η1Ν1 (А/5(оскНо1т/24 /90) на 0-е сутки |
хорьков/группа. Ιη = индивидуально/Ро = пул.
ΙΙΙ.2.2. Приготовление вакцинных композиций (табл. 2).
Композиция 1: трехвалентная простая (безадъювантная) расщепленная композиция.
10-Кратный концентрированный ΡВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция 2. Трехвалентная противогриппозная расщепленная с ΜΡΕ/Ο821 в липосомах.
10-Кратный концентрированный ΡВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма Η1Ν1, Η3Ν2 и 17,5 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин. К композиции добавляют премикс так называемого ΌΟ821-ΜΡΤίη и затем перемешивают в течение минимум 15 мин. Премикс ΩΟ821-ΜΡΕίη представляет собой смесь липосом (приготовленных из ^ОΡС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), ΜΡΤ (2 мг/мл)) и иммуностимулятора 0821. Премикс инкубируют в течение минимум 15 мин перед добавлением к трехвалентной сплит-смеси. Концентрация ΜΡΤ и 0821 в конечной композиции составляет 50 мкг на 500 мкл. Композицию хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: в каждую композицию добавляют 10-кратный концентрированный ΡВ8 для достижения изотоничности и однократной концентрации в конечном объеме. Объем Н2О рассчитывают для достижения заданного объема.
Таблица 2
Конечный состав композиций 1 и 2 (композиции, приготовленные с использованием расщепленных штаммов (для 500 мкл))
Композиция | Антиген | Твин 80 | Тритон Х-100 | νΕ5 | ООРС | Холестерин | МРЬ | 0521 |
1 | Η1Ν1: 15 мкг Η3Ν2: 15 мкг В: 17,5 мкг | 375 мкг | 55 мкг | 50 мкг | ||||
2 | Η1Ν1: 15 мкг Η3Ν2: 15 мкг В: 17,5 мкг | 375 мкг | 55 мкг | 50 мкг | 1 мг | 250 мкг | 50 мкг | 50 мкг |
- 37 018860
ΙΙΙ.2.3. Результаты считывания (табл. 3).
Таблица 3
Результат считывания | Временная точка | Тип образца | Способ анализа |
Выделение вируса | Начиная с 1-х суток и в течение 7 суток после контрольного заражения | Назальные смывы | Титрование |
Анти-ΗΙантитела (ΗΙтитры) | До, после примирования, после иммунизации, после контрольного заражения | Образцы сыворотки | Тест на ингибирование гемагглютинации |
ΙΙΙ.3. Результаты.
Схематическое представление результатов приведено на фиг. 1 и 2.
ΙΙΙ.3.1. Гуморальный иммунитет (фиг. 1).
Активность в отношении ингибирования гемагглютинации против вакцинных штаммов Η3Ν2 (вакцинный штамм А/Рапаша/2007/99 и штамм для контрольного заражения АЖуошгпд/3/2003) детектировали в образцах сыворотки от 6 животных на группу на 17-е сутки после интраназального гетерологичного примирования, на 21-е сутки после иммунизации и на 13-е сутки после контрольного заражения.
Титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа определяли, используя тест на ингибирование гемагглютинации (ΗΙ), как подробно представлено в примере 1.2.1. Сделаны следующие выводы:
для двух штаммов А/№№ и для всех групп, после иммунизации наблюдали увеличение ΗΙ-титров во всех вакцинированных группах;
после иммунизации А/Рапаша/2007/99, более высокие статистически значимые антиА/Рапаша/2007/99 ΗΙ-титры наблюдали для трехвалентной сплит-вакцины с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах по сравнению с трехвалентной простой сплит-вакциной;
после иммунизации А/Рапаша/2007/99 только трехвалентная сплит-композиция с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах оказалась способной значительно увеличить ΗΙ-титры к гетерологичному штамму А/\Ууоштд/3/2003 (перекрестная реактивность перед контрольным заражением этим дрейфующим штаммом);
после контрольного заражения А/^уошгпд/3/2003 существенное увеличение антиА/^уошгпд/3/2003 ΗΙ-титров наблюдали как для трехвалентной обычной сплит-композиции, так и для трехвалентной сплит-композиции с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах;
для штаммов А/№\\' Са1ебоша/20/99 и В/8йапдбопд/7/97 более высокие статистически значимые Η1титры наблюдали при использовании трехвалентной сплит-вакцины с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах по сравнению с трехвалентной простой сплит-вакциной.
ΙΙΙ.3.2. Вирусный шеддинг (фиг. 3).
Титрование вирусов в назальных смывах осуществляли на 6 животных на группу, как подробно описано в примере Ι.2.3. Назальные смывы получали путем введения 5 мл РВ8 в обе ноздри бодрствующим животным. Инокулят собирали в чашку Петри и помещали в контейнеры для образцов на -80°С.
Через двое суток после контрольного заражения более низкое статистически значимое выделение вируса наблюдали при использовании трехвалентной сплит-композиции с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах по сравнению с трехвалентной простой сплит-композицией.
На 49-е сутки (через 7 суток после контрольного заражения) в назальных смывах вирус не обнаруживался.
ΙΙΙ.3.3. Вывод эксперимента.
Более высокие гуморальные ответы (ΗΙ-титры) наблюдали при использовании трехвалентной сплит-композиции с адъювантом МРЬ/0821 в липосомах по сравнению с трехвалентной обычной сплиткомпозицией для всех 4 штаммов.
После иммунизации А/Рапаша/2007/99 только трехвалентная сплит-композиция с адъювантом МРЬ/О821 в липосомах оказалась способной значительно увеличить ΗΙ-титры к гетерологичному штамму А/\Ууоштд/3/2003 (перекрестная реактивность перед контрольным заражением этим штаммом).
Композиции с МРЬ/0821 в липосомах продемонстрировали дополнительную пользу в отношении эффективности защиты на хорьках (более низкое выделение вируса после гетерологичного контрольного заражения). По-видимому, перекрестная реакция, наблюдаемая после иммунизации трехвалентной сплит-композицией с МРЬ/0821 в липосомах, против дрейфующего штамма, использованного для контрольного заражения, коррелирует с защитным эффектом, наблюдаемым на этих хорьках.
Пример Ιν. Доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на примированных С57ВГ6 мышах
Ιν.1. План эксперимента и задача.
Для этого эксперимента использовали С57ВГ6 мышей, примированых гетерологичными штаммами.
Задача состояла в сравнении гуморального (ΗΙ-титры) и СМI (Ιί.'8, окрашивание внутриклеточных цитокинов) иммунных ответов, индуцированных имеющейся в продаже от С1ахо8шййК1те трехвалентной сплит-вакциной (Ииапх™) по сравнению с трехвалентной субъединичной вакциной (вакцина Адлр
- 38 018860 ра1™ от СЫгоп), а также СМ1 ответа, полученного с использованием этих вакцин с адъювантом - липосомами, содержащими только 3П-МРЬ, только ЭО821 (0821 в липосомах, т.е. подвергнутый детоксикации 0821) или МРЬ/0821 в липосомах. С целью получения той же композиции, что и в вакцине Р1иапх, в приведенном ниже примере композиции приготавливали, исходя из нерасфасованных расщепленных моно-форм, а не из имеющихся в продаже дозировок Ниапх. Приготовленные композиции обозначали как Ииапх-подобные.
1У.1.1. Обработка/группа.
Самок С57В1/6 мышей в возрасте 6-8 недель получали от Наг1ап Ногз), Нидерланды. Мышей примировали на 0-е сутки гетеросубтипическими штаммами (по 5 мкг НА-содержащих цельных инактивированных Н1М А/Веутд/262/95, №N2 А/Рапата/2007/99, В/Сйапдбопд/7/97). На 28-е сутки мышам вводили посредством внутримышечной инъекции 1,5 мкг НА-содержащей трехвалентной сплиткомпозиции (А/№\у Са1ебоша/20/99, АЖуоттд/3/2003, В/Лапдзи/10/2003), простой или адъювантной (см. группы в табл. 4-6, ниже).
Таблица 4
Гр, | Антиген/Композиция | Другая обработка |
1 | Трехвалентная сплит* / обычная (безадъювантная ) = Яиапх-подобная | Гетерологичное примирование на 0-сутки |
2 | Трехвалентная сплит* / липосомы, содержащие 3ϋ-ΜΡΙ | Г етерологичное примирование на О-сутки |
3 | Трехвалентная сплит* / ϋΩ321 | Гетерологичное примирование на 0-сутки |
4 | Трехвалентная сплит* / ΜΡί_/Ο821 в липосомах | Гетерологичное примирование на 0-сутки |
5 | Аддпра!™ (субъединичная) | Гетерологичное примирование на 0-сутки |
6 | Аддпра!™ (субъединичная) / липосомы, содержащие ЗО-МРЬ | Гетерологичное примирование на 0-сутки |
7 | Аддпра!™ (субъединичная) / Д0821 | Гетерологичное примирование на 0-сутки |
8 | Аддпра!™ (субъединичная) / МРЬ/0321 в липосомах | Гетерологичное примирование на 0-сутки |
9 | рвз | Гетерологичное примирование на 0-сутки |
* Ниапх-подобная. 16 мышей/группа.
ΐν.1.2. Приготовление вакцинных композиций.
Композиция для группы 1.
10-Кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и νΕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, №N2 и 15 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция для группы 2.
10-Кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и νΕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах), добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, №N2 и 15 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин. Добавляют концентрированные липосомы, содержащие 3О-МРЬ (приготовленные из ООРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), 3О-МРЬ (2 мг/мл)), для достижения конечной концентрации МРЬ, равной 50 мкг на дозу. Затем композицию перемешивают в течение 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция для группы 3.
10-Кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и νΕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах) добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, №N2 и 15 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавлениями. Композицию перемешивают в течение 15 мин. Затем добавляют премикс, приготовленный из липосом (приготовленных из ООРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл)) и 0821, обозначаемого как 00821, для достижения концентрации 0821, равной 50 мкг на дозу. Этот премикс инкубируют по меньшей мере в течение 15 мин перед добавлением к смеси трехвалентной сплит-композиции. Композицию перемешивают в течение минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция для группы 4.
10-Кратный концентрированный РВ8 (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и νΕ8 (в количествах с учетом детергентов, присутствующих в штаммах) добавляют в воду для инъекций. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого штамма НШ1, №N2 и 15 мкг штамма В, каждый раз с 10-минутным перемешиванием между добавле
- 39 018860 ниями. Композицию перемешивают в течение 15 мин. Затем добавляют смесь, приготовленную из липосом, содержащих 3И-МРЬ (приготовленных из ИОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), 3О-МРЬ (2 мг/мл)), и 0821 для достижения концентраций 0821 и МРЬ, равных по 50 мкг на дозу. Эту смесь инкубируют по меньшей мере в течение 15 мин перед добавлением к смеси трехвалентной сплит-композиции. Так называемую трехвалентную сплит-МРЬ/р821 в липосомах композицию перемешивают в течение минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: в каждую композицию для групп 1-4 добавляют 10-кратный концентрированный РВ8 для достижения изотоничности и однократной концентрации в конечном объеме. Объем Н2О рассчитывают для достижения заданного объема.
Композиция для группы 5.
Одну дозу Аддпра1™ смешивают с равным объемом РВ8тоб (модифицированный РВ8), рН 7,4. Композицию перемешивают в течение минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Композиция для группы 6.
Смешивают РВ8, рН 7,4, и одну дозу Аддпра1™. Затем при перемешивании добавляют липосомы, содержащие 3О-МРЬ (приготовленные из ИОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), 3И-МРЬ (2 мг/мл)), для достижения 50 мкг МРЬ в дозе. Композицию перемешивают в течение минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: РВ8 добавляют для достижения изотоничности в конечном объеме. Аддлра1 составляет половину объема композиции.
Композиция для группы 7.
Смешивают РВ8, рН 7,4, и одну дозу Аддпра1™. Затем при перемешивании добавляют премикс липосом (приготовленных из ЭОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл)) и 0821, обозначаемого как 00821, для достижения 50 мкг 0821 в дозе. Этот премикс инкубируют в течение по меньшей мере 15 мин перед добавлением. Композицию перемешивают минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: добавляют РВ8 для достижения изотоничности в конечном объеме. Аддпра1™ составляет половину объема композиции.
Композиция для группы 8.
Смешивают РВ8, рН 7,4, и одну дозу Аддпра1™. Премикс так называемого 00821-МРЫп добавляют при перемешивании к композиции. Премикс 00821-МРип представляет собой смесь липосом (приготовленных из ЭОРС (40 мг/мл), холестерина (10 мг/мл), МРЬ (2 мг/мл)) и иммуностимулятора 0821. Этот премикс инкубируют в течение по меньшей мере 15 мин перед добавлением к смеси Аддпра1/РВ8. Количество МРЬ и 0821 в композиции равно по 50 мкг каждого. Композицию перемешивают минимум 15 мин и хранят при 4°С, если не вводят немедленно.
Примечание: добавляют РВ8 для достижения изотоничности в конечном объеме. Аддлра1 составляет половину объема композиции.
Таблица 5
Конечный состав композиций 1-4, приготовленных с использованием расщепленных штаммов (для 1 мл)
Г руппа | Антиген | Твин 80 | Т ритон Х-100 | УЕ5 | ООРС | Холестерин | МРЬ | □821 |
1 | Η1Ν1 15 мкг Η3Ν2 15 мкг В 17.5 мкг | 750 мкг | 110 мкг | 100 мкг | ||||
2 | Аналогично 1 | Анал 1 | 110 мкг | 100 мкг | 1 мг | 250 мкг | 50 мкг | - |
3 | Аналогично 1 | Анал 1 | 110 мкг | 100 мкг | 1 мг | 250 мкг | - | 50 мкг |
4 | Аналогично 1 | Анал 1 | 110 мкг | 100 мкг | 1 мг | 250 мкг | 50 мкг | 50 мкг |
Таблица 6
Конечный состав композиций 5-8, приготовленных с использованием вакцины Аддлра1™ (1 мл)
Группа | Антиген | ООРС | Холестерин | МРЬ | 0321 |
5 | 1 доза вакцины Аддпра! | - | - | - | |
6 | Аналогично 5 | 1 мг | 250 мкг | 50 мкг | - |
7 | Аналогично 5 | 1 мг | 250 мкг | - | 50 мкг |
8 | Аналогично 5 | 1 мг | 250 мкг | 50 мкг | 50 мкг |
- 40 018860
Γν.1.3. Результаты считывания (табл. 7).
Таблица 7
Результат считывания | Временная точка | Тип образца | )п/Ро | Способ анализа |
Анти-Н 1-антитела (Ы-титры) | На 21-е сутки после иммунизации (на 49-е сутки) | Образцы сыворотки | Ιη | Тест на ингибирование гемагглютинации |
СО4, С08, И-2, ΙΕΝ-у (РАС5) | На 7-е сутки после иммунизации (на 35-е сутки) | РВ!_ | Ро | Окрашивание внутриклеточных цитокинов (ЮЗ) |
Л = индивидуально/Ро = пул.
Ш.2. Результаты.
Ш.2.1. Гуморальный ответ (Ш-титры через 21 сутки после иммунизации).
Гуморальные ответы по Ш-титрам - фиг. 4.
Активность в отношении ингибирования гемагглютинации против трех вакцинных штаммов (Λ/№\ν Са1ебоша/20/99, АЖуотшд/3/2003, В/Лапдзи/10/2003) детектировали в образцах сыворотки от 8 животных на группу на 21-е сутки после иммунизации.
По сравнению с мышами, иммунизированными ΡВ8, увеличение в Ш-титрах наблюдали после иммунизации всеми Е1и-вакцинами-кандидатами, протестированными на всех трех штаммах (трехвалентная сплит-вакцина или трехвалентная субъединичная вакцина).
Для всех трех штаммов более высокие статистически значимые Ш-титры наблюдали у мышей, иммунизированных трехвалентной сплит-вакциной с адъювантом только ИО821 или ΜΡΕ/Ο821 в липосомах, по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентной расщепленной Е1и-вакциной, обычной или с адъювантом в виде липосом, содержащих только 3Ό-ΜΡΓ. Ранжирование гуморального ответа было следующим: (ΜΡΕ/Ο821 в липосомах = только ИО821) > (липосомы, содержащие только 3Ό-ΜΡΓ = обычная вакцина) > ΡВ8.
Для всех трех штаммов более высокие статистически значимые Ш-титры наблюдали у мышей, иммунизированных трехвалентной субъединичной вакциной со следующим адъювантом: только 00821, липосомы, содержащие только 3Ό-ΜΡΓ, или ΜΡΕ/Ο821 в липосомах, по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентной обычной сплит-вакциной. Ранжирование гуморального ответа было следующим: (ΜΡΜΟ821 в липосомах = только ЭО821 = липосомы, содержащие только 3Ό-ΜΡΓ) > обычная вакцина > ΡВ8.
Трехвалентная сплит-вакцина и трехвалентная субъединичная вакцина индуцировали похожие Штитры для композиций без адъюванта или с адъювантом: только ЭО821 или ΜΡΕ/Ο821 в липосомах.
Ш.2.2. Клеточно-опосредованный иммунный ответ ДС8 на 7-е сутки после иммунизации).
СИ4 Т-клеточные ответы - фиг. 5.
РВМС от 8 мышей/группа собирали на 7-е сутки после иммунизации и тестировали в 4 пулах по 2 мыши/группа. Что касается общего количества специфических к цельному Е1и-вирусу СИ4+ Т-клеток (экспрессирующих ^-2, ΣΕΝ-γ и оба цитокина):
какой бы ни была композиция, идентичные СИ4+ Т-клеточные ответы наблюдали для трехвалентной сплит-вакцины и трехвалентной субъединичной вакцины;
более высокие СИ4+ Т-клеточные ответы наблюдали для трехвалентных композиций (сплит- или субъединичных) с адъювантом ΜΡΕ/Ο821 в липосомах по сравнению с трехвалентными композициями (сплит- или субъединичными), обычными или с адъювантами липосомами, содержащими только 3ΌΜΡΓ или только ΌΡ821;
что касается клеточного ответа, индуцированного трехвалентной композицией (сплит- или субъединичной), то имеет место синергический эффект липосом, содержащих 3Ό-ΜΡΓ + ЭО821, по сравнению только с ИО821 или с липосомами, содержащими только 3Ό-ΜΡΓ;
что касается клеточного ответа, то ранжирование было следующим: (ΜΡΕ/Ο821 в липосомах) > (липосомы, содержащие только 3Ό-ΜΡΓ = только ЭО821 = обычная вакцина = ΡВ8).
Ш.3. Краткое изложение результатов и выводы.
Для всех трех штаммов более высокие статистически значимые Ш-титры наблюдали у мышей, иммунизированных трехвалентными композициями (сплит- или субъединичными) с адъювантом - только ΩΟ821 или ΜΡΕ/Ο821 в липосомах, по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентными обычными композициями (сплит- или субъединичными). По-видимому, липосомы, содержащие только 3Ό-ΜΡΓ, индуцируют более высокий гуморальный ответ, когда они приготовлены с трехвалентной субъединичной композицией, а не с трехвалентной сплит-композицией.
Какой бы ни была композиция, аналогичные СИ4+ Т-клеточные ответы были получены для трехвалентной сплит-вакцины (Е1иаг1х) и трехвалентной субъединичной (Адпрра1) вакцины.
Трехвалентные композиции (сплит- или субъединичные) с адъювантом ΜΡΕ/Ο821 в липосомах индуцировали более высокие СИ4+ Т-клеточные ответы по сравнению с трехвалентными композициями (сплит- или субъединичными), простыми или с адъювантами - липосомами, содержащими только 3ΌΜΡΓ, или только Р821 в липосомах (ΌΡ821).
- 41 018860
Пример V. Доклинические сравнительные исследования вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа с адъювантом 3Э-МРЕ/О821 в липосомной композиции (3О-МРЬ в двух разных концентрациях)
У.1. Мыши.
У.1.1. План эксперимента и задача.
Для этого эксперимента использовали С57ВЕ6 мышей, примированых гетерологичными штаммами. Задача состояла в анализе гуморального (ΗΙ-титры) и СМI (Κ.'8, окрашивание внутриклеточных цитокинов) иммунных ответов, индуцированных имеющейся в продаже от С1ахо8тййК1тс трехвалентной сплит-вакциной (Ε1πηπχ™), в безадъювантной форме и с адъювантом - липосомами, содержащими 3ΌМРЬ и ΩΟ821 в двух разных концентрациях.
У.1.2. Обработка/группа.
Самок С57ВЕ6 мышей в возрасте 8 недель получали от ΗπιΈ-πι Нидерланды. Мышей примировали интраназально на 0-е сутки гетеросубтипическими штаммами (цельными инактивированными А/Всушд/262/95, Η3Ν2 А/Рапата/2007/99, В/8Еапдйопд/7/97). На 28-е сутки мышам вводили посредством внутримышечной инъекции трехвалентную сплит-вакцину (А/Нс^ Са1сйоп1а, АЛУуоттд, Β/Лапдки), обычную или с адъювантом - иммуностимуляторами в двух разных концентрациях в липосомных композициях (см. группы в табл. 8).
Таблица 8
Группа | Антиген(ы) + дозировка | Композиция + дозировка | Другие обработки |
1 | Трехвалентная сплит Е1и - 1,5 мкг/штамм/50 мкл | Простая | Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально |
2 | Трехвалентная сплит Е|ц 1,5 мкг/штамм/50 мкл | Липосомы, содержащие 50 мкг 30-МРЬ на 0,5 мл дозы | Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально |
3 | Трехвалентная сплит Е1и - 1,5 мкг/штамм/50 мкл | 00521, 50 мкг на 0,5 мл дозы | Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально |
4 | Трехвалентная сплит Е!и - 1,5 мкг/штамм/50 мкл | ΜΡΙ. и 0521 по 25 мкг на 0,5 мл дозы | Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально |
5 | Трехвалентная сплит Е1и - 1,5 мкг/штамм/50 мкл | МРЬ и 0821 по 50 мкг на 0,5 мл дозы | Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально |
6 | РВЗ | Отсутствует | Гетерологичное примирование на 0-сутки, цельная инактивированная 5 мкг/20 мкл, интраназально |
Композиции приготавливали, как в примере Ιν.
ν.1.3. Результаты.
Гуморальные ответы по ΗΙ-титрам - фиг. 24.
Активность в отношении ингибирования гемагглютинации против 3 вакцинных штаммов детектировали в образцах сыворотки от 9 животных на группу на 21-е сутки после иммунизации.
По сравнению с мышами, иммунизированными РВ8, увеличение в ΗΙ-титрах наблюдали после иммунизации всеми Ε1и-вакцинами-кандидатами, протестированными на всех трех штаммах.
Для всех трех штаммов более высокие статистически значимые ΗΙ-титры наблюдали у мышей, иммунизированных трехвалентной сплит-вакциной с адъювантом МРЬ и 0821 в любой концентрации, по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентной обычной сплит-Ε1и-вакциной (максимальное значение р составляет 0,03).
Никакого статистически значимого различия между двумя группами липосомных адъювантов не наблюдали.
Клеточно-опосредованный иммунный ответ ДС8 на 7-е сутки после иммунизации) - фиг. 25.
РВМС от 9 мышей/группа собирали на 1-е сутки после иммунизации и тестировали в трех пулах по 3 мыши/группа. Что касается специфических к цельному Ε1и-вирусу СЭ4+ Т-клеток, экспрессирующих ΙΕ-2, ΙΕΝ-γ или оба цитокина, то как можно видеть из фиг. 25, наиболее высокие ΙΕΝ-γ-специфические СО4+ Т-клеточные ответы получали после иммунизации трехвалентной адъювантной сплит-вакциной с иммуностимуляторами в самой высокой концентрации. Однако ΙΕ2- и ΙΕ2+ΙΕΝ-γ Т-клеточные ответы для
- 42 018860 обеих концентраций иммуностимуляторов были аналогичны.
Пример У1. Клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа с адъювантом МРЬ/0821 в липосомной композиции (3Р-МРЬ в двух разных концентрациях), на пожилом населении в возрасте старше 65 лет.
У1.1. План исследования и задачи.
Фаза Ι/ΙΙ открытого рандомизированного исследования с целью демонстрации не менее эффективного клеточно-опосредованного иммунного ответа противогриппозных вакцин-кандидатов от С1ахо8тййКйпе В1о1од1са15, содержащих различные адъюванты, вводимых пожилому населению (в возрасте 65 лет и старше), по сравнению с Ниапх™ (известной в Бельгии как α-Κίχ™), вводимой взрослым людям (18-40 лет).
Оценивали четыре параллельные группы:
взрослых людей (в возрасте 18-40 лет) в одной контрольной группе, получающих одну дозу Ииапх™ (группа Ииапх);
200 пожилых субъектов (в возрасте 65 лет и старше), рандомизированных на три группы в соотношении 3:3:2:
одну группу из 75 субъектов, получающих противогриппозную вакцину с адъювантом А801В, одну группу из 75 субъектов, получающих противогриппозную вакцину с адъювантом А801Е, Ии-группу сравнения из 50 субъектов, получающих одну дозу Е1иапх™.
Первостепенная задача.
Первостепенная задача заключается в том, чтобы продемонстрировать не меньшую эффективность через 21 сутки после вакцинации противогриппозных адъювантных вакцин, вводимых пожилым субъектам (в возрасте 65 лет и старше), по сравнению с Ииапх™, вводимой взрослым людям (в возрасте 18-40 лет), в отношении частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 Т-лимфоцитов, продуцирующих по меньшей мере два разных цитокина (СР40Ь, 1Ь-2, ΤΝΕ-α, ΙΕΝ-γ).
Второстепенные задачи:
1) оценить безопасность и реактогенность вакцинации противогриппозными адъювантными вакцинами-кандидатами в течение 21 суток после внутримышечного введения вакцины пожилым субъектам (в возрасте 65 лет и старше). Для сравнения используют Ииапх™;
2) оценить гуморальный иммунный ответ (антигемагглютининовый титр) через 21, 90 и 180 суток после вакцинации противогриппозными адъювантными вакцинами-кандидатами. Для сравнения используют Ииапх™.
Третьестепенная задача.
Третьестепенная задача заключается в оценке клеточно-опосредованного иммунного ответа (продуцирование ΙΕΝ-γ, 1Ь-2, СР40Ь и ΤΝΕ-α и ответ В-клеток памяти) через 21, 90 и 180 суток после вакцинации адъювантными противогриппозными вакцинами. Для сравнения используют Ииапх™.
УЕ2. Вакцинная композиция и введение.
Использованы два разных адъюванта:
1) А801В - адъювант на основе липосом, содержащих 50 мкг МРЬ и 0821;
2) А801Е - разведенная в два раза композиция А801В.
Контроль: полная доза Ииалх™ путем в/м введения.
Все вакцины предназначены для внутримышечного введения. Штаммы, используемые в пяти вакцинах, представляют собой штаммы, которые рекомендованы ВОЗ для северного полушария на сезон 2005-2006 г., т.е. А/\ем Са1ебоша/20/99 (НШ1), А/\ем УогкА/2004 (№N2) и В/Лапдви/10/2003.
Три инактивированных расщепленных вирионных антигена (одновалентные формы), используемые при приготовлении адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата, являются в точности теми же, что и активные ингредиенты, используемые при приготовлении имеющейся в продаже Е1иапх™/а-К1х™, - противогриппозной вакцины на основе инактивированного расщепленного вириона от С8К Вю. Они получены из вирусов, растущих на куриных эмбрионах. Штаммы вируса гриппа являются рекомендованными штаммами на сезон 2005/2006 гг., которые используются при приготовлении имеющейся в продаже Е1иапх™/а-К1х™ 2005/2006 гг.
Штаммы, используемые в трех вакцинах, представляют собой штаммы, которые рекомендованы ВОЗ для северного полушария на сезон 2005-2006 гг., т.е.
А/\ем Са1ебоша/20/99 (НШ1) ГУК-116,
А/\ем ¥огк/55/2004 (№N2) ΝΥ^ Х-157,
В/Лапдви/10/2003.
Подобно Е1иапх™/а-К1х™ адъювантная вакцина содержит 15 мкг гемагглютинина (НА) каждого штамма вируса гриппа на дозу.
ΥΙ.2.1. Описание партий А801В-адъювантной вакцины.
А801В-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой 2-компонентную вакцину, состоящую из концентрированных трехвалентных инактивированных расщепленных вирионных антигенов, представленных в стеклянном флаконе, и из стеклянного флакона, содержащего адъю
- 43 018860 вант АБ01В. В момент инъекции содержимое флакона для адъюванта извлекают и вводят во флакон, содержащий концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После перемешивания содержимое извлекают с помощью шприца, использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции и объем доводят до 1 мл. Одна доза восстановленной АБ01Вадъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 1 мл.
АБ01В-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой вакцину, не содержащую консервант.
νΐ.2.2. Состав АБ01В-адъювантной клинической партии.
Одна доза восстановленной АБ01В-адъювантной противогриппозной вакцины соответствует 1 мл. Ее состав приведен в табл. 8'. Она содержит по 15 мкг НА каждого штамма вируса гриппа, как и в зарегистрированной вакцине Е1иапх™/а-К1х®.
Таблица 8'
Состав (компоненты вируса гриппа и адъюванта) восстановленной АБ01В-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата
Компонент | Количество на дозу | Аналитическая ссылка |
АКТИВНЫЕ ИНГРЕДИЕНТЫ | ||
Инактивированные расщепленные вирионы: - А/Νθν/ Са1ес1оп1а/20/99 (Н1 N1) ΐνΗ-116; - Α/Νθ\ν Уогк/55/2004 (Η3Ν2) ΝΥΜΟ Х-157; - В/Дапязи/10/2003 | 15 мкг НА 15 мкг НА 15 мкг НА | Евр фармакопея 158 Евр. фармакопея 158 Евр. фармакопея 158 |
АДЪЮВАНТ А801В | ||
- Липосомы:. • диолеилфосфатидилхолин (ООРС); • холестерин; . ΜΡί | 1000 мкг 250 мкг 50 мкг | ΟδΚΒίο 3217 Евр. фармакопея 0993 С8К Βίο 2972 |
-0821 | 50 мкг | Θ8Κ Βίο 3034 |
νΐ.2.3. Способ приготовления партии АБ01В-адъювантной вакцины.
Приготовление АБ01В-адъювантной противогриппозной вакцины состоит из трех основных стадий: приготовление партии трехвалентной конечной композиции (2-кратной концентрированной) без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов;
приготовление адъюванта АБ01В;
разведение АБ01В-адъювантной сплит-вирусной вакцины экстемпорально.
Приготовление партии трехвалентной конечной композиции без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов.
Объемы трех одновалентных партий берут на основании содержания НА, измеренного в каждой одновалентной партии перед приготовлением композиции, и целевого объема, равного 1320 мл. Концентрированный, забуференый фосфатом физиологический раствор (РО4, N8/^) (80 мкл/доза) и предварительно приготовленную смесь Твина 80, Тритона Х-100 и α-токоферил-гидросукцината разводят в воде для инъекций. Затем три концентрированные моно-формы (А/№\у Са1еБоша/20/99 ΐνΚ-116, А/№\т Уогк/55/2004 КУМС Х-157, В/Лапдзи/10/2003) последовательно разводят в полученном растворе, представляющем собой забуференный фосфатом физиологический раствор/Твин 80 - Тритон Х-100 - αтокоферил-гидросукцинат (рН 7,8, 81 мМ Као, 1,56 мМ КС1, 4,79 мМ Ка2НР04, 0,87 мМ КН2Р04, 7,2 мМ КаН2Р04, 72,8 мМ К2НР04, 750 мкг/мл Твина 80, 110 мкг/мл Тритона Х-100 и 100 мкг/мл αтокоферил-гидросукцината), для получения конечной концентрации по 30 мкг НА из штаммов А (НШ1 и №N2) в 1 мл трехвалентной конечной формы (15 мкг НА/штамм А/500 мкл трехвалентной конечной формы) и 35 мкг НА из штамма В (17,5 мкг НА/штамм В/500 мкл трехвалентной конечной формы). Между добавлениями каждой одновалентной формы смесь перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре. После добавления последней одновалентной формы и 15-30 мин перемешивания рН контролируют и подводят до 7,65±0,25 с помощью НС1 или №0Н.
Трехвалентную конечную форму антигенов помещают в стерильных условиях в 3 мл стерильные стеклянные флаконы типа I (Европейская фармакопея). Каждый флакон имеет объем 600 мкл (500 мкл + 100 мкл с учетом переполнения).
Приготовление партии адъюванта АБ01В и заполнение ею контейнера для адъюванта.
Адъювант АБ01В готовят путем смешивания двух компонентов: ЦБ21 и липосом, содержащих МРЬ. Приготовление каждого из этих компонентов суммировано ниже. ЦБ21 представляет собой тритерпеновый гликозид, получаемый из коры дерева Ош11а)а заропапа и выпускаемый Адш1а №огсйез!ег, МА, ИБА (в настоящее время АпБдешсз).
ОБ21 поступает в СБК Вю1одюа1з в виде лиофилизованного порошка. Приготовление ЦБ21 на СБК Вю включает суспендирование порошка ЦБ21 в воде для инъекций в концентрации приблизительно
- 44 018860 мг/мл, подведение рН до рН 6,0±0,2 и стерилизацию фильтрованием. Жидкую партию 0821 хранят при -20°С в полиэтиленовых контейнерах.
МРЬ представляет собой 3-О-деацил-4'-монофосфорил-липид А, полученный последовательным кислотным и основным гидролизами липополисахарида из штамма Ке595 8а1топе11а ттпеко1а. Он производится О8К Вю1од1са1к, НатШоп, Мойапа. Нерасфасованная форма МРЬ поставляется в виде лиофилизованной соли триэтиламина (ТЕА).
В процессе приготовления липосом, содержащих МРЬ, ООРС (диолеилфосфатидилхолин), холестерин и МРЬ растворяют в этаноле. После выпаривания растворителя под вакуумом образуется липидная пленка. Добавляют забуференный фосфатом физиологический раствор (9 мМ №2НРО4, 41 мМ КН2РО4, 100 мМ №1С1) при рН 6,1 и смесь подвергают предварительной гомогенизации, затем гомогенизации высокого давления при 15000 фунт-сила/кв.дюйм (103 МПа) (±20 циклов). В результате этого получаются липосомы, которые подвергают стерилизации фильтрованием через мембрану 0,22 мкм на стерильном (класс 100) участке. Стерильный продукт затем распределяют по стерильным стеклянным контейнерам и хранят в холодной комнате (от 2 до 8°С).
Партию стерильного препарата смешивают с партией стерильного раствора 0821. После 30 мин перемешивания эту смесь добавляют к смеси воды для инъекций и 500 мМ фосфата с 1 М №С1, рН 6,1, когда разводят в 10 раз. Количество 500 мМ фосфата с 1 М №С1, рН 6,1, при разведении в 10 раз рассчитывают таким образом, чтобы достичь изотоничности в конечном объеме. Контролируют рН. Затем адъювант подвергают стерилизации фильтрованием (0,22 мкм) и распределяют по флаконам в стерильных условиях. Флаконы хранят при температуре от 2 до 8°С. Разбавитель А801В представляет собой опалесцирующую бесцветную жидкость без инородных частиц, содержащуюся в стерильном стеклянном флаконе типа 1. Целевое наполнение для каждого флакона составляет 0,7 мл, чтобы удовлетворять данной спецификации (> 0,5 мл).
Разведение А801В-адъювантной вирусной сплит-вакцины экстемпорально.
В момент инъекции содержимое флакона, содержащего адъювант, извлекают и вводят во флакон, содержащий концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После перемешивания содержимое извлекают с помощью шприца, иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции и объем доводят до 1 мл. Одна доза восстановленной А801В-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 1 мл.
νΐ.2.4. Описание партий А801Е-адъювантной вакцины.
А801Е-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой 3-компонентную вакцину, состоящую из концентрированных трехвалентных инактивированных расщепленных вирионных антигенов, представленных в стеклянном флаконе, из стеклянного флакона, содержащего адъювант А801В, и из стеклянного флакона, содержащего разбавитель (раствор хлорида натрия для инъекций) для двукратного разведения А801В.
Для приготовления адъюванта А801Е содержимое флакона с разбавителем извлекают с помощью шприца и вводят во флакон, содержащий адъювант А801В, затем перемешивают. В момент инъекции 600 мкл адъюванта А801Е извлекают с помощью шприца из флакона с А801Е и вводят во флакон, содержащий концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После перемешивания содержимое извлекают с помощью шприца и использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции. Одна доза восстановленной А801Е-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 1 мл.
А801Е-адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой вакцину, не содержащую консервант.
νΐ.2.5. Состав А801Е-адъювантной клинической партии.
Одна доза восстановленной А801Е-адъювантной противогриппозной вакцины соответствует 1 мл. Ее состав приведен в табл. 9. Она содержит по 15 мкг НА каждого штамма вируса гриппа, как и в зарегистрированной вакцине Р1иапх™/а-К1х®.
- 45 018860
Таблица 9
Состав (компоненты вируса гриппа и адъюванта) восстановленной Л801Е-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата
Компонент | Количество на дозу | Аналитическая ссылка |
АКТИВНЫЕ ИНГРЕДИЕНТЫ | ||
Инактивированные расщепленные вирионы: - Α/Νβνν Са1ес1оп1а/20/99 (Η1Ν1) МЧ-116; - Α/Νβνν Уогк/55/2004 (Η3Ν2) ЫУМС Х-157; - В/фапдвиЛ 0/2003 | 15 мкг НА 15 мкг НА 15 мкг НА | Евр. фармакопея 158 Евр. фармакопея 158 Евр. фармакопея 158 |
АДЪЮВАНТ А301В | ||
- Липосомы: • диолеилфосфатидилхолин (ООРС); • холестерин; . МРЬ | 500 мкг 125 мкг 25 мкг | 68К Βίο 3217 Евр. фармакопея 0993 СЗК Βίο 2972 |
-0821 | 25 мкг | СЗК Βίο 3034 |
У1.2.6. Способ приготовления патрии Л801Е-адъювантной вакцины.
Приготовление Л801В-адъювантной противогриппозной вакцины состоит из трех основных стадий: приготовление партии трехвалентной конечной композиции (2-кратной концентрированной) без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов;
приготовление адъюванта Л801В;
приготовление адъюванта Л801Е с последующим разведением Л801-Е-адъювантной вирусной сплит-вакцины экстемпорально.
Приготовление партии трехвалентной конечной композиции без адъюванта и заполнение ею контейнера для антигенов
Дана ссылка на раздел У.2.3 для Л801В-адъювантной противогриппозной вакцины.
Приготовление партии адъюванта Л801В и заполнение ею контейнера для адъюванта.
Дана ссылка на раздел У.2.3 для Л801В-адъювантной противогриппозной вакцины.
Разведение Л801Е-адъювантной вирусной сплит-вакцины экстемпорально.
Для приготовления адъюванта Л801Е содержимое флакона с разбавителем извлекают с помощью шприца и вводят во флакон, содержащий адъювант Л801В, затем перемешивают. В момент инъекции 600 мкл адъюванта Л801Е извлекают с помощью шприца из флакона с Л801Е и вводят во флакон, содержащий концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После перемешивания содержимое извлекают с помощью шприца и использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции. Одна доза восстановленной Л801Е-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 1 мл.
Четыре запланированных посещения для одного субъекта: на 0-е, 21-е, 90-е и 180-е сутки с взятием образца крови в каждое посещение для оценки иммуногенности.
Режим вакцинации: одна инъекция противогриппозной вакцины на 0-е сутки.
УТ2.7. Иммунологические анализы.
Анализ ингибирования гемагглютинации.
Иммунный ответ определяли путем измерения ингибирующих гемагглютинацию (ΗΙ) антител, используя способ, описанный Центром ВОЗ по совместному изучению гриппа (ЭДΗО Со11аЬога!тд Сеп1ге 1ог тПиепха), Центрами по контролю заболеваемости, Атланта, США (1991). Измерение титров антител осуществляли на размороженных образцах сыворотки с помощью стандартизированного и комплексно утвержденного микрометода с использованием 4 единиц ингибирования гемагглютинации (4 ΗΙυ) соответствующих антигенов и 0,5%-ной суспензии куриных эритроцитов. Неспецифические сывороточные ингибиторы удаляли тепловой обработкой и обработкой разрушающим рецепторы ферментом. Полученные образцы сыворотки оценивали по уровням ΗΙ-антител. Начиная с исходного разведения 1:10, готовили серии разведений (в 2 раза) до конечного разведения включительно, составляющего 1:20480. За конечную точку титрования принимали наибольшее разведение, при котором наблюдали полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы осуществляли в двух повторах.
Проточная цитометрия цитокинов (СЕС), используемая для оценки частоты встречаемости цитокин(ы)-позитивных СЭ4 или СЭ8 Т-лимфоцитов.
Антиген-специфические СЭ4 и СЭ8 Т-клетки периферической крови могут быть повторно стимулированы 1п У1!го к продуцированию СЭ40Ь, ГЬ-2, ΤΝΕ-α и ΙΡΝ-γ, если их инкубировать с их соответствующим антигеном. В результате количество антиген-специфических СЭ4 и СЭ8 Т-клеток можно подсчитать с помощью проточной цитометрии с использованием традиционного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также продуцирования внутриклеточных цитокинов. В настоящем исследовании в качестве антигенов для повторной стимуляции специфических к вирусу гриппа Т-клеток будут использованы антигены вакцинного вируса гриппа. Результаты будут выражены в виде частоты
- 46 018860 встречаемости цитокин(ы)-позитивных СЭ4 или СЭ8 Т-клеток в СЭ4 или СЭ8 Т-клеточной субпопуля ции.
ЕЫ8РОТ (фермент-опосредованный иммуноспот), используемый для оценки частоты встречаемости В-клеток памяти.
Е11кро!-технология В-клеток позволяет осуществить количественное определение В-клеток памяти, специфических к данному антигену. В-клетки памяти могут быть индуцированы для дифференцировки в плазматические клетки ш уйго после культивирования с СрС в течение 5 суток. Следовательно, образованные т уйго антиген-специфические плазматические клетки могут быть подсчитаны с использованием ейкро1-анализа В-клеток. Кратко, образованные ш уйго плазматические клетки инкубируют в культуральных планшетах, сенсибилизированных антигеном. Антиген-специфические плазматические клетки будут образовывать пятна антитело/антиген, которые могут быть детектированы с использованием традиционной иммуноферментной методики. В настоящем исследовании вакцинные штаммы вируса гриппа или антитела против человеческого иммуноглобулина используются для сенсибилизации культуральных планшетов с целью подсчета клеток плазмы, секретирующих антитела против вируса гриппа или ЩС, соответственно. Результаты выражают в виде частоты встречаемости антиген-специфических плазматических клеток на миллион ЩС-продуцирующих плазматических клеток.
Исследовательская характеристика РВМС.
Может быть осуществлена экспрессия отобранных поверхностных/активационных маркеров (т.е. СЭ4, СЭ8, СЭ45КО, СП45КА, СЭ28, СЭ27 или некоторых ΚΙΚ (ингибирующий рецептор киллерных клеток).
Функция индуцированных вакциной Т-лимфоцитов может быть определена путем анализа хомингмаркеров (кошт^ шагкегк) (т.е. ССК7, СХСК5), цитокинов (Т-хелперных 1 или Т-хелперных 2 цитокинов) или путем анализа экспрессии факторов, ассоциированных с регуляторными функциями, таких как Тохр3 (Югкйеай Ьох р3), СТЬА-4 (цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4) или ТСРв (трансформирующий фактор роста β). В частности, СП8+СЭ28-популяция или популяции других регуляторных Тклеток могут быть проанализированы в отношении гуморальных, В- и Т-клеточных ответов на вакцинный антиген.
УТ. 3. Результаты по иммуногенности.
У13.1. Конечные точки и результаты для СМТ
Для того чтобы охарактеризовать СМ! ответ после вакцинации адъювантными противогриппозными вакцинами, СЭ4 и СЭ8 Т-лимфоциты повторно стимулировали ш уйго, используя антигены трех вакцинных штаммов (используемые по отдельности или в виде пула). Специфические к вирусу гриппа СО4/СО8 Т-лимфоциты подсчитывали с помощью проточной цитометрии с использованием традиционного иммунофлуоресцентного мечения продуцирования внутриклеточных цитокинов (ГЬ-2, ΙΡΝ-γ, ТИР-а и СЭ40Ь).
Оценка первичной конечной точки.
На 21-е сутки: СМХ ответ у всех субъектов в отношении частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 Т-лимфоцитов на 106 в тестах на продукцию по меньшей мере двух разных цитоки нов (ΙΣ-2, ΙΡΝ-γ, ТЯР-а и СО40Ь).
Для оценки СМI ответа частоту встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 анализируют следующим образом.
Применяя подход по определению не меньшей эффективности, не меньшая эффективность по меньшей мере одной противогриппозной адъювантной вакцины-кандидата (вводимой пожилым людям в возрасте > 65 лет - группа, обозначенная как Р1и е1йег1у или Р1и ЕЬЭ) по сравнению с Р1иапх™ (вводимой взрослым людям в возрасте 18-40 лет - группа, обозначенная как Р1и Уоипд или Р1и ΥΝΟ) достигалась, когда нижний предел (ИЬ) двустороннего 98,75% доверительного интервала средних геометрических (СМ) соотношений (между группой Р1иапх™ (18-40 лет) и группой противогриппозной адъювантной вакцины-кандидата (> 65 лет) в отношении частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 Т-клеток, продуцирующих по меньшей мере два цитокина на 21-е сутки) оказывался ниже 2,0.
р/иапх, взрослые у
\_ιινΐ пр0гпивогриппозная адъювантная <2 ^ЬдИ98,75%
98,75% ДИ для СМ-отношений через 21 сутки после вакцинации подсчитывали с использованием модели анализа ковариантности (АКСРУА) с логарифмически (по основанию 10) преобразованными частотами встречаемости. Модель АНСОУА включала вакцинированную группу в качестве фиксируемого эффекта (Р1иаг1х™ (18-40 лет) против противогриппозной адъювантной вакцины-кандидата (> 65 лет)), а частоту встречаемости перед вакцинацией - в качестве параметра уравнения регрессии. СМ-отношения и их 98,75% ДИ получают в результате экспоненциального преобразования соответствующего группового сопоставления в рамках данной модели. 98,75% ДИ для скорректированного СМ (среднего геометрического) получают в результате экспоненциального преобразования 98,75% ДИ для среднего значения по группе, полученного методом наименьших квадратов в рамках упомянутой выше модели АМСОУА.
- 47 018860
Результаты - инференциальный анализ (табл. 10).
Скорректированные СМ и СМ-отношения (со своими 98,75% ДИ) специфических к вирусу гриппа СИ4 Т-лимфоцитов, продуцирующих по меньшей мере два цитокина (ΙΕ-2, ΙΕΝ-γ, ΤΝΡ-α и СИ40Ь) на 21-е сутки после повторной стимуляции ίη νίίτο объединенными антигенами ΙΙ, представлены в табл. 10. Для каждой адъювантной противогриппозной вакцины верхний предел двустороннего 98,75% ДИ для СМ-отношения оказывается значительно ниже клинического предела 2,0. Это демонстрирует не меньшую эффективность обеих адъювантных противогриппозных вакцин, вводимых пожилым субъектам, по сравнению с вакциной Пиапх™, вводимой взрослым людям в возрасте 18-40 лет, в отношении частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СИ4 после вакцинации.
Таблица 10 Скорректированное СМ-отношение специфических к вирусу гриппа СИ4 Т-клеток, продуцирующих по меньшей мере два цитокина после повторной стимуляции объединенными вакцинными антигенами, 21-е сутки (АТР группа по иммуногенности)
СМ-отношение (Пи ΥΝΟ 1А501В) | |||||
Пи ΥΝΟ | А301В | ДИ 98,8% | |||
Ν I СМ | N | СМ | Значение | И. | иь |
74 | 2844,8 | 71 | 2725,6 | 1,04 | 0,79 | 1,38 |
СМ-отношение (Ни ΥΝΘ / А501Е) | |||||
Ни ΥΝΟ | А501Е | | ДИ 98,8% | |||
N | СМ | N | СМ | Значение | ЬЬ | иь |
74 | 2879,6 | 74 | 2697,0 | 1,07 | 0,79 | 1,44 |
Скорректированное СМ = среднее геометрическое для антитела, скорректированное относительно фонового титра;
Ν = количество субъектов с доступными результатами как до, так и после вакцинации;
ДИ 98,8% = доверительный интервал, равный 98,8% для скорректированного СМ-отношения (модель Αηсονа: корректировка относительно фона);
ЬЬ = нижний предел;
ИЬ = верхний предел;
источник данных табл. ΙΙΙΑ Приложения.
Результаты - описательный анализ (фиг. 6).
Были получены следующие основные результаты:
1) перед вакцинацией СΜI ответ выше у молодых взрослых людей, чем у пожилых людей;
2) после вакцинации:
наблюдали усиливающий эффект противогриппозной вакцины на СΜI ответ у молодых взрослых людей (18-40 лет),
СМ! ответ у пожилых людей, получавших адъювантную противогриппозную вакцину, сопоставим с СΜI ответом у молодых взрослых людей.
Различие между состояниями до и после вакцинации в ответах СИ4 Т-лимфоцитов для всех исследованных цитокинов (ΙΕ-2, СИ40Ь, ΤΝΕ-α и ΙΕΝ-γ) было значительно более высоким при использовании адъювантных вакцин по сравнению с Пиапх™ для всех тестов.
Анализ третьестепенной задачи.
С целью оценки третичной конечной точки частоту встречаемости специфических к вирусу гриппа СИ4/СИ8 Т-лимфоцитов и В-клеток памяти измеряли на 0-е, 21-е, 90-е и 180-е сутки.
Частоту встречаемости специфических к вирусу гриппа цитокин-позитивных СИ4/СИ8 Тлимфоцитов для каждого антигена суммировали (описательная статистика) для каждой вакцинированной группы на 0-е и 21-е сутки.
Для сравнения обнаруженного различия между двумя группами (противогриппозная адъювантная вакцина относительно Пиапх™) использовали непараметрический критерий (критерий Уилкоксона (\νί1сохоп)), а статистическое значение р рассчитывают для каждого антигена в каждом отличном тесте.
Данные описательной статистики индивидуального различия между ответами на 21-е сутки/0-е сутки (после/до вакцинации) рассчитывают для каждой вакцинированной группы и каждого антигена в каждом отличном тесте.
Для сравнения индивидуального различия (после/до вакцинации) используют непараметрический критерий (критерий Уилкоксона), а статистическое значение р будет рассчитано для каждого антигена в каждом отличном тесте.
Значения р согласно критерию Уилкоксона, используемому для сравнения различия в частоте встречаемости специфических к вирусу гриппа СИ4 Т-лимфоцитов, представлены в табл. 11.
Результаты - оценка третичной конечной точки (табл. 11)
Основные выводы:
перед вакцинацией СМ частота встречаемости специфических к вирусу гриппа СИ4 Т-клеток была
- 48 018860 аналогичной во всех группах пожилых субъектов, но самой большой была у взрослых людей в возрасте 18-40 лет;
у пожилых субъектов после вакцинации (21-е сутки) частота встречаемости специфических к вирусу гриппа ί.Ό4 Т-лимфоцитов была значительно выше после вакцинации адъювантными вакцинами по сравнению с Ииапх™;
после вакцинации частота встречаемости специфических к вирусу гриппа ί.Ό4 Т-лимфоцитов оставалась более низкой у пожилых субъектов, вакцинированных А801В- или А801Е-адъювантными вакцинами, чем у взрослых людей в возрасте 18-40 лет, вакцинированных Пиап.х™;
ОМ частота встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ8 Т-клеток до вакцинации и после вакцинации, по существу, была аналогичной во всех группах.
Таблица 11 Инференциальная статистика: значения р согласно критериям Краскела-Уоллиса для ί.Ό4 Т-клеток в каждую временную точку (АТР группа по иммуногенности)
Описание теста | Значение р | |||
А801В относит. Ни ΥΝ6 | А501Е относит. Пи ΥΝΟ | |||
0-е сутки | 21-е сутки | 0-е сутки | 21-е сутки | |
ВСЕ ПО ДВА | <0,0001 | 0,0070 | <0,0001 | 0,0025 |
С040Ь | <0,0001 | 0,0056 | <0,0001 | 0,0015 |
ΙΝΡγ | <0,0001 | 0,0009 | <0,0001 | 0,0006 |
112 | <0,0001 | 0,0029 | <0,0001 | 0,0021 |
ΤΝΕα | <0,0001 | 0.0295 | <0,0001 | 0,0378 |
А501В относит. Ни Είϋ | А301Е относит. Е!и ΕΙ ϋ | |||
0-е сутки | 21-е сутки | 0-е сутки | 21-е сутки | |
ВСЕ ПО ДВА | 0,6165 | 0,0004 | 0,8744 | 0,0018 |
СО401. | 0,7560 | 0,0005 | 0,9504 | 0,0021 |
ΙΝΕγ | 0,9936 | 0,0008 | 0,9835 | 0,0029 |
И2 | 0,6702 | 0,0011 | 0,7855 | 0,0023 |
ΤΝΕα | 0,5450 | 0,0022 | 0,6688 | 0,0040 |
Результаты - оценка конечных точек в отношении гуморального иммунного ответа.
Наблюдаемые переменные.
На 0-е, 21-е, 90-е и 180-е сутки: титры ингибирующих гемагглютинацию (Ш) сывороточных антител, тестируемые по отдельности против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (анти-Η1N1, анти-Η3N2 и анти-В антитела).
Отсекаемую величину для Ш антитела против всех вакцинных антигенов определяли в лаборатории перед анализом (и она равна 1:10). Серонегативным субъектом является субъект, титр антител которого ниже отсекаемой величины. Серопозитивным субъектом является субъект, титр антител которого выше величины отсекаемой величины или равен ей. Титр антител ниже отсекаемой величины в данном анализе, представлен произвольной выбранной величиной, равной половине отсекаемой величины.
На основании титров Ш-антител рассчитывают следующие параметры:
средние геометрические титры (ОМТ) Ш антител на 0-е и 21-е сутки, рассчитанные путем взятия антилогарифма от среднего для логарифмических преобразований титров, факторы сероконверсии (8Е) на 21-е сутки, определенные как кратное увеличение сывороточных ОМТ Ш на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками, уровни сероконверсии (8С) на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных либо с Штитром перед вакцинацией <1:10 и с титром после вакцинации >1:40, либо с титром перед вакцинацией >1:10 и минимум 4-кратным увеличением титра после вакцинации, уровни серопротекции (8РК) на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных с сывороточным Ш-титром >1:40.
95% ДИ для ОМ получают в пределах каждой группы по отдельности. Сначала получают 95% ДИ для среднего значения логарифмически преобразованного титра в предположении, что логарифмически преобразованные титры характеризуются нормальным распределением с неизвестной переменной. Затем получают 95% ДИ для ОМ в результате экспоненциального преобразования 95% ДИ для среднего значения логарифмически преобразованного титра.
Отсутствующий серологический результат для измерения конкретного антитела не заменяют. Следовательно, субъект без серологического результата для данной временной точки не вносит вклад в анализ испытания в эту временную точку.
Результаты по гуморальному иммунному ответу (фиг. 7 и табл. 12).
ОМТ Ш-антител до вакцинации для всех 3 вакцинных штаммов находились в одном и том же диапазоне в 4 подвергаемых обработке группах. После вакцинации имеется очевидное воздействие 2 адъювантов, которые увеличивают гуморальный ответ у пожилых людей по сравнению со стандартной Пиап.х в той же популяции (фиг. 7 показана на линейной шкале, однако то же самое воздействие с очевидностью будет наблюдаться на логарифмической шкале).
- 49 018860
СΜΤ:
значительно выше в отношении Н1 Ν1 для Α801Е;
значительно выше в отношении Η3Ν2 для обоих адъювантов;
никакого значительного различия не наблюдали в отношении СΜΤ после вакцинации между двумя группами субъектов, получавших адъювантные вакцины.
Через двадцать одни сутки после вакцинации субъекты Ниапх (18-40 лет) имели более высокий ΗΙответ для штаммов №\ν Са1ебоша и В/Лапдзи.
Как показано в табл. 12, адъювантные противогриппозные вакцины превышали требования Европейских ведомств в отношении ежегодной регистрации вирионных сплит-противогриппозных вакцин |№(е Гог Сшбапсе оп Ηа^тοη^ζаί^οη оГ Кецшгетейз Гог [пПиепха ¥ассше8 Гог (Не 1ттипо1од1са1 аззеззтеп( оГ аппиа1 з!гат сйапдез (СΡΜΡ/ВАΡ/214/96)] для субъектов в возрасте старше 60 лет.
После вакцинации имелось статистическое различие в уровнях серопротекции ΗΙ-антител между группой Е1иаг1х (> 65 лет) и Е1иМ.801В и НиМ^Ш для штамма Α/Η1Ν1/№\ν Са1ебоша.
Для каждого вакцинного штамма уровни серопротекции для 2 противогриппозных адъювантных вакцинных групп лежат в одном и том же диапазоне, что и для группы Е1иапх (18-40 лет).
Для каждого вакцинного штамма уровни сероконверсии для 2 противогриппозных адъювантных вакцинных групп лежат в одном и том же диапазоне, что и для группы Е1иапх (18-40 лет), за исключением штамма №\ν Са1ебоша.
Таблица 12
Уровни серопротекции, уровни сероконверсии и факторы конверсии на 21-е сутки (АТР группа по иммуногенности)
Штаммы | Группа | Ν | Уровень серопротекции (ΗΙ-титр г 40) % | Уровень сероконверсии (> 4-кратное увеличение) [ДИ 95%] % | Фактор конверсии [ДИ 95%) % |
Стандарт ЕС (>60 лет) | > 60% | > 30% | > 2,0 | ||
Стандарт ЕС (<60 лет) | > 70% | > 40% | >2,5 | ||
Α/Νβνν Са1еСоп1а (Η1Ν1) | Е1и Упд | 75 | 100 [95,20-100) | 77,3 [66,2-86,2] | 35,1 [21,9-56,4] |
ΕΙιι Ег6ег1у | 49 | 71,4 [56,74-83,42) | 30,6 [18,3-45,4] | 3,7 [2,4-5,7] | |
Е1иА801 В | 75 | 97,3 [90,70-99,681 | 48,0 [36,5-59,8] | 4,5 [3,3-6,1] | |
ΕΙιιΑδΟΊΕ | 75 | 93,3 [85,12-97,80] | 52,0 [40,2-63,7] | 5,0 [3,6-6,9] | |
Α/Νβνγ Уогк (Η3Ν2) | Е1и Упд | 75 | 93,3(85,12-97,80] | 76,0 [64,7-85,11 | 9,2 [7,1-11,8] |
Е1и Егбег1у | 49 | 81,6(67,98-91,24] | 69,4 [54,6-81,7] | 8,2 [5,7-11,8] | |
Р1иА801В | 75 | 96,0(88,75-99,17] | 85,3 [75,3-92,41 | 13,1 [10,0-17,11 | |
Р1иА801Е | 75 | 93,3 [85,12-97,80] | 80,0 [69,2-88,4] | 14,5 [10,4-20,2] | |
В/Лапдви (В) | Р1и Упд | 75 | 100 [95,20-100] | 81,3 [70,7-89,5] | 13,9(10,1-19,1] |
Е1и ЕШег1у | 49 | 93,9(83,13-98,72] | 44,9 [30,7-59,8] | 4,3(3,0-6,1] | |
Р1иА301В | 75 | 100 [95,20-100] | 65,3 [53,5-76,0] | 5,2 [4,2-6,5] | |
ΕΙιιΑδΟΊΕ | 75 | 97,3 [90,70-99,681 | 70,7 [59,0-80,61 | 6,7 [5,1-8,9] |
Ν = общее количество субъектов;
% = процент субъектов с титром на 21-е сутки в пределах конкретного диапазона;
ДИ = доверительный интервал.
νΙ.3.2. Выводы по иммуногенности.
Частота встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 перед вакцинацией была значительно ниже у пожилых взрослых по сравнению со взрослыми людьми в возрасте 18-40 лет. После вакцинации Ниапх™ послевакцинационная частота встречаемости (21-е сутки) оставалась ниже у пожилых взрослых людей по сравнению с молодыми людьми. В противоположность этому, не меньшая эффективность в терминах частоты встречаемости в отношении послевакцинационной частоты встречаемости специфических к вирусу гриппа СЭ4 после вакцинации адъювантными вакцинами пожилых субъектов была продемонстрирована по сравнению с вакцинацией Е1иапх™ взрослых людей в возрасте 18-40 лет.
Что касается гуморального иммунного ответа в терминах ΗΙ-антительного ответа, то все противогриппозные вакцины удовлетворяли требованиям Европейских ведомств в отношении ежегодной регистрации инактивированных противогриппозных вакцин |№(е Гог Сшбапсе оп Ηа^тοη^8аί^οη оГ Кецшгетеп(з Гог Мие^а ¥ассшез Гог (Не 1ттипо1од1са1 аззеззтеп! оГ аппиа1 з1га1п сНапдез (СΡΜΡ/ВАΡ/214/96)]. У пожилых людей адъювантные вакцины опосредовали, по меньшей мере, тенденцию к более высокому гуморальному иммунному ответу на гемагглютинин вируса гриппа по сравнению с Ниапх™. Значительное различие между гуморальным иммунным ответом против каждого вакцинного штамма, опосредованным у пожилых субъектов адъювантными вакцинами по сравнению с Ниапх™, суммировано в табл. 13. По сравнению со взрослыми людьми в возрасте 18-40 лет, вакцинированными Е1иапх™, пожилые субъекты, вакцинированные адъювантными вакцинами, продемонстрировали тенденцию к более высоким послевакцинационным СΜΤ и фактору сероконверсии на 21-е сутки против штамма Α/№\ν Υο^к.
- 50 018860
Таблица 13 Штаммы вируса гриппа, при использовании которых наблюдали значительно более высокий гуморальный иммунный ответ (на основании не перекрывания 95% ДИ) у пожилых субъектов, вакцинированных разными адъювантными вакцинами, по сравнению с Е1иапх в одной и той же популяции
Роз1 уасс СМТ | Фактор сероконверсии | Уровень серопротекции | Уровень сероконверсии | |
НиА8(ИВ 1 | Α/Νβ\ν Уогк | Α/Νβνν Са!е<1огпа | ||
Р1иА801Е | Α/Νθυν Са1е6оп1а Α/Νβνν Уогк | Α/Νβνιζ Са!ес!оп1а |
Роз1-уасс СМТ= средний геометрический титр после вакцинации.
У1.4. Выводы по реактогенности.
У1.4.1. Регистрация неблагоприятных событий (АЕ).
Регистрировали вызывающие беспокойства симптомы (см. табл. 14), имеющие место в течение 7 суток периода контрольного наблюдения (день вакцинации и 6 последующих суток). Кроме того, регистрировали непредусмотренные симптомы, имеющие место в течение 21 суток периода контрольного наблюдения (день вакцинации и 20 + 3 последующих суток). Интенсивность следующих далее АЕ оценивали, как описано в табл. 15.
Таблица 14
Вызывающие беспокойства местные/общие неблагоприятные события
Вызывающие беспокойства местные АЕ | Вызывающие беспокойства общие АЕ |
Боль в месте инъекции Покраснение в месте инъекции Припухлость в месте инъекции Гематома | Усталость Лихорадка Головная боль Мышечная боль Дрожь Суставная боль в руке с инъекцией Суставная боль в других местах |
Внимание: температуру регистрировали по вечерам. При необходимости дополнительных измерений температуры в другое время суток регистрировали самое высокое значение температуры.
Таблица 15
Баллы по шкале интенсивности для вызывающих беспокойства симптомов у взрослых
Неблагоприятное событие | Оценка интенсивности | Параметр |
Боль в месте инъекции | 0 | Отсутствует |
1 | при касании | |
2 | при движении конечностью | |
3 | препятствует обычной деятельности | |
Покраснение в месте инъекции | Регистрируют самый большой размер на поверхности в мм | |
Припухлость в месте инъекции | Регистрируют самый большой размер на поверхности в мм | |
Гематома в месте инъекции | Регистрируют самый большой размер на поверхности в мм | |
Лихорадка* | Регистрируют температуру в “САР | |
Головная боль | 0 | Отсутствует |
1 | легко переносится | |
2 | влияет на обычную деятельность | |
3 | препятствует обычной деятельности | |
Усталость | 0 | Отсутствует |
1 | легко переносится | |
2 | влияет на обычную деятельность | |
3 | препятствует обычной деятельности | |
Суставная боль в месте инъекции и других местах | 0 | Отсутствует |
1 | легко переносится | |
2 | влияет на обычную деятельность | |
3 | препятствует обычной деятельности | |
Мышечная боль | 0 | Отсутствует |
1 | легко переносится | |
2 | влияет на обычную деятельность | |
з | препятствует обычной деятельности | |
Дрожь | 0 | Отсутствует |
1 | легко переносится | |
2 | влияет на обычную деятельность | |
3 | препятствует обычной деятельности |
* Лихорадку определяют, если температура под мышкой больше или равна 37,5°С (99,5°Е).
Максимальную интенсивность местного покраснения/набухания в месте инъекции оценивают сле- 51 018860 дующим образом: 0 означает 0 мм; 1 означает от >0 до <20 мм; 2 означает от >20 до <50 мм; 3 означает >50 мм. Максимальную интенсивность лихорадки оценивают следующим образом: 1 означает от >37,5 до <38,0°С; 2 означает от >38,0 до <39,0°С; 3 означает >39,0°С.
Исследователь осуществляет оценку интенсивности для всех других АЕ, т.е. непредусмотренных симптомов, включая 8АЕ (тяжелые АЕ), зафиксированные в ходе исследования. Оценка основана на клиническом опыте исследователя. Интенсивность каждого зафиксированного АЕ оценивают по одной из следующих категорий:
(слабое) - соответствует АЕ, которое легко переносится субъектом, приводя к минимальному дискомфорту и не влияя на каждодневную деятельность;
(умеренное) - соответствует АЕ, которое является достаточно дискомфортным в отношении влияния на обычную каждодневную деятельность;
(тяжелое) - соответствует АЕ, которое препятствует обычной каждодневной деятельности (у взрослых/подростков такое АЕ может, например, создавать препятствие для присутствия на работе/в школе и вынуждать вводить корректирующую терапию).
νΙ.4.2. Регистрация неблагоприятных событий (АЕ).
Обнаружено, что реактогенность, наблюдаемая у пожилых субъектов при использовании адъювантных вакцин, в отношении как местных, так и общих симптомов, оказалась более высокой, чем при использовании Р1иапх™. Ие только возникновение, но и интенсивность симптомов увеличивались после вакцинации адъювантными вакцинами (фиг. 8). Более высокая тенденция к симптомам с оценкой 3 была показана в группе субъектов, получавших адъювантную вакцину с иммуностимуляторами (МРЬ, 0821) в самой высокой концентрации по сравнению с группой субъектов, получавших адъювантную вакцину, в которой иммуностимуляторы присутствуют в более низкой концентрации. Однако во всех случаях симптомы быстро исчезали.
Пример νΙΙ. Доклиническая оценка адъювантных ^^вакцин на мышах.
В этом исследовании использовали двухвалентную антигенную композицию из папилломавируса человека (ΗΓν), в которой комбинированы вирусоподобные частицы (УЪР), образованные из Ь1 Η₽ν 16 и Ь1 Η₽ν 18, в качестве антигена. Задача данного исследования заключалась в сравнении эффективности этого антигенного препарата после приготовления его композиции с А801В и разведенным 1/5 А801В, оцениваемым против существующего в настоящее время адъюванта, обнаруженного в вакцине против цервикального рака от С8К, А804 (МРЬ на квасцах).
νΙΙ.1. Вакцинация.
Мышей (п=12 на группу) инъецировали на 0-е и 28-е сутки вакцинными композициями, содержащими Ь1 №ν16/18 (по 2 мкг или по 0,5 мкг каждого), взятый из способа Ηί-5 80/80Ь, и приготовленными с А804 (приготовленная композиция 50 мкг МРЬ с квасцами) или А801В (50 мкг 0821 - 50 мкг МРЬ в 0,5 мл) в 1/10 и 1/50 дозе для человека. Поскольку исследование проводили на мышах, 1/10 дозы для человека может считаться равной композиции А801В для человека, т.е. равной 50 мкг 0821 и 50 мкг МРЬ в 0,5 мл, а 1/50 может считаться разведением 1/5 композиции А801В для человека, т.е. равной 10 мкг 0821 и 10 мкг МРЬ в 0,5 мл. Образцы крови брали на 14-е и 45-е сутки после введения дозы ΙΙ (рок! ΙΙ) с целью анализа на суммарные специфические к анти-Ы типу антитела в индивидуальных образцах сыворотки. Окрашивание внутриклеточных цитокинов измеряли на 7-е и 14-е сутки рой ΙΙ на РВМС, а на 45-е сутки рок! ΙΙ - с использованием клеток селезенки. Частоту встречаемости УЕР-специфических В-клеток памяти измеряли на 45-е сутки рок! ΙΙ с использованием клеток селезенки.
УП.2. ЕЫ8А анти-ΗРV 16/18 Ь1.
Количественное определение антител против Ь1 из №ν-16 и ЧРУ-18 проводили посредством ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ), используя Ь1 из №ν-16 и ЧРУ-18 для сенсибилизации. Антигены разводили до конечной концентрации 0,5 мкг/мл в РВ8 и оставляли адсорбироваться в течение ночи при 4°С в лунках 96-луночных титрационных микропланшетов (Мах1когр Iштиηо-р1аΐе, Νι.ιικ, Оепшатк). Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С с РВ8, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (В8А) (насыщающий буфер). Образцы сыворотки, разведенные в буфере, содержащем РВ8 + 0,1% Твина 20 + 1% В8А, добавляли в сенсибилизированные с помощью Ь1 №У планшеты и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали четыре раза смесью РВ8 + 0,1% Твина 20, в каждую лунку добавляли биотин-конъюгированные анти-мышиные Ι§ (Оако), разведенные 1/1000 в насыщающем буфере, и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. После стадии промывки добавляли конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена (Эако, ИК), разведенный 1/3000 в насыщающем буфере, еще на 30 мин при 37°С. Планшеты промывали, как указано выше, и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре с раствором 0,04% о-фенилендиамина (81дша), 0,03% Н2О2 в 0,1%-ном Твине 20, 0,05 М цитратном буфере рН 4,5. Реакцию останавливали добавлением 2н. Η28Ο4 и планшеты считывали при 492/620 нм. ЕША-титры рассчитывали на основании ссылки с использованием 8ойМахРто (используя четырехпараметрическое уравнение) и выражали в ЕЙ (единицы активности фермента)/мл.
- 52 018860
У11.3. Окрашивание внутриклеточных цитокинов (1С8).
Внутриклеточное окрашивание цитокинов Т-клеток выполняли на РВЬ на 7-е и 14-е сутки рок! II и на клетках селезенки на 45-е сутки после второй иммунизации. РВМС (1 пул/группа) или клетки селезенки (4 пула от 3 органов на группу) отбирали у мышей. Антигенную стимуляцию ίη νίίΐΌ клеток селезенки выполняли в конечной концентрации 5-106 клеток/мл (микропланшет с 96 лунками) с использованием УЪР 16 или 18 (5 мкг/мл) + СЭ496 СЭ28 антител (1 мкг/мл) и затем инкубировали 3 ч при 37°С. После стадии повторной стимуляции антигеном клетки инкубировали в течение ночи в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) при 37°С для ингибирования секреции цитокинов. Окрашивание клеток выполняли следующим образом: клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкл РВ8 с 1% РС8, содержащего 2% Рс-блокирующего реагента (1/50; 2.4С2). После 10 мин инкубации при 4°С добавляли 50 мкл смеси анти-СЭ4-АРС (1/50) и анти-СО8 регСр (1/50) и инкубировали 30 мин при 4°С. После промывки в РВ8 с 1% РС8 клетки подвергали пермеабилизации путем ресуспендирования в 200 мкл СуЮП.хСуЮрегш (набор от ВИ) и инкубировали 20 мин при 4°С. Затем клетки промывали, используя Регт АакЫ (набор от ВИ), и ресуспендировали с использованием 50 мкл смеси анти-ΙΡΝ-γ АРС (1/50) + анти-1Ь-2 Р1ТС (1/50), разведенных в Регт АакЫ. После 2 ч инкубации при 4°С клетки промывали Регт АакЫ и ресуспендировали в РВ8 с 1% РС8 + 1% параформальдегида. Анализ образцов осуществляли с использованием РАС8. Живые клетки сортировали (Р8С/88С) и сбор данных осуществляли приблизительно на 20000 событий (лимфоцитов). Проценты ΙΕΝγ+ или 1Ь2+ рассчитывали на отсортированных популяциях СЭ4+ и СЭ8+.
У11.4. В-клеточная память.
Через сорок пять суток после второй иммунизации мышей умерщвляли; клетки селезенки отделяли с использованием градиента ЬутрЫоргер (Себаг1апе). Затем В-клетки ресуспендировали в среде КРМ1 1640 (С1Ьсо), содержащей добавки (1 мМ пируват натрия, не основные аминокислоты МЕМ (минимальной поддерживающей среды), Реп/81гер (пенициллин/стрептомицин), глутамин и β-2-меркаптоэтанол), 5% фетальной телячьей сыворотки, 50 единиц/мл гЫЬ-2 (рекомбинантный человеческий 1Ь-2) (еВюкс1епсе) и 3 мкг/мл СрС. Клетки культивировали в течение пяти суток в конечной концентрации 106 клеток/мл в 5 мл, распределенных на 6 плоскодонных лунок. После стадии активации этанолом нитроцеллюлозные планшеты (МиШксгееп-ГР; М1Шроге) сенсибилизировали 10 мкг/мл УЪР или анти-мышиными 1д козы (САМ; 81дта), разведенными 1/200 в РВ8. После стадии насыщения с использованием полной среды в планшеты, сенсибилизированные УЪР, добавляли по 100 мкл 2х106 клеток/мл, а в САМпланшеты добавляли по 100 мкл 106 и 5х105 клеток/мл. После инкубации в течение 2 ч при 37°С планшеты хранили в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали четыре раза РВ8 с 0,1% Твина 20, на планшеты наносили анти-мышиные биотинилированные (Вю1) 1д, разведенные 1/200 в РВ8 с 1% В8А и 5% РС8 (буфер для разведения), и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После стадии промывки добавляли Ех1гапйт ИКР (81дта), разведенный 1/550 в буфере для разведения, еще на 1 ч при 37°С. Планшеты промывали, как указано выше, и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре с раствором АЕС (3-амино-9-этилкарбазол) (81дта). Реакцию останавливали путем осторожного ополаскивания планшетов под водопроводной водой. После сушки планшеты считывали с использованием К8400.
У11.5. Статистический анализ.
Средние значения для композиций сравнивали с использованием одностороннего дисперсионного анализа (АЫОУА 1). Анализ выполняли с логарифмически (по основанию 10) преобразованными данными с целью получения нормального распределения. Когда детектировали значительное различие между средними значениями процесса (значение р < 0,05), выполняли парные сравнения среди средних значений с уровнем значимости 0,05 (критерий множественных сравнений Стьюдента-Ньюмана-Кеулса (8Ц1беп1-№\утап-Кеи1к).
- 53 018860 νΐΐ.6. Результаты.
Мышей иммунизировали, как в ΥΠ.1, выше. Использовали следующие группы.
Группа | Антиген | Адъювант | Разведение адъюванта |
1 | 1.1 НРУ 16-18, 2 мкг | А304 | 1/10 дозы для человека (эквивалент 50 мкг МРЬ на 0,5 мл Ηϋ) |
2 | 11 ΗΡν 16-18, 0,5 мкг | А304 | 1/50 дозы для человека (эквивалент 10 мкг МРЬ на 0,5 мл Ηϋ) |
3 | и НРУ 16-18, 2 мкг | А304 | 1/10 дозы для человека (эквивалент 50 мкг МРЬ на 0,5 мл НО) |
4 | 1_1 НРУ 16-18, 0,5 мкг | А504 | 1/50 дозы для человека (эквивалент 10 мкг МРЬ на 0,5 мл Ηϋ) |
5 | 1.1 НРУ 16-18, 2 мкг | А301В | 1/10 дозы для человека (эквивалент 50 мкг МРГ на 0,5 мл НО) |
6 | Ы НРУ 16-18, 0,5 мкг | А301В | 1/50 дозы для человека (эквивалент 10 мкг ΜΡΙ. на 0,5 мл НО) |
7 | Ы НРУ 16-18, 2 мкг | А301В | 1/10 дозы для человека (эквивалент 50 мкг МРЬ на 0,5 мл НО) |
8 | И НРУ 16-18, 0,5 мкг | А301В | 1/50 дозы для человека (эквивалент 10 мкг МРЬ на 0,5 мл Ηϋ) |
νΐΐ.6.1. Гуморальные ответы.
Никакого значительного изменения в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз антигенов с обоими разбавлениями адъюванта как для титров антител против Ь1 НРУ-16, так и для титров антител против Ь1 НРУ-18 (фиг. 9).
Никакого значительного изменения в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз каждого адъюванта, какая бы ни была доза антигена, для титров антител против Ь1 НРУ-16. При изучении титров антител против Ь1 НРУ-18 наблюдали слабое увеличение титра для А801В (1/10 НИ) по сравнению с А801В (1/50 НИ), как измерено на 14-е сутки роз! II (2,5-кратное изменение дозы, значение р = 0,0035), однако это изменение наблюдали только для 2 мкг антигена, а не для 0,5 мкг антигена (значение р = 0,0867). Что касается 45-х суток роз! II, то никакого значительного изменения в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз каждого адъюванта, какая бы ни была доза антигена.
УП.6.2. Клеточные ответы.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов.
Никакого влияния антигена на изменение в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз антигенов, какая бы ни была доза адъюванта для НРУ18-й1. Похожие частоты встречаемости УГР16специфических СИ4+ Т-клеток получали при использовании двух тестируемых доз антигенов с разными дозами адъювантов (фиг. 10).
Слабый эффект от дозировки (2,6-кратный, значение р = 0,0009 для НРСА-И; 2-кратный, значение р = 0,0187 для НР\;16-И) наблюдали для А801В (1/10 НИ) по сравнению с А801В (1/50 НИ), однако это изменение наблюдали только для 2 мкг антигена, а не для 0,5 мкг антигена.
Специфические В-клетки памяти.
Никакого влияния антигена на изменение в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз антигенов, какая бы ни была доза адъюванта, для Ь1 из НРУ 16 или 18 (фиг. 11).
Никакого влияния адъюванта на изменение в зависимости от доз не наблюдали для двух тестируемых доз адъювантов, какая бы ни была доза антигена, для Ь1 из НРУ 17 или 18.
Как можно видеть из приведенных выше результатов, в результате разведения 1/5 А801В получают композицию, которая обладает такой же эффективностью в иммуногенных композициях, что и сам А801В.
Пример Уш. Доклиническая оценка адъювантных вакцин 8. рпеитошае на мышах.
Пневмококковая вакцина, использованная в этом исследовании, представляла собой 11-валентную адъювантную пневмококковую конъюгатную вакцину (11 РСУ/А8), состоящую из смеси 11 пневмококковых полисахаридных конъюгатов с адъювантом либо А801В, либо А801Е. Конъюгаты содержат очищенные полисахариды из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Н, 9ν, 14, 18С, 19Н и 23Н 8. рпеитошае, каждый из которых по отдельности конъюгирован с белком-носителем, либо дифтерийным анатоксином (ИТ), либо столбнячным анатоксином (ТТ), либо белком Ό (РИ) из Н. тПиепхае. Вакцины представлены в виде высушенного сублимационной сушкой порошка, чтобы затем быть восстановленными с использованием одного из жидких адъювантов. 1 1РСУ/А8 приготавливают следующим образом.
Для каждого полисахарида имеются конкретные условия активации и связывания. Они приведены ниже в таблице. Отсортированный (по размерам частиц) полисахарид (за исключением Р8 5, 6В и 23Н)
- 54 018860 растворяли в 2 М №1С1 или в воде для инъекций (νΕΙ). Для всех серотипов была проведена оценка оптимальной концентрации полисахарида. Все серотипы, за исключением серотипа 18С, конъюгировали непосредственно с белком-носителем, как подробно представлено ниже.
К раствору полисахарида (Р8) добавляли СПАР (соотношение СПАР/Р8 0,75 мг/мг Р8) из концентрированного раствора, 100 мг/мл, в ацетонитриле или растворе ацетонитрил/вода (50%/50%). Через 1,5 мин добавляли 0,2М-0,ЗМ ΝηΘΗ для получения конкретного рН для активации (ρΗ3). Активацию полисахарида проводили при этом рН в течение 3 мин при 25°С. К активированному полисахариду добавляли очищенный белок (белок Ό или ΌΤ) (количество зависит от начального соотношения Р8/белок-носитель) и реакцию сочетания проводили при конкретном рН (ρΗ0) в течение включительно до 2 ч (в зависимости от серотипа) при регулировании рН. Затем для погашения непрореагировавших цианатных сложноэфирных групп к смеси добавляли 2 М раствор глицина. рН подводили до рН гашения (ρΗ4 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем в течение ночи при 2-8°С при непрерывном медленном перемешивании.
Подготовка 18С.
18С связывали с белком-носителем через линкер - дигидразид адипиновой кислоты (АЭ^. Перед образованием конъюгата полисахарид серотипа 18С подвергали микрофлюидизации.
Получение производных столбнячного анатоксина с использованием БОАС.
Для получения производных столбнячного анатоксина очищенный ТТ разбавляли до 25 мг/мл в 0,2 М №1С1 и добавляли спейсер Α^Η для достижения конечной концентрации, равной 0,2 М. После завершения растворения спейсера рН подводили до 6,2. Затем добавляли БОАС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) для достижения конечной концентрации 0,02 М и смесь перемешивали в течение 1 ч при регулировании рН. Реакцию конденсации останавливали путем увеличения рН включительно до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25°С. Производные ТТ затем подвергали диафильтрации (мембрана с СО (сШ-оТТ; начало отсчета) 10 кДа) с целью удаления оставшихся Α^Η и реагента БОАС.
Окончательно, нерасфасованную форму ТТАН подвергали стерильной фильтрации после стадии сочетания и хранили при -70°С.
Химическое сочетание ТТАН с Р8 18С.
Подробности параметров конъюгирования можно найти в табл. 1.
г подвергнутого микрофлюидизации Р8 разводили в определенной концентрации в воде и подводили до 2 М №1С1 путем добавления порошка №С1. Для достижения соответствующего соотношения СПАР/Р8 добавляли раствор СПАР (100 мг/мл, свежеприготовленный в смеси 50/50 об./об. ацетонитрил/νΕΙ).
рН повышали включительно до рН активации 9,0 путем добавления 0,3 М ΝηΘΗ и поддерживали при этом рН до добавления ТТАН.
Через 3 мин добавляли производные ТТЛц (20 мг/мл в 0,2 М №1С1) для достижения соотношения ТТан/Р8, равного 2; производили регулировку рН до рН сочетания 9,0. Раствор оставляли на 1 ч при регулировании рН.
Для гашения к смеси Р8/ΤΤΑΗ/С^ΑР добавляли 2 М раствор глицина.
рН подводили до рН гашения (рН 9,0).
Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем оставляли стоять в течение ночи при 28°С при непрерывном медленном перемешивании.
Очистка конъюгатов.
Конъюгаты очищали гель-фильтрацией, используя колонку для гель-фильтрации с 8срНасгу1 500ΗΚ, уравновешенную 0,15 М №1С1 (8500ΗΚ для 18С), для удаления небольших молекул (включая ОМАР (4(КХ-диметиламино)пиридин или диметиламинопиридин) и неконъюгированных Р8 и белка. Вследствие разных молекулярных размеров реакционных компонентов конъюгаты Р8-РП, РЗ-ГТ или Р8-^Τ элюируются первыми, затем свободный Р8, после чего свободный РО или свободный ΌΤ и в конце ОМАР и другие соли (ЛаС1, глицин). Фракции, содержащие конъюгаты, детектировали по УФ280 нм. Фракции объединяли в соответствии с их Кй, подвергали стерильной фильтрации (0,22 мкм) и хранили при 2-8°С. Определяли соотношения Р8/белок в препаратах конъюгатов.
- 55 018860
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Р8 8.рηеишоη^ае-белок Э/ТТ/ЭТ
Серотип | 1 микрофлюид. | 3 микрофлюид. | 4 микрофлюид. | 5 | 6В | 7Р микрофлюид. |
Конц. РЗ (мг/мл) | 2,5 | 3,0 | 2,5 | 7,1 | 5,0 | 5,0 |
Растворение РЗ | ννρι | 2 М ЫаС1 | ννπ | ννπ | 2 М №С1 | 2 М №С1 |
Конц. Ρϋ (мг/мл) | 10,0 | 5.0 | 10,0 | 5,0 | 5,0 | 10,0 |
Исх. соотн. Ρδ/Ρϋ (масс./масс.) | 1,5/1 | 1/1 | 1,5/1 | 1/1 | 1,1/1 | 1,2/1 |
Конц. ΟϋΑΡ (мг/мг РЗ) | 0,50 | 0,75 | 0,50 | 0,79 | 0,83 | 0,75 |
рНа=рНс=рНч | 9,0/9,0/9,0 | 9,0/9,0/9,0 | 9,5/9,5/9,0 | 9,0/9,0/9,0 | 9,5/9,5/9,0 | 9,5/9,5/9,5 |
Серотип | 9У микрофлюид. | 14 микрофлюид. | 18С микрофлюид. | 19Е микрофлюид. | 23Е |
Конц. Р8 (мг/мл) | 5,0 | 5,0 | 4,5 | 9,0 | 2,38 |
Растворение РЗ | 2 М ЫаС1 | 2 М ИаС! | 2 М ЫаС1 | 2 М №С1 | 2 М №С1 |
Конц, белканосителя (мг/мл) | 10,0 | 10,0 | 20,0 (ТТ) | 20,0 (ДТ) | 5,0 |
Исх. соотн. белокноситель/РЗ (масс./масс.) | 1,2/1 | 1,2/1 | 2/1 | 1,5/1 | 1/1 |
Конц. СО АР (мг/мг РЗ) | 0,50 | 0,75 | 0,75 | 1,5 | 0,79 |
рНа=рНс=рНч | 9,5/9,5/9,0 | 9,5/9,5/9,0 | 9,0/9,0/9,0 | 9.0/9,0/9,0 | 9,5/9,5/9,0 |
Затем 11 конъюгатов смешивали друг с другом и перед иммунизацией конечный антигенный препарат смешивали с соответствующим адъювантом.
Группы из 40 самок старых мышей Ва1Ь/с в возрасте 4 недель иммунизировали в/м на 0-е, 14-е и 28е сутки, используя 0,1 мкг 11-валентных Р8 конъюгатов, приготовленных либо с А801В, либо с А801Е. В образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки, определяли дозу антител против Р8 1дО с помощью ЕЫ8А.
Как можно видеть из фиг. 12, наблюдали сопоставимые ответы для конпозиции с разведенным А801Е по сравнению с композицией с А801В, за исключением Р8 14, когда наблюдали более высокий ответ при использовании А801В, и Р8 19Б, когда наблюдали более высокий ответ при использовании А801Е.
Пример IX. Доклиническая оценка адъювантных и безадъювантных цитомегаловирусных иммуногенных композиций.
1Х.1. Морские свинки.
1Х.1.1. Ейка анти-дВ.
Количественное определение анти-дВ антител выполняли посредством ЕЫ8А с использованием дВ в качестве сенсибилизирующего антигена. Антиген разводили в конечной концентрации 4 мкг/мл в РВ8 и по 100 мкл инкубировали в течение ночи при 4°С в 96-луночных титрационных микропланшетах. Затем планшеты насыщали в течение 1 ч при 37°С с использованием по 200 мкл РВ8, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина. Добавляли двукратные серийные разведения сыворотки (по 100 мкл/лунка) и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза РВ8 с 0,1% Твина 20, в каждую лунку добавляли по 100 мкл конъюгированных с пероксидазой хрена антител против 1дО морских свинок (Пако, ИК) и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4
- 56 018860 раза РВ8 с 0,1% Твина 20 и 1 раз водой. Затем их инкубировали в течение 20 мин при 22°С после добавления по 100 мкл раствора о-фенилендиамина (81дта) в 0,1 М цитратном буфере рН 4,2. Эту реакцию останавливали добавлением по 100 мкл 2 н. Н28О4 и считывали на 490/620 нм. Е11ка-титры определяли интерполяцией значений ОЭ от ссылочного образца с использованием 8ойМахРто. Титры выражали в Еи/мл.
Статистические анализы осуществляли для данных Е11ка на 14-е сутки рок! 2, используя ИМБТАТ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
1) логарифмическое преобразование данных;
2) критерий Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения групп;
3) критерий Кокрена с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
4) дисперсионный анализ для выбранных данных (односторонний);
5) Н8П-критерий Тьюки для множественных сравнений.
ГХ.1.2. Анализ нейтрализации.
Перед проведением анализа МКС5-клетки (10000 клеток/200 мкл среды МЕМ) распределяли по 96луночным микропланшетам и инкубировали в течение 3 суток при 37°С с СО2. Приготавливали двукратные разведения образцов инактивированной (30 мин при 56°С) сыворотки и инкубировали со 100 мкл раствора вируса (800 ГРИ(единицы иммунопреципитации)/мл) в течение 1 ч при 37°С. После инкубации инокулировали по 100 мкл смеси образцов сыворотки с вирусом в 96-луночные микропланшеты с монослоем МКС5. Планшеты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 1 ч при 35°С. После инкубации в течение ночи при 37°С планшеты фиксировали 80%-ным раствором ацетона (20 мин при -20°С). Раствор ацетона удаляли и детектировали СΜV-позитивные клетки, используя специфические моноклональные антитела против немедленно раннего антигена в течение 1 ч при 37°С. Планшеты промывали 3 раза РВ8, в каждую лунку добавляли биотин-конъюгированные анти-мышиные и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После стадии промывки добавляли конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена еще на 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза и инкубировали в течение 10 мин с раствором истинно голубого (Тгие-Ь1ие). Путем исследования под микроскопом регистрировали сигналы специфической окраски. Титры нейтрализующих антител выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали 50%-ное уменьшение СМУ-позитивных клеток по сравнению с вирусным контролем (СМУ с клетками без сыворотки).
ГХ.1.3. Протоколы иммунизации.
Иммунизировали 4 группы. Каждая группа состояла из 8 самок морских свинок Наг!1еу Сг1:(1а) в возрасте 5-8 недель за исключением контрольной группы (группа 4), состоящей только из 4 субъектов. Субъектов иммунизировали в/м на 0-е и 28-е сутки. Образцы сыворотки собирали через 28 суток после первой иммунизации и через 14 суток после второй иммунизации. Е11ка осуществляли, как описано выше, на образцах сыворотки, взятых через 28 суток после первой иммунизации (28 рок! I) и через 14 суток после второй иммунизации (14 рок! II). Анализы нейтрализации осуществляли, как описано выше, для 14 рок! II. Рассматривались приведенные ниже группы:
Группа | Антиген | Адъювант |
1 | дв | ЫаС1 |
2 | дВ | А801В |
3 | дв | А501Е |
4 | ИаС! | №С! |
Антиген приготавливали следующим образом. Вакцинный антиген экспрессируют в клетках китайского хомячка (СНО) в виде дВ** - укороченных химерных конструкций, содержащих пептидные последовательности от гликопротеина βϋ вируса простого герпеса 2 (Н8У2) на его Ν- и С-конце. дВ** укорочен по своему С-концевому домену, содержащему мембрано-якорную последовательность, и поэтому секретируется в культуральный супернатант.
Для первых трех групп по 15 мкг дВ**, приготовленного в 500 мкл либо РВ8, либо А801В или А801Е (полученных как в примере П.2, выше), вводили внутримышечной инъекцией. Группе 4 вводили внутримышечно только РВ8.
ГХ.1.4. Результаты.
Как можно видеть на фиг. 13, значительно более высокие ЕЫ8А-титры анти-дВ наблюдали для двух адъювантных групп по сравнению с дВ без адъюванта (в 8 и 5,5 раз выше для дВ/А801В и дВ/А801Е, соответственно). Титры антител для введения рок! II были совсем немного выше (в 1,5 раз) в группе дВ/А801В по сравнению с группой дВ/А801Е.
Множественное сравнение: Тьюки-Н8П
- 57 018860
Группа | Кол-во случаев | Среднее | Без адъванта | А301Е | А501В |
Без адъванта | 8 | 4,7917 | Ά * | ** | |
А301Е | 8 | 5,5293 | ** | ||
А801В | 8 | 5,8942 | +* | |
Без адъюванта < А801Е = А801В.
Что касается титров нейтрализующих антител (фиг. 14), то:
никаких специфических нейтрализующих антител не наблюдали в группе дВ без адъюванта; в обеих адъювантных группах детектировали специфические нейтрализующие антитела; в обеих адъювантных группах наблюдали похожие уровни нейтрализующих антител.
ЕХ.2. Мыши.
К.2.1. ЕЫ8А анти-дВ
Количественное определение анти-дВ антител осуществляли посредством ЕЫ8А с использованием дВ в качестве сенсибилизирующего антигена. Антиген разводили в конечной концентрации 1 мкг/мл в ΡВ8 и по 100 мкл инкубировали в течение ночи при 4°С в 96-луночных титрационных микропланшетах. Затем планшеты насыщали в течение 1 ч при 37°С с использованием по 200 мкл ΡВ8, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина. Добавляли двукратные серийные разведения сыворотки (по 100 мкл/лунка) и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза ΡВ8 с 0,1% Твина 20, в каждую лунку добавляли по 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена еще на 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза ΡВ8 с 0,1% Твина 20 и 1 раз водой. Затем их инкубировали в течение 10 мин при 22°С с 100 мкл 75%-ного тетраметилбензидина в 0,1 М цитратном буфере рН 5,8. Эту реакцию останавливали добавлением по 100 мкл 0,4 н. Н28О4 и считывали на 450/620 нм. Е11за-титры определяли интерполяцией значений ОЭ от ссылочного образца с использованием 8ойΜаxΡ^о. Титры выражали в ЕИ/мл.
Статистические анализы осуществляли для данных Е11за на 14-е сутки роз! 2, используя иИ[8ТАТ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
1) логарифмическое преобразование данных;
2) критерий Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения групп;
3) критерий Кокрена с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
4) дисперсионный анализ для выбранных данных (односторонний);
5) Н8Э-критерий Тьюки для множественных сравнений.
ЕХ.2.2. Анализ нейтрализации.
Перед проведением анализа ΜΚС5-клетки (10000 клеток/200 мкл среды ΜЕΜ) распределяли по 96луночным микропланшетам и инкубировали в течение 3 суток при 37°С с 5% СО2. Приготавливали двукратные разведения (60 мкл) образцов инактивированной (30 мин при 56°С) сыворотки и инкубировали с 60 мкл раствора вируса (800 ШИ/мл) в течение 1 ч при 37°С. После инкубации инокулировали по 100 мкл смеси образцов сыворотки с вирусом в 96-луночные микропланшеты с монослоем ΜΚΤ5. Планшеты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 1 ч при 35°С. После инкубации в течение ночи при 37°С планшеты фиксировали 80%-ным раствором ацетона (20 мин при -20°С). Раствор ацетона удаляли и детектировали СΜV-позитивные клетки, используя специфические моноклональные антитела против немедленно раннего I (ЕЕ^) антигена в течение 1 ч при 37°С. Планшеты промывали 3 раза ΡВ8, в каждую лунку добавляли биотин-конъюгированные анти-мышиные Λ и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После стадии промывки добавляли конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена еще на 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 4 раза и инкубировали в течение 10 мин с раствором истинно голубого. Путем исследования под микроскопом регистрировали сигналы специфической окраски. Титры нейтрализующих антител выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали 50%-ное уменьшение СΜV-позитивных клеток по сравнению с вирусным контролем (ί,'Μν с клетками без сыворотки).
^.2.3. Окрашивание внутриклеточных цитокинов.
Внутриклеточную детекцию Т-клеточных цитокинов осуществляли на ΡΕΕ на 7-е и 21-е сутки после второй иммунизации. Отбирали ΡΕΕ у мышей и объединяли (1 пул на группу). Антигенную стимуляцию ш νίΙΐΌ лимфоцитов (конечная концентрация 107 клеток/мл) выполняли либо с использованием пула пептида, охватывающего СΜV последовательность, либо белка дВ. Смесь ΡΕΕ/антиген инкубировали 2 ч при 37°С. Затем клетки инкубировали в течение ночи в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) при 37°С для ингибирования секреции цитокинов. Окрашивание клеток выполняли следующим образом: клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкл ΡВ8 с 1% ЕС8, содержащего 2% Есблокирующего реагента. После 10 мин инкубации при 4°С добавляли 50 мкл смеси анти-СЭ4-РЕ и антиί.Ό8 регСр и инкубировали 30 мин при 4°С. После стадии промывки в ΡВ8 с 1% ЕС8 клеточные мембраны подвергали пермеабилизации путем ресуспендирования в 200 мкл Су1оПх-Су1орегт (набор Веск!оп
- 58 018860
Рюкшвоп) и инкубировали 20 мин при 4°С. Затем клетки промывали, используя Регт νηβΐι (набор от ВЭ), и ресуспендировали с использованием 50 мкл смеси анти-Ш^гамма АРС + анти-[Ь-2 ПТС, разведенных в Ре^тVа5Й. После 2 ч инкубации при 4°С клетки ресуспендировали в РВ8 с 1% ЕС8 + 1% параформальдегида. Анализ образцов осуществляли с использованием ЕАС8. Живые клетки сортировали и сбор данных осуществляли приблизительно на +/- 20000 событий (лимфоцитов). Проценты ΙΕΝγ+ или ΙΕ2+ рассчитывали на отсортированных популяциях СЭ4+ и СЭ8+.
ΙΧ.2.4. Протоколы иммунизации.
Иммунизировали 4 группы. Каждая группа состояла из 12 самок С57ВЕ6 мышей в возрасте 4-10 недель.
Группа | Антиген | Адъювант |
1 | дв | РВЗ |
2 | дВ | А801В |
3 | дв | А801Е |
4 | №С1 | МаС! |
Антиген приготавливали следующим образом. Вакцинный антиген экспрессируют в клетках китайского хомячка (СНО) в виде дВ** - укороченных химерных конструкций, содержащих пептидные последовательности от гликопротеина дР вируса простого герпеса 2 (Н8У2) на его Ν- и С-конце. дВ** укорочен по своему С-концевому домену, содержащему мембрано-якорную последовательность, и поэтому секретируется в культуральный супернатант.
Каждую группу дВ** в концентрации 1,5 мкг/доза приготавливали в 625 мкл РВ8 либо адъюванта А801В или А801Е (полученных как в примере ΙΙ.2, выше, с концентрацией 100 мкл иммуностимуляторов в 1 мл или 50 мкл иммуностимуляторов в одном мл, соответственно). Внутримышечной инъекцией вводили 50 мкл (т.е. 1/10 дозы для человека в 0,5 мл). Одной контрольной группе мышей вводили инъекцией физиологический раствор. Инъекции выполняли на 0-е и 28-е сутки. Образцы сыворотки отбирали на 14е сутки после вторых инъекций для ЕЫ8А и анализов нейтрализации. Собирали РВЬ на 7-е сутки и 21-е сутки после вторых инъекций для Ιί.'8.
ΙΧ.2.5. Результаты.
ЕБША-титры анти-дВ (фиг. 15).
В безадъювантной группе дВ наблюдали уровень анти-дВ антител от очень слабого до недетектируемого. Однако в обеих адъювантных группах, А801В и А801Е, соответственно, наблюдали высокий антительный ответ (в 65 и 66 раз выше). Между группами А801В и А801Е статистической значимости не было.
Множественное сравнение: Тьюки-Н8Р
Г руппа | Кол-во случаев | Среднее | Без адъванта | А801Е | А801В |
Без адъванта | 12 | 2,1132 | ** | ** | |
А801Е | 12 | 3,9317 | ** | ||
А301В | 12 | 3,9375 | ** |
Без адъюванта < А801Е = А801В.
Титры СМУ-нейтрализующих антител (фиг. 16).
Значительно более высокие анти-дВ нейтрализующие титры наблюдали для двух адъювантных групп по сравнению с группой дВ без адъюванта. Никакого значительного различия в титрах нейтрализующих антител не наблюдали между композициями с А801В и А801Е.
Клеточно-опосредованный иммунитет.
Вследствие очень низкого уровня ответа, наблюдаемого после повторной стимуляции образцов через 7 суток после второй инъекции (7 рое! ΙΙ), невозможно выявить никакого различия между группами и невозможно установить никакого убедительного ответа по стимуляции СР4 и СР8 (фиг. 17). Такие ответы от низких до недетектируемых вероятно имели место из-за технической стороны (!есйтса1 15вие) в процессе приготовлений образцов. Тем не менее, можно было заметить ответы через 21 сутки после второй инъекции. Данные для СР4 (фиг. 18) показывают отсутствие различия после повторной стимуляции с использованием дВ (5 мкг/мл) или пептидов (2 мкг/мл или 4 мкг/мл). Похожий цитокиновый профиль показан для А801Е и А801В. Никакого убедительного ответа для стимуляции СР8 установить невозможно (фиг. 19).
Эти эксперименты показывают, что адъювант, имеющий низкие уровни иммуностимуляторов, является так же иммунологически эффективным для другой антигенной композиции и в двух разных организмах, как и адъювант, имеющий более высокие уровни.
Χ. Доклиническая оценка адъювантной вакцины на основе КТ8,8.
Х.1. Приготовление.
Антигенная композиция КТ8,8 продуцируется в 8ассйаготусев сегеу151ае и состоит из двух белков, КТ8 и 8, которые являются внутриклеточными и самопроизвольно собираются в смешанные полимер
- 59 018860 ные организованные в виде частиц структуры, для каждой из которых установлено, что она содержит в среднем 100 полипептидов. КТБ представляет собой гибридную полипептидную цепь (51 кДа) из 424 аминокислот, состоящую из 189 аминокислот, происходящих из спорозоитного поверхностного антигена малярийного паразита штамма NΕ53 Р. ДаШрагит (СБР антиген, аминокислоты 207-395), слитого с аминоконцевым участком белка Б вируса гепатита В. Б представляет собой полипептид с молекулярной массой 24 кДа (длиной 226 аминокислот), соответствующий поверхностному антигену вируса гепатипа В. Лиофилизованная гранула антигена содержит приблизительно 50 мкг (когда предполагается приготовление композиции в 0,5 мл с АБ01В) или 25 мкг (когда предполагается приготовление композиции в 0,5 мл с АБ01Е) антигена.
АБ01В и АБ01Е приготавливали путем смешивания различных компонентов (РВБ, липосом, МРЬ и ОБ21) в резервуаре и перемешивания в стерильных условиях. Затем продукт подвергали стерильной фильтрации перед внесением во флаконы или шприцы. Жидкий адъювант хранили при температуре от 2 до 8°С перед его использованием для повторного растворения лиофилизованной гранулы антигена.
X. 2. Эксперименты на мышах.
Проводили два эксперимента на мышах с целью сравнения специфических к КТБ,Б иммунных ответов, индуцированных под действием КТБ,Б/АБ01В по сравнению с КТБ,Б, приготовленным с АБ01Е. В каждом эксперименте С57В1/6 мышей (10 мышей/группа) иммунизировали внутримышечно три раза с промежутком в две недели с использованием 10, 5 или 2,5 мкг КТБ,Б, приготовленного с адъювантами АБ01В или АБ01Е. В качестве контролей иммунизировали две группы либо только АБ01В, либо только АБ01Е. Для каждой мыши оценивали специфические к НВз и СБ антительные ответы по ЕБ1БА через 15 суток после третьей иммунизации. Средние геометрические титры антител и их доверительные интервалы 95% рассчитывали для всех мышей, получающих одну и ту же обработку в обоих экспериментах. Статистические анализы для оценки влияния адъюванта и влияний доз антигена выполняли на объединенных данных обоих экспериментов. СЭ4- и СО8-специфические Т-клеточные ответы измеряли посредством проточной цитометрии через 7 суток после второй и третьей иммунизации на пулах клеток крови от 5 мышей на группу. Таким образом, для каждой группы в каждом эксперименте были получены два значения.
Гуморальный иммунный ответ.
Как показано на фиг. 20 и 21, оба адъюванта АБ01В и АБ01Е индуцируют сильные сравнимые антительные ответы против СБР и НВз.
Трехсторонним ΑN0VΑ для анти-СБР СМТ продемонстрировано, что не было никаких значительных различий между АБ01В и АБ01Е для доз 5 или 2,5 мкг КТБ,Б.
Для дозы 10 мкг было обнаружено, что адъювант АБ01В индуцирует более высокие анти-СБ титры, чем АБ01Е, а СМТ-отношение группа АБ01В/группа АБ01Е составляло 1,93 (ДИ 95%: 1,33-2,79; р=0,001).
Специфический клеточно-опосредованный иммунный ответ.
На фиг. 22 и 23 показаны уровни СЭ4 и СЭ8 Т-клеток, специфических к СБР и НВз, которые экспрессируют ГБ-2 и/или IБN-гамма.
СО4-ответ, специфический к СБР, имеет тенденцию к более высоким значениям при использовании АБ01В по сравнению с АБ01Е после трех иммунизации, в то время как СБ8 Т-клеточный ответ при использовании АБ01Е равен или превышает таковой для АБ01В.
СО4-ответ, специфический к НВз, имеет тенденцию к более высоким значениям при использовании АБ01В по сравнению с АБ01Е после трех иммунизации, за исключением более низкой дозы КТБ,Б, когда для двух адъювантов уровни СБ4 Т-клеток сопоставимы. НВз-специфические СБ8 Т-клеточные ответы, индуцированные КТБ,Б, приготовленным с АБ01Е, равны или превышают ответы, индуцированные КТБ,Б, приготовленным САБ01В.
Полагают, что эти различия находятся в пределах ожидаемой вариабельности анализов в клеточной иммунологии.
Доклиническая оценка вакцины КТБ,Б/АБ01Е на мышах показала приемлемый профиль безопасности, аналогичный таковому у КТБ,Б/АБ01В.
XI. Клиническая оценка КТБ,Б/АБ01Е.
Композиции приготавливают, как в примере Х, выше. В качестве эксципиента в лиофилизованной грануле антигена используют сахарозу. Как и в примере X, для повторного растворения лиофилизованного антигена используют жидкий адъювант. АБ01Е приготавливали, как описано в примере ΙΙ.2, и хранили при температуре от 2 до 8°С, пока не потребуется повторное растворение.
Фазу II рандомизированного двойного слепого исследования безопасности и иммуногенности КТБ,Б с адъювантом АБ01Е в настоящее время проводят на детях в возрасте от 18 месяцев до 4 лет, проживающих в Габоне. Режимом вакцинации является 0-, 1-, 2-месячный режим вакцинации. Поставлены следующие задачи для КТБ,Б/АБ01Е при введении в виде 3 доз внутримышечно в режиме 0, 1, 2 месяцев детям в возрасте от 18 месяцев до 4 лет, проживающим в эндемической для малярии области:
первоначальная:
оценить безопасность в течение одного месяца после 3-го введения (роз! 3);
- 60 018860 продемонстрировать не меньшую эффективность вакцины на основе Κ,Τδ,δ с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде по анти-С8 антительному ответу через один месяц после 3-го введения;
вторичная:
оценить реактогенность в течение одного месяца после 3-го введения;
продемонстрировать не меньшую эффективность вакцины на основе Κ,Τδ,δ с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде по анти-ИВк антительному ответу через один месяц после 3-го введения;
дать описание серопротекции против гепатита В через один месяц включительно после 3-го введения;
дать описание анти-С8-ответу через один месяц включительно после 3-го введения;
третичная:
безопасность в срок от 1 месяца после 3-го введения до 12 месяцев после 3-го введения; гуморальный иммунный ответ на антиген С8 через 12 месяцев после 3-го введения;
гуморальный иммунный ответ на антиген ΗΒ8 через 12 месяцев после 3-го введения; исследовательская:
оценить Т-клеточно-опосредованный иммунный ответ на антиген С8 через 12 месяцев включительно после 3-го введения;
оценить иммунный ответ В-клеток памяти на антиген С8 через 12 месяцев включительно после 3-го введения;
дать описание анти-С8-ответа через один месяц включительно после 3-го введения в соответствии с задокументированным при скрининге положением по ΗΒν-иммунизации.
Было зарегистрировано 180 субъектов - 90 получали вакцину с зарегистрированным ранее патентованным адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде (в приведенных ниже таблицах обозначено как контроль), а 90 получали вакцину с адъювантом Α801Ε. Проводили скриниг здоровых мальчиков и девочек в возрасте от 18 месяцев до 4 лет. Вакцины вводили в/м способом в левую дельтовидную мышцу.
Возникновение и природа симптомов (вызывающих беспокойства и непредусмотренных), имеющих место в течение 7-суточного (сутки 0-6) послевакцинационного периода после каждого введения и в целом (общая когорта вакцинированных)
Любой симптом | Общие симптомы | Местные симптомы | |||||||||||||||
ДИ 95% | | ДИ 95% | ДИ 95% | ||||||||||||||
[Гр. | N | п | % | ЦБ | иь | N | п | % | Ц. | υι. | N | п | % | и. | иь | |
Доза 1 | Гр. 1 | 90 | 40 | 44,4 | 34,0 | 55,3 | 90 | 23 | 25,6 | 16,9 | 35,8 | 90 | 20 | 22,2 | 14,1 | 32,2 |
Гр;2 | 90 | 47 | 52,2 | 41,4 | 62,9 | 90 | 26 | 28,9 | 19.8 | 39.4 | 90 | 32 | 35,6 | 25.7 | 46,3 |
Доза 2 | Гр 1 | 88 | 50 | 56,8 | 45,8 | 67,3 | 88 | 36 | 40,9 | 30,5 | 51,9 | 88 | 35 | 39,8 | 29,5 | 50,8 |
Гр 2 | 87 | 53 | 60,9 | 49,9 | 71,2 | 87 | 39 | 44,8 | 34,1 | 55,9 | 87 | 34 | 39,1 | 28,8 | 50,1 | |
Доза 3 | Г£Ц | 83 | 78 | 94,0 | 86,5 | 98,0 | 83 | 34 | 41,0 | 30,3 | 52,3 | 83 | 76 | 91,6 | 83,4 | 96,5 |
Гр 2 | 85 | 82 | 96,5 | 90,0 | 99,3 | 85 | 50 | 58,8 | 47,6 | 69,4 | 85 | 79 | 92,9 | 85,3 | 97,4 | |
Общее кол-во/ доза | Гр 1 | 261 | 168 | 64,4 | 58,2 | 70,2 | 261 | 93 | 35,6 | 29,8 | 41,8 | 261 | 131 | 50,2 | 44,0 | 56,4 |
Гр 2 | 262 | 182 | 69,5 | 63,5 | 75,0 | 262 | 115 | 43,9 | 37,8 | 50,1 | 262 | 145 | 55,3 | 49,1 | 61,5 | |
Общее кол-во/ субъект | гр 1 | 90 | 87 | 96,7 | 90,6 | 99,3 | 90 | 60 | 66,7 | 55,9 | 76,3 | 90 | 83 | 92,2 | 84,6 | 96,8 |
Гр 2 | 90 | 85 | 94,4 | 87,5 | 98,3 | 90 | 70 | 77,8 | 67,8 | 85,9 | 90 | 84 | 93,3 | 86,1 | 97,5 |
Гр 1 = ΚΤδ,δ/Αδ01Ε.
Гр 2 = контроль.
ЬЬ = нижний предел.
ИЬ = верхний предел.
Для каждой дозы и параметра общее кол-во/субъект:
Ν = количество субъектов по меньшей мере с одной введенной дозой;
η/% = количество/процент субъектов, проявляющих, по меньшей мере, симптом одного типа после введения любой исследуемой вакцины;
Для параметра общее кол-во/доза:
Ν = количество введенных доз;
η/% = количество/процент доз, проявляющих по меньшей мере симптом одного типа после введения любой исследуемой вакцины;
ДИ 95% = доверительный интервал строго 95%;
ЬЬ = нижний предел;
ИЬ = верхний предел.
Эти данные демонстрируют, что при использовании вакцины на основе ΚΤδ,δ с адъювантом Αδ01Ε получали приемлемые результаты по реактогенности в педиатрической популяции по сравнению с контрольной композицией.
Серологические ответы измеряли путем оценки антительных ответов на ΗΒδ и на СδР-повторы (анти-К32ЬК). Образцы сыворотки для определения антител отбирали при скрининге на 60-е сутки и на 90-е
- 61 018860 сутки (при второй вакцинации и третьей вакцинации). Уровни антител против С8 измеряли в соответствии со стандартной методологией Ηυ8Α, используя планшет с адсорбированным на нем антигеном В32ЬВ и стандартное антитело сравнения в качестве контроля, согласно 8ОΡ (стандартным рабочим процедурам), принятым в лаборатории. Результаты представлены в Еи/мл.
Антитело к поверхностному антигену вируса гепатита В измеряли, используя имеющийся в продаже набор для иммуноанализа Ηυ8Α (тест-набор Αυ8ΑΕ ΞΙΑ от ЛЬЬо!ι) или эквивалентный ему в соответствии с инструкциями для данного анализа. Результаты представлены в т1и/мл.
Уровни серопозитивности и СМС для анти-С8 антител (общая группа вакцинированных)
>= 0,5 тЮ/мл | СМС | |||||||||||
ДИ 95% | ДИ 95% | |||||||||||
Анти- тело | Гр. | График | Ν | η | % | ЬЬ | иь | зн-ие | IX | иь | Μίη | Мах |
АнтиС8 | Гр. 1 | СКРИНИНГ | 89 | 0 | 0,0 | 0,0 | 4,1 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | <0,5 | <0,5 |
ΡΙΙ(ϋ60) | 78 | 78 | 100 | 95,4 | 100 | 31,9 | 64,9 | 103,2 | 4,6 | 568,6 | ||
ΡΙΙΙ(ϋ9Ο) | 75 | 75 | 100 | 95,2 | 100 | 215,6 | 178,8 | 259,9 | 14,3 | 1922,3 | ||
Гр. 2 | СКРИНИНГ | 90 | 1 | 1,1 | 0,0 | 6,0 | 0,3 | 0,2 | 0,3 | <0.5 | 0,5 | |
ριΐ(ϋ6θ) | 78 | 78 | 100 | 95,4 | 100 | 56,9 | 45,7 | 70,9 | 3,6 | 2380,9 | ||
РНЦ090) | 80 | 80 | 100 | 95,5 | 100 | 164,8 | 134,1 | 202,6 | 6,3 | 2093,6 |
Гр. 1 = ВΤ8,8/Л801Е.
Гр. 2 = контроль.
СМС = средняя геометрическая концентрация антител, рассчитанная для всех субъектов.
ΡΙΙ(Ό60) = после второй вакцинации (60-е сутки).
ΡΙΙΙ(Ό90) = после третьей вакцинации (90-е сутки).
Ν = количество субъектов с доступными результатами.
п/% = количество/процент субъектов с концентрацией в конкретном диапазоне.
ДИ 95% = доверительный интервал строго 95%.
ЬЬ = нижний предел.
иь = верхний предел.
МЕН^ДХ = минимум/максимум.
Уровни серопозитивности и СМС для анти-Жк антител (общая группа вакцинированных)
>=10 тШ/мл | СМС | |||||||||||
ДИ 95% | ДИ 95% | |||||||||||
Анти- тело | Гр. | График | N | η | % | ιχ | иь | зн-ие | IX | иь | Μίη | Мах |
АнтиНВэ | Гр. 1 | СКРИНИНГ | 89 | 43 | 48,3 | 37,6 | 59,2 | 40,8 | 23,3 | 71,4 | <10,0 | 46421,6 |
ΡΙΙ (ϋ60) | 78 | 77 | 98,7 | 93,1 | 100 | 8936,4 | 4684,2 | 17048,7 | <10,0 | 1615367 | ||
ΡΙΙΙ (090) | 75 | 75 | 100 | 95,2 | 100 | 24527,7 | 15316,5 | 39278,5 | 21,1 | 169436 | ||
гр. 2 | СКРИНИНГ | 90 | 37 | 41,1 | 30,3 | 52,0 | 20,0 | 12,8 | 31,0 | <10,0 | 30796,4 | |
РН (060) | 78 | 77 | 98,7 | 93,1 | 100 | 3640,0 | 1963,1 | 6749,3 | <10,0 | 1508114 | ||
ΡΙΙΙ (090) | 80 | 80 | 100 | 95,5 | 100 | 19435,0 | 13511,3 | 28099,9 | 178,6 | 1103974 |
Гр. 1 = ВΤ8,8/Л801Е.
Гр. 2 = контроль.
СМС = средняя геометрическая концентрация антител, рассчитанная для всех субъектов.
ΡΙΙ(Ό60) = после второй вакцинации (60-е сутки). ΡΙΙΙ(Ό90) = после третьей вакцинации (90-е сутки). Ν = количество субъектов с доступными результатами. п/% = количество/процент субъектов с концентрацией в конкретном диапазоне.
ДИ 95% = доверительный интервал строго 95%.
ЬЬ = нижний предел.
иЬ = верхний предел. МIN/МЛX = минимум/максимум.
Эти данные демонстрируют, что при использовании вакцинной композиции на основе ΒΤ8,8 с адъювантом Л801Е получали приемлемые гуморальные иммунные ответы в педиатрической популяции по сравнению с зарегистрированным контролем.
Пример ΧΙΙ. Доклиническая оценка вируса ветряной оспы с Л801В по сравнению с Л801Е.
В состав вакцины-кандидата входит укороченный оболочечный белок, дЕ, У2У, продуцируемый в клетках СНО.
- 62 018860
Для этого исследования С57ВЕ6 мышей (и = 48) примировали (вакциной) УагПп.х (~4 1од рГи (бляшкообразующая единица)/доза) в количестве одной дозы для человека (ΗΌ), вводимой подкожно. Через пять недель после примирования Уап1пх мышей подразделяли на 5 групп по 12 мышей и вводили внутримышечной инъекцией (в район большеберцовой кости) на 0-е и 28-е сутки по 5 мкг только дЕ, по 5 мкг дЕ + А801Е* (1/10 ΗΌ) или по 5 мкг дЕ + А801В (1/10 ΗΌ). Контрольной группе мышей (только примированные) вводили инъекцией физиологический раствор (0,9%-ный №1С1). Иммунные ответы оценивали через 14 и/или 30 суток после второй вакцинации. Оценивали уровни общих дЕ-специфических антител и частоту встречаемости цитокин-продуцирующих (^2/®^) СЭ4 и СЭ8 Т-клеток.
дЕ-специфические антительные ответы.
Проводили ЕЫ8А для детекции и количественного определения дЕ-специфических антител в образцах сыворотки мышей, используя белок дЕ в качестве сенсибилизирующего антигена. ЕЬША-титры определяли в виде обратной величины разведения сыворотки, которое дает величину поглощения (оптической плотности), равную 50% от максимальной величины поглощения. ЕЬША-титры рассчитывали, используя регрессионный анализ.
Данные демонстрируют, что дЕ/А801Е и дЕ/А801В индуцируют похожие уровни дЕспецифических антител (значения р > 0,05). Обе композиции индуцировали значительно более высокие ответы по сравнению только с одним антигеном дЕ (в 10-13 раз, значения р < 0,05) как через 14, так и через 30 суток рое! II (фиг. 26).___________________________________________________________
Группа | Через 14 суток роз1 II | ДИ 95% | Через 30 суток роз! II | ДИ 95% | ||
ОМТ (Еи/мл) | ЬЬ | III- | ОМТ (Еи/мл) | ьь | иь | |
дЕ | 12067 | 5960 | 24433 | 3832 | 911 | 16115 |
дЕ/А301Е | 125934 | 95504 | 166059 | 50439 | 38071 | 66825 |
дЕ/А501В | 131728 | 88112 | 196934 | 47589 | 36158 | 62635 |
УагИпх | 34 | 11 | 105 | 33 | 10 | 102 |
дЕ-специфические СЭ4- и СО8-ответы.
Продуцирование цитокинов оценивали по ί.Ό4 и СЭ8 Т-клеткам, используя методику окрашивания внутриклеточных цитокинов. Выделяли клетки селезенки из каждой группы, состоящей из 12 мышей, через 30 суток рок! II и объединяли в 4 группы по 3 селезенки. Клетки селезенки (1χ106) инкубировали в течение 2 ч в присутствии пептидов дЕ (63 пептида), охватывающих весь белок дЕ (пептиды по 20 аминокислот/перекрывание 10 аминокислот), и затем инкубировали в течение ночи в присутствии брефелдина. После этого клетки окрашивали флуоресцентными тАЬ (моноклональными антителами), специфическими к СЭ4/СЭ8 клеточной поверхности, и затем подвергали пермеабилизации в отношении внутриклеточных цитокинов ЕЕ-2 и ΕΕΝγ.
Как показано на фиг. 26, несмотря на то что похожие цитокиновые профили (^-2/^^/) были индуцированы при использовании композиций как дЕ/А801В, так и дЕ/А801Е, композиция с А801В индуцировала более высокую величину как ί.Ό4, так и СЭ8 цитокин-продуцирующих клеток (в 2 раза, р>0,05 для ί.Ό4; в 3,6 раза, р>0,05 для СЭ8). Вследствие неожиданно высокой вариабельности Т-клеточных ответов возможности для детекции значительного различия между дозами адъюванта были очень ограничены (<50%). Важно, что обе композиции дЕ, приготовленные с А801В или А801Е, индуцировали количество цитокин-продуцирующих ί.Ό4 Т-клеток значительно большее по величине (в 13,3 раза, р< 0,05) по сравнению с одним только дЕ. Более высокие уровни СЭ8-клеток также индуцировались под действием дЕ, приготовленного с А801В или А801Е, (в 3,8 раза, р > 0,05 ) по сравнению с одним только антигеном дЕ.
Пример ХШ. Доклиническая оценка А801В по сравнению с А801Е на модели гриппа у хорьков.
Материалы и методы.
Самок хорьков (Мик!е1а ри!огшк Гиго) в возрасте 4-6 месяцев получали от МШАУ Соикийаису (МатрШие, υΚ). Хорьков примировали на 0-е сутки гетеросубтипическим штаммом Η1Ν1 А/8(оскЫо1т/24/90 (4 1од ТСЮ^/мл) в количестве 250 мкл, введенных интраназально. На 21-е сутки хорькам посредством внутримышечной инъекции вводили полную человеческую дозу (1000 мкл вакцинная доза, 15 мкг НА на штамм А; 17,5 мкг штамма В) комбинации Η1Ν1 А/№\\' Са1ебоша С/20/99 (15 мкг/мл), Η3Ν2 А/Ауотшд/3/2003 (15 мкг/мл) и В/Лаидки/10/2003 (17,5 мкг/мл). Затем осуществляли контрольное заражение хорьков на 42-е сутки через интраназальный путь с использованием 250 мкл гетеросубтипического штамма А11.А/ХУ/55/04 (4,51 1од ТСШ50/мл).
На 21-е сутки проводили вакцинации либо простой трехвалентной композицией (простая в приведенных ниже таблицах), либо трехвалентными композициями с адъювантом А801В (А801В в приведенных ниже табл.) или А801Е (А801Е в приведенных ниже табл.). Композиции приготавливали, как приведено выше в примере 3.
Мониторинг температуры тела.
Индивидуальные температуры регистрировали в течение периода контрольного заражения и оценивали с использованием телеметрических имплантатов, с помощью которых регистрировали температуру
- 63 018860 каждого индивидуального животного каждые 15 мин до и после контрольного заражения. Все имплантаты проверили и обновили и перед размещением во внутрибрюшинной полости провели новое калибрование с использованием Ό8Ι (Ό;·ιΙ;·ι 8с1епсе5 1п1егпайопа1). На время этих измерений всех животных индивидуально размещали в отдельных клетках. Температуры регистрировали каждые 15 мин в течение 6 суток до примирования и включительно до 4 суток после примирования, а также в течение 3 суток перед контрольным заражением и включительно до 7 суток после контрольного заражения.
Тест на ингибирование гемагглютинации (Н1).
Методика тестирования.
Определяли титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа, используя тест на ингибирование гемагглютинации (Н1). Принцип Н1-теста основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (КВС) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Образцы сыворотки первоначально обрабатывали 25%-ным раствором нейраминидазы (КОЕ) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 единицами гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации, используя отверстия) для прочтения. Титры выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали полное ингибирование гемагглютинации. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, недетектируемый уровень оценивали как титр, равный 5.
Статистический анализ.
Статистический анализ осуществляли для Н1-титров, используя υΝΙ8ΤΛΤ. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
критерий Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения в группах;
критерий Кокрена с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами);
односторонний дисперсионный анализ, выполненный на группах;
Н8О-критерий Тьюки для множественных сравнений.
Титрование вирусов в назальных смывах.
Все назальные образцы сначала подвергали стерильной фильтрации через фильтры 8рш X (Соз1аг) для удаления любого бактериального загрязнения. По 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных смывов переносили в титрационные микропланшеты, содержащие по 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл клеток МОСК (2,4х105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С в течение 6-7 суток. Через 6-7 суток инкубации культуральную среду осторожно удаляют, добавляют по 100 мкл 1/20 А8Т-1-содержащей среды и инкубируют в течение еще 18 ч. Интенсивность желтого формазанового красителя, образующегося в результате восстановления А8Т-1 жизнеспособными клетками, пропорциональна количеству находящихся в лунке жизнеспособных клеток по окончании анализа титрования вирусов и определяется количественно путем измерения поглощения в каждой лунке на соответствующей длине волны (450 нм). Начало отсчета определяют как среднее значение ОО для неинфицированных контрольных клеток - 0,3 ОО (0,3 ОО соответствует ± 3 8£Оеу ОО для неинфицированных контрольных клеток). Положительный балл определяют, когда ОО находится ниже начала отсчета, и, наоборот, отрицательный балл определяют, когда ОО находится выше начала отсчета. Титры вирусного шеддинга определяли согласно Кееб апб Миепск и выражали в виде 1од ТСГО50/мл.
Анализ пролиферации лимфоцитов.
РВМС собирали центрифугированием в градиенте плотности (20 мин при 2500 об/мин и 4°С) с использованием раствора Исо11 Ьутрко1у1е-Матта1 (Се6аг1апе). РВМС ресуспендировали в 5 мл культуральной среды (КРМ1/А66 при 4°С) с 10% нормализованной сыворотки хорьков. В состав добавок входили 100 мМ пируват натрия, не основные аминокислоты МЕМ, пенициллин/стрептамицин, глутамин и разбавленный в 1000 раз (1000х) концентрированный в2-меркаптоэтанол.
Свежевыделенные РВМС немедленно использовали для анализов пролиферации 1п уйго. Клетки размещали в 96-луночных планшетах с плоским дном для тканевых культур (2х105 клеток/лунка) и культивировали с разными концентрациями антигена (от 0,1 до 1 мкг НА цельного инактивированного вируса) в течение 44-96 ч и затем импульсно метили, используя 0,5 мкКи [3Н]тимидина. Включение радиоактивной метки подтверждали через 4-16 ч с помощью β-эмиссионной спектроскопии.
- 64 018860
Результаты.
Вирусная нагрузка в назальных смывах после контрольного заражения.
Назальные смывы собирали за 2 суток до примирования (примирование -в 0-е сутки), через 1, 2 и 7 суток после примирования, а также за 4 суток до контрольного заражения (контрольное заражение в 42-е сутки) и в течение 7 суток после контрольного заражения.
Группа | -2 | 0 | +1 | +2 | +7 | 39 | 42 | 43 | 44 | 45 | 47 | 49 |
Простая | 0,82 | 1,84 | 5,35 | 1,85 | 0,8 | 1,82 | 5,77 | 4,44 | 1,97 | 0,9 | ||
А301Е | 0,82 | 2,11 | 5,83 | 1,65 | 0,8 | 1,62 | 4,93 | 4,15 | 2,4 | 0,85 | ||
А301В | 0,81 | 2,26 | 5,38 | 1.91 | 0,82 | 1,74 | 2,25 | 1,89 | 1,350 | 0,9 |
Результаты см. на фиг. 27.
Выделение вирусов после примирования.
Пик выделения вирусов наблюдали у всех хорьков через 2 суток после примирования.
Через 7 суток после примирования во всех группах наблюдали только остаточную вирусную нагрузку.
Выделение вирусов после контрольного заражения.
Пик выделения вирусов наблюдали через 24 ч после контрольного заражения.
Титрование вирусов через 3 суток после контрольного заражения продемонстрировало высокие титры вирусов (отсутствиезащиты) у хорьков, иммунизированных трехвалентной обычной композицией. Незначительное уменьшение выделения вирусов наблюдали у хорьков, иммунизированных трехвалентной сплит-А801Е композицией, по сравнению с наблюдаемым при использовании трехвалентной сплиткомпозицией с адъювантом А801В.
Температурный мониторинг.
Температуру тела регистрировали, начиная с 6 суток до примирования (примирование - в 0-е сутки) и включительно до 4 суток после примирования, а также от 3 суток до контрольного заражения и включительно до 7 суток после контрольного заражения (контрольное заражение - в 42-е сутки). Измерения выполняли каждые 15 мин и среднее значение рассчитывали в середине дня для каждой группы. Результаты показаны на фиг. 28.
После примирования.
Мониторинг температуры тела до, в процессе и после примирования продемонстрировал увеличе ние температуры во всех группах.
После контрольного заражения.
Интерпретация мониторинга температуры тела вызывает затруднение. Легкое увеличение температуры тела наблюдали после контрольного заражения у хорьков, иммунизированных трехвалентной простой сплит- и трехвалентной сплит-А801Е композицией, но не трехвалентной сплит-А801В. Приведенная ниже оценка была получена для хорьков с увеличением температуры тела более чем на 0,4°С.
Увеличение температуры после контрольного заражения
Трехвалентная простая 5/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,7, +0,8)
Трехвалентная А301В 0/8
Трехвалентная А801Е 6/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,5, +0,9, +1,6)
Результаты этого считывания менее понятны по сравнению с другими считываниями, используе мыми для хорьков.
Тест на ингибирование гемагглютинации (Н1).
Образцы сыворотки собирали за 4 суток до примирования, через 17 суток после примирования, через 21 сутки после иммунизации и через 13 суток после контрольного заражения. Результаты показаны на фиг. 29 и 30. Для всех трех вакцинных штаммов статистически значимо более высокие Н1-титры наблюдали у хорьков, иммунизированных трехвалентной сплит-композицией с адъювантом А801В или А801Е по сравнению с трехвалентной простой Сплит-композицией. Никакого различия не наблюдали между двумя адъювантными группами. По сравнению с другими группами статистически значимые более высокие перекрестно-реактивные Н1-титры в отношении Λ/№\ν Уогк №N2 (штамм для контрольного заражения) наблюдали после иммунизации хорьков трехвалентными сплит-композициями с адъювантом А801В.
Claims (11)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Применение иммуногенной композиции, содержащей антиген, полученный из Р1актойшт Та1с1рагит, в комбинации с адъювантом, содержащим иммунологически активную сапониновую фракцию, полученную из коры Ош11а)а каропапа тойпа и представленную в форме липосомы, и липополисахарид, где указанная сапониновая фракция и указанный липополисахарид представлены в композиции на уровне от 1 до 30 мкг на дозу, для предупреждения инфекции, вызванной Р1актойшт ТаШраглт, и/или малярии у человека.
- 2. Применение по п.1, где указанная иммунологически активная сапониновая фракция представляет собой 0821.
- 3. Применение по п.2, где указанная адъювантная композиция дополнительно содержит стерин, причем соотношение сапонин:стерин составляет 1:1-1:100 мас./мас.
- 4. Применение по п.3, где указанный стерин представляет собой холестерин.
- 5. Применение по любому из пп.1-4, где указанный липополисахарид представляет собой нетоксичное производное липида А.
- 6. Применение по п.5, где указанное производное липида А представляет собой 30-МРБ (3-де-Оацилированный монофосфориллипид А).
- 7. Применение по п.6, где указанный 30-МРБ присутствует в количестве 20-30 мкг на дозу.
- 8. Применение по любому из пп.1-7, где сапонин представляет собой 0821 и 0821 присутствует в количестве 20-30 мкг на дозу.
- 9. Применение по п.1, где (а) сапонин представляет собой 0821 и липополисахарид представляет собой 30-МРБ; (б) композиция содержит по 25 мкг 0821 и 30-МРБ на дозу.
- 10. Применение по любому из пп.1-9, где антиген, полученный из Р1актойшт ТаШраглт, представляет собой циркумспорозоитный белок (С8 белок).
- 11. Применение по любому из пп.1-10, где антиген, полученный из Р1актойшт Та1с1раглт, представляет собой КЛ8,8.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0525321.6A GB0525321D0 (en) | 2005-12-13 | 2005-12-13 | Novel compositions |
GB0609902A GB0609902D0 (en) | 2006-05-18 | 2006-05-18 | Novel composition |
GB0620337A GB0620337D0 (en) | 2006-10-12 | 2006-10-12 | Vaccine |
GBGB0620336.8A GB0620336D0 (en) | 2006-10-12 | 2006-10-12 | Vaccine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201001189A1 EA201001189A1 (ru) | 2011-02-28 |
EA018860B1 true EA018860B1 (ru) | 2013-11-29 |
Family
ID=37876836
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200801307A EA014353B1 (ru) | 2005-12-13 | 2006-12-12 | Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант |
EA201001189A EA018860B1 (ru) | 2005-12-13 | 2006-12-12 | Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200801307A EA014353B1 (ru) | 2005-12-13 | 2006-12-12 | Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20080279926A1 (ru) |
EP (6) | EP2364722B1 (ru) |
JP (2) | JP5461015B2 (ru) |
KR (1) | KR101363879B1 (ru) |
CN (3) | CN103861100A (ru) |
AR (1) | AR058543A1 (ru) |
AT (1) | ATE542543T1 (ru) |
AU (1) | AU2006325377B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0619795B8 (ru) |
CA (1) | CA2633008C (ru) |
CR (2) | CR10101A (ru) |
CY (3) | CY1112589T1 (ru) |
DK (3) | DK2364720T3 (ru) |
EA (2) | EA014353B1 (ru) |
ES (6) | ES2451573T3 (ru) |
HK (2) | HK1118477A1 (ru) |
HR (3) | HRP20120136T1 (ru) |
IL (2) | IL191703A (ru) |
MA (1) | MA30023B1 (ru) |
MY (1) | MY145943A (ru) |
NO (1) | NO20082472L (ru) |
NZ (2) | NZ596870A (ru) |
PE (1) | PE20071098A1 (ru) |
PL (3) | PL1959992T3 (ru) |
PT (3) | PT1959992E (ru) |
SG (2) | SG10201405533TA (ru) |
SI (3) | SI2364720T1 (ru) |
TW (1) | TWI457133B (ru) |
WO (1) | WO2007068907A2 (ru) |
Families Citing this family (82)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK3017827T3 (en) | 2005-12-22 | 2019-02-18 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Pneumococcal polysaccharide conjugate VACCINE |
WO2007144772A2 (en) | 2006-06-15 | 2007-12-21 | Novartis Ag | Adjuvant-sparing multi-dose influenza vaccination regimen |
WO2009000826A1 (en) | 2007-06-26 | 2008-12-31 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates |
EP2034022A1 (en) | 2007-09-10 | 2009-03-11 | Universite Libre De Bruxelles | Leukotriene B4 binding soluble lipocalin receptor from ixodes ricinus |
EP2045263A1 (en) | 2007-10-02 | 2009-04-08 | Universite Libre De Bruxelles | Identification and molecular characterisation of salivary metalloproteases expressed in the tick salivary glands |
EP3508505A1 (en) * | 2007-12-24 | 2019-07-10 | ID Biomedical Corporation of Quebec | Recombinant rsv antigens |
CA2752809A1 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-26 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Inactivated dengue virus vaccine with aluminium-free adjuvant |
GB0910046D0 (en) * | 2009-06-10 | 2009-07-22 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel compositions |
PL2444103T3 (pl) * | 2009-06-19 | 2018-05-30 | Eyegene Inc. | Szczepionka przeciwko rakowi szyjki macicy |
PE20121541A1 (es) | 2009-06-24 | 2012-12-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Antigenos de virus de sincicio respiratorio recombinantes |
US8889146B2 (en) | 2009-06-24 | 2014-11-18 | Glaxosmithkline Biologicals, Sa | Vaccine |
SG178026A1 (en) | 2009-07-15 | 2012-03-29 | Novartis Ag | Rsv f protein compositions and methods for making same |
KR20120107121A (ko) * | 2009-12-22 | 2012-09-28 | 사노피 파스퇴르 리미티드 | 면역원성 조성물 |
CN101791401B (zh) * | 2009-12-31 | 2012-04-18 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鱼用浸泡疫苗多组合佐剂及其应用和使用方法 |
EP2528621B1 (en) | 2010-01-27 | 2016-09-21 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Modified tuberculosis antigens |
JP2017071615A (ja) * | 2010-10-27 | 2017-04-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 神経障害を治療するための免疫原性組成物及び方法 |
GB201101331D0 (en) * | 2011-01-26 | 2011-03-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Compositions and uses |
SG194733A1 (en) * | 2011-05-17 | 2013-12-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine against streptococcus pneumoniae |
GB201116248D0 (en) * | 2011-09-20 | 2011-11-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Liposome production using isopropanol |
BR112014007927B1 (pt) * | 2011-10-06 | 2021-04-13 | Immunovaccine Technologies Inc | Composições de lipossoma compreendendo um adjuvante e usos das referidas composições e usos das referidas composições |
GB201213364D0 (en) | 2012-07-27 | 2012-09-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Purification process |
PE20150464A1 (es) * | 2012-08-16 | 2015-04-25 | Pfizer | Proceso de glucoconjugacion y composiciones |
SI2928489T1 (sl) * | 2012-12-05 | 2019-05-31 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Imunogeni sestavek |
BR112016002354A2 (pt) * | 2013-08-05 | 2017-09-12 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | composição imunogênica, métodos para proteger um bebê contra infecção ou doença e para evocar uma resposta imune, regime de vacinação, e, kit |
JP6494232B2 (ja) | 2013-10-03 | 2019-04-03 | 日東電工株式会社 | 粘膜ワクチン組成物 |
KR20160067087A (ko) * | 2013-10-03 | 2016-06-13 | 닛토덴코 가부시키가이샤 | 주사 백신 조성물 |
US10391167B2 (en) | 2013-10-03 | 2019-08-27 | Nitto Denko Corporation | Mucosal vaccine composition |
US10071155B2 (en) | 2013-10-03 | 2018-09-11 | Nitto Denko Corporation | Nasal mucosal vaccine composition |
GB201318862D0 (en) * | 2013-10-25 | 2013-12-11 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Calcium fluoride compositions |
EP3122380A1 (en) * | 2014-03-25 | 2017-02-01 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Army | Non-toxic adjuvant formulation comprising a monophosphoryl lipid a (mpla)-containing liposome composition and a saponin |
GB201405921D0 (en) * | 2014-04-02 | 2014-05-14 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel methods for inducing an immune response |
US9107906B1 (en) | 2014-10-28 | 2015-08-18 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
JP2018500322A (ja) * | 2014-12-18 | 2018-01-11 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン接種 |
JP2018509384A (ja) | 2015-01-06 | 2018-04-05 | イミューノヴァクシーン テクノロジーズ インコーポレイテッドImmunovaccine Technologies Inc. | リピドa模倣体、調製方法、及びその使用 |
MY187472A (en) * | 2015-09-10 | 2021-09-23 | Inventprise Llc | Multivalent vlp conjugates |
GB201518684D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
JP6900385B2 (ja) | 2015-11-06 | 2021-07-07 | アジュバンス・テクノロジーズ・インコーポレーテッド | トリテルペンサポニン類似物 |
GB201522068D0 (en) * | 2015-12-15 | 2016-01-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Dried composition |
BE1024160B9 (fr) | 2015-12-22 | 2017-12-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Formulation immunogène |
CN105770887A (zh) * | 2016-03-04 | 2016-07-20 | 邓招红 | 一种用于hbv疫苗的佐剂及其制备方法 |
US10611800B2 (en) | 2016-03-11 | 2020-04-07 | Pfizer Inc. | Human cytomegalovirus gB polypeptide |
WO2018104313A1 (en) | 2016-12-07 | 2018-06-14 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel process |
CN110225757A (zh) | 2017-01-31 | 2019-09-10 | 默沙东公司 | 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法 |
US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
WO2018201022A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Compositions and methods for vaccine delivery |
JP7339942B2 (ja) * | 2017-09-08 | 2023-09-06 | アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート | サポニンを含むリポソーム製剤および使用方法 |
US11324821B2 (en) | 2017-10-16 | 2022-05-10 | Adjuvance Technologies, Inc. | Triterpene saponin analogues |
MX2020005481A (es) * | 2017-12-01 | 2020-12-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Purificacion de saponina. |
EP3717005A1 (en) | 2017-12-01 | 2020-10-07 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Saponin extraction |
WO2019175147A1 (en) | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccines against intra-abdominal infections |
TWI820099B (zh) * | 2018-03-28 | 2023-11-01 | 台灣浩鼎生技股份有限公司 | 新穎皂素佐劑及其評估方法 |
US11389519B2 (en) * | 2018-06-11 | 2022-07-19 | Inventprise, Llc | Virus-like particle conjugates |
WO2020055503A1 (en) | 2018-09-14 | 2020-03-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Nanoparticle vaccine adjuvant and methods of use thereof |
US11629172B2 (en) | 2018-12-21 | 2023-04-18 | Pfizer Inc. | Human cytomegalovirus gB polypeptide |
US11419932B2 (en) | 2019-01-24 | 2022-08-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom |
JP2022525773A (ja) | 2019-03-18 | 2022-05-19 | ヤンセン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | 大腸菌o抗原多糖のバイオコンジュゲートを製造する方法、その組成物およびその使用方法 |
CR20210522A (es) | 2019-03-18 | 2021-12-17 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Bioconjugados de antígenos–polisacáridos de e. coli, métodos de producción y métodos de utilización de los mismos |
KR20220035457A (ko) | 2019-07-21 | 2022-03-22 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 치료 바이러스 백신 |
EP3777884A1 (en) | 2019-08-15 | 2021-02-17 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
KR20220107166A (ko) | 2019-10-02 | 2022-08-02 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 스타필로코커스 펩티드 및 사용 방법 |
TW202128216A (zh) * | 2019-12-13 | 2021-08-01 | 大陸商遠大賽威信生命科學(南京)有限公司 | 免疫刺激組合物及其用途 |
EP4077356A1 (en) | 2019-12-19 | 2022-10-26 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | S. aureus antigens and compositions thereof |
KR20220128372A (ko) | 2020-01-16 | 2022-09-20 | 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 | Fimh 돌연변이체, 이를 갖는 조성물 및 이의 용도 |
EP4103227A1 (en) | 2020-02-14 | 2022-12-21 | Merck Sharp & Dohme LLC | Hpv vaccine |
WO2021195024A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Adjuvance Technologies, Inc. | Adjuvant compounds, salt forms, and formulations |
WO2021224205A1 (en) * | 2020-05-05 | 2021-11-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Microfluidic mixing device and methods of use |
EP4161570A1 (en) | 2020-06-05 | 2023-04-12 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Modified betacoronavirus spike proteins |
TWI810589B (zh) | 2020-06-21 | 2023-08-01 | 美商輝瑞股份有限公司 | 人巨細胞病毒糖蛋白B(gB)多肽 |
EP4210739A1 (en) * | 2020-09-10 | 2023-07-19 | The Rochester General Hospital | Haemophilus infuluenzae vaccine and methods of use |
EP4213870A1 (en) | 2020-09-17 | 2023-07-26 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Multivalent vaccine compositions and uses thereof |
EP4237085A1 (en) | 2020-10-28 | 2023-09-06 | Sanofi Pasteur | Liposomes containing tlr4 agonist, preparation and uses thereof |
GB2600468A (en) | 2020-10-30 | 2022-05-04 | Excivion Ltd | Adjuvant composition |
MX2023008251A (es) | 2021-01-12 | 2023-07-26 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Mutantes de fimh, composiciones con estos y uso de estos. |
EP4032547A1 (en) | 2021-01-20 | 2022-07-27 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Hsv1 fce derived fragements for the treatment of hsv |
JP2024514074A (ja) | 2021-04-01 | 2024-03-28 | ヤンセン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | E.coli o18バイオコンジュゲートの産生 |
WO2023020994A1 (en) * | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods |
CN118019547A (zh) * | 2021-08-19 | 2024-05-10 | 默沙东有限责任公司 | 热稳定脂质纳米粒子及其使用方法 |
US20230190920A1 (en) | 2021-12-19 | 2023-06-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for long-lasting germinal center responses to a priming immunization |
WO2023154960A1 (en) | 2022-02-14 | 2023-08-17 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pan-pneumovirus vaccine compositions and methods of use thereof |
WO2023175454A1 (en) | 2022-03-14 | 2023-09-21 | Pfizer Inc. | Methods for producing an adjuvant |
CN116162173B (zh) * | 2022-10-28 | 2024-06-04 | 安徽农业大学 | 一种GnRH6-CRM197重组蛋白去势疫苗及制备方法 |
WO2024116096A1 (en) | 2022-12-01 | 2024-06-06 | Pfizer Inc. | Pneumococcal conjugate vaccine formulations |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994000153A1 (en) * | 1992-06-25 | 1994-01-06 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine composition containing adjuvants |
WO1996033739A1 (en) * | 1995-04-25 | 1996-10-31 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccines containing a saponin and a sterol |
WO1998015287A1 (en) * | 1996-10-05 | 1998-04-16 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccines |
WO2002032454A1 (en) * | 2000-10-18 | 2002-04-25 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Adjuvant composition comprising an immunostimulatory oligonucleotide and a tocol |
WO2003028760A2 (en) * | 2001-10-01 | 2003-04-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine |
US20030219453A1 (en) * | 1998-03-19 | 2003-11-27 | Smithkline Beecham Biologicals, Sa | Vaccines |
WO2005117958A1 (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant |
WO2006123155A2 (en) * | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine composition comprising b-subunit of e. coli heat toxin and an atigen and an adjuvant |
Family Cites Families (183)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US666843A (en) * | 1900-07-02 | 1901-01-29 | Eastman Kodak Co | Spirit-level. |
US3238190A (en) | 1963-10-23 | 1966-03-01 | Madaus & Co K G Fa Dr | Aescin recovery |
DE2921961C2 (de) | 1979-05-30 | 1986-02-06 | Santrade Ltd., Luzern/Lucerne | Bohreinheit |
US4372945A (en) | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
US4270537A (en) | 1979-11-19 | 1981-06-02 | Romaine Richard A | Automatic hypodermic syringe |
DD155875A1 (de) | 1980-12-31 | 1982-07-14 | Willy Nordheim | Verfahren zur herstellung eines ballaststoffarmen inaktivierten influenzaimpfstoffes |
IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
US4866034A (en) | 1982-05-26 | 1989-09-12 | Ribi Immunochem Research Inc. | Refined detoxified endotoxin |
US4436727A (en) | 1982-05-26 | 1984-03-13 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
DD211444A3 (de) | 1982-08-19 | 1984-07-11 | Saechsisches Serumwerk | Verfahren zur herstellung von influenza-impfstoffen |
US4596556A (en) | 1985-03-25 | 1986-06-24 | Bioject, Inc. | Hypodermic injection apparatus |
FI861417A0 (fi) | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
DD300833A7 (de) | 1985-10-28 | 1992-08-13 | Saechsische Landesgewerbefoerd | Verfahren zur herstellung von inaktivierten influenza-vollvirusimpfstoffen |
US4877611A (en) | 1986-04-15 | 1989-10-31 | Ribi Immunochem Research Inc. | Vaccine containing tumor antigens and adjuvants |
US5173294A (en) | 1986-11-18 | 1992-12-22 | Research Foundation Of State University Of New York | Dna probe for the identification of haemophilus influenzae |
CA1283827C (en) | 1986-12-18 | 1991-05-07 | Giorgio Cirelli | Appliance for injection of liquid formulations |
EP1103623A1 (en) | 1987-01-07 | 2001-05-30 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Human mucin core protein: nucleic acid probes, peptide fragments and antibodies thereto, and uses thereof in diagnostic and therapeutic methods |
US6054438A (en) | 1987-01-07 | 2000-04-25 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Nucleic acid fragments encoding portions of the core protein of the human mammary epithelial mucin |
GB8704027D0 (en) | 1987-02-20 | 1987-03-25 | Owen Mumford Ltd | Syringe needle combination |
US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
WO1988009797A1 (en) | 1987-06-05 | 1988-12-15 | The United States Of America, As Represented By Th | Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management |
US4790824A (en) | 1987-06-19 | 1988-12-13 | Bioject, Inc. | Non-invasive hypodermic injection device |
US4940460A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-10 | Bioject, Inc. | Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly |
US4941880A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-17 | Bioject, Inc. | Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly |
EP1088830A3 (en) | 1987-06-22 | 2004-04-07 | Medeva Holdings B.V. | Hepatitis b surface antigen particles |
DE3734306A1 (de) | 1987-10-10 | 1989-04-27 | Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg | Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien |
US4963484A (en) | 1988-01-29 | 1990-10-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Genetically engineered polypeptides with determinants of the human DF3 breast carcinoma-associated antigen |
US5339163A (en) | 1988-03-16 | 1994-08-16 | Canon Kabushiki Kaisha | Automatic exposure control device using plural image plane detection areas |
US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
GB8819209D0 (en) | 1988-08-12 | 1988-09-14 | Research Corp Ltd | Polypeptide & dna encoding same |
FR2638359A1 (fr) | 1988-11-03 | 1990-05-04 | Tino Dalto | Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau |
ATE205534T1 (de) | 1988-12-16 | 2001-09-15 | Nederlanden Staat | Pneumolysin-mutanten und pneumokokken-impfstoffe daraus |
GB8913737D0 (en) | 1989-06-15 | 1989-08-02 | Univ Birmingham | A novel anti-allergy treatment |
EP0414374B1 (en) | 1989-07-25 | 1997-10-08 | Smithkline Biologicals S.A. | Novel antigens and methods for their preparation |
US5064413A (en) | 1989-11-09 | 1991-11-12 | Bioject, Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5312335A (en) | 1989-11-09 | 1994-05-17 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
DE4005528C2 (de) | 1990-02-22 | 1998-01-15 | Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg | Austragvorrichtung für Medien |
US5256643A (en) | 1990-05-29 | 1993-10-26 | The Government Of The United States | Human cripto protein |
SE466259B (sv) | 1990-05-31 | 1992-01-20 | Arne Forsgren | Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal |
US5190521A (en) | 1990-08-22 | 1993-03-02 | Tecnol Medical Products, Inc. | Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin |
US5527288A (en) | 1990-12-13 | 1996-06-18 | Elan Medical Technologies Limited | Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs |
CA2059693C (en) | 1991-01-28 | 2003-08-19 | Peter J. Kniskern | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae |
CA2059692C (en) | 1991-01-28 | 2004-11-16 | Peter J. Kniskern | Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine |
US5476929A (en) | 1991-02-15 | 1995-12-19 | Uab Research Foundation | Structural gene of pneumococcal protein |
DK0571538T5 (da) | 1991-02-15 | 2002-03-04 | Uab Research Foundation | Strukturgen for pneumokokprotein |
US6592876B1 (en) | 1993-04-20 | 2003-07-15 | Uab Research Foundation | Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products |
GB9113809D0 (en) | 1991-06-26 | 1991-08-14 | Cancer Res Campaign Tech | Papillomavirus l2 protein |
EP1298211B1 (en) | 1991-07-19 | 2006-07-12 | The University Of Queensland | Polynucleotide segment of HPV16 Genome |
US5552146A (en) | 1991-08-15 | 1996-09-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis |
GB9118204D0 (en) | 1991-08-23 | 1991-10-09 | Weston Terence E | Needle-less injector |
SE9102652D0 (sv) | 1991-09-13 | 1991-09-13 | Kabi Pharmacia Ab | Injection needle arrangement |
WO1993010152A1 (en) | 1991-11-16 | 1993-05-27 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | HYBRID PROTEIN BETWEEN CS FROM PLASMODIUM AND HBsAG |
US5328483A (en) | 1992-02-27 | 1994-07-12 | Jacoby Richard M | Intradermal injection device with medication and needle guard |
JPH06510799A (ja) | 1992-06-25 | 1994-12-01 | シティ・オブ・ホープ | サイトメガロウイルスのポリペプチドによる細胞溶解性t−リンパ球の誘導 |
DE122007000094I1 (de) | 1992-06-25 | 2008-03-27 | Papillomavirus vakzine | |
US5786148A (en) | 1996-11-05 | 1998-07-28 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein |
US5383851A (en) | 1992-07-24 | 1995-01-24 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5437951A (en) | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
US5569189A (en) | 1992-09-28 | 1996-10-29 | Equidyne Systems, Inc. | hypodermic jet injector |
US5334144A (en) | 1992-10-30 | 1994-08-02 | Becton, Dickinson And Company | Single use disposable needleless injector |
GB9224584D0 (en) | 1992-11-23 | 1993-01-13 | Connaught Lab | Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases |
ATE494005T1 (de) | 1993-03-09 | 2011-01-15 | Univ Rochester | Herstellung von menschlichem papillomaviren hüllprotein und virus-ähnlichen teilchen |
US5801005A (en) | 1993-03-17 | 1998-09-01 | University Of Washington | Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
WO1994021292A1 (en) | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a |
JP3429313B2 (ja) | 1993-05-18 | 2003-07-22 | オハイオ・ステイト・リサーチ・ファウンデーション | 中耳炎ワクチン |
US5744144A (en) | 1993-07-30 | 1998-04-28 | University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures | Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof |
ATE254475T1 (de) | 1993-09-22 | 2003-12-15 | Jackson H M Found Military Med | Verfahren zur aktivierung von löslichem kohlenhydraten durch verwendung von neuen cyanylierungsreagenzien, zur herstellung von immunogenischen konstrukten |
BE1007535A3 (nl) | 1993-09-24 | 1995-07-25 | Innovative Sputtering Tech | Gelaagde metaalstructuur. |
GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
US5688506A (en) | 1994-01-27 | 1997-11-18 | Aphton Corp. | Immunogens against gonadotropin releasing hormone |
WO1995024176A1 (en) | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Bioject, Inc. | Ampule filling device |
US5466220A (en) | 1994-03-08 | 1995-11-14 | Bioject, Inc. | Drug vial mixing and transfer device |
GB9409962D0 (en) | 1994-05-18 | 1994-07-06 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
US5565204A (en) | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
DE122007000093I1 (de) | 1994-10-07 | 2008-03-27 | Univ Loyola Chicago | Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung |
US5599302A (en) | 1995-01-09 | 1997-02-04 | Medi-Ject Corporation | Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring |
AU4727296A (en) | 1995-02-24 | 1996-09-11 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation |
IL117459A (en) | 1995-03-22 | 2005-11-20 | Merck & Co Inc | Dna encoding human papillomavirus type 18 |
US20010053365A1 (en) * | 1995-04-25 | 2001-12-20 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccines |
US6440425B1 (en) | 1995-05-01 | 2002-08-27 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
US5688267A (en) * | 1995-05-01 | 1997-11-18 | Ep Technologies, Inc. | Systems and methods for sensing multiple temperature conditions during tissue ablation |
US5730723A (en) | 1995-10-10 | 1998-03-24 | Visionary Medical Products Corporation, Inc. | Gas pressured needle-less injection device and method |
US5668267A (en) | 1995-05-31 | 1997-09-16 | Washington University | Polynucleotides encoding mammaglobin, a mammary-specific breast cancer protein |
US5843464A (en) | 1995-06-02 | 1998-12-01 | The Ohio State University | Synthetic chimeric fimbrin peptides |
US5981215A (en) | 1995-06-06 | 1999-11-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Human criptin growth factor |
EA199800046A1 (ru) | 1995-06-07 | 1998-06-25 | Байокем Вэксинс Инк. | Полипептид, последовательность днк, вакцинная композиция (варианты), антитело или его фрагмент, вакцина, применения указанных полипептида, последовательности днк и антитела или его фрагмента |
GB9513074D0 (en) | 1995-06-27 | 1995-08-30 | Cortecs Ltd | Novel anigen |
US6290970B1 (en) | 1995-10-11 | 2001-09-18 | Aventis Pasteur Limited | Transferrin receptor protein of Moraxella |
US5997881A (en) | 1995-11-22 | 1999-12-07 | University Of Maryland, Baltimore | Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A |
US5893397A (en) | 1996-01-12 | 1999-04-13 | Bioject Inc. | Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus |
US6090576A (en) | 1996-03-08 | 2000-07-18 | Connaught Laboratories Limited | DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella |
GB9607549D0 (en) | 1996-04-11 | 1996-06-12 | Weston Medical Ltd | Spring-powered dispensing device |
CA2253252A1 (en) | 1996-05-01 | 1997-11-06 | The Rockefeller University | Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines |
US7341727B1 (en) | 1996-05-03 | 2008-03-11 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
EP0956289A4 (en) | 1996-08-16 | 2004-10-13 | Smithkline Beecham Corp | NOVEL PROKARYOTA POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES AND USES THEREOF |
US5955306A (en) | 1996-09-17 | 1999-09-21 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Genes encoding proteins that interact with the tub protein |
US5882896A (en) | 1996-09-24 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | M protein |
US5882871A (en) | 1996-09-24 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | Saliva binding protein |
AU6909098A (en) | 1996-10-31 | 1998-05-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences |
WO1998021337A2 (en) | 1996-11-12 | 1998-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | C3 BINDING PROTEIN OF $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE) |
US5840871A (en) | 1997-01-29 | 1998-11-24 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Prostate-associated kallikrein |
EP0973911A1 (en) | 1997-01-30 | 2000-01-26 | Imperial College Of Science, Technology & Medicine | MUTANT $i(msbB) or $i(htrB) GENES |
CO4870792A1 (es) | 1997-02-25 | 1999-12-27 | Corixa Corp | Compuestos y conjunto de medios de diagnostico para detectar y vigilar la progresion de cancer de prostata |
JP3036686B2 (ja) | 1997-02-27 | 2000-04-24 | 政夫 高橋 | 冠状動脈のバイパス手術に用いる血管吻合部の止血保持装置 |
DE19708537A1 (de) | 1997-03-03 | 1998-09-10 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc. |
CN1259052A (zh) * | 1997-04-01 | 2000-07-05 | 科里克萨有限公司 | 单磷酰基脂质a的水性免疫佐剂组合物 |
ZA982968B (en) | 1997-04-09 | 1998-10-27 | Corixa Corp | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer |
US6130043A (en) | 1997-05-02 | 2000-10-10 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate |
US5993412A (en) | 1997-05-19 | 1999-11-30 | Bioject, Inc. | Injection apparatus |
JP2001502925A (ja) | 1997-06-03 | 2001-03-06 | コノート ラボラトリーズ リミテッド | モラクセラのラクトフェリン受容体遺伝子 |
GB9712347D0 (en) | 1997-06-14 | 1997-08-13 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
CA2297374A1 (en) | 1997-07-21 | 1999-01-28 | North American Vaccine, Inc. | Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines |
US5928215A (en) * | 1997-08-14 | 1999-07-27 | Becton, Dickinson And Acompany | Syringe filling and delivery device |
GB9717953D0 (en) | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
PT1015561E (pt) | 1997-09-05 | 2006-11-30 | Medimmune Inc | Método in vitro para desorganização/reorganização de partículas semelhantes ao vírus papilomavírus (vlps) |
AU1145699A (en) | 1997-09-05 | 1999-03-22 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Oil in water emulsions containing saponins |
AU9510598A (en) | 1997-09-24 | 1999-04-12 | American Cyanamid Company | Human complement c3-degrading proteinase from (streptococcus pneumoniae) |
AU2447999A (en) | 1997-09-26 | 1999-05-03 | Corixa Corporation | Murine model for human carcinoma |
EP1992640A1 (en) | 1997-12-24 | 2008-11-19 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy and diagnosis of breast cancer and methods for their use |
IT1298087B1 (it) | 1998-01-08 | 1999-12-20 | Fiderm S R L | Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni |
ATE315088T1 (de) | 1998-02-05 | 2006-02-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Tumorassoziierte antigenderivate der mage-familie,nukleinsäuresequenzen die dafür kodieren, zur herstellung von fusionsproteinen und zusammensetzungen zur impfung |
US20020039584A1 (en) | 1998-02-20 | 2002-04-04 | Medigene Ag | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
KR100794394B1 (ko) | 1998-04-07 | 2008-01-15 | 메디뮨 인코포레이티드 | 백신용 폐렴 구균의 콜린 결합성 단백질의 유도체 |
CN1191851C (zh) | 1998-04-07 | 2005-03-09 | 圣朱德儿童研究医院 | 包含胆碱结合蛋白an-末端截取物的氨基酸的多肽、由该多肽衍生的疫苗及其应用 |
CN1163602C (zh) | 1998-04-07 | 2004-08-25 | 科里克萨公司 | 结核杆菌抗原融合蛋白及其应用 |
JP2002511266A (ja) | 1998-04-15 | 2002-04-16 | ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ | 腫瘍関連核酸及びその使用 |
AU770378B2 (en) | 1998-04-23 | 2004-02-19 | Uab Research Foundation | Pneumococcal surface protein C(PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor |
GB9809683D0 (en) | 1998-05-06 | 1998-07-01 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9810285D0 (en) | 1998-05-13 | 1998-07-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
KR20070089890A (ko) | 1998-06-03 | 2007-09-03 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 모락셀라 카탈리스로부터의 basb027 단백질 및 유전자,항원, 항체, 및 이들의 용도 |
GB9812163D0 (en) | 1998-06-05 | 1998-08-05 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9812440D0 (en) | 1998-06-09 | 1998-08-05 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9812613D0 (en) | 1998-06-11 | 1998-08-12 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
EP1870466A3 (en) | 1998-07-14 | 2008-03-19 | Corixa Corporation | Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer |
GB9820002D0 (en) | 1998-09-14 | 1998-11-04 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
JP2002526082A (ja) | 1998-09-24 | 2002-08-20 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | ストレプトコッカス・ニューモニア由来のヒト補体c3分解ポリペプチド |
AU1819400A (en) | 1998-11-17 | 2000-06-05 | Schlumberger Technology Corporation | Transmitting information over a communication link |
AU2027400A (en) | 1998-11-19 | 2000-06-05 | St. Jude Children's Research Hospital | Identification and characterization of novel pneumococcal choline binding proteins, cbpg and cbpd, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
WO2000037105A2 (en) | 1998-12-21 | 2000-06-29 | Medimmune, Inc. | Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines |
ES2348708T3 (es) | 1999-01-29 | 2010-12-13 | Corixa Corporation | Proteinas de fusion de her-2/neu. |
GB9904559D0 (en) | 1999-02-26 | 1999-04-21 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
AU3391200A (en) | 1999-03-04 | 2000-09-21 | Corixa Corporation | Compositions and methods for breast cancer therapy and diagnosis |
EP1162999B1 (en) * | 1999-03-19 | 2006-11-29 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine against Streptococcus pneumoniae |
US6245568B1 (en) | 1999-03-26 | 2001-06-12 | Merck & Co., Inc. | Human papilloma virus vaccine with disassembled and reassembled virus-like particles |
HU229255B1 (en) | 1999-04-19 | 2013-10-28 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
DE60027890T2 (de) | 1999-06-10 | 2007-04-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Streptococcus pneumoniae proteine und impfstoffe |
FR2796289B1 (fr) | 1999-07-16 | 2001-08-10 | Cross Site Technologies | Seringue sans aiguille avec injecteur a elements superposes |
FR2796291B1 (fr) | 1999-07-16 | 2001-09-21 | Cross Site Technologies | Seringue sans aiguille munie d'un systeme de declenchement piezo-electrique |
FR2796290B1 (fr) | 1999-07-16 | 2001-09-14 | Cross Site Technologies | Seringue sans aiguille fonctionnant avec un generateur d'onde de choc a travers une paroi |
GB9917977D0 (en) | 1999-07-30 | 1999-09-29 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9918038D0 (en) | 1999-07-30 | 1999-09-29 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9918208D0 (en) | 1999-08-03 | 1999-10-06 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9918302D0 (en) | 1999-08-03 | 1999-10-06 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
US6139179A (en) | 1999-09-03 | 2000-10-31 | Davis-Standard Corporation | Extruder screw having multi-channeled barrier section |
GB9921146D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-11-10 | Smithkline Beecham Biolog | Novel composition |
GB9921147D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-11-10 | Smithkline Beecham Biolog | Novel composition |
US6494865B1 (en) | 1999-10-14 | 2002-12-17 | Becton Dickinson And Company | Intradermal delivery device including a needle assembly |
FR2800619B1 (fr) * | 1999-11-05 | 2002-02-08 | Cross Site Technologies | Seringue sans aiguille avec un moyen de poussee temporairement retenu |
FR2802102B1 (fr) | 1999-12-08 | 2002-07-12 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille munie d'un tube d'ejection a section constante |
FR2802103B1 (fr) * | 1999-12-08 | 2003-10-03 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille fonctionnant avec entrainement du principe actif par effet tube a choc |
FR2802820B1 (fr) | 1999-12-27 | 2002-10-18 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille fonctionnant par effet tube a choc, avec maintien prealable du principe actif sur le cote |
FR2804329B1 (fr) * | 2000-02-02 | 2002-12-13 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille munie d'un opercule contenant le principe actif |
FR2804869B1 (fr) * | 2000-02-11 | 2002-05-17 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille pour l'injection d'un liquide contenu dans une ampoule pre-remplie |
FR2805749B1 (fr) | 2000-03-01 | 2002-05-17 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille a deux niveaux de vitesse d'injection |
FR2807946B1 (fr) | 2000-04-19 | 2002-06-07 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille fonctionnant avec un chargement pyrotechnique bicomposition |
FR2809626B1 (fr) * | 2000-05-30 | 2003-03-07 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille avec membrane d'isolation d'un ejecteur multiconduit |
NZ553554A (en) | 2000-06-20 | 2008-11-28 | Id Biomedical Corp | Streptococcus antigens |
FR2810554B1 (fr) | 2000-06-22 | 2003-05-16 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille munie d'un reservoir modulable |
FR2812202B1 (fr) | 2000-07-28 | 2002-09-13 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille fonctionnant par mise en compression du reservoir contenant le principe actif liquide |
GB0019375D0 (en) | 2000-08-07 | 2000-09-27 | Int Centre Genetic Eng & Bio | Method of polypeptide renaturation |
GB0022742D0 (en) | 2000-09-15 | 2000-11-01 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
FR2815544B1 (fr) * | 2000-10-23 | 2003-02-14 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Seringue sans aiguille securisee a architecture compacte |
WO2002067983A1 (en) | 2001-02-23 | 2002-09-06 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel vaccine |
US20030031684A1 (en) | 2001-03-30 | 2003-02-13 | Corixa Corporation | Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA) |
TWI228420B (en) | 2001-05-30 | 2005-03-01 | Smithkline Beecham Pharma Gmbh | Novel vaccine composition |
JP2005519990A (ja) * | 2001-10-12 | 2005-07-07 | ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション | イミダゾキノリン化合物を用いて免疫応答を増強するための方法および産物 |
WO2003054007A2 (en) | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Shire Biochem Inc. | Streptococcus antigens |
US7026465B2 (en) | 2002-02-15 | 2006-04-11 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis |
EP1551221A4 (en) * | 2002-07-03 | 2007-08-01 | Coley Pharm Group Inc | NUCLEIC ACID COMPOSITIONS FOR STIMULATING IMMUNE RESPONSES |
GB0504436D0 (en) * | 2005-03-03 | 2005-04-06 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
CA2602637A1 (en) | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccines against chlamydial infection |
EA013326B1 (ru) | 2005-04-26 | 2010-04-30 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Вакцина |
NZ562729A (en) * | 2005-04-29 | 2009-10-30 | Infectious Disease Res Inst Id | Novel method for preventing or treating M tuberculosis infection using Mtb72f fusion proteins |
-
2006
- 2006-12-11 TW TW095146300A patent/TWI457133B/zh not_active IP Right Cessation
- 2006-12-12 SI SI200631793T patent/SI2364720T1/sl unknown
- 2006-12-12 ES ES11168826.3T patent/ES2451573T3/es active Active
- 2006-12-12 KR KR1020087016980A patent/KR101363879B1/ko active IP Right Grant
- 2006-12-12 JP JP2008545078A patent/JP5461015B2/ja active Active
- 2006-12-12 US US12/096,838 patent/US20080279926A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-12 EP EP11168822.2A patent/EP2364722B1/en active Active
- 2006-12-12 EP EP11168821.4A patent/EP2364721B1/en active Active
- 2006-12-12 ES ES11168822.2T patent/ES2444623T3/es active Active
- 2006-12-12 NZ NZ596870A patent/NZ596870A/xx not_active IP Right Cessation
- 2006-12-12 BR BRPI0619795A patent/BRPI0619795B8/pt active IP Right Grant
- 2006-12-12 PL PL06831376T patent/PL1959992T3/pl unknown
- 2006-12-12 PL PL11168820T patent/PL2364720T3/pl unknown
- 2006-12-12 EP EP11168826.3A patent/EP2364723B1/en active Active
- 2006-12-12 CA CA2633008A patent/CA2633008C/en active Active
- 2006-12-12 SG SG10201405533TA patent/SG10201405533TA/en unknown
- 2006-12-12 CN CN201410035418.6A patent/CN103861100A/zh active Pending
- 2006-12-12 EP EP11168827.1A patent/EP2364724B1/en active Active
- 2006-12-12 AT AT06831376T patent/ATE542543T1/de active
- 2006-12-12 EP EP11168820.6A patent/EP2364720B1/en active Active
- 2006-12-12 CN CN2013103564887A patent/CN103405764A/zh active Pending
- 2006-12-12 DK DK11168820.6T patent/DK2364720T3/da active
- 2006-12-12 ES ES11168821.4T patent/ES2445170T3/es active Active
- 2006-12-12 NZ NZ568825A patent/NZ568825A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-12-12 AU AU2006325377A patent/AU2006325377B2/en active Active
- 2006-12-12 PT PT06831376T patent/PT1959992E/pt unknown
- 2006-12-12 MY MYPI20082050A patent/MY145943A/en unknown
- 2006-12-12 SG SG201101856-1A patent/SG170127A1/en unknown
- 2006-12-12 PL PL11168827T patent/PL2364724T3/pl unknown
- 2006-12-12 EA EA200801307A patent/EA014353B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-12-12 PT PT111688206T patent/PT2364720E/pt unknown
- 2006-12-12 PT PT111688271T patent/PT2364724E/pt unknown
- 2006-12-12 DK DK11168827.1T patent/DK2364724T3/da active
- 2006-12-12 WO PCT/GB2006/004634 patent/WO2007068907A2/en active Application Filing
- 2006-12-12 CN CN2012101089032A patent/CN102631670A/zh active Pending
- 2006-12-12 SI SI200631697T patent/SI2364724T1/sl unknown
- 2006-12-12 SI SI200631300T patent/SI1959992T1/sl unknown
- 2006-12-12 EA EA201001189A patent/EA018860B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-12-12 DK DK06831376.6T patent/DK1959992T3/da active
- 2006-12-12 ES ES11168827.1T patent/ES2436645T3/es active Active
- 2006-12-12 ES ES11168820.6T patent/ES2479165T3/es active Active
- 2006-12-12 ES ES06831376T patent/ES2378471T3/es active Active
- 2006-12-12 EP EP06831376A patent/EP1959992B1/en active Active
- 2006-12-13 AR ARP060105496A patent/AR058543A1/es not_active Application Discontinuation
- 2006-12-13 PE PE2006001600A patent/PE20071098A1/es not_active Application Discontinuation
-
2008
- 2008-05-26 IL IL191703A patent/IL191703A/en active IP Right Grant
- 2008-05-29 NO NO20082472A patent/NO20082472L/no not_active Application Discontinuation
- 2008-06-03 MA MA30995A patent/MA30023B1/fr unknown
- 2008-06-20 CR CR10101A patent/CR10101A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-06-26 CR CR10118A patent/CR10118A/xx unknown
- 2008-09-16 HK HK08110254.2A patent/HK1118477A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2008-09-16 HK HK11111652.3A patent/HK1157219A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-02-03 US US13/020,045 patent/US10039823B2/en active Active
-
2012
- 2012-02-10 HR HR20120136T patent/HRP20120136T1/hr unknown
- 2012-03-30 CY CY20121100324T patent/CY1112589T1/el unknown
- 2012-11-22 JP JP2012256348A patent/JP2013056927A/ja active Pending
-
2013
- 2013-11-06 HR HRP20131057TT patent/HRP20131057T1/hr unknown
- 2013-11-20 IL IL229521A patent/IL229521A0/en unknown
- 2013-11-22 CY CY20131101050T patent/CY1114864T1/el unknown
-
2014
- 2014-05-28 HR HRP20140484TT patent/HRP20140484T1/hr unknown
- 2014-06-25 CY CY20141100461T patent/CY1115308T1/el unknown
-
2016
- 2016-11-17 US US15/354,233 patent/US10143745B2/en active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994000153A1 (en) * | 1992-06-25 | 1994-01-06 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine composition containing adjuvants |
WO1996033739A1 (en) * | 1995-04-25 | 1996-10-31 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccines containing a saponin and a sterol |
WO1998015287A1 (en) * | 1996-10-05 | 1998-04-16 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccines |
US20030219453A1 (en) * | 1998-03-19 | 2003-11-27 | Smithkline Beecham Biologicals, Sa | Vaccines |
WO2002032454A1 (en) * | 2000-10-18 | 2002-04-25 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Adjuvant composition comprising an immunostimulatory oligonucleotide and a tocol |
WO2003028760A2 (en) * | 2001-10-01 | 2003-04-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine |
WO2005117958A1 (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant |
WO2006123155A2 (en) * | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine composition comprising b-subunit of e. coli heat toxin and an atigen and an adjuvant |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BEREZIN V.E. ET AL.: "Controlled organization of multimolecular complexes of enveloped virus glycoproteins: Study of immunogenicity". VACCINE 1988 UNITED KINGDOM, vol. 6, no. 5, 1988, pages 450-456, XP002435079, ISSN: 0264-410X, the whole document * |
DELIYANNIS GEORGIA ET AL.: "Immunopotentiation of humoral and cellular responses to inactivated influenza vaccines by two different adjuvants with potential for human use". VACCINE, vol. 16, no. 20, December 1998 (1998-12), pages 2058-2068, XP004138457, ISSN: 0264-410X, the whole document * |
MISCHLER R. ET AL.: "Inflexal(R)V a trivalent virosome subunit Influenza vaccine: Production". VACCINE 20 DEC 2002 UNITED KINGDOM, vol. 20, no. SUPPL. 5, 20 December 2002 (2002-12-20), pages B17-B23, XP002435078, ISSN: 0264-410X, the whole document * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA018860B1 (ru) | Вакцинные композиции, содержащие сапониновый адъювант | |
KR101916787B1 (ko) | Cd4 t-세포 및/또는 개선된 b-메모리 세포 반응을 유도하는 인플루엔자 바이러스 및 수중유 에멀젼 애주번트의 용도 | |
EA015817B1 (ru) | Иммуногенная композиция, содержащая адъювант в виде эмульсии "масло в воде" | |
EA024250B1 (ru) | Дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа для применения у человека и содержащая её вакцина, способы их приготовления и их применение для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых вирусом гриппа у людей | |
JP5918870B2 (ja) | インフルエンザに対する改善されたワクチン接種 | |
UA98612C2 (ru) | Иммуногенная композиция, пригодная для человека, включающая антиген или антигенный препарат в комбинации с адъювантом, содержащим qs21 в форме липосомы и 3d-mpl | |
BRPI0609519A2 (pt) | composição, uso de uma composição, método de vacinação, uso de um antìgeno, e, método para a preparação de uma composição imunogênica |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |