BR112015012841B1

BR112015012841B1 - Composição imunogênica e uso de uma composição imunogênica

Info

Publication number: BR112015012841B1
Application number: BR112015012841-6A
Authority: BR
Inventors: Dominique Boutriau; Sophie Marie Jeanne Valentine Germain; Hugues Wallemacq
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2012-12-05
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2022-05-03
Also published as: CN104884081A; EP2928489B1; FI3513806T3; HUE043091T2; LT3513806T; US10130694B2; PT3513806T; US20150313984A1; AR093712A1; JP6626521B2; SI3513806T1; AU2013354186A1; ES2939307T3; PL2928489T3; JP2016502551A; JP2018104446A; SI2928489T1; CA2893435A1; US9694064B2; HRP20230359T1

Abstract

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA. A presente invenção refere-se a composições imunogênicas compreendendo um polipeptídeo de clostridium difficile (C.difficile) e um adjuvante sem alumínio.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a composições imunogênicas compreendendo um polipeptídeo de Clostridium difficile (C. difficile) e um adjuvante sem alumínio. A invenção também refere-se a composições de vacina e o uso das composições de vacina e imunogênicas da invenção na profilaxia ou terapia ou na fabricação de um medicamento.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] C. difficile é a causa mais importante de infecções intestinais nosocomiais e é a principal causa de colite pseudomembranosa colitis em humanos (Bartlett et al Am. J. Clin. Nutr. 11 suppl: 2521-6 (1980)). A taxa de mortalidade associada geral para indivíduos infectados com C. difficile foi calculada como 5,99% em 3 meses de diagnóstico, com maior mortalidade associada com idade avançada, sendo 13,5% em pacientes acima de 80 anos (Karas et al Journal of Infection 561:1-9 (2010)). O tratamento atual para infecção por C. difficile é a administração de antibióticos (metronidazol e vancomicina), entretanto, há evidência de cepas que são resistentes a estes antibióticos (Shah et al., Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8(5), 555-564 (2010)). Desta maneira, há uma necessidade de composições imunogênicas capazes de induzir anticorpos e/ou uma resposta imune protetora para C. difficile.

[003] A enterotoxicidade de C. difficile é principalmente devido à ação de duas toxinas, toxina A (‘ToxA’) e toxina B (‘ToxB’). Os dimínios C- terminal de toxina A e toxina B compreendem unidades de repetição, por exemplo, o domínio C-terminal de toxina A é constituído de unidades de repetição contíguas (Dove et al Infect. Immun. 58:480-499 (1990)). Por esta razão, o domínio C-terminal pode ser referido como ‘domínio de repetição’. Estas porções de repetição podem ser separadas adicionalmente em repetições mais curtas (SRs) e repetições longas (LRs), conforme descrito em Ho et al (PNAS 102:18373-18378 (2005)).

[004] Composições imunogênicas compreendendo antígenos de C. difficile foram descritas. WO96/12802 e WO00/61762 e Lyerly et al (Current Microbiology 21:29-32 (1990)) dizem respeito a fragmentos de toxina A, em particular fragmentos do domínio C-terminal, para induzir uma resposta imune protetora em hamsters. WO9920304 refere-se a uma mistura de toxina A corporificada e toxina B inativada por incubação em formaldeído. WO00/61762 refere-se a composições imunogênicas compreendendo tanto o domínio C-terminal de comprimento completo ou fragmentos do domínio C- terminal de toxina A e toxina B de C. difficile. Similarmente WO2012/163817, WO2012/163811 e WO2012/163810 fornecem revelações de possíveis fragmentos de toxina A e toxina B, bem como proteínas de fusão destes.

[005] Composições ou vacinas inéditas com melhor imunogenicidade são necessárias. Como uma estratégia, adjuvantes foram usados para tentar e melhorar a resposta imune que surge de qualquer dado antígeno. Por exemplo, WO2009035707 descreve uma composição compreendendo um toxóide de toxinas A e B de C. difficile e um adjuvante, tais como composto de hidróxido de alumínio.

[006] Adjuvantes contendo combinações de lipopolissacarídeo e Saponinas de Quillaja foram previamente revelados, por exemplo, em EP0671948. Emulsões óleo em água per se são bem conhecidas na tecnologia e sugeriu-se ser usadas como composições de adjuvante (EP 399843; WO 95/17210).

[007] Ainda há uma necessidade de vacina e composições imunogênicas que fornecem uma resposta imune adequada contra C. difficile. SUMÁRIO

[008] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo compreendendo um fragmento de toxina A de Clostridium difficile (C. difficile) e/ou um fragmento de toxina B de C. difficile e um adjuvante compreendendo um fração de saponina imunologicamente ativa apresentada na forma de um lipossoma. A fração de saponina imunologicamente ativa pode ser QS21 e o lipopolissacarídeo pode ser 3D-MPL. Adequadamente, a composição imunogênica pode compreender cerca de 50 μg 3D-MPL e cerca de 50 μg QS21.

[009] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo compreendendo um fragmento de toxina A de C. difficile e/ou um fragmento de toxina B de C. difficile e um adjuvante compreendendo uma emulsão óleo em água, em que a dita emulsão óleo em água compreende um óleo metabolizável, um tocol e um emulsificante. O óleo metabolizável pode estar presente em uma quantidade de cerca de 5,35 mg. O tocol pode estar presente em uma quantidade de cerca de 5,94 mg. Adequadamente, o agente de emulsificação pode estar presente em uma quantidade de cerca de 2,425 mg. Adequadamente, o óleo metabolizável é esqualeno, o tocol é alfa-tocoferol e o agente de emulsificação é mono-oleato de polioxietileno sorbitano.

[0010] Adequadamente, a composição imunogênica de acordo com qualquer aspecto da invenção compreende um fragmento do domínio de repetição da toxina A de C. difficile e um fragmento do domínio de repetição da toxina B de C. difficile e obtém anticorpos que neutralizam a toxina A e toxina B. Em uma modalidade adicional da invenção, a composição imunogênica compreende um fragmento de toxina A de C. difficile e um fragmento de toxina B de C. difficile em que um do fragmentos é um fragmento N-terminal e o outro é um fragmento do domínio de repetição.

[0011] Adequadamente, a composição imunogênica de acordo com qualquer aspecto da invenção compreende uma variante de polipeptídeo de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 ou SEQ ID NO:27.

[0012] Adequadamente, a composição imunogênica de acordo com qualquer aspecto da invenção compreende um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35 ou uma variante ou fragmento de qualquer uma destas sequências.

[0013] As composições imunogênicas de acordo com a invenção podem compreender antígenos adicionais, tais como antígenos derivados de uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Haemophilus influenzae (H.influenzae), Neisseria meningitidis (N.meningitidis), Escherichia coli (E.coli), Moraxella catarrhalis (M.cattarhalis), Clostridium tetani (C. tetani), Corynebacterium diptherieriae (C. diptherieriae), Bordetella pertussis (B. pertussis), Staphilococcus epidermidis (S.epidermidis), enterococos e Staphilococcus aureus (S.aureus).

[0014] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma vacina compreendendo a composição imunogênica de acordo com a invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0015] Em um aspecto, a invenção refere-se a um uso da composição imunogênica ou da vacina de acordo com a invenção no tratamento ou prevenção de doença de C. difficile.

[0016] Em um aspecto, a invenção refere-se à composição imunogênica ou a vacina de acordo com a invenção para uso no tratamento ou prevenção de doença de C. difficile.

[0017] Em um aspecto, a invenção refere-se ao uso da composição imunogênica ou a vacina de acordo com a invenção na preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de doença de C. difficile.

[0018] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar doença de C. difficile compreendendo administrando a composição imunogênica ou a vacina de acordo com a invenção a um indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] FIGURA 1 - Gráficos mostrando resultados de ELISA de antiToxA e anti-ToxB para hamsters imumizados com F2 formulado com Adjuvante A; Adjuvante A sem QS21 e Adjuvante A sem MPL.

[0020] FIGURA 2 - Gráficos mostrando resultados de ELISA de antiToxA e anti-ToxB para hamsters imumizados com F2-não adjuvado ou F2 formulado com Adjuvante A, Adjuvante B e Alum.

[0021] FIGURA 3 - Gráficos mostrando resultados de ELISA de antiToxA e anti-ToxB para soros pós I de hamsters imumizados machos e fêmeas com uma faixa de dosagem de proteínas de fusão F2 formuladas em Adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C.

[0022] FIGURA 4 - Gráficos mostrando resultados de ELISA de antiToxA e anti-ToxB para soros pós II de hamsters imumizados machos e fêmeas com uma faixa de dosagem de proteínas de fusão F2 formuladas em Adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C.

[0023] FIGURA 5 - Gráficos mostrando resultados de ELISA de antiToxA e anti-ToxB para soros pós II de hamsters imumizados machos e fêmeas com uma faixa de dosagem de proteínas de fusão F2 formuladas em Adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C.

[0024] FIGURA 6 - Gráficos mostrando resultados de ELISA de antiToxA e anti-ToxB para soros do dia 87 pós III de hamsters imumizados machos e fêmeas com uma faixa de dosagem de proteínas de fusão F2 formuladas em Adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C.

[0025] FIGURA 7 - Gráficos mostrando resultados de ELISA de antiToxA e anti-ToxB para hamsters imumizados machos com uma faixa de dosagem de proteínas de fusão F2 formuladas em Adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C em soros pós I, II e III.

[0026] FIGURA 8 - Gráficos mostrando resultados de ELISA de antiToxA e anti-ToxB para hamsters imumizados machos e fêmeas com uma mistura (ToxA+ToxB) ou com a proteína de fusão F2 formulada em Alum ou Adjuvante A.

[0027] FIGURA 9 - Gráfico mostrando imunogenicidade anti-ToxA em camundongos imunizados com um fragmento do C-terminal de toxina A (aa 2387-2706), um fragmento do C-terminal de toxina B (aa 1750-2360) ou fusões 1, 2, 3, 4 ou 5 formulado no adjuvante B.

[0028] FIGURA 10 - Gráfico mostrando inibição de hemaglutinina em camundongos imunizados com um fragmento do C-terminal de toxina A (aa 2387-2706), um fragmento do C-terminal de toxina B (aa 1750-2360) ou fusões 1, 2, 3, 4 ou 5 formulado no adjuvante B.

[0029] FIGURA 11 - Gráfico mostrando imunogenicidade anti-ToxB em camundongos imunizados com um fragmento do C-terminal de toxina A (aa 2387-2706), um fragmento do C-terminal de toxina B (aa 1750-2360) ou fusões 1, 2, 3, 4 ou 5 formulado no adjuvante B.

[0030] FIGURA 12 - Títulos de inibição de citotoxicidade de camundongos imunizados com um fragmento do C-terminal de toxina A (aa 2387-2706), um fragmento do C-terminal de toxina B (aa 1750-2360) ou fusões 1, 2, 3, 4 ou 5 formulado no adjuvante B.

[0031] FIGURA 13 - Gráfico mostrando resultados de ELISA de anti-ToxA para camundongos imunizados com as fusões F2, F52New, F54Gly, G54New ou F5 ToxB formuladas no adjuvante B.

[0032] FIGURA 14 - Gráfico mostrando resultados de ELISA de anti-ToxB para camundongos imunizados com as fusões F2, F52New, F54Gly, F54New ou F5ToxB formuladas no adjuvante B.

[0033] FIGURA 15 - Gráfico mostrando inibição de hemaglutinina em camundongos imunizados com as fusões F2, F52New, F54Gly, F54New ou F5ToxB formuladas no adjuvante B.

[0034] FIGURA 16 - Gráfico mostrando títulos de citotoxicidade em Células HT29 de camundongos imunizados com as fusões F2, F52New, F54Gly, F54New ou F5ToxB formuladas no adjuvante B.

[0035] FIGURA17 - Gráfico mostrando títulos de citotoxicidade em Células IMR90 de camundongos imunizados com as fusões F2, F52New, F54Gly, F54New ou F5ToxB formuladas no adjuvante B.

[0036] FIGURA 18 - Gráfico mostrando resultados de ELISA de anti-ToxA para camundongos imunizados com C. difficile ToxA-Cter (aa 2387-2706), ToxB-Cter (aa 1750-2360) e proteínas de fusão (não adjuvadas).

[0037] FIGURA 19 - Gráfico mostrando resultados de ELISA de anti-ToxB para camundongos imunizados com ToxA-Cter de C. difficile (aa 2387-2706), ToxB-Cter (aa 1750-2360) e proteínas de fusão (não adjuvadas).

[0038] FIGURA 20 - Gráfico mostrando resultados de ELISA de anti-ToxA para camundongos imunizados com ToxA-Cter de C. difficile (aa 2387-2706), ToxB-Cter (aa 1750-2360) e proteínas de fusão formulado no adjuvante B: soros pós II, III, Pré-reforço, pós IV.

[0039] FIGURA 21 - Gráfico mostrando resultados de ELISA de anti-ToxB para camundongos imunizados com ToxA-Cter de C. difficile (aa 2387-2706), ToxB-Cter (aa 1750-2360) e proteínas de fusão formulado no adjuvante B: Soros pós II, III, Pré-reforço, pós IV.

[0040] FIGURA 22 - Gráfico que descreve o espectro Longe do UV das fusões, 2, 3, 4 e 5 medido usando dicroísmo circular. O espectro para fusão 2 é representado por uma linha com os pontos apresentados como pequenos quadrados, o espectro para fusão 3 é representado por uma linha com os pontos apresentados como pequenas formas de diamante, fusão 4 é representada por uma linha com os pontos apresentados como círculos e fusão 5 é representada por uma linha com os pontos apresentados como formas de cruz.

[0041] FIGURA 23 - Gráfico que descreve o espectro próximo ao UV das fusões 2, 3, 4 e 5 medido usando dicroísmo circular. O espectro para fusão 2 é representado por uma linha com os pontos apresentados como formas de cruz, o espectro para fusão 3 é representado por uma linha com os pontos apresentados como círculos, o espectro para fusão 4 é representado por uma linha com os pontos apresentados como triângulos e o espectro para fusão 5 é representado por uma linha com os pontos apresentados como pequenas formas de diamante.

[0042] FIGURA 24 - Gráfico que descreve o espectro Longe do UV das fusões F52New, F54Gly, F54New e F5ToxB medido usando dicroísmo circular. O espectro para F52New é representado por uma linha com os pontos apresentados como cruzes duplas, o espectro para F54Gly é representado por uma linha com os pontos apresentados como triângulos, F54New é representado por uma linha com os pontos apresentados como quadrados e F5ToxB é representado por uma linha com os pontos apresentados como formas de cruz.

[0043] FIGURA 25 - Gráfico que descreve o espectro próximo ao UV das fusões F52New, F54Gly, F54New e F5ToxB medido usando dicroísmo circular. O espectro para F52New é representado por uma linha com os pontos apresentados como cruzes duplas, o espectro para F54Gly é representado por uma linha com os pontos apresentados como triângulos, F54New é representado por uma linha com os pontos apresentados como quadrados e F5ToxB é representado por uma linha com os pontos apresentados como formas de cruz.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0044] Os inventores apresentaram composições imunogênicas compreendendo um polipeptídeo compreendendo um fragmento de toxina A de C. difficile e/ou um fragmento de toxina B de C. difficile formulado com adjuvantes sem alum, particularmente adjuvantes, tais como Adjuvante A e Adjuvante B aqui descritos, fornecem uma melhor resposta imune contra C. difficile comparado às composições contendo polipeptídeo de C. difficile não adjuvado. Composições imunogênicas de acordo com a invenção também podem fornecer uma melhor resposta imune contra C. difficile comparada aos polipeptídeos formulado com alum de C. difficile.

POLIPEPTÍDEOS

[0045] O polipeptídeo compreendendo um fragmento de toxina A de C. difficile e/ou um fragmento de toxina B de C. difficile pode compreender toxina A ou toxina B purificada que foi inativada adequadamente por incubação em formaldeído, tais como as descritas em WO9920304.

[0046] O polipeptídeo pode compreender um fragmento N-terminal de toxina A de C. difficile e um fragmento do domínio de repetição da toxina B de C. difficile. O polipeptídeo pode conter um fragmento do domínio de repetição da toxina A de C. difficile e um fragmento N-terminal de toxina B de C. difficile. O polipeptídeo pode compreender um fragmento do domínio de repetição da toxina A de C. difficile e um fragmento do domínio de repetição da toxina B de C. difficile.

[0047] O polipeptídeo pode compreender tanto o N - terminal de comprimento completo e/ ou domínio C-terminal de toxina A e toxina B de C. difficile ou fragmentos deste.

[0048] Em uma modalidade, o polipeptídeo nas composições imunogênicas de acordo com a invenção não contém o domínio N-terminal de comprimento completo de toxina A e/ou toxina B de C. difficile. Em uma modalidade, o polipeptídeo nas composições imunogênicas de acordo com a invenção não contém um Fragmento do domínio N-terminal de toxina A e/ou toxina B de C. difficile.

[0049] O polipeptídeo pode ser uma proteína de fusão. Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender uma sequência de fusão, tais como Seq ID NOS: 36 e 37 ou outras sequências descritas em WO2012/028741.

[0050] O polipeptídeo pode compreender um primeiro fragmento e um segundo fragmento, em que (i) o primeiro fragmento é um fragmento do domínio de repetição da toxina A; (ii) o segundo fragmento é um fragmento do domínio de repetição da toxina B; (iii) o primeiro fragmento compreende uma primeira extremidade proximal em uma primeira porção de repetição; (iv) o segundo fragmento compreende uma segunda extremidade proximal em uma segunda porção de repetição; e em que o primeiro fragmento e o segundo fragmento são adjacentes um ao outro e em que a primeira porção de repetição e a segunda porção de repetição têm similaridades estruturais.

[0051] O termo polipeptídeo refere-se a uma sequência contígua de aminoácidos.

[0052] O termo ‘toxina A domínio de repetição’ refere-se ao domínio C-terminal da proteína da toxina A de C. difficile compreendendo sequências repetidas. Por exemplo, o domínio C-terminal da proteína da toxina A pode ser aminoácidos 1832-2710 de toxina A da cepa VPI10463 (ATCC43255) e/ou seu equivalente em uma diferente cepa. Aminoácidos 1832-2710 da toxina A da cepa VPI10463 (ATCC43255) corresponde a aminoácidos 18322710 de SEQ ID NO:1.

[0053] O termo ‘domínio de repetição da toxina B’ refere-se ao domínio C-terminal da proteína da toxina B de C. difficile. Por exemplo, o domínio C-terminal da proteína da toxina B pode ser aminoácidos 1834-2366 da toxina B da cepa VPI10463 (ATCC43255) e/ou seu equivalente em uma diferente cepa. Aminoácidos 1834-2366 da toxina B da cepa VPI10463 (ATCC43255) corresponde a aminoácidos 1834-2366 de SEQ ID NO:2.

[0054] O domínio N-terminal de comprimento completo de toxina A pode ser aminoácidos 1-542 da toxina A da cepa VPI10463 (ATCC43255) e/ou seu equivalente em uma diferente cepa. Assim o termo “um fragmento N-terminal de C. difficile de toxina A” ou “um fragmento do domínio N- terminal de toxina A” refere-se a um fragmento de aminoácidos 1-542 da toxina A da cepa VPI10463 (ATCC43255) e/ou seu equivalente em uma diferente cepa. Aminoácidos 1-542 da toxina A da cepa VPI10463 (ATCC43255) corresponde a aminoácidos 1-542 de SEQ ID NO: 1.

[0055] O domínio N-terminal de comprimento completo de toxina B pode ser aminoácidos 1-543 da toxina B da cepa VPI10463 (ATCC43255) e/ou seu equivalente em uma diferente cepa. Assim o termo “um fragmento N-terminal de toxina B de C. difficile” ou “um fragmento do domínio N- terminal de toxina B” refere-se a um fragmento de aminoácidos 1-543 da toxina B da cepa VPI10463 (ATCC43255) e/ou seu equivalente em uma diferente cepa. Aminoácidos 1-543 da toxina B da cepa VPI10463 (ATCC43255) corresponde a aminoácidos 1-543 de SEQ ID NO: 2.

[0056] Toxinas A e B de C. difficile são proteínas conservadas. Entretanto, a sequência difere uma pequena quantidade entre cepas. Além disso, a sequência de aminoácidos para toxinas A e B em diferentes cepas pode diferir em inúmeros aminoácidos.

[0057] Em uma modalidade, a toxina A domínio de repetição e/ou domínio de repetição da toxina B pode ser uma sequência que é uma variante com pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 1832-2710 de SEQ ID NO:1 ou uma variante com pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 1834-2366 de SEQ ID NO:2.

[0058] Em uma modalidade, o domínio N-terminal da toxina A pode ser uma sequência que é uma variante com pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 1-542 de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o domínio N-terminal da toxina B pode ser uma sequência que é uma variante com pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com aminoácidos 1-543 de SEQ ID NO: 2.

[0059] Uma ‘variante’ é um polipeptídeo que varia dos polipeptídeos referentes por substituições conservativas de aminoácidos, em que um resíduo é substituído por um outro com as mesmas propriedades físico-químicas. Tipicamente tais substituições estão entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser e Thr; entre os resíduos ácidos Asp e Glu; entre Asn e Gln e entre os resíduos básicos Lys e Arg; ou resíduos aromáticos Phe e Tyr.

[0060] Além disto, a numeração do aminoácido pode diferir entre os domínios C-treminais ou domínio N-terminal da toxina A (ou toxina B) de uma cepa e toxina A (ou toxina B) de uma outra cepa. Por esta razão, o termo ‘equivalente em uma diferente cepa’ refere-se aos aminoácidos que correspondem aos de uma cepa de referência (por exemplo, C. difficile VPI10463), mas que são encontrados em uma toxina de uma diferente cepa e que assim podem ser numerados diferentemente. Uma região de aminoácidos ‘equivalentes’ pode ser determinada alinhando as sequências das toxinas das diferentes cepas. Os números dos aminoácidos fornecidos referem-se aos da cepa VPI10463.

[0061] O termo ‘fragmento’ de um polipeptídeo ou proteína refere-se a uma porção contígua, tais como pelo menos 100, 150, 180, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ou 600 aminoácidos, da polipeptídeo ou proteína.

[0062] “Fragmento do domínio N-terminal de toxina A” de C. difficile refere-se a uma porção contígua, tais como pelo menos 100, 150, 180, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500 ou 530 aminoácidos, do domínio N-terminal de comprimento completo de toxina A. “Fragmento do domínio N-terminal de toxina B” de C. difficile refere-se a uma porção contígua, tais como pelo menos 100, 150, 180, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500 ou 530 aminoácidos do domínio N-terminal de comprimento completo de toxina B.

[0063] Fragmento do domínio de repetição da toxina A pode ser uma porção contígua de pelo menos 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ou 600 aminoácidos do domínio de repetição da toxina A. Fragmento do domínio de repetição da toxina A pode ser uma porção contígua de menos que 750, menos que 700, menos que 650, menos que 600 ou menos que 580 aminoácidos. Fragmento do domínio de repetição da toxina B pode ser uma porção contígua de pelo menos 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ou 600 aminoácidos do domínio de repetição da toxina B. Fragmento do domínio de repetição da toxina B pode ser uma porção contígua de menos que 530, menos que 500, menos que 480 ou menos que 450 aminoácidos.

[0064] O termo ‘primeiro fragmento’ refere-se a uma porção contígua de pelo menos 100, tais como 150, 180, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 ou 600 aminoácidos do domínio de repetição da toxina A. O termo ‘segundo fragmento’ refere-se a uma porção contígua de pelo menos 100, tais como 200, 230, 250, 280, 300, 350, 400, 450 ou 500 aminoácidos do domínio de repetição da toxina B.

[0065] O termo ‘primeira extremidade proximal’ refere-se à extremidade do primeiro fragmento (fragmento de Tox A) que é covalentemente ligado ao segundo fragmento (fragmento de Tox B) ou covalentemente ligado a uma sequência ligante entre o primeiro e segundo fragmento. O termo ‘segunda extremidade proximal’ refere-se à extremidade do segundo fragmento que está mais perto do primeiro fragmento na estrutura primária (sequência de aminoácidos).

[0066] O domínio C-terminal de toxina A é constituído de 8 porções de repetição (designadas porção de repetição I, porção de repetição II, porção de repetição III, porção de repetição IV, porção de repetição V, porção de repetição VI, porção de repetição VII e porção de repetição VIII). Cada uma destas porções de repetição pode ser adicionalmente dividida em repetições curtas (SRs) e repetições longas (LRs) (exceto para porção de repetição VIII da Tox A que não tem uma repetição longa). Cada uma das repetições longas tem alguma similaridade estrutural e de sequência com outras repetições longas. Similarmente, as repetições curtas têm alguma similaridade de sequência e estrutural uma com a outra. Similarmente o domínio C-terminal de toxina B é constituído de 5 porções de repetição subdivididas em SRs e LRs. Cada porção de repetição contém um LR e entre 2 e 5 SRs (exceto para Tox B porção de repetição V que não tem uma repetição longa). Para os propósitos da revelação uma ‘porção de repetição’ refere-se a uma das oito porções de repetição de ToxA (designadas I, II, III, IV, V, VI, VII ou VIII) ou uma das cinco porções de repetição de ToxB (designadas I, II, III, IV ou V) ou uma porção de repetição parcial da toxina A ou domínio de repetição da toxina B. Da forma aqui usada o termo ‘primeiro porção de repetição’ refere- se a uma porção de repetição (ou porção parcial de repetição) do domínio de repetição da toxina A. O termo ‘segunda porção de repetição’ refere-se a uma porção de repetição (ou porção parcial de repetição) do domínio de repetição da toxina B.

[0067] Por exemplo, porção de repetição I de ToxA contém três SRs e um LR, que podem ser referidos como o primeiro SRI de ToxA, o segundo SRI de ToxA, o terceiro SRI de ToxA e o LRI de ToxA, respectivamente.

[0068] A primeira extremidade proximal é considerada como uma ‘porção de repetição’ se as primeiras extremidades do fragmento em um aminoácido que está nesta porção de repetição (isto é, a primeira extremidade proximal contém somente parte da sequência da porção de repetição). Similarmente, a segunda extremidade proximal é considerada como uma ‘porção de repetição’ e as segundas extremidades do fragmento em um aminoácido que está nesta porção de repetição. Por exemplo, a primeira extremidade proximal está na ‘porção de repetição I da ToxA se as primeiras extremidades do fragmento com qualquer um dos aminoácidos 1833-1923 (inclusive) de VPI10463 ou seu equivalente em uma outra cepa. A primeira extremidade proximal está em uma ‘repetição longa’ ou uma ‘repetição curta’ se as primeiras extremidades do fragmento em um aminoácido que está em uma ‘repetição longa’ ou uma ‘repetição curta’, similarmente a segunda extremidade proximal está em uma ‘repetição longa’ ou uma ‘repetição curta’ se as segundas extremidades do fragmento em um aminoácido que está em uma ‘repetição longa’ ou uma ‘repetição curta’.

[0069] As posições do aminoácido de cada domínio foram definidas para toxina A e toxina B da cepa VPI10463 (ATCC43255). Estas são como se segue (Tabela 1)

[0070] Em uma modalidade, a porção de repetição da toxina A refere- se aos aminoácidos 1832-1924, 1925-2058, 2059-2192, 2193-2306, 23072440, 2441-2553, 2554-2644 ou 2645-2710 da toxina A (SEQ ID NO:1) ou um equivalente em uma diferente cepa de C. difficile. Em uma outra modalidade, a porção de repetição da toxina B refere-se aos aminoácidos 1834-1926, 1927-2057, 2058-2189, 2190-2323 ou 2324-2366 da toxina B (SEQ ID NO:2) ou um equivalente em uma diferente cepa de C. difficile.

[0071] O termo ‘repetição curta’ pode referir-se a aminoácidos 18321852, 1853-1873, 1874-1893, 1925-1944 1945-1965, 1966-1986, 1987-2007, 2008-2027, 2059-2078, 2079-2099, 2100-2120, 2121-2141, 2142-2161, 21932212, 2213-2233, 2234-2253, 2254-2275, 2307-2326, 2327-2347, 2348-2368, 2369-2389, 2390-2409, 2441-2460, 2461-2481, 2482-2502, 2503-2522, 25542573, 2574-2594, 2595-2613, 2645-2664, 2665-2686 ou 2687-2710 da toxina A (SEQ ID NO:1) ou aminoácidos 1834-1854, 1855-1876, 1877-1896, 1927- 1946, 1947-1967, 1968-1987, 1988-2007, 2008-2027, 2058-2078, 2079-2099, 2100-2119, 2120-2139, 2140-2159, 2190-2212, 2213-2233, 2234-2253, 2254-2273, 2274-2293, 2324-2343 ou 2344-2366 da toxina B (SEQ ID NO:2) ou seus equivalentes em uma diferente cepa de C. difficile.

[0072] Similarmente, o termo ‘repetição longa’ pode referir-se aos aminoácidos 1894-1924, 2028-2058, 2162-2192, 2276-2306, 2410-2440, 2523-2553 ou 2614-2644 da toxina A (SEQ ID NO:1) ou aminoácidos 18971926, 2028-2057, 2160-2189 ou 2294-2323 da toxina B (SEQ ID NO:2) ou seus equivalentes em uma diferente cepa de C. difficile.

[0073] Os polipeptídeos da invenção podem ser parte de uma proteína maior, tais como um precursor ou uma proteína de fusão. É frequentemente vantajoso incluir uma sequência de aminoácidos adicional que contém sequências que ajudam na purificação, tais como múltiplos resíduos de histidina ou uma sequência adicional para estabilidade durante produção recombinante. Além disto, adição de polipeptídeo exógeno ou cauda de lipídeo ou sequência de polinucleotídeos para aumentar o potencial imunogênico da molécula final também é considerada.

[0074] A palavra ‘adjacente’ significa separada por menos que ou exatamente 20, 15, 10, 8, 5, 2, 1 ou 0 aminoácidos na estrutura primária.

[0075] Os fragmentos podem ser posicionados, de maneira tal que o N-terminal do primeiro fragmento seja adjacente ao C-terminal do segundo fragmento, alternativamente o C-terminal do primeiro fragmento pode ser adjacente ao N-terminal do segundo fragmento ou o C-terminal do primeiro fragmento pode ser adjacente ao C-terminal do segundo fragmento ou o N- terminal do primeiro fragmento pode ser adjacente ao N-terminal do segundo fragmento.

[0076] Duas sequências terão ‘similaridade de sequência uma com a outra’ se elas forem maiores que 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência.

[0077] O termo ‘identidade’ é conhecido na tecnologia. Identidade é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, como caso pode ser, conforme determinado comparando as sequências. Na tecnologia, “identidade” também significa o grau de parentesco da SEQuência entre polipeptídeo ou sequência de polinucleotídeos, como o caso pode ser, conforme determinado pela combinação entre as tiras de tais sequências. “Identidade” pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos incluindo, mas sem limitações, os descritos em (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis de SEQuence Data, Parte I, Griffin, A.M. e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Métodos para determinar a identidade são designados para dar a maior combinação entre as sequências testadas. Além disso, métodos para determinar a identidade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas sem limitações, o programa Needle, BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403410 (1990)) e FASTA Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)). A família BLAST de programas é publicamente disponível da NCBI e outrsa fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). O algoritmo de Smith Warerman bem conhecido também pode ser usado para determinar identidade.

[0078] Em um exemplo, parâmetros para comparação de sequência de polipeptídeos incluem o seguinte:

[0079] Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

[0080] Matriz de comparação: BLOSSUM62 eq Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

[0081] Penalidade da folga: 10

[0082] Penalidade da extensão da folga: 0,5

[0083] Um programa usado com estes parâmetros é publicamente disponível como o programa ‘Needle’ do pacote EMBOSS (Rice P.et al, Trends in Genetics 2000 col.16(6):276-277). Os parâmetros mencionados anteriormente são os parâmetros padrão para comparações de peptídeo (juntamente com nenhuma penalidade para folgas da extremidade).

[0084] Em uma modalidade a primeira porção de repetição e a segunda porção de repetição têm alta similaridade estrutural uma com a outra. Duas sequências podem ser consideradas como tendo alta similaridade estrutural quando sua identidade de sequência é maior que 40%, 45%, 50% ou 60%. A presença de alta identidade de sequência pode ser determinada usando softwares que permitem o alinhamento de sequências (EMBOSS, Blast, ...). Estrutura de modelo 3D poderia ser fielmente construída, usando o servidor de rede SwissModel, para uma proteína se ela compartilhar mais que 40%, 45%, 50% ou 60% de identidade de sequência com uma proteína tendo uma estrutura 3D conhecida.

[0085] Em uma modalidade o polipeptídeo da invenção obtém anticorpos que neutralizam a toxina A ou toxina B. Em uma modalidade adicional o polipeptídeo obtém anticorpos que neutralizam a toxina A. Em uma modalidade adicional o polipeptídeo obtém anticorpos que neutralizam toxina B. Em uma modalidade adicional o polipeptídeo obtém anticorpos que neutralizam toxina A e toxina B. A frase ‘obtém anticorpos neutralizantes’ significa que quando as composições são usadas para imunizar um mamífero, por exemplo, um camundongo, um porquinho da India ou um humano, o mamífero gera anticorpos neutralizantes.

[0086] Se um polipeptídeo obtém anticorpos neutralizantes contra uma toxina pode ser medido por camundongos de imunização com uma composição imunogênica compreendendo o polipeptídeo, soros de coleta e análise dos títulos da anti-toxina dos soros usando ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). Os soros poderiam ser comparados a uma amostra de referência obtida de camundongos que não foram imunizados. Um exemplo desta técnica pode ser encontrada nos exemplo 6. O polipeptídeo da invenção obtém anticorpos que neutralizam toxina A se os soros contra o polipeptídeo der uma leitura de ELISA maior que 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% ou 100% maior que a amostra de referência.

[0087] Em uma modalidade adicional o polipeptídeo da invenção obtém uma resposta imune protetora em um hospedeiro mamífero contra cepas de C. difficile. A frase ‘obtém uma resposta imune protetora’ significa que quando a composição imunogênica da invenção é usada para imunizar um mamífero, tais como um camundongo, porquinho da India ou humano, o mamífero gera anticorpos capazes de proteger o mamífero da morte causada por C. difficile. Em uma modalidade o hospedeiro mamífero é selecionado do grupo que consiste em camundongo, coelho, porquinho da India, macaco, primata não humano ou humano. Em uma modalidade o hospedeiro mamífero é um camundongo. Em uma modalidade adicional o hospedeiro mamífero é um humano.

[0088] Se um polipeptídeo obtém uma resposta imune protetora em um hospedeiro mamífero contra cepas de C. difficile pode ser determinado usando um ensaio de desafio. Em um ensaio como este o hospedeiro mamífero é vacinado com o polipeptídeo e desafiado por exposição a C. difficile. O tempo no qual o mamífero sobrevive depois do desafio é comparado como o tempo no qual um mamífero de referência que não foi imunizado com o polipeptídeo sobrevive. Um polipeptídeo obtém uma resposta imune protetora se um mamífero imunizado com o polipeptídeo sobreviver pelo menos 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% ou 100% mais depois do desafio com C. difficile que um mamífero de referência que não foi imunizado com o polipeptídeo. Em uma modalidade o polipeptídeo da invenção obtém uma resposta imune protetora contra C. difficile em um mamífero selecionado do grupo que consiste em camundongo, porquinho da India, macaco ou humano. Em uma modalidade o mamífero é um camundongo, em uma modalidade adicional o mamífero é um humano.

[0089] A estrutura nativa dos domínios C-terminais (repetição) das toxinas A e B consiste em uma estrutura tipo solenóide β estendida. Esta estrutura consiste principalmente em estruturas de lâmina β, com uma minoria de estruturas α helicais, conforme visto em Ho et al (PNAS 102:18373-18378 (2005)). As estruturas secundárias presentes podem ser determinadas usando dicroísmo circular (CD). Por exemplo, a estrutura secundária pode ser determinada medindo a forma e magnitude do espectro de CD na região longe do UV (190-250 nm) e comparando os resultados com os das estruturas conhecidas. Isto pode ser realizado usando um caminho ótico de 0,01 cm de 178 a 250 nm, com um 1 nm de resolução e largura da banda em espectropolarímetro Jasco J-720, por exemplo, conforme visto no exemplo 5 a seguir.

[0090] Em uma modalidade o primeiro fragmento compreende menos que 28%, 25%, 23%, 20%, 18%, 15%, 10% ou 7% de estrutura secundária alfa helical. Em uma modalidade o segundo fragmento compreende menos que 28%, 25%, 23%, 20%, 18%, 15%, 10% ou 7% de estrutura secundária alfa helical. Em uma modalidade adicional tanto o primeiro fragmento quanto o segundo fragmento compreendem menos que 28%, 25%, 23%, 20%, 18%, 15%, 10% ou 7% de estrutura secundária alfa helical.

[0091] Em uma modalidade o primeiro fragmento compreende mais que 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40% ou 42% da estrutura de lâmina beta. Em uma modalidade o segundo fragmento compreende mais que 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40% ou 42% da estrutura de lâmina beta. Em uma modalidade adicional tanto o primeiro fragmento quanto o segundo fragmento compreendem mais que 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40% ou 42% da estrutura de lâmina beta.

[0092] Em uma modalidade a primeira extremidade proximal está na porção de repetição V (aminoácidos 2307-2440 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa), porção de repetição VI (aminoácidos 2441-2553 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa), porção de repetição VII (aminoácidos 2554-2644 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou porção de repetição VIII (aminoácidos 2645-2710 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) da toxina A. Em uma modalidade adicional a primeira extremidade proximal está na porção de repetição VII (aminoácidos 2554-2644 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) da toxina A. Em uma modalidade adicional a primeira porção de repetição da extremidade proximal VIII (aminoácidos 2645-2710 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) da toxina A.

[0093] Em uma modalidade a segunda extremidade proximal está na porção de repetição I (aminoácidos 1834-1926 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa), porção de repetição II (aminoácidos 1927-2057 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou porção de repetição III (aminoácidos 2058-2189 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa) da toxina B. Em uma modalidade adicional a segunda extremidade proximal está na porção de repetição II (aminoácidos 1927-2057 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa) da toxina B. Em uma modalidade adicional a segunda extremidade proximal está na porção de repetição I (aminoácidos 1834-1926 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa) da toxina B.

[0094] Em uma modalidade a primeira extremidade proximal está em uma repetição longa. A primeira extremidade proximal pode estar na repetição longa V da toxina A (aminoácidos 2410-2440 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou na repetição longa VI da toxina A (aminoácidos 2523-2553 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou na repetição longa VII da toxina A (aminoácidos 26142644 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa).

[0095] Em uma modalidade a segunda extremidade proximal está em uma repetição longa. A segunda extremidade proximal pode estar na repetição longa I da toxina B (aminoácidos 1897-1926 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou na repetição longa II da toxina B (aminoácidos 2028-2057 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou na repetição longa III da toxina B (aminoácidos 2160-2189 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa).

[0096] Em uma modalidade adicional a primeira extremidade proximal e a segunda extremidade proximal estão ambas nas repetições longas. Em uma modalidade a primeira extremidade proximal está na repetição longa V da toxina A (aminoácidos 2410-2440 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou na repetição longa VI da toxina A (aminoácidos 2523-2553 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou na repetição longa VII da toxina A (aminoácidos 26142644 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) e a segunda extremidade proximal está na repetição longa da toxina B (aminoácidos 18971926 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou na repetição longa II da toxina B (aminoácidos 2028-2057 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa) ou na repetição longa III da toxina B (aminoácidos 2160-2189 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa). Em uma modalidade a primeira extremidade proximal está na repetição longa VII da toxina A (aminoácidos 2614-2644 de SEQ ID NO:1 ou seu equivalente em uma diferente cepa) e a segunda extremidade proximal está na repetição longa II da toxina B (aminoácidos 2028-2057 de SEQ ID NO:2 ou seu equivalente em uma diferente cepa).

[0097] Em uma modalidade a primeira extremidade proximal está nos aminoácidos 2620-2660 da toxina A. Em uma modalidade a segunda extremidade proximal está nos aminoácidos 2030-2050 da toxina B. Em uma modalidade adicional a primeira extremidade proximal está nos aminoácidos 2620-2660 da toxina A e a segunda extremidade proximal está nos aminoácidos 2030-2050 da toxina B.

[0098] Em uma modalidade o primeiro fragmento compreende pelo menos 100, 150, 180, 200, 240, 250, 280, 300, 330, 350, 380, 400, 430, 450, 480, 500 ou 530 aminoácidos. Em uma modalidade o segundo fragmento compreende pelo menos 100, 130, 150, 180, 200, 230, 250, 270, 300, 330, 350, 390 ou 400 aminoácidos.

[0099] Em uma modalidade o polipeptídeo compreende adicionalmente um ligante. Este ligante pode ser entre a primeira extremidade proximal e a segunda extremidade proximal, alternativamente o ligante pode ligar as extremidades distais do primeiro fragmento e/ou do segundo fragmento a uma sequência adicional de aminoácidos.

[00100] Um ligante da sequência de peptídeos pode ser empregado para separar o primeiro fragmento e segundo fragmento. Um ligante da sequência de peptídeos como este é incorporado na proteína de fusão usando técnicas padrão bem conhecidas na tecnologia. Ligante da sequência de peptídeos adequados podem ser escolhidos com base nos seguintes fatores: (1) sua capacidade de adotar uma conformação estendida flexível; (2) sua incapacidade de adotar uma estrutura secundária que poderia interagir com epítopos funcionais no primeiro fragmento e/ou do segundo fragmento; e (3) a falta de resíduos hidrofóbicos ou carregados que devem reagir com os epítopos funcionais de ToxA e/ou ToxB. Ligantes da sequência de peptídeos podem conter resíduos de Glicina(Gly), Asparagina (Asn) e Serina (Ser). Outros aminoácidos quase neutros, tais como Thr e Ala também podem ser usados no ligante de sequências. Sequências de aminoácidos que podem ser usadas empregadas como ligantes incluem as reveladas em Maratea et al., Gene 40:39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:82588262 (1986); patente U.S. No. 4.935.233 e patente U.S. No. 4.751.180. O ligante de sequências geralmente podem ser de 1 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento.

[00101] Em uma modalidade o ligante compreende 1-20, 1-15, 1-10, 15, 1-2, 5-20, 5-15, 5-15, 10-20 ou 10-15 aminoácidos. Em uma modalidade o ligante é um ligante de glicina, o ligante pode compreender múltiplos resíduos de glicina contíguos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17 ou 20) ou alternativamente o ligante pode compreender alguns resíduos de glicina e alguns resíduos de outros aminoácidos, tal como alanina. Em uma modalidade adicional o ligante compreende um único resíduo de glicina.

[00102] Em uma modalidade o polipeptídeo da invenção é parte de uma proteína de fusão maior. As proteínas de fusão podem compreender adicionalmente aminoácidos que codificam uma porção imunogênica de um antígeno de proteína adicional. Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender adicionalmente uma porção imunogênica de um antígeno de proteína obtido ou derivado de uma bactéria selecionada do grupo que consiste em S.pneumoniae, H.influenzae, N.meningitidis, E.coli, M.cattarhalis, C.tetanii, C.diphtheriae, B.pertussis, S.epidermidis, enterococos, S.aureus e Pseudomonas aeruginosa. Neste caso o ligante pode estar entre o primeiro fragmento ou o segundo fragmento e uma porção imunogênica adicional de um antígeno de proteína.

[00103] O termo “porção imunogênica deste” ou ‘fragmento imunogênico’ refere-se a um fragmento de um polipeptídeo em que o fragmento compreende um epítopo que é reconhecido por linfócitos T citotóxicos, linfócitos T ajudantes ou células B. Adequadamente, a porção imunogênica compreender pelo menos 30%, adequadamente pelo menos 50%, especialmente pelo menos 75% e em particular pelo menos 90% (por exemplo 95% ou 98%) dos aminoácidos na sequência de referência. Em uma modalidade, a porção imunogênica compreenderá todas as regiões do epítopo da sequência de referência.

[00104] Também espera-se que as composições imunogênicas de acordo com a invenção compreendendo as proteínas de fusão específicas do fragmento do domínio de repetição da toxina A de C. difficile e um fragmento do domínio de repetição da toxina B de C. difficile aqui descritas forneçam uma melhor resposta imune contra C. difficile comparadas às composições compreendendo polipeptídeos ou fragmentos de C. difficile conhecidos.

ADJUVANTES

[00105] As composições imunogênicas aqui reveladas incluem pelo menos um polipeptídeo de C. difficile em combinação com um adjuvante sem alumínio. Os polipeptídeos são formulados com um adjuvante que não tem alumínio ou sais de alumínio, isto é, um adjuvante sem alumínio ou sistema de adjuvante.

[00106] Em certas modalidades, o polipeptídeo de C. difficile é formulado com um adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa apresentada na forma de um lipossoma. O adjuvante pode compreender adicionalmente um lipopolissacarídeo. O adjuvante pode incluir QS21. Por exemplo, em uma modalidade, o adjuvante contém QS21 em uma formulação lipossomal. Em uma modalidade, o sistema de adjuvante inclui 3D-MPL e QS21. Por exemplo, em uma modalidade, o adjuvante contém 3D-MPL e QS21 em uma formulação lipossomal. Opcionalmente, o sistema de adjuvante também contém colesterol. Em uma modalidade específica, o adjuvante inclui QS21 e colesterol. Opcionalmente, o sistema de adjuvante contém 1, 2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DOPC). Por exemplo, em um sistema de adjuvante específico contém colesterol, DOPC, 3D-MPL e QS21.

[00107] Em um exemplo específico, a composição imunogênica inclui um adjuvante formulado em uma dose que inclui: de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 mg de colesterol; de cerca de 0,25 a cerca de 2 mg de DOPC; de cerca de 10 μg a cerca de 100 μg de 3D-MPL; e de cerca de 10 μg a cerca de 100 μg QS21. Em um exemplo específico adicional a composição imunogênica inclui e adjuvante formulado em uma dose que inclui: de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 mg de colesterol, de cerca de 0,25 a cerca de 2 mg de DOPC, de cerca de 10 μg a cerca de 100 μg 3D-MPL e de cerca de 10 μg a cerca de 100 μg de QS21. Em uma formulação específica adicional o adjuvante é formulado em uma dose compreendendo de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 mg de colesterol, de cerca de 0,25 a cerca de 2 mg de DOPC, de cerca de 10 μg a cerca de 70 μg 3D-MPL e de cerca de 10 μg a cerca de 70 μg de QS21. Em uma formulação específica, o adjuvante é formulado em uma única dose que contém: cerca de 0,25 mg de colesterol; cerca de 1,0 mg de DOPC; cerca de 50 μg de 3D-MPL; e cerca de 50 μg QS21. Em outras modalidades, a composição imunogênica é formulada com uma dose fracional (que é uma dose, que é uma fração das formulações de dose única anteriores, tais como metade da quantidade anterior dos componentes (colesterol, DOPC, 3D-MPL e QS21), % da quantidade anterior dos componentes ou uma outra dose fracional (por exemplo, 1/3, 1/6, etc.) da quantidade anterior dos componentes.

[00108] Em uma modalidade, as composições imunogênicas de acordo com a invenção incluem um adjuvante contendo combinações de lipopolissacarídeo e saponinas de Quillaja que foram reveladas anteriormente, por exemplo, em EP0671948. Esta patente demonstrou uma forte sinergia quando um lipopolissacarídeo (3D-MPL) foi combinado com uma saponina de Quillaja (QS21).

[00109] O adjuvante pode compreender adicionalmente oligonucleotídeos imunoestimulatórios (por exemplo, CpG) ou um carreador.

[00110] Uma saponina particularmente adequada para uso na presente invenção é Quil A e seus derivados. Quil A é uma preparação de saponina isolada da árvore da América do Sul Quillaja Saponaria Molina e foi primeiro descrita por Dalsgaard et al. em 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254) por ter atividade adjuvante. Fragmentos purificados de Quil A foram isolados por HPLC que retém atividade adjuvante sem a toxicidade associada com Quil A (EP 0 362 278), por exemplo, QS7 e QS21 (também conhecido como QA7 e QA21). QS21 é uma saponina neutra derivada da casca de Quillaja saponaria Molina, que induz células T citotóxicas CD8+ (CTLs), células Th1 e uma resposta de anticorpo IgG2a predominante e é uma saponina preferida no contexto da presente invenção.

[00111] Em uma modalidade específica, QS21 é fornecido na sua composição menos reatogênica onde ela é finalizada com um esterol exógeno, tal como colesterol, por exemplo. Existem várias formas particulares de composições menos reatogênicas em que QS21 é finalizado com um colesterol exógeno. Em uma modalidade específica, a saponina /esterol é na forma de uma estrutura de lipossoma (WO 96/33739, Exemplo 1). Nesta modalidade os lipossomas adequadamente contêm um lipídeo neutro, por exemplo, fosfatidilcolina, que é adequadamente não cristalino a temperatura ambiente, por exemplo, fosfatidilcolina de gema de ovo, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) ou dilauril fosfatidilcolina. Os lipossomas também podem conter um lipídeo carregado que aumenta a estabilidade da estrutura lipossoma-QS21 para lipossomas compostos de lipídeos saturados. Nestes casos a quantidade de lipídeo carregado é adequadamente 1-20% p/p, preferivelmente 5-10%. A razão de esterol para fosfolipídeo é 1-50% (mol/mol), adequadamente 20-25%.

[00112] Esteróis adequados incluem β-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol e colesterol. Em uma modalidade particular, a composição adjuvante compreende colesterol como esterol. Estes esteróis são bem conhecidos na tecnologia, por exemplo, colesterol é revelado no Merck Index, 11a Edn., página 341, como um esterol que ocorre naturalmente encontrado na gordura animal.

[00113] Onde a fração de saponina ativa é QS21, a razão de QS21 : esterol tipicamente será na ordem de 1:100 a 1:1 (p/p), adequadamente entre 1:10 a 1:1 (p/p) e preferivelmente 1:5 a 1:1 (p/p). Adequadamente excesso de esterol está presente, a razão de QS21:esterol sendo pelo menos 1:2 (p/p). Em uma modalidade, a razão de QS21:esterol é 1:5 (p/p). O esterol é adequadamente colesterol.

[00114] Em uma modalidade, a invenção fornece uma dose de uma composição imunogênica compreendendo saponina imunologicamente ativa, preferivelmente QS21, a um nível de 60 μg ou menos, por exemplo, entre 1 e 60 μg. Em uma modalidade, a dose da composição imunogênica compreende QS21 a um nível de aproximadamente em torno de 50 μg, por exemplo, entre 45 e 55 μg, adequadamente entre 46 - 54 μg ou entre 47 e 53 μg ou entre 48 e 52 μg ou entre 49 e 51 μg ou 50 μg por dose.

[00115] Em uma outra modalidade a dose da composição imunogênica compreende QS21 a um nível em torno de 25 μg, por exemplo, entre 20 - 30 μg, adequadamente entre 21 - 29 μg ou entre 22 e 28 μg ou entre 23 e 27 μg ou entre 24 e 26 μg ou 25 μg.

[00116] Em uma outra modalidade, a dose da composição imunogênica compreende QS21 a um nível em torno de 10 μg por, por exemplo, entre 5 e 15 μg, adequadamente entre 6 e 14 μg, por exemplo, entre 7 e 13 μg ou entre 8 e 12 μg ou entre 9 e 11 μg ou 10 μg.

[00117] Especificamente, um 0,5 mL de volume de dose de vacina contém 25 μg ou 50 μg de QS21 por dose. Especificamente, um 0,5 mL de volume de dose de vacina contém 50 μg de QS21 por dose.

[00118] O lipopolissacarídeo pode ser um derivado não tóxico de lipídeo A, particularmente monofosforil lipídeo A ou mais particularmente 3- Desacilado monofosforil lipídeo A (3D - MPL).

[00119] 3D-MPL é vendido com o nome MPL por GlaxoSmithKline Biologicals N.A. e é referido em todo o documento como MPL ou 3D-MPL. Ver, por exemplo, patentes U.S. Nos. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 e 4.912.094. 3D-MPL principalmente promove respostas de célula T CD4+ com um fenótipo IFN-D (Th1). 3D-MPL pode ser produzido de acordo com os métodos revelados em GB 2 220 211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente nas composições da presente invenção 3D-MPL de partícula pequena é usado. 3D-MPL de tamanho pequeno tem um tamanho de partícula, de maneira tal que pode ser filtrado para esterilidade através de um filtro de 0,22 μ m. Tais preparações são descritas em WO 94/21292.

[00120] A invenção, desta forma, fornece uma dose de uma composição imunogênica compreendendo lipopolissacarídeo, preferivelmente 3D-MPL, a um nível de 75 μg ou menos, por exemplo, entre 1 e 60 μg. Em uma modalidade o lipopolissacarídeo está presente em uma quantidade de cerca de 50 μg por dose.

[00121] Em uma modalidade, a dose da composição imunogênica compreende 3D-MPL a um nível em torno de 50 μg, por exemplo, entre 45 - 55 μg, adequadamente entre 46 - 54 μg ou entre 47 e 53 μg ou entre 48 e 52 μg ou entre 49 e 51 μg ou 50 μg.

[00122] Em uma modalidade, a dose da composição imunogênica compreende 3D-MPL a um nível em torno de 25 μg, por exemplo, entre 20 - 30 μg, adequadamente entre 21 - 29 μg ou entre 22 e 28 μg ou entre 23 e 27 μg ou entre 24 e 26 μg ou 25 μg.

[00123] Em uma outra modalidade, a dose da composição imunogênica compreende 3D-MPL a um nível em torno de 10 μg, por exemplo, entre 5 e 15 μg, adequadamente entre 6 e 14 μg, por exemplo, entre 7 e 13 μg ou entre 8 e 12 μg ou entre 9 e 11 μg ou 10 μg.

[00124] Em uma modalidade, o volume da dose é 0,5 mL. Em uma modalidade adicional, a composição imunogênica é em um volume adequado para uma dose cujo volume é maior que 0,5 mL, por exemplo, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mL. Em uma modalidade adicional, a dose humana é entre 1 mL e 1,5 mL.

[00125] Especificamente, um volume de dose de vacina de 0,5 mL contém 25 μg ou 50 μg de 3D-MPL por dose. Especificamente, um volume de dose de vacina de 0,5 mL contém 50 μg de 3D-MPL por dose.

[00126] A dose da composição imunogênica de acordo com qualquer aspecto da invenção adequadamente refere-se à dose humana. Pelo termo “dose humana” entende-se uma dose que é em um volume adequado para uso humano. Geralmente este é entre 0,3 e 1,5 mL. Em uma modalidade, uma dose humana é 0,5 mL. Em uma modalidade adicional, uma dose humana é maior que 0,5 mL, por exemplo, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mL. Em uma modalidade adicional, uma dose humana é entre 1 mL e 1,5 mL.

[00127] Composições da invenção adequadas são as em que lipossomas são inicialmente preparadas sem MPL (conforme descrito em WO 96/33739) e MPL é então adicionado, adequadamente na forma de partículas pequenas abaixo de partículas de 100 nm ou partículas que são suscetíveis à filtração estéril através de uma membrana de 0,22 μm. O MPL, desta forma, não está contido na membrana da vesícula (conhecido como MPL fora). Composições onde o MPL está contido na membrana da vesícula (conhecido como MPL dentro) também formam um aspecto da invenção. O polipeptídeo compreendendo um fragmento de toxina A de C. difficile e/ou um fragmento de toxina B de C. difficile pode estar contido na membrana de vesícula ou contido fora da membrana da vesícula.

[00128] Em uma modalidade específica, QS21 e 3D-MPL estão presentes na mesma concentração final por dose da composição imunogênica. Em um aspecto desta modalidade, uma dose da composição imunogênica compreende um nível final de 25 μg de 3D-MPL e 25 μg de QS21 ou 50 μg de 3D-MPL e 50 μg de QS21.

[00129] Em uma modalidade, o adjuvante inclui uma emulsão óleo- em-água. Por exemplo, a emulsão óleo-em-água pode incluir uma fase de óleo que incorpora um óleo metabolizável e um componente da fase de óleo adicional, tal como um tocol. A emulsão óleo-em-água também pode conter um componente aquoso, tal como uma solução de salina tamponada (por exemplo, salina tamponada de fosfato). Além do mais, a emulsão óleo-em- água tipicamente contém um emulsificante. Em uma modalidade, o óleo metabolizável é esqualeno. Em uma modalidade, o tocol é alfa-tocoferol. Em uma modalidade, o emulsificante é um emulsificante agente tensoativo não iônico (tal como mono-oleato de polioxietetileno sorbitano, TWEEN80™). Em modalidades exemplares, a emulsão óleo-em-água contém esqualeno e alfa tocoferol em uma razão que é igual ou menor que 1 (p/p).

[00130] O óleo metabolizável na emulsão óleo-em-água pode estar presente em uma quantidade de 0,5-10 mg. O tocol na emulsão óleo-em-água pode estar presente em uma quantidade de 0,5 - 11 mg. O agente de emulsificação na emulsão óleo-em-água pode estar presente em uma quantidade de 0,4 - 4 mg.

[00131] De maneira que qualquer óleo em água composição seja adequado para administração a humano, a fase de óleo do sistema de emulsão tem que compreender um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem conhecido na tecnologia. Metabolizável pode ser definido como ‘sendo capaz de ser transformado por metabolismo’ (Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25a edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que não é tóxico ao receptor e é capaz de ser transformado por metabolismo. Raízes, sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Óleos sintéticos também são parte desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis, tais como NEOBEE® (triglicerídeos caprílico/cáprico feitos usando glicerol de fontes de óleo vegetal e ácidos graxos de cadeia média (MCTs) de óleos de coco ou semente de palma) e outros. Um óleo metabolizável particularmente adequado é esqualeno. Esqualeno (2,6,10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosaexaeno) é um óleo insaturado que é encontrado em grandes quantidades em óleo de fígado de tubarão e em quantidades menores em óleo de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de casca de arroz e levedura e é um óleo particularmente preferido para uso nesta invenção. Esqualeno é um óleo metabolizável em virtude do fato de que ele é um intermediário na biossíntese de colesterol (Merck index, 10a Edição, entrada no.8619).

[00132] Adequadamente o óleo metabolizável está presente na composição adjuvante em uma quantidade de 0,5-10 mg, preferivelmente 110, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 ou 5-6 mg (por exemplo 2-3, 5-6 ou 9-10 mg), especificamente cerca de 5,35 mg ou em torno de 2,14 mg/dose.

[00133] Tocóis são bem conhecidos na tecnologia e são descritos em EP0382271. Adequadamente o tocol é alfa-tocoferol ou um derivado deste, tais como succinato de alfa-tocoferol (também conhecido como succinato de vitamina E). O dito tocol adequadamente está presente em uma quantidade de 0,5-11 mg, preferivelmente 1-11, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 mg (por exemplo 10-11, 5-6, 2.5-3.5 ou 1-3 mg). Em uma modalidade específica o tocol está presente em uma quantidade de cerca de 5,94 mg ou em torno de 2,38 mg por dose.

[00134] A emulsão óleo em água compreende adicionalmente um agente de emulsificação. O agente de emulsificação adequadamente pode ser mono-oleato de polioxietileno sorbitano. Em uma modalidade particular o agente de emulsificação pode ser Polissorbato® 80 (Polioxietileno (20) mono-oleato de sorbitano) ou Tween® 80.

[00135] O dito agente de emulsificação adequadamente está presente na composição adjuvante em uma quantidade de 0,1-5, 0,2-5, 0,3-4, 0,4-3 ou 2-3 mg (por exemplo 0,4-1.2, 2-3 ou 4-5 mg) de agente de emulsificação. Em uma modalidade específica o agente de emulsificação está presente em uma quantidade de cerca de 0,97 mg ou cerca de 2,425 mg.

[00136] Em uma modalidade, as quantidades de componentes específicos presentes na composição são as quantidades presentes em uma dose humana de 0,5 mL. Em uma modalidade adicional, a composição imunogênica é em um volume adequado para uma dose humana cujo volume é maior que 0,5 mL, por exemplo, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mL. Em uma modalidade adicional, a dose humana é entre 1 mL e 1,5 mL.

[00137] Onde o adjuvante está em uma forma líquida e é para ser combinado com uma forma líquida de uma composição de polipeptídeo, a composição adjuvante em uma dose humana será uma fração do volume final pretendido da dose humana, por exemplo, aproximadamente metade do volume final pretendido da dose humana, por exemplo, um volume de 350 μL para uma dose humana pretendida de 0,7 mL ou um volume de 250 μL para uma dose humana pretendida de 0,5 mL. A composição adjuvante é diluída quando combinada com a composição de antígeno de polipeptídeo para fornecer a dose humana final da vacina. O volume final de uma dose como esta, certamente, variará dependendo do volume inicial da composição adjuvante e o volume da composição de antígeno de polipeptídeo adicionado na composição adjuvante. Em uma modalidade alternativa, um adjuvante líquido é usado para reconstituir uma composição de polipeptídeo liofilizada. Nesta modalidade, o dose humana da composição adjuvante é aproximadamente igual ao volume final da dose humana. A composição adjuvante líquida é adicionada ao frasco contendo a composição de polipeptídeo liofilizada. A final dose humana pode variar entre 0,5 e 1,5 mL.

[00138] O método de produzir emulsões óleo-em-água é bem conhecido por versados na tecnologia. Comumente, o método compreende misturar a fase de óleo contendo tocol com um agente tensoativo, tais como uma solução PBS/ mono-oleato de polioxietileno sorbitano, seguido por homogeneização usando um homogeneizador. Ficará evidente para um versado na tecnologia que um método compreendendo passar a mistura duas vezes através de uma agulha da seringa será adequado para homogeneizar pequenos volumes de líquido. Igualmente, o processo de emulsificação em microfluidisador (máquina M110S Microfluidics, máximo de 50 passagens, por um período de 2 minutos a uma entrada de pressão máxima de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar)) poderia ser adaptado por versados na tecnologia para produzir volumes menores ou maiores de emulsão. A adaptação poderia ser alcançada por experimentação de rotina compreendendo a medição da emulsão resultante até que uma preparação fosse alcançada com gotículas de óleo do diâmetro requerido.

[00139] Em uma emulsão óleo em água, o óleo e emulsificante deveriam ser em um carreador aquoso. O carreador aquoso pode ser, por exemplo, salina tamponada de fosfato.

[00140] Preferivelmente os sistemas emulsão óleo-em-água da presente invenção têm um tamanho de gotícula de óleo pequeno na faixa submicron. Adequadamente os tamanhos da gotícula serão na faixa de 120 a 750 nm, mais preferivelmente tamanhos de 120 a 600 nm de diâmetro. Acima de tudo preferivelmente a emulsão óleo-em-água contém gotículas de óleo das quais pelo menos 70% em intensidade são menos que 500 nm de diâmetro, mais preferivelmente pelo menos 80% em intensidade são menos que 300 nm de diâmetro, mais preferivelmente pelo menos 90% em intensidade são na faixa de 120 a 200 nm de diâmetro.

[00141] Em uma modalidade, a composição imunogênica não é 3 μg ou 10 μg de qualquer de SEQ ID Nos. 1 a 7 combinado com um adjuvante compreendendo uma emulsão óleo em água tendo 0,125 mL de emulsão de SB62 (Volume total), 5,35 mg de esqualeno, 5,94 mg de DL-α-tocoferol e 2,425 mg de polissorbato 80 por dose de 0,5 mL. Em uma modalidade, a composição imunogênica não é 3 μg ou 10 μg de qualquer um de SEQ ID Nos. 1 a 7 combinado com um adjuvante compreendendo uma emulsão óleo em água 5,35 mg de esqualeno, 5,94 mg de DL-α-tocoferol e 2,425 mg de polissorbato 80 por dose de 0,5 mL. Em uma modalidade, a composição imunogênica não contém um adjuvante compreendendo uma emulsão óleo em água tendo esqualeno, DL-α-tocoferol e polissorbato 80.

COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS E VACINAS

[00142] Em uma modalidade a composição imunogênica compreende adicionalmente antígenos adicionais. Em uma modalidade os antígenos adicionais são antígenos derivados de uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Haemophilus influenzae (H.influenzae), Neisseria meningitidis (N.meningitidis), Escherichia coli (E.coli), Moraxella catarrhalis (M.cattarhalis), Clostridium tetani (C. tetani), Corynebacterium diptherieriae (C. diptherieriae), Bordetella pertussis (B. pertussis), Staphilococcus epidermidis (S.epidermidis), enterococos e Staphilococcus aureus (S.aureus). Em uma modalidade adicional a composição imunogênica da invenção pode compreender antígenos adicionais de C. difficile por exemplo, as proteínas em camadas-S (WO01/73030). Opcionalmente a composição imunogênica compreende adicionalmente um sacarídeo de C. difficile.

[00143] É adicionalmente fornecida uma vacina compreendendo a composição imunogênica. Esta vacina pode compreender adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto adicional da invenção é fornecida uma vacina compreendendo a composição imunogênica da invenção e um adjuvante.

[00144] As preparações de vacina contendo composições imunogênicas da presente invenção podem ser usadas para proteger um mamífero suscetível à infecção por C. difficile ou tratar um mamífero com uma infecção por C. difficile, por meio da administração da dita vacina por meio de uma via sistêmica ou mucosal. Estas administrações podem incluir injeção por vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou por administração mucosal nos tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. Embora a vacina da invenção possa ser administrada como uma única dose, componentes destes também podem ser coadministrados juntos ao mesmo tempo ou em tempos diferentes (por exemplo, conjugados de sacarídeo pneumocócico poderiam ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas depois da administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina para coordenação da resposta imunes com relação um ao outro). Além de uma via única de administração, 2 diferentes vias de administração podem ser usadas. Por exemplo, sacarídeos ou conjugados de sacarídeo podem ser administrados intramuscular (IM) ou intradermicamente (ID) e proteínas bacterianas podem ser administrados intranasal (EM) ou intradermicamente (ID). Além do mais, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses de início e EM para doses de reforço.

[00145] O conteúdo das toxinas na vacina tipicamente será na faixa de 1-250 μg, preferivelmente 5-50 μg, acima de tudo tipicamente na faixa de 5 - 25 μg. Depois de uma vacinação inicial, indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas. A preparação da vacina é geralmente descrita em Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação nos lipossomas é descrita por Fullerton, patente U.S. 4.235.877.

[00146] Em um aspecto da invenção é fornecido um estojo de vacina, compreendendo um frasco contendo uma composição imunogênica da invenção, opcionalmente na forma liofilizada e compreende adicionalmente um frasco contendo um adjuvante conforme descrito aqui. Prevê-se que neste aspecto da invenção, o adjuvante será usado para reconstituir a composição imunogênica liofilizada.

[00147] Um aspecto adicional da invenção é um método de prevenir ou tratar infecção por C. difficile compreendendo administrar ao indivíduo uma dose imunoprotetora da composição imunogênica ou vacina da invenção. Em uma modalidade é fornecido um método de prevenir ou tratar episódios primários e/ou de recorrência de infecção por C. difficile compreendendo administrar ao indivíduo uma dose imunoprotetora da composição imunogênica ou vacina da invenção. Em uma modalidade o indivíduo é selecionado do grupo que consiste em camundongo, coelho, porquinho da India, macaco, primata não humano ou humano. Em uma modalidade o indivíduo é um camundongo. Em uma modalidade adicional o indivíduo é um humano.

[00148] Um aspecto adicional da invenção é uma composição imunogênica ou vacina ou estojo da invenção para uso no tratamento ou prevenção de infecção ou doença causada por C. difficile. Em uma modalidade é fornecida uma composição imunogênica ou vacina ou estojo da invenção para uso no tratamento ou prevenção de episódios primários e/ou recorrentes de doença de C. difficile.

[00149] Um aspecto adicional da invenção é uso da composição imunogênica ou vacina ou estojo da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença de C. difficile. Em uma modalidade é fornecida uma composição imunogênica ou vacina ou estojo da invenção para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de episódios primários e/ou recorrentes de doença de C. difficile.

[00150] “Doença de C. difficile” refere-se a qualquer infecção ou doença causada por toxinas liberadas por C. difficile. Exemplos de doença de C. difficile são diarreia associada por antibiótico (AAD), colite pseudomembranosa e megacolon tóxico, que pode ser fatal.

[00151] “Em torno de” ou “aproximadamente” são definidos como em 10% mais ou menos da dada figura para os propósitos da invenção.

[00152] Os termos “compreendendo”, “compreender” e “compreende” aqui são pretendidos pelos inventores para ser opcionalmente adequados com os termos “que consiste em”, “consiste em” e “consiste em”, respectivamente, em muitos casos. O termo “compreende” significa “inclui.” Assim, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra “compreende,” e variações, tais como “compreender” e “compreendendo” serão entendidas para significar a inclusão de um composto ou composição estabelecido (por exemplo, ácido nucléico, polipeptídeo, antígeno) ou etapa ou grupo de compostos ou etapas, mas não a exclusão de quaisquer outros compostos, composição, etapas ou grupos destes. A abreviação, “por exemplo” é derivada do latim exempli gratia e é usada aqui para indicar um exemplo não limitante. Assim, a abreviação “por exemplo” é sinônimo com o termo “por exemplo.”

[00153] Modalidades aqui com relação à “vacina” da invenção também são aplicáveis às modalidades com relação às “composições imunogênicas” da invenção e vice versa.

[00154] A menos que de outra forma explicado, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado comumente entendido por um versado na tecnologia ao qual esta revelação pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Enciclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[00155] Os termos singulares “um,” “uma,” “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Similarmente, a palavra “ou” deve incluir “e” a menos que o contexto claramente indique de outra forma. O termo “pluralidade” refere-se a dois ou mais. Adicionalmente entende-se que tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácido e todos os valores de peso molecular ou massa molecular dados para ácidos nucléicos ou polipeptídeos são estimativas e são fornecidos para descrição. Adicionalmente, limitações numéricas dadas com relação às concentrações ou níveis de uma substância, tal como um antígeno de polipeptídeo, podem ser aproximados.

[00156] Todas as referências ou pedidos de patente citados neste pedido de patente são incorporados pela referência aqui na íntegra.

[00157] Estes exemplos apresentados a seguir são para os propósitos de ilustração somente e não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção de nenhuma maneira.

[00158] Entende-se que aspectos e modalidades particulares aqui descritos são mostrados a título de ilustração e não como limitações da invenção. As principais características desta invenção podem ser empregadas em várias modalidades sem fugir do escopo da invenção. Versados na tecnologia perceberão ou serão capazes de determinar usando estudo de rotina, inúmeros equivalentes aos procedimentos específicos aqui descritos. Tais equivalentes são considerados como no escopo desta invenção e são cobertos pelas reivindicações.

[00159] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível de habilidade dos versados na tecnologia ao qual esta invenção refere-se. Todas as publicações e pedidos de patente estão aqui incorporados pela referência igualmente como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado pela referência. Todos os documentos aqui referidos são incorporados pela referência até o ponto permitido.

[00160] O uso da palavra “um” ou “uma” quando usado em conjunto com o termo “compreendendo” nas reivindicações e/ou na especificação pode significar “um,” mas ele também é consistente com o significado de “um ou mais,” “pelo menos um,” e “um ou mais que um.”

[00161] A invenção será descrita em mais detalhes pela referência às seguintes figuras e exemplos não limitantes.

EXEMPLOS Adjuvantes usados nos experimentos: Adjuvante A

[00162] Adjuvante tendo 50 μg de QS21 apresentada na forma de um lipossoma, 50 μg de 3D-MPL, 0,25 mg de colesterol e 1,0 mg de DOPC por 0,5 mL de dose. Uma dose de 50 μL adequada para imunização de hamsters contém 5 μg de QS21, 5 μg de 3D-MPL, 0,025 mg de colesterol e 0,1 mg de DOPC. Adjuvante B

[00163] Adjuvante que consiste em uma emulsão óleo em água tendo 0,125 mL de emulsão de SB62 (Volume total), 5,35 mg de esqualeno, 5,94 mg de DL-α-tocoferol e 2,425 mg de polissorbato 80 por dose de 0,5 mL. Uma dose de 50 μL contém 0,0125 mL de emulsão de SB62 (Volume total), 0,53 5mg de esqualeno, 0,594 mg de DL-α-tocoferol e 0,2425 mg de polissorbato 80. Adjuvante C

[00164] Adjuvante tendo 25 μg de QS21 apresentado na forma de um lipossoma, 25 μg de 3D-MPL, 0,25 mg de colesterol e 1,0 mg de DOPC. Uma dose de 50 μL contém 2,5 μg de QS1', 2,5 μg de 3D-MPL, 0,025 mg de colesterol e 0,1 mg de DOPC. GSK adjuvante AS04D Adjuvante tendo 50 μg de MPL e 0,5 mg (Al3+ total) por dose de 0,5 mL. Uma dose de 50 μL contém 5 μg de MPL e 50 μg (AL3+ total). Alum Adjuvante tendo Hidróxido de alumínio, 500 μg por dose de 0,5 mL. Uma dose de 50 μL adequado de imunização de hamster contém 50 μg por dose de 50 μg. Protocolos Resposta anti-ToxA e anti-ToxB ELISA: Protocolo para os exemplos 2 a 4, 7 e 8

[00165] Fragmentos ToxA ou ToxB (para os exemplos 2 e 4 -ToxA (2121-2686) e ToxB (1968-2366) para os exemplos 3, 5, 6, 7 e 8 -ToxA (2387-2706) e ToxB (1750-2360)) foram revestidos a 2 μg/mL (para ToxA) ou 1 μg/mL (para ToxB) em salina tamponada de fosfato (PBS) em placas de microtitulação de alta ligação (Nunc MAXISORPTM), durante toda a noite a 4 °C. As placas foram bloqueadas com PBS+1% de soro de albumina sérica (BSA) para 30 min a RT com agitação. Soros de Hamster ou camundongos são pré-diluídos 1/100 (para amostras pós dose I ou II) ou 1/500 (para amostras pós dose III) em PBS-BSA0,2%-TWEENTM 0,05% e então, 2 diluições de duas vezes adicionais foram feitas em microplacas e incubadas a temperatura ambiente (RT) por 30 min. Depois da lavagem, anticorpo de hamster ou camundongo ligado foi detectado usando Jackson ImmunoLaboratories Inc. Anti-Camundongo conjugado à peroxidase (ref: 110-035-003) ou Anti-Hamster (ref: 107-035-142) diluído 1:5000 em PBS- BSA0,2%-tween 0,05% (‘anticorpo de detecção’). Os anticorpos de detecção foram incubados por 30 min a 20 °C com agitação. A cor foi desenvolvida usando 4 mg de O-fenilenediamina (OPD) + 5 μL de H2O2 por 10 mL de tampão de citrato 0,1 M pH 4,5 por 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50 μL de HCl e a densidade ótica (OD) foi lida a 490 nm com relação a 620 nm.

[00166] O nível de anticorpos anti-ToxA ou anti-ToxB presentes em cada soro individual é determinado por comparação a um soro de referência (calibrado contra Jackson Global IgG) adicionado em cada placa e expresso em μg/mL. Um título médio geométrico de GMT foi calculado usando software Excel para as amostras em cada grupo de tratamento para as imunizações de hamster ou camundongos.

Exemplo 1 Projeto de cinco proteínas de fusão de ToxA-ToxB de C. Difficile

[00167] Proteínas de fusão (também chamadas ‘fusões’) contendo fragmentos dos Domínios de repetição C-terminais de ToxA e ToxB foram projetadas. Estas proteínas de fusão continham um fragmento do Domínio de repetição C-terminal de ToxA e um fragmento do domínio de repetição C- terminal de ToxB e um junção entre a extremidade C-terminal do fragmento ToxA e a extremidade N terminal do fragmento ToxB. Duas estratégias foram elaboradas, na primeira estratégia; a fusão foi projetada, de maneira tal que a estrutura solenóide longa foi mantida na junção entre os dois fragmentos. Na segunda estratégia, os dois fragmentos das fusões são separados por um ligante para permitir seu dobramento correto independente.

[00168] A parte C-terminal de ToxA e ToxB é composta de SEQuências repetidas: repetições curtas (SR) e repetições longas (LR) (PNAS 2005 vol 102 : 18373-18378).

[00169] A estrutura 3D parcial conhecida para o domínio C-terminal de ToxA foi descrita (PNAS 2005 Greco et al., vol 102 : 18373-18378 ; Nature Structural & Molecular biology 2006 vol 13(5) : 460-461 ; PDB codes : 2F6E, 2G7C e 2QJ6).

[00170] Os inventores previram que existem dois tipos de interações importantes entre resíduos da parte C-terminal de ToxA e ToxB. A primeira interação ocorre entre resíduos contidos em um LR e seu SR anterior e é importante para manter a estrutura tipo solenóide. O segundo tipo de interação ocorre entre resíduos contidos em um LR e o seguinte SR e esta interação medeia a função de ligação ao carboidrato da toxina.

[00171] Uma repetição SR-LR-SR “estrutural-funcional” inédita foi definida. A estrutura desta repetição foi mantida intacta nas fusões projetadas.

[00172] As posições das repetições curtas (SR) e longas (LR) das repetições ToxA e ToxB são apresentadas na tabela 1.

[00173] Uma lista das caixas “SR-LR-SR” contida no domínio C- terminal de ToxA e ToxB está apresentada na tabela 2 a seguir.

[00174] Finalmente, o número de SRs entre dois LRs foi mantido nas fusões projetadas para manter a estrutura tipo solenóide longa.

[00175] Antes do projeto das junções para as fusões, duas hipóteses de trabalho foram definidas: primeira hipótese, quanto mais curtas as fusões, melhor a probabilidade de as fusões serem estavelmente sobre expressas; segunda hipótese, de acordo com o conceito de caixas “SR-LR-SR”, a posição de início tem que ser escolhida de maneira a garantir uma correta dobra do primeiro SR desta caixa SR-LR-SR previamente definida. Assim, as fusões se iniciam no começo do SR que antecede a caixa SR-LR-SR. Usando estas duas hipóteses, três posições de início foram analisadas: resíduo 2370, 2234 e 2121 de ToxA.

[00176] A posição de início 2370 foi excluída. A posição de início 2234 também foi excluída em virtude de um dos resíduos envolvidos nas interações importantes para a estabilidade estrutural da proteína não ser conservado. Assim, decidiu-se que todas as fusões projetadas começarão no 2121 de ToxA.

[00177] Todas as fusões terminarão no último resíduo de ToxB.

[00178] Quatro fusões (F1-4) foram projetadas de maneira a manter toda a fusão em uma estrutura tipo solenóide longa entre os dois fragmentos de fusão.

[00179] Fusões 1 (F1) e 2 (F2) foram projetadas usando a mesma hipótese. Todas as sequências de proteínas SR de ToxA e ToxB foram comparadas usando um software de múltiplos alinhamentos (ClustalW - Thompson JD et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680). As sequências mais similares foram a terceira SR VIII de ToxA e a terceira SR II de ToxB e terceira SR III de ToxB. De maneira a fazer uma escolha entre estas duas SR de ToxB, um modelamento de homologia estrutural (usando a interface SwissModel - Arnold K et al. (2006) Bioinformatics, 22, 195-201) foi realizada na parte C-terminal de ToxB usando a estrutura 3D conhecida do domínio C-terminal parcial de ToxA (PDB code : 2QJ6). Usando o terceiro SR VIII de ToxA, a melhor superposição estrutural local (realizada usando SwissPDBViewer - Guex N et al. (1997), Electrophoresis 18, 2714-2723) foi obtida com o terceiro SR II de ToxB. Assim, duas junções foram projetadas: a primeira é entre o terceiro SR VIII de ToxA e o quarto SR II de ToxB (F1) e a segunda é entre o segundo SR VIII de ToxA e o terceiro SR II de ToxB (F2).

[00180] Para projetar a fusão 3 (F3), uma superposição estrutural global foi realizada tanto entre a estrutura conhecida do domínio C-terminal parcial de ToxA quanto a estrutura prevista do domínio C-terminal de ToxB (usando softwares SwissModel e SwissPDBViewer). A melhor superposição foi encontrada entre LR VII de ToxA e LR II de ToxB. Assim, decidiu-se preparar uma junção neste LR similar. A junção foi realizada principalmente em uma região onde a sequência é conservada entre ToxA e ToxB, depois desta de maneira a manter na parte ToxA da fusão, os resíduos em interação com o SR anterior e finalmente, de maneira a manter na parte ToxB, os resíduos em interação com o seguinte SR.

[00181] Para o projeto de fusão 4 (F4), o domínio C-terminal de ToxB foi dividido em 4 fragmentos e um modelamento de homologia mais preciso (SwissModel) foi realizado neles. A separação foi realizada de maneira a manter intactas as caixas “SR-LR-SR” (cada domínio termina na extremidade do SR que segue um LR). Uma superposição estrutural entre as estruturas previstas destes fragmentos e a estrutura 3D conhecida de ToxA foi preparada e a melhor superposição estrutural foi obtida para o terceiro SR de ToxB (SR I) e o último SR de ToxA (terceiro SR VIII). Assim, a junção foi feita entre o segundo SR VIII de ToxA e o terceiro SRI de ToxB.

[00182] A última fusão (F5) foi projetada de maneira a permitir um dobramento correto independente dos dois fragmentos da fusão. Um ligante foi adicionado entre o último resíduo da sequência de proteínas de ToxA e o começo do quarto SR II de ToxB (sempre levando-se em consideração a importância de uma caixa intacta de “SR-LR-SR”). Somente uma resíduo exógeno (Glicina) foi adicionado como um ligante e localizado entre duas glicinas existentes. Assim, o ligante também pode ser descrito como composto de 3 Glicinas circundadas por cepa beta conhecida (para ToxA) e prevista (para ToxB).

Exemplo 2 Imunização de hamsters com proteína de fusão F2: Adjuvante A, Adjuvante A sem QS21 ou Adjuvante A sem MPL e comparação com Adjuvante B, Alum ou formulações não adjuvadas.

[00183] Grupos de 16 hamsters (mistura de machos e fêmeas) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 1 μg da proteína de fusão F2 adjuvada com 50 μL de Adjuvante A, Adjuvante A sem MPL, Adjuvante A sem QS21, Adjuvante B , Alum ou não adjuvado.

[00184] Títulos de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB foram determinados em soros individuais coletados no dia 41/42 (pós III). Os resultados são descritos nas tabelas 3 e 4 e figuras 1 e 2. Tabela 3: ELISA anti-ToxA: concentrações (μg/mL) nos soros individuais no dia 42

CI=intervalo de confiança Std dev=desvio padrão Tabela 4: ELISA anti-ToxB: concentrações (μg/mL) nos soros individuais no dia 42

Figuras 1 e 2 Resultados para figura 1:

[00185] O F2 foi injetado com o adjuvante completo A, uma formulação similar sem QS21 ou sem MPL.

[00186] Para a resposta de anti-ToxA, tanto MPL quanto QS21 têm um valor adicionado mesmo se o QS21 parecer o mais efetivo.

[00187] Para a resposta de anti-ToxB, o efeito do MPL é menos evidente, enquanto que a remoção de QS21 tem um efeito drástico nos títulos de IgG. Resultados para figura 2:

[00188] Com relação à comparação do adjuvante, o adjuvante A induziu significativamente mais anticorpos anti-ToxA e anti-ToxB comparado ao Alum, Adjuvante B ou formulações não adjuvadas. Adjuvante B induziu mais anticorpos anti-ToxA e anti-ToxB comparados às formulações não adjuvadas.

Exemplo 3 Pims 20110544 - Imunização de hamsters machos com uma faixa de dosagem de proteína de fusão F2 formulada no adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C.

[00189] Grupos de 10 hamsters machos foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 0,3 μg , 1 μg ou 3 μg da proteína de fusão F2 adjuvada com doses de 50 μL Adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C.

[00190] Títulos de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB foram medidos de soros individuais coletados no dia 13 (pós I), dia 27 (pós II), dia 42 (pós III 14) e dia 84 (pós III 56). Pims 20110545 - Imunização de hamsters fêmeas com uma faixa de dosagem de proteína de fusão F2 formulada no adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C.

[00191] Grupos de 10 hamsters fêmeas foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 0,3 μg , 1μg ou 3 μg da proteína de fusão F2 adjuvada com Adjuvante B, AS04D, Adjuvante A ou Adjuvante C.

[00192] Títulos de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB foram medidos de soros individuais coletados no dia 13 (pós I), dia 27 (pós II), dia 42 (pós III 14) e dia 84 (pós III 56). Figuras 3 a 7 Pims 20110544 e 20110545 Tabela 5: Títulos de ELISA Anti-ToxA pós I (Título médio geométrico ou GMT)

Tabela 6: Títulos de ELISA Anti-ToxB pós I (GMT)

Tabela 7: títulos de ELISA anti-ToxA pós II (GMT)

Tabela 8: títulos de ELISA anti-ToxB pós II (GMT)

Tabela 9: títulos de ELISA anti-ToxA pós III no dia 42 (GMT)

Tabela 10: títulos de ELISA anti-ToxB pós III no dia 42 (GMT)

Tabela 11: títulos de ELISA anti-ToxA pós III no dia 84 (GMT)

Tabela 12: títulos de ELISA anti-ToxB pós III no dia 84 (GMT)

Exemplo 4 Pims 20120011 e 20120008 - Imunização de hamsters com proteína de fusão F2 ou uma mistura de Toxina A e fragmentos de toxina B, formulado em Alum, Adjuvante A ou não adjuvado.

[00193] Grupos de 8 fêmea e 8 hamsters machos foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 1 μg da proteína de fusão F2, uma fusão F2 com um poli His tag (F2-His marcado) ou uma mistura de C-terToxA (2387-2706) (0,6 μg)+C-terToxB (1750-2360) (0,4 μg) formulado em Alum, Adjuvante A ou não adjuvado.

[00194] Títulos de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB foram determinados em soros individuais coletados no dia 13, dia 27 e dia 42 (pós III). Figura 8 Tabela 13

Geomédia=Título médio geométrico Resultados:

[00195] Anticorpos anti-ToxA e anti-ToxB foram induzidos depois da imunização com a proteína de fusão F2, mas também com a mistura de ToxA e ToxB. Adjuvante A induz títulos de ELISA significativamente maiores comparados a outras formulações.

Exemplo 5 Imunização de camundongos com fragmentos de Tox A ou fusões de Tox B e ToxA-ToxB Figuras 9 a 12 camundongos Balb/C foram imunizados com os construtos descritos no exemplo 1.

[00196] Grupos de 15 camundongos Balb/c fêmeas foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 3μg ou 10 μg dos fragmentos de ToxA e ToxB separados (ToxA C-termo (2387-2706) (0,6μg)+C-terToxB (1750-2360) , bem como com proteínas de fusões ToxA-ToxB adjuvadas com Adjuvante B. Um grupo de controle de 10 camundongos foi vacinado com Adjuvante B somente.

[00197] Títulos de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB foram determinados em soros individuais coletados no dia 42 (pós III).

[00198] Títulos de inibição de hemaglutinina foram determinados em soros pós III agrupados. Resposta de Elisa anti-ToxA e anti-ToxB: Protocolo

[00199] Amostras dos Fragmentos ToxA ou ToxB foram revestidos a 1 μg/mL para fragmentos de ToxB ou 2 μg/mL para fragmentos de ToxA em salina tamponada de fosfato (PBS) em placas de microtitulação de alta ligação (Nunc MAXISORPTM), durante toda a noite a 4° C. As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1% por 30 min a RT com agitação. Os camundongos anti-soros são pré-diluídos 1/1000 em PBS-BSA0,2%- TWEENTM 0,05%. e então, diluições de duas vezes adicionais foram feitas em microplacas e incubadas a RT por 30 min com agitação. Depois da lavagem, anticorpo de murino ligado foi detectado usando IgG anti-camundongo de cabra affiniPure conjugado a peroxidase Jackson ImmunoLaboratories Inc. (H+L) (ref: 115-035-003) diluído 1:5000 em PBS-BSA0,2%-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por 30 min. a 20 °C com agitação. A cor foi desenvolvida usando 4 mg de O-fenilenediamina (OPD) + 5 μL de H2O2 por 10 mL de tampão de citrato 0,1 M pH 4,5 por 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50 μL de HCl e a densidade ótica (OD) foi lida a 490 nm com relação ao 620 nm.

[00200] O nível de anticorpos anti-ToxA ou anti-ToxB presentes nos soros foi expresso em títulos de ponto médio por comparação com um soro de referência. Um GMT foi calculado para as 15 amostras em cada grupo de tratamento (10 para o grupo de controle). Ensaio de inibição de hemaglutinina: Protocolo

[00201] 8 diluições de duas vezes em série de anti-soros agrupados de camundongos (25 μL) foram realizadas em salina tamponada de fosfato (PBS) em microplacas de base U de 96 poços.

[00202] 25 μL de toxina A nativa (0,2 μg/poço) foram então adicionados e as placas foram incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos.

[00203] Depois da incubação, 50 μL de eritrócitos de coelho purificados diluídos a 2% foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas a 37 °C por 2 horas.

[00204] Placas foram analisadas visualmente, com hemaglutinação apresentando como células vermelhas difusas no poço e a inibição da hemaglutinação observada como um ponto vermelho assentado no poço.

[00205] Os títulos de inibição foram definidos como o recíproco da maior diluição da hemaglutinação que inibe o soro. Ensaio de citotoxicidade

[00206] Células de fibroblastos IMR90 foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2, em Meio essencial mínimo de Eagle EMEM + 10% de soro fetal bovino + 1% de glutamina + 1% de antibióticos (penincilina-estreptomicina- anfotericina) e foram semeados em placas de cultura de tecido de 96 poços a uma densidade de 5,104 células/poço.

[00207] Depois de 24 h, 100 μL do meio celular foram removidos das células.

[00208] 8 (para o experimento no exemplo 5) ou 12 (para o experimento no exemplo 6) diluições de duas vezes em série de anti-soros agrupados de camundongos (50 μL) foram realizados em meios celulares.

[00209] 50 μL de toxina B nativa (0,5 ng/mL) são então adicionados e as placas incubadas a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.

[00210] Células foram observadas depois de 24 horas e a proporção das células redondas foi determinada.

[00211] Os títulos de inibição foram definidos como recíprocos e a maior diluição do soro que inibe 50% de arredondamento celular. Resultados:

[00212] Anticorpos anti-Tox A foram induzidos depois da imunização com fragmento de o ToxA sozinho, mas também com cada uma das 5 fusões.

[00213] As propriedades funcionais destes anticorpos foram testadas no ensaio de hemaglutinação. Este ensaio é somente adaptado para avaliação de Tox A sem nenhuma hemaglutinação é observada com ToxB.

[00214] Inibição da hemaglutinação foi observada com os soros do fragmento de anti-Tox A ou soros direcionados contra cada uma das fusões ToxA-ToxB.

[00215] Um ELISA usando anticorpos ToxB também foi realizado. Anticorpos anti-Tox B foram induzidos depois da imunização com o fragmento de ToxB sozinho, mas também com as fusões F2, F3 e F4.

[00216] Títulos de inibição obtidos usando soros de camundongos imunizados com o fragmento de ToxB ou as fusões ToxA-ToxB foram maiores que os obtidos usando soros de controle.

Exemplo 6 Imunização de camundongos com fusões Tox A-Tox B

[00217] Grupos de 25 camundongos fêmeas foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 3 μg das proteínas de fusão ToxA-ToxB formuladas no adjuvante B ou 10 μg de uma mistura não adjuvada de ToxA(6μg)+ToxB(4μg). Além de F2, quatro outros construtos de proteína de fusão foram usados, estes foram F54 Gli (SEQ ID NO:21), F54 New (SEQ ID NO:23), F5 ToxB (SEQ ID NO:25) e F52 New (SEQ ID NO:27).

[00218] Um ELISA foi realizado usando o protocolo de resposta de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB descrito no exemplo 5 exceto que aqui as amostras dos fragmentos ToxA ou ToxB foram revestidos a 1 μg/mL em salina tamponada de fosfato em placas de microtitulação de alta ligação. Um ensaio de inibição de hemaglutinina foi realizado conforme descrito no exemplo 5, exceto que os eritrócitos do coelho foram diluídos a 2,5% . Um ensaio de citotoxicidade toxB foi realizado conforme descrito no exemplo 5, exceto que 50 μL da toxina B a uma concentração de 0,015 μg/mL foi usada. Um ensaio de citotoxicidade de toxA adicionado foi realizado conforme descrito a seguir.

[00219] Títulos de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB foram determinados em soros individuais coletados no dia 42 (pós III 14). Figuras 13 e 14. Tabela 15

Figuras 15 a 17

[00220] Um ensaio de inibição de hemaglutinina foi realizado conforme descrito no exemplo 5.

[00221] Um ensaio de citotoxicidade toxB foi realizado conforme descrito no exemplo 5 exceto que 12 diluições de duas vezes em série de antisoros agrupados de camundongos foram realizadas em vez de 8 e as placas foram incubadas durante toda a noite em vez de por 24 horas antes que as células fossem observadas. Um ensaio de citotoxicidade toxA adicional foi realizado conforme descrito a seguir. ensaio de citotoxicidade ToxA

[00222] Células HT29 foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2 em DMEM +10% de soro bovino fetal +1% de glutamina +1% de antibióticos (penincilina-estreptomicina-anfotericina) e foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 poços a uma densidade de 5,104 células/poço. Depois de 24 h, os meios celulares foram removidos dos poços. Diluições de duas vezes em série de anti-soros agrupados de camundongos (50 μL) foram realizadas em meios celulares.

[00223] 50 μL de Toxina A nativa (0,15 ng/mL) são então adicionados e as placas incubadas a 37 °C com 5% de CO2 por 48 horas. Células foram observadas depois de 48 horas e a proporção das células redondas foram determinadas. Os resultados do ELISA de anti-ToxA, ELISA de anti-ToxB, ensaios de inibição de hemaglutinina e citotoxicidade são descritos nas figuras mencionadas anteriormente 13 a 17.

Exemplo 7 Imunização de camundongos com ToxA-Cter, ToxB-Cter ou proteínas de fusão de C. Difficile em uma formulação não adjuvada

[00224] Grupos de 15 camundongos fêmeas foram imunizados IM nos dias 0, 14 28 e 120 com 1 ou 3 μg de proteínas de fusão ToxA C-ter, ToxB C- ter ou ToxA-ToxB. Todos estes antígenos foram injetados em uma formulação não adjuvada. Um grupo de controle (10 camundongos) foi injetado com o NaCl somente.

[00225] Títulos de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB foram medidos de soros individuais coletados no dia 28 (pós II), dia 42 (pós III 14), dia 120 (Pré-reforço 87) e dia 134 (pós IV 14). Figuras 18 e 19 Tabela 17

Exemplo 8 Imunização de camundongos com ToxA-Cter, ToxB-Cter ou proteínas de fusão de C. Difficile formuladas no adjuvante B. Figuras 20 e 21

[00226] Grupos de 15 camundongos fêmeas foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 e 120 com 1 ou 3 μg de proteínas de fusão ToxA C-termo (aminoácidos 2387-2706) e ToxB C-termo (aminoácidos 1750-2360) ou ToxA-ToxB. Estas proteínas foram injetadas em uma formulação de adjuvante B.

[00227] Um grupo de controle (10 camundongos) foi injetado com o Adjuvante B sozinho.

[00228] Títulos de ELISA anti-ToxA e anti-ToxB foram determinados em soros individuais coletados no dia 28 (pós II), dia 42 (pós III 14) , dia 120 (Pré reforço III 87 ou pré reforço) e dia 134 (pós IV 14). Tabela 19

Exemplo 9 Expressão e purificação de clone das proteínas de fusão Plasmídeo de expressão e cepa recombinante

[00229] Genes que codificam as proteínas de fusão dos domínios C- terminal parciais de ToxA e ToxB (SEQ ID NO:3, 4, 5, 6 e 7) e um His tag foram clonados no vetor de expressão pET24b(+)(Novagen) usando os sítios restritos NdeI/XhoI usando procedimentos padrão. O construto final foi gerado pela transformação de cepa de E. coli BLR (DE3) com o vetor de expressão recombinante de acordo com método padrão com células tratadas com CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135,). Cepa hospedeira:

[00230] BLR(DE3). BLR é um derivado recA de BL21. Cepas tendo a designação (DE3) são lisogênicas para um profago À que contém um RNA polimerase de T7 indutível por IPTG. Lisógenos À DE3 são designados para expressão de proteína de vetores pET. Esta cepa também é deficiente nas lon e ompT proteases.

[00231] Genótipo : cepa de E.coli BLR::DE3, F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR). Expressão da proteínas recombinantes:

[00232] Um transformante de E.coli foi retirado da placa de ágar e usado para inocular 200 mL de caldo de LBT ± 1% (p/v) glicose + canamicina (50 μg/mL) para obter O.D.600nm entre 0,1 -0,2. Culturas foram incubadas durante toda a noite a 37 °C, 250 RPM.

[00233] Esta cultura durante toda a noite foi diluída para 1:20 em 500 mL de meio LBT contendo canamicina (50 μg/mL) e cresceu a 37 °C a uma velocidade de agitação de 250 rpm até que O.D.620 atingisse 0,5/0,6.

[00234] A O.D.600nm em torno de 0,6, a cultura foi resfriada antes de induzir a expressão da proteína recombinante por adição de 1 mM isopropil β- D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG; EMD Chemicals Inc., número do catálogo: 5815) e incubada durante toda a noite a 23 °C, 250 RPM.

[00235] Depois da indução durante toda a noite (em torno de 16 horas), O.D .600nm foi avaliado depois da indução e a cultura foi centrifugada a 14 000 RPM por 15 minutos e precipitados foram congelados a -20 °C separadamente. Purificação:

[00236] O precipitado bacteriano foi ressuspenso em 20 mM tampão de bicina (pH 8,0) contendo NaCl 500 mM e uma mistura de inibidor de protease (Complete, Roche). Bactérias foram lisadas usando um sistema French Press 20 000 PSI. Componentes solúveis (sobrenadante) e insolúveis (precipitado) foram separados por centrifugação, por exemplo, a 20.000 g por 30 min a 4 °C.

[00237] A proteína marcada 6-His foi purificada em condições nativas em IMAC. Os componentes solúveis foram carregados em uma coluna GE (15 mL, por exemplo) (Carregado com Ni) pré-equilibrada com o mesmo tampão usado para ressuspensão bacteriana. Depois do carregamento na coluna, a coluna foi lavada com o mesmo tampão. Eluição foi realizada usando um tampão de bicina 20 mM (pH 8,0) contendo NaCl 500 mM e diferentes concentrações de imidazol (5-600 mM). Depois da análise com gel, mais frações puras foram selecionadas, concentradas e carregadas em cromatografia SEC para a etapa de purificação adicional.

[00238] frações contendo as proteínas de fusão foram selecionadas com base na pureza do SDS-PAGE e dializadas contra tampão de bicina (bicina 20 mM, NaCl 150 mM, com ou sem EDTA 5 mM pH8,0). Concentração de proteína foi determinada usando ensaio de proteína DC de BioRad. Proteínas foram assim agrupadas, filtradas para esterilidade em 0,22 μm, armazenadas a -80 °C.

[00239] Alternativamente, purificação de IMAC foi precedida por uma etapa de purificação de DEAE tampão de bicina 2 mM (pH 8,0) para carregamento e lavagem e eluída usando um gradiente com o mesmo tampão, mas com NaCl 1M adicionado.

Exemplo 10 Expressão e purificação de clone de fragmentos Tox A e Tox B de C. Difficile separados Plasmídeo de expressão e cepa recombinante.

[00240] Genes que codificam os fragmentos de proteína ToxA e ToxB (SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9) e um His tag foram clonados no vetor de expressão pET24b(+) (Novagen) usando os sítios de restrição NdeI/XhoI usando procedimentos padrão. O construto final foi gerado pela transformação de cepa BLR de E. coli (DE3) com o vetor de expressão recombinante de acordo com método padrão com células tratadas com CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135,). Cepa hospedeira:

[00241] BLR(DE3). BLR é um derivado recA de BL21. Cepas tendo a designação (DE3) são lisogênicas para um profago À que contém um RNA polimerase T7 indutível por IPTG. Lisógenos À DE3 são designados para expressão de proteína de vetores pET. Esta cepa também é deficiente nas lon e ompT proteases.

[00242] Genótipo: cepa de E.coli BLR::DE3, F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR) Expressão das proteínas recombinantes:

[00243] Um transformante de E.coli foi retirado da placa de ágar e usado para inocular 200 mL de caldo LBT ± 1% (p/v) de glicose + canamicina (50 μg/mL) para obter O.D.600nm entre 0,1 -0,2. Culturas foram incubadas durante toda a noite a 37 °C, 250 RPM.

[00244] Esta cultura durante toda a noite foi diluída para 1:20 em 500 mL de meio LBT contendo canamicina (50 μg/mL) e cresceu a 37 °C a uma velocidade de agitação de 250 rpm até que O.D.620 atingisse 0,5/0,6.

[00245] A um O.D.a 600nm em torno de 0,6, a cultura foi resfriada antes da indução da expressão da proteína recombinante por adição de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número do catálogo: 5815) e incubada durante toda a noite a 23 °C, 250 RPM.

[00246] Durante a incubação durante toda a noite (em torno de 16 horas), O.D. a 600nm foi avaliado depois da indução e a cultura foi centrifugada a 14 000 RPM por 15 minutos e precipitados foram congelados a -20 °C separadamente. Purificação:

[00247] O precipitado bacteriano foi ressuspenso em tampão de bicina 20 mM (pH 8,0) contendo NaCl 500 mM suplementado por uma mistura de inibidor de protease (Complete sem EDTA, Roche cat 11873580001) e benzonase. (Roche cat 1,01695,0001). Bactérias foram lisadas usando um sistema French Press 2 X 20 000 PSI. Componentes solúveis (sobrenadante) e insolúveis (precipitado) foram separados por centrifugação a 34.000 g ou 48.000 g por 25-30 min a 4 °C. Sobrenadante foi coletado e filtrado em um filtro de 0,22 μm.

[00248] A proteína marcada com 6-His foi purificada em condições nativas em IMAC. Os componentes solúveis foram carregados em uma coluna GE (por exemplo, 15 mL) (Carregado com Ni ) pré-equilibrados com o mesmo tampão usado para a ressuspensão bacteriana. Depois do carregamento, a coluna foi lavada com o mesmo tampão. Para ToxA:

[00249] Eluição foi realizada usando um tampão de bicina 20 mM (pH 8,0) contendo NaCl 500 mM e diferentes concentrações de imidazol (5-100 mM). Depois da análise com gel, mais frações puras foram selecionadas, concentradas e carregadas em cromatografia SEC (SUPERDEXTM 75) para a etapa de purificação adicional no mesmo tampão sem imidazol. Para ToxB:

[00250] Uma segunda lavagem foi realizada com tampão de bicina 20 mM (pH 8,0) contendo NaCl 500 mM e 0,5% de deoxicolato ou mesmo tampão com NaCl 150 mM. Eluição foi realizada usando um tampão de bicina 20 mM (pH 8,0) contendo NaCl 500 mM e diferentes concentrações de imidazol (10-500 mM). Depois da análise com gel, mais frações puras foram selecionadas, suplementadas com EDTA 5 mM e carregadas em cromatografia SEC (SUPERDEXTM 200) para a etapa de purificação adicional em mesmo tampão com EDTA 5 mM.

[00251] Frações contendo fragmentos ToxA ou ToxB foram selecionadas com base na pureza do SDS-PAGE e dializadas contra tampão de bicina (bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0), concentração de proteína foi determinada usando ensaio de proteína RCDC de BioRad. Proteínas foram assim agrupadas, filtradas para esterilidade em 0,22 μm, armazenadas a -80 °C.

Exemplo 11 Avaliação do peso molecular das cinco fusões ToxA-ToxB de C. Difficile

[00252] Ultracentrifugação analítica é usada para determinar a homogeneidade e distribuição do tamanho em solução das diferentes espécies em uma amostra de proteína medindo a taxa com a qual as moléculas se movem em resposta a uma força centrífuga. Isto é com base no cálculo dos coeficientes de sedimentação das diferentes espécies que são obtidas pelo experimento de velocidade de sedimentação, que depende de sua forma e massa molecular. 1. Amostras de proteína são giradas em uma ultracentrífuga analítica Beckman-Coulter PROTEOMELABTM XL-1 a 42 000RPM depois que o rotor A-60Ti foi equilibrado a 15 °C. a. proteína de fusão F1, 500 μg/mL, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0 b. proteína de fusão F2, 500 μg/mL, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0 c. proteína de fusão F3, 500 μg/mL, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0 d. proteína de fusão F4, 500 μg/mL, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0 e. proteína de fusão F5, 500 μg/mL, bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH8,0 2. Para a coleta de dados, 160 varreduras foram registradas a 280 nm a cada 5 minutos. 3. Análise de dados foi realizada usando o programa SEDFIT para a determinação da distribuição C(S). A determinação do volume específico parcial das proteínas foi realizada com o software SEDNTERP com relação à sua sequência de aminoácidos. SEDNTERP também foi usado para determinar a viscosidade e a densidade do tampão. 4. O peso molecular das diferentes espécies foi determinado a partir do gráfico de distribuição C(S) (concentração em função do coeficiente de sedimentação), considerando-se sua melhor representação dos dados brutos que a distribuição C(M) (concentração em função do peso molecular) para caracterizar a distribuição do tamanho de uma mistura. O peso molecular das principais espécies detectadas da distribuição C(S) de todas as cinco proteínas de fusão ToxA-ToxB corresponde a sua forma monomérica. O melhor ajuste das razões friccionais determinado para as cinco fusões são todos entre 2 e 2,2. Isto pode indicar que as proteínas estão presentes em solução como uma forma alongada, que poderia ser consistente com a estrutura da proteína.

Exemplo 12 Avaliação das estruturas secundárias e terciárias das fusões ToxA-ToxB de C. Difficile por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência

[00253] Dicroísmo circular é usado para determinar a composição da estrutura secundária de uma proteína medindo a diferença na absorção da luz polarizada para a esquerda em função da luz polarizada para a direita que é devido à assimetria estrutural. A forma e a magnitude dos espectros CD na região longe do UV (190-250 nm) são diferentes se uma proteína apresentar uma estrutura de lâmina beta-, alfa-hélice ou rolo aleatório. A abundância relativa de cada tipo de estrutura secundária em uma dada amostra de proteína pode ser calculada por comparação ao espectro de referência.

[00254] A estrutura terciária de uma amostra de proteína pode ser estimada pela avaliação da imobilização dos aminoácidos aromáticos. A observação de um sinal CD na região próxima ao UV (250-50 nm) pode ser atribuída à polarização de resíduos de fenilalanina, tirosina e triptofano e é uma boa indicação de que a proteína é dobrada em uma estrutura bem definida. O seguinte protocolo foi usado: 1. Espectros longe do UV são medidos usando um caminho ótico de 0,01 cm de 178 to a, com uma resolução de 1 nm e largura da banda em um espectropolarímetro Jasco J-720. Temperatura da célula é mantida a 23 °C por um bloco de célula Peltier thermostated RTE-111. Um fluxo de nitrogênio de 10 L/min é mantido durante as medições. 2. Espectros próximo ao UV são medidos usando um caminho ótico de 0,01 cm de 250 a 300 nm, com uma resolução de 1 nm e largura da banda em um espectropolarímetro Jasco J-720. Temperatura da célula é mantida a 23 °C por um bloco de célula Peltier thermostated RTE-111. Um fluxo de nitrogênio de 6L/min é mantido durante as medições.

[00255] A observação dos espectros longe do UV (figura 22) para todas as cinco proteínas de fusão ToxA-ToxB sugere um teor fraco de estruturas de alfa hélice e um alto teor de estrutura de lâmina betas. Também, todas as proteínas apresentaram um máximo a 230 nm, que não é usual para proteínas globulares solúveis. Esta particularidade foi bem caracterizada na literatura e é associada com um pequeno grupo de proteínas conhecidas por sua ausência de alfa hélice e seu alto teor em lâmina beta e aminoácidos aromáticos (Zsila, Analytical Biochemistry, 391( 2009) 154-156). As particularidades são coerentes com a estrutura que é esperada para as proteínas de fusão ToxA-ToxB. Estruturas de cristal de 13 proteínas que apresentam os espectros CD característicos com um sinal positivo a 230 nm foram comparadas (Banco de Dados de Proteína). O teor de estrutura secundária médio das proteínas é 42% de lâmina hélice ±9% e 7% de alfa hélice ±6%. Isto fortemente indica que a assinatura espectral das proteínas de fusão ToxA-ToxB é diagnóstico de uma proteína contendo alta lâmina hélice e baixa alfa hélice.

[00256] A observação da forma dos espectros próximo ao UV (figura 23) para todas as cinco proteínas de fusão indica que pelo menos alguns dos aminoácidos aromáticos são imobilizados, que é uma forte indicação de uma estrutura terciária compacta e específica. Além disso, o tratamento da proteína com uma concentração de desnaturação de ureia causou o desaparecimento do sinal próximo ao UV, que é uma indicação adicional que estes espectros característicos foram devido ao dobramento da proteína.

Exemplo 13 Projeto, clonagem, expressão e purificação das 4 proteínas de fusão adicionais

[00257] Quatro proteínas de fusão adicionais foram projetadas usando os princípios de projeto descritos no exemplo 1, estas foram nomeadas F54 Gli (SEQ ID NO:21), F54 New (SEQ ID NO:23), F5 ToxB (SEQ ID NO:25) e F52 New (SEQ ID NO:27).

[00258] Estas proteínas de fusão foram expressas de acordo com o procedimento descrito no exemplo 9.

Exemplo 14 Avaliação do peso molecular das fusões ToxA-ToxB de C. Difficile descritas em SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO: 27

[00259] O peso molecular das fusões descritas em SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:27 foram determinados conforme descrito no exemplo 11.

[00260] O peso molecular das principais espécies determinado a partir da distribuição C(S) de todas as quatro fusões de proteína descritas em SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:27 corresponde a sua forma monomérica e todas as proteínas apresentam propriedades de sedimentação similares às fusões F1 a F5.

Exemplo 15 Avaliação das estruturas secundárias e terciárias de fusões ToxA-ToxB de C. Difficile descritas em SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:1525 e SEQ ID NO:27

[00261] As estruturas secundárias e terciárias das fusões descritas em SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:27 foram estimadas de acordo com o método descrito no exemplo 5. O CD próximo ao UV para estas proteínas de fusão pode ser encontrado na figura 24 e os espectros próximos ao UV para estas fusões podem ser encontrados na figura 25.

[00262] Análise dos espectros CD próximos ou longe do UV das proteínas descritas em SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:27 mostra que todas as quatro têm a mesma estrutura de lâmina mais alta em beta que fusões F1 a F5. Além do mais, a observação dos espectros próximos ao UV não mostrou nenhuma diferença significativa na posição dos aminoácidos aromáticos na estrutura terciária comparado às fusões F1 a F5. SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:1 - sequência da toxina A MSLISKEELIKLAYSIRPRENEYKTILTNLDEYNKLTTNNNENKILQLK KLNESIDVFMN KYKTSSRNRALSNLKKDILKEVILIKNSNTSPVEKNLHFVWIGGEVSDI ALEYIKQWADI NAEYNIKLWYDSEAFLVNTLKKAIVESSTTEALQLLEEEIQNPQFDNM KFYKKRMEFIYD RQKRFINYYKSQINKPTVPTIDDIIKSHLVSEYNRDETVLESYRTNSLR KINSNHGIDIR ANSLFTEQELLNIYSQELLNRGNLAAASDIVRLLALKNFGGVILDVDM LPGIHSDLFKTI SRPSSIGLDRWEMIKLEAIMKYKKYINNYTSENFDKLDQQLKDNFKLII ESKSEKSEIFS KLENLNVSDLEIKIAFALGSVINQALISKQGSILTNLVIEQVKNRYQFL NQHLNPAIESD NNFTDTTKIFHDSLFNSATAENSMFLTKIAPILQVGFMPEARSTISLSGP GAYASAYYDF INLQENTIEKTLKASDLIEFKFPENNLSQLTEQEINSLWSFDQASAKYQ FEKYVRDYTGG SLSEDNGVDFNKNTALDKNILLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQG DDISYEATCNLF SKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVK VTFIGHGKDEF NTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGCNMFSYDFNV EETYPGKLLLS IMDKITSTLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEA IMSDLSSKEYI FFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIE SSIGDYIYY EKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKILISFEDI SKNNSTYSV RFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQ LDHTSQVNT LNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQL VNLISNAVNDT INVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAI NMSLSIAAT VASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLS ESKKYGPLKT EDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFF SSPSISSHIP SLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLEND GTRLLDSIRDLY PGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEI RNKLSYSFDGA GGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKD VLSKIDINK NKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLS GDKNILISN LSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDS KNILEFYNDST LEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQ VKVNGLILNES VYSSILDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFT LVGKTNLGYVE FICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVVVEPIYNPDTGEDISTS LDFSYEPLYG IDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINL DSSSFEYKWS TEGSDFILVRILEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLG YIMSNFKSF NSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFN LVTGWQTINGK KYYFDINTGAALTSYKIINGKHFYFNNDGVMQLGVFKGPDGFEYFAP ANTQNNNIEGQAI VYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGL QVIDNNKYYFNPD TAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIG VFSTSNGFEYFA PANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGLQTIDSKK YYFNTNTAEAATG WQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIIN GKHFYFNTDGIMQ IGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDS KAVTGWRIINNK KYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDAN NESKMVTGVFKG PNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTG WQTIDGKKYYFNL NTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFI ASTGYTSINGKHFY FNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGK KYYFGSDSKAVT GLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIIS GKHFYFNTDGIM QIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLILHDNIYYFGNN SKAATGWVTIDG NRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAP ANTDANNIEGQAI RYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAA GGLFEIDGVIYFFGV DGVKAPGIYG SEQ ID NO:2 - sequência da toxina B MSLVNRKQLEKMANVRFRTQEDEYVAILDALEEYHNMSENTVVEKI LKLKDINSLTDIYI DTYKKSGRNKALKKFKEILVTEVLELKNNNLTPVEKNLHFVWIGGQI NDTAINYINQWKD VNSDYNVNVFYDSNAFLINTLKKTVVESAINDTLESFRENLNDPRFDY NKFFRKRMEIIY DKQKNFINYYKAQREENPELIIDDIVKTILSNEYSKEIDELNTYIEESLN KITQNSGNDV RNFEEFKNGESFNLYEQELVERWNLAAASDILRISALKEIGGMILDVD MLPGIQPDLFES IEKPSSVTVDFWEMTKLEAIMKYKEYIPEYTSEHFDMLDEEVQSSFES VLASKSDKSEIF SSLGDMEASPLEVKIAFNSKGIINQGLISVKDSYCSNLIVKQIENRYKIL NNSLNPAISE DNDFNTTTNTFIDSIMAEANADNGRFMMELGKILRVGFFPDVKTTINL SGPEAYAAAYQD LLMFKEGSMNIHLIEADLRNFEISKTNISQSTEQEMASLWSFDDARAK AQFEEYKRNYFE GSLGEDDNLDFSQNIVVDKEILLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKIS YEAACNLFAK TPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFI GHGKDEFNT DIFAGFDVDSLSTEIEAAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSINVEETY PGKLLLKVK DKISELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKD ISSKEYISF NPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVIS NIDTQIVEER IEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISE TDEGFSIRF INKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNL DTTHEVNTLN AAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKVV ELVSTALDETID LLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLT TATTAIIT SSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKVVDYFKHVSL VETEGVFTLLD DKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFF SAPSITYREPHL SIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDG TKLLDRIRDNYEG EFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREK LSYSFYGSG GTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNVVRDVTIESDKIKKGDLIE GILSTLSIEEN KIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGE LKILMLNS NHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPD VVLISKVYMD DSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYILKDDIKISLSLTLQDEKTI KLNSVHLDES GVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDAN FIISGTTSIGQ FEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDI SSTVINFSQKY LYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKIN VNINDLSIRY VWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDK QDVPVSEIILSFT PSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPP VNNLITGFVTVG DDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYF APANTLDENLEG EAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKG LNQIGDYKYYFN SDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQ IGVFNTEDGFKYFA HHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSK YYFDEDTAEAYIG LSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYF YIDDNGIVQIG VFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTI ETGWIYDMENESD KYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNEN GEMQFGYINIED KMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLD LDEKRYYFTDEYI AATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO:3 - sequência de Fusão 1 MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGP NGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGW RIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNF YFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLT LNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGK KYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFN TDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKK YYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNT NTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNI EGQAIRYQNRFLILHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAM GANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQ 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sequência de aminoácidos de proteína de fusão F52 New MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIG VFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLN GKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKY YFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVF KGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSK AVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYY FNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNT DGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILY QNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTG WQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDG IMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLILHDNIYY FGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKT IDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMP DTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAVKGLNQIGDYKYYFNSD GVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFY FAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFN NKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAY IGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNID DNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVN DNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKY YFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISF 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NFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKF LTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDG KKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYF NTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGK KYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANN IEGQAIRYQNRFLILHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAM GANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQ AIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAA AGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAV SEQ ID NO:30 - sequência de fragmento de toxina A de F5 ToxB MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFK GPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVT GWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERN NFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKF LTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDG KKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYF NTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGK KYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANN IEGQAIRYQNRFLILHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAM GANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQ AIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAA AGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAV SEQ ID NO:31 - sequência de fragmento de toxina A de F52 New MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFK GPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVT GWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERN NFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKF LTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDG KKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYF NTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGK KYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANN IEGQAIRYQNRFLILHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAM GANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQ AIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAA AGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAV SEQ ID NO:32 - sequência de fragmento de toxina B de F54Gli TGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFST EDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWK ELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDN KHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAH HNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKY YFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGII ESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQ AVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKA CKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIED KMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWL DLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO:33 - sequência de fragmento de toxina B de F54 New TGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFST EDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWK ELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDN KHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAH HNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKY YFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGII ESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQ AVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKA CKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIED KMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWL DLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO:34 - sequência de fragmento de toxina B de F5 ToxB SGLIYINDSLYYFKPPVNNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIID DKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLI IDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYK YYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAEN GEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFD DSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIM QVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSD GYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIY DMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENN NYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAH QNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYF DPDTAQLVISE SEQ ID NO:35 - sequência de fragmento de toxina B de F52 New KGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEI DGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGIL NFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDG QYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGI VQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFG ETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGI MRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFN TPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATG SVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO:36 - C-TAB.G5 proteína de fusão MVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYF DNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTA EAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVF KGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAV TGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTII SGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRF LILHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNK NFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDA NNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPD TAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGRSMHNLITGFVTVGDD KYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAP ANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHY FSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGV MKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEE GEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEA YIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKV FYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTV NDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYF NPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNEN GEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENF EGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVI SE SEQ ID NO:37 C-TAB.G5,1 proteína de fusão VTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDN DSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEA ATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKG PNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTG LRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISG KHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLI LHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKN FYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDAN NIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDT AMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGRSMHNLITGFVTVGDDK YYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPA NTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFS PETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVM KVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGE EISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIG LSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVF YFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVN DNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFN PETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQF GYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESIN YTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE

Claims

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um polipeptídeo compreendendo um fragmento de toxina A isolado de CLOSTRIDIUM DIFFICILE e/ou um fragmento isolado de toxina B de C. DIFFICILE e em que o polipeptídeo compreende as SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37; e b) um adjuvante compreendendo uma fração de saponina imunologicamente ativa apresentada na forma de um lipossoma.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito adjuvante compreende adicionalmente um lipopolissacarídeo, que é 3D-MPL.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o dito adjuvante compreende adicionalmente um esterol, que é colesterol, em que a composição compreende o esterol a uma razão de saponina: esterol de 1:1 a 1:100 p/p ou de 1:1 a 1:10 p/p ou de 1:1 a 1:5 p/p.

4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a dita fração de saponina imunologicamente ativa é QS21.

5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é formulado em uma dose compreendendo: de 0,1 a 0,5 mg de colesterol, de 0,25 a 2 mg de DOPC, de 10 μg a 70 μg de 3D-MPL, e de 10 μg a 70 μg QS21.

6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende um fragmento do domínio de repetição da toxina A de CLOSTRIDIUM DIFFICILE e/ou um fragmento do domínio de repetição da toxina B de C. DIFFICILE.

7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é um polipeptídeo compreendendo um primeiro fragmento e um segundo fragmento, em que (i) o primeiro fragmento é um fragmento do domínio de repetição da toxina A; (ii) o segundo fragmento é um fragmento do domínio de repetição da toxina B; (iii) o primeiro fragmento tem uma primeira extremidade proximal; (iv) o segundo fragmento tem uma segunda extremidade proximal; e em que o primeiro fragmento e o segundo fragmento são adjacentes um ao outro.

8. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a primeira extremidade proximal e a segunda extremidade proximal não rompem porções de repetição curta-repetição longa-repetição curta (SR-LR-SR).

9. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a primeira extremidade proximal está na porção de repetição VIII (aminoácidos 2645-2710) da toxina A, por exemplo nos aminoácidos 2700-2710 ou 2680-2690 da toxina A.

10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a segunda extremidade proximal está na porção de repetição II (aminoácidos 1927-2057) da toxina B, por exemplo nos aminoácidos 1960-1970, 1988-1998 ou 18671877 da toxina B.

11. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a primeira extremidade proximal está na repetição curta 2 da porção de repetição VIII da toxina A (aminoácidos 2665-2686) e a segunda extremidade proximal está na repetição curta 3 da porção de repetição I da toxina B (1877-1896), ou em que que a primeira extremidade proximal está na repetição curta 3 da porção de repetição VIII da toxina A (aminoácidos 2645-2686) e a segunda extremidade proximal está na repetição curta 1 da porção de repetição I da toxina B (aminoácidos 1834-1854).

12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende as SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 ou SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35.

13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é um polipeptídeo compreendendo um primeiro fragmento e um segundo fragmento, em que (i) o primeiro fragmento é um fragmento do domínio de repetição da toxina A; (ii) o segundo fragmento é um fragmento do domínio de repetição da toxina B; (iii) o primeiro fragmento compreende uma primeira extremidade proximal em uma primeira porção de repetição; (iv) o segundo fragmento compreende uma segunda extremidade proximal em uma segunda porção de repetição; e em que o primeiro fragmento e o segundo fragmento são adjacentes um ao outro, e em que a primeira porção de repetição e a segunda porção de repetição têm similaridade estrutural uma com a outra, e em que as sequências de aminoácidos das proteínas de fusão são SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 21, 23, 25, 27, 36 e 37.

14. Uso de uma composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para a prevenção ou tratamento de doença de C. difficile.