CN104884081A - 免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile，C. difficile)多肽和不含铝的佐剂的免疫原性组合物。

Description

免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及包含艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile，C. difficile)多肽和不含铝的佐剂的免疫原性组合物。本发明还涉及疫苗组合物，以及本发明的疫苗和免疫原性组合物在预防或治疗或制备药物中的用途。

背景

艰难梭状芽孢杆菌是医院肠道感染的最重要原因并且是人中假膜性结肠炎的主要原因(Bartlett等人Am. J. Clin. Nutr. 11 suppl: 2521-6 (1980))。感染艰难梭状芽孢杆菌的个体的总体相关死亡率在诊断的3个月内计算为5.99%，并且更高的死亡率与高龄相关，在超过80岁的患者中为13.5% (Karas等人 Journal of Infection 561:1-9 (2010))。目前对艰难梭状芽孢杆菌感染的治疗是施用抗生素 (甲硝唑和万古霉素) ，然而，已经存在对这些抗生素具有抗性的菌株的证据(Shah等人., Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8(5), 555–564 (2010))。因此，存在对能够诱发针对艰难梭状芽孢杆菌的抗体和/或保护性免疫应答的免疫原性组合物的需求。

艰难梭状芽孢杆菌的肠毒性主要由于毒素A(“ToxA”)和毒素B(“ToxB”)两种毒素的作用。毒素A和毒素B的C端结构域包含重复单位，例如毒素A的C端结构域由连续的重复单位构成(Dove等人Infect. Immun. 58:480-499 (1990))。由于这一原因，C端结构域也可以称为“重复结构域”。如Ho等人 (PNAS 102:18373-18378 (2005))中描述，这些重复部分可以进一步分为短重复(SRs)和长重复(LRs)。

已经描述了包含来自艰难梭状芽孢杆菌的抗原的免疫原性组合物。WO96/12802和WO00/61762和Lyerly等人 (Current Microbiology 21:29-32 (1990))涉及毒素A的片段，特别是C端结构域的片段，其用于诱导仓鼠中的保护性免疫应答。WO9920304涉及通过在甲醛中孵育灭活的共同纯化的毒素A和毒素B的混合物。WO00/61762涉及包含艰难梭状芽孢杆菌的毒素A和毒素B的全长C端结构域或C端结构域的片段的免疫原性组合物。类似地，WO2012/163817、WO2012/163811和WO2012/163810提供毒素A和毒素B的可能的片段以及其融合蛋白的公开内容。

需要具有改进的免疫原性的新组合物或疫苗。作为一种策略，已经用佐剂尝试和改进针对任何给定抗原产生的免疫应答。例如，WO2009035707描述了包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A和B的类毒素以及佐剂诸如氢氧化铝化合物的组合物。

以前已经公开了含有脂多糖和皂树(Quillaja)皂苷的组合的佐剂，例如，在EP0671948中。水包油乳剂自身在本领域众所周知，已表明可用作佐剂组合物(EP 399843; WO 95/17210)。

仍然需要提供针对艰难梭状芽孢杆菌的合适的免疫应答的疫苗和免疫原性组合物。

概述

在一个方面，本发明涉及包含多肽和佐剂的免疫原性组合物，所述多肽包含艰难梭状芽孢杆菌(C. difficile)毒素A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素B片段，且所述佐剂包含以脂质体的形式呈现的免疫活性皂苷级分。免疫学活性皂苷级分可以是QS21，且脂多糖可以是3D-MPL。合适地，免疫原性组合物可以包含约50 μg 3D-MPL和约50 μg QS21。

在一个方面，本发明涉及包含多肽和佐剂的免疫原性组合物，所述多肽包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素B片段，且所述佐剂包含水包油乳剂，其中所述水包油乳剂包含可代谢油、母育酚和乳化剂。可代谢油可以以约5.35 mg的量存在。母育酚可以以约5.94 mg的量存在。合适地，乳化剂可以以约2.425 mg的量存在。合适地，可代谢油是角鲨烯，母育酚是α-生育酚，且乳化剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

合适地，根据本发明的任何方面的免疫原性组合物包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A重复结构域片段和艰难梭状芽孢杆菌毒素B重复结构域片段，且引发中和毒素A和毒素B的抗体。在本发明的进一步实施方案中，免疫原性组合物包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A片段和艰难梭状芽孢杆菌毒素B片段，其中所述片段中的一种是N端片段，而另一种是重复结构域片段。

合适地，根据本发明的任何方面的免疫原性组合物包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的多肽变体。

合适地，根据本发明的任何方面的免疫原性组合物包含含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的多肽或任何这些序列的变体或片段。

根据本发明的免疫原性组合物可以包含额外抗原，诸如衍生自细菌的抗原，所述细菌选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S. pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae, H.influenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis, N.meningitidis)、大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis, M.cattarhalis)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani, C. tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptherieriae, C. diptherieriae)、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis, B. pertussis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, S.epidermidis)、肠球菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)。

在一个方面，本发明涉及包含根据本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。

在一个方面，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物或疫苗在治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病中的用途。

在一个方面，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病。

在一个方面，本发明涉及根据本发明的免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病的药物中的用途。

在一个方面，本发明涉及预防或治疗艰难梭状芽孢杆菌疾病的方法，其包括将根据本发明的免疫原性组合物或疫苗施用于受试者。

附图简述

图1 - 显示用佐剂A；佐剂A无QS21和佐剂A无MPL配制的F2免疫的仓鼠的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。

图2 - 显示用未佐剂化的F2或用佐剂A、佐剂B和明矾配制的F2免疫的仓鼠的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。

图3 – 用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫的雄性和雌性仓鼠的第I次免疫后血清的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。

图4 – 用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫的雄性和雌性仓鼠的第II次免疫后血清的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。

图5 – 在佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫的雄性和雌性仓鼠的第III次免疫后血清的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。

图6 – 在佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫的雄性和雌性仓鼠的第III次免疫后第87天血清的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。

图7 – 在第I、II和III次免疫后血清上，在佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫的雄性仓鼠的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。

图8 - 显示用混合物(ToxA+ToxB)或用明矾或佐剂A中配制的F2融合蛋白免疫的雄性和雌性仓鼠的抗ToxA和抗ToxB ELISA结果的图。

图9 – 显示用佐剂B中配制的毒素A的C端的片段(aa 2387-2706)、毒素B的C端的片段(aa 1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的抗ToxA免疫原性的图。

图10 – 显示用佐剂B中配制的毒素A的C端的片段(aa 2387-2706)、毒素B的C端的片段(aa 1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的血细胞凝集抑制的图。

图11 – 显示用佐剂B中配制的毒素A的C端的片段(aa 2387-2706)、毒素B的C端的片段(aa 1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的抗ToxB免疫原性的图。

图12 – 来自用佐剂B中配制的毒素A的C端片段(aa 2387-2706)、毒素B的C端片段(aa 1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠的细胞毒性抑制滴度。

图13 - 显示用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、G54New或F5 ToxB融合体免疫的小鼠的抗ToxA ELISA结果的图。

图14 - 显示用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠的抗ToxB ELISA结果的图。

图15 - 显示用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠的血细胞凝集抑制的图。

图16 – 显示来自用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠的HT29细胞中的细胞毒性滴度的图。

图17 - 显示来自用佐剂B中配制的F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠的IMR90细胞中的细胞毒性滴度的图。

图18 - 用艰难梭状芽孢杆菌ToxA-Cter (aa 2387-2706)、ToxB-Cter (aa 1750-2360)和融合蛋白(未佐剂化的)免疫的小鼠的抗ToxA ELISA结果的图。

图19 - 用艰难梭状芽孢杆菌ToxA-Cter (aa 2387-2706)、ToxB-Cter (aa 1750-2360)和融合蛋白(未佐剂化的)免疫的小鼠的抗ToxB ELISA结果的图。

图20 - 用佐剂B中配制的艰难梭状芽孢杆菌ToxA-Cter (aa 2387-2706)、ToxB-Cter (aa 1750-2360)和融合蛋白免疫的小鼠的抗ToxA ELISA结果的图：第II次免疫后、第III次免疫后、加强前、第IV免疫后血清。

图21 - 用佐剂B中配制的艰难梭状芽孢杆菌ToxA-Cter (aa 2387-2706)、ToxB-Cter (aa 1750-2360)和融合蛋白免疫的小鼠的抗ToxB ELISA结果的图：第II次免疫后、第III次免疫后、加强前、第IV免疫后血清。

图22 –描述使用圆二色性测量的融合体2、3、4和5的远UV谱的图。融合体2的谱用具有表示为小矩形的点的线表示，融合体3的谱用具有表示为小菱形的点的线表示，融合体4用具有表示为圆形的点的线表示，并且融合体5用具有表示为十字形的点的线表示。

图23 -描述使用圆二色性测量的融合体2、3、4和5的近UV谱的图。融合体2的谱用具有表示为十字形的点的线表示，融合体3的谱用具有表示为圆形的点的线表示，融合体4的谱用具有表示为三角形的点的线表示，并且融合体5的谱用具有表示为小菱形的点的线表示。

图24 -描述使用圆二色性测量的融合体F52New、F54Gly、F54New和F5ToxB的远UV谱的图。F52New的谱用具有表示为双十字的点的线表示，F54Gly的谱用具有表示为三角形的点的线表示，F54New用具有表示为矩形的点的线表示，并且F5ToxB用具有表示为十字形的点的线表示。

图25 -描述使用圆二色性测量的融合体F52New、F54Gly、F54New和F5ToxB的近UV谱的图。F52New的谱用具有表示为双十字的点的线表示，F54Gly的谱用具有表示为三角形的点的线表示，F54New用具有表示为矩形的点的线表示，并且F5ToxB用具有表示为十字形的点的线表示。

详述

本发明人已经显示，包含含有用不含铝的佐剂、特别是佐剂诸如本文所述的佐剂A和佐剂B配制的艰难梭状芽孢杆菌毒素A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素B片段的多肽的免疫原性组合物提供与含有未佐剂化的艰难梭状芽孢杆菌多肽的组合物相比改善的免疫应答。根据本发明的免疫原性组合物还可以提供与用明矾配制的艰难梭状芽孢杆菌多肽相比改善的针对艰难梭状芽孢杆菌的免疫应答。

多肽

包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素B片段的多肽可以包含已经合适地通过在甲醛中孵育灭活的纯化的毒素A或毒素B，诸如WO9920304中描述的那些。

所述多肽可以包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A N端片段和艰难梭状芽孢杆菌毒素B重复结构域片段。所述多肽可以含有艰难梭状芽孢杆菌毒素A重复结构域片段和艰难梭状芽孢杆菌毒素B N端片段。所述多肽可以包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A重复结构域片段和艰难梭状芽孢杆菌毒素B重复结构域片段。

所述多肽可以包含艰难梭状芽孢杆菌的毒素A和毒素B的全长N端和/或C端结构域或其片段。

在一个实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物中的多肽不含有艰难梭状芽孢杆菌的毒素A和/或毒素B的全长N端结构域。在一个实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物中的多肽不含有艰难梭状芽孢杆菌的毒素A和/或毒素B的N端结构域片段。

所述多肽可以是融合蛋白。例如，所述融合蛋白可以包含融合序列，诸如Seq ID NO:36和37或WO2012/028741中描述的其它序列。

所述多肽可以包含第一片段和第二片段，其中

(i) 所述第一片段是毒素A重复结构域片段；

(ii) 所述第二片段是毒素B重复结构域片段；

(iii) 所述第一片段包含在第一重复部分内的第一近端；

(iv) 所述第二片段包含在第二重复部分内的第二近端；并且

其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述第一重复部分和所述第二重复部分具有结构相似性。

术语多肽是指氨基酸的连续序列。

术语“毒素A重复结构域”是指包含重复序列的来自艰难梭状芽孢杆菌的毒素A蛋白的C端结构域。例如，毒素A蛋白的C端结构域可以是来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A的氨基酸1832-2710和/或它们在不同菌株中的等价物。来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A的氨基酸1832-2710对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1832-2710。

术语“毒素B重复结构域”是指来自艰难梭状芽孢杆菌的毒素B蛋白的C端结构域。例如，毒素B蛋白的C端结构域可以是来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素B的氨基酸1834-2366和/或它们在不同菌株中的等价物。来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素B的氨基酸1834-2366对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1834-2366。

毒素A的全长N端结构域可以是来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A的氨基酸1-542和/或它们在不同菌株中的等价物。因此，术语“艰难梭状芽孢杆菌毒素A N端片段”或“毒素A的N端结构域片段”是指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A的氨基酸1-542的片段和/或它们在不同菌株中的等价物。来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A的氨基酸1-542对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-542。

毒素B的全长N端结构域可以是来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素B的氨基酸1-543和/或它们在不同菌株中的等价物。因此，术语“艰难梭状芽孢杆菌毒素B N端片段”或“毒素B的N端结构域片段”是指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素B的氨基酸1-543的片段和/或它们在不同菌株中的等价物。来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素B的氨基酸1-543对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-543。

艰难梭状芽孢杆菌毒素A和B是保守蛋白。然而，该序列在菌株间有少量差别。此外，不同菌株中的毒素A和B的氨基酸序列可能在氨基酸的数量上有所不同。

在一个实施方案中，毒素A重复结构域和/或毒素B重复结构域可以是这样的序列，其是与SEQ ID NO:1的氨基酸1832-2710具有至少90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体或与SEQ ID NO:2的氨基酸1834-2366具有至少90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体。

在一个实施方案中，毒素A N端结构域可以是作为与SEQ ID NO:1的氨基酸1-542具有至少90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体的序列。在一个实施方案中，毒素B N端结构域可以是作为与SEQ ID NO:2的氨基酸1-543具有至少90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体的序列。

“变体”是通过保守性氨基酸取代(由此，残基由具有相同物理化学性质的另一个残基所取代)而与参照多肽有所不同的多肽。通常这样的取代在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间，并在碱性残基Lys和Arg之间；或在芳香族残基Phe和Tyr之间。

此外，在来自一种菌株的毒素A (或毒素B)与来自另一种菌株的毒素A (或毒素B)的C端结构域或N端结构域之间，氨基酸编号可以有所不同。由于这一原因，术语“不同菌株中的等效物”是指，对应于参考菌株(例如艰难梭状芽孢杆菌VPI10463)的那些，但发现于来自不同菌株的毒素中并且可能因此而编号不同的氨基酸。可以通过比对来自不同菌株的毒素的序列来确定“等效物”氨基酸的区域。全文中提供的氨基酸编号是指菌株VPI10463的编号。

术语多肽或蛋白的“片段”是指来自该多肽或蛋白的连续部分，诸如至少100、150、180、200、230、250、300、350、380、400、450、480、500、530、550、580或600个氨基酸。

艰难梭状芽孢杆菌的“毒素A的N端结构域片段”是指来自毒素A的全长N端结构域的连续部分，诸如至少100、150、180、200、230、250、300、350、380、400、450、480、500或530个氨基酸。艰难梭状芽孢杆菌的“毒素B的N端结构域片段”是指来自毒素B的全长N端结构域的连续部分，诸如至少100、150、180、200、230、250、300、350、380、400、450、480、500或530个氨基酸。

毒素A重复结构域片段可以是来自毒素A重复结构域的至少100、200、230、250、300、350、380、400、450、480、500、530、550、580或600个氨基酸的连续部分。毒素A重复结构域片段可以是小于750、小于700、小于650、小于600或小于580个氨基酸的连续部分。毒素B重复结构域片段可以是来自毒素B重复结构域的至少100、200、230、250、300、350、380、400、450、480、500、530、550、580或600个氨基酸的连续部分。毒素B重复结构域片段可以是小于530、小于500、小于480或小于450个氨基酸的连续部分。

术语“第一片段”是指毒素A重复结构域的至少100，诸如150、180、250、300、350、380、400、450、480、500、530、550、580或600个氨基酸的连续部分。术语“第二片段”是指毒素B重复结构域的至少100，诸如200、230、250、280、300、350、400、450或500个氨基酸的连续部分。

术语“第一近端”是指第一片段(Tox A片段)的末端，其与第二片段(Tox B片段)共价连接或与第一和第二片段之间的接头序列共价连接。术语“第二近端”是指第二片段的末端，其在一级结构(氨基酸序列)上与第一片段最接近。

毒素A的C端结构域由8个重复部分(命名为重复部分I、重复部分II、重复部分III、重复部分IV、重复部分V、重复部分VI、重复部分VII和重复部分VIII)构成，这些重复部分的每一个可以进一步分为短重复(SRs)和长重复(LRs) (除了Tox A重复部分VIII，其不具有长重复)。长重复的每一个与其他长重复具有某些结构和序列相似性。类似地，短重复彼此之间具有某些序列和结构相似性。类似地，毒素B的C端由5个细分为SRs和LRs的重复部分构成。每一个重复部分包含一个LR和2-5个SRs (除了Tox B重复部分V，其不具有长重复)。对于本公开的目的， “重复部分”是指ToxA的八个重复部分(命名为I、II、III、IV、V、VI、VII和VIII)中的一个或ToxB的五个重复部分(命名为I、II、III、IV或V)中的一个或来自毒素A或毒素B重复结构域的部分的重复部分。如本文所使用，术语“第一重复部分”是指来自毒素A重复结构域的重复部分(或部分的重复部分)。术语“第二重复部分”是指来自毒素B重复结构域的重复部分(或部分的重复部分)。

例如，ToxA的重复部分I包含三个SRs和一个LR，其可以分别称为ToxA的第一个SRI、ToxA的第二个SRI、ToxA的第三个SRI和ToxA的LRI。

如果第一片段在处于该重复部分内的氨基酸处终止(即第一近端仅包含部分的重复部分序列) ，则认为第一个近端在“重复部分”内。类似地，如果第二片段在处于该重复部分内的氨基酸处终止，则认为第二近端在“重复部分”内。例如，如果第一片段以VPI10463的氨基酸1833-1923 (包括在内的)或它们在另一菌株中的等效物的任何一个氨基酸终止，则第一近端在“ToxA的重复部分I”内。如果第一片段在处于“长重复”或“短重复”内的氨基酸处终止，则第一近端在“长重复”或“短重复”内，类似地，如果第二片段在处于“长重复”或“短重复”内的氨基酸处终止，则第二近端在“长重复”或“短重复”内。

已经确定了来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A和毒素B的每一结构域的氨基酸位置。这些如下(表1)

在一个实施方案中，毒素A 的重复部分是指毒素A (SEQ ID NO:1)的氨基酸1832-1924、1925-2058、2059-2192、2193-2306、2307-2440、2441-2553、2554-2644或2645-2710或在艰难梭状芽孢杆菌的不同菌株中的等效物。在另一个实施方案中，毒素B的重复部分是指毒素B (SEQ ID NO:2)的氨基酸1834-1926、1927-2057、2058-2189、2190-2323或2324-2366或在艰难梭状芽孢杆菌的不同菌株中的等效物。

术语“短重复”可以是指毒素A (SEQ ID NO:1)的氨基酸1832-1852、1853-1873、1874-1893、1925-1944 1945-1965、1966-1986、1987-2007、2008-2027、2059-2078、2079-2099、2100-2120、2121-2141、2142-2161、2193-2212、2213-2233、2234-2253、2254-2275、2307-2326、2327-2347、2348-2368、2369-2389、2390-2409、2441-2460、2461-2481、2482-2502、2503-2522、2554-2573、2574-2594、2595-2613、2645-2664、2665-2686或2687-2710或毒素B (SEQ ID NO:2)的氨基酸1834-1854、1855-1876、1877-1896、1927-1946、1947-1967、1968-1987、1988-2007、2008-2027、2058-2078、2079-2099、2100-2119、2120-2139、2140-2159、2190-2212、2213-2233、2234-2253、2254-2273、2274-2293、2324-2343或2344-2366 或它们在艰难梭状芽孢杆菌的不同菌株中的等效物。

类似地，术语“长重复”可以是指毒素A (SEQ ID NO:1)的氨基酸1894-1924、2028-2058、2162-2192、2276-2306、2410-2440、2523-2553或2614-2644或毒素B (SEQ ID NO:2)的氨基酸1897-1926、2028-2057、2160-2189或2294-2323或它们在艰难梭状芽孢杆菌的不同菌株中的等效物。

本发明的多肽可以是更大的蛋白诸如前体或融合蛋白的一部分。包括含有有助于纯化的序列诸如多组氨酸残基的额外氨基酸序列、或用于重组产生过程中稳定性的额外序列通常是有利的。此外，还考虑添加外源多肽或脂质尾或多核苷酸序列以提高最终分子的免疫原性潜力。

词语“邻近”表示在一级结构中通过少于或正好20、15、10、8、5、2、1或0个氨基酸而分隔。

片段可以这样安置，从而使第一片段的N端邻近第二片段的C端，或者第一片段的C端可以邻近第二片段的N端，或者第一片段的C端可以邻近第二片段的C端，或者第一片段的N端可以邻近第二片段的N端。

如果两条序列具有大于30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性，则它们将具有“彼此的序列相似性”。

术语“同一性”是本领域已知的。同一性是两条或更多条多肽序列之间或者两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，作为示例可以是如通过比较序列确定。在本领域，“同一性”也表示多肽或多核苷酸序列之间序列相关性的程度，作为示例可以是如通过此类序列的字符串之间的匹配确定。“同一性”可以容易地通过已知方法计算，包括但不限于描述于以下中的那些 (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)。设计测定同一性的方法以产生检测序列之间的最大匹配。此外，测定同一性的方法编程于公开可得的计算机程序中。用于测定两条序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于Needle程序BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F.等人., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)), and FASTA Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988))。BLAST家族程序可以从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual, Altschul, S.,等人., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.,等人., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一性。

在一个实施方案中，用于多肽序列比较的参数包括以下：

算法：Needleman和Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

比较矩阵：来自Henikoff和Henikoff，

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)的BLOSSUM62

缺口罚分：10

缺口延伸罚分：0.5。

可使用这些参数的程序作为来自EMBOSS程序包中的“Needle”程序是公开可得的(Rice P.et al, Trends in Genetics 2000 col.16(6):276-277)。前述参数是用于多肽比较的缺省参数 (连同对末端缺口无罚分)。

在一个实施方案中，第一重复部分和第二重复部分彼此具有高结构相似性。当两条序列的序列同一性高于40%、45%、50%或60%时，可以认为它们具有高结构相似性。高序列同一性的存在可以通过使用允许序列比对的软件(EMBOSS, Blast, …)来确定。如果3D模型结构与具有已知3D结构的蛋白共享多于40％、45％、50％或60％序列同一性，则可以对于蛋白使用SwissModel网络服务器忠实地构建3D模型结构。

在一个实施方案中，本发明的多肽诱导中和毒素A或毒素B的抗体。在进一步的实施方案中，多肽诱导中和毒素A的抗体。在进一步的实施方案中，多肽诱导中和毒素B的抗体。在进一步的实施方案中，多肽诱导中和毒素A和毒素B的抗体。短语“诱导中和抗体”表示当使用组合物免疫哺乳动物例如小鼠、豚鼠或人时，该哺乳动物产生中和抗体。

可以通过用包含该多肽的免疫原性组合物免疫小鼠、收集血清并通过使用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血清的抗毒素滴度来测量多肽是否诱发针对毒素的中和抗体。应该将血清与获取自未进行免疫的小鼠的参考样品进行比较。该技术的实例可以见于实施例6。如果针对本发明的多肽的血清产生了高于参考样品超过10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%或100%的ELISA读数，则该多肽诱导了中和毒素A的抗体。

在进一步的实施方案中，本发明的多肽在哺乳动物宿主中诱发针对艰难梭状芽孢杆菌菌株的保护性免疫应答。短语“诱导保护性免疫应答”表示当使用本发明的免疫原性组合物免疫哺乳动物诸如小鼠、豚鼠或人时，该哺乳动物产生能够保护哺乳动物避免由艰难梭状芽孢杆菌导致的死亡的抗体。在一个实施方案中，哺乳动物宿主选自小鼠、兔、豚鼠、猴、非人灵长类动物或人。在一个实施方案中，哺乳动物宿主是小鼠。在进一步实施方案中，哺乳动物宿主是人。

可以使用攻击测定来确定多肽是否在哺乳动物宿主中诱发针对艰难梭状芽孢杆菌菌株的保护性免疫应答。在此类测定中，将哺乳动物宿主用该多肽接种并通过暴露于艰难梭状芽孢杆菌进行攻击。将哺乳动物在攻击后存活的时间与未用该多肽免疫的参考哺乳动物存活的时间进行比较。如果在用艰难梭状芽孢杆菌攻击后，用该多肽免疫的哺乳动物存活长于未用该多肽免疫的参考哺乳动物至少10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%或100%，则多肽诱导了保护性免疫应答。在一个实施方案中，本发明的多肽在选自小鼠、豚鼠、猴或人的哺乳动物中诱发针对艰难梭状芽孢杆菌的保护性免疫应答。在一个实施方案中，哺乳动物是小鼠，在进一步的实施方案中，哺乳动物是人。

来自毒素A和B的C端(重复)结构域的天然结构由延伸的β螺线管类结构组成。如Ho等人 (PNAS 102:18373-18378 (2005))中所见，该结构主要由β折叠结构组成，具有少量的α螺旋结构。可以使用圆二色性(CD)测定存在的二级结构。例如，二级结构可以通过测量在远UV区(190-250nm)中CD谱的形状和幅值并且将结果与已知结构的那些比较而确定。例如，如下文实施例5中所见，这可以在Jasco J-720旋光分光计上从178-250nm使用0.01cm的光程以1nm分辨率和带宽来进行。

在一个实施方案中，第一片段包含少于28%、25%、23%、20%、18%、15%、10%、或7%的α螺旋二级结构。在一个实施方案中，第二片段包含少于28%、25%、23%、20%、18%、15%、10%、或 7%的α螺旋二级结构。在进一步的实施方案中，第一片段和第二片段均包含少于28%、25%、23%、20%、18%、15%、10%、或7%的α螺旋二级结构。

在一个实施方案中，第一片段包含多于20%、25%、28%、30%、33%、35%、38%、40%、或42%的β折叠结构。在一个实施方案中，第二片段包含多于20%、25%、28%、30%、33%、35%、38%、40%、或42%的β折叠结构。在进一步的实施方案中，第一片段和第二片段均包含多于20%、25%、28%、30%、33%、35%、38%、40%、或42%的β折叠结构。

在一个实施方案中，第一近端在毒素A的重复部分V (SEQ ID NO:1的氨基酸2307-2440或它们在不同菌株中的等效物)、重复部分VI (SEQ ID NO:1的氨基酸2441-2553或它们在不同菌株中的等效物)、重复部分VII (SEQ ID NO:1的氨基酸2554-2644或它们在不同菌株中的等效物)或重复部分VIII (SEQ ID NO:1的氨基酸2645-2710或它们在不同菌株中的等效物)中。在进一步的实施方案中，第一近端在毒素A的重复部分VII (SEQ ID NO:1的氨基酸2554-2644或它们在不同菌株中的等效物)内。在进一步的实施方案中，第一近端在毒素A的重复部分VIII (SEQ ID NO:1的氨基酸2645-2710或它们在不同菌株中的等效物)内。

在一个实施方案中，第二近端在毒素B的重复部分I (SEQ ID NO:2的氨基酸1834-1926或它们在不同菌株中的等效物)、重复部分II (SEQ ID NO:2的氨基酸1927-2057或它们在不同菌株中的等效物)、或重复部分III (SEQ ID NO:2的氨基酸2058-2189或它们在不同菌株中的等效物)中。在进一步的实施方案中，第二近端在毒素B的重复部分II (SEQ ID NO:2的氨基酸1927-2057或它们在不同菌株中的等效物)内。在进一步的实施方案中，第二近端在毒素B的重复部分I (SEQ ID NO:2的氨基酸1834-1926或它们在不同菌株中的等效物)内。

在一个实施方案中，第一近端在长重复内。第一近端可以在毒素A的长重复V (SEQ ID NO:1的氨基酸2410-2440或它们在不同菌株中的等效物)内、或在毒素A的长重复VI (SEQ ID NO:1的氨基酸2523-2553或它们在不同菌株中的等效物)内、或在毒素A的长重复VII (SEQ ID NO:1的氨基酸2614-2644或它们在不同菌株中的等效物)内。

在一个实施方案中，第二近端在长重复内。第二近端可以在毒素B的长重复I (SEQ ID NO:2的氨基酸1897-1926或它们在不同菌株中的等效物)内、或在毒素B的长重复II (SEQ ID NO:2的氨基酸2028-2057或它们在不同菌株中的等效物)内、或在毒素B的长重复III (SEQ ID NO:2的氨基酸2160-2189或它们在不同菌株中的等效物)内。

在进一步的实施方案中，第一近端和第二近端均在长重复内。在一个实施方案中，第一近端在毒素A的长重复V (SEQ ID NO:1的氨基酸2410-2440或它们在不同菌株中的等效物)内、或在毒素A的长重复VI (SEQ ID NO:1的氨基酸2523-2553或它们在不同菌株中的等效物)内、或在毒素A的长重复VII (SEQ ID NO:1的氨基酸2614-2644或它们在不同菌株中的等效物)内，并且第二近端在毒素B的长重复I (SEQ ID NO:2的氨基酸1897-1926或它们在不同菌株中的等效物)内、或在毒素B的长重复II (SEQ ID NO:2的氨基酸2028-2057或它们在不同菌株中的等效物)内、或在毒素B的长重复III (SEQ ID NO:2的氨基酸2160-2189或它们在不同菌株中的等效物)内。在一个实施方案中，第一近端在毒素A的长重复VII (SEQ ID NO:1的氨基酸2614-2644或它们在不同菌株中的等效物)内，并且第二近端在毒素B的长重复II (SEQ ID NO:2的氨基酸2028-2057或它们在不同菌株中的等效物)内。

在一个实施方案中，第一近端在毒素A的氨基酸2620-2660内。在一个实施方案中，第二近端在毒素B的氨基酸2030-2050内。在进一步的实施方案中，第一近端在毒素A的氨基酸2620-2660内，并且第二近端在毒素B的氨基酸2030-2050内。

在一个实施方案中，第一片段包含至少100、150、180、200、240、 250、280、300、330、350、380、 400、430、450、480、500或 530个氨基酸。在一个实施方案中，第二片段包含至少100、130、150、180、200、230、250、270、300、330、350、390、或400个氨基酸。

在一个实施方案中，多肽还包含接头。该接头可以在第一近端和第二近端之间，或者该接头可以将第一片段和/或第二片段的远端与进一步的氨基酸序列连接。

可以使用肽接头序列以分隔第一片段和第二片段。使用本领域熟知的标准技术将这样的肽接头序列整合入融合蛋白中。可以根据以下因素选择合适的肽接头序列：(1) 它们采用柔性延伸构象的能力；(2) 它们不能采用可以与第一片段和/或第二片段上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3) 缺少可以与Tox A和/或ToxB功能性表位相互作用的疏水性或带电残基。肽接头序列可包含甘氨酸(Gly)、天冬酰胺(Asn)和丝氨酸(Ser)残基。其他的近中性氨基酸诸如Thr和Ala也可用于接头序列中。可有效地用作接头的氨基酸序列包括公开于Maratea等人., Gene 40:39-46 (1985); Murphy等人., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262 (1986); 美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中的那些。接头序列的长度通常可以为1-约50个氨基酸。

在一个实施方案中，接头包含1-20、1-15、1-10、1-5、1-2、5-20、5-15、5-15、10-20、或10-15个氨基酸。在一个实施方案中，接头是甘氨酸接头，该接头可以包含多个连续甘氨酸残基(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、or 20) ，或者该接头可以包含一些甘氨酸残基和一些其他氨基酸诸(诸如丙氨酸)的残基。在进一步的实施方案中，接头包含单个甘氨酸残基。

在一个实施方案中，本发明的多肽是更大的融合蛋白的一部分。融合蛋白还可以包含编码进一步的蛋白抗原的免疫原性部分的氨基酸。例如，融合蛋白还可以包含获自或来源自选自以下的细菌的蛋白抗原的免疫原性部分：肺炎链球菌(S.pneumoniae)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、大肠杆菌(E.coli)、卡他莫拉氏菌(M.cattarhalis)、C.tetanii、白喉棒杆菌(C.diphtheriae)、百日咳杆菌(B.pertussis)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肠球菌(enterococci)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。在这种情况下，接头可以在第一片段或第二片段与蛋白抗原的进一步的免疫原性部分之间。

术语“其免疫原性部分”或“免疫原性片段”是指多肽的片段，其中该片段包含被细胞毒性T淋巴细胞、辅助T淋巴细胞或B细胞识别的表位。合适地，免疫原性部分将包含至少30％、合适地至少50％、尤其至少75％和具体至少90％ (例如95％或98％)的参考序列中的氨基酸。在一个实施方案中，免疫原性部分将包含参考序列所有的表位区。

与包含已知的艰难梭状芽孢杆菌多肽或片段的组合物相比，还期望包含本文所述的艰难梭状芽孢杆菌毒素A重复结构域片段和艰难梭状芽孢杆菌毒素B重复结构域片段的特定融合蛋白的根据本发明的免疫原性组合物提供改善的针对艰难梭状芽孢杆菌的免疫应答。

佐剂

本文公开的免疫原性组合物包括组合不含铝的佐剂的至少一种艰难梭状芽孢杆菌多肽。用不含铝或铝盐的佐剂(即，不含铝的佐剂或佐剂系统)配制多肽。

在某些实施方案中，用以脂质体的形式呈现的包含免疫活性皂苷级分的佐剂配制艰难梭状芽孢杆菌多肽。所述佐剂可以进一步包含脂多糖。所述佐剂可以包括QS21。例如，在一个实施方案中，所述佐剂含有脂质体制剂中的QS21。在一个实施方案中，所述佐剂系统包括3D-MPL和QS21。例如，在一个实施方案中，所述佐剂含有脂质体制剂中的3D-MPL和QS21。任选地，所述佐剂系统还含有胆固醇。在一个具体实施方案中，佐剂包括QS21和胆固醇。任选地，所述佐剂系统含有1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。例如，在一种特定佐剂系统中含有胆固醇、DOPC、3D-MPL和QS21。

在一个具体实例中，所述免疫原性组合物包括剂量中配制的佐剂，所述剂量包括：约0.1至约0.5 mg胆固醇；约0.25至约2 mg DOPC；约10 μg至约100 μg 3D-MPL；和约10 μg至约100 μg QS21。在一个进一步具体实例中，所述免疫原性组合物包括剂量中配制的佐剂，所述剂量包括：约0.1至约0.5mg胆固醇，约0.25至约2mg DOPC，约10 μg至约100 μg 3D-MPL，和约10 μg至约100 μg QS21。在一个进一步具体制剂中，将佐剂配制在剂量中，所述剂量包含约0.1至约0.5mg胆固醇，约0.25至约2mg DOPC，约10 μg至约70μg 3D-MPL，和约10 μg至约70μg QS21。在一种具体制剂中，将佐剂配制在单一剂量中，所述剂量含有：约0.25 mg胆固醇；约1.0 mg DOPC；约50 μg 3D-MPL；和约50 μg QS21。在其他实施方案中，将免疫原性组合物用分数剂量(即，作为前述单一剂量制剂的分数的剂量，诸如前述组分(胆固醇、DOPC、3D-MPL和QS21)的量的一半，前述组分的量的?，或前述组分的量的另一分数剂量(例如，1/3、1/6等))配制。

在一个实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物包括含有脂多糖和先前例如EP0671948中已经公开的皂树皂苷的组合的佐剂。该专利表明当脂多糖(3D-MPL)与皂树皂苷(QS21)组合时的强烈的协同作用。

佐剂可以进一步包含免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG)或载体。

特别适用于本发明的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是一种从南美洲的树木南美皂皮树分离的皂苷制剂，并且在1974年由Dalsgaard等人首先描述(“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)具有佐剂活性。已经通过HPLC分离了Quil A的纯化片段，其保留佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(EP 0 362 278)，所述片段例如QS7和QS21 (也称作QA7和QA21)。QS-21是一种来源于南美皂皮树的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+毒性T细胞(CTLs)、Th1细胞和占优势的IgG2a抗体应答，并且是本发明的背景下的优选皂苷。

在一个具体实施方案中，QS21是在其反应原性较低的组合物中提供的，其中用外源甾醇，诸如胆固醇对其进行猝灭。存在一些特定形式的反应原性较低的组合物，其中用外源胆固醇猝灭QS21。在一个具体实施方案中，皂苷/甾醇是脂质体结构的形式(WO 96/33739，实施例1)。在该实施方案中，脂质体合适地含有中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下合适地是非晶体，所述磷脂酰胆碱例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱。脂质体也可以含有带电脂质，其增加由饱和脂质组成的脂质体的脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况下，带电脂质的量合适地是1-20% w/w，优选5-10%。甾醇与磷脂的比例是1-50% (mol/mol), 合适地是20-25%。

合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化甾醇和胆固醇。在一个具体实施方案中，佐剂组合物包含胆固醇作为甾醇。这些甾醇是本领域已知的，例如，胆固醇在Merck Index, 第11版, page 341中被公开为动物脂肪中存在的天然甾醇。

当活性皂苷级分是QS21时，QS21:甾醇的比例典型地将是1:100-1:1 (w/w)的数量级，合适地是1:10-1:1 (w/w)，优选是1:5-1:1 (w/w)。存在合适过量的甾醇，QS21 :甾醇的比例是至少1:2 (w/w)。在一个实施方案中，QS21 :甾醇的比例是1:5 (w/w)。甾醇合适地是胆固醇。

在一个实施方案中，本发明提供包含60μg或更低、例如1至60μg的水平的免疫学活性皂苷(优选QS21)的免疫原性组合物的剂量。在一个实施方案中，免疫原性组合物的剂量包含近似约50 μg，例如45至55 μg，合适地46 – 54 μg或47至53 μg或48至52 μg或49至51 μg或50 μg/剂量的水平的QS21。

在另一个实施方案中，免疫原性组合物的剂量包含约25 μg，例如20 – 30 μg，合适地21 – 29 μg或22至28 μg或23至27 μg或24至26 μg或25 μg的水平的QS21。

在另一个实施方案中，免疫原性组合物的剂量包含约10 μg/剂量，例如5至15 μg，合适地6至14 μg，例如7至13 μg或8至12 μg或9至11 μg或10μg的水平的QS21。

具体地，0.5 ml疫苗剂量体积含有25 μg或50 μg QS21/剂量。具体地，0.5 ml疫苗剂量体积含有50 μg QS21/剂量。

脂多糖可以是脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。

3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以MPL的名称销售，并且在文件中称作MPL或3D-MPL。参见例如美国专利号4,436,727; 4,877,611; 4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-γ (Th1)表型的CD4+ T细胞应答。根据GB 2 220 211 A公开的方法可以生产3D-MPL。化学上，它是具有3、4、5或 6个酰化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。优选地，本发明的组合物中，采用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒径使得它可以通过0.22μm滤器进行灭菌过滤。此类制剂描述于WO 94/21292中。

本发明因此提供包含75μg或更低、例如1至60μg的水平的脂多糖(优选3D-MPL)的免疫原性组合物的剂量。在一个实施方案中，所述脂多糖以约50μg/剂量的量存在。

在一个实施方案中，免疫原性组合物的剂量包含约50 μg，例如45 – 55 μg，合适地46 – 54 μg或47至53 μg或48至52 μg或49至51 μg或50 μg的水平的3D-MPL。

在一个实施方案中，免疫原性组合物的剂量包含约25 μg，例如20 – 30 μg，合适地21 – 29 μg或22至28 μg或23至27 μg或24至26 μg或25 μg的水平的3D-MPL。

在另一个实施方案中，免疫原性组合物的剂量包含约10 μg，例如5至15 μg，合适地6至14 μg，例如7至13 μg或8至12 μg或9至11 μg或10μg的水平的3D-MPL。

在一个实施方案中，剂量的体积是0.5 ml。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物的体积是适于剂量的体积，所述体积是高于0.5 ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在进一步的实施方案中，人剂量是1 ml-1.5 ml。

具体地，0.5 ml疫苗剂量体积含有25 μg或50 μg 3D-MPL/剂量。具体地，0.5 ml疫苗剂量体积含有50 μg 3D-MPL/剂量。

根据本发明的任何方面的免疫原性组合物的剂量合适地是指人剂量。术语“人剂量”意指在适于人使用的体积中的剂量。通常，这是0.3至1.5 ml。在一个实施方案中，人剂量是0.5 ml。在一个进一步实施方案中，人剂量高于0.5 ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在一个进一步实施方案中，人剂量是1 ml至1.5 ml。

本发明的合适组合物是这样的组合物，其中最初在没有MPL的条件下制备脂质体(如WO 96/33739中所描述)，然后添加MPL，合适地作为小于100 nm颗粒或容易通过0.22 μm膜进行灭菌过滤的颗粒的小颗粒。因此，MPL不包含在囊泡膜中(称作MPL在外)。MPL包含在囊泡膜内(称作MPL在内)的组合物也形成本发明的一方面。包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素B片段的多肽可以包含在囊泡膜内或包含在囊泡膜外。

在一个具体实施方案中，QS21和3D-MPL以相同终浓度/剂量的免疫组合物存在。在该实施方案的一个方面，一个剂量的免疫原性组合物包含最终水平25 μg的3D-MP和25 μg的QS21或50 μg的3D-MPL和50 μg的QS21。

在一个实施方案中，所述佐剂包括水包油乳剂。例如，所述水包油乳剂可以包括并入可代谢油和额外的油相成分诸如母育酚的油相。水包油乳剂也可以含有水性组分，诸如缓冲盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)。此外，所述水包油乳剂通常含有乳化剂。在一个实施方案中，所述可代谢油是角鲨烯。在一个实施方案中，所述母育酚是α-生育酚。在一个实施方案中，所述乳化剂是非离子表面活性剂乳化剂(诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯，TWEEN80?)。在示例性实施方案中，水包油乳剂含有比率等于或小于1 (w/w)的角鲨烯和α生育酚。

水包油乳剂中的可代谢油可以以0.5-10mg的量存在。水包油乳剂中的母育酚可以以0.5 – 11 mg的量存在。水包油乳剂中的乳化剂可以以0.4 – 4 mg的量存在。

为了使任何水包油组合物适于人施用，乳剂系统的油相必须包含可代谢油。术语可代谢油的含义在本领域众所周知。可代谢可定义为“能够通过代谢被转化” (Dorland”s Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 第25版 (1974))。所述油可为任何植物油、鱼油、动物油或合成油，它们对受体是无毒的，且能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是常用的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，可包括商售油，诸如NEOBEE? (使用来自植物油来源的甘油和来自椰子油或棕榈仁油的中链脂肪酸(MCTs)制成的辛酸/癸酸甘油三酯)等。特别合适的可代谢油是角鲨烯。角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是一种不饱和油，其大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本发明的特别优选的油。角鲨烯是可代谢油缘于以下事实：其是胆固醇生物合成的中间体(Merck index, 第10版，登录号8619)。

合适地，可代谢油以0.5-10 mg，优选1-10、2-10、3-9、4-8、5-7或5-6 mg (例如，2-3、5-6或9-10mg)，具体约5.35 mg或约2.14mg/剂量的量存在于佐剂组合物中。

母育酚是本领域众所周知的，并且描述于EP0382271。合适地，母育酚是α-生育酚或其衍生物，诸如α-生育酚琥珀酸酯(也称作维生素E琥珀酸酯)。所述母育酚合适地以0.5-11 mg，优选1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6 mg (例如，10-11、5-6、2.5-3.5或1-3 mg)的量存在。在一个具体实施方案中，所述母育酚以约5.94 mg或约2.38mg/剂量的量存在。

水包油乳剂进一步包含乳化剂。所述乳化剂可以合适地是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。在一个具体实施方案中，所述乳化剂可以是聚山梨糖醇? 80 (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)或Tween? 80。

所述乳化剂合适地以0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或2-3 mg (例如0.4-1.2、2-3或4-5 mg)乳化剂的量存在于佐剂组合物中。在一个具体实施方案中，所述乳化剂以约0.97 mg或约2.425 mg的量存在。

在一个实施方案中，组合物中存在的特定组分的量是0.5ml人剂量中存在的量。在一个进一步实施方案中，所述免疫原性组合物是以适合于人剂量的体积，所述体积高于0.5 ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在一个进一步实施方案中，所述人剂量是1 ml至1.5 ml。

当所述佐剂呈液体形式并且与多肽组合物的液体形式组合时，人剂量中的佐剂组合物将是人剂量的预期最终体积的分数，例如人剂量的预期最终体积的近似一半，例如用于0.7ml 的预期人剂量的350 μl体积，或用于0.5 ml的预期人剂量的250 μl体积。当佐剂组合物与多肽抗原组合物组合以提供最终人剂量的疫苗时，将其稀释。此类剂量的最终体积当然将根据佐剂组合物的初始体积和添加至佐剂组合物的多肽抗原组合物的体积而变化。在一个替代实施方案中，液体佐剂用于重构冻干多肽组合物。在本实施方案中，佐剂组合物的人剂量近似等于人剂量的最终体积。将液体佐剂组合物添加至含有冻干多肽组合物的小瓶。最终人剂量可以在0.5和1.5 ml之间变化。

产生水包油乳剂的方法对于本领域技术人员是众所周知的。通常，所述方法包括将含有母育酚的油相与表面活性剂诸如PBS/聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯溶液混合，随后使用均质器均化。对于本领域技术人员将清楚的是，包括使混合物穿过注射针两次的方法将适合于均质小体积的液体。同样地，微流化器中的乳化过程(M110S微流体机器，最大50次穿过，在6巴(约850巴的输出压力)的最大压力输入持续2分钟的期间)可以由本领域技术人员调整以产生更小或更大体积的乳剂。所述调整可以通过常规实验实现，所述常规实验包括测量所得乳剂，直到用所需直径的油滴实现制备。

在水包油乳剂中，油和乳化剂应该在水性载体中。水性载体可以是，例如，磷酸盐缓冲盐水。

优选地，本发明的水包油乳剂系统具有亚微米范围的小油滴粒径。合适地，小油滴直径大小在120-750 nm的范围内，更优选直径大小在120-600 nm的范围内。最优选地，水包油乳剂含有小油滴，其至少70% (以强度计)的直径低于500 nm，更优选至少80% (以强度计)的直径低于300 nm，更优选至少90% (以强度计)的直径在120-200 nm的范围内。

在一个实施方案中，免疫原性组合物不是与佐剂组合的3μg或10 μg的任何SEQ ID No.1至7，所述佐剂包含具有0.125 mL SB62乳剂(总体积)、5.35 mg角鲨烯、5.94 mg DL-α-生育酚和2.425 mg聚山梨醇酯80/0.5ml剂量的水包油乳剂。在一个实施方案中，免疫原性组合物不是与佐剂组合的3μg或10 μg的任何SEQ ID No.1至7，所述佐剂包含水包油乳剂5.35 mg角鲨烯、5.94 mg DL-α-生育酚和2.425 mg聚山梨醇酯80/0.5ml剂量。在一个实施方案中，免疫原性组合物不含有包含具有角鲨烯、DL-α生育酚和聚山梨醇酯80的水包油乳剂的佐剂。

免疫原性组合物和疫苗

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含额外抗原。在一个实施方案中，所述额外抗原是衍生自细菌的抗原，所述细菌选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、大肠杆菌、卡他莫拉菌、破伤风梭状芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、百日咳博代氏杆菌、表皮葡萄球菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以包含来自艰难梭状芽孢杆菌的进一步的抗原，例如S层蛋白(WO01/73030)。任选地，免疫原性组合物还包含来自艰难梭状芽孢杆菌的糖类。

还提供包含免疫原性组合物的疫苗。该疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。在本发明进一步的方面，提供包含本发明的免疫原性组合物和佐剂的疫苗。

可以通过经全身或粘膜途径施用包含本发明的免疫原性组合物的疫苗制剂，使用所述疫苗来保护对艰难梭状芽孢杆菌感染易感的哺乳动物或治疗患有艰难梭状芽孢杆菌感染的哺乳动物。这些施用可以包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或通过向口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道的粘膜施用。尽管本发明的疫苗可以作为单一剂量施用，但其组分也可以在同一时间或以不同次数一同共施用(例如，肺炎球菌糖缀合物可以单独、在疫苗的任何细菌蛋白组分施用的同一时间或其后1-2周施用，以协调对于彼此的免疫应答)。除了单一的施用途径之外，可以使用2种不同的施用途径。例如，糖类或糖缀合物可以肌内(IM)或皮内(ID)施用，并且细菌蛋白可以鼻内(IN)或皮内(ID)施用。此外，本发明的疫苗，对于初免剂量可以肌内施用，并且对于加强剂量，可以鼻内施用。

疫苗中毒素的含量通常将在1-250μg的范围内，任选5-50μg，最常见在5 - 25μg的范围内。初始接种后，受试者可以接受一次或适当分隔开的几次加强免疫。疫苗制剂通常描述于Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)中。在脂质体内封装由Fullerton的美国专利4,235,877描述。

在本发明的一个方面，提供疫苗试剂盒，其包括含有本发明的免疫原性组合物的小瓶，任选以冷冻干燥形式，并且还包括含有如本文描述的佐剂的小瓶。预想在本发明的该方面中，将使用佐剂来重构冷冻干燥的免疫原性组合物。

本发明的进一步的方面是预防或治疗艰难梭状芽孢杆菌感染的方法，其包括向受试者施用免疫保护性剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。在一个实施方案中，提供预防或治疗艰难梭状芽孢杆菌感染的原发性和/或复发事件的方法，其包括向受试者施用免疫保护性剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。

在一个实施方案中，所述受试者选自小鼠、兔、豚鼠、猴、非人灵长类动物或人。在一个实施方案中，所述受试者是小鼠。在一个进一步实施方案中，所述受试者是人。

本发明的进一步的方面是用于治疗或预防由艰难梭状芽孢杆菌引起的感染或疾病的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。在一个实施方案中，提供用于治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病的原发性和/或复发事件的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。

本发明的进一步的方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在制造用于治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供用于制造用于治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病的原发性和/或复发事件的药物的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。

“艰难梭状芽孢杆菌疾病”是指由艰难梭状芽孢杆菌释放的毒素引起的任何感染或疾病。艰难梭状芽孢杆菌疾病的实例是抗生素相关的腹泻(AAD)、伪膜性结肠炎和中毒性巨结肠症，其可以是威胁生命的。

将“左右”或“大约”定义为关于本发明的目的的给定数值的10％或多或少之内。

在每一种情况下，本发明人意在本文的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprises)”可以任选地分别被术语“由……组成(consisting of)”、“由……组成(consist of)”和“由……组成(consists of)”所替换。术语“包含(comprises)”表示“包括(includes)”。因此，除非上下文另外需要，将理解词语“包含(comprises)”及变式诸如“包含(comprise)”和“包含(comprising)”意指包括陈述的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或步骤，或化合物或步骤的组，但不排除任何其他的化合物、组合物、步骤、或其组。缩写“例如(e.g.)”来源于拉丁文例如(exempli gratia)，并用于本文以表示非限定性实例。因此，缩写“例如 (e.g.) ”与术语“例如(for example)”同义。

本文中涉及本发明的“疫苗”的实施方案也适用于涉及本发明的“免疫原性组合物”的实施方案，并且反之亦然。

除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学中普通术语的定义可以见于Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew等人. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9);和Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。

除非上下文明确另有说明，单数术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。类似地，除非上下文明确另有说明，词语“或”旨在包括“和”。术语“复数”是指两个或更多。还应理解对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小、和所有分子量(molecular weight)或分子量(molecular mass)值均是估算值，并且提供用于说明。此外，关于物质(诸如多肽抗原)的浓度或水平给出的数值界限可以是近似的。

本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请以其整体通过引用并入本文。

下文记载的这些实施例仅用于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

将理解的是，本文描述的特定方面和实施方案通过说明的方式而不是作为本发明的限制来显示。本发明的主要特征可以在各种实施方案中采用，而不脱离本发明的范围。本领域技术人员将认识到或者能够使用常规研究确定本文所述的特定方法的许多等同方案。此类等同方案被视为在本发明的范围内，并且被权利要求所覆盖。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明本发明涉及的本领域技术人员的技能的水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物或专利申请被具体且单独地指明通过引用并入。本文中提到的所有文件都在可允许的最大程度上通过引用并入。

当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时使用词语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”意指“一个/种(one)”，但它也与“一个/种或多个/种(one or more)”、 “至少一个/种(at least one)”和“一个/种或多于一个/种(one or more than one)”的含义一致。

本发明将参考以的非限制性图表和实施例进一步描述。

实施例

实验中使用的佐剂：

佐剂A

具有50 μg以脂质体的形式呈现的QS21、50 μg 3D-MPL、0.25 mg胆固醇和1.0 mg DOPC/0.5ml剂量的佐剂。适合于免疫仓鼠的50μl的剂量含有5μg QS21、5μg 3D-MPL、0.025mg胆固醇和0.1mg DOPC。

佐剂B

由具有0.125 mL SB62乳剂(总体积)、5.35 mg角鲨烯、5.94 mg DL-α-生育酚和2.425 mg聚山梨醇酯80/0.5ml剂量的水包油乳剂组成的佐剂。50μl剂量含有0.0125ml SB62乳剂(总体积)、0.535mg角鲨烯、0.594mg DL-α生育酚和0.2425 mg聚山梨醇酯80。

佐剂C

具有25 μg以脂质体的形式呈现的QS21、25 μg 3D-MPL、0.25 mg胆固醇和1.0 mg DOPC的佐剂。50μl剂量含有2.5μg QS1`、2.5μg 3D-MPL、0.025mg胆固醇和0.1mg DOPC。

GSK佐剂AS04D

具有50μg MPL和0.5mg (总共Al ³⁺ )/0.5ml剂量的佐剂。50μl的剂量含有5μg MPL和50μg (总共AL ³⁺ )。

明矾

具有500μg氢氧化铝/0.5ml剂量的佐剂。适合于仓鼠免疫的50μl的剂量含有50μg/50μg剂量。

方案

抗ToxA和抗ToxB ELISA应答：实施例2至4、7和8的方案

将磷酸盐缓冲盐水(PBS)中2 μg/ml (对于ToxA)或1 μg/ml (对于ToxB)的ToxA或ToxB片段(对于实施例2和4 - ToxA (2121-2686)和ToxB (1968-2366)，对于实施例3、5、6、7和8 - ToxA (2387-2706)和ToxB (1750-2360))在4℃在高结合微量滴定板(Nunc MAXISORP^TM)上包被过夜。将板在室温在摇动的情况下用PBS+1%牛血清白蛋白(BSA)封闭30分钟。将仓鼠或小鼠血清在PBS-BSA0.2%-TWEEN^TM 0.05%中1/100 (对于剂量I后或剂量II后样品)或1/500 (对于剂量III后样品)预稀释，然后，在微孔板中进行2次进一步两倍稀释，且在室温(RT)孵育30分钟。洗涤后，结合的仓鼠或小鼠抗体使用在PBS-BSA0.2%-tween 0.05% (“检测抗体”)中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories Inc. 过氧化物酶缀合的抗小鼠(ref:110-035-003)或抗仓鼠(ref:107-035-142)检测。检测抗体在20℃在摇动的情况下孵育30分钟。使用4 mg邻苯二胺(OPD) + 5 μl H₂O₂/10 ml pH 4.5 0.1M柠檬酸缓冲液在黑暗中在室温显色15分钟。用50 μl HCl停止反应，且读取在490 nm相对于620 nm的光学密度(OD)。

每个个别血清中存在的抗ToxA或抗ToxB抗体的水平通过与添加至各板的参考血清(针对Jackson Global IgG校准)的比较来确定，并且以μg/ml表示。对于仓鼠或小鼠免疫的各处理组中的样品，使用Excel软件计算几何平均滴度GMT。

实施例1

五种艰难梭状芽孢杆菌ToxA-ToxB融合蛋白的设计

设计包含ToxA和ToxB的C端重复结构域的片段的融合蛋白(也称为 “融合体”)。这些融合蛋白包含ToxA的C端重复结构域的片段和ToxB的C端重复结构域的片段，和ToxA片段的C端与ToxB片段的N端之间的连接。设计两种策略，在第一种策略中；设计融合体从而在两条片段之间的连接处保持长螺线管结构。在第二种策略中，融合体的两条片段由接头分隔开，以允许它们独立的正确折叠。

ToxA和ToxB的C端部分由重复序列构成：短重复(SR)和长重复(LR) (PNAS 2005 vol 102 : 18373-18378)。

已描述了ToxA的C端结构域的部分已知的3D结构 (PNAS 2005 Greco等人., vol 102 : 18373-18378 ; Nature Structural & Molecular biology 2006 vol 13(5) : 460-461 ; PDB codes : 2F6E, 2G7C and 2QJ6)。

本发明人预测在ToxA和ToxB的C端部分的残基之间存在两种重要的相互作用。第一种相互作用发生包含在LR及其在前的SR中的残基之间，并且对于维持螺线管类结构是重要的。第二类相互作用发生包含在LR和随后的SR中的残基之间，并且该相互作用介导毒素的碳水化合物结合功能。

定义新的“结构-功能”重复SR-LR-SR。该重复的结构在设计的融合体中保持完整。

ToxA和ToxB重复的短重复(SR)和长重复(LR)的位置显示于表1中。

ToxA和ToxB的C端结构域中包含的“SR-LR-SR”盒的列表显示于下表2中。

最后，两个LRs之间的SRs数目维持在设计的融合体中，以保持长螺线管类结构。

在设计用于融合体的连接之前，定义两种工作假设：第一种假设，融合体越短，融合体在表达过程中稳定的可能性越大；第二种假设，根据“SR-LR-SR”盒的概念，必须选择起始位置以确保该之前定义的SR-LR-SR盒的第一个SR的正确折叠。因此，融合体在位于SR-LR-SR盒之前的SR的起始处起始。使用这两种假设，分析了三个起始位置：ToxA的残基2370、2234和2121。

排除了起始位置2370。由于涉及对于蛋白结构稳定性重要的相互作用的残基之一不是保守的，所以还排除了起始位置2234。因此，决定所有设计的融合体将在ToxA的残基2121处起始。

所有融合体将在ToxB的最后一个残基处结束。

设计四个融合体(F1-4)以维持在两个融合片段之间的长螺线管类结构中的完整融合。

使用相同的假设设计融合体1(F1)和2(F2)。已经使用多重比对软件比较了ToxA和ToxB的所有SR蛋白序列(ClustalW - Thompson JD等人. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680)。更相似的序列为ToxA的第三个SR VIII和ToxB的第三个SR II和ToxB的第三个SR III。为了在ToxB的这两个SR之间做出选择，使用部分的ToxA C端结构域的已知3D结构(PDB代号：2QJ6)在ToxB的C端部分上进行结构同源性建模(使用SwissModel 界面- Arnold K等人. (2006) Bioinformatics, 22, 195-201)。使用ToxA的第三个SR VIII，用ToxB的第三个SR II获得了最佳局部结构叠加(使用SwissPDBViewer进行 - Guex N等人. (1997), Electrophoresis 18, 2714-2723)。因此，设计了两个连接：第一个在ToxA的第三个SR VIII和ToxB的第四个SR II之间(F1)，并且第二个在ToxA的第二个SR VIII和ToxB的第三个SR II之间(F2)。

为了设计融合体3 (F3)，在ToxA的部分C端结构域的已知结构和ToxB的C端结构域的预测结构之间进行整体结构叠加(使用SwissModel和SwissPDBViewer软件)。在ToxA的LR VII和ToxB的LR II之间发现最佳叠加。因此，决定在该类似的LR中产生连接。首先在其中ToxA和ToxB之间的序列是保守的区域中进行连接，随后为了保持融合体的ToxA部分，残基与在前的SR相互作用，并且最后，为了保持ToxB部分，残基与随后的SR相互作用。

对于融合体4 (F4)的设计，将ToxB的C端结构域分为4个片段并且在它们上进行更精确的同源性建模(SwissModel)。实现该分裂(split)以保持“SR-LR-SR”盒完整(每一结构域在跟随LR的SR的末端处结束)。进行这些片段的预测结构和ToxA的已知3D结构之间的结构叠加，并且对于ToxB的第三个SR (SR I)和ToxA的最后一个SR (第三个SR VIII)获得了最佳结构叠加。因此，在ToxA的第二个SR VIII和ToxB的第三个SRI之间完成了连接。

设计最后一个融合体(F5)以允许融合体的两个片段的独立的正确折叠。在ToxA蛋白序列的最后一个残基和ToxB的第四个SR II的起始之间添加接头(始终考虑完整的“SR-LR-SR”盒的重要性)。添加仅一个外源残基(甘氨酸)作为接头并且位于两个现存的甘氨酸之间。因此，还可以将接头描述为由已知的(对于ToxA)和预测的(对于ToxB) β链环绕的3个甘氨酸构成。

实施例2

用F2融合蛋白免疫仓鼠：佐剂A、无QS21的佐剂A或无MPL的佐剂A，和与佐剂B、明矾或未佐剂化制剂的比较。

16只仓鼠(雄性和雌性的混合)的组在第0、14和28天用50μl佐剂A、无MPL的佐剂A、无QS21的佐剂A、佐剂B、明矾佐剂化或未佐剂化的1μg F2融合蛋白IM免疫。

在第41/42天(第III次免疫后)收集的个别血清中测定抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。结果描述于表3和4和图1和2。

表 3：ELISA抗ToxA：个体第42天血清上的浓度(μg/ml)

CI=置信区间

St Dev=标准偏差。

表 4：ELISA抗ToxB：个体第42天血清上的浓度(μg/ml)

图1和2

图1的结果：

F2用全佐剂A、无QS21的类似制剂或无MPL的类似制剂注射。

对于抗ToxA响应，MPL和QS21两者均具有附加价值，即使QS21似乎是最有效的。

对于抗ToxB响应，MPL的作用不太明显的，而QS21去除对IgG滴度具有激烈作用。

图2的结果：

关于佐剂比较，与明矾、佐剂B或未佐剂化的制剂相比，佐剂A诱导显著更高的抗ToxA和抗ToxB抗体。与未佐剂化的制剂相比，佐剂B诱导更高的抗ToxA和抗ToxB抗体。

实施例3

Pims 20110544 –用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫雄性仓鼠

10只雄性仓鼠的组在第0、14和28天用50μl剂量的佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C佐剂化的0.3 μg、1μg或3 μg的F2融合蛋白IM免疫。

从第13天(第I次免疫后)、第27天(第II次免疫后)、第42天(第III次免疫后14天)和第84天(第III次免疫后56天)收集的个别血清测量抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。

Pims 20110545 –用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C中配制的F2融合蛋白的剂量范围免疫雌性仓鼠

10只雌性仓鼠的组在第0、14和28天用佐剂B、AS04D、佐剂A或佐剂C佐剂化的0.3 μg、1μg或3 μg的F2融合蛋白IM免疫。

从第13天(第I次免疫后)、第27天(第II次免疫后)、第42天(第III次免疫后14天)和第84天(第III次免疫后56天)收集的个别血清测量抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。

图3至7

Pims 20110544和20110545

表 5：第I次免疫后抗ToxA ELISA滴度(几何平均滴度或GMT)

表 6：第I次免疫后抗ToxB ELISA滴度(GMT)

表 7：第II次免疫后抗ToxA ELISA滴度(GMT)

表 8：第II次免疫后抗ToxB ELISA滴度(GMT)

表 9：第III次免疫后第42天抗ToxA ELISA滴度(GMT)

表 10：第III次免疫后第42天抗ToxB ELISA滴度(GMT)

表 11：第III次免疫后第84天抗ToxA ELISA滴度(GMT)

表 12：第III次免疫后第84天抗ToxB ELISA滴度(GMT)

实施例4

Pims 20120011和20120008 –用明矾、佐剂A中配制的或未佐剂化的F2融合蛋白或毒素A和毒素B片段的混合物免疫仓鼠。

8只雌性和8只雄性仓鼠的组在第0、14和28天用明矾、佐剂A中配制的或未佐剂化的1 μg F2融合蛋白、具有多His标签的F2融合体(F2-His标记的)或C-terToxA (2387-2706) (0.6μg)+C-terToxB (1750-2360) (0.4μg)的混合物IM免疫。

在第13天、第27天和第42天(第III次免疫后)收集的个别血清中测定抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。图8

表 13

表 14

几何平均值=几何平均滴度。

结果：

在用F2融合蛋白和还有用ToxA和ToxB的混合物免疫后诱导了抗ToxA和抗ToxB抗体。与其他制剂相比，佐剂A诱导显著更高的ELISA滴度。

实施例5

用Tox A或Tox B片段和ToxA-ToxB融合体免疫小鼠

图9至12

Balb/C小鼠用实施例1中描述的构建体免疫。

15只雌性Balb/c小鼠的组在第0、14和28天用佐剂B佐剂化的3μg或10 μg ToxA和ToxB (ToxA C-term (2387-2706) (0.6μg)+C-terToxB (1750-2360)的分别片段以及ToxA-ToxB融合蛋白IM免疫。10只小鼠的对照组用单独的佐剂B接种。

在第42天(第III次免疫后)收集的个别血清中测定抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。

在混合的第III次免疫后血清中测定血细胞凝集抑制滴度。

抗ToxA和抗ToxB ELISA应答：方案

将磷酸盐缓冲盐水(PBS)中1 μg/ml (对于ToxB片段)或2 μg/ml (对于ToxA片段)的ToxA或ToxB片段的样品在4℃在高结合微量滴定板(Nunc MAXISORP^TM)上包被过夜。将板在室温在摇动的情况下用PBS-BSA 1%封闭30分钟。将小鼠抗血清在PBS-BSA0.2%-TWEEN^TM 0.05%中1/1000预稀释，然后，在微孔板中进行进一步两倍稀释，且在室温在摇动的情况下孵育30分钟。洗涤后，结合的鼠抗体使用在PBS-BSA0.2%-tween 0.05%中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories Inc. 过氧化物酶缀合的affiniPure山羊抗小鼠IgG (H+L) (ref:115-035-003)检测。检测抗体在20℃在摇动的情况下孵育30分钟。使用4 mg邻苯二胺(OPD) + 5 μl H₂O₂/10 ml pH 4.5 0.1M柠檬酸缓冲液在黑暗中在室温显色15分钟。用50 μl HCl停止反应，且读取在490 nm相对于620 nm的光学密度(OD)。

血清中存在的抗ToxA或抗ToxB抗体的水平通过与参考血清的比较来以中点滴度表示。对于各处理组中的15个样品(对于对照组为10个样品)，计算GMT。

血细胞凝集抑制测定：方案

在96孔U底微量培养板中进行小鼠混合抗血清(25μl)在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的8次连续两倍稀释。

随后添加25 μl的天然的毒素A (0.2 μg/孔)并将板在室温下孵育30分钟。

孵育后，向每个孔中添加50 μl以2％稀释的纯化的兔红细胞。将板在37℃下孵育2小时。

对板进行目视分析，血细胞凝集显示为孔中弥散的红细胞，并且血细胞凝集抑制观察为孔中沉淀的红点。

将抑制滴度定义为抑制血细胞凝集的血清最高稀释度的倒数。

细胞毒性测定

在37℃和5% CO₂下，将IMR90成纤维细胞在Eagle氏最小必需培养基EMEM + 10%胎牛血清 + 1%谷氨酰胺 + 1%抗生素(青霉素-链霉素-两性霉素)中培养，并以5.10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中。

24小时后，从孔中去除100μl细胞培养基。

在细胞培养基中进行小鼠混合抗血清(50μl)的8次(对于实施例5中的实验)或12次(对于实施例6中的实验) 连续两倍稀释。

随后添加50 μl的天然毒素B (0.5ng/ml)，并将板在37℃和5% CO₂中孵育24小时。

在24小时后观察细胞，并测定变圆细胞的比例。

将抑制滴度定义为抑制50％的细胞变圆的血清最高稀释度的倒数。

结果：

用单独ToxA片段免疫后诱导了抗Tox A抗体，而且使用5种融合体的每一种免疫后也诱导了抗Tox A抗体。

在血细胞凝集测定中检测这些抗体的功能特性。由于用ToxB没有观察到血细胞凝集，因此该测定仅适用于Tox A评价。

用抗Tox A片段血清或针对ToxA-ToxB融合体的每一种的血清，观察到了血细胞凝集抑制。

还进行了使用ToxB抗体的ELISA。用单独ToxB片段免疫后诱导抗Tox B抗体，而且使用F2、F3和F4融合体免疫后也诱导抗Tox B抗体。

使用来自用ToxB片段或ToxA-ToxB融合体免疫的小鼠的血清获得的抑制滴度大于使用对照血清获得的抑制滴度。

实施例6

用Tox A-Tox B融合体免疫小鼠

25只雄性小鼠的组在第0、14和28天用佐剂B中配制的3 μg ToxA-ToxB融合蛋白或10 μg ToxA(6μg)+ToxB(4μg)的未佐剂化的混合物IM免疫。除了F2以外，还使用四种其他融合蛋白构建体，存在F54 Gly (SEQ ID NO:21)、F54 New (SEQ ID NO:23)、F5 ToxB (SEQ ID NO:25)和F52 New (SEQ ID NO:27)。

使用实施例5中描述的抗ToxA和抗ToxB ELISA应答：方案进行ELISA，除了此处将toxA或toxB片段的样品在磷酸缓冲盐溶液中以1 μg/ml包被在高结合微量滴定板上。如实施例5中所述进行血细胞凝集抑制测定，除了以2.5%稀释兔红细胞。

如实施例5中所述进行toxB细胞毒性测定，除了使用0.015μg/ml的浓度的50μl毒素B。如下所述进行进一步toxA细胞毒性测定。

在第42天(第III次免疫后14天)收集的个别血清中测定抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。图13和14

表 15

表 16

图15至17

如实施例5中所述进行血细胞凝集抑制测定。

如实施例5中所述进行toxB细胞毒性测定，除了进行小鼠混合的抗血清12次系列两倍稀释，而不是8次，并且在观察细胞之前，将板孵育过夜，而不是24小时。如下文描述进行进一步的toxA细胞毒性测定。

ToxA细胞毒性测定

将HT29细胞在37℃用5%CO₂在DMEM +10%胎牛血清+1%谷氨酰胺+1%抗生素(青霉素-链霉素-两性霉素)中培养，并且以5.10⁴ 个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中。24小时后，将细胞培养基从孔中除去。小鼠混合的抗血清(50μl)的系列两倍稀释在细胞培养基中进行。

随后添加50 μl的天然毒素A (0.15ng/ml)并将板在37℃和5% CO₂中孵育48小时。在48小时后观察细胞，并测定变圆细胞的比例。抗ToxA ELISA、抗ToxB Elisa、血细胞凝集抑制和细胞毒性测定的结果描述于上述图13-17中。

实施例7

用未佐剂化的制剂中的艰难梭状芽孢杆菌ToxA-Cter、ToxB-Cter或融合蛋白免疫小鼠

15只雌性小鼠的组在第0、14、28和120天用1或3 μg ToxA C-ter、ToxB C-ter或ToxA-ToxB融合蛋白IM免疫。所有这些抗原在未佐剂化的制剂中注射。对照组(10只小鼠)用单独的NaCl注射。

从第28天(第II次免疫后)、第42天(第III次免疫后14天)、第120天(加强前87天)和第134天(第IV次免疫后14天)收集的个别血清测量抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。图18和19。

实施例8

用佐剂B中配制的艰难梭状芽孢杆菌ToxA-Cter、ToxB-Cter或融合蛋白免疫小鼠。

图20和21

15只雌性小鼠的组在第0、14、28和120天用1或3 μg ToxA C-term (氨基酸2387-2706)和ToxB C-term (氨基酸1750-2360)或ToxA-ToxB融合蛋白IM免疫。这些蛋白在佐剂B制剂中注射。

对照组(10只小鼠)用单独的佐剂B注射。

在第28天(第II次免疫后)、第42天(第III次免疫后14天)、第120天(第III次加强前87天或加强前)和第134天(第IV次免疫后14天)收集的个别血清中测定抗ToxA和抗ToxB ELISA滴度。

表 19

表 20

实施例9

融合蛋白的克隆表达和纯化

表达质粒和重组菌株

使用标准方法，用NdeI/XhoI限制位点将编码ToxA和ToxB的部分C端结构域的融合蛋白(SEQ ID NO:3、4、5、6和 7)和His标签的基因克隆入pET24b(+)表达载体(Novagen)中。按照使用CaCl₂处理的细胞的标准方法，用重组表达载体通过转化大肠杆菌菌株BLR (DE3)产生最终构建体(Hanahan D. ? Plasmid transformation by Simanis. ? In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。

宿主菌株：

BLR(DE3)。BLR是BL21的recA衍生物。具有命名(DE3)的菌株对于包含IPTG诱导型T7 RNA聚合酶的λ原噬菌体是溶原的。设计λ DE3溶原体用于来自pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT蛋白酶。

基因型：大肠杆菌BLR::DE3菌株，F^- ompT hsdS _B(r_B ^- m_B ^-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 (Tet^R)

重组蛋白的表达：

从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT肉汤培养基±1% (w/v)葡萄糖+卡那霉素(50 μg/ml)，以获得0.1-0.2之间的O.D.600nm。在37℃，250 RPM下过夜孵育培养物。

将该过夜培养物稀释在500 ml的含有卡那霉素(50 μg/ml)的LBT培养基中至1:20，并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.620达到0.5/0.6。

在O.D.600nm为0.6左右时，将培养物冷却下来，随后通过添加1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG；EMD Chemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达，并在23℃，250 RPM下过夜孵育。

过夜诱导后(16个小时左右)，评估诱导后的O.D._600nm，并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟，并将沉淀分离地冷冻于-20℃。

纯化：

在包含500 mM NaCl和蛋白酶抑制剂的混合物(完全的，Roche)的20 mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)中重悬细菌沉淀。使用French Press系统20 000 PSI裂解细菌。通过离心例如在4℃下以20 000g 30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。

在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶组分装载到使用与用于细菌重悬相同的缓冲液预平衡的GE柱(例如15 ml) (装载Ni的)上。在装载上柱后，将柱用相同缓冲液洗涤。使用含有500 mM NaCl和不同浓度的咪唑(5-600 mM)的20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)进行洗脱。凝胶分析后，选择更纯的级分，浓缩并装载到SEC层析上用于进一步的纯化步骤。

通过SDS-PAGE根据纯度选择含有融合蛋白的级分，并对N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(20mM N-二(羟乙基)甘氨酸、150 mM NaCl，含有或不含有5mM EDTA pH8.0)透析，使用BioRad的DC Protein Assay测定蛋白浓度。这样将蛋白混合，在0.22 μm上无菌过滤，保存于-80℃。

或者，在IMAC纯化之前，进行DEAE纯化步骤，所述DEAE纯化步骤使用用于装载和洗涤的2mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)，并使用相同缓冲液但添加1M NaCl的梯度洗脱。

实施例10

分离的艰难梭状芽孢杆菌Tox A和Tox B片段的克隆表达和纯化

表达质粒和重组菌株。

使用标准方法，用NdeI/XhoI限制位点将编码ToxA和ToxB的蛋白片段(SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)和His标签的基因克隆入pET24b(+)表达载体(Novagen)中。按照使用CaCl₂处理的细胞的标准方法，用重组表达载体通过转化大肠杆菌菌株BLR (DE3)产生最终构建体(Hanahan D. ? Plasmid transformation by Simanis. ? In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。

宿主菌株：

BLR(DE3)。BLR是BL21的recA衍生物。具有命名(DE3)的菌株对于包含IPTG诱导型T7 RNA聚合酶的λ原噬菌体是溶原性的。设计λ DE3溶原体用于来自pET载体的蛋白表达。该菌株也缺乏lon和ompT蛋白酶。

基因型：大肠杆菌BLR::DE3菌株， F^- ompT hsdS _B(r_B ^- m_B ^-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 (Tet^R)

重组蛋白的表达：

从琼脂板上刮下大肠杆菌转化子并用于接种200 ml的LBT肉汤培养基±1% (w/v)葡萄糖+卡那霉素(50 μg/ml)，以获得0.1-0.2之间的O.D._600nm。在37℃，250 RPM下过夜孵育培养物。

在500 ml的含有卡那霉素(50 μg/ml)的LBT培养基中将该过夜培养物稀释至1:20，并且在37℃下以250 rpm的转速生长直到O.D.₆₂₀达到0.5/0.6。

在600nm处的O.D.为0.6左右时，将培养物冷却下来，随后添加1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG; EMD Chemicals Inc., 目录号: 5815)诱导重组蛋白的表达，并在23℃，250 RPM下过夜孵育。

过夜诱导后(16个小时左右)，评估诱导后的600nm处的O.D.，并且以14 000 RPM将培养物离心15分钟，并将沉淀分离地冷冻于-20℃。

纯化：

在包含500 mM NaCl并添加有蛋白酶抑制剂(完全的，但无EDTA，Roche目录11873580001)和核酸酶(benzonase)(Roche目录1.01695.0001)的混合物的20 mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)中重悬细菌沉淀。使用French Press系统2 X 20 000 PSI裂解细菌。通过在4℃下以34 000g或48 000g离心25-30分钟分离可溶(上清液)和不可溶(沉淀)组分。收集上清液并在0.22 μm滤器上过滤。

在IMAC上在非变性条件下纯化6-His标签化的蛋白。将可溶组分装载到使用与用于细菌重悬相同的缓冲液预平衡的GE柱(例如15 ml) (装载Ni的)上。装载后，将柱用相同缓冲液洗涤。

对于ToxA：

使用含有500 mM NaCl和不同浓度的咪唑(5-100 mM)的20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)进行洗脱。凝胶分析后，选择更纯的级分，浓缩并装载到SEC层析(SUPERDEX^TM 75)上，用于在无咪唑的相同缓冲液中进一步的纯化步骤。

对于ToxB：

用含有500 mM NaCl和0.5%脱氧胆酸的20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)或含有150 mM NaCl的相同缓冲液进行第二次洗涤。使用含有500 mM NaCl和不同浓度的咪唑(10-500 mM)的20mM N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)进行洗脱。凝胶分析后，选择更纯的级分，添加5 mM EDTA并装载到SEC层析(SUPERDEX^TM 200)上，用于在含有5 mM EDTA的相同缓冲液中进一步的纯化步骤。

通过SDS-PAGE根据纯度选择含有ToxA或ToxB片段的级分，并对N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(20mM N-二(羟乙基)甘氨酸、150 mM NaCl，pH8.0)透析，使用BioRad的RCDC Protein Assay测定蛋白浓度。因此，将蛋白混合，在0.22 μm上无菌过滤，保存于-80℃。

实施例11

五种艰难梭状芽孢杆菌ToxA-ToxB融合体的分子量评价

使用分析超速离心，通过测量分子响应离心力而移动的速率来确定蛋白样品中不同种类在溶液中的同质性和大小分布。这基于通过沉降速度实验获得的不同种类的沉降系数的计算结果，其依赖于它们的分子形状和质量。

1. AN-60Ti转子已经被平衡至15℃后，将蛋白样品在Beckman-Coulter PROTEOMELAB^TM XL-1分析超速离心机中以42 000RPM旋转。

a. F1融合蛋白， 500μg/ml, 20mM N-二(羟乙基)甘氨酸，150mM NaCl, pH8,0

b. F2融合蛋白， 500μg/ml, 20mM N-二(羟乙基)甘氨酸，150mM NaCl, pH8,0

c. F3融合蛋白， 500μg/ml, 20mM N-二(羟乙基)甘氨酸，150mM NaCl, pH8,0

d. F4融合蛋白，500μg/ml, 20mM N-二(羟乙基)甘氨酸，150mM NaCl, pH8,0

e. F5融合蛋白， 500μg/ml, 20mM N-二(羟乙基)甘氨酸，150mM NaCl, pH8,0。

2. 对于数据采集，在280nm处每5分钟记录160次扫描。

3. 使用程序SEDFIT进行数据分析来测定C(S)分布。用SEDNTERP软件从它们的氨基酸序列进行蛋白的微分比容的测定。SEDNTERP也用于测定缓冲液的粘度和密度。

4. 考虑到与C(M)分布(浓度相比于分子量)相比，原始数据是表征混合物的大小分布的更好的表示法，所以从C(S)分布曲线(浓度相比于沉降系数)中测定不同种类的分子量。从所有五种ToxA-ToxB融合蛋白的C(S)分布检测到的主要种类的分子量对应于它们的单体形式。对五种融合体测定到的最佳拟合摩擦比率均在2-2.2之间。这可以说明蛋白以伸长形式存在于溶液中，这可以是与蛋白结构一致的。

实施例12

通过圆二色性和荧光光谱学评价艰难梭状芽孢杆菌ToxA-ToxB融合体的二级结构和三级结构

使用圆二色性，通过测量由于结构不对称而产生的左旋偏振光相对于右旋偏振光的吸收差异来确定蛋白的二级结构组成。蛋白展示出β折叠、α螺旋还是随机卷曲结构，在远UV区(190-250nm)中的CD光谱的形状和幅值是不同的。给定蛋白样品中的每一种二级结构类型的相对丰度可以通过与参考光谱比较来计算。

蛋白样品的三级结构可以通过评价芳香族氨基酸的固定化来评定。在近UV区(250-50nm)中观察到CD信号可以归因于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基的极化，并且是蛋白折叠为完全确定的结构的良好指示。

使用以下方案：

1. 在Jasco J-720旋光分光计上从178-250nm使用0.01cm的光程以1nm分辨率和带宽测量远UV光谱。通过Peltier恒温的RTE-111细胞模块保持细胞的温度为23℃。在测定过程中保持10L/分钟的氮气流。

2. 在Jasco J-720旋光分光计上从250-300nm使用0.01cm的光程以1nm分辨率和带宽测量近UV光谱。通过Peltier恒温的RTE-111细胞模块保持细胞的温度为23℃。在测量过程中保持6L/分钟的氮气流。

对所有五种ToxA-ToxB融合蛋白的远UV光谱(图22)的观察表明低含量的α螺旋结构和高含量的β折叠结构。而且，所有蛋白均在230nm处展示出最大值，其对于可溶性球状蛋白而言是不常见的。这种特性已在文献中得到深入表征，并且与已知缺乏α螺旋及具有高含量的β折叠和芳香族氨基酸的一小类的蛋白相关(Zsila, Analytical Biochemistry,391( 2009) 154-156)。那些特性与对ToxA-ToxB融合蛋白预期的结构是一致的。比较了在230nm处展示出具有阳性信号的特征CD光谱的13个蛋白的晶体结构(Protein Data Bank)。那些蛋白的平均二级结构含量为42% β折叠±9%和7% α螺旋±6%。这有力地说明ToxA-ToxB融合蛋白的光谱特征是含有高β折叠和低α螺旋的蛋白的诊断结果。

对所有五种融合蛋白的近UV光谱的形状(图23)的观察说明至少某些芳香族氨基酸是固定的，其是紧密且特异的三级结构的有力指示。此外，用变性浓度的尿素处理蛋白导致近UV信号的消失，其是该特征光谱归因于蛋白折叠的另一个指示。

实施例13

4个进一步的融合蛋白的设计、克隆、表达和纯化

使用实施例1中描述的设计原则设计四个进一步的融合蛋白，将它们命名为F54 Gly (SEQ ID NO:21)、F54 New (SEQ ID NO:23)、F5 ToxB (SEQ ID NO:25)和F52 New (SEQ ID NO:27)。

按照实施例9中描述的方案表达这些融合蛋白。

实施例14

SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO: 27中描述的艰难梭状芽孢杆菌ToxA-ToxB融合体的分子量的评价

如实施例11中所描述测定SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27中描述的融合体的分子量。

从SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27中描述的所有四个蛋白融合体的C(S)分布测定的主要种类的分子量对应于它们的单体形式，并且所有蛋白均展示出与F1-F5融合体类似的沉降特性。

实施例15

SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:1525和SEQ ID NO:27中描述的艰难梭状芽孢杆菌ToxA-ToxB融合体的二级结构和三级结构的评价

按照实施例5中描述的方法评价SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27中描述的融合体的二级结构和三级结构。对这些融合蛋白的远UV CD可以见于图24中，并且对这些融合体的近UV光谱可以见于图25中。

SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, and SEQ ID NO:27中描述的蛋白的近和远UV CD光谱分析显示相比F1-F5融合体，所有四个均具有同样高的β折叠结构。此外，近UV光谱观察显示，相比于F1-F5融合体，在三级结构中芳香族氨基酸的位置没有显著差异。

Claims (103)

1.免疫原性组合物，其包含：

a) 包含分离的艰难梭状芽孢杆菌毒素A片段和/或分离的艰难梭状芽孢杆菌毒素B片段的多肽；和

b) 包含以脂质体的形式呈现的免疫活性皂苷级分的佐剂。

2.根据权利要求2的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含脂多糖。

3.根据权利要求1或权利要求2的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含甾醇，其中所述组合物包含皂苷：甾醇的比例为1:1至1:100 w/w的甾醇。

4.根据权利要求3的免疫原性组合物，其中皂苷：甾醇的比例为1:1至1:10 w/w。

5.根据权利要求4的免疫原性组合物，其中皂苷：甾醇的比例为1:1至1:5 w/w。

6.根据权利要求3-5中任一项的免疫原性组合物，其中所述甾醇是胆固醇。

7.根据权利要求1-6中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫活性皂苷级分是QS21。

8.根据权利要求2-7中任一项的免疫原性组合物，其中所述脂多糖是脂质A衍生物。

9.根据权利要求8的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。

10.根据权利要求9的免疫原性组合物，其中免疫活性皂苷级分是QS21，且比例QS21 :3D-MPL是1 :1 (w/w)。

11.根据权利要求2-10中任一项的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以约1 – 约70 μg/剂量的量存在。

12.根据权利要求11的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以约50μg的量存在。

13.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述皂苷以约1 – 约70 μg/剂量的量存在。

14.根据权利要求13的免疫原性组合物，其中所述皂苷以约50μg的量存在。

15.权利要求1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。

16.权利要求1-15中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含胆固醇、DOPC、3D-MPL和QS21。

17.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述佐剂配制在包含以下的剂量中：

约0.1至约0.5 mg胆固醇，

约0.25至约2 mg DOPC，

约10 μg至约70 μg 3D-MPL，和

约10 μg至约70 μg QS21。

18.权利要求17的免疫原性组合物，其中所述佐剂配制在包含以下的剂量中：

约0.25 mg胆固醇，

约1.0 mg DOPC，

约50 μg 3D-MPL，和

约50 μg QS21。

19.免疫原性组合物，包含：

a) 包含分离的艰难梭状芽孢杆菌毒素A片段和/或分离的艰难梭状芽孢杆菌毒素B片段的多肽；和

b) 包含水包油乳剂的佐剂，其中所述水包油乳剂包含可代谢油、母育酚和乳化剂。

20.如权利要求19中要求保护的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物不是与佐剂组合的3μg或10 μg的SEQ ID No.1至7中任一种，所述佐剂包含0.125 mL SB62乳剂(总体积)、5.35 mg角鲨烯、5.94 mg DL-α-生育酚和2.425 mg聚山梨醇酯80/0.5ml剂量，或由0.125 mL SB62乳剂(总体积)、5.35 mg角鲨烯、5.94 mg DL-α-生育酚和2.425 mg聚山梨醇酯80/0.5ml剂量组成。

21.根据权利要求19或权利要求20的免疫原性组合物，所述所述水包油乳剂包含1-10、2-10、3-9、4-8、5-7或5-6 mg可代谢油/剂量。

22.根据权利要求19-21中任一项的免疫原性组合物，其中所述水包油乳剂包含0.5-11、1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6 mg母育酚/剂量。

23.根据权利要求19-22中任一项的免疫原性组合物，其中所述水包油乳剂包含0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或2-3 mg乳化剂/剂量。

24.根据权利要求19-23中任一项的免疫原性组合物，其中组合物包含约5.35 mg/剂量的量的可代谢油。

25.根据权利要求19-23中任一项的免疫原性组合物，其中可代谢油的量为约2.14 mg/剂量。

26.根据权利要求19-25中任一项的免疫原性组合物，其中母育酚的量为约5.94 mg/剂量。

27.根据权利要求19-25中任一项的免疫原性组合物，其中母育酚的量为约2.38 mg/剂量。

28.根据权利要求19-27中任一项的免疫原性组合物，其中乳化剂的量为约2.425 mg/剂量。

29.根据权利要求19-27中任一项的免疫原性组合物，其中乳化剂的量为0.97 mg/剂量。

30.根据权利要求19-29中任一项的免疫原性组合物，其中可代谢油为角鲨烯。

31.如权利要求19-30中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述母育酚为α-生育酚。

32.如权利要求19-31中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述乳化剂为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

33.如权利要求32中要求保护的免疫原性组合物，其中所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯选自Polysorbate? 80或Tween? 80。

34.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有0.5至1.5 ml的体积。

35.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有0.5 ml的体积。

36.根据权利要求19-35中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有0.7 ml的体积。

37.根据权利要求19-35中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有1.0 ml的体积。

38.如前述权利要求中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述多肽包含艰难梭状芽孢杆菌毒素A重复结构域片段和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素B重复结构域片段。

39.如前述权利要求中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述多肽包含艰难梭状芽孢杆菌的毒素A的N端结构域和/或艰难梭状芽孢杆菌毒素B的N端结构域的片段。

40.如前述权利要求中任一项要求保护的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物中的多肽已被化学脱毒。

41.如权利要求40中要求保护的免疫原性组合物，其中所述化学脱毒是通过在甲醛中孵育。

42.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽包含毒素A重复结构域片段和毒素B重复结构域片段。

43.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽诱发中和毒素A或毒素B或两者的抗体。

44.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽是包含第一片段和第二片段的多肽，其中

(i) 所述第一片段是毒素A重复结构域片段；

(ii) 所述第二片段是毒素B重复结构域片段；

(iii) 所述第一片段具有第一近端；

(iv) 所述第二片段具有第二近端；并且

其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近。

45.根据权利要求44的免疫原性组合物，其中所述第一近端在短重复内。

46.根据权利要求44的免疫原性组合物，其中所述第二近端在短重复内。

47.根据权利要求44-46中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端不破坏短重复-长重复-短重复(SR-LR-SR)部分。

48.根据权利要求44-47中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二近端不破坏短重复-长重复-短重复(SR-LR-SR)部分。

49.根据权利要求44-46中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端和所述第二近端不破坏短重复-长重复-短重复(SR-LR-SR)部分。

50.根据权利要求44-45中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端不在毒素A (SEQ ID NO. 1)的氨基酸1878-1940、2012-2074、2146-2208、2258-2322、2394-2456、2507-2569或2598-2660内。

51.根据权利要求44-46中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二近端不在毒素B (SEQ ID NO. 2)的氨基酸1881-1942、2012-2074、2144-2208或2278-2339内。

52.根据权利要求44-51中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII (氨基酸2645-2710)内。

53.根据权利要求44-52中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710或2680-2690内。

54.根据权利要求44-53中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二近端在毒素B的重复部分I (氨基酸1834-1926)内。

55.根据权利要求44-54中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二近端在毒素B的氨基酸1860-1878或1854-1876内。

56.根据权利要求44-53中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二近端在毒素B的重复部分II (氨基酸1927-2057)内。

57.根据权利要求44-53或56中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970、1988-1998或1867-1877内。

58.根据权利要求44-51和54-57中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一片段由整个毒素A重复结构域(氨基酸1832-2710)组成。

59.根据权利要求44-53和58中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二片段由整个毒素B重复结构域(氨基酸1833-2366)组成。

60.根据权利要求52、53、54或55中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII (氨基酸2645-2710)内，且其中所述第二近端在毒素B的重复部分I (氨基酸1834-1926)内。

61.根据权利要求52、53、56或57中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII (氨基酸2645-2710)内，且其中所述第二近端在毒素B的重复部分II (氨基酸1927-2057)内。

62.根据权利要求52、53、56或57中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复3 (氨基酸2687-2710)内，且所述第二近端在毒素B的重复部分II 的短重复4(氨基酸1988-2007)内。

63.根据权利要求52、53、56或57中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复2 (氨基酸2665-2686)内，且所述第二近端在毒素B的重复部分II 的短重复3(氨基酸1968-1987)内。

64.根据权利要求52、53、54或55中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复2 (氨基酸2665-2686)内，且所述第二近端在毒素B的重复部分I 的短重复3(氨基酸1877-1896)内。

65.根据权利要求44-51、52、53、54、55和60中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复3 (氨基酸2645-2686)内，且所述第二近端在毒素B的重复部分I 的短重复1(氨基酸1834-1854)内。

66.根据权利要求52、53、56或57中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复3 (氨基酸2687-2710)内，且所述第二近端在毒素B的重复部分II 的短重复4(氨基酸1988-2007)内。

67.根据权利要求61的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710内，且所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970内。

68.根据权利要求61的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2680-2690内，且所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970内。

69.根据权利要求61的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710内，且所述第二近端在毒素B的氨基酸1988-1998内。

70.根据权利要求61的免疫原性组合物，其中所述第一近端在氨基酸2680-2690内，且所述第二近端在氨基酸1860-1878内。

71.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的免疫原性片段。

72.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的至少500、600、700、750、800、850或900个氨基酸的免疫原性片段。

73.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽包含

(i) SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27；或

与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27具有至少90%、95%、98%、99%或100%相似性的变体。

74.根据权利要求1-37中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽包含：

(i) SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33 or SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35；或

(ii) 与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少90%、95%、98%、99%或100%相似性的变体；或

(iii) SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的至少250、280、300、350、380、400、430、450、480、500、530、550、580或600个氨基酸的片段。

75.根据权利要求1-37中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽是包含第一片段和第二片段的多肽，其中

(i) 所述第一片段是毒素A重复结构域片段；

(ii) 所述第二片段是毒素B重复结构域片段；

(iii) 所述第一片段包含第一重复部分内的第一近端；

(iv) 所述第二片段包含第二重复部分内的第二近端；

其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述第一重复部分和所述第二重复部分彼此具有结构相似性。

76.根据权利要求75的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VII内。

77.根据权利要求75或权利要求76的免疫原性组合物，其中所述第二近端在毒素B的重复部分II内。

78.根据权利要求75-77中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在长重复内。

79.根据权利要求75-78中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二近端在长重复内。

80.根据权利要求75-79中任一项的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的长重复VII (氨基酸2614-2644)内。

81.根据权利要求80的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2620-2640内。

82.根据权利要求75-81中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二近端在毒素B的长重复II (氨基酸2028-2057)内。

83.根据权利要求82的免疫原性组合物，其中所述第一近端在毒素B的氨基酸2030-2050内。

84.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽还包含接头。

85.根据权利要求84的免疫原性组合物，其中所述接头包含1-20个之间的氨基酸。

86.根据权利要求84-85中任一项的免疫原性组合物，其中所述接头是甘氨酸接头。

87.根据权利要求84-86中任一项的免疫原性组合物，其中所述接头在所述第一片段的近端和所述第二片段的近端之间。

88.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽是更大的融合蛋白的一部分。

89.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽包含来自毒素A的多于450、475、500、525、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825或850个氨基酸。

90.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽包含来自毒素A的少于850、825、800、775、750、725、700、675、650、625或600个氨基酸。

91.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽包含来自毒素B的多于350、375、400、425、450、475、500或525个氨基酸。

92.根据任一前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述多肽包含来自毒素B的少于525、500、475或450个氨基酸。

93.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽在哺乳动物宿主中诱发针对艰难梭状芽孢杆菌菌株的保护性免疫应答。

94.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽包含少于25%、20%、18%或15%的α螺旋结构。

95.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽包含多于25%、30%、35%、38%或40%的β折叠结构。

96.根据前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其还包含额外抗原。

97.权利要求96的免疫原性组合物，其中所述额外抗原是衍生自细菌的抗原，所述细菌选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、大肠杆菌、卡他莫拉菌、破伤风梭状芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、百日咳博代氏杆菌、表皮葡萄球菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌。

98.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其还包含来自于艰难梭状芽孢杆菌的糖。

99.一种疫苗，其包含前述权利要求中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。

100.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物或权利要求99的疫苗在治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病中的用途。

101.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物或权利要求99的疫苗，其用于治疗或预防艰难梭状芽孢杆菌疾病。

102.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物或权利要求99的疫苗在制备用于预防或治疗艰难梭状芽孢杆菌疾病的药物中的用途。

103.预防或治疗艰难梭状芽孢杆菌疾病的方法，其包括向哺乳动物受试者施用前述权利要求中任一项的免疫原性组合物或权利要求99的疫苗。