JP7149285B2 - Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する免疫応答を誘導するための方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月１５日出願の米国仮出願第６２／４７１，６３６号および２０１７年３月２１日出願の同第６２／４７４，４３４号に対する優先権を主張し、それらの開示は全ての目的のために各々本明細書に組み込まれる。

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列リストのコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＮＯＶＶ＿０５８＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５、記録日：２０１８年３月１３日、ファイルサイズ１８７キロバイト）。

サブユニット系ワクチンを使用する疾患に対するワクチン接種は、タンパク質が標的集団に投与されたときに効果的なままであるように、十分な量のタンパク質抗原を生成すること、および抗原の安定性を維持することに依存する。

サブユニットワクチンを生成する際の複雑さは、生成中の複数工程で生じる。標的タンパク質が低レベルで生成される可能性があるか、または不溶性である可能性があり、タンパク質が特に好ましい免疫原性プロファイルを有していたとしても経済的に好ましくない生成となる。

細菌感染症は依然として健康上の懸念である。実際、細菌が最先端の抗生物質に対して耐性を発達させるため、細菌ワクチンがますます求められている。細菌性サブユニットワクチンは、組換えタンパク質の生成に依存する。しかしながら、細菌タンパク質は、低発現および不溶性に起因して高レベルで生成することが難しいことが多く、それらはまた安定性の低減を被る場合もある。したがって、特に難しい抗原標的のためのワクチンを生成するより良いアプローチは、包括的な健康利益を提供するであろう。特に、クロストリジウム細菌、とりわけ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症は依然として特定の問題である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）は、発展途上国における院内抗生物質関連下痢の主な原因である。超病原性菌株が発達し、死亡率の増加を伴う重度の疾患をもたらしている。同族のグルコシル化毒素ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ、ならびに二成分ＡＤＰリボシル化毒素（ＣＤＴ）が、病理発生を引き起こす主な病原性因子である。これらの毒素を標的とするワクチンの必要性が満たされていない。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する免疫応答を誘導する方法および組成物が本明細書で開示される。本組成物は、複数のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素を含有するポリペプチドを含有し、対象に投与されると有利な免疫応答を誘導する。多毒素ポリペプチドを生成するための方法も開示される。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ三種混合毒素ワクチン構築物。図は、ＣＤＴｂの活性化ドメインの後にフーリン切断部位を有する（構築物１４２０）、および有しない（構築物１４７０）ＣＤＴｂ、Ｔｃｄ Ｂ、およびＴｃｄ Ａの結合ドメインを含有するＣ．ｄｉｆｆ三種混合毒素ワクチンの図を示す。 三種混合毒素ワクチンＢＶ１４７０およびＢＶ１４２０の発現および溶解度。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９昆虫細胞を、０．１のＭＯＩで組換えバキュロウイルスＢＶ１４２０およびＢＶ１４７０に感染させ、感染後４８および７２時間で回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によりタンパク質発現を分析した。等体積の総タンパク質（Ｔ、細胞および培地）および浄化培地（Ｍ）を、２Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合し、４％～１２％のポリアクリルアミドＮｕＰａｇｅゲルで実行した。ペレット状の感染細胞を１％ ＮＰ９、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣＬ、ｐＨ８．０の緩衝液に可溶化した。溶解した細胞を９０００ｘｇで４０分間遠心分離した。上清（Ｓ、可溶性）を除去し、ペレット（Ｉ、不溶性）を元の体積まで緩衝液に懸濁して、上述のようにＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。三種混合毒素タンパク質の位置を矢印で印を付けた。 三種混合毒素ワクチンＢＶ１４７０およびＢＶ１４２０の時間経過発現。図６に記載するように、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９昆虫細胞を組換えバキュロウイルスＢＶ１４２０およびＢＶ１４７０に感染させた。様々な感染後時間点で、総タンパク質、培地、可溶性、および不溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により分析した。三種混合毒素タンパク質の位置を矢印で印を付ける。 三種混合毒素ワクチンの精製。ＮＰ９を添加して０．２％の最終濃度にした後、感染Ｓｆ９細胞の全細胞培養物から三種混合毒素ワクチンを精製した。ＮＰ９抽出物を２回浄化し、連続してＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、フェニルＨＰ、およびＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑカラムで精製した。三種混合毒素を各カラムから溶出し、示すように次のカラムに充填した。Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑカラムから溶出した三種混合毒素陽性画分をプールし、０．２μＭフィルタを通してフィルタ減菌した。 Ｓｆ９細胞からの三種混合毒素ワクチンＢＶ１４７０の精製図８に記載されるように三種混合毒素ワクチンＢＶ１４７０を感染細胞から精製した。Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑカラムからのフィルタ処理した最終生成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により純度について分析した。抗ＣＤＴｂ、抗ＴｃｄＢ、および抗ＴｃｄＡ抗体を使用して、三種混合毒素タンパク質をウエスタンブロットにより同定した。 Ｓｆ９細胞からの三種混合毒素ワクチンＢＶ１４２０の精製図８に記載されるように三種混合毒素ワクチンＢＶ１４２０を感染細胞から精製した。Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑカラムからのフィルタ処理した最終生成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により純度について分析した。抗ＴｃｄＢ抗体を使用して、三種混合毒素タンパク質をウエスタンブロットにより同定した。 三種混合毒素ＢＶ１４２０の体積グラフによる粒径分布。Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏを使用して動的光散乱により三種混合毒素ＢＶ１４２０の粒径を決定した。体積によるサイズ分布のグラフを示す。 三種混合毒素ＢＶ１４７０の強度グラフによる粒径分布。Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏを使用して動的光散乱により三種混合毒素ＢＶ１４２０の粒径を決定した。強度によるサイズ分布のグラフを示す。 陰性染色した三種混合毒素ＢＶ１４２０の電子顕微鏡写真。電子顕微鏡写真の精製された三種混合毒素ＢＶ１４２０を約１０ｕｇ／ｍｌに希釈し、酢酸ウラニルで陰性染色した。 ＢＶ１４２０三種混合毒素ワクチンマウス致死毒素接種研究１。０日目および１４日目に三種混合毒素ワクチンＢＶ１４２０でマウスを免疫化し、３５日目に致死用量のＴｃｄ ＡまたはＣＤＴを接種し、接種後１０日間監視した。示すようにマウスを出血させ、抗毒素ＩｇＧおよび毒素中和抗体について血清を分析した。毒素接種後１０日間死亡率および罹患率について動物を監視した。 ＢＶ１４２０三種混合毒素ワクチンマウス致死毒素接種研究１－血清抗毒素ＩｇＧ応答。プレートに結合した天然毒素を使用して、ＥＬＩＳＡにより抗Ｔｃｄ Ａ、抗Ｔｃｄ Ｂ、および抗ＣＤＴ ＩｇＧの力価について４２日目に血清試料をアッセイした。 ＢＶ１４２０三種混合毒素ワクチンマウス致死毒素接種研究１－毒素中和抗体（ＴＮＡ）力価。毒素中和力価は比色Ｖｅｒｏ細胞に基づくアッセイを使用して決定した。示される力価は細胞を死滅させなかった血清の最高希釈の逆数である。 ＢＶ１４２０三種混合毒素ワクチンマウス致死毒素接種研究１－動物の生存率。動物の生存率は接種１０日後に決定された。２０％を超える体重減少を示す動物は屠殺され、死亡と記録された。 ＢＶ１４２０三種混合毒素ワクチンマウス致死毒素接種研究２－毒素Ｂの生存率。０日目および１４日目に三種混合毒素ワクチンＢＶ１４２０でマウスを免疫化し、３５日目に致死用量のＴｃｄ Ｂを接種し、接種後１０日間監視した。示すようにマウスを出血させ、抗毒素ＩｇＧおよび毒素中和抗体（ＴＮＡ）について血清を分析した。毒素接種後１０日間死亡率および罹患率について動物を監視した。 ＢＶ１４２０三種混合毒素ワクチンマウス致死毒素接種研究２－抗毒素ＩｇＧレベル。プレートに結合した天然毒素を使用して、ＥＬＩＳＡにより抗Ｔｃｄ Ａ、抗Ｔｃｄ Ｂ、および抗ＣＤＴ ＩｇＧの力価について４２日目に血清試料をアッセイした。 ＢＶ１４２０三種混合毒素ワクチンマウス致死毒素接種研究２－毒素Ｂ ＴＮＡ力価。毒素中和力価は比色Ｖｅｒｏ細胞に基づくアッセイを使用して決定した。示される力価は細胞を死滅させなかった血清の最高希釈の逆数である。 ＢＶ１４２０三種混合毒素ワクチンマウス致死毒素接種研究２－毒素Ｂの生存率。動物の生存率は接種１０日後に決定された。２０％を超える体重減少を示す動物は屠殺され、死亡と記録された。 ＴｃｄＢ遺伝子転座ドメインを有する追加のワクチンタンパク質を示す。ＢＶ１５１２は下の図に示される。 多量体タンパク質発現：多量体タンパク質ＢＶ１５１２の発現およびウエスタンブロット分析。 四価の多量体タンパク質発現：図２５は、２つの四価の多量体タンパク質を図示する。両方の場合において、第２のＴｃｄＢ菌株からのペプチドは、複数の菌株に対する免疫を広範化するために導入される。上の図では、菌株０２７からのＴｃｄＢペプチドがＣ末端に付加される。下の図では、ペプチドは、第１の菌株の菌株６３０からのＴｃｄＢタンパク質とＴｃｄＡ（Ｒ１９）タンパク質との間に導入される。 四価の多量体タンパク質発現：図２０の上の図に示される四価のタンパク質の発現およびウエスタンブロット分析。 四価の多量体タンパク質発現：図２０の下の図に示される四価のタンパク質の発現およびウエスタンブロット分析。 ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素ならびにキメラ三価（Ｔ）および四価（Ｑ）の毒素融合タンパク質の設計。図２３Ａは、キメラ三価および四価の毒素融合タンパク質を構築するために使用したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ（ＴｃｄＡ）、毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）、および二成分毒素（ＣＤＴ）の機能性ドメインの図を示す。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは、酵素グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）ドメイン、自己触媒システインプロテアーゼ（ＣＰ）ドメイン、孔形成転座（ＰＴ）ドメイン（橙色）、および受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む共通の機能性ドメインを共有する。二成分毒素（ＣＤＴ）は、酵素ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ構成要素（ＣＤＴａ）および受容体結合構成要素（ＣＤＴｂ）からなる。ＣＤＴｂは、切断されると２０ｋＤａおよび７５ｋＤａの断片を作り出す２つのセリン型タンパク質分解切断部位（矢印）を有する４２個のアミノ酸（ａａ）シグナル配列を含有する。図２４Ｂは、キメラ三価の毒素融合タンパク質（Ｔ毒素）およびキメラ四価の毒素融合タンパク質（Ｑ毒素）の図を示す。Ｔ毒素融合タンパク質は、２４の反復配列を含有するＴｃｄＢ_{（００３）}のＲＢＤおよび１９の反復配列を伴うＴｃｄＡの切り詰められたＲＢＤを有するＣＤＴｂの完全長コード配列からなる。発現されたＴ毒素融合タンパク質は、２０５ｋＤａの分子量（ＭＷ）の１８１３ ａａからなる。Ｑ毒素融合タンパク質は、２４の反復配列を含有するＴｃｄＢ_{（００３）}のＲＢＤ、１９の反復配列で切り詰められたＴｃｄＡのＲＢＤ、および２４の反復配列を含有するＴｃｄＢ_{（０２７）}のＲＢＤに対するＣＤＴｂの完全長コード配列からなる。発現されたＱ毒素融合タンパク質は、２６８ｋＤａの分子量の２３５９ ａａからなる。 Ｔ毒素およびＱ毒素融合タンパク質の発現および精製。精製されたＴ毒素（レーン２および３）のＳＤＳ－ＰＡＧＥは２０５ｋＤａの分子量で移動し、Ｑ毒素（レーン４および５）は２６８ｋＤａの分子量で移動する。分子量マーカー（レーン１）。図２４Ａは、Ｔ毒素およびＱ毒素の純度が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ走査デンシトメトリーにより決定されるとき、＞９０％であったことを示す。図２４Ｂは、ウサギ抗ＣＤＴｂ特異的抗体でプローブされたときのウエスタンブロット分析を示す。図２４Ｃは、ニワトリ抗ＴｃｄＢ特異的抗体でプローブされたときのウエスタンブロット分析を示す。図２４Ｄは、ニワトリ抗ＴｃｄＡ特異的抗体でプローブされたときのウエスタンブロット分析を示す。 マウスにおけるＴ毒素およびＱ毒素融合タンパク質の免疫原性。０および１４日目に、アルミニウム（５０μｇ）でアジュバント化されたＴ毒素（１００μｇ）もしくはＱ毒素（１００μｇ）、またはＰＢＳ（対照群）で、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの群（Ｎ＝１０／群）をＩＭ免疫化した。２回目のワクチン接種１８日後に血清を収集した。図２５Ａは、ＥＬＩＳＡにより決定されたＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ_{（００３）}、およびＣＤＴｂに対する血清ＩｇＧ力価を示す。図２５Ｂは、Ｖｅｒｏ細胞アッセイにおいて決定された各毒素の毒素中和抗体の力価を示す。図２５Ｃでは、マウスは、２回目の免疫化の２１日後にＩＰ投与された致死用量（ＭＬＤ_１００％＝２．０μｇ）のＴｃｄＢ_{（００３）}を受けた。＊有意性は、Ｔ毒素またはＱ毒素群をＰＢＳ対照群と比較するマンテル－コックスログランク検定により決定された。 ハムスターにおけるＴ毒素およびＱ毒素融合タンパク質の免疫原性。２１日間隔で３回、１２０μｇのアルミニウムでアジュバント化された３０μｇのＱ毒素、またはＰＢＳ（対照群）で雄のハムスター（Ｎ＝８／群）をＩＭ免疫化した。３回目の投与の２週間後、試料を収集し分析した。図２６Ａは、ＥＬＩＳＡにより決定されたＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ_{（００３）}、およびＣＤＴｂに対する血清ＩｇＧ力価を示す。図２６Ｂは、Ｖｅｒｏ細胞アッセイにおいて決定された各毒素の毒素中和抗体の力価を示す。図２６Ｃおよび２６Ｄでは、３回目の免疫化の２週間後、胞子接種の１日前に全ての動物をクリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）でＩＰ処置し、強制飼養により２００ｃｆｕのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０（Ｃ）または５００ｃｆｕのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株Ｂ１／ＮＡＰ１／０２７（Ｄ）を接種させた。接種後８日間、動物を観察した。

定義
本明細書で使用される、「アジュバント」という用語は、免疫原と組み合わせて使用されるとき、免疫原に対して誘導される免疫応答を増大するか、またはさもなければ変更もしくは修飾する化合物を指す。疫応答の修飾には、抗体および細胞の免疫応答のいずれかまたはその両方の強化またはその特異性の広範化が含まれ得る。

本明細書で使用される、「免疫原」、「抗原」、および「エピトープ」という用語は、互換的に使用され、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質およびペプチドなどの物質を指す。

本明細書で使用される、「融合タンパク質」という用語は、１つのタンパク質のアミノ末端および別のタンパク質のカルボキシ末端で、連結ペプチドを介して直接もしくは間接的に接合または融合されて単一の連続したポリペプチドを形成する２つ以上のタンパク質もしくはタンパク質断片から構成されるタンパク質を意味する。いくつかの態様では、融合タンパク質は、「多価のタンパク質」とも称され得る。多価のタンパク質は、一緒に融合した２つ以上３つの別個のタンパク質抗原からのタンパク質またはタンパク質断片を含有する。

本明細書で使用される、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果を得るためのアプローチを指す。本発明の目的のために、有益なまたは所望の結果は、感染症もしくは疾患の開始または進行を阻害もしくは抑制すること、感染症もしくは疾患の症状を寛解させる、またはその発達を低減すること、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。

本明細書で使用される、「予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」と互換的に使用され、感染症もしくは疾患の完全な予防、またはその感染症もしくは疾患の症状の発達の予防、感染症もしくは疾患の開始、またはその症状の遅延、または後に発達する感染症もしくは疾患の重症度、またはその症状の減少を意味し得る。

本明細書で使用される、「効果的な用量」または「効果的な量」とは、マラリアの少なくとも１つの症状を低減する免疫応答を誘導するのに十分な免疫原の量を指す。効果的な用量または効果的な量は、例えば、分泌および／または血清抗体を中和する量を測定することにより、例えば、プラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、またはマイクロ中和アッセイにより決定され得る。

本明細書で使用される、「ワクチン」という用語は、病原体に由来する免疫原を含む調製物（例えば、本明細書に記載の融合タンパク質）を指し、防御免疫（例えば、病原体の感染から対象を保護する、および／または病原体の感染により生じる疾患もしくは状態の重症度を低減する免疫）を提供する、病原体に対する免疫応答を誘導するために使用される。防御免疫応答は、抗体および／または細胞媒介応答の形成を含み得る。文脈により、「ワクチン」という用語は、防御免疫をもたらすために脊椎動物に投与される免疫原の懸濁液または溶液も指し得る。

本明細書で使用される、「対象」という用語は、ヒトおよび他の動物を含む。一実施形態では、対象はヒトである。

本明細書で使用される、「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、そして特にヒトにおける使用のために、連邦もしくは州政府の規制機関により承認されているか、または米国薬局方、欧州薬局方、または他の一般的に認識される薬局方に列記されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物における防御免疫応答を誘導するためのワクチンおよび／または抗原組成物として有用であり得る。

本明細書で使用される、「約」という用語は、示される数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。
概要
本開示は、昆虫細胞からの大きなタンパク質、特に複数の抗原を含有する多価のタンパク質の高発現を達成するための方法および組成物を提供する。本明細書に開示される高レベルのタンパク質の生成は、本分野の以前の経験を考慮して特に意外なことである。

多価のタンパク質
本明細書に開示される多価の（多価のタンパク質は本明細書で多量体とも称され得る）タンパク質は、複数の病原体および／または同じ生物からの複数の病原性タンパク質からの作用から保護することができる。例えば、ある特定の病原体は、各々が対象に悪影響を及ぼす複数の分子を生成し得る。より効果的な応答は、複数の別個の抗原に対する応答を誘導することによりもたらされる。

タンパク質である多価のタンパク質は、複数の細菌毒素からのタンパク質部分を含有する。いくつかの態様では、多価のタンパク質は、例えば毒素など、同じ生物からのタンパク質の部分を含むか、またはそれからなる。他の態様では、多価のタンパク質は、２つ以上の生物からのタンパク質を含むか、またはそれからなる。特定の態様では、多価のタンパク質の２つのタンパク質は同じ生物からのものではない。いくつかの態様では、異なる菌株からの同じタンパク質（すなわち、同種集合）を使用して、その部分を生成することができる。異なる菌株からの同じタンパク質を使用することにより、複数の菌株に対する保護を可能にし、毒性のある菌株が新しく生じる状況において特に有用である。他の例としては、Ａ～Ｈの８つの血清型を有するＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍが挙げられる。本明細書に開示される方法および組成物を使用して、８つ全ての血清型に対して単一のワクチンを提供することができる。他の特定の例としては、コレラ、ジフテリア、およびシゲラ、または破傷風、百日咳、およびジフテリアから保護するのための組み合わせ毒素ワクチンが挙げられる。したがって、いくつかの態様では、多量体タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なるタンパク質からの部分を含有し得る。その部分を構成要素として使用して、多量体の免疫原性ポリペプチドを生成する。

ワクチンを生成するために使用される例示的な多量体および構成要素は下の表に記載される。Ｑ毒素およびＢＶ１５１２をコードする核酸配列、ならびにＢＶ１４２０およびＢＶ１４７０の代替的な核酸配列は、標準的なコドン変換を使用して示されるアミノ酸をコードするそれらの適切な縮重コドンである。

さらなるワクチン構築物は、異なる配向で上記の様々な構成要素を使用し得る。加えて、これらの開示される配列の各々に少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を構成要素として使用して、多量体タンパク質を生成することができる。

リンカー
いくつかの態様では、リンカーは、多価のタンパク質において、１つ以上のタンパク質間で使用され得る。いくつかの態様では、リンカーは、ポリ－（Ｇｌｙ）ｎリンカーであり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。他の態様では、リンカーは、ＧＧ、ＧＧＧ、またはＧＧＧＧ（配列番号２６）である。また他の態様では、リンカーは、ジペプチド、トリペプチド、およびクアドリペプチドからなる群から選択される。好ましいジペプチドは、アラニン－セリン（ＡＳ）、ロイシン－グルタミン酸（ＬＥ）、セリン－アルギニン（ＳＲ）である。

多価の抗原は、複数の毒素を対象に放出する生物からの保護に特に適している。例えば、細菌は、ヒトにおいて疾患を引き起こす毒素を生成することが知られている。したがって、本開示の主な焦点はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅであり、本開示の多量体ポリペプチドは、他の種からのタンパク質毒素の部分を使用して調製され得る。

毒素生成種としては、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、およびＣ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍが挙げられる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、２つの腸内毒素ＡおよびＢを放出し、これは毒素産生性菌株により生成される。毒素Ａは最小細胞傷害性活性を有する腸内毒であり、一方、毒素Ｂは強力な細胞毒であるが、限られた腸内毒活性を有する。第３の毒素である二成分毒素はＣＤＴとしても知られ、同じく細菌により生成される。毒素ＡおよびＢをコードする配列が既知である（Ｍｏｎｃｒｉｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１１０５－１１０８（１９９７）、Ｂａｒｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４００４（１９９０）、Ｄｏｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０－４８８（１９９０））。二成分毒素をコードする配列も既知である（受入番号ＡＢＳ５７４７７、ＡＡＢ６７３０５、ＡＡＦ８１７６１）。

病原体感染から保護するための本開示の有用性は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する三価のタンパク質ワクチンにより図示される。図１は、２つの例示的な多量体タンパク質（ＢＶ１４２０およびＢＶ１４７０）の構造を示す。各多量体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからの３つの毒素タンパク質である毒素Ａ（ＴｃｄＡ）、毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）、および二成分毒素（ＣＤＴｂ）の部分を含有する。三種混合毒素１４２０はフーリン切断部位も含有する。これらのタンパク質は、大きく、つまり１８００アミノ酸超であり、昆虫細胞において発現される場合、使用可能な量のタンパク質をもたらすことが以前には予想されていなかったであろう。しかしながら、驚くべきことに、両タンパク質は高レベルで発現される。図３を参照されたい。実際、図５が示すように、ＢＶ１４７０の収量は２６９ｍｇ／Ｌであった。同様に、ＢＶ１４２０の収量は１６６ｍｇ／Ｌであった。

精製された多量体タンパク質の分析により、それらは、ＢＶ１４２０についてはおよそ約１６ｎｍ、そしてＢＶ１４７０については約１８ｎｍのピーク直径を有するナノ粒子構造であることが確認された。特に、図７および８に示す直径の分布は、精製後、高い割合の多量体タンパク質がナノ粒子構造を保持したことを図示する。

ＢＶ１４２０の三価のナノ粒子のマウスへの投与は、３つ全てのタンパク質に対する免疫応答が得られたことを示す。さらに、図１３が図示するように、得られた免疫応答は、毒素Ａおよび二成分毒素による致死接種から１００％のマウスを保護し、同様に、毒素Ｂによる致死接種に応答して６７％～８３％のマウスを保護した。対照的に、ＰＢＳ対照群のマウスは二成分毒素対照群の２匹のマウスを除いて全て死亡した。

四価の毒素も多量体免疫原性ペプチドの好ましい種類である。図２０は、４つの部分または構成要素が順番に配置された２つの図示的な例を示す。多量体の実質的な長さにかかわらず、良好なタンパク質生成が得られた。図２２。

図２３は、第２のＴｃｄＢ型からの毒素の部分を付加することによる、３毒素融合タンパク質の四価の毒素への変換を図示する。これら２つのタンパク質の比較は、昆虫細胞発現が高レベルの生成をもたらすことができることを示す。図２４Ａ～Ｄを参照されたい。

したがって、例示的な多量体は、様々な配向で構造化された部分を含む。例えば、Ｎ末端から出発して、第１の部分は、ＴｃｄＡ部分、ＴｃｄＢ部分、またはＣＤＴｂ部分であり得る。第２の部分は、ＴｃｄＡ部分、ＴｃｄＢ部分、またはＣＤＴｂ部分であり得る。第３の部分は、ＴｃｄＡ部分、ＴｃｄＢ部分、またはＣＤＴｂ部分であり得る。第４の部分は、存在する場合、ＴｃｄＡ部分、ＴｃｄＢ部分、またはＣＤＴｂ部分であり得る。したがって、各部分は各位置を占有し得る。常にではないが、典型的には、２つの隣接する部分は同じ種類の毒素からの部分ではない。好ましい実施形態では、Ｎ末端部分は、ＣＤＴｂ部分である。

分子生物学的技法
本明細書に開示される多価のタンパク質は、分子生物学的アプローチを通して調製される。クローニング、変異、細胞培養などの本発明に適用できる分子生物学的技法を説明する一般書には、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合併企業）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が含まれる。これらの書は、変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、ならびに例えば、ＰｆＣＳＰなどのクローニングおよび変異に関連する多くの他の関連のある論題を記載する。したがって、本発明は、本発明の融合タンパク質上またはその中に発現されるタンパク質の特徴を改善または変更するために、既知のタンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の方法を使用することも包含する。様々な種類の変異誘発を使用して、タンパク質分子をコードする変異型核酸を生成および／もしくは単離する、かつ／または本発明の融合タンパク質中またはその上のタンパク質をさらに修飾／変異させることができる。それらには、限定されないが、部位特異的、ランダム点変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャッフリング）、ウラシル含有テンプレートを使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、ホスホロチオエート修飾されたＤＮＡ変異誘発、ギャップのある二本鎖ＤＮＡを使用する変異誘発が含まれる。さらなる好適な方法には、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主菌株を使用する変異誘発、制限－選択および制限－精製、欠失変異誘発、完全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復などが含まれる。例えば、キメラ構築物を伴う変異誘発も本発明に含まれる。一実施形態では、変異誘発は、既知の天然に存在する分子または変更されたもしくは変異した天然に存在する分子の情報、例えば、配列、配列比較、物理特性、結晶構造などにより導かれてもよい。

タンパク質のクローニング方法は当該技術分野において既知である。遺伝子は、ＤＮＡインサートとしてベクター内にクローニングすることができる。「ベクター」という用語は、核酸が生物、細胞、または細胞構成要素間で伝播および／または移動することができる手段を指す。ベクターには、自己複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが含まれる。ベクターは、自己複製しないネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ－リジンコンジュゲートされたＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートされたＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートされたＤＮＡなどでもあり得る。全てではないが、多くの一般的な実施形態では、本発明のベクターは、プラスミドまたはバクミドである。

したがって、本発明は、本発明の融合タンパク質の形成を誘導する細胞において発現され得る発現ベクター内にクローニングされる、キメラ分子を含むタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。「発現ベクター」は、その中に組み込まれた核酸の発現ならびに複製を促進することが可能なベクター（プラスミドなど）である。典型的には、発現される核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「作動可能に連結」され、プロモーターおよび／またはエンハンサーにより転写調節制御を受ける。一実施形態では、ヌクレオチドは、マラリア原虫タンパク質（上記に論じられる）をコードする。別の実施形態では、発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。

本発明のいくつかの実施形態では、タンパク質は、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンをＳｆ９細胞などの昆虫細胞が好むものに変更する）、サイレント置換、付加、または欠失をもたらす変更を含有する変異を含み得る。例えば、米国特許公開第２００５／０１１８１９１号（全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

加えて、ヌクレオチドを配列決定して、正しいコード領域がクローニングされ、あらゆる望ましくない変異を含有しないことを確実にする。ヌクレオチドは、任意の細胞における発現のために、発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）内にサブクローニングされ得る。上記は、タンパク質がどのようにクローニングされ得るかの単に１つの例である。当業者はさらなる方法が使用され得ることを理解する。

宿主細胞
高レベルの発現が昆虫細胞の発現系において得られた。昆虫細胞の非限定的な例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である。

ベクター、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当該技術分野において周知の方法に従い宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、核酸の真核生物細胞内への導入は、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションにより達成され得る。一実施形態では、ベクターは組換えバキュロウイルスである。

ナノ粒子生成
ナノ粒子は、組換えタンパク質が発現される条件下で発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を成長させることによって生成され得る。一態様では、多価のタンパク質の生成方法は、タンパク質をコードするベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトすることと、ナノ粒子形成を可能にする条件下でタンパク質を発現させることとを含む。別の実施形態では、真核生物細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、または哺乳類の細胞からなる群から選択される。適切な成長条件の選択は、技術内であるか、または当業者の技術内である。

宿主細胞を成長させる方法は、限定されないが、回分、流加、連続、および灌流細胞培養技法を含む。細胞培養は、細胞が精製および単離のためにタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を伝播し発現するバイオリアクター（例えば、発酵チャンバ）内での細胞の成長および伝播を意味する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクター内で、減菌の制御された温度および大気条件下で行われる。バイオリアクターは、温度、大気、攪拌、および／またはｐＨなどの環境条件が監視され得る、細胞を培養するために使用されるチャンバである。一実施形態では、バイオリアクターはステンレススチールのチャンバである。別の実施形態では、バイオリアクターは、予め減菌されたプラスチック袋（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ（登録商標）、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．）である。他の実施形態では、予め減菌されたプラスチック袋は、約５０Ｌ～１０００Ｌの袋である。

ナノ粒子の洗剤抽出および精製
ナノ粒子は、洗剤を使用して宿主細胞から回収され得る。好適な洗剤には、非イオン性界面活性剤が含まれる。例えば、非イオン性界面活性剤は、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、ノノキシノール－９、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイル カルボニル］）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－デカノイル－Ｎ－メチルグルカミン、ｎ－デシルアルファ－Ｄグルコピラノシド、デシルベータ－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデカノイル－Ｎ－メチルグルカミド、ｎドデシルアルファ－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルベータ－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルベータ－Ｄ－マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコール、モノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ｎ－ヘキサデシルベータ－Ｄ－マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、メチル－６－０－（Ｎ－ヘプチルカルバモイル）－アルファ－Ｄ－グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチルグルカミン、Ｎ－ノナノイルＮ－メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル－ベータ－Ｄグルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコール、モノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ－１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアレート、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシエチレン８ステアレート、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ポリオキシエチレン２５ステアリン酸プロピレングリコール、キラヤ樹皮からのサポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ １５－Ｓ－１２、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ １５－Ｓ－３０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ １５－Ｓ－５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ １５－Ｓ－７、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ １５－Ｓ－９、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ ＮＰ－１０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ ＮＰ－４、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ ＮＰ－４０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、Ｔｙｐｅ ＮＰ－７ Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ ＮＰ－９、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ ＴＭＮ－１０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｔｙｐｅ ＴＭＮ－６、テトラデシル－ベータ－Ｄ－マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ－２１、Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ－３２、Ｔｒｉｔｏｎ ＤＦ－１２、Ｔｒｉｔｏｎ ＤＦ－１６、Ｔｒｉｔｏｎ ＧＲ－５Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ ＱＳ－１５、Ｔｒｉｔｏｎ ＱＳ－４４、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１０２、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１５１、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－２００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－２０７、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１６５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－４０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－７０５－７０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、チロキサポール、ｎ－ウンデシルベータ－Ｄ－グルコピラノシド、それらの半合成誘導体、またはそれらの組み合わせであり得る。Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ－９が好ましい洗剤である。

宿主細胞を４８～７２時間成長させたら、細胞を培地から単離し、洗剤含有溶液を添加して細胞膜を可溶化し、洗剤抽出物にナノ粒子を放出させる。洗剤は約０．１％～約１．０％の最終濃度に添加され得る。例えば、濃度は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．５％、約０．７％、約０．８％、または約１．０％であり得る。ある特定の態様では、範囲は約０．１％～約０．３％であり得る。好ましくは、濃度は約０．２％である。

ナノ粒子は、その後、遠心分離など、その完全性を保存する方法を使用して単離され得る。いくつかの態様では、塩化物、ショ糖、イオジキサノールの使用など、勾配遠心分離を使用することができる。他の技法、例えば、イオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技法が代替的にまたは追加で使用され得る。

一態様では、洗剤抽出物は順次複数のカラムに添加される。例えば、第１のカラムはＴＭＡＥなどのイオンクロマトグラフィーカラムであってよく、第２のカラムはフェニルＨＰなどの疎水性相互作用カラムであってよく、第３のカラムはＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑカラムなどの強アニオン交換カラムであってよい。純度の増加は３工程手順を繰り返すことによって得ることができる。

以下は単離および精製タンパク質を作製するための一般的な手順を提供する。当業者は、利用することができる変形があることを理解するであろう。

生成は、Ｓｆ９細胞（非感染）をシェーカーフラスコに播種し、細胞を拡張させ、細胞が成長し倍加するにつれて規模を拡大する（例えば、１２５－ｍｌのフラスコから５０ＬのＷａｖｅ袋に）ことによって開始される。細胞を成長させるために使用される培地は、適切な細胞系（好ましくは無血清培地、例えば、昆虫培地ＥｘＣｅｌｌ－４２０，ＪＲＨ）のために配合される。次いで、細胞を最も効率的な感染多重度（例えば、細胞当たり約１～約３のプラーク形成単位）で組換えバキュロウイルスに感染させる。感染が生じたら、融合タンパク質（および任意選択で、他の免疫原）をウイルスゲノムから発現させる。通常、感染は、細胞が成長の中対数期（４～８×１０^６細胞／ｍｌ）にあるとき最も効率的であり、少なくとも約９０％生存可能である。

本開示のタンパク質は、感染のおよそ４８～９６時間後に回収することができる。いくつかの態様では、回収は、約４８時間、約７２時間、または約４８～約７２時間で行われる。典型的には、回収は、細胞培養培地のＶＬＰのレベルが最大に近いが広範な細胞溶解前であるときに行われる。回収時のＳｆ９細胞密度および生存率は、約０．５×１０^６細胞／ｍｌ～約１．５×１０^６細胞／ｍｌであり得、色素排除アッセイにより示されるとき、少なくとも２０％の生存率を有する。

粒子を可溶化するために、０．２％ＮＰ９／２５ｍＭのＴｒｉｓ／５０ｍＭのＮａＣｌ／ｐＨ８．０の最終濃度までＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９を細胞培養物に直接添加する。室温で１時間インキュベートし、その後可溶化液を２回９０００ｇで３０分間遠心分離する。ナノ粒子を含有する上清を収集する。次いで、上清を緩衝液Ａに添加し、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液Ｂ：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／１ＭのＮａＣｌ）に溶出する。溶出液をフェニルＨＰカラム（緩衝液Ａ：３５０ｍＭのクエン酸Ｎａ／２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、および緩衝液Ｂ： ５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０）、次いでＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑカラム（緩衝液Ａ： ２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／２５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液Ｂ：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／１ＭのＮａＣｌ）に適用する。生成物を含有するプールした画分を２ミクロンのフィルタに通す。図８～１０を参照されたい。

上述の手順は、１５０ｍｇ／Ｌ～約３００ｍｇ／Ｌの収量で少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約９８％の純度を可能にする。純度は総タンパク質を示すゲルに基づくアプローチにより測定され得る。

所望する場合、無傷のバキュロウイルスが不活性化され得る。不活性化は、化学方法、例えば、ホルマリンまたはβ－プロピオラクトン（ＢＰＬ）により達成され得る。無傷のバキュロウイルスの除去および／または不活性化は、上記に例示するように、当該技術分野で既知の選択的沈殿およびクロマトグラフ方法を使用しても大規模に達成され得る。不活性化の方法は、ＶＬＰを含有する試料を、０．２％ ＢＰＬ中で３時間、約２５℃～約２７℃でインキュベートすることを含む。バキュロウイルスは、ＶＬＰを含有する試料を、４℃で、０．０５％ ＢＰＬ中で３日間、次いで３７℃で１時間インキュベートすることによっても不活性化することができる。

上記の技法は、様々な規模にわたって実践することができる。例えば、Ｔフラスコ、振盪フラスコ、スピナーボトル、最大工業規模のバイオリアクター。バイオリアクターは、ステンレススチールのタンクまたは予め減菌されたプラスチック袋（例えば、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．により販売されるシステム）のいずれかを含み得る。当業者は、特定の状況に何が最も望ましいかを知っているであろう。

タンパク質のサイズおよび収量
本明細書に開示される方法を使用した多量体タンパク質の収量は際立っている。いくつかの例では、収量は約１５０ｍｇ／Ｌ～約３００ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、収量は、約４０ｍｇ／Ｌ、約６０ｍｇ／Ｌ、約８０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、または約３００ｍｇ／Ｌである。特定の態様では、収量は、約４０ｍｇ／Ｌ～約３００ｍｇ／Ｌ、約８０ｍｇ／Ｌ～約２５０ｍｇ／Ｌ、または約１００ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／Ｌの範囲である。

本明細書に開示される大きい多量体タンパク質は、典型的には、約１５００～２５００個のアミノ酸の範囲である。いくつかの態様では、それらは、約１５００～約２０００個のアミノ酸の範囲である。他の態様では、それらは、約１８００～約２０００個のアミノ酸の範囲である。

多量体タンパク質は、約１１ｎｍ～約３５ｎｍの典型的な直径を有するナノ粒子を形成する。直径の範囲は、約１５ｎｍ～約２５ｎｍであり得る。これらの範囲の多量体タンパク質ナノ粒子の図示的な例は図９に示される。

重要なことには、タンパク質が大きくても、それらは可溶性のままである。例えば、精製された多量体タンパク質は、約８０％可溶性性、約８５％可溶性、約９０％可溶性、約９５％可溶性、約９７％可溶性、または約９９％可溶性であり得る。いくつかの態様では、溶解度は、約９０％～約９９％または約９０％～約９５％である。

修飾された抗原およびポリペプチド
本明細書に開示される抗原は、それらの抗原の変形および変異体を包含する。ある特定の態様では、抗原は開示される抗原に対して同一性を共有し得る。一般に、また具体的に特定された抗原の文脈において具体的に定義されない限り、同一性パーセンテージは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％であり得る。同一性パーセンテージは、デフォルトパラメータを使用して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏにおいて利用可能なアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して計算することができる。

特定の態様では、ナノ粒子に含有されるタンパク質は、そのタンパク質からなる。他の態様では、ナノ粒子に含有されるタンパク質は、そのタンパク質を含む。タンパク質自体への拡張は様々な目的のためであり得る。

いくつかの態様では、抗原は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方で拡張され得る。いくつかの態様では、拡張部は、精製または検出などの機能に有用なタグである。いくつかの態様では、タグはエピトープを含有する。例えば、タグは、ポリグルタメートタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ポリＨｉｓタグ（約５～１０のヒスチジンを有する）、Ｍｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、マルトース結合タンパク質タグ、チオレドキシンタグ、またはＦｃタグであり得る。他の態様では、拡張部は、タンパク質に融合して発現を強化するＮ末端シグナルペプチドであり得る。そのようなシグナルペプチドは細胞における発現中に切断されることが多いが、一部のナノ粒子は無傷のシグナルペプチドを有する抗原を含有し得る。したがって、ナノ粒子が抗原を含む場合、抗原は拡張部を含有し得、したがって、ナノ粒子に組み込まれるとき、融合タンパク質であり得る。配列に対する同一性を計算する目的のため、拡張部は含まれない。いくつかの態様では、抗原は切り詰められてもよい。例えば、Ｎ末端は、約１０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、または約２００個のアミノ酸だけ切り詰められ得る。例えば、Ｃ末端は、約１０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、または約２００個のアミノ酸だけ切り詰められ得る。

医薬組成物
本明細書に開示される医薬組成物は、多量体タンパク質および薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、過度の毒性、刺激、またはアレルギー反応なく対象に投与することができる任意の医薬品を含む。薬学的に許容される担体は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤も含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、一般的に安全で非毒性の医薬組成物を調製する際に有用である任意の賦形剤であり、獣医学ならびにヒトの製薬学的用途に許容される。

本明細書で有用な医薬組成物は、それ自体が組成物を受ける脊椎動物に対して有害な免疫応答の生成を誘導しない任意の医薬品を含み、過度の毒性および免疫原なく投与され得る（例えば、多量体融合タンパク質）、任意の好適な希釈剤または賦形剤を含む薬学的に許容される担体を含有する。

いくつかの態様では、製剤は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る。薬学的に許容される担体には、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、減菌等張水性緩衝液、およびそれらの組み合わせを含む。薬学的に許容される担体、希釈剤、および他の賦形剤の完全な詳解は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．最新版）に述べられている。製剤は、投与モードに適するように適応される。例示的な実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に適しており、減菌であり、微粒子ではなく、かつ／または発熱性ではない。

本組成物は、湿潤剤、または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、またはそれらの混合物も含有し得る。本組成物は、再構築（例えば、水または生理食塩水で）に適した凍結乾燥粉末などの固体形態、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、または粉末であり得る。経口用製剤には、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体が含まれ得る。

アジュバント
特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激物質の使用により強化され得る。アジュバントは、抗原に対する免疫の一般的増加を促進するために実験的に使用されている（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。免疫化プロトコルは、長年、応答を刺激するためにアジュバントを使用しており、そのためアジュバントは当業者に周知である。一部のアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を及ぼす。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原がアルミニウムによって引き起こされるときに増加する。抗原の乳化も抗原提示の持続時間を延長する。任意のアジュバントの包含は、Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」に記載されており、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれ、本開示の範囲内に想定される。

例示的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅させたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントには、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ＭＤＰ化合物（ｔｈｕｒ－ＭＤＰおよびｎｏｒ－ＭＤＰなど）、ＣＧＰ（ＭＴＰ－ＰＥ）、脂質Ａ、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＭＦ－５９、ＲＩＢＩ（細菌から抽出された３つの構成要素を含有する）、ＭＰＬ、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、ならびに２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中の細胞壁骨格（ＣＷＳ）が含まれる。他の好ましい態様では、２％ Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ａｌ（ＯＨ）_３）などのアルミニウムが使用される。いくつかの態様では、アジュバントは、小重膜（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）脂質小胞、例えば、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）であり得る。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、約１００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の小重膜非リン脂質小胞である。それらは、Ｂｒｉｊ ７２、コレステロール、オレイン酸、およびスクアレンを含む。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓは、効果的なアジュバントであることが示されている（米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、および同第４，９１１，９２８号を参照されたい。

サポニンアジュバント
サポニンを含有するアジュバントはまた、本明細書に開示される免疫原と組み合わせることもできる。サポニンは、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から得られるグリコシドである。典型的には、サポニンは、複数の画分をもたらす多工程精製プロセスを使用して調製される。本明細書で使用される、「Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａからのサポニン画分」という用語は、一般的にＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの半精製されたもしくは定義されたサポニン画分、またはその実質的に純粋な画分を説明するために使用される。

サポニン画分
いくつかのアプローチがサポニン画分の生成に適している。画分Ａ、Ｂ、およびＣは、米国特許第６，３５２，６９７号に記載されており、以下のように調製され得る。粗製の水性Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ抽出物のＱｕｉｌ Ａからの親油性画分をクロマトグラフィーによって分離し、水中７０％のアセトニトリルで溶出して親油性画分を回収した。次いで、この親油性画分を、酸性水中２５％～６０％のアセトニトリルの勾配を使用する溶出で、半分取ＨＰＬＣにより分離した。 「画分Ａ」または「ＱＨ－Ａ」として本明細書で言及される画分は、およそ３９％のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはそれに対応する。「画分Ｂ」または「ＱＨ－Ｂ」として本明細書で言及される画分は、およそ４７％のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはそれに対応する。「画分Ｃ」または「ＱＨ－Ｃ」として本明細書で言及される画分は、およそ４９％のアセトニトリルで溶出される画分であるか、またはそれに対応する。画分の精製に関する追加の情報は、米国特許第５，０５７，５４０号に見出すことができる。本明細書に記載されるように調製される場合、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ａ、Ｂ、およびＣは各々、限定可能な特性を有する化学的に密接に関係している分子の族またはファミリーを表す。それらが得られるクロマトグラフィー条件は、溶出プロファイルの観点から、回分間の再現性および生物学的活性が非常に一貫しているような条件である。

他のサポニン画分が記載されている。画分Ｂ３、Ｂ４、およびＢ４ｂがＥＰ０４３６６２０に記載されている。画分ＱＡ１～ＱＡ２２がＥＰ０３６３２２７９（Ｂ２）、Ｑ－ＶＡＣ（Ｎｏｒ－Ｆｅｅｄ，ＡＳ Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ Ｓｐｉｋｏｓｉｄｅ（ｌｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ，Ｕｌｔｕｎａａｌｌｅｎ ２Ｂ，７５６ ５１ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に記載されている。ＥＰ０３６３２２７９（Ｂ２）の画分ＱＡ－１、ＱＡ－２、ＱＡ－３、ＱＡ－４、ＱＡ－５、ＱＡ－６、ＱＡ－７、ＱＡ－８、ＱＡ－９、ＱＡ－１０、ＱＡ－１１、ＱＡ－１２、ＱＡ－１３、ＱＡ－１４、ＱＡ－１５、ＱＡ－１６、ＱＡ－１７、ＱＡ－１８、ＱＡ－１９、ＱＡ－２０、ＱＡ－２１、およびＱＡ－２２、特にＱＡ－７、ＱＡ－１７、ＱＡ－１８、およびＱＡ－２１が使用され得る。それらは、ＥＰ０３６３２２７９（Ｂ２）、特にページ６、ならびにページ８および９の実施例１に記載されているように得られる。

本明細書で記載され、アジュバントの形成に使用されるサポニン画分は実質的に純粋な画分であることが多い、つまり、画分は実質的に他の材料からの汚染がない。特定の態様では、実質的に純粋なサポニン画分は、他のサポニンまたは他のアジュバント材料など、最大４０重量％、最大３０重量％、最大２５重量％、最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０重量％、最大７重量％、最大５重量％、最大２重量％、最大１重量％、最大０．５重量％、または最大０．１重量％の他の化合物を含有し得る。

ＩＳＣＯＭ構造
サポニン画分は、ＩＳＣＯＭと称されるケージのような粒子の形態で投与され得る（Ｉｍｍｕｎｅ ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＣＯＭｐｌｅｘ）。ＩＳＣＯＭは、ＥＰ０１０９９４２（Ｂ１）、ＥＰ０２４２３８０（Ｂ１）、およびＥＰ０１８０５４６（Ｂ１）に記載されているように調製され得る。特定の実施形態では、ＥＰ９６００６４７－３（ＰＣＴ／ＳＥ９７／００２８９）に記載されるように、輸送および／または随伴抗原が使用され得る。

マトリックスアジュバント
いくつかの態様では、ＩＳＣＯＭは、ＩＳＣＯＭマトリックス複合体である。ＩＳＣＯＭマトリックス複合体は、少なくとも１つのサポニン画分と、脂質とを含む。脂質は、コレステロールなど、少なくともステロールである。特定の態様では、ＩＳＣＯＭマトリックス複合体はリン脂質も含む。ＩＳＣＯＭマトリックス複合体は、１つ以上の他の免疫調節（アジュバント活性）物質も含有し得るが、必ずしもグリコシドでなくてもよく、ＥＰ０４３６６２０（Ｂ１）に記載されるように生成され得る。

他の態様では、ＩＳＣＯＭはＩＳＣＯＭ複合体である。ＩＳＣＯＭ複合体は、少なくとも１つのサポニン、少なくとも１つの脂質、および少なくとも１種類の抗原またはエピトープを含有する。ＩＳＣＯＭ複合体は、抗原の部分が粒子内に組み込まれるように、洗剤処理によって会合した抗原を含有する。対照的に、ＩＳＣＯＭマトリックスは、抗原との混和物として製剤化され、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子と抗原との間の会合は、静電および／または疎水性相互作用によって媒介される。

一実施形態によると、ＩＳＣＯＭマトリックス複合体もしくはＩＳＣＯＭ複合体、あるいはＩＳＣＯＭもしくはＩＳＣＯＭマトリックス複合体にも組み込まれるか、またはそれと混合される少なくとも１つの追加のアジュバントに組み込まれるサポニン画分は、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの画分Ａ、画分Ｂ、もしくは画分Ｃ、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの半精製された調製物、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの精製された調製物、または任意の精製された細画分、例えば、ＱＡ１～２１から選択される。

特定の態様では、各ＩＳＣＯＭ粒子は、少なくとも２つのサポニン画分を含有し得る。異なるサポニン画分の重量％の任意の組み合わせを使用することができる。任意の２つ画分の重量％の任意の組み合わせを使用することができる。例えば、粒子は、それぞれ、任意の重量％の画分Ａと、粗製サポニン画分もしくは画分Ｃなどの、任意の重量％の別のサポニン画分とを含有し得る。したがって、特定の態様では、各ＩＳＣＯＭマトリックス粒子または各ＩＳＣＯＭ複合体粒子は、０．１～９９．９重量、５～９５重量％、１０～９０重量％、１５～８５重量％、２０～８０重量％、２５～７５重量％、３０～７０重量％、３５～６５重量％、４０～６０重量％、４５～５５重量％、４０～６０重量％、または５０重量％の１つのサポニン画分、例えば、画分Ａと、各々の場合において残余が最大１００％の別のサポニン、例えば、任意の粗製画分、または任意の他の画分、例えば、画分Ｃとを含有し得る。重量は、サポニン画分の総重量として計算される。ＩＳＣＯＭマトリックス複合体およびＩＳＣＯＭ複合体アジュバントの例は、米国公開出願第２０１３／０１２９７７０号に開示されている。

特定の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリックスまたはＩＳＣＯＭ複合体は、５～９９重量％の１つの画分、例えば、画分Ａと、残余が最大１００重量％の別の画分、例えば、粗製サポニン画分または画分Ｃとを含む。重量は、サポニン画分の総重量として計算される。

別の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリックスまたはＩＳＣＯＭ複合体は、４０％～９９重量％の１つの画分、例えば、画分Ａと、１重量％～６０重量％の別の画分、例えば、粗製サポニン画分または画分Ｃとを含む。重量は、サポニン画分の総重量として計算される。

また別の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリックスまたはＩＳＣＯＭ複合体は、７０％～９５重量％の１つの画分、例えば、画分Ａと、３０重量％～５重量％の別の画分、例えば、粗製サポニン画分または画分Ｃとを含む。重量は、サポニン画分の総重量として計算される。他の実施形態では、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａからのサポニン画分は、ＱＡ１～２１のうちのいずれか１つから選択される。

サポニン画分の混合物を含有する粒子に加えて、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子およびＩＳＣＯＭ複合体粒子は各々、１つのサポニン画分のみを使用して形成され得る。本明細書に開示される組成物は、各粒子が１つのサポニン画分のみを含有する複数の粒子を含有し得る。つまり、ある特定の組成物は、各個々の粒子がＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａからの１つのサポニン画分を含有する、１つ以上の異なる種類のＩＳＣＯＭマトリックス複合体粒子および／または１つ以上の異なる種類のＩＳＣＯＭ複合体粒子を含有し得、１つの複合体中のサポニン画分は、他の複合体粒子中のサポニン画分とは異なる。

特定の態様では、１種類のサポニン画分または粗製サポニン画分が１つのＩＳＣＯＭマトリックス複合体または粒子に組み込まれ得、別の種類の実質的に純粋なサポニン画分もしくは粗製サポニン画分が別のＩＳＣＯＭマトリックス複合体または粒子に組み込まれ得る。組成物またはワクチンは、各種類が物理的に異なる粒子に組み込まれた１種類のサポニンを有する、少なくとも２種類の複合体または粒子を含み得る。

本組成物において、１つのサポニン画分Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａおよび別のサポニン画分Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａが異なるＩＳＣＯＭマトリックス複合体粒子および／またはＩＳＣＯＭ複合体粒子に別個に組み込まれるＩＳＣＯＭマトリックス複合体粒子および／またはＩＳＣＯＭ複合体粒子の混合物が使用され得る。

各々が１つのサポニン画分を有するＩＳＣＯＭマトリックスまたはＩＳＣＯＭ複合体粒子が、任意の組み合わせの重量％で組成物中に存在し得る。特定の態様では、組成物は、残りの部分が異なるサポニン画分を含有するＩＳＣＯＭマトリックスまたは複合体で構成された第１のサポニン画分を含有する、０．１重量％～９９．９重量％、５重量％～９５重量％、１０重量％～９０重量％、１５重量％～８５重量％、２０重量％～８０重量％、２５重量％～７５重量％、３０重量％～７０重量％、３５重量％～６５重量％、４０重量％～６０重量％、４５重量％～５５重量％、４０～６０重量％、または５０重量％のＩＳＣＯＭマトリックスまたは複合体を含有し得る。いくつかの態様では、残りの部分は、各マトリックスまたは複合体粒子が１つのサポニン画分のみを含有する、１つ以上のＩＳＣＯＭマトリックスまたは複合体である。他の態様では、ＩＳＣＯＭマトリックスまたは複合体粒子は、２つ以上のサポニン画分を含有し得る。

好ましい組成物では、第１のＩＳＣＯＭマトリックス中のサポニン画分は画分Ａ（「画分Ａマトリックス」）であり、第２のＩＳＣＯＭマトリックスまたはＩＳＣＯＭ複合体粒子中のサポニン画分は画分Ｃ（「画分Ｃマトリックス」）である。したがって、好ましい組成物は、アジュバントとして、画分Ａマトリックスアジュバントと、画分Ｃマトリックスアジュバントとを含む。組成物中の各マトリックスの量は異なり得る。例えば、画分Ａマトリックスの量は、約８０％（ｗ／ｗ）、約８５％（ｗ／ｗ）、約９０％（ｗ／ｗ）、約９２％（ｗ／ｗ）、または約９５％（ｗ／ｗ）であり、残余が画分Ｃマトリックスであり得る。好適な８５：１５画分Ａマトリックおよび画分Ｃマトリックスの組み合わせの好適な例は、約８５対約１５の比率の画分Ａマトリックスと画分Ｃマトリックスとの混合物であるＭａｔｒｉｘ－Ｍ（商標）（Ｎｏｖａｖａｘ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）である。

ＱＳ－７およびＱＳ－２１画分などの他のサポニン画分、それらの生成、およびそれらの使用は、米国特許第５，０５７，５４０号、同第６，２３１，８５９号、同第６，３５２，６９７号、同第６，５２４，５８４号、同第６，８４６，４８９号、同第７，７７６，３４３号、および同第８，１７３，１４１号に記載されている。これらの画分は、本明細書に開示される方法および組成物において使用され得る。

免疫刺激物質
本開示の組成物はまた、「免疫刺激物質」とともに製剤化されてもよい。それらは、免疫系の応答を増加させるための身体自体の化学メッセンジャー（サイトカイン）である。免疫刺激物質には、限定されないが、免疫刺激性、免疫増強、および炎症促進活性を伴う様々なサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３）；成長因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）－コロニー刺激因子（ＣＭ）；ならびに他の免疫刺激性分子、例えば、マクロファージ炎症因子Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２などが含まれる。免疫刺激性分子は、本開示の組成物と同じ製剤において投与され得るか、または別個に投与され得る。タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかが、免疫刺激作用をもたらすように投与され得る。したがって、一実施形態では、本開示は、アジュバントおよび／または免疫刺激物質を含む抗原性およびワクチン製剤を含む。

免疫応答の誘導方法
病原体に対する免疫応答を誘発する方法も本開示において提供される。本方法は、多量体タンパク質を含む、免疫学的に効果的な量の組成物を対象に投与することを伴う。免疫学的に効果的な量の本開示の組成物の投与は、融合タンパク質上に存在するエピトープに特異的な免疫応答を誘発する。そのような免疫応答は、Ｂ細胞応答および／またはＴ細胞応答を含み得る。対象に投与されるとき、多量体タンパク質は、好ましくは中和抗体を誘導する。好ましくは、免疫応答は、多量体タンパク質に含有される各タンパク質に存在する少なくとも１つの立体構造エピトープに特異的な要素を含む。

投与
投与は、任意の好適な経路によるものであり得る。好適な経路は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および経口もしくは肺経路、または坐剤による）、経皮的、または皮内を含む。投与は、注入もしくはボーラス注射による、上皮もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、上咽頭、中咽頭、膣、尿道、膀胱、および腸粘膜など）によるものであってよく、他の生物学的活性剤と一緒に投与され得る。いくつかの態様では、鼻腔内または他の粘膜投与経路は、他の投与経路よりも実質的に高い抗体または他の免疫応答をもたらし得る。投与は、全身性または局所であり得る。

いくつかの態様では、投与は、針およびシリンジを使用する注射による、無針注射デバイスによるものであり得る。他の態様では、投与は、液滴による、大きな粒子エアロゾル（約１０ミクロンより大きい）、または上気道内への噴霧によるものである。

いくつかの態様では、製剤の構成要素のうちの１つ以上で充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットが提供される。特定の態様では、キットは、多量体タンパク質を含有する第１の容器、およびアジュバントを含有する第２の容器の２つの容器を含み得る。製造、薬剤もしくは生物学的製品の使用もしくは販売を規制する政府機関により規定される形態の通知がそのような容器（複数可）に付随してもよく、その通知は、ヒト投与のための製造、使用、または販売機関による承認を反映する。製剤はまた、組成物の量を示すアンプルまたはサシェなどの気密密封された容器にパッケージされ得る。

いくつかの態様では、投与は標的化され得る。例えば、本組成物は、免疫化部位で免疫応答を誘発するために、粘膜組織を標的とするような方法で投与され得る。腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）などの粘膜組織も、特定の粘膜標的化特性を有するアジュバントを含有する組成物の経口投与の使用により免疫化を標的とすることができる。鼻咽頭リンパ組織（ＮＡＬＴ）および気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）などのさらなる粘膜組織も標的とすることができる。

いくつかの態様では、各々異なる抗原の集まりを有する複数の組成物が投与され得る。２つ以上の多量体タンパク質が投与される場合、タンパク質は、例えば、多量体タンパク質を含有する１つ以上の容器からの材料の注射により、対象の同じ位置に同時に共投与することができる。他の態様では、それらは、短期間内で異なる部位に順次共投与され得、例えば、１つの投与は大腿であってよく、第２の投与は腕であってよく、両投与は短期間内に生じる（例えば、最大３０分）。

ヒトの好ましい効果的な用量を決定するために、ヒト臨床研究が当業者によって行われ得る。そのような臨床研究は、日常的であり、当該技術分野で周知である。用いられる正確な用量はまた、投与経路にもよる。効果的な用量は、インビトロまたはインビボ試験系から導かれる用量応答曲線から推定することができる。用量は、例えば、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、および他の臨床要因に基づいて調整され得る。

単一の用量で免疫を刺激するが、所望の効果を達成するために、追加の投与量が同じまたは異なる経路で投与され得る。例えば、新生児および乳児においては、十分なレベルの免疫を誘発するために、複数投与が必要とされ得る。投与は、感染に対する十分なレベルの保護を維持する上で必要であるため、投与は小児期を通して周期的に継続され得る。同様に、例えば、医療従事者、保育士、幼児の家族、高齢者、易感染心肺機能を有する個人など、反復性または重度の感染症に特にかかりやすい成人は、防御免疫応答を確立および／または維持するために、複数の免疫化を必要とし得る。誘導された免疫のレベルは、例えば、分泌および血清抗体の量を測定することにより監視され、投与量が調整されるか、必要に応じてワクチン接種を繰り返して所望の防御レベルを誘発および維持することができる。

ワクチン組成物は、受動的投与療法に有用な毒素に対して抗体を調製するためにも使用され得る。Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ．“Ｐａｓｓｉｖｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）ａｓ ａ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ａｇａｉｎｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｗｅａｐｏｎｓ，”Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２００２；８（８）：８３３－８４１を参照されたい。

実施例１
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ三種混合毒素ワクチン構築物
２つの三種混合毒素ワクチンを構築した。タンパク質構築物の図を図１に示す。三種混合毒素１４２０（ＢＶ１４２０とも称される）は、Ｎ末端からＣ末端に、活性化ドメインペプチド、成熟ＣＤＴｂペプチド、ＴｃｄＢ ＲＢＤペプチド、および１９の反復配列（Ｒ１９）を含有するＴｃｄＡ ＲＢＤペプチドを含有する。フーリン切断部位（ＲＡＲＲＲＫＫＲ；配列番号２７）は活性化ドメインと成熟ＣＤＴｂペプチドとの間に位置した。図２および３は、それぞれ、ＢＶ１４７０のタンパク質および遺伝子配列を示す。リンカーはＴｃｄＢペプチドのいずれかの端部に位置する。

実施例２
三種混合毒素ワクチンの発現
Ｓｆ９細胞を、単一の転写物として三種混合ワクチンを発現するバキュロウイルスベクターで形質転換した。Ｓｆ９細胞からの発現データを図２に示す。図２は、４８時間および７２時間で回収した各タンパク質の発現を示す。注目すべきことに、各タンパク質は２００ｋＤａを超えるが、高レベルの生成が達成される。図７は、４８時間～９６時間の発現の時間経過を示す。データは、両タンパク質について、タンパク質が非常に可溶性であることを示す。

実施例３
三種混合毒素ワクチンの精製
粒子を可溶化し精製するために、０．２％ ＮＰ９／２５ｍＭのＴｒｉｓ／５０ｍＭのＮａＣｌ／ｐＨ８．０の最終濃度までＴｅｒｇｉｔｏｌ（ＮＰ９）を細胞培養物に直接添加する。室温で１時間インキュベートし、その後可溶化液を２回９０００ｇで３０分間遠心分離する。ナノ粒子を含有する上清を収集する。次いで、上清を緩衝液Ａに添加し、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液Ｂ：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／１ＭのＮａＣｌ）に溶出する。溶出液をフェニルＨＰカラム（緩衝液Ａ：３５０ｍＭのクエン酸Ｎａ／２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、および緩衝液Ｂ：５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０）、次いでＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑカラム（緩衝液Ａ：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／２５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液Ｂ：２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／１ＭのＮａＣｌ）に適用する。生成物を含有するプールした画分を２ミクロンのフィルタに通す。図４～６を参照されたい。Ｓｆ９からの１４７０の精製により２６９ｍｇ／リットルのタンパク質を得た。Ｓｆ９細胞からの１４２０の精製により１６６ｍｇ／リットルを得た。

実施例４
三種混合毒素ワクチン粒子の分析
三種混合毒素ＢＶ１４２０の体積グラフによる粒径分布を、Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏを使用して動的光散乱により分析した。体積によるサイズ分布のグラフを図７に示す。平均直径は約３０ｎｍであった。図８は、三種混合毒素ＢＶ１４７０の強度グラフによる粒径分布を示す。平均直径は約１８ｎｍであった。

図９は、陰性染色した三種混合毒素ＢＶ１４２０の様々な電子顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡写真の精製された三種混合毒素ＢＶ１４２０を約１０ｕｇ／ｍｌに希釈し、酢酸ウラニルで陰性染色した。

実施例５
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ三種混合毒素ワクチン：致死毒素接種および動物の生存率
図１０は、毒素Ａおよび二成分毒素に対する三種混合毒素ワクチンのマウス試験の結果を提供する。群１～６は、示されるようにＢＶ１４２０抗原（３０μｇ）またはＰＢＳを投与された。群１および４は５０μｇの水酸化アルミニウムを含有する。群２および５は５０μｇの水酸化アルミニウムおよび５０μｇのＩＳＣＯＭマトリックスＭアジュバントを含有した。マウスを０日目および１４日目に免疫化し、０、１４、および３２日目に出血させた。３５日目にマウスに毒素Ａまたは二成分毒素を接種した。

図１１は血清ＩｇＧ応答を示す。ＰＢＳは予想どおり抗体を誘導しなかった。水酸化アルミニウムを含むか、またはＡｌｕｍ ＯＪおよびマトリックスＭの両方のいずれかを含む三種混合毒素ワクチンは、毒素Ａ、毒素Ｂ、およびＣＤＴｂに対して約１０^４～約１０^６の範囲の力価を誘導した。図１２は、抗体が毒素ＡおよびＣＴＤｂの両方を中和したことを確立する。図１３は、６つの群の動物の生存率を示す。群１、２、４、および５は、１００％の生存率を示した。二成分毒素接種の２匹のマウスを除き、対照ＰＢＳ群の動物は全て死亡した。これらのデータは、三種混合毒素ワクチンが毒素の作用から保護することを確立する。

第２の接種研究では、毒素Ｂに関していくつかの構築物を生成し、単独でまたは組み合わせで試験した。群１のマウスには、水酸化アルミニウムとともにＢＶ１４２０（３０μｇ）を投与した。群２のマウスには、水酸化アルミニウムとともにＢＶ１４７０（３０μｇ）を投与し、群３には、水酸化アルミニウムとともにロタウイルスＶＰ６およびＴｃｄＢ ＲＢＤ（１０μｇ）を含有するタンデムタンパク質を投与した。群４のマウスには、ＢＶ１４７０およびＶＰ６／ＴｃｄＢ ＲＢＤを投与した。群５には、トキソイドＢ（１０μｇ）を投与した。群６は対照であり、ＰＢＳを投与した。抗ＩｇＧ応答は図１５に示される。各場合において、高い力価の抗体が得られた。毒素Ａペプチドを含有する群の各々は、１０^４～約１０^５の範囲の高い力価の抗毒素Ａ応答を誘導した。全ての群に毒素Ｂペプチドを投与し、各々１０^４～約１０^６の範囲の高い力価を示した。二成分毒素ペプチドを含有する群の各々は、１０^５～約１０^６の範囲の高い力価の応答を誘導した。図１６は、毒素Ｂの両方を中和した抗体を生成し、トキソイドＢがより高いレベルを示すことを確立する。

群１～６のマウスの生存率を図１７に示す。ＰＢＳ対照群の全てのマウスは３日目までに死亡し、６匹中５匹が１日以内に死亡した。毒素Ｂの生存率は１００％であった。群１～４に関して、生存率は６７％～８３％の範囲であった。

実施例６
さらなる三種混合毒素ワクチン
高発現レベルを得ると同時に、さらなるワクチンを生成することができる。図１８および１９は、ＴｃｄＢ遺伝子の転座遺伝子を伴うさらなる三価のワクチンタンパク質を示す。ＢＶ１５１２は下の図に示される。図１８は、さらなるワクチンの構造を示す。多量体タンパク質配列： ＣＤＴｂタンパク質がＡ－Ｓリンカーによって転座ドメイン（ＴＤ）から分離され、ＴＤがＳ－ＲリンカーによってＴｃｄＡＲ１９タンパク質から分離されることを示すＢＶ１５１２多量体ワクチンタンパク質の配列。図１９は、Ｓｆ９細胞からの多量体タンパク質ＢＶ１５１２の発現を示す。

実施例７
四価のワクチン
４つのペプチドを含有する多量体タンパク質を生成した。図２０。この例では、第２のＴｃｄＢ菌株からのペプチドは、さらなるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株に対する免疫を広範化するために導入された。第１の四価の多量体タンパク質（ＣＢＡＢまたはｐＣＤＴｂ／ＴｃｄＢ_６３０／ＴｃｄＡＲ１９／ＴｃｄＢ_０２７）は、Ｃ末端に付加された菌株０２７からのＴｃｄＢペプチド含んだ（図２０、上の図を参照されたい）。第２の四価の多量体ペプリドでは、菌株０２７ペプチドからのＴｃｄＢペプチドは、第１の菌株である菌株６３０からのＴｃｄＢタンパク質とＴｃｄＡ（Ｒ１９）タンパク質との間に導入された（図２０、下の図を参照）。図２１は、上述のＳｆ９細胞からのＣＢＢＡの四価の多量体の発現を示す。データは、得られた収量が４２ｍｇ／Ｌであったことを示す。第２のタンパク質（図２６に示すように、ＣＢＢＡまたはｐＣＤＴｂ／ＴｃｄＢ_６３０／ＴｃｄＡＲ１９／ＴｃｄＢ_０２７）もＳｆ９系において生成され、４０ｍｇ／Ｌの収量を達成した。図２２を参照されたい。

実施例８
Ｔ毒素およびＱ毒素融合タンパク質の設計、発現および精製
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＴｃｄＡのＲＢＤ、ＴｃｄＢ_{（００３）}、ＴｃｄＢ_{（０２７）}、およびＣＤＴｂをコードするために、キメラ融合タンパク質を構築した。ＴｃｄＡのＲＢＤアミノ酸配列はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株ＶＰＩ １０４６３（ＡＴＣＣ ４３２５５）、ＮＣＢＩ Ｐ１６１５４（毒素型０、リボ型００３）に由来し、ＴｃｄＢ_{（００３）}は菌株ＶＰＩ １０４６３（ＡＴＣＣ ４３２５５）、ＮＣＢＩ Ｐ１８１７７（毒素型０、リボ型００３）に由来し、ＴｃｄＢ_{（０２７）}は菌株ＣＤ１９６、ＮＣＢＩ ＷＰ＿００９８８８４４２．１（毒素型ＩＩＩ、リボ型０２７）に由来し、ＣＤＴｂは菌株ＣＤ１９６、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＳ５７４７７．１（毒素型ＩＩＩ、リボ型０２７）に由来する。

ＴｃｄＡ ＲＢＤ（３８のうち１９の反復配列で切り詰められた）、ＴｃｄＢ_{（００３）}およびＴｃｄＢ_{（０２７）}ＲＢＤ（各々２４の反復配列）、ならびにＣＤＴｂのコード配列は、昆虫細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）における発現のためにコドン最適化された。

ＣＤＴｂ遺伝子断片（アミノ酸１～８３５）、ＴｃｄＡ ＲＢＤ（１３１４塩基対［ｂｐ］、６８１６～８１３０ｂｐ）、およびＴｃｄＢ_{（００３）}ＲＢＤ（１６０８ｂｐ、５４９３～７０９８ｂｐ）をコードするヌクレオチド配列は、合成遺伝子からのＰＣＲ増幅により得た。ＰＣＲ増幅した遺伝子断片を制限酵素で消化した：ＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩでＣＤＴｂ、ＮｈｅＩ／ＸｂａＩでＴｃｄＢ_{（００３）}ＲＢＤ、そしてＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでＴｃｄＡ ＲＢＤ。消化後、３つの遺伝子を、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩの部位にライゲートした。３つのＲＢＤをコードするプラスミドを使用して、三価の融合タンパク質（以後、Ｔ毒素と称する）を発現させるためにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞のＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した、組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）バキュロウイルスを構築した（図２３Ｂ）。

Ｓｐｅｌ／ＨｉｎＩＩＩで消化させたＴｃｄＢ_{（０２７）}ＲＢＤ（１６０８ｂｐ、５４９３－７０９８）を三価の融合遺伝子のＣ末端に融合して、プラスミド、および４つ全てのＲＢＤの毒素をコードするバキュロウイルス構築物を形成し、これを、同様にＳｆ９細胞に発現させて、四価の融合タンパク質（以後、Ｑ毒素と称する）を生成した（図２３Ｂ；配列番号２１）。

したがって、構築物は、ｐＣＤＴｂ：１～８３５からの８３５個のアミノ酸；菌株：ＣＤ１９６；毒素型：ＩＩＩ、リボ型：０２７；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＳ５７４７７．１；ＴｃｄＢ_００３：８３８～１３７３からの５３６個のアミノ酸；ＮＣＢＩ：Ｐ１８１７７、菌株＝ＡＴＣＣ４３２５／ＶＰＩ １０４６３、毒素型０、リボ型：０８７；ＴｃｄＡ：１３７６～１８１３からの４３８個のアミノ酸；ＮＣＢＩ：Ｐ１６１５４、菌株＝ＡＴＣＣ４３２５／ＶＰＩ １０４６３、毒素型０；リボ型：０８７、およびＴｃｄＢ_０２７：１８１５～２３５１からの５３６個のアミノ酸；ＮＣＢＩ：０１３３１５、菌株ＣＤ１９６；毒素型：ＩＩＩ、イボ型：０２７を含有する。部分の各々は、２つのアミノ酸リンカー：ｐＣＤＴｂ部分とＴｃｄＢ００３部分との間のＡＳ、ＴｃｄＢ００３部分とＴｃｄＡ部分との間のＳＲ、ＴｃｄＡ部分とＴｃｄＢ０２７部分との間のＴＳによって分離されている。

融合タンパク質を、２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中の０．２％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ－９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、および２μｇ／ｍＬのロイペプチンを含む緩衝液に洗剤溶解により抽出した。遠心分離により可溶化液を精製し、融合タンパク質を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、フェニルＨＰ、および３０Ｑカラムクロマトグラフィーで精製した。精製されたＴ毒素およびＱ毒素を、およそ４．０ｍｇ／ｍＬで２５ｍＭのＴｒｉｓおよび２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に製剤化し、＜－６０℃で保存した。精製されたＴ毒素およびＱ毒素の回収は、それぞれ、２６７および１５４ｍｇ／Ｌであった。Ｔ毒素およびＱ毒素は、それぞれ、２０５ｋＤａおよび２６８ｋＤａの分子量でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに移動し、＞９０％の純度であった（図２３Ａ）。毒素特異的抗体によるウエスタンブロット分析により、各融合タンパク質のＣＤＴｂ、ＴｃｄＢ、およびＴｃｄＡの発現が確認された（図２３Ｂ～Ｄ）。

実施例９
マウスにおけるＴ毒素およびＱ毒素融合タンパク質の免疫原性
Ｔ毒素およびＱ毒素融合タンパク質の免疫原性を評価するために、Ｎｏｂｌｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ’ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコルに従い、マウス研究を行った。０および１４日目に、５０μｇの水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）を用いて製剤化されたＴ毒素（３０または１００μｇ）もしくはＱ毒素（１００μｇ）、またはＰＢＳ（対照）で、雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）をＩＭ免疫化した。２回目の投与の１８日後に血清を収集した。２回目の免疫化３週間後に、マウスに１００％の最小致死用量（ＭＬＤ_１００％）のＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ_{（００３）}、またはＣＤＴａ、およびＣＤＴｂを腹腔内（ＩＰ）接種した。

ＥＬＩＳＡにより、毒素に対する抗体についてマウスの血清を評価した。９６ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、各毒素（２μｇ／ｍＬ）で一晩、２～８℃でコーティングした。血清の５倍系列希釈液を２つ組でプレートに添加した。結合した抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出した。３，３′，５，５′テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｉｇｍａ）を添加し、ＴＭＢ停止緩衝液（Ｓｃｙｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍでプレートを読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して結果を分析した。力価は、最大ＯＤ_{４５０ｎｍ}の５０％の読み取りをもたらした逆数希釈として報告された。検出の下限（ＬＬＯＤ）を下回ると記録された力価値は、ＧＭＴを計算するために力価５０が割り当てられた。免疫化後のマウス血清ＩｇＧ力価は、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、およびＣＤＴに関して高く、Ｔ毒素とＱ毒素との間で比較可能であった（図２５Ａ）。

Ｖｅｒｏ細胞（ＣＣＬ－８１、ＡＴＣＣ）を、２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質（Ｇｉｂｃｏ）で補足されたＤＭＥＭ中で維持した。マウス血清の２倍系列希釈を、９６ウェルの平底組織培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において調製した。２×最小細胞傷害性用量のＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、またはＣＤＴを含有する、等体積（５０μＬ）のアッセイ培地（５％熱不活性化ＦＢＳを含む１×ＤＭＥＭ、１×ＮＥＡＡ、０．３％デキストロース、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、０．００６％フェノールレッド）を希釈した血清に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。５０μＬの培地および１５０μＬの減菌鉱油（Ｓｉｇｍａ）に懸濁したＶｅｒｏ細胞（７．５×１０^４細胞／ｍＬ）を添加し、プレートを３７℃で６～７日間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルの色に関してプレートを観察した。培地および毒素処理された対照ウェルは赤／赤色を帯びたピンクであり、細胞対照ウェルは黄色／黄色を帯びた橙色であった。各試料希釈に関して、黄色／黄色を帯びた橙色であった最後のウェルは、エンドポイント中和抗体力価として記録された。＜ＬＬＯＤと記録された力価値はＧＭＴを計算するために値５が割り当てられた。３つの毒素の各々に対する毒素中和抗体（ＴＮＡ）力価は、Ｔ毒素とＱ毒素融合タンパク質との間で比較可能であった（図２５Ｂ）。

２回目の免疫化の３週間後に、マウスにＴｃｄＢ_{（００３）}を接種した。Ｑ毒素でワクチン接種された群は、８０％の生存率を有し（ｐ＝０．００４３）、一方、Ｔ毒素群の６５％（ｐ＝０．０１８）が接種を生き延びた。対照的に、対照群においては、２０％のみが毒素接種を生き延びた（図２５Ｃ）。

実施例１０
ハムスターにおけるＴ毒素およびＱ毒素融合タンパク質の免疫原性
７０～１００グラムの雄の５～７週齢のゴールデンシリアンハムスター（ＨｓｄＨａｎ：Ａｕｒａ；Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、３週間間隔で、３０μｇのＱ毒素および１２０μｇのアルミニウム、またはＰＢＳ（対照）で、３回の免疫化を受け、交互に大腿にＩＭ投与された。３回目の免疫化の２週間後に血清を収集し、動物を１０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシンでＩＰ処置した。１日後、動物に強制飼養により菌株６３０またはＮＡＰ１を接種させ、８日間観察した。

ＥＬＩＳＡにより、毒素に対する抗体についてハムスターの血清を評価した。９６ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、各毒素（２μｇ／ｍＬ）で一晩、２～８℃でコーティングした。血清の５倍系列希釈液を２つ組でプレートに添加した。結合した抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートされたウサギ抗ハムスターＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出した。３，３′，５，５′テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｉｇｍａ）を添加し、ＴＭＢ停止緩衝液（Ｓｃｙｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍでプレートを読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して結果を分析した。力価は、最大ＯＤ_{４５０ｎｍ}の５０％の読み取りをもたらした逆数希釈として報告された。検出の下限（ＬＬＯＤ）を下回ると記録された力価値は、ＧＭＴを計算するために力価５０が割り当てられた。３週間間隔で、Ｑ毒素で３回免疫化されたハムスターは、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、およびＣＤＴｂ毒素に対して高いＩｇＧ力価をもたらした（図２６Ａ）。

Ｖｅｒｏ細胞（ＣＣＬ－８１、ＡＴＣＣ）を、２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質（Ｇｉｂｃｏ）で補足されたＤＭＥＭ中で維持した。ハムスター血清の２倍系列希釈を、９６ウェルの平底組織培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において調製した。２×最小細胞傷害性用量のＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、またはＣＤＴを含有する、等体積（５０μＬ）のアッセイ培地（５％熱不活性化ＦＢＳを含む１×ＤＭＥＭ、１×ＮＥＡＡ、０．３％デキストロース、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、０．００６％フェノールレッド）を希釈した血清に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。５０μＬの培地および１５０μＬの減菌鉱油（Ｓｉｇｍａ）に懸濁したＶｅｒｏ細胞（７．５×１０^４細胞／ｍＬ）を添加し、プレートを３７℃で６～７日間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルの色に関してプレートを観察した。培地および毒素処理された対照ウェルは赤／赤色を帯びたピンクであり、細胞対照ウェルは黄色／黄色を帯びた橙色であった。各試料希釈に関して、黄色／黄色を帯びた橙色であった最後のウェルは、エンドポイント中和抗体力価として記録された。＜ＬＬＯＤと記録された力価値はＧＭＴを計算するために値５が割り当てられた。３つの毒素の各々に対するＴＮＡ力価は、Ｔ毒素とＱ毒素融合タンパク質との間で比較可能であった（図３１Ｂ）。

クリンダマイシン処置後、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０を感染させた動物は９０％の生存率を有し（図２６Ｃ）、一方、ＮＡＰ１を感染させた動物は７５％の生存率を有した（図３１Ｄ）。プラセボ群の全ての動物はいずれかの菌株を感染させた後４８～７２時間以内に死亡した。

参照による組み込み
本明細書に特定される特許および公開出願の各々は、全ての目的のために本明細書に組み込まれる。

Claims (19)

1. 多価の免疫原性ポリペプチドであって、少なくとも４つのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素タンパク質の部分を含み、
   前記部分が、
   （ｉ）二成分毒素（ＣＤＴ）部分であって、二成分毒素の受容体結合構成要素を含む部分、
   （ｉｉ）毒素Ａ（ＴｃｄＡ）タンパク質の受容体結合ドメインを含む毒素Ａ部分、
   （ｉｉｉ）第１の毒素Ｂ部分であって、第１の毒素Ｂタンパク質の受容体結合ドメインを含む部分、及び
   （ｉｖ）第２の毒素Ｂ部分であって、第２の毒素Ｂタンパク質の受容体結合ドメインを含む部分、
   であり、前記毒素Ｂタンパク質が異なるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）菌株からのものである、多価の免疫原性ポリペプチド。
2. 少なくとも１つの毒素Ｂ部分が流行性菌株からのものである、請求項１に記載の多価の免疫原性ポリペプチド。
3. 前記毒素Ｂ部分のうちの１つが６３０菌株（ＴｃｄＢ_{（００３）}）からのものである、請求項１に記載の多価の免疫原性ポリペプチド。
4. 前記少なくとも４つのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素タンパク質の部分が、第１及び第２の毒素Ｂ部分間の前記毒素Ａ部分とともに配向されている、または、前記ＣＤＴ部分が、前記毒素Ｂ部分のうちの一方または両方のＮ末端である、請求項１に記載の多価の免疫原性ポリペプチド。
5. （ａ）前記ＣＤＴ部分が、配列番号２２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、または、
   （ｂ）前記毒素Ｂ部分のうちの１つが、配列番号２３もしくは配列番号２５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、または
   （ｃ）前記毒素Ａ部分が、配列番号２４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、
   請求項１に記載の多価の免疫原性ポリペプチド。
6. 前記少なくとも４つのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素タンパク質の部分が、２アミノ酸リンカー、３アミノ酸リンカー、または４アミノ酸リンカーにより分離されている、請求項１に記載の多価の免疫原性ポリペプチド。
7. 前記多価の免疫原性ポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の多価の免疫原性ポリペプチド。
8. 請求項１～７のいずれかに記載の多価の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
9. 請求項１に記載の多価の免疫原性ポリペプチドの調製方法であって、
   （ａ）昆虫宿主細胞において前記多価の免疫原性ポリペプチドを発現させることと、
   （ｂ）非イオン性洗剤の存在下で前記多価の免疫原性ポリペプチドを精製することと、
   （ｃ）薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤に前記多価の免疫原性ポリペプチドを懸濁することと、を含む、方法。
10. 前記昆虫宿主細胞が、前記多価の免疫原性ポリペプチドの発現に好適な条件下で、組換えバキュロウイルス構築物でトランスフェクトされる、請求項９に記載の方法。
11. 請求項１～７のいずれかに記載の多価の免疫原性ポリペプチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と、を含む、ワクチン組成物。
12. 前記組成物がアジュバントを含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
13. 前記アジュバントがサポニン系アジュバントであり、
    前記サポニン系アジュバントが、画分Ａマトリックスおよび画分Ｃマトリックスを含有する、請求項１２に記載のワクチン組成物。
14. 前記アジュバントが前記アジュバントの重量あたり８５％～９２％の画分Ａマトリックスを含み、前記アジュバントの残りが画分Ｃマトリックスを含む、請求項１３に記載のワクチン組成物。
15. クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の予防または治療のための薬剤の製造のための、請求項１～７のいずれかに記載の多価の免疫原性ポリペプチド、または請求項８に記載の核酸の使用。
16. 請求項１～７のいずれかに記載の多価の免疫原性ポリペプチドと、非イオン性洗剤と、を含む、ナノ粒子。
17. 前記昆虫宿主細胞がＳｆ９細胞である、請求項９に記載の方法。
18. 前記リンカーが、アラニン－セリン（ＡＳ）、ロイシン－グルタミン酸（ＬＥ）、およびセリン－アルギニン（ＳＲ）からなる群から選択される、請求項６に記載の多価の免疫原性ポリペプチド。
19. 前記流行性菌株がＮＡＰ１菌株（ＴｃｄＢ_{（０２７）}）である、請求項２に記載の多価の免疫原性ポリペプチド。

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