CN110691609B - 用于诱导针对艰难梭菌的免疫应答的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于治疗或预防细菌感染的方法和组合物。具体地，所述方法和组合物涉及艰难梭菌感染。在特定方面，所述组合物是含有多聚多肽的疫苗，所述多聚多肽含有来自细菌的多种毒素的部分。所述多肽诱导有效的免疫应答，从而治疗或预防感染。

Description

用于诱导针对艰难梭菌的免疫应答的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年3月15日提交的美国临时申请第62/471,636号和于2017年3月21日提交的美国临时申请第62/474,434号的优先权，所述美国临时申请的公开内容出于所有目的各自并入本文中。

对以电子方式提交的文本文件的说明

与本申请一起以电子方式提交的文本文件的内容以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读格式副本(文件名：NOVV_058_02WO_SeqList_ST25，记录日期：2018年3月13日，文件大小：187千字节)。

背景技术

使用基于亚单位的疫苗接种针对疾病的疫苗取决于产生足够量的蛋白抗原以及维持抗原的稳定性，使得蛋白质在向目标群体施用时仍然有效。

生产亚单位疫苗中的难题会在生产过程中的多个步骤中出现。靶蛋白可以以低水平产生或者可以是不可溶的，从而导致经济上不利的生产，即使当蛋白质具有特别有利的免疫原性特征时。

细菌感染仍然是健康问题。实际上，随着细菌对一线抗生素进化出抗性，细菌疫苗越来越受到追捧。细菌亚单位疫苗依赖于重组型蛋白产生。然而，由于低表达和不溶性，细菌蛋白通常可能难以以高水平产生，并且其也可能遭受稳定性降低的情况。因此，生产疫苗(特别是困难抗原标靶)的更好方法将提供全球健康益处。具体地，梭菌细菌(尤其是艰难梭菌(C.difficile))感染仍然是一个特殊问题。艰难梭菌感染(CDI)是发达国家医院抗生素相关性腹泻的主要原因。高毒力菌株的进化带来了使死亡率增加的严重疾病。同源葡糖基化毒素(即TcdA和TcdB)和二元ADP-核糖基化毒素(CDT)是引起发病机理的主要毒力因子。存在对靶向这些毒素的疫苗的未满足的需要。

发明内容

本文公开了诱导针对艰难梭菌的免疫应答的方法和组合物。所述组合物含有多肽，所述多肽含有多种艰难梭菌毒素，在向受试者施用时，所述多种艰难梭菌毒素诱导有利的免疫应答。还公开了用于产生多毒素多肽的方法。

附图说明

图1.艰难梭菌三重毒素疫苗构建体.附图示出了在活化CDTb结构域后含有具有(构建体1420)和不具有(构建体1470)弗林蛋白酶切割位点的CDTb、Tcd B和Tcd A的结合结构域的艰难梭菌三重毒素疫苗的图示。

图2.三重毒素疫苗BV1470和BV1420的表达和溶解度.用重组型杆状病毒BV1420和BV1470以0.1的MOI感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9昆虫细胞、在感染后48小时和72小时时采集所述昆虫细胞并且通过SDS-PAGE和考马斯染色来分析所述昆虫细胞的蛋白质表达。将等体积的总蛋白质(T，细胞和培养基)和澄清的培养基(M)与2X SDS-PAGE样品缓冲液进行混合，并且在4％-12％的聚丙烯酰胺NuPage凝胶上进行运行。将沉淀的感染细胞溶解于1％NP9、25mM Tris、50mM NaCL、pH 8.0缓冲液中。将裂解后的细胞以9000x g离心40分钟。除去上清液(S，可溶)，将团粒(I，不溶)悬浮于缓冲液中至原始体积并且如上文所描述的通过SDS-PAGE进行分析。用箭头标记三重毒素蛋白的位置。

图3.三重毒素疫苗BV1470和BV1420的时程表达.如图6中所描述的，用重组型杆状病毒BV1420和BV1470感染草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞。在感染后的各个时间点处通过SDS-PAGE和考马斯染色分析总蛋白质、培养基、可溶和不可溶蛋白质。用箭头标记三重毒素蛋白的位置。

图4.三重毒素疫苗的纯化.在加入NP9到0.2％的最终浓度后，从经过感染的Sf9细胞的总细胞培养物中纯化三重毒素疫苗。将NP9提取物澄清两次，并且在连续的FractogelEMD TMAE、Phenyl HP和Source 30Q柱上进行纯化。如所示出的，从每个柱中洗脱三重毒素并且将其加载到下一个柱上。合并来自Source 30Q柱的经过洗脱的三重毒素阳性级分并且通过0.2μM过滤器进行过滤灭菌。

图5.从Sf9细胞中纯化三重毒素疫苗BV1470.如在图8中所描述的，从感染后的细胞中纯化三重毒素疫苗BV1470。通过SDS-PAGE和考马斯染色来分析来自Source 30Q柱的最终过滤产物的纯度。使用抗CDTb抗体、抗TcdB抗体和抗TcdA抗体通过蛋白质印迹来鉴定三重毒素蛋白。

图6.从Sf9细胞中纯化三重毒素疫苗BV1420.如在图8中所描述的，从感染后的细胞中纯化三重毒素疫苗BV1420。通过SDS-PAGE和考马斯染色来分析来自Source 30Q柱的最终过滤产物的纯度。使用抗TcdB抗体通过蛋白质印迹来鉴定三重毒素蛋白。

图7.三重毒素BV1420的粒径分布对体积曲线图.使用Zeta Sizer Nano通过动态光散射来测定三重毒素BV1420的粒径。示出了大小分布对体积曲线图。

图8.三重毒素BV1470的粒径分布对强度曲线图.使用Zeta Sizer Nano通过动态光散射来测定三重毒素BV1420的粒径。示出了大小分布对强度曲线图。

图9A-图9D.负染色三重毒素BV1420的电子显微照片.将经过纯化的三重毒素BV1420的电子显微照片稀释到大约10μg/ml并且用乙酸铀酰进行负染色。

图10.BV1420三重毒素疫苗小鼠致死毒素攻击研究1.在第0天和第14天用三重毒素疫苗BV1420对小鼠进行免疫，并且在第35天用致死剂量的Tcd A或CDT攻击小鼠且在攻击后监测10天。如所示出的对小鼠进行放血，并且对小鼠的抗毒素IgG和毒素中和抗体进行血清分析。在毒素攻击后监测动物的死亡率和发病率，持续10天。

图11.BV1420三重毒素疫苗小鼠致死毒素攻击研究1—血清抗毒素IgG应答.使用与板结合的天然毒素，通过ELISA测定第42天血清样品的抗Tcd A滴度、抗Tcd B滴度和抗CDT IgG滴度。

图12.BV1420三重毒素疫苗小鼠致死毒素攻击研究1—毒素中和抗体(TNA)滴度.使用基于比色Vero细胞的测定法来测定毒素中和滴度。所指示的滴度是未杀死细胞的血清的最高稀释度的倒数。

图13.BV1420三重毒素疫苗小鼠致死毒素攻击研究1—动物存活率.在攻击后10天测定动物存活率。将显示体重减轻超过20％的动物处死并且记录为死亡。

图14.BV1420三重毒素疫苗小鼠致死毒素攻击研究2—毒素B存活率.在第0天和第14天用三重毒素疫苗BV1420对小鼠进行免疫，并且在第35天用致死剂量的Tcd B攻击小鼠且在攻击后监测10天。如所示出的对小鼠进行放血，并且对小鼠的抗毒素IgG和毒素中和抗体(TNA)进行血清分析。在毒素攻击后监测动物的死亡率和发病率，持续10天。

图15.BV1420三重毒素疫苗小鼠致死毒素攻击研究2—抗毒素IgG水平.使用与板结合的天然毒素，通过ELISA测定第42天血清样品的抗Tcd A滴度、抗Tcd B滴度和抗CDTIgG滴度。

图16.BV1420三重毒素疫苗小鼠致死毒素攻击研究2—毒素B TNA滴度.使用基于比色Vero细胞的测定法来测定毒素中和滴度。所指示的滴度是未杀死细胞的血清的最高稀释度的倒数。

图17.BV1420三重毒素疫苗小鼠致死毒素攻击研究2—毒素B存活率.在攻击后10天测定动物存活率。将显示体重减轻超过20％的动物处死并且记录为死亡。

图18.示出了具有TcdB基因易位结构域的另外的疫苗蛋白。在底部图中示出了BV1512。

图19.多聚体蛋白表达：多聚体蛋白BV1512的表达和蛋白质印迹分析。

图20.四价多聚体蛋白表达：图25展示了两种四价多聚体蛋白。在两种情况下，引入来自第二TcdB菌株的肽以增强针对多种菌株的免疫力。在上图中，来自菌株027的TcdB肽添加在C端处。在下图中，肽被引入在TcdB蛋白与来自第一菌株—菌株630的TcdA(R19)蛋白之间。

图21.四价多聚体蛋白表达：图20的上图中示出了四价蛋白的表达和蛋白质印迹分析。

图22.四价多聚体蛋白表达：图20的下图中示出了四价蛋白的表达和蛋白质印迹分析。

图23.艰难梭菌毒素以及嵌合三价(T)和四价(Q)毒素融合蛋白的设计.图23A示出了用于构建嵌合三价和四价毒素融合蛋白的艰难梭菌毒素A(TcdA)、毒素B(TcdB)和二元毒素(CDT)的功能性结构域的图示。TcdA和TcdB共享共同的功能性结构域，包含酶促葡糖基转移酶(GT)结构域、自催化半胱氨酸蛋白酶(CP)结构域、成孔易位(PT)结构域(橙色)和受体结合结构域(RBD)。二元毒素(CDT)由酶促ADP-核糖基转移酶组分(CDTa)和受体结合组分(CDTb)组成。CDTb含有42个具有两个丝氨酸型蛋白水解切割位点(箭头)的氨基酸(aa)信号序列，当切割时，所述信号序列会产生20kDa和75kDa的片段。图24B示出了嵌合三价毒素融合蛋白(T毒素)和嵌合四价毒素融合蛋白(Q毒素)的图示。T毒素融合蛋白由CDTb的全长编码序列组成，其中TcdB₍₀₀₃₎的RBD含有24个重复序列并且TcdA的截短RBD具有19个重复序列。经过表达的T毒素融合蛋白由分子量(MW)为205kDa的1813个aa组成。Q毒素融合蛋白由CDTb的全长编码序列组成，TcdB₍₀₀₃₎的RBD含有24个重复序列，TcdA的RBD以19个重复序列截短并且TcdB₍₀₂₇₎的RBD含有24个重复序列。经过表达的Q毒素融合蛋白由分子量为268kDa的2359个aa组成。

图24A-24C.T毒素融合蛋白和Q毒素融合蛋白的表达和纯化.经过纯化的T毒素(泳道2和3)的SDS-PAGE以205kDa的分子量迁移并且Q毒素(泳道4和5)以268kDa的分子量迁移。分子量标记物(泳道1)。图24A示出了如通过SDS-PAGE扫描显像测密术测定的T毒素和Q毒素纯度>90％。图24B示出了用兔抗CDTb特异性抗体探测的蛋白质印迹分析。图24C示出了用鸡抗TcdB特异性抗体探测的蛋白质印迹分析。图24D示出了用鸡抗TcdA特异性抗体探测的蛋白质印迹分析。

图25A-25C.T毒素融合蛋白和Q毒素融合蛋白在小鼠体内的免疫原性.在第0天和第14天，用辅佐以alum(50μg)或PBS(对照组)的T毒素(100μg)或Q毒素(100μg)对雌性C57BL/6小鼠组(N＝10个/组)进行IM免疫。在第二次疫苗接种后18天收集血清。图25A示出了通过ELISA测定的TcdA、TcdB₍₀₀₃₎和CDTb的血清IgG滴度。图25B示出了在Vero细胞测定中测定的每种毒素的毒素中和抗体滴度。在图25C中，小鼠在第二次免疫后21天接受IP施用致死剂量(MLD_100％＝2.0μg)的TcdB₍₀₀₃₎。^*通过将T毒素组或Q毒素组与PBS对照组进行比较，通过Mantel-Cox对数秩测试测定显著性。

图26A-26D.T毒素融合蛋白和Q毒素融合蛋白在仓鼠体内的免疫原性.用辅佐以120μg alum或PBS(对照组)的30μg的Q毒素以21天的间隔对雄性仓鼠(N＝8个/组)进行IM免疫3次。在第三次给药后两周，对样品进行收集和分析。图26A示出了通过ELISA测定的TcdA、TcdB₍₀₀₃₎和CDTb的血清IgG滴度。图26B示出了在Vero细胞测定中测定的每种毒素的毒素中和抗体滴度。在图26C和26D中，在第三次免疫后两周，在孢子攻击前一天用克林霉素(10mg/kg)IP处理所有动物，并且通过强饲法用200cfu的艰难梭菌菌株630(C)或用500cfu的艰难梭菌菌株B1/NAP1/027(D)攻击所有动物。攻击后观察动物8天。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“佐剂”是指当与免疫原组合使用时增强或以其它方式改变或修改针对免疫原诱导的免疫应答的化合物。修改免疫应答可以包含强化或扩大抗体和细胞免疫应答中的任一者或两者的特异性。

如本文所用，术语“免疫原”、“抗原”和“表位”可互换使用，并且指能够引发免疫应答的如蛋白质和肽等物质。

如本文所用，术语“融合蛋白”意指包含两个或更多个蛋白质或蛋白片段的蛋白质，所述两个或更多个蛋白质或蛋白片段在一个蛋白质的氨基端和另一个蛋白质的羧基端处经由连接肽直接或间接连接或融合以形成单个连续多肽。在一些方面，融合蛋白可以被称为“多价蛋白”。多价蛋白含有来自融合在一起的两种或三种以上离散蛋白抗原的蛋白质或蛋白片段。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指用于获得有益或期望结果(例如，临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或期望的结果可以包含：抑制或遏制感染或疾病的发生或进展；改善或减少感染或疾病症状的发展；或其组合。

如本文所用，“预防(pevention)”可与“预防(prophylaxis)”互换使用，并且可以意指完全预防感染或疾病或预防所述感染或疾病症状的发展；延迟感染或疾病或其症状的发作；或者降低随后发展的感染或疾病或其症状的严重程度。

如本文所用，“有效剂量”或“有效量”是指足以诱导减少至少一种疟疾症状的免疫应答的免疫原的量。有效剂量或有效量可以例如通过测量中和分泌和/或血清抗体的量来确定，例如通过噬菌斑中和、补体结合、酶联免疫吸附(ELISA)或微量中和测定。

如本文所用，术语“疫苗”是指包含源自于病原体的免疫原(例如，本文所描述的融合蛋白)的制剂，所述制剂用于诱导针对提供保护性免疫(例如，保护受试者免受病原体感染和/或降低由病原体感染引起的疾病或病状的严重程度的免疫)的病原体的免疫应答。保护性免疫应答可以包含形成抗体和/或细胞介导的应答。取决于上下文，术语“疫苗”还可以指施用于脊椎动物以产生保护性免疫的免疫原的悬浮液或溶液。

如本文所用，术语“受试者”包含人类和其它动物。在一个实施例中，受试者为人类。

如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其它普遍认可的药典中列出的可用于哺乳动物，并且更具体地可用于人类。这些组合物可以用作用于在脊椎动物中诱导保护性免疫应答的疫苗组合物和/或抗原组合物。

如本文所用，术语“约”意指所示数值加减10％。

概述

本公开提供了用于从昆虫细胞中实现大蛋白，具体地含有多种抗原的多价蛋白的高表达的方法和组合物。鉴于本领域的先前经验，特别出乎意料地产生了如本文所公开的高水平蛋白。

多价蛋白

本文所公开的多价(多价蛋白质在本文中也可以称为多聚体)蛋白可以保护免受多种病原体和/或来自相同生物体的多种致病性蛋白的效应的影响。例如，某些病原体可能会产生多个分子，每个分子都会对受试者产生不利影响。通过诱导针对多种单独抗原的应答来产生更为有效的应答。

蛋白质多价蛋白含有来自多种细菌毒素的蛋白质部分。在一些方面，多价蛋白包括来自相同生物体(例如，如毒素)的蛋白质的部分或由所述部分组成。在其它方面，多价蛋白包括来自多于一种生物体的蛋白质或由所述蛋白质组成。在特定方面，没有多价蛋白的两种蛋白质来自相同的生物体。在一些方面，来自不同菌株的相同蛋白质(即，同源物)可以用于产生所述部分。使用来自不同菌株的相同蛋白质允许保护免受多种菌株的影响，并且在新出现毒性菌株的情况下尤其有用。其它实例包含肉毒杆菌，其具有A到H的8种血清学类型。本文所公开的方法和组合物可以用于提供针对所有8种血清型的单一疫苗。其它特定实例包含组合毒素疫苗以预防霍乱、白喉和志贺氏菌、或破伤风、百日咳和白喉。因此，在一些方面，多聚体蛋白可以含有来自2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同蛋白质的部分。这些部分可以用作产生多聚体免疫原性多肽的组分。

下表描述了用于产生疫苗的示例性多聚体和组分。对Q-毒素和BV1512进行编码的核酸序列以及BV1420和BV1470的替代性核酸序列是使用对所示氨基酸进行编码的标准密码子转换适当简并密码子的那些核酸序列。

另外的疫苗构建体可以以不同定向使用上述各种组分。另外，与所公开的这些序列中的每个序列具有至少90％同一性的蛋白质可以用作产生多聚体蛋白的组分。

连接子

在一些方面，可以在多价蛋白中的一种或多种蛋白质之间使用连接子。在一些方面，连接子是聚(Gly)n连接子，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19或20。在其它方面，连接子为GG、GGG或GGGG(SEQ ID NO:26)。在又其它方面，连接子选自由以下组成的组：二肽、三肽和四肽。优选的二肽是丙氨酸-丝氨酸(AS)、亮氨酸-谷氨酸(LE)、丝氨酸-精氨酸(SR)。

多价抗原特别适用于防止将多种毒素释放到受试者体内的生物体。例如，已知细菌会产生导致人类疾病的毒素。因此，虽然本公开的主要焦点是艰难梭菌；但是可以使用来自其它物种的蛋白毒素的部分来制备本公开的多聚体多肽。

产生毒素的物种包含产气荚膜梭菌、肉毒杆菌、艰难梭菌以及破伤风梭菌、芽孢杆菌(例如，炭疽芽孢杆菌)、弧菌(例如，霍乱弧菌)、志贺氏菌和棒状杆菌。艰难梭菌释放两种肠毒素A和B，所述肠毒素由产毒菌株产生。毒素A是具有最小细胞毒性活性的肠毒素，而毒素B是强效细胞毒素但却具有有限的肠毒性活性。也称为CDT的第三毒素(即二元毒素)也由细菌产生。对毒素A和B进行编码的序列是已知的(Moncrief等人,《感染免疫学(Infect.Immun.)》65:1105-1108(1997)；Barroso等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》18:4004(1990)；Dove等人,《感染免疫学》58:480-488(1990))。对二元毒素进行编码的序列也是已知的(登录号ABS57477、AAB67305、AAF81761)。

通过针对艰难梭菌的三价蛋白疫苗说明了本公开的用于防止病原体感染的有用性。图1示出了两种示例性多聚体蛋白(BV1420和BV1470)的结构。每个多聚体含有来自艰难梭菌的三种毒素蛋白(即毒素A(TcdA)、毒素B(TcdB)和二元毒素(CDTb))的部分。三重毒素1420还含有弗林蛋白酶切割位点。这些蛋白质很大—超过1800个氨基酸—并且先前将不期望在昆虫细胞中表达时产生可用量的蛋白质。然而，令人惊讶的是，两种蛋白质都以高水平表达。参见图3。实际上，如图5所示，BV1470的产率为269mg/L。类似地，BV1420的产率为166mg/L。

对经过纯化的多聚体蛋白的分析证实了其呈纳米颗粒结构，其中BV1420的峰值直径为约16nm，并且BV1470的峰值直径为约18nm。值得注意的是，图7和8中所示出的直径分布说明高百分比的多聚体蛋白在纯化后保留了纳米颗粒结构。

向小鼠施用BV1420三价纳米颗粒表明获得了对所有三种蛋白质的免疫应答。此外，如图13所展示的，所获得的免疫应答保护100％的小鼠免受毒素A和二元毒素的致命攻击，并且保护67％到83％的小鼠响应于毒素B的致命攻击。相比之下，除二元毒素对照组中的两只小鼠外，PBS对照组中的小鼠全部死亡。

四价毒素也是多聚体免疫原性肽的优选类型。图20示出了两个说明性实例，其中四个部分或组分按顺序布置。尽管多聚体的长度很长，但是获得了良好的蛋白质产量。图22.

图23展示了通过添加来自第二TcdB类型的毒素部分将三重毒素融合蛋白转化为四价毒素。比较这两种蛋白质表明昆虫细胞表达能够产生高水平的产量。参见图24A-24D。

因此，示例性多聚体包含以各种定向组织的部分。例如，从N端开始，第一部分可以为TcdA部分、TcdB部分或CDTb部分。第二部分可以为TcdA部分、TcdB部分或CDTb部分。第三部分可以为TcdA部分、TcdB部分或CDTb部分。如果存在，第四部分可以为TcdA部分、TcdB部分或CDTb部分。因此，每个部分可以占据每个位置。通常，尽管并非总是如此，但是两个相邻部分不是来自相同类型毒素的部分。在优选的实施例中，N端部分是CDTb部分。

分子生物学技术

通过分子生物学方法来制备本文所公开的多价蛋白。描述适用于本发明的分子生物学技术(如克隆、突变、细胞培养等)的一般文本包含Berger和Kimmel,《分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)》、《酶学方法(Methods in Enzymology)》,第152卷,学术出版社(Academic Press,Inc.),加利福尼亚州圣地亚哥(Berger)；Sambrook等人,《分子克隆—实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)》(第3版),第1-3卷,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory),纽约冷泉港,2000(“Sambrook”)和《当今分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)》,F.M.Ausubel等人编著,《当今方案(Current Protocols)》,格林出版协会公司(GreenePublishing Associates,Inc.)与约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)合资企业(“Ausubel”)。这些文本描述了诱变、载体的用途、启动子和与例如克隆和突变PfCSP等有关的许多其它相关主题。因此，本发明还涵盖使用蛋白质工程和重组型DNA技术的已知方法来改进或改变在本发明的融合蛋白上或中表达的蛋白质的特性。各种类型的诱变可以用于产生和/或分离对蛋白质分子进行编码的变体核酸和/或进一步修饰/突变本发明的融合蛋白中或上的蛋白质。所述诱变包含但不限于定点诱变、随机点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向的诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用缺口双链体DNA的诱变等。另外合适的方法包含点错配修复、使用修复缺陷型宿主菌株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成进行的诱变、双链断裂修复等。例如涉及嵌合构建体的诱变也包含在本发明中。在一个实施例中，诱变可以通过天然存在的分子或经过改变或经过突变的天然存在的分子的已知信息(例如，序列、序列比较、物理性质、晶体结构等)来指导。

克隆蛋白质的方法是本领域已知的。可以将基因作为DNA插入物克隆到载体中。术语“载体”是指核酸可以在生物体、细胞或细胞组分之间进行繁殖和/或转移的方式。载体包含自主复制或可以整合到宿主细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体也可以是不自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一链内的DNA和RNA两者构成的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等。在许多但不是所有常见的实施例中，本发明的载体是质粒或杆粒。

因此，本发明包括对蛋白质进行编码的核苷酸，所述核苷酸包含克隆到表达载体中的嵌合分子，所述表达载体可以在诱导形成本发明的融合蛋白的细胞中表达。“表达载体”是能够促进表达并且复制掺入其中的核酸的如质粒等载体。通常，待表达的核酸与启动子和/或增强子“可操作地连接”并且受启动子和/或增强子的转录调节控制。在一个实施例中，核苷酸对疟原虫蛋白(如上文所讨论的)进行编码。在另一个实施例中，表达载体是杆状病毒载体。

在本发明的一些实施例中，蛋白质可以包括含有产生沉默取代、添加或缺失的改变的突变，例如以优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子变为由如Sf9细胞等昆虫细胞所偏爱的那些密码子)。参见例如美国专利公开2005/0118191，所述美国专利公开出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

另外，可以对核苷酸进行测序以确保正确的编码区被克隆并且不含有任何不需要的突变。可以将核苷酸亚克隆到表达载体(例如，杆状病毒)中以在任何细胞中进行表达。以上仅是可以如何克隆蛋白质的一个实例。本领域技术人员应理解，可以使用另外的方法。

宿主细胞

在昆虫细胞表达系统中获得了高水平表达。昆虫细胞的非限制性实例为草地贪夜蛾(Sf)细胞(例如，Sf9、Sf21)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(例如，High Five细胞)和果蝇S2细胞。

载体(例如，包括对融合蛋白进行编码的多核苷酸的载体)可以根据本领域熟知的方法转染到宿主细胞中。例如，将核酸引入到真核细胞中可以通过磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染和采用多胺转染试剂的转染来实现。在一个实施例中，所述载体为重组型杆状病毒。

纳米颗粒产生

可以通过在表达重组型蛋白的条件下生长由表达载体转化的宿主细胞来产生纳米颗粒。一方面，产生多价蛋白的方法包括将对蛋白质进行编码的载体转染到合适的宿主细胞中以及在允许纳米颗粒形成的条件下对蛋白质进行表达。在另一个实施例中，真核细胞选自由酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、禽类细胞或哺乳动物细胞组成的组。适当生长条件的选择在本领域普通技术人员的技能或技术人员的能力范围内。

生长宿主细胞的方法包含但不限于分批、分批进料、连续和灌注细胞培养技术。细胞培养意指细胞在生物反应器(发酵室)中的生长和繁殖，其中细胞繁殖并且表达蛋白质(例如，重组型蛋白)以进行纯化和分离。通常，在生物反应器中在无菌、受控温度和大气条件下进行细胞培养。生物反应器是用于培养细胞的室，可以监测所述室中的环境条件，如温度、大气、搅拌和/或pH值。在一个实施例中，生物反应器是不锈钢室。在另一个实施例中，生物反应器是预先灭菌的塑料袋(例如，新泽西州布里奇沃特Wave Biotech公司的)。在其它实施例中，预先灭菌的塑料袋为约50L到1000L的袋。

纳米颗粒的洗涤剂提取和纯化

可以使用洗涤剂从宿主细胞中采集纳米颗粒。合适的洗涤剂包含非离子表面活性剂。例如，非离子表面活性剂可以是双(聚乙二醇双[咪唑基羰基])、壬苯醇醚-9、双(聚乙二醇双[咪唑基羰基])、35、/>56、/>72、/>76、/>92V、/>97、/>58P、/>EL、十乙二醇单十二醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正癸基α-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷酰-N-甲基葡萄糖胺、正十二烷基α-D-麦芽糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、七聚乙二醇单葵醚、七聚乙二醇单十二醚、七聚乙二醇单十四醚、正十六烷基β-D-麦芽糖苷、六乙二醇单十二醚、六乙二醇单十六醚、六乙二醇单十八醚、六乙二醇单十四醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-0-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷、九甘醇单十二醚、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、N-壬酰-N-甲葡糖胺、八乙二醇单癸醚、八乙二醇单十二醚、八乙二醇单十六醚、八乙二醇单十八醚、八乙二醇单十四醚、辛基-β-D-喃葡萄糖、戊乙二醇单癸醚、戊乙二醇单十二醚、戊乙二醇单十六醚、戊乙二醇单己醚、戊乙二醇单十八醚、戊乙二醇单辛醚、戊乙二醇缩水甘油醚、戊乙二醇乙醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基乙醚、聚氧化乙烯100硬脂酸盐、聚氧乙烯20异十六醚、聚氧化乙烯20油烯基乙醚、聚氧化乙烯40硬脂酸盐、聚氧化乙烯50硬脂酸盐、聚氧化乙烯8硬脂酸盐、聚氧化乙烯双(咪唑基羰基)、聚氧化乙烯25丙二醇硬脂酸盐、来自皂树皮的皂苷、/>20、/>40、/>60、/>65、/>80、/>85、Tergitol 15-S-12型、Tergitol 15-S-30型、Tergitol 15-S-5型、Tergitol 15-S-7型、Tergitol 15-S-9型、Tergitol NP-10型、Tergitol NP-4型、Tergitol NP-40型、Tergitol NP-7型、TergitolNP-9型、Tergitol TMN-10型、Tergitol TMN-6型、十四基-β-D-麦芽糖苷、四甘醇单癸醚、四甘醇单十二醚、四甘醇单十四醚、三甘醇单癸醚、三甘醇单十二醚、三甘醇单十六醚、三甘醇单辛醚、三甘醇单十四醚、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-151、Triton X-200、Triton X-207、/>X-100、/>X-114、/>X-165、/>X-305、/>X-405、/>X-45、/>X-705-70、/>20、21、/>40、/>60、/>61、/>65、/>80、81、/>85、泰洛沙泊、正十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、其半合成衍生物或其组合。Tergitol NP-9为优选洗涤剂。

一旦宿主细胞生长48到72小时，就将细胞从培养基中分离，并且添加含有洗涤剂的溶液以溶解细胞膜，从而在洗涤剂提取物中释放纳米颗粒。可以添加洗涤剂以达到约0.1％到约1.0％的最终浓度。例如，浓度可以为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.5％、约0.7％、约0.8％或约1.0％。在某些方面，所述范围可以为约0.1％到约0.3％。优选地，浓度为约0.2％。

然后，可以使用保持纳米颗粒完整性的方法(如离心)来分离所述纳米颗粒。在一些方面，可以使用梯度离心，如使用氯化铯、蔗糖和碘克沙醇。其它技术可以用作替代性方案，或者另外可以是如标准纯化技术，包含例如离子交换和凝胶过滤色谱法。

一方面，将洗涤剂提取物依次添加到多个柱中。例如，第一柱可以为如TMAE等离子色谱柱，第二柱可以为如苯基HP等疏水相互作用柱，并且第三柱可以为如Source 30Q柱等强阴离子交换柱。可以通过重复三步程序来获得增加的纯度。

以下提供了用于制备分离和纯化蛋白质的一般程序。本领域技术人员将理解的是，存在可以利用的变型。

通过将Sf9细胞(未经感染的)接种到摇瓶中来开始生产，这允许细胞随细胞生长与繁殖而扩展和扩大(例如，从125ml的烧瓶到50L的Wave袋)。为合适的细胞系调配用于生长细胞的培养基(优选地无血清培养基，例如昆虫培养基ExCell-420、JRH)。接下来，以最有效的感染复数(例如，每个细胞约1个到约3个噬斑形成单位)用重组型杆状病毒来感染细胞。一旦发生感染，就由病毒基因组对融合蛋白(以及任选地，其它免疫原)进行表达。通常，当细胞处于对数生长中期(4-8x 10⁶个细胞/ml)并且至少有约90％存活时，感染是最有效的。

可以在感染大约48到96小时后采集本公开的蛋白质。在一些方面，在约48小时、约72小时或在约48小时与约72小时之间进行采集。通常，当细胞培养基中的VLP水平接近最大值但在广泛的细胞裂解之前时进行采集。如由染料排除测定所示的，采集时的Sf9细胞密度和活力可以为约0.5x 10⁶个细胞/ml到约1.5x 10⁶个细胞/ml，其中存活率为至少20％。

为了溶解颗粒，将Tergitol NP9直接添加到细胞培养物中以达到0.2％NP9/25mMTris/50mM NaCl/pH 8.0的最终浓度。在室温下温育1小时，然后将裂解物以9000g离心两次，每次持续30分钟。收集含有纳米颗粒的上清液。然后，将上清液加入到缓冲液A中并且在缓冲液B中对其进行洗脱(缓冲液A：25mM pH 8.0/50mM NaCl，缓冲液B：25mM Tris pH 8.0/1M NaCl)。将洗脱物应用到Phenyl HP柱中(缓冲液A：350mM柠檬酸钠/25mM Tris pH 7.5；以及缓冲液B：5mM Tris pH 8.0)并且然后应用到Source 30Q柱中(缓冲液A：25mM Tris pH8.0/250mM NaCl，缓冲液B：25mM Tris pH 8.0/1M NaCl)。使含有产物的合并级分通过2微米过滤器。参见图8-10。

上文所描述的程序能够以150mg/L到约300mg/L的产率获得至少约90％、至少约95％或约98％的纯度。纯度可以通过基于凝胶的方法进行测量，所述方法指示总蛋白质。

如果需要，可以使完整的杆状病毒灭活。灭活可以通过化学方法(例如，福尔马林或β-丙内酯(BPL))来完成。如上文所例示的，除去和/或灭活完整的杆状病毒在很大程度上还可以通过使用本领域已知的选择性沉淀和色谱方法来完成。灭活方法包括在约25℃到约27℃下将含有VLP的样品在0.2％的BPL中温育3小时。还可以通过将含有VLP的样品在0.05％的BPL、4℃下温育3天，然后在37℃下温育1小时来使杆状病毒灭活。

上述技术可以在各种不同的尺度下进行实践。例如，T型烧瓶、摇瓶、旋转瓶直至工业规模的生物反应器。生物反应器可以包括不锈钢罐或预先灭菌的塑料袋(例如，由新泽西州布里奇沃特Wave Biotech公司销售的系统)。本领域技术人员将了解，什么是特定环境下最为期望的。

蛋白质大小和产率

使用本文所公开的方法的多聚体蛋白产率是显著的。在一些情况下，产率为约150mg/L到约300mg/L。在一些实施例中，产率为约40mg/L、约60mg/L、约80mg/L、约100mg/L、约150mg/L、约200mg/L、约250mg/L或约300mg/L。在特定方面，产率范围为约40mg/L到约300mg/L、约80mg/L到约250mg/L或约100mg/mL到约300mg/L。

本文所公开的大多数多聚体蛋白的范围通常为约1500-2500个氨基酸。在一些方面，所述多聚体蛋白的范围为约1500个氨基酸到约2000个氨基酸。在其它方面，所述多聚体蛋白的范围为约1800个氨基酸到约2000个氨基酸。

多聚体蛋白形成具有约11nm到约35nm的典型直径的纳米颗粒。直径范围可以为约15nm到约25nm。图9中示出了这些范围内的多聚体蛋白纳米颗粒的说明性实例。

重要的是，即使蛋白质很大，但其仍然可溶。例如，经过纯化的多聚体蛋白可以是约80％可溶、约85％可溶、约90％可溶、约95％可溶、约97％可溶或约99％可溶。在一些方面，溶解度为约90％到约99％或约90％到约95％。

经过修饰的抗原和多肽

本文所公开的抗原涵盖那些抗原的变型和突变体。在某些方面，抗原可以与所公开的抗原共享同一性。通常，并且除非在特异性鉴定的抗原的上下文中具体定义，否则同一性百分比可以为至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％。可以使用对齐程序Clustal Omega来计算百分比同一性，所述程序可使用默认参数在www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo上获得。

在特定方面，纳米颗粒中含有的蛋白质由所述蛋白质组成。在其它方面，纳米颗粒中含有的蛋白质包括所述蛋白质。蛋白质本身的延伸可以用于各种目的。

在一些方面，抗原可以在N端处、C端处或两者处延伸。在一些方面，延伸是如纯化或检测等功能可用的标签。在一些方面，标签含有表位。例如，标签可以为聚谷氨酸标签、FLAG标签、HA标签、聚His标签(具有约5-10个组氨酸)、Myc标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、绿色荧光蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、硫氧还蛋白标签或Fc标签。在其它方面，延伸可以为与蛋白质融合以增强表达的N端信号肽。虽然这种信号肽通常在细胞中表达期间被切割，但是一些纳米颗粒可以含有具有完整信号肽的抗原。因此，当纳米颗粒包括抗原时，抗原可以含有延伸，并且因此当掺入到纳米颗粒中时所述抗原可以是融合蛋白。出于计算序列同一性的目的，扩展不包含在内。在一些方面，可以将抗原截短。例如，N端可以被截短约10个氨基酸、约30个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或约200个氨基酸。例如，C端可以被截短约10个氨基酸、约30个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或约200个氨基酸。

药物组合物

本文所公开的药物组合物包括多聚体蛋白和药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂包含可以向受试者施用而没有过度毒性、刺激或过敏反应的任何药剂。药学上可接受的载剂还可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是可用于制备通常安全且无毒的药物组合物的任何赋形剂，并且是兽医以及人类药物用途可接受的。

可用于本文的药物组合物含有药学上可接受的载剂，所述载剂包含任何合适的稀释剂或赋形剂，所述稀释剂或赋形剂包含本身不会诱导产生对接受组合物的脊椎动物有害的免疫应答的任何药剂，并且可以在没有过度毒性和免疫原的情况下施用所述稀释剂或赋形剂；例如多聚体融合蛋白。

在一些方面，调配物可以包含药学上可接受的载剂或赋形剂。药学上可接受的载剂包含但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗水性缓冲液以及其组合。《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(新泽西州马克出版公司(MackPub.Co.)，现行版)中呈现了对药学上可接受的载剂、稀释剂和其它赋形剂的详尽讨论。调配物可以被适配成适用于施用模式。在一个示例性实施例中，所述调配物适于向人类施用、是无菌的、非微粒的和/或无热原的。

组合物还可以含有润湿剂、或乳化剂、或pH缓冲剂、或其混合物。组合物可以呈固体形式，如适于重构的冻干粉末(例如，用水或盐水)、液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或粉末。口服调配物可以包含标准载剂，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

佐剂

可以通过使用免疫应答的被称为佐剂的非特异性刺激剂来增强特定组合物的免疫原性。已经通过实验使用佐剂来促进针对抗原的免疫力的普遍增加(例如，美国专利第4,877,611号)。免疫方案已经多年使用佐剂来刺激应答，并且因此，佐剂是本领域普通技术人员所熟知的。一些佐剂会影响抗原呈递的方式。例如，当蛋白抗原被alum沉淀时，免疫应答会增加。抗原的乳化也延长了抗原呈递的持续时间。在本公开的范围内设想了在出于所有目的以全文引用的方式并入本文中的Vogel等人,《疫苗佐剂和赋形剂汇编(A Compendiumof Vaccine Adjuvants and Excipients)》(第2版)中所描述的包含的任何佐剂。

示例性佐剂包含完全弗氏佐剂(含有被杀死的结核分枝杆菌的免疫应答的非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其它佐剂包括GMCSP化合物、BCG化合物、MDP化合物，如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)、MF-59、RIBI，其含有从2％角鲨烯/80乳液中的细菌、MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)中提取的三种组分。在其它优选的方面，使用alum，如2％Alhydrogel(Al(OH)₃)。在一些方面，佐剂可以是paucilamellar脂质囊泡；例如，/>是paucilamellar非磷脂囊泡，其范围为约100nm到约500nm。所述囊泡包括Brij 72、胆固醇、油酸和角鲨烯。已经证明Novasomes是有效佐剂(参见美国专利第5,629,021号、第6,387,373号和第4,911,928号)。

皂苷佐剂

含有皂苷的佐剂也可以与本文所公开的免疫原进行组合。皂苷是源自皂树皮(Quillaja saponaria Molina)的糖苷。通常，使用产生多个级分的多步纯化方法来制备皂苷。如本文所用，术语“来自皂树皮的皂苷级分”一般用于描述皂树皮的半纯化或限定的皂苷级分或其基本上纯的级分。

皂苷级分

用于产生皂苷级分的若干方法是合适的。级分A、B和C描述于美国专利第6,352,697号中并且可以如下进行制备。通过色谱法分离来自Quil A(即粗制水性皂树皮提取物)的亲脂性级分，并且用水中的70％乙腈进行洗脱，以对亲脂性级分进行回收。然后通过半制备性HPLC分离此亲脂性级分，其中使用酸性水的25％到60％乙腈进行梯度洗脱。本文中称为“级分A”或“QH-A”的级分是或对应于以大约39％乙腈洗脱的级分。本文中称为“级分B”或“QH-B”的级分是或对应于以大约47％乙腈洗脱的级分。本文中称为“级分C”或“QH-C”的级分是或对应于以大约49％乙腈洗脱的级分。可在美国专利第5,057,540号中找到关于级分纯化的另外的信息。当如本文所描述的进行制备时，皂树皮的级分A、B和C各自代表具有可限定性质的化学上密切相关的分子的基团或家族。获得所述级分的色谱条件使得洗脱曲线和生物活性方面的批到批重现性高度一致。

已经描述了其它皂苷级分。EP 0436620中描述了级分B3、B4和B4b。EP 03632279B2中描述了级分QA1-QA22：Q-VAC(Nor-Feed，AS丹麦)、Quillaja saponaria MolinaSpikoside(lsconova AB，Ultunaallén 2B，756 51乌普萨拉，瑞典)。可以使用EP 03632279 B2的级分QA-1、QA-2、QA-3、QA-4、QA-5、QA-6、QA-7、QA-8、QA-9、QA-10、QA-11、QA-12、QA-13、QA-14、QA-15、QA-16、QA-17、QA-18、QA-19、QA-20、QA-21和QA-22，尤其是QA-7、QA-17、QA-18和QA-21。如在EP 0 3632 279 B2中(特别是在第6页以及第8页和第9页的实例1中)所描述的获得所述级分。

本文所描述的并且用于形成佐剂的皂苷级分通常是基本上纯的级分；也就是说，级分基本上不存在来自其它材料的污染物。在特定方面，基本上纯的皂苷级分可以含有至多40重量％、至多30重量％、至多25重量％、至多20重量％、至多15重量％、至多10重量％、至多7重量％、至多5重量％、至多2重量％、至多1重量％、至多0.5重量％或至多0.1重量％的其它化合物，如其它皂苷或其它佐剂材料。

ISCOM结构

皂苷级分可以以被称为ISCOM(免疫刺激性复合物)的笼状颗粒的形式进行施用。可以如在EP 0109942B1、EP 0242380B1和EP 0180546B1中所描述的来制备ISCOM。在特定实施例中，如在EP 9600647-3(PCT/SE97/00289)中所描述的，可以使用转运抗原和/或载客抗原。

基质佐剂

在一些方面，ISCOM为ISCOM基质复合物。ISCOM基质复合物包括至少一种皂苷级分和脂质。脂质至少为如胆固醇等甾醇。在特定方面，ISCOM基质复合物还含有磷脂。ISCOM基质复合物还可以含有一种或多种其它免疫调节(佐剂活性)物质(不一定是糖苷)，并且可以如在EP 0436620B1中所描述的进行制备。

在其它方面，ISCOM为ISCOM复合物。ISCOM复合物含有至少一种皂苷、至少一种脂质和至少一种类型的抗原或表位。ISCOM复合物含有抗原，所述抗原通过洗涤剂处理而缔合，使得抗原的一部分整合到颗粒中。相比之下，ISCOM基质被调配为具有抗原的混合物，并且ISCOM基质颗粒与抗原之间的缔合通过静电和/或疏水相互作用来介导。

根据一个实施例，整合到ISCOM基质复合物或ISCOM复合物中的皂苷级分或也整合到ISCOM基质复合物或ISCOM基质复合物中或与其混合的至少一种另外的佐剂选自皂树皮的级分A、级分B或级分C、皂树皮的半纯化制剂、皂树皮的经过纯化的制剂或任何经过纯化的亚级分，例如QA 1-21。

在特定方面，每个ISCOM颗粒可以含有至少两种皂苷级分。可以使用不同皂苷级分的重量％的任何组合。可以使用任何两种级分的重量％的任何组合。例如，颗粒可以分别含有任何重量％的级分A和任何重量％的另一种皂苷级分，如粗制皂苷级分或级分C。因此，在特定方面，每个ISCOM基质颗粒或每个ISCOM复合物颗粒可以含有0.1重量％到99.9重量％、5重量％到95重量％、10重量％到90重量％、15重量％到85重量％、20重量％到80重量％、25重量％到75重量％、30重量％到70重量％、35重量％到65重量％、40重量％到60重量％、45重量％到55重量％、40重量％到60重量％或50重量％的一种皂苷级分(例如，级分A)和在每种情况下高达100％的另一种皂苷的其余级分，例如任何粗制级分或任何其它级分，例如级分C。将重量计算为皂苷级分的总重量。美国公开申请第2013/0129770号中公开了ISCOM基质复合物和ISCOM复合物佐剂的实例。

在特定实施例中，ISCOM基质或ISCOM复合物包括5-99重量％的一种级分(例如，级分A)以及高达100重量％的另一种级分的其余级分(例如，粗制皂苷级分或级分C)。将重量计算为皂苷级分的总重量。

在另一个实施例中，ISCOM基质或ISCOM复合物包括40重量％到99重量％的一种级分(例如，级分A)以及1重量％到60重量％的另一种级分(例如，粗制皂苷级分或级分C)。将重量计算为皂苷级分的总重量。

在又另一个实施例中，ISCOM基质或ISCOM复合物包括70重量％到95重量％的一种级分(例如，级分A)以及30重量％到5重量％的另一种级分(例如，粗制皂苷级分或级分C)。将重量计算为皂苷级分的总重量。在其它实施例中，来自皂树皮的皂苷级分选自QA 1-21中的任一种。

除含有皂苷级分混合物的颗粒之外，ISCOM基质颗粒和ISCOM复合物颗粒各自可以仅使用一种皂苷级分而形成。本文所公开的组合物可以含有多个颗粒，其中每个颗粒仅含有一种皂苷级分。也就是说，某些组合物可以含有一种或多种不同类型的ISCOM基质复合物颗粒和/或一种或多种不同类型的ISCOM复合物颗粒，其中每个单独的颗粒含有来自皂树皮的一种皂苷级分，其中一种复合物中的皂苷级分不同于其它复合物颗粒中的皂苷级分。

在特定方面，一种类型的皂苷级分或粗制皂苷级分可以整合到一种ISCOM基质复合物或颗粒中，并且另一种类型的基本上纯的皂苷级分或粗制皂苷级分可以整合到另一种ISCOM基质复合物或颗粒中。组合物或疫苗可以包括至少两种类型的复合物或颗粒，每种类型具有整合到在物理上不同的颗粒中的一种类型的皂苷。

在组合物中，可以使用ISCOM基质复合物颗粒和/或ISCOM复合物颗粒的混合物，在所述混合物中，将一种皂苷级分皂树皮和另一种皂苷级分皂树皮分别掺入不同的ISCOM基质复合物颗粒和/或ISCOM复合物颗粒中。

ISCOM基质颗粒或ISCOM复合物颗粒可以以重量％的任何组合存在于组合物中，所述ISCOM基质颗粒或ISCOM复合物颗粒各自具有一种皂苷级分。在特定方面，组合物可以含有0.1重量％到99.9重量％、5重量％到95重量％、10重量％到90重量％、15重量％到85重量％、20重量％到80重量％、25重量％到75重量％、30重量％到70重量％、35重量％到65重量％、40重量％到60重量％、45重量％到55重量％、40重量％到60重量％或50重量％的ISCOM基质或复合物，所述SCOM基质或复合物含有第一皂苷级分，其中剩余部分由含有不同皂苷级分的ISCOM基质或复合物构成。在一些方面，剩余部分是一种或多种ISCOM基质或复合物，其中每种基质或复合物颗粒仅含有一种皂苷级分。在其它方面，ISCOM基质或复合物颗粒可以含有多于一种皂苷级分。

在优选组合物中，第一ISCOM基质中的皂苷级分为级分A(“级分A基质”)，并且第二ISCOM基质或ISCOM复合物颗粒中的皂苷级分为级分C(“级分C基质”)。因此，优选组合物包括作为佐剂的级分A基质佐剂和级分C基质佐剂。组合物中的每种基质的量可以变化。例如，级分A基质的量可以为约80％(w/w)、约85％(w/w)、约90％(w/w)、约92％(w/w)或约95％(w/w)，其余为级分C基质。合适的85:15级分A基质和级分C基质组合的合适实例是Matrix-M^TM(Novavax AB，瑞典乌普萨拉)，即比率为约85比约15的级分A基质和级分C基质的混合物。

其它皂苷级分(如QS-7和QS-21级分)、其产生和其用途描述于美国专利第5,057,540号；第6,231,859号；第6,352,697号；第6,524,584号；第6,846,489号；第7,776,343号和第8,173,141号中。这些级分可以用于本文所公开的方法和组合物中。

免疫刺激剂

本公开的组合物还可以与“免疫刺激剂”一起进行调配。所述免疫刺激剂是身体自身增加免疫系统应答的化学信使(细胞因子)。免疫刺激剂包含但不限于：具有免疫刺激活性、免疫增强活性和促炎活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如，粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CM)；以及其它免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子、Flt3配体、B7.1；B7.2等。免疫刺激分子可以以与本公开的组合物相同的调配物进行施用，或者可以单独施用。可以施用蛋白质或对蛋白质进行编码的表达载体以产生免疫刺激效应。因此，在一个实施例中，本公开包括抗原调配物和疫苗调配物，所述调配物包括佐剂和/或免疫刺激剂。

诱导免疫应答的方法

本公开还提供了引发针对病原体的免疫应答的方法。所述方法涉及向受试者施用免疫有效量的包括多聚体蛋白的组合物。施用免疫有效量的本公开的组合物会引发对融合蛋白上存在的表位具有特异性的免疫应答。这种免疫应答可以包含B细胞应答和/或T细胞应答。当向受试者施用时，多聚体蛋白优选地诱导中和抗体。优选地，免疫应答包含对存在于多聚体蛋白中含有的每种蛋白质中的至少一种构象表位具有特异性的元素。

施用

可以通过任何合适的途径进行施用。合适的途径包含肠胃外施用(例如，皮内、肌肉内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜施用(例如，鼻内和口服或肺部途径或通过栓剂)、透皮或皮内施用。可以通过输注或推注、经过上皮或粘膜与皮肤内层(例如，口腔粘膜、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱和肠粘膜等)吸收进行施用，并且可以与其它生物活性剂一起施用。在一些方面，鼻内或其它粘膜施用途径可以产生显著高于其它施用途径的抗体或其它免疫应答。施用可以是全身性的或局部的。

在一些方面，可以使用针和注射器、通过无针注射装置注射进行施用。在其它方面，通过滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)或通过使喷雾进入上呼吸道进行施用。

在一些方面，提供了一种药物包或试剂盒，其包括用调配物组分中的一种或多种填充的一个或多个容器。在一个特定方面，试剂盒可以包含两个容器，第一容器含有多聚体蛋白，并且第二容器含有佐剂。与一个或多个这种容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映了机构针对人类施用在制造、使用或销售方面的许可。调配物也可以包装在密封容器中，如指示组合物的量的安瓿或小药囊中。

在一些方面，施用可以是靶向性的。例如，组合物可以以靶向粘膜组织的方式进行施用，以在免疫位点处引发免疫应答。通过口服施用含有具有特定粘膜靶向性质的佐剂的组合物，可以将如肠相关淋巴组织(GALT)等粘膜组织作为免疫目标。还可以靶向如鼻咽淋巴组织(NALT)和支气管相关淋巴组织(BALT)等另外的粘膜组织。

在一些方面，可以施用多种组合物，每种组合物具有不同的抗原集合。在施用多于一种多聚体蛋白的情况下，可以向受试者的相同位置同时联合施用蛋白质；例如，通过从一个或多个含有多聚体蛋白的容器中注射材料。在其它方面，可以在短时间内在不同位点处依次联合施用蛋白质；例如，一次施用可以在大腿内，并且第二次施用可以在手臂中，其中两次施用都在短时间段内(例如，最多30分钟)进行。

可以进行人体临床研究以由技术人员测定对人类的优选有效剂量。这种临床研究是常规性的并且是本领域所熟知的。待采用的精确剂量还将取决于施用途径。可以根据源自体外或体内测试系统的剂量-应答曲线来外推有效剂量。可以基于例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、施用时间和其它临床因素对剂量进行调整。

虽然可以用单剂量刺激免疫，但是可以通过相同或不同的途径来施用另外的剂量，以达到期望的效果。例如，在新生儿和婴儿中，可能需要多次施用以引发足够的免疫水平。可以在整个童年时期间隔施用，以维持足够的抗感染保护水平。类似地，特别容易受到反复感染或严重感染的成年人(如例如医护人员、日托工作者、幼儿家庭成员、老年人和心肺功能受损的人)可能需要进行多次免疫接种以建立和/或保持保护性免疫应答。可以对诱导免疫的水平进行监测，例如通过测量中和分泌抗体和血清抗体的量以及引发和维持所期望保护水平所必需的调整剂量或重复疫苗接种。

疫苗组合物还可以用于制备针对可用于被动施用疗法的毒素的抗体。参见Casadevall,“作为生物武器的特定防御的被动抗体施用(即时免疫)(Passive AntibodyAdministration(Immediate Immunity)as a Specific Defense Against BiologicalWeapons)”,《新发传染病(Emerging Infectious Diseases)》。2002；8(8):833-841。

实例

实例1

艰难梭菌三重毒素疫苗构建体

构建两种三重毒素疫苗。图1中示出了蛋白质结构的示意图。三重毒素1420(也称为BV1420)从N端到C端含有活化结构域肽、成熟CDTb肽、TcdB RBD肽和含有19个重复序列(R19)的TcdA RBD肽。弗林蛋白酶切割位点(RARRRKKR；SEQ ID NO:27)位于活化结构域肽与成熟CDTb肽之间。图2和3分别示出了BV1470的蛋白质序列和基因序列。连接子位点处于TcdB肽的任一端处。

实例2

三重毒素疫苗的表达

用表达三重疫苗的杆状病毒载体将Sf9细胞转化作为单个转录物。图2中示出了来自Sf9细胞的表达数据。图2示出了在48小时和72小时时采集的每种蛋白质的表达。值得注意的是，即使每种蛋白质超过200kDa，但是也能实现高水平的生产。图7示出了从48小时到96小时的表达时间过程。数据显示，两种蛋白质都是高度可溶的。

实例3

三重毒素疫苗的纯化

为了溶解和纯化颗粒，将Tergitol(NP9)直接添加到细胞培养物中，到0.2％NP9/25mM Tris/50mM NaCl/pH 8.0的最终浓度。在室温下温育1小时，然后将裂解物以9000g离心两次，每次持续30分钟。收集含有纳米颗粒的上清液。然后，将上清液加入到缓冲液A中并且在缓冲液B中对其进行洗脱(缓冲液A：25mM pH 8.0/50mM NaCl，缓冲液B：25mM Tris pH8.0/1M NaCl)。将洗脱物应用到Phenyl HP柱中(缓冲液A：350mM柠檬酸钠/25mM Tris pH7.5；以及缓冲液B：5mM Tris pH 8.0)并且然后应用到Source 30Q柱中(缓冲液A：25mMTris pH 8.0/250mM NaCl，缓冲液B：25mM Tris pH 8.0/1M NaCl)。使含有产物的合并级分通过2微米过滤器。参见图4-6。从Sf9中纯化1470产生269毫克/升的蛋白质。从Sf9中纯化1420产生166毫克/升。

实例4

对三重毒素疫苗颗粒的分析

使用Zeta Sizer Nano通过动态光散射分析三重毒素BV1420的粒径分布对体积曲线图。图7中示出了大小分布对体积的曲线图。平均直径为约30nm。图8示出了三重毒素BV1470的粒径分布对强度曲线图。平均直径为约18nm。

图9示出了负染色三重毒素BV1420的各个电子显微照片。将经过纯化的三重毒素BV1420的电子显微照片稀释到大约10μg/ml并且用乙酸铀酰进行负染色。

实例5

艰难梭菌三重毒素疫苗：致命毒素攻击和动物存活率

图10提供了三重毒素疫苗对抗毒素A和二元毒素的小鼠试验的结果。如图所示，向第1到6组施用BV1420抗原(30μg)或PBS。第1组和第4组含有50μg氢氧化铝；第2组和第5组含有50μg氢氧化铝和50μg ISCOM Matrix M佐剂。在第0天和第14天对小鼠进行免疫，在第0天、第14天和第32天对其进行放血。在第35天时用毒素A或二元毒素攻击小鼠。

图11示出了血清IgG应答。如所预期的，PBS并未诱导抗体。三重毒素疫苗外加氢氧化铝或者三重毒素疫苗外加氢氧化铝和Matrix M两者针对毒素A、毒素B和CDTb诱导范围为约10⁴到约10⁶的滴度。图12证实，抗体中和毒素A和CTDb两者。图13示出了所述6个组的动物存活率。第1组、第2组、第4组和第5组显示出100％的存活率。除二元毒素攻击的两只小鼠外，对照PBS组中的所有动物均死亡。这些数据证实，三重毒素疫苗保护免受毒素的影响。

在第二攻击研究中，对于毒素B，产生多个构建体并且对其进行单独或组合测试。向第1组小鼠施用BV1420(30μg)和氢氧化铝。向第2组小鼠施用BV1470(30μg)和氢氧化铝，向第3组施用含有轮状病毒VP6和TcdB RBD的串联蛋白质(10μg)以及氢氧化铝。向第4组小鼠施用BV1470和VP6/TcdB RBD。向第5组施用类毒素B(10μg)。第6组为对照组，并且向所述组施用PBS。图15中示出了抗IgG应答。在每种情况下都获得高滴度抗体。含有毒素A肽的组中的每个组诱导范围介于10⁴与约10⁵之间的高滴度抗毒素A应答。向所有组施用毒素B肽，并且每个组显示出范围介于10⁴与约10⁶之间的高滴度。含有二元毒素肽的组中的每个组诱导范围介于10⁵与约10⁶之间的高滴度应答。图16证实，产生了中和两种毒素B的抗体，其中类毒素B显示出更高的水平。

图17中示出了第1到6组小鼠的存活率。PBS对照组中的所有小鼠在第3天死亡，其中6只中有5只在一天内死亡。毒素B存活率为100％。对于第1到4组，存活率范围为67％到83％。

实例6

另外的三重毒素疫苗

可以在获得高表达水平的同时产生另外的疫苗。图18和19示出了具有TcdB基因易位基因的另外的三价疫苗蛋白质。在底部图中示出了BV1512。图18示出了另外的疫苗结构：多聚体蛋白质序列：BV1512多聚体疫苗蛋白质的序列，其显示，CDTb蛋白质通过A-S连接子与易位结构域(TD)分离，并且TD通过S-R连接子与TcdAR19部分分离。图19示出了来自Sf9细胞的多聚体蛋白质BV1512的表达。

实例7

四价疫苗

产生含有四种肽的多聚体蛋白质。图20。在此实例中，引入来自第二TcdB菌株的肽以增强针对另外的艰难梭菌菌株的免疫力。第一四价多聚体蛋白质(CBAB或pCDTb/TcdB₆₃₀/TcdAR19/TcdB₀₂₇)包含在C端处添加的来自菌株027的TcdB肽(参见图20，上图)。在第二四价多聚体肽中，将来自菌株027肽的TcdB肽引入在来自第一菌株——菌株630的TcdB蛋白质与TcdA(R19)蛋白质之间(参见图20，下图)。图21示出了如上文所描述的来自Sf9细胞的CBBA四价多聚体的表达。数据显示，所获得的产率为42mg/L。还在Sf9系统中产生第二蛋白质(如图26中所示出的CBBA或pCDTb/TcdB₆₃₀/TcdAR19/TcdB₀₂₇)，并且所述第二蛋白质获得了40mg/L的产率。参见图22。

实例8

T毒素融合蛋白和Q毒素融合蛋白的设计、表达和纯化

构建嵌合融合蛋白以对艰难梭菌TcdA的RBD、TcdB₍₀₀₃₎、TcdB₍₀₂₇₎和CDTb进行编码。TcdA的RBD氨基酸序列源自艰难梭菌菌株VPI 10463(ATCC 43255)、NCBI P16154(毒素型0、核糖核酸型003)；TcdB₍₀₀₃₎源自菌株VPI 10463(ATCC 43255)、NCBI P18177(毒素型0、核糖核酸型003)；TcdB₍₀₂₇₎源自菌株CD196、NCBI WP_009888442.1(毒素型III、核糖核酸型027)；并且CDTb源自菌株CD196、GenBank ABS57477.1(毒素型III、核糖核酸型027)。

TcdA RBD(用38个重复序列中的19个重复序列截短)、TcdB₍₀₀₃₎和TcdB₍₀₂₇₎RBD(各自24个重复序列)以及CDTb的编码序列进行密码子优化以在昆虫细胞中表达(GenScript)。

通过由合成基因进行的PCR扩增来获得编码CDTb基因片段(氨基酸1-835)、TcdARBD(1314个碱基对[bp]，bp 6816-8130)和TcdB₍₀₀₃₎RBD(1608个bp，bp 5493-7098)的核苷酸序列。用限制酶消化PCR扩增的基因片段：用BamHI/NheI消化CDTb；用NheI/XbaI消化TcdB₍₀₀₃₎RBD；并且用XbaI/HindIII消化TcdA RBD。消化后，将所述三种基因连接到pFastBac1(英杰公司(Invitrogen))的BamH1位点和HindIII位点中。使用编码所述三种RBD的质粒、使用草地贪夜蛾(Sf9)昆虫细胞中的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(英杰公司)来表达三价融合蛋白质——以下称为T毒素，从而构建重组型苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)多核型多角体病毒(AcMNPV)杆状病毒(图23B)。

将用Spel/HinIII消化的TcdB₍₀₂₇₎RBD(1608个bp，5493-7098)与三价融合基因的C端融合，以形成编码所有四种毒素的RBD的质粒和杆状病毒构建体，所述构建体类似地在Sf9细胞中表达以产生四价融合蛋白——下文称为Q毒素(图23B；SEQ ID NO:21)。

因此，构建体含有pCDTb：835个氨基酸，1-835；菌株：CD196；毒素型：III，核糖核酸型：027；GenBank：ABS57477.1；TcdB₀₀₃：536个氨基酸，838-1373；NCBI：P18177，菌株＝ATCC4325/VPI 10463，毒素型0，核糖核酸型：087；TcdA：438个氨基酸，1376-1813；NCBI：P16154，菌株＝ATCC 4325/VPI 10463，毒素型0；核糖核酸型：087；以及TcdB₀₂₇：536个氨基酸，1815-2351；NCBI：013315，菌株CD196；毒素型：III，核糖核酸型：027。所述部分中的每个部分由双氨基酸连接子分离：pCDTb部分与TcdB003部分之间的AS、TcdB003部分与TcdA部分之间的SR、TcdA部分与TcdB027部分之间的TS。

在包括25mM Tris缓冲液(pH 8.0)中的0.2％Tergitol NP-9、250mM NaCl和2μg/mL亮抑酶肽的缓冲液中通过洗涤剂裂解提取融合蛋白。通过离心纯化裂解物，并且用Fractogel EMD TMAE、phenyl HP和30Q柱色谱法来纯化融合蛋白。在25mM Tris和250mMNaCl(pH 8.0)中以大约4.0mg/mL调配经过纯化的T毒素和Q毒素，并且将其在<-60℃下储存。经过纯化的T毒素和Q毒素的回收率分别为267mg/L和154mg/L。T毒素和Q毒素分别在分子量为205kDa和268kDa的SDS-PAGE凝胶中迁移，并且纯度>90％(图23A)。利用毒素特异性抗体的蛋白质印迹分析证实了每种融合蛋白中CDTb、TcdB和TcdA的表达(图23B-D)。

实例9

T毒素融合蛋白和Q毒素融合蛋白在小鼠体内的免疫原性

为了评估T毒素融合蛋白和Q毒素融合蛋白的免疫原性，根据Noble LifeSciences的实验动物使用与管理委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)批准的方案进行小鼠研究。在第0天和第14天用与50μg氢氧化铝(alum)一起调配的T毒素(30μg或100μg)或Q毒素(100μg)或PBS(对照)对雌性C57BL/6只小鼠(6-8周龄)进行IM免疫。在第二次给药后18天收集血清。在第二次免疫后3周，用100％最小致死剂量(MLD_100％)的TcdA、TcdB₍₀₀₃₎或CDTa和CDTb对小鼠进行腹腔内(IP)攻击。

通过ELISA评估小鼠血清的毒素抗体。在2-8℃下用每种毒素(2μg/mL)涂覆96孔的MaxiSorp微量滴定板(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))过夜。将血清的五倍连续稀释液一式两份地加入到板中。用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(SouthernBiotech)检测结合的抗体。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(西格玛公司(Sigma))，并且用TMB终止缓冲液(Scytek Laboratories)来终止反应。用SpectraMax Plus读板仪(美谷分子仪器公司(Molecular Devices))在450nm下对板进行读取；使用SoftMaxPro软件对结果进行分析。将滴度报告为产生最大OD_450nm的50％的读数的倒数稀释度。为记录为低于检测下限(LLOD)的滴度值指定滴度50以计算GMT。免疫后的小鼠血清IgG滴度对TcdA、TcdB和CDT而言较高，并且在T毒素与Q毒素之间相当(图25A)。

将Vero细胞(CCL-81，ATCC)保持在补充有20％热灭活的胎牛血清(FBS)和抗生素(Gibco)的DMEM中。在96孔的平底组织培养板(赛默飞世尔科技公司)中制备小鼠血清的两倍连续稀释液。将含有2x最小细胞毒性剂量的TcdA、TcdB或CDT的等体积(50μL)的测定培养基(具有5％热灭活FBS、1x NEAA、0.3％右旋糖、1x青霉素/链霉素/谷氨酰胺、0.006％酚红的1x DMEM)加入到经稀释的血清中，并且在37℃下温育1小时。加入悬浮于50μL培养基和150μL无菌矿物油(西格玛公司)中的Vero细胞(7.5x 10⁴个细胞/毫升)，并且将板在37℃下温育6-7天。温育后，观察到板的颜色良好。培养基和毒素处理的对照孔呈红色/淡粉红；细胞对照孔呈黄色/黄橙色。对于每次样品稀释，将呈黄色/黄橙色的最后一个孔记录为终点中和抗体滴度。为记录为<LLOD的滴定值指定值5以计算GMT。所述三种毒素中的每种毒素的毒素中和抗体(TNA)滴度在T毒素融合蛋白与Q毒素融合蛋白之间相当(图25B)。

第二次免疫后三周，用TcdB₍₀₀₃₎攻击小鼠。用Q毒素接种的组的存活率为80％(p＝0.0043)，而T毒素组中有65％(p＝0.018)在攻击中存活。相比而言，对照组中仅20％在毒素攻击中存活(图25C)。

实例10

T毒素融合蛋白和Q毒素融合蛋白在仓鼠体内的免疫原性

5-7周龄且70到100克的雄性金色叙利亚仓鼠(HsdHan:Aura；HarlanLaboratories)每隔3周接受3次用30μg Q毒素和120μg alum或PBS(对照)(在交替的腿中IM施用)进行的免疫。在第三次免疫后两周收集血清，并且用10mg/kg克林霉素IP对动物进行处理。一天后，用菌株630或NAP1通过强饲法攻击动物并且观察8天。

通过ELISA评估仓鼠血清的毒素抗体。在2-8℃下用每种毒素(2μg/mL)涂覆96孔的MaxiSorp微量滴定板(赛默飞世尔科技公司)过夜。将血清的五倍连续稀释液一式两份地加入到板中。用辣根过氧化物酶缀合的兔抗仓鼠IgG(Southern Biotech)检测结合的抗体。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(西格玛公司)，并且用TMB终止缓冲液(ScytekLaboratories)来终止反应。用SpectraMax Plus读板仪(美谷分子仪器公司(MolecularDevices))在450nm下对板进行读取；使用SoftMax Pro软件对结果进行分析。将滴度报告为产生最大OD_450nm的50％的读数的倒数稀释度。为记录为低于检测下限(LLOD)的滴度值指定滴度50以计算GMT。以3周的间隔用Q毒素免疫三次的仓鼠对TcdA毒素、TcdB毒素和CDTb毒素产生高IgG滴度(图26A)。

将Vero细胞(CCL-81，ATCC)保持在补充有20％热灭活的胎牛血清(FBS)和抗生素(Gibco)的DMEM中。在96孔的平底组织培养板(赛默飞世尔科技公司)中制备仓鼠血清的两倍连续稀释液。将含有2x最小细胞毒性剂量的TcdA、TcdB或CDT的等体积(50μL)的测定培养基(具有5％热灭活FBS、1x NEAA、0.3％右旋糖、1x青霉素/链霉素/谷氨酰胺、0.006％酚红的1x DMEM)加入到经稀释的血清中，并且在37℃下温育1小时。加入悬浮于50μL培养基和150μL无菌矿物油(西格玛公司)中的Vero细胞(7.5x 10⁴个细胞/毫升)，并且将板在37℃下温育6-7天。温育后，观察到板的颜色良好。培养基和毒素处理的对照孔呈红色/淡粉红；细胞对照孔呈黄色/黄橙色。对于每次样品稀释，将呈黄色/黄橙色的最后一个孔记录为终点中和抗体滴度。为记录为<LLOD的滴定值指定值5以计算GMT。所述三种毒素中的每种毒素的TNA滴度在T毒素融合蛋白与Q毒素融合蛋白之间相当(图31B)。

克林霉素处理后，用艰难梭菌菌株630感染的动物的存活率为90％(图26C)，而用NAP1感染的动物的存活率为75％(图31D)。安慰剂组中的所有动物在用任一菌株感染后48-72小时内死亡。

通过引用并入

本文所确定的专利和公开申请中的每一个出于所有目的并入本文。

序列表

<110> 诺瓦瓦克斯股份有限公司

Tian, Jing-Hui

Liu, Ye

Smith, Gale

Glenn, Gregory

Flyer, David

<120> 用于诱导针对艰难梭菌的免疫应答的方法和组合物

<130> NOVV-058/02WO

<150> US 62/474,434

<151> 2017-03-21

<150> US 62/471,636

<151> 2017-03-16

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1813

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三重毒素疫苗BV1470

<220>

<221> misc_feature

<222> (588)..(588)

<223> Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400> 1

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp Ala Ser Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser

835 840 845

Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val

850 855 860

Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala

865 870 875 880

Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn

885 890 895

Gln Ser Gly Val Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe

900 905 910

Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu

915 920 925

Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr

930 935 940

Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

945 950 955 960

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu

965 970 975

Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met

980 985 990

Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp

995 1000 1005

Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His

1010 1015 1020

Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn

1025 1030 1035

Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu

1040 1045 1050

Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn

1055 1060 1065

Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val

1070 1075 1080

Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp

1085 1090 1095

Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp

1100 1105 1110

Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln Val Gly Phe

1115 1120 1125

Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile

1130 1135 1140

Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr Ile

1145 1150 1155

Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

1160 1165 1170

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile

1175 1180 1185

Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu

1190 1195 1200

Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp

1205 1210 1215

Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro

1220 1225 1230

Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile

1235 1240 1245

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile

1250 1255 1260

Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met

1265 1270 1275

Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly

1280 1285 1290

Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly

1295 1300 1305

Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu

1310 1315 1320

Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys

1325 1330 1335

Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val

1340 1345 1350

Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln

1355 1360 1365

Leu Val Ile Ser Glu Ser Arg Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly

1370 1375 1380

Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn

1385 1390 1395

Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr

1400 1405 1410

Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val

1415 1420 1425

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu

1430 1435 1440

Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys

1445 1450 1455

Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp

1460 1465 1470

Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe

1475 1480 1485

Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

1490 1495 1500

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

1505 1510 1515

Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn

1520 1525 1530

Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu

1535 1540 1545

Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr

1550 1555 1560

Gly Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

1565 1570 1575

Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys

1580 1585 1590

Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr

1595 1600 1605

Ile Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met

1610 1615 1620

Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1625 1630 1635

Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg

1640 1645 1650

Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe

1655 1660 1665

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly

1670 1675 1680

Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly

1685 1690 1695

Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu

1700 1705 1710

Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe

1715 1720 1725

Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

1730 1735 1740

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr

1745 1750 1755

Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn

1760 1765 1770

Gly Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala

1775 1780 1785

Gly Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val

1790 1795 1800

Asp Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

1805 1810

<210> 2

<211> 835

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (588)..(588)

<223> Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400> 2

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp

835

<210> 3

<211> 536

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 3

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

20 25 30

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu

50 55 60

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro

65 70 75 80

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

85 90 95

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe

115 120 125

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

130 135 140

Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr

195 200 205

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

225 230 235 240

Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

245 250 255

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

275 280 285

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

290 295 300

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

305 310 315 320

Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

325 330 335

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

340 345 350

Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val

355 360 365

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

370 375 380

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

385 390 395 400

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn

420 425 430

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

450 455 460

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

465 470 475 480

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

500 505 510

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

515 520 525

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

530 535

<210> 4

<211> 438

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 4

Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr

20 25 30

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

35 40 45

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

50 55 60

Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

65 70 75 80

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr

85 90 95

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

100 105 110

Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

115 120 125

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

130 135 140

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu

145 150 155 160

Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

180 185 190

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

195 200 205

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe

225 230 235 240

Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

245 250 255

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

260 265 270

Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp

275 280 285

Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val

290 295 300

Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly

305 310 315 320

Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

370 375 380

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

405 410 415

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

420 425 430

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

435

<210> 5

<211> 5442

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 三重毒素疫苗BV1470

<220>

<221> misc_feature

<222> (1763)..(1763)

<223> n是a、c、g或t

<400> 5

atggaaatcg tcaacgaaga catcctgccg aacaacggtt tgatgggcta ctacttcacc 60

gatgagcact tcaaggacct gaagctcatg gctcctatca aggacggaaa cctgaagttc 120

gaggaaaaga aggtcgataa gctgctcgac aaggataaga gcgacgttaa gtcaatcagg 180

tggaccggca gaatcatccc atccaaggat ggagagtaca ctctctctac agaccgtgac 240

gatgtcttga tgcaggtgaa caccgaatcg actatctcca acactctgaa ggtgaacatg 300

aagaagggaa aggagtacaa ggtgcgcatc gaactgcaag ataagaacct cggttctatc 360

gacaacctct cctctccaaa cctctactgg gagttggatg gcatgaagaa gatcatcccg 420

gaggaaaact tgttcctgcg tgactacagc aacatcgaaa aggacgatcc cttcatccct 480

aacaacaact tcttcgatcc caagctgatg tctgactggg aggacgaaga tctcgacacc 540

gataacgaca acatccctga cagctacgag cgcaacggat acactatcaa ggatctcatc 600

gctgtgaagt gggaggactc cttcgccgaa cagggttaca agaagtacgt ctcaaactac 660

ttggagtcga acacagctgg tgacccctac accgactacg aaaaggcctc cggctctttc 720

gataaggcta tcaagaccga ggctagggac ccactcgtcg ctgcttaccc catcgtggga 780

gtcggtatgg agaagttgat catcagcact aacgaacacg cttcaactga ccagggcaag 840

acagtttcaa gagccaccac taactcgaag accgagtcca acactgctgg cgtttccgtg 900

aacgtcggct accagaacgg attcaccgcc aacgttacaa ccaactactc gcacactaca 960

gataactcca ccgctgtgca agactctaac ggagagagct ggaacactgg tctgtctatc 1020

aacaagggcg aaagcgctta catcaacgcc aacgtccgct actacaacac tggcacagcc 1080

cccatgtaca aggtgacccc taccactaac ctcgtcttgg atggagacac actgtctacc 1140

atcaaggctc aggagaacca aatcggaaac aacctcagcc ccggtgacac ataccctaag 1200

aagggattgt caccactggc cctcaacact atggaccagt tcagctcaag gttgatcccg 1260

atcaactacg atcaactcaa gaagttggac gctggcaagc agatcaagct ggagacaacc 1320

caagtctccg gtaacttcgg caccaagaac tcgtccggcc agatcgttac tgaaggaaac 1380

agctggtcag attacatctc acaaatcgac tcgatctccg cctctatcat cctggacaca 1440

gagaacgaat cctacgagcg tcgcgtgacc gctaagaact tgcaggaccc cgaggacaag 1500

acaccggaac tgaccatcgg cgaggccatc gaaaaggctt tcggtgccac caagaaggac 1560

ggcttgctgt acttcaacga tatccctatc gacgagtcct gcgttgaact gatcttcgac 1620

gataacactg ctaacaagat caaggattcc ctgaagacac tctctgacaa gaagatctac 1680

aacgtgaagc tcgagagggg tatgaacatc ttgatcaaga cccccactta cttcacaaac 1740

ttcgacgatt acaacaacta ccnttctacc tggagcaacg tcaacactac aaaccaggac 1800

ggactgcaag gttcggccaa caagctcaac ggcgagacca agatcaagat cccaatgagc 1860

gaactgaagc cgtacaagag atacgtgttc tcaggctact cgaaggaccc actcactagc 1920

aactcaatca tcgtgaagat caaggctaag gaggaaaaga ccgactacct ggtccccgag 1980

cagggctaca ctaagttctc ttacgagttc gaaaccactg agaaggactc tagcaacatc 2040

gaaatcaccc tcatcggcag cggaacaacc tacttggaca acctgtcaat caccgagttg 2100

aactcgactc ccgaaatcct ggacgagccc gaagtcaaga tccctaccga tcaggagatc 2160

atggacgctc acaagatcta cttcgccgac ctgaacttca acccctctac tggaaacaca 2220

tacatcaacg gcatgtactt cgctcctaca caaaccaaca aggaggccct ggactacatc 2280

cagaagtacc gtgtcgaagc cactctccaa tactccggtt tcaaggatat cggcacaaag 2340

gacaaggaga tgaggaacta cttgggtgac ccaaaccagc cgaagaccaa ctacgtgaac 2400

ctgagatcat acttcactgg tggcgagaac atcatgacat acaagaagct gcgtatctac 2460

gctatcaccc ctgacgaccg tgaactcttg gttttgtccg tggacgctag catggtcagc 2520

ggtctcatct acatcaacga ctcgttgtac tacttcaagc cccctgtgaa caacctgatc 2580

acaggtttcg ttaccgtggg cgacgataag tactacttca acccaatcaa cggtggcgct 2640

gcctccatcg gcgagaccat catcgacgat aagaactact acttcaacca gagcggagtt 2700

ctccaaactg gtgtgttctc aacagaggac ggtttcaagt acttcgctcc ggccaacacc 2760

ttggacgaaa acctggaggg tgaagccatc gacttcactg gcaagttgat catcgatgag 2820

aacatctact acttcgacga taactaccgc ggtgctgtgg agtggaagga actcgacggc 2880

gagatgcact acttctctcc agaaaccggc aaggccttca agggattgaa ccagatcggt 2940

gactacaagt actacttcaa ctcggatggc gtgatgcaaa agggattcgt ctccatcaac 3000

gacaacaagc actacttcga cgattccggt gttatgaaag tgggctacac agagatcgac 3060

ggcaagcact tctacttcgc tgagaacgga gaaatgcaga tcggtgtctt caacactgaa 3120

gatggtttca agtacttcgc ccaccacaac gaagatttgg gcaacgagga aggagaggaa 3180

atcagctact caggcatcct gaacttcaac aacaagatct actacttcga tgactctttc 3240

accgctgtgg tcggatggaa ggacctggag gatggtagca agtactactt cgacgaggat 3300

actgctgaag cctacatcgg cctgtcgctc atcaacgacg gacagtacta cttcaacgac 3360

gatggcatca tgcaagtcgg attcgttacc atcaacgaca aggtgttcta cttctcggat 3420

tccggtatca tcgagtctgg cgtccagaac atcgacgata actacttcta catcgacgat 3480

aacggaatcg tgcaaatcgg tgtcttcgac acaagcgatg gctacaagta cttcgctccc 3540

gccaacaccg tgaacgacaa catctacgga caggctgtgg agtactcagg cctggtccgt 3600

gttggagaag acgtgtacta cttcggcgag acctacacta tcgaaactgg atggatctac 3660

gacatggaga acgaatctga caagtactac ttcaaccctg agacaaagaa ggcctgcaag 3720

ggtatcaacc tgatcgacga tatcaagtac tacttcgatg aaaagggtat catgcgcacc 3780

ggcctcatct cattcgaaaa caacaactac tacttcaacg agaacggaga aatgcaattc 3840

ggttacatca acatcgagga caagatgttc tacttcggag aagatggtgt catgcagatc 3900

ggtgttttca acactccaga cggcttcaag tacttcgctc accaaaacac actcgacgag 3960

aacttcgagg gagaatccat caactacact ggttggttgg acctggatga gaagaggtac 4020

tacttcaccg acgaatacat cgctgccact ggctccgtca tcatcgacgg agaggaatac 4080

tacttcgacc cggatacagc ccagctggtc atctctgaat ctagaatggt gaccggtgtc 4140

ttcaagggtc ccaacggctt cgagtacttc gctcccgcca acactcacaa caacaacatc 4200

gaaggtcaag ctatcgtcta ccaaaacaag ttcttgaccc tgaacggcaa gaagtattat 4260

tttgacaacg attctaaggc cgttactggc tggcaaacaa tcgacggaaa gaagtattat 4320

ttcaatctga acactgccga ggctgccacc ggttggcaga ctatcgatgg caagaagtac 4380

tactttaacc tcaacactgc cgaagctgcc acaggatggc aaaccatcga cggcaagaag 4440

tactatttta acacaaacac cttcatcgct tctactggct acacaagcat caacggaaag 4500

catttttatt tcaacaccga tggaatcatg cagatcggtg tgttcaaggg accaaacggt 4560

ttcgaatact tcgctccggc taacacagac gctaacaaca tcgagggcca ggctatcttg 4620

taccaaaaca agttcctcac tttgaacggc aagaagtact attttggctc tgacagcaag 4680

gccgtcactg gactgaggac aatcgatggc aagaagtact actttaatac taacacagcc 4740

gttgctgtga ccggctggca gactatcaac ggaaagaagt attatttcaa taccaacact 4800

tcaatcgctt cgaccggtta cactatcatc tctggcaagc atttttattt taacaccgac 4860

ggcatcatgc aaatcggtgt cttcaagggc cccgatggct tcgaatactt cgcccccgct 4920

aacactgatg ctaacaacat cgagggacag gctatccgtt accaaaaccg cttcctgtac 4980

ctccacgaca acatctacta cttcggcaac aactcaaagg ctgccacagg atgggtgacc 5040

atcgatggta accgttacta cttcgagccc aacactgcca tgggtgctaa cggctacaag 5100

acaatcgaca acaagaactt ctacttccgc aacggtctcc cacagatcgg cgtcttcaag 5160

ggatcaaacg gtttcgagta cttcgctcct gccaacaccg acgccaacaa catcgagggc 5220

caagctatca ggtaccaaaa cagattcctg cacctgctcg gcaagatcta ctacttcgga 5280

aacaactcga aggccgttac tggttggcag acaatcaacg gcaaggtgta ctacttcatg 5340

ccagacaccg ctatggctgc cgctggtggc ctcttcgaaa tcgacggcgt gatctacttc 5400

ttcggcgttg atggagtgaa ggctccgggt atctacggct aa 5442

<210> 6

<211> 2505

<212> DNA

<213> 艰难梭菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (1763)..(1763)

<223> n是a、c、g或t

<400> 6

atggaaatcg tcaacgaaga catcctgccg aacaacggtt tgatgggcta ctacttcacc 60

gatgagcact tcaaggacct gaagctcatg gctcctatca aggacggaaa cctgaagttc 120

gaggaaaaga aggtcgataa gctgctcgac aaggataaga gcgacgttaa gtcaatcagg 180

tggaccggca gaatcatccc atccaaggat ggagagtaca ctctctctac agaccgtgac 240

gatgtcttga tgcaggtgaa caccgaatcg actatctcca acactctgaa ggtgaacatg 300

aagaagggaa aggagtacaa ggtgcgcatc gaactgcaag ataagaacct cggttctatc 360

gacaacctct cctctccaaa cctctactgg gagttggatg gcatgaagaa gatcatcccg 420

gaggaaaact tgttcctgcg tgactacagc aacatcgaaa aggacgatcc cttcatccct 480

aacaacaact tcttcgatcc caagctgatg tctgactggg aggacgaaga tctcgacacc 540

gataacgaca acatccctga cagctacgag cgcaacggat acactatcaa ggatctcatc 600

gctgtgaagt gggaggactc cttcgccgaa cagggttaca agaagtacgt ctcaaactac 660

ttggagtcga acacagctgg tgacccctac accgactacg aaaaggcctc cggctctttc 720

gataaggcta tcaagaccga ggctagggac ccactcgtcg ctgcttaccc catcgtggga 780

gtcggtatgg agaagttgat catcagcact aacgaacacg cttcaactga ccagggcaag 840

acagtttcaa gagccaccac taactcgaag accgagtcca acactgctgg cgtttccgtg 900

aacgtcggct accagaacgg attcaccgcc aacgttacaa ccaactactc gcacactaca 960

gataactcca ccgctgtgca agactctaac ggagagagct ggaacactgg tctgtctatc 1020

aacaagggcg aaagcgctta catcaacgcc aacgtccgct actacaacac tggcacagcc 1080

cccatgtaca aggtgacccc taccactaac ctcgtcttgg atggagacac actgtctacc 1140

atcaaggctc aggagaacca aatcggaaac aacctcagcc ccggtgacac ataccctaag 1200

aagggattgt caccactggc cctcaacact atggaccagt tcagctcaag gttgatcccg 1260

atcaactacg atcaactcaa gaagttggac gctggcaagc agatcaagct ggagacaacc 1320

caagtctccg gtaacttcgg caccaagaac tcgtccggcc agatcgttac tgaaggaaac 1380

agctggtcag attacatctc acaaatcgac tcgatctccg cctctatcat cctggacaca 1440

gagaacgaat cctacgagcg tcgcgtgacc gctaagaact tgcaggaccc cgaggacaag 1500

acaccggaac tgaccatcgg cgaggccatc gaaaaggctt tcggtgccac caagaaggac 1560

ggcttgctgt acttcaacga tatccctatc gacgagtcct gcgttgaact gatcttcgac 1620

gataacactg ctaacaagat caaggattcc ctgaagacac tctctgacaa gaagatctac 1680

aacgtgaagc tcgagagggg tatgaacatc ttgatcaaga cccccactta cttcacaaac 1740

ttcgacgatt acaacaacta ccnttctacc tggagcaacg tcaacactac aaaccaggac 1800

ggactgcaag gttcggccaa caagctcaac ggcgagacca agatcaagat cccaatgagc 1860

gaactgaagc cgtacaagag atacgtgttc tcaggctact cgaaggaccc actcactagc 1920

aactcaatca tcgtgaagat caaggctaag gaggaaaaga ccgactacct ggtccccgag 1980

cagggctaca ctaagttctc ttacgagttc gaaaccactg agaaggactc tagcaacatc 2040

gaaatcaccc tcatcggcag cggaacaacc tacttggaca acctgtcaat caccgagttg 2100

aactcgactc ccgaaatcct ggacgagccc gaagtcaaga tccctaccga tcaggagatc 2160

atggacgctc acaagatcta cttcgccgac ctgaacttca acccctctac tggaaacaca 2220

tacatcaacg gcatgtactt cgctcctaca caaaccaaca aggaggccct ggactacatc 2280

cagaagtacc gtgtcgaagc cactctccaa tactccggtt tcaaggatat cggcacaaag 2340

gacaaggaga tgaggaacta cttgggtgac ccaaaccagc cgaagaccaa ctacgtgaac 2400

ctgagatcat acttcactgg tggcgagaac atcatgacat acaagaagct gcgtatctac 2460

gctatcaccc ctgacgaccg tgaactcttg gttttgtccg tggac 2505

<210> 7

<211> 1608

<212> DNA

<213> 艰难梭菌

<400> 7

atggtcagcg gtctcatcta catcaacgac tcgttgtact acttcaagcc ccctgtgaac 60

aacctgatca caggtttcgt taccgtgggc gacgataagt actacttcaa cccaatcaac 120

ggtggcgctg cctccatcgg cgagaccatc atcgacgata agaactacta cttcaaccag 180

agcggagttc tccaaactgg tgtgttctca acagaggacg gtttcaagta cttcgctccg 240

gccaacacct tggacgaaaa cctggagggt gaagccatcg acttcactgg caagttgatc 300

atcgatgaga acatctacta cttcgacgat aactaccgcg gtgctgtgga gtggaaggaa 360

ctcgacggcg agatgcacta cttctctcca gaaaccggca aggccttcaa gggattgaac 420

cagatcggtg actacaagta ctacttcaac tcggatggcg tgatgcaaaa gggattcgtc 480

tccatcaacg acaacaagca ctacttcgac gattccggtg ttatgaaagt gggctacaca 540

gagatcgacg gcaagcactt ctacttcgct gagaacggag aaatgcagat cggtgtcttc 600

aacactgaag atggtttcaa gtacttcgcc caccacaacg aagatttggg caacgaggaa 660

ggagaggaaa tcagctactc aggcatcctg aacttcaaca acaagatcta ctacttcgat 720

gactctttca ccgctgtggt cggatggaag gacctggagg atggtagcaa gtactacttc 780

gacgaggata ctgctgaagc ctacatcggc ctgtcgctca tcaacgacgg acagtactac 840

ttcaacgacg atggcatcat gcaagtcgga ttcgttacca tcaacgacaa ggtgttctac 900

ttctcggatt ccggtatcat cgagtctggc gtccagaaca tcgacgataa ctacttctac 960

atcgacgata acggaatcgt gcaaatcggt gtcttcgaca caagcgatgg ctacaagtac 1020

ttcgctcccg ccaacaccgt gaacgacaac atctacggac aggctgtgga gtactcaggc 1080

ctggtccgtg ttggagaaga cgtgtactac ttcggcgaga cctacactat cgaaactgga 1140

tggatctacg acatggagaa cgaatctgac aagtactact tcaaccctga gacaaagaag 1200

gcctgcaagg gtatcaacct gatcgacgat atcaagtact acttcgatga aaagggtatc 1260

atgcgcaccg gcctcatctc attcgaaaac aacaactact acttcaacga gaacggagaa 1320

atgcaattcg gttacatcaa catcgaggac aagatgttct acttcggaga agatggtgtc 1380

atgcagatcg gtgttttcaa cactccagac ggcttcaagt acttcgctca ccaaaacaca 1440

ctcgacgaga acttcgaggg agaatccatc aactacactg gttggttgga cctggatgag 1500

aagaggtact acttcaccga cgaatacatc gctgccactg gctccgtcat catcgacgga 1560

gaggaatact acttcgaccc ggatacagcc cagctggtca tctctgaa 1608

<210> 8

<211> 1317

<212> DNA

<213> 艰难梭菌

<400> 8

atggtgaccg gtgtcttcaa gggtcccaac ggcttcgagt acttcgctcc cgccaacact 60

cacaacaaca acatcgaagg tcaagctatc gtctaccaaa acaagttctt gaccctgaac 120

ggcaagaagt attattttga caacgattct aaggccgtta ctggctggca aacaatcgac 180

ggaaagaagt attatttcaa tctgaacact gccgaggctg ccaccggttg gcagactatc 240

gatggcaaga agtactactt taacctcaac actgccgaag ctgccacagg atggcaaacc 300

atcgacggca agaagtacta ttttaacaca aacaccttca tcgcttctac tggctacaca 360

agcatcaacg gaaagcattt ttatttcaac accgatggaa tcatgcagat cggtgtgttc 420

aagggaccaa acggtttcga atacttcgct ccggctaaca cagacgctaa caacatcgag 480

ggccaggcta tcttgtacca aaacaagttc ctcactttga acggcaagaa gtactatttt 540

ggctctgaca gcaaggccgt cactggactg aggacaatcg atggcaagaa gtactacttt 600

aatactaaca cagccgttgc tgtgaccggc tggcagacta tcaacggaaa gaagtattat 660

ttcaatacca acacttcaat cgcttcgacc ggttacacta tcatctctgg caagcatttt 720

tattttaaca ccgacggcat catgcaaatc ggtgtcttca agggccccga tggcttcgaa 780

tacttcgccc ccgctaacac tgatgctaac aacatcgagg gacaggctat ccgttaccaa 840

aaccgcttcc tgtacctcca cgacaacatc tactacttcg gcaacaactc aaaggctgcc 900

acaggatggg tgaccatcga tggtaaccgt tactacttcg agcccaacac tgccatgggt 960

gctaacggct acaagacaat cgacaacaag aacttctact tccgcaacgg tctcccacag 1020

atcggcgtct tcaagggatc aaacggtttc gagtacttcg ctcctgccaa caccgacgcc 1080

aacaacatcg agggccaagc tatcaggtac caaaacagat tcctgcacct gctcggcaag 1140

atctactact tcggaaacaa ctcgaaggcc gttactggtt ggcagacaat caacggcaag 1200

gtgtactact tcatgccaga caccgctatg gctgccgctg gtggcctctt cgaaatcgac 1260

ggcgtgatct acttcttcgg cgttgatgga gtgaaggctc cgggtatcta cggctaa 1317

<210> 9

<211> 1820

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三重毒素疫苗BV1420

<220>

<221> misc_feature

<222> (595)..(595)

<223> Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400> 9

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Arg Ala Arg Arg Arg Lys Lys

165 170 175

Arg Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn

180 185 190

Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile

195 200 205

Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr

210 215 220

Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Asp Tyr

225 230 235 240

Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg

245 250 255

Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys

260 265 270

Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr

275 280 285

Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly

290 295 300

Val Ser Val Asn Val Gly Tyr Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr

305 310 315 320

Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser

325 330 335

Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser

340 345 350

Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro

355 360 365

Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr

370 375 380

Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser

385 390 395 400

Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn

405 410 415

Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln

420 425 430

Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln

435 440 445

Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr

450 455 460

Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser

465 470 475 480

Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val

485 490 495

Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr

500 505 510

Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly

515 520 525

Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu

530 535 540

Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr

545 550 555 560

Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn

565 570 575

Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn

580 585 590

Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly

595 600 605

Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile

610 615 620

Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr

625 630 635 640

Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala

645 650 655

Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys

660 665 670

Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu

675 680 685

Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile

690 695 700

Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys

705 710 715 720

Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala

725 730 735

Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met

740 745 750

Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln

755 760 765

Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile

770 775 780

Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln

785 790 795 800

Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu

805 810 815

Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp

820 825 830

Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu Ser Val Asp Ala Ser Met Val Ser Gly

835 840 845

Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro Val Asn

850 855 860

Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe

865 870 875 880

Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp

885 890 895

Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu Gln Thr Gly Val

900 905 910

Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu

915 920 925

Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile

930 935 940

Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val

945 950 955 960

Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr

965 970 975

Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr

980 985 990

Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp

995 1000 1005

Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr

1010 1015 1020

Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu

1025 1030 1035

Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1040 1045 1050

Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

1055 1060 1065

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe

1070 1075 1080

Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp

1085 1090 1095

Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile

1100 1105 1110

Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp

1115 1120 1125

Gly Ile Met Gln Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe

1130 1135 1140

Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile

1145 1150 1155

Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile

1160 1165 1170

Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala

1175 1180 1185

Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser

1190 1195 1200

Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr

1205 1210 1215

Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser

1220 1225 1230

Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly

1235 1240 1245

Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly

1250 1255 1260

Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr

1265 1270 1275

Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu

1280 1285 1290

Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

1295 1300 1305

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn

1310 1315 1320

Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly

1325 1330 1335

Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr

1340 1345 1350

Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr

1355 1360 1365

Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu Ser Arg Met

1370 1375 1380

Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1385 1390 1395

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val

1400 1405 1410

Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

1415 1420 1425

Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly

1430 1435 1440

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly

1445 1450 1455

Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr

1460 1465 1470

Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

1475 1480 1485

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser

1490 1495 1500

Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln

1505 1510 1515

Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro

1520 1525 1530

Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr

1535 1540 1545

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly

1550 1555 1560

Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys

1565 1570 1575

Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Trp

1580 1585 1590

Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ser

1595 1600 1605

Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr

1610 1615 1620

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

1625 1630 1635

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn

1640 1645 1650

Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu

1655 1660 1665

His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr

1670 1675 1680

Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn

1685 1690 1695

Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn

1700 1705 1710

Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly

1715 1720 1725

Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn

1730 1735 1740

Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His

1745 1750 1755

Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val

1760 1765 1770

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro

1775 1780 1785

Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly

1790 1795 1800

Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile

1805 1810 1815

Tyr Gly

1820

<210> 10

<211> 842

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (595)..(595)

<223> Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400> 10

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Arg Ala Arg Arg Arg Lys Lys

165 170 175

Arg Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn

180 185 190

Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile

195 200 205

Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr

210 215 220

Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Asp Tyr

225 230 235 240

Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg

245 250 255

Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys

260 265 270

Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr

275 280 285

Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly

290 295 300

Val Ser Val Asn Val Gly Tyr Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr

305 310 315 320

Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser

325 330 335

Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser

340 345 350

Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro

355 360 365

Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr

370 375 380

Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser

385 390 395 400

Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn

405 410 415

Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln

420 425 430

Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln

435 440 445

Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr

450 455 460

Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser

465 470 475 480

Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val

485 490 495

Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr

500 505 510

Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly

515 520 525

Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu

530 535 540

Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr

545 550 555 560

Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn

565 570 575

Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn

580 585 590

Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly

595 600 605

Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile

610 615 620

Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr

625 630 635 640

Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala

645 650 655

Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys

660 665 670

Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu

675 680 685

Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile

690 695 700

Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys

705 710 715 720

Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala

725 730 735

Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met

740 745 750

Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln

755 760 765

Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile

770 775 780

Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln

785 790 795 800

Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu

805 810 815

Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp

820 825 830

Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu Ser Val Asp

835 840

<210> 11

<211> 536

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 11

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

20 25 30

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu

50 55 60

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro

65 70 75 80

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

85 90 95

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe

115 120 125

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

130 135 140

Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr

195 200 205

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

225 230 235 240

Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

245 250 255

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

275 280 285

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

290 295 300

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

305 310 315 320

Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

325 330 335

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

340 345 350

Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val

355 360 365

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

370 375 380

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

385 390 395 400

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn

420 425 430

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

450 455 460

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

465 470 475 480

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

500 505 510

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

515 520 525

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

530 535

<210> 12

<211> 438

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 12

Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr

20 25 30

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

35 40 45

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

50 55 60

Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

65 70 75 80

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr

85 90 95

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

100 105 110

Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

115 120 125

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

130 135 140

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu

145 150 155 160

Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

180 185 190

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

195 200 205

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe

225 230 235 240

Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

245 250 255

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

260 265 270

Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp

275 280 285

Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val

290 295 300

Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly

305 310 315 320

Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

370 375 380

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

405 410 415

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

420 425 430

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

435

<210> 13

<211> 5466

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 三重毒素疫苗BV1470

<220>

<221> misc_feature

<222> (1787)..(1787)

<223> n是a、c、g或t

<400> 13

atggaaatcg tcaacgaaga catcctgccg aacaacggtt tgatgggcta ctacttcacc 60

gatgagcact tcaaggacct gaagctcatg gctcctatca aggacggaaa cctgaagttc 120

gaggaaaaga aggtcgataa gctgctcgac aaggataaga gcgacgttaa gtcaatcagg 180

tggaccggca gaatcatccc atccaaggat ggagagtaca ctctctctac agaccgtgac 240

gatgtcttga tgcaggtgaa caccgaatcg actatctcca acactctgaa ggtgaacatg 300

aagaagggaa aggagtacaa ggtgcgcatc gaactgcaag ataagaacct cggttctatc 360

gacaacctct cctctccaaa cctctactgg gagttggatg gcatgaagaa gatcatcccg 420

gaggaaaact tgttcctgcg tgactacagc aacatcgaaa aggacgatcc cttcatccct 480

aacaacaact tcttcgatcc caagctgcgc gctcgccgcc gcaagaagcg catgtctgac 540

tgggaggacg aagatctcga caccgataac gacaacatcc ctgacagcta cgagcgcaac 600

ggatacacta tcaaggatct catcgctgtg aagtgggagg actccttcgc cgaacagggt 660

tacaagaagt acgtctcaaa ctacttggag tcgaacacag ctggtgaccc ctacaccgac 720

tacgaaaagg cctccggctc tttcgataag gctatcaaga ccgaggctag ggacccactc 780

gtcgctgctt accccatcgt gggagtcggt atggagaagt tgatcatcag cactaacgaa 840

cacgcttcaa ctgaccaggg caagacagtt tcaagagcca ccactaactc gaagaccgag 900

tccaacactg ctggcgtttc cgtgaacgtc ggctaccaga acggattcac cgccaacgtt 960

acaaccaact actcgcacac tacagataac tccaccgctg tgcaagactc taacggagag 1020

agctggaaca ctggtctgtc tatcaacaag ggcgaaagcg cttacatcaa cgccaacgtc 1080

cgctactaca acactggcac agcccccatg tacaaggtga cccctaccac taacctcgtc 1140

ttggatggag acacactgtc taccatcaag gctcaggaga accaaatcgg aaacaacctc 1200

agccccggtg acacataccc taagaaggga ttgtcaccac tggccctcaa cactatggac 1260

cagttcagct caaggttgat cccgatcaac tacgatcaac tcaagaagtt ggacgctggc 1320

aagcagatca agctggagac aacccaagtc tccggtaact tcggcaccaa gaactcgtcc 1380

ggccagatcg ttactgaagg aaacagctgg tcagattaca tctcacaaat cgactcgatc 1440

tccgcctcta tcatcctgga cacagagaac gaatcctacg agcgtcgcgt gaccgctaag 1500

aacttgcagg accccgagga caagacaccg gaactgacca tcggcgaggc catcgaaaag 1560

gctttcggtg ccaccaagaa ggacggcttg ctgtacttca acgatatccc tatcgacgag 1620

tcctgcgttg aactgatctt cgacgataac actgctaaca agatcaagga ttccctgaag 1680

acactctctg acaagaagat ctacaacgtg aagctcgaga ggggtatgaa catcttgatc 1740

aagaccccca cttacttcac aaacttcgac gattacaaca actaccnttc tacctggagc 1800

aacgtcaaca ctacaaacca ggacggactg caaggttcgg ccaacaagct caacggcgag 1860

accaagatca agatcccaat gagcgaactg aagccgtaca agagatacgt gttctcaggc 1920

tactcgaagg acccactcac tagcaactca atcatcgtga agatcaaggc taaggaggaa 1980

aagaccgact acctggtccc cgagcagggc tacactaagt tctcttacga gttcgaaacc 2040

actgagaagg actctagcaa catcgaaatc accctcatcg gcagcggaac aacctacttg 2100

gacaacctgt caatcaccga gttgaactcg actcccgaaa tcctggacga gcccgaagtc 2160

aagatcccta ccgatcagga gatcatggac gctcacaaga tctacttcgc cgacctgaac 2220

ttcaacccct ctactggaaa cacatacatc aacggcatgt acttcgctcc tacacaaacc 2280

aacaaggagg ccctggacta catccagaag taccgtgtcg aagccactct ccaatactcc 2340

ggtttcaagg atatcggcac aaaggacaag gagatgagga actacttggg tgacccaaac 2400

cagccgaaga ccaactacgt gaacctgaga tcatacttca ctggtggcga gaacatcatg 2460

acatacaaga agctgcgtat ctacgctatc acccctgacg accgtgaact cttggttttg 2520

tccgtggacg ctagcatggt cagcggtctc atctacatca acgactcgtt gtactacttc 2580

aagccccctg tgaacaacct gatcacaggt ttcgttaccg tgggcgacga taagtactac 2640

ttcaacccaa tcaacggtgg cgctgcctcc atcggcgaga ccatcatcga cgataagaac 2700

tactacttca accagagcgg agttctccaa actggtgtgt tctcaacaga ggacggtttc 2760

aagtacttcg ctccggccaa caccttggac gaaaacctgg agggtgaagc catcgacttc 2820

actggcaagt tgatcatcga tgagaacatc tactacttcg acgataacta ccgcggtgct 2880

gtggagtgga aggaactcga cggcgagatg cactacttct ctccagaaac cggcaaggcc 2940

ttcaagggat tgaaccagat cggtgactac aagtactact tcaactcgga tggcgtgatg 3000

caaaagggat tcgtctccat caacgacaac aagcactact tcgacgattc cggtgttatg 3060

aaagtgggct acacagagat cgacggcaag cacttctact tcgctgagaa cggagaaatg 3120

cagatcggtg tcttcaacac tgaagatggt ttcaagtact tcgcccacca caacgaagat 3180

ttgggcaacg aggaaggaga ggaaatcagc tactcaggca tcctgaactt caacaacaag 3240

atctactact tcgatgactc tttcaccgct gtggtcggat ggaaggacct ggaggatggt 3300

agcaagtact acttcgacga ggatactgct gaagcctaca tcggcctgtc gctcatcaac 3360

gacggacagt actacttcaa cgacgatggc atcatgcaag tcggattcgt taccatcaac 3420

gacaaggtgt tctacttctc ggattccggt atcatcgagt ctggcgtcca gaacatcgac 3480

gataactact tctacatcga cgataacgga atcgtgcaaa tcggtgtctt cgacacaagc 3540

gatggctaca agtacttcgc tcccgccaac accgtgaacg acaacatcta cggacaggct 3600

gtggagtact caggcctggt ccgtgttgga gaagacgtgt actacttcgg cgagacctac 3660

actatcgaaa ctggatggat ctacgacatg gagaacgaat ctgacaagta ctacttcaac 3720

cctgagacaa agaaggcctg caagggtatc aacctgatcg acgatatcaa gtactacttc 3780

gatgaaaagg gtatcatgcg caccggcctc atctcattcg aaaacaacaa ctactacttc 3840

aacgagaacg gagaaatgca attcggttac atcaacatcg aggacaagat gttctacttc 3900

ggagaagatg gtgtcatgca gatcggtgtt ttcaacactc cagacggctt caagtacttc 3960

gctcaccaaa acacactcga cgagaacttc gagggagaat ccatcaacta cactggttgg 4020

ttggacctgg atgagaagag gtactacttc accgacgaat acatcgctgc cactggctcc 4080

gtcatcatcg acggagagga atactacttc gacccggata cagcccagct ggtcatctct 4140

gaatctagaa tggtgaccgg tgtcttcaag ggtcccaacg gcttcgagta cttcgctccc 4200

gccaacactc acaacaacaa catcgaaggt caagctatcg tctaccaaaa caagttcttg 4260

accctgaacg gcaagaagta ttattttgac aacgattcta aggccgttac tggctggcaa 4320

acaatcgacg gaaagaagta ttatttcaat ctgaacactg ccgaggctgc caccggttgg 4380

cagactatcg atggcaagaa gtactacttt aacctcaaca ctgccgaagc tgccacagga 4440

tggcaaacca tcgacggcaa gaagtactat tttaacacaa acaccttcat cgcttctact 4500

ggctacacaa gcatcaacgg aaagcatttt tatttcaaca ccgatggaat catgcagatc 4560

ggtgtgttca agggaccaaa cggtttcgaa tacttcgctc cggctaacac agacgctaac 4620

aacatcgagg gccaggctat cttgtaccaa aacaagttcc tcactttgaa cggcaagaag 4680

tactattttg gctctgacag caaggccgtc actggactga ggacaatcga tggcaagaag 4740

tactacttta atactaacac agccgttgct gtgaccggct ggcagactat caacggaaag 4800

aagtattatt tcaataccaa cacttcaatc gcttcgaccg gttacactat catctctggc 4860

aagcattttt attttaacac cgacggcatc atgcaaatcg gtgtcttcaa gggccccgat 4920

ggcttcgaat acttcgcccc cgctaacact gatgctaaca acatcgaggg acaggctatc 4980

cgttaccaaa accgcttcct gtacctccac gacaacatct actacttcgg caacaactca 5040

aaggctgcca caggatgggt gaccatcgat ggtaaccgtt actacttcga gcccaacact 5100

gccatgggtg ctaacggcta caagacaatc gacaacaaga acttctactt ccgcaacggt 5160

ctcccacaga tcggcgtctt caagggatca aacggtttcg agtacttcgc tcctgccaac 5220

accgacgcca acaacatcga gggccaagct atcaggtacc aaaacagatt cctgcacctg 5280

ctcggcaaga tctactactt cggaaacaac tcgaaggccg ttactggttg gcagacaatc 5340

aacggcaagg tgtactactt catgccagac accgctatgg ctgccgctgg tggcctcttc 5400

gaaatcgacg gcgtgatcta cttcttcggc gttgatggag tgaaggctcc gggtatctac 5460

ggctaa 5466

<210> 14

<211> 2529

<212> DNA

<213> 艰难梭菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (1787)..(1787)

<223> n是a、c、g或t

<400> 14

atggaaatcg tcaacgaaga catcctgccg aacaacggtt tgatgggcta ctacttcacc 60

gatgagcact tcaaggacct gaagctcatg gctcctatca aggacggaaa cctgaagttc 120

gaggaaaaga aggtcgataa gctgctcgac aaggataaga gcgacgttaa gtcaatcagg 180

tggaccggca gaatcatccc atccaaggat ggagagtaca ctctctctac agaccgtgac 240

gatgtcttga tgcaggtgaa caccgaatcg actatctcca acactctgaa ggtgaacatg 300

aagaagggaa aggagtacaa ggtgcgcatc gaactgcaag ataagaacct cggttctatc 360

gacaacctct cctctccaaa cctctactgg gagttggatg gcatgaagaa gatcatcccg 420

gaggaaaact tgttcctgcg tgactacagc aacatcgaaa aggacgatcc cttcatccct 480

aacaacaact tcttcgatcc caagctgcgc gctcgccgcc gcaagaagcg catgtctgac 540

tgggaggacg aagatctcga caccgataac gacaacatcc ctgacagcta cgagcgcaac 600

ggatacacta tcaaggatct catcgctgtg aagtgggagg actccttcgc cgaacagggt 660

tacaagaagt acgtctcaaa ctacttggag tcgaacacag ctggtgaccc ctacaccgac 720

tacgaaaagg cctccggctc tttcgataag gctatcaaga ccgaggctag ggacccactc 780

gtcgctgctt accccatcgt gggagtcggt atggagaagt tgatcatcag cactaacgaa 840

cacgcttcaa ctgaccaggg caagacagtt tcaagagcca ccactaactc gaagaccgag 900

tccaacactg ctggcgtttc cgtgaacgtc ggctaccaga acggattcac cgccaacgtt 960

acaaccaact actcgcacac tacagataac tccaccgctg tgcaagactc taacggagag 1020

agctggaaca ctggtctgtc tatcaacaag ggcgaaagcg cttacatcaa cgccaacgtc 1080

cgctactaca acactggcac agcccccatg tacaaggtga cccctaccac taacctcgtc 1140

ttggatggag acacactgtc taccatcaag gctcaggaga accaaatcgg aaacaacctc 1200

agccccggtg acacataccc taagaaggga ttgtcaccac tggccctcaa cactatggac 1260

cagttcagct caaggttgat cccgatcaac tacgatcaac tcaagaagtt ggacgctggc 1320

aagcagatca agctggagac aacccaagtc tccggtaact tcggcaccaa gaactcgtcc 1380

ggccagatcg ttactgaagg aaacagctgg tcagattaca tctcacaaat cgactcgatc 1440

tccgcctcta tcatcctgga cacagagaac gaatcctacg agcgtcgcgt gaccgctaag 1500

aacttgcagg accccgagga caagacaccg gaactgacca tcggcgaggc catcgaaaag 1560

gctttcggtg ccaccaagaa ggacggcttg ctgtacttca acgatatccc tatcgacgag 1620

tcctgcgttg aactgatctt cgacgataac actgctaaca agatcaagga ttccctgaag 1680

acactctctg acaagaagat ctacaacgtg aagctcgaga ggggtatgaa catcttgatc 1740

aagaccccca cttacttcac aaacttcgac gattacaaca actaccnttc tacctggagc 1800

aacgtcaaca ctacaaacca ggacggactg caaggttcgg ccaacaagct caacggcgag 1860

accaagatca agatcccaat gagcgaactg aagccgtaca agagatacgt gttctcaggc 1920

tactcgaagg acccactcac tagcaactca atcatcgtga agatcaaggc taaggaggaa 1980

aagaccgact acctggtccc cgagcagggc tacactaagt tctcttacga gttcgaaacc 2040

actgagaagg actctagcaa catcgaaatc accctcatcg gcagcggaac aacctacttg 2100

gacaacctgt caatcaccga gttgaactcg actcccgaaa tcctggacga gcccgaagtc 2160

aagatcccta ccgatcagga gatcatggac gctcacaaga tctacttcgc cgacctgaac 2220

ttcaacccct ctactggaaa cacatacatc aacggcatgt acttcgctcc tacacaaacc 2280

aacaaggagg ccctggacta catccagaag taccgtgtcg aagccactct ccaatactcc 2340

ggtttcaagg atatcggcac aaaggacaag gagatgagga actacttggg tgacccaaac 2400

cagccgaaga ccaactacgt gaacctgaga tcatacttca ctggtggcga gaacatcatg 2460

acatacaaga agctgcgtat ctacgctatc acccctgacg accgtgaact cttggttttg 2520

tccgtggac 2529

<210> 15

<211> 1608

<212> DNA

<213> 艰难梭菌

<400> 15

atggtcagcg gtctcatcta catcaacgac tcgttgtact acttcaagcc ccctgtgaac 60

aacctgatca caggtttcgt taccgtgggc gacgataagt actacttcaa cccaatcaac 120

ggtggcgctg cctccatcgg cgagaccatc atcgacgata agaactacta cttcaaccag 180

agcggagttc tccaaactgg tgtgttctca acagaggacg gtttcaagta cttcgctccg 240

gccaacacct tggacgaaaa cctggagggt gaagccatcg acttcactgg caagttgatc 300

atcgatgaga acatctacta cttcgacgat aactaccgcg gtgctgtgga gtggaaggaa 360

ctcgacggcg agatgcacta cttctctcca gaaaccggca aggccttcaa gggattgaac 420

cagatcggtg actacaagta ctacttcaac tcggatggcg tgatgcaaaa gggattcgtc 480

tccatcaacg acaacaagca ctacttcgac gattccggtg ttatgaaagt gggctacaca 540

gagatcgacg gcaagcactt ctacttcgct gagaacggag aaatgcagat cggtgtcttc 600

aacactgaag atggtttcaa gtacttcgcc caccacaacg aagatttggg caacgaggaa 660

ggagaggaaa tcagctactc aggcatcctg aacttcaaca acaagatcta ctacttcgat 720

gactctttca ccgctgtggt cggatggaag gacctggagg atggtagcaa gtactacttc 780

gacgaggata ctgctgaagc ctacatcggc ctgtcgctca tcaacgacgg acagtactac 840

ttcaacgacg atggcatcat gcaagtcgga ttcgttacca tcaacgacaa ggtgttctac 900

ttctcggatt ccggtatcat cgagtctggc gtccagaaca tcgacgataa ctacttctac 960

atcgacgata acggaatcgt gcaaatcggt gtcttcgaca caagcgatgg ctacaagtac 1020

ttcgctcccg ccaacaccgt gaacgacaac atctacggac aggctgtgga gtactcaggc 1080

ctggtccgtg ttggagaaga cgtgtactac ttcggcgaga cctacactat cgaaactgga 1140

tggatctacg acatggagaa cgaatctgac aagtactact tcaaccctga gacaaagaag 1200

gcctgcaagg gtatcaacct gatcgacgat atcaagtact acttcgatga aaagggtatc 1260

atgcgcaccg gcctcatctc attcgaaaac aacaactact acttcaacga gaacggagaa 1320

atgcaattcg gttacatcaa catcgaggac aagatgttct acttcggaga agatggtgtc 1380

atgcagatcg gtgttttcaa cactccagac ggcttcaagt acttcgctca ccaaaacaca 1440

ctcgacgaga acttcgaggg agaatccatc aactacactg gttggttgga cctggatgag 1500

aagaggtact acttcaccga cgaatacatc gctgccactg gctccgtcat catcgacgga 1560

gaggaatact acttcgaccc ggatacagcc cagctggtca tctctgaa 1608

<210> 16

<211> 1317

<212> DNA

<213> 艰难梭菌

<400> 16

atggtgaccg gtgtcttcaa gggtcccaac ggcttcgagt acttcgctcc cgccaacact 60

cacaacaaca acatcgaagg tcaagctatc gtctaccaaa acaagttctt gaccctgaac 120

ggcaagaagt attattttga caacgattct aaggccgtta ctggctggca aacaatcgac 180

ggaaagaagt attatttcaa tctgaacact gccgaggctg ccaccggttg gcagactatc 240

gatggcaaga agtactactt taacctcaac actgccgaag ctgccacagg atggcaaacc 300

atcgacggca agaagtacta ttttaacaca aacaccttca tcgcttctac tggctacaca 360

agcatcaacg gaaagcattt ttatttcaac accgatggaa tcatgcagat cggtgtgttc 420

aagggaccaa acggtttcga atacttcgct ccggctaaca cagacgctaa caacatcgag 480

ggccaggcta tcttgtacca aaacaagttc ctcactttga acggcaagaa gtactatttt 540

ggctctgaca gcaaggccgt cactggactg aggacaatcg atggcaagaa gtactacttt 600

aatactaaca cagccgttgc tgtgaccggc tggcagacta tcaacggaaa gaagtattat 660

ttcaatacca acacttcaat cgcttcgacc ggttacacta tcatctctgg caagcatttt 720

tattttaaca ccgacggcat catgcaaatc ggtgtcttca agggccccga tggcttcgaa 780

tacttcgccc ccgctaacac tgatgctaac aacatcgagg gacaggctat ccgttaccaa 840

aaccgcttcc tgtacctcca cgacaacatc tactacttcg gcaacaactc aaaggctgcc 900

acaggatggg tgaccatcga tggtaaccgt tactacttcg agcccaacac tgccatgggt 960

gctaacggct acaagacaat cgacaacaag aacttctact tccgcaacgg tctcccacag 1020

atcggcgtct tcaagggatc aaacggtttc gagtacttcg ctcctgccaa caccgacgcc 1080

aacaacatcg agggccaagc tatcaggtac caaaacagat tcctgcacct gctcggcaag 1140

atctactact tcggaaacaa ctcgaaggcc gttactggtt ggcagacaat caacggcaag 1200

gtgtactact tcatgccaga caccgctatg gctgccgctg gtggcctctt cgaaatcgac 1260

ggcgtgatct acttcttcgg cgttgatgga gtgaaggctc cgggtatcta cggctaa 1317

<210> 17

<211> 2307

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 三重毒素疫苗BV1512

<220>

<221> misc_feature

<222> (588)..(588)

<223> Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400> 17

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp Ala Ser Met Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser

835 840 845

Asp Ile Glu Leu Glu Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn

850 855 860

Val Ile Ser Asn Ile Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu

865 870 875 880

Ala Lys Asn Leu Thr Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe

885 890 895

Lys Leu Ile Glu Ser Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln

900 905 910

Asn Glu Leu Glu Asp Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu

915 920 925

Thr Asp Glu Gly Phe Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu

930 935 940

Ser Ile Phe Val Glu Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn

945 950 955 960

His Ile Thr Glu Glu Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr

965 970 975

Val Asn Gly Lys Leu Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu

980 985 990

Val Asn Thr Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr

995 1000 1005

Asn Ser Ser Lys Glu Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys

1010 1015 1020

Val Gln Val Tyr Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile

1025 1030 1035

Thr Asp Ala Ala Lys Val Val Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp

1040 1045 1050

Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile

1055 1060 1065

Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys

1070 1075 1080

Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu

1085 1090 1095

Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala Val Asn Leu Thr Thr Ala Thr Thr

1100 1105 1110

Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile

1115 1120 1125

Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu

1130 1135 1140

Val Asn Asn Glu Leu Val Leu Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val

1145 1150 1155

Asp Tyr Phe Lys His Val Ser Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe

1160 1165 1170

Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val

1175 1180 1185

Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys

1190 1195 1200

Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr

1205 1210 1215

Asp Asp Ile Asp His Phe Phe Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg

1220 1225 1230

Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu

1235 1240 1245

Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro

1250 1255 1260

Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg

1265 1270 1275

Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp

1280 1285 1290

Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala

1295 1300 1305

Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn

1310 1315 1320

Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro

1325 1330 1335

Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe

1340 1345 1350

Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn

1355 1360 1365

Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu Ser Glu Ser Asp Val Trp Ile Ile

1370 1375 1380

Asp Val Asp Asn Val Val Arg Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys

1385 1390 1395

Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser

1400 1405 1410

Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe

1415 1420 1425

Ser Gly Glu Val Asn Gly Ser Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe

1430 1435 1440

Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu

1445 1450 1455

Ser Lys Ser Tyr Lys Leu Leu Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu

1460 1465 1470

Met Leu Asn Ser Asn His Ile Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly

1475 1480 1485

Phe Asn Ser Glu Leu Gln Lys Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp

1490 1495 1500

Ser Glu Gly Lys Glu Asn Gly Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu

1505 1510 1515

Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys

1520 1525 1530

Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn

1535 1540 1545

Asn Leu Lys Asp Val Lys Val Ile Thr Lys Asp Asn Val Asn Ile

1550 1555 1560

Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser

1565 1570 1575

Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His

1580 1585 1590

Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Arg

1595 1600 1605

Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu

1610 1615 1620

Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser Asn

1625 1630 1635

Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr

1640 1645 1650

Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile

1655 1660 1665

Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr

1670 1675 1680

Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr

1685 1690 1695

Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe

1700 1705 1710

Ser Gln Lys Tyr Leu Tyr Gly Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val

1715 1720 1725

Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro

1730 1735 1740

Val Tyr Glu Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp

1745 1750 1755

Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu

1760 1765 1770

Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu

1775 1780 1785

Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg

1790 1795 1800

Phe Val Asn Val Phe Lys Asp Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Ser

1805 1810 1815

Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln Asp Val Pro Val Ser Glu Ile Ile

1820 1825 1830

Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr

1835 1840 1845

Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn

1850 1855 1860

Asn Phe Gly Met Ser Arg Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro

1865 1870 1875

Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn

1880 1885 1890

Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu

1895 1900 1905

Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr

1910 1915 1920

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn

1925 1930 1935

Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys

1940 1945 1950

Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln

1955 1960 1965

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile

1970 1975 1980

Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe

1985 1990 1995

Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

2000 2005 2010

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

2015 2020 2025

Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn

2030 2035 2040

Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly

2045 2050 2055

Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

2060 2065 2070

Ala Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile

2090 2095 2100

Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln

2105 2110 2115

Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro

2120 2125 2130

Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr

2135 2140 2145

Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly

2150 2155 2160

Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn

2165 2170 2175

Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr

2180 2185 2190

Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro

2195 2200 2205

Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

2210 2215 2220

Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg

2225 2230 2235

Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

2240 2245 2250

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly

2255 2260 2265

Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly

2270 2275 2280

Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp

2285 2290 2295

Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2300 2305

<210> 18

<211> 835

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (588)..(588)

<223> Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400> 18

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp

835

<210> 19

<211> 1030

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 19

Met Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu

1 5 10 15

Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile

20 25 30

Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr

35 40 45

Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser

50 55 60

Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp

65 70 75 80

Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe

85 90 95

Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu

100 105 110

Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu

115 120 125

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu

130 135 140

Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn

145 150 155 160

Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu

165 170 175

Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln

180 185 190

Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val

195 200 205

Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro Thr

210 215 220

Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly Val Ser

225 230 235 240

Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp Pro Leu Leu

245 250 255

Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala Val Asn Leu Thr

260 265 270

Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ile Ala Ser Gly

275 280 285

Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro

290 295 300

Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val

305 310 315 320

Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe

325 330 335

Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile

340 345 350

Ser Glu Ile Asp Phe Asn Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys Cys Glu

355 360 365

Ile Trp Arg Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile

370 375 380

Asp His Phe Phe Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu

385 390 395 400

Ser Ile Tyr Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser

405 410 415

Lys Asp Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp

420 425 430

Glu Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr

435 440 445

Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr Trp

450 455 460

Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser Asn Thr Arg

485 490 495

Ser Phe Ile Val Pro Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile Arg Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ser

515 520 525

Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu Ser Glu Ser Asp Val Trp

530 535 540

Ile Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp

545 550 555 560

Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser

565 570 575

Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe Ser

580 585 590

Gly Glu Val Asn Gly Ser Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile

595 600 605

Leu Glu Gly Ile Asn Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser

610 615 620

Tyr Lys Leu Leu Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu Met Leu Asn Ser

625 630 635 640

Asn His Ile Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Phe Asn Ser Glu Leu

645 650 655

Gln Lys Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu Asn

660 665 670

Gly Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu

675 680 685

Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys Pro

690 695 700

Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val Ile Thr

705 710 715 720

Lys Asp Asn Val Asn Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Asp Ile

725 730 735

Lys Ile Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys Thr Ile Lys Leu

740 745 750

Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala Glu Ile Leu Lys Phe

755 760 765

Met Asn Arg Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser Asp Ser Leu Met Ser Phe

770 775 780

Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser

785 790 795 800

Asn Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr

805 810 815

Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile Gln

820 825 830

Pro Tyr Phe Ile Lys Phe Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr

835 840 845

Val Gly Asn Arg Gln Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp

850 855 860

Asp Ser Gly Asp Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe Ser Gln Lys Tyr

865 870 875 880

Leu Tyr Gly Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn

885 890 895

Ile Tyr Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Val Tyr Glu Thr Asn Asn

900 905 910

Thr Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys

915 920 925

Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser Asn

930 935 940

Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn Lys Val

945 950 955 960

Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp Lys Thr Leu

965 970 975

Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln Asp Val Pro Val

980 985 990

Ser Glu Ile Ile Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr Tyr Glu Asp Gly Leu

995 1000 1005

Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu Tyr Asn Glu Lys Phe

1010 1015 1020

Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met

1025 1030

<210> 20

<211> 438

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 20

Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr

20 25 30

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

35 40 45

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

50 55 60

Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

65 70 75 80

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr

85 90 95

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

100 105 110

Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

115 120 125

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

130 135 140

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu

145 150 155 160

Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

180 185 190

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

195 200 205

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe

225 230 235 240

Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

245 250 255

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

260 265 270

Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp

275 280 285

Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val

290 295 300

Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly

305 310 315 320

Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

370 375 380

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

405 410 415

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

420 425 430

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

435

<210> 21

<211> 2351

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Q-毒素融合蛋白

<220>

<221> misc_feature

<222> (588)..(588)

<223> Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400> 21

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp Ala Ser Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser

835 840 845

Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val

850 855 860

Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala

865 870 875 880

Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn

885 890 895

Gln Ser Gly Val Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe

900 905 910

Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu

915 920 925

Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr

930 935 940

Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

945 950 955 960

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu

965 970 975

Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met

980 985 990

Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp

995 1000 1005

Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His

1010 1015 1020

Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn

1025 1030 1035

Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu

1040 1045 1050

Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn

1055 1060 1065

Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val

1070 1075 1080

Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp

1085 1090 1095

Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp

1100 1105 1110

Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln Val Gly Phe

1115 1120 1125

Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile

1130 1135 1140

Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr Ile

1145 1150 1155

Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

1160 1165 1170

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile

1175 1180 1185

Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu

1190 1195 1200

Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp

1205 1210 1215

Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro

1220 1225 1230

Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile

1235 1240 1245

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile

1250 1255 1260

Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met

1265 1270 1275

Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly

1280 1285 1290

Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly

1295 1300 1305

Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu

1310 1315 1320

Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys

1325 1330 1335

Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val

1340 1345 1350

Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln

1355 1360 1365

Leu Val Ile Ser Glu Ser Arg Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly

1370 1375 1380

Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn

1385 1390 1395

Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr

1400 1405 1410

Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val

1415 1420 1425

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu

1430 1435 1440

Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys

1445 1450 1455

Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp

1460 1465 1470

Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe

1475 1480 1485

Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

1490 1495 1500

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

1505 1510 1515

Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn

1520 1525 1530

Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu

1535 1540 1545

Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr

1550 1555 1560

Gly Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

1565 1570 1575

Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys

1580 1585 1590

Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr

1595 1600 1605

Ile Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met

1610 1615 1620

Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1625 1630 1635

Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg

1640 1645 1650

Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe

1655 1660 1665

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly

1670 1675 1680

Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly

1685 1690 1695

Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu

1700 1705 1710

Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe

1715 1720 1725

Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

1730 1735 1740

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr

1745 1750 1755

Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn

1760 1765 1770

Gly Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala

1775 1780 1785

Gly Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val

1790 1795 1800

Asp Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly Thr Ser Met Val Ser

1805 1810 1815

Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro

1820 1825 1830

Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys

1835 1840 1845

Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

1850 1855 1860

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val

1865 1870 1875

Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1880 1885 1890

Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile

1895 1900 1905

Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe

1910 1915 1920

Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

1925 1930 1935

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly

1940 1945 1950

Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly

1955 1960 1965

Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr

1970 1975 1980

Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp

1985 1990 1995

Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly

2000 2005 2010

Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn

2015 2020 2025

Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly

2030 2035 2040

Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe

2045 2050 2055

Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr

2060 2065 2070

Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu

2075 2080 2085

Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

2090 2095 2100

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp

2105 2110 2115

Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr

2120 2125 2130

Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp

2135 2140 2145

Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn

2150 2155 2160

Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg

2165 2170 2175

Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu

2180 2185 2190

Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr

2195 2200 2205

Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile

2210 2215 2220

Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr

2225 2230 2235

Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn

2240 2245 2250

Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe

2255 2260 2265

Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr

2270 2275 2280

Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu

2285 2290 2295

Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu

2300 2305 2310

Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr

2315 2320 2325

Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

2330 2335 2340

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

2345 2350

<210> 22

<211> 835

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (588)..(588)

<223> Xaa可以是任何天然产生的氨基酸

<400> 22

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp

835

<210> 23

<211> 536

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 23

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

20 25 30

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu

50 55 60

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro

65 70 75 80

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

85 90 95

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe

115 120 125

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

130 135 140

Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr

195 200 205

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

225 230 235 240

Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

245 250 255

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

275 280 285

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

290 295 300

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

305 310 315 320

Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

325 330 335

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

340 345 350

Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val

355 360 365

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

370 375 380

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

385 390 395 400

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn

420 425 430

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

450 455 460

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

465 470 475 480

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

500 505 510

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

515 520 525

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

530 535

<210> 24

<211> 438

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 24

Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr

20 25 30

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

35 40 45

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

50 55 60

Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

65 70 75 80

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr

85 90 95

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

100 105 110

Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

115 120 125

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

130 135 140

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu

145 150 155 160

Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

180 185 190

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

195 200 205

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe

225 230 235 240

Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

245 250 255

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

260 265 270

Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp

275 280 285

Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val

290 295 300

Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly

305 310 315 320

Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

370 375 380

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

405 410 415

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

420 425 430

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

435

<210> 25

<211> 536

<212> PRT

<213> 艰难梭菌

<400> 25

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

20 25 30

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu

50 55 60

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro

65 70 75 80

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

85 90 95

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe

115 120 125

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

130 135 140

Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr

195 200 205

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

225 230 235 240

Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

245 250 255

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

275 280 285

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

290 295 300

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

305 310 315 320

Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

325 330 335

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

340 345 350

Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val

355 360 365

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

370 375 380

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

385 390 395 400

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn

420 425 430

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

450 455 460

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

465 470 475 480

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

500 505 510

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

515 520 525

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

530 535

<210> 26

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 以合成方式合成的肽连接子

<400> 26

Gly Gly Gly Gly

1

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 弗林蛋白酶切割位点序列

<400> 27

Arg Ala Arg Arg Arg Lys Lys Arg

1 5

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 弗林蛋白酶切割位点序列

<400> 28

cgcgctcgcc gccgcaagaa gcgc 24

Claims (17)

1.一种多价免疫原性多肽，其包括至少四种艰难梭菌(C.difficile)毒素蛋白的部分；其中所述至少四种艰难梭菌毒素蛋白的部分是：

(i)二元毒素(CDT)部分，其由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成；

(ii)毒素A部分，其由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成；

(iii)第一毒素B部分，其由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成；和

(iv)第二毒素B部分，其由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成；其中所述第一毒素B部分和第二毒素B部分来自毒素B蛋白，所述毒素B蛋白来自不同的艰难梭菌菌株。

2.根据权利要求1所述的多价免疫原性多肽，其中所述部分以两种毒素B部分之间的毒素A部分定向。

3.根据权利要求1所述的多价免疫原性多肽，其中所述CDT部分处于所述毒素B部分之一或两者的N端。

4.根据权利要求1所述的多价免疫原性肽，其中每个部分被两个氨基酸连接子、三个氨基酸连接子或四个氨基酸连接子分开。

5.根据权利要求4所述的多价免疫原性肽，其中所述部分被两个氨基酸连接子分开，并且所述连接子选自由丙氨酸-丝氨酸(AS)、亮氨酸-谷氨酸(LE)和丝氨酸-精氨酸(SR)组成的组。

6.根据权利要求1所述的多价免疫原性多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。

7.一种核酸，其包括对根据权利要求1到6中任一项所述的多肽进行编码的多核苷酸。

8.一种制备根据权利要求1所述的多价免疫原性多肽的方法，所述方法包括：

(a)在昆虫宿主细胞中表达所述多价免疫原性多肽；

(b)在存在非离子型洗涤剂的情况下纯化呈纳米颗粒形式的所述多价免疫原性多肽；以及

(c)将所述纳米颗粒悬浮于药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂中。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述昆虫宿主是Sf9细胞。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中在适合表达所述多肽的条件下用重组型杆状病毒构建体转染所述昆虫宿主细胞。

11.一种免疫原性组合物，其包括根据权利要求1到6中任一项所述的多价免疫原性多肽以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。

12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包括佐剂。

13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是基于皂苷的佐剂。

14.根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其中所述基于皂苷的佐剂含有级分A基质和级分C基质。

15.根据权利要求14所述的免疫原性组合物，其中级分A基质的量为85％到92％，并且其余部分为级分C基质。

16.一种根据权利要求1到6中任一项所述的多价免疫原性多肽或根据权利要求7所述的核酸的用途，其用于制备供预防或治疗艰难梭菌感染用的药物。

17.一种纳米颗粒，其包括根据权利要求1到6中任一项所述的多价免疫原性多肽和非离子型洗涤剂。