TW201722983A - 豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的製備方法及含該外鞘蛋白質的醫藥組合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的製備方法及含該外鞘蛋白質的醫藥組合物。本發明方法係透過使用一新穎之阿拉伯糖誘導表現載體，從而提高豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的合成效率。另一方面，本發明醫藥組合物以合適比例組合前述外鞘蛋白質及其他有利成分而取得優異的免疫誘發效果。

Description

豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的製備方法及含該外鞘蛋白 質的醫藥組合物

本發明關於一種豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的製備方法；尤指一種使用原核細胞表現系統之豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的製備方法。

第二型豬環狀病毒(porcine circovirus type 2；PCV2)為影響全球養豬產業甚鉅之病毒性病原，其主要造成豬離乳後多系統消耗症候群(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)，臨床症狀為發燒、淋巴結腫大、體重減輕或消弱、呼吸困難、下痢、蒼白及偶發黃疸等症狀。另可能引發豬皮膚炎腎病症候群(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、先天性震顫(infectious congenital tremor,ICT)及繁殖障礙。此外，PCV2與其他病毒性或細菌性病原混合感染豬隻則會引起呼吸道疾病綜合症(porcine respiratory disease complex,PRDC)。豬隻感染PCV2所引發之疾病會造成育成率與飼料換肉率降低，進而造成養豬業者之嚴重經濟損失。

領域中針對PCV2之預防與控制提出20點飼養管理要點，如統進統出、良好衛生管理、病情嚴重者淘汰或隔離及疫苗接種等。其中疫苗接種可有效降低PCV2感染率，進而提升育成率。目前 領域中的PCV2疫苗分為三類，包括不活化PCV2疫苗、不活化桿狀病毒次單位苗及不活化豬第一型與第二型環狀病毒(PCV1-PCV2)嵌合病毒疫苗(Beach and Meng,2012；Chanhee,2012)。

不活化PCV2疫苗乃是將PCV2感染豬腎細胞株PK-15後，收取病毒液經不活化處理與混合佐劑所製成；不活化桿狀病毒次單位苗乃是將帶有PCV2外鞘蛋白質(capsid protein)ORF2基因之桿狀病毒轉染昆蟲細胞後，進行免疫原ORF2之表現。若抗原表現於細胞內，疫苗製備之方式乃是將含有細胞之培養液進行超音波破碎處理，再經不活化處理與混合佐劑製成。若抗原分泌至胞外，則進行細胞培養上清液之收集，再經病毒載體之不活化處理與混合佐劑製成疫苗；不活化PCV1-PCV2嵌合病毒疫苗乃是將PCV1中之ORF2置換為PCV2之ORF2並進行細胞感染、病毒液收取、病毒不活化及混合佐劑所製成。

綜觀目前PCV2疫苗之生產方式皆是以培養病毒之方式進行，因而具有製備時間長且生產成本高的缺點。為降低疫苗成本，領域中研究人員嘗試利用培養成本較低之重組大腸桿菌進行疫苗抗原ORF2之生產，但仍遭遇ORF2產量低落、重組ORF2無法形成類病毒顆粒(virus-like particle)、製程複雜或免疫效果不佳之瓶頸。

爰是，本發明的一個目的為提供一種製備豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的方法，以降低PCV2疫苗的生產時間及成本。

本發明的另一個目的為提供一種防治豬第二型環狀病毒感染的組合物，其以豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質作為活性成分，並包含合適之佐劑，從而提供產業一防治豬第二型環狀病毒感染的工具。

本發明的又一個目的為提供一種製備豬干擾素的方法，以降低生產豬干擾素所需的時間及成本，而有利於應用豬干擾素於防治豬第二型環狀病毒感染之組合物。

為了達到上述目的，本發明提供一種表現一蛋白質的方法，其包含：(a)取得一阿拉伯糖誘導表現載體；其中前述阿拉伯糖誘導表現載體包含一表現元件及一目標蛋白質的核苷酸序列；其中前述表現元件包含：一啟動子；一T7噬菌體轉譯增強元件，其具有SEQ ID NO 01所示之序列；及一核糖體結合部位，其具有SEQ ID NO 02所示序列；(b)將前述阿拉伯糖誘導表現載體轉形至一大腸桿菌宿主中，並進行目標蛋白質之誘導表現；其中前述目標蛋白質為：豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質或豬干擾素。

較佳地，前述啟動子的-16部位具有SEQ ID NO 03所示之序列。

較佳地，前述表現元件具有SEQ ID NO 04所示序列。

較佳地，前述阿拉伯糖誘導表現載體進一步包含一融合伴子的核苷酸序列、及/或一標記分子的核苷酸序列。較佳地，前述融合伴子為：大腸桿菌之MsyB、大腸桿菌之YjgD基因、Lambda噬菌體D蛋白質、麵包酵母菌SUMO蛋白質、或其組合。較佳地，前述標記分子為：His tag、Strep II tag、FLAG tag、或其組合。

較佳地，前述目標蛋白質為豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質，且其核苷酸序列具有SEQ ID NO 09或SEQ ID NO 24所示序列。較佳地，前述阿拉伯糖誘導表現載體具有SEQ ID NO 46所示序列。

較佳地，前述豬干擾素為豬干擾素α或豬干擾素γ。較佳地，前述目標蛋白質為豬干擾素，且其核苷酸序列具有SEQ ID NO 64或SEQ ID NO 76所示序列。較佳地，前述阿拉伯糖誘導表現載體具有SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 87、或SEQ ID NO 95所示序列。較佳地，前述方法不包含前述豬干擾素的折疊步驟。

較佳地，前述步驟(b)之後進一步包含一步驟(c)：純化前述目標蛋白質。較佳地，前述步驟(c)之後進一步包含一步驟(d)：以一SUMO蛋白酶處理前述目標蛋白質。較佳地，步驟(d)之處理中，前述目標蛋白質與前述SUMO蛋白酶的重量比值為4至20。

本發明提供又一種防治豬第二型環狀病毒感染的組合物，其包含：2.5至250μg/mL之豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質；2.5至25μg/mL之豬干擾素α；2.5至25μg/mL之豬干擾素γ；及一醫藥可接受之載劑。

較佳地，前述組合物進一步包含一醫藥可接受之佐劑。較佳地，前述醫藥可接受之佐劑為：MONTANIDE^TM ISA 536 VG佐劑、MONTANIDE^TM GEL 01佐劑、弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子聚合物、肽、油乳液、或其組合。

較佳地，前述組合物包含：3.5至170μg/mL之豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質；5至20μg/mL之豬干擾素α；5至20μg/mL之豬干擾素γ；及一醫藥可接受之載劑。

綜上所述，本發明主要提供一種表現一蛋白質的方法，其透過使用一阿拉伯糖誘導表現載體。本發明方法有助於以更高的效率合成豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質及疫苗中作為佐劑使用的豬干擾素。另一方面，本發明醫藥組合物以合適比例組合前述外鞘蛋白質及其他有利成分而取得優異的免疫誘發效果。據此，本發明揭露內容對於領域中豬第二型環狀病毒的防治工作有顯著助益。

第一圖係實施例一所製得的5個豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質表現載體的示意圖。

第二圖顯示以蛋白質電泳及西方墨漬法觀察實施例一所製得的5個表現載體轉形至大腸桿菌宿主後的蛋白質誘導表現情形。 (A)蛋白質電泳結果。(B)西方墨漬法結果；第1行：BL21(DE3)/pET29a；第2行：BL21(DE3)/pET-SUMO-ORF2；第3行：BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-ORF2；第4行：Rosetta2/pET-SUMO-ORF2；第5行：BL21(DE3)/pET-SUMO-OPTORF2；第6行：BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-OPTORF2；第7行：BL21/pBA-OPTSUMO-OPTORF2。

第三圖顯示利用蛋白質電泳觀察實施例一所製得的4個表現載體轉形至大腸桿菌宿主後的融合蛋白質可溶性表現情形。T：總細胞破碎物；S：可溶性蛋白質；IS：不可溶性蛋白質。箭頭標示處為目標蛋白質。

第四圖係蛋白質電泳圖，其顯示利用固定化金屬離子親和性層析法純化pBA-OPTSUMO-OPTORF2於宿主細胞(E.coli BL21)表現之融合蛋白質的結果。第1行：E.coli BL21(pBA-OPTSUMO-OPTORF2)之總細胞破碎物；第2行：經純化之融合蛋白質。

第五圖顯示以蛋白質電泳及西方墨漬法觀察實施例二中重組SUMO蛋白酶(SUMOPH)和重組D-SUMO蛋白酶(DSUMOPH)於宿主細胞【E.coli BL21(DE3)】中的表現情形。(A)蛋白質電泳結果。(B)西方墨漬法結果。T：總細胞破碎物；S：可溶性蛋白質；IS：不可溶性蛋白質。箭頭標示處為目標蛋白質。

第六圖係蛋白質電泳圖，其顯示利用固定化金屬離子親和性層析法純化pET-SUMOPH及pET-D-SUMOPH於宿主細胞【E.coli BL21(DE3)】表現之重組蛋白酶的結果。第1行：經純化之SUMO蛋白酶(SUMOPH)；第2行：經純化之D-SUMO蛋白酶(DSUMOPH)。

第七圖係蛋白質電泳圖，其顯示重組SUMO-ORF2融合蛋白質之純化、剪切及過濾。第1行：純化之SUMO-ORF2融合蛋白 質。第2行：經剪切之SUMO-ORF2融合蛋白質。第3行：經剪切及過濾(100kDa過濾膜)後取得之ORF2融合蛋白質。

第八圖係穿透式電子顯微鏡影像，其顯示SUMO-ORF2融合蛋白質(A)、經蛋白酶剪切的重組SUMO-ORF2融合蛋白質(B)、及經蛋白酶剪切再經過濾後所得之ORF2融合蛋白質(C)形成類病毒顆粒的影像。

第九圖係蛋白質電泳圖，其顯示實施例三之重組豬干擾素的表現情形；T：總細胞破碎物；S：可溶性蛋白質。(A)pET-OPTPIFNAH/E.coli Shuffle；(B)pBA-OPTPIFNAH/E.coli Shuffle；(C)pET-SUMO-OPTPIFNAH/E.coli Shuffle；(D)pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH/E.coli Shuffle；(E)pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH-l/E.coli Shuffle；(F)pET-OPTPIFNRH/E.coli BL21(DE3)；(G)pET-SUMO-OPTPIFNRH/E.coli BL21(DE3)；(H)pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH/E.coli BL21(DE3)；(I)pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH/E.coli BL21(DE3)。箭頭標示處為目標蛋白質。

第十圖係蛋白質電泳圖，其顯示實施例三之重組豬干擾素經表現後的純化結果。第1行：E.coli Shuffle(pET-OPTPIFNAH)表現所得之融合蛋白質的純化結果；第2行：E.coli Shuffle(pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH)表現所得之融合蛋白質經D-SUMO蛋白酶【pET-D-SUMOP/E.coli BL21(DE3)細胞破碎物】剪切後再經純化的結果；第3行：E.coli BL21(DE3)(pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH)表現所得之融合蛋白質經D-SUMO蛋白酶【pET-D-SUMOP/E.coli BL21(DE3)細胞破碎物】剪切後再經純化的結果。

第十一圖係ELISA試驗結果，其顯示實施例4實驗3中各樣品於豬隻中產生的抗PCV2抗體力價。

第十二圖係顯示實施例4實驗3中各樣品降低豬隻病毒血症 的程度。

第十三圖係ELISA試驗結果，其顯示實施例4實驗4中各樣品於豬隻中產生的抗PCV2抗體力價。

第十四圖係顯示實施例4實驗4中各樣品降低豬隻病毒血症的程度。

第十五圖係ELISA試驗結果，其顯示實施例4實驗5中各樣品於豬隻中產生的抗PCV2抗體力價。

如前所述，雖然領域中已嘗試透過大腸桿菌表現系統生產豬第二型環狀病毒的外鞘蛋白質，然而截至本發明申請時，仍未能克服產量過低的缺點，而阻礙豬第二型環狀病毒之防疫工作的精進。

本發明方法係採用本發明之申請人於中華民國發明專利申請案第103146225號案(申請日：西元2014年12月30日)所揭露的阿拉伯糖誘導表現元件來製備豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質。前揭中華民國專利第103146225號案的全部內容係併入於本案中作為參考文獻。

本文中所述「目標蛋白質」係指欲藉由原核細胞表現系統表現的蛋白質。於本發明中，前述目標蛋白質係為豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質、豬干擾素α、或豬干擾素γ。

本文中所述「目標蛋白質的核苷酸序列」或其他類似之敘述係指一核苷酸序列，其透過活體內或活體外的轉錄/轉譯機制後，可形成前述目標蛋白質。據此，本發明所述「豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的核苷酸序列」或「豬干擾素的核苷酸序列」亦定義如前。同理，本發明所述「融合伴子的核苷酸序列」或「標記分子的核苷酸序列」亦定義如前。

本發明所述「融合伴子」係指為利於提高合成之前述目標蛋白質的水溶性而使用的分子。為上述目的，將一融合伴子的核苷酸序列與前述目標蛋白質的核苷酸序列以遺傳工程的方式建構於同一表現載體上，從而使前述目標蛋白質與前述融合伴子合成為一融合蛋白質。前述融合伴子例如但不限於：大腸桿菌之MsyB、大腸桿菌之YjgD、Lambda噬菌體D蛋白質、麵包酵母菌SUMO蛋白質、或其組合。

本發明所述「標記分子」係指為利於觀察前述目標蛋白質之合成或為利於純化前述目標蛋白質所使用的分子。為上述目的，將一標記分子的核苷酸序列與前述目標蛋白質的核苷酸序列以遺傳工程的方式建構於同一表現載體上，從而使前述目標蛋白質與前述標記分子合成為一融合蛋白質。前述標記分子例如但不限於：His tag、Strep II tag、FLAG tag、或其組合。

本發明的第一個面向為一種製備豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質、豬干擾素α、或豬干擾素γ的方法。前述方法包含(a)取得一阿拉伯糖誘導表現載體；其中前述阿拉伯糖誘導表現載體包含一表現元件及一目標蛋白質的核苷酸序列；及(b)將前述阿拉伯糖誘導表現載體轉形至一大腸桿菌宿主中進行目標蛋白質之表現。

於一可行實施態樣中，前述目標蛋白質為豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質。於一可行實施態樣中，前述目標蛋白質為豬干擾素α或豬干擾素γ。

於一較佳實施態樣中，前述表現元件係如本發明之申請人於中華民國發明專利申請案第103146225號案(申請日：西元2014年12月30日)中所述者。具體而言，前述表現元件包含：一啟動子；一T7噬菌體轉譯增強元件；及一核糖體結合部位。舉例來說，前述表現元件係中華民國發明專利申請案第103146225號案中所述araB-M11表現元件。

在一較佳實施態樣中，前述T7噬菌體轉譯增強元件具有SEQ ID NO：01所示之序列。在一較佳實施態樣中，前述核糖體結合部位具有SEQ ID NO 02所示序列。在一較佳實施態樣中，前述啟動子的-16部位具有SEQ ID NO：03所示之序列。在一較佳實施態樣中，前述表現元件具有SEQ ID NO 04所示序列。

於一可行實施態樣中，其中前述步驟(b)之後進一步包含一步驟(c)：純化前述目標蛋白質。當於本發明方法中使用His tag作為前述標記分子時，可採用固定化金屬離子親和性層析法(immobilized-metal ion affinity chromatography)純化前述目標蛋白質。

於一可行實施態樣中，當於本發明方法中使用SUMO蛋白質作為前述融合伴子時，於前述步驟(c)之後進一步包含一步驟(d)：以一SUMO蛋白酶處理前述目標蛋白質。前述「處理」係指使前述SUMO蛋白酶剪切前述SUMO融合伴子，以使前述目標蛋白質與前述SUMO蛋白質分離。

於一可行實施態樣中，前述SUMO蛋白酶係透過T7表現載體而製得。於一較佳實施態樣中，於前述處理中，前述目標蛋白質與前述SUMO蛋白酶的重量比值為4至20。

於一較佳實施態樣中，前述方法不包含前述豬干擾素之折疊步驟。所屬領域具有通常知識者當可理解於一原核細胞表現系統中的「折疊步驟」係指透過使用尿素或鹽酸胍(guanidine hydrochloride)溶解包涵體，再經透析等步驟使所產出的胜肽折疊形成三級結構或四級結構的過程。從而所屬領域具有通常知識者當可理解本發明所述「不包含前述豬干擾素之折疊步驟」係指本發明方法中所製得的胜肽可自行折疊為所欲蛋白質，而無須前述使用尿素或鹽酸胍、及透析等人為步驟。

於一可行實施態樣中，前述宿主為一大腸桿菌。較佳地，前述大腸桿菌為BL21、BL21(DE3)、Rosetta2、或Shuffle。

本發明的第二個面向為一種防治豬第二型環狀病毒感染的組 合物，其包含：豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質、豬干擾素α、豬干擾素γ、及一醫藥可接受之載劑。

於一較佳實施態樣中，前述防治豬第二型環狀病毒感染的組合物包含：2.5至250μg/mL之豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質；2.5至25μg/mL之豬干擾素α；2.5至25μg/mL之豬干擾素γ；及一醫藥可接受之載劑。又於另一更佳實施態樣中，前述防治豬第二型環狀病毒感染的組合物包含：3.5至170μg/mL之豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質；5至20μg/mL之豬干擾素α；5至20μg/mL之豬干擾素γ；及一醫藥可接受之載劑。

於一較佳實施態樣中，前述豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質係如本發明方法所製得者。於一較佳實施態樣中，前述豬干擾素α、及/或前述豬干擾素γ係如本發明方法所製得者。

本發明所述「醫藥可接受之載劑」係指從醫學/藥學的觀點而論，不對前述豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質、前述豬干擾素α、及/或前述豬干擾素γ於前述組合物防治豬第二型環狀病毒感染的目的上產生負面影響的物質。於一可行實施態樣中，前述醫藥可接受之載劑例如，但不限於：水、磷酸緩衝食鹽水、醇、甘油、甲殼素、海藻酸鹽、軟骨素、維生素E、礦物質、或其組合。

於一較佳實施態樣中，前述組合物進一步包含一醫藥可接受之佐劑。本發明所述「醫藥可接受之佐劑」係指從醫學/藥學的觀點而論，有助於前述豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質、前述豬干擾素α、及/或前述豬干擾素γ於前述組合物防治豬第二型環狀病毒感染的目的上產生免疫增強效果的物質。於一可行實施態樣中，前述醫藥可接受之載劑例如，但不限於：MONTANIDE^TM ISA 536 VG佐劑、MONTANIDE^TM GEL 01佐劑、弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子聚合物、肽、油乳液、或其組合。於一較佳實施態樣中，前述醫藥可接受之載劑為MONTANIDF^TM ISA 536 VG佐劑、MONTANIDE^TM GEL 01佐劑、或其組合。

本發明之研究過程將進一步於下列實施例中詳述。惟以下內容僅例示性的說明本發明的特徵，以利理解。所屬領域具有通常知識者自可在不違背本發明精神的前題下參酌下列內容並基於領域中的通常知識加以變化，而仍屬於本發明的權利範圍。

實施例一：建構豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質(PCV2 ORF2)表現載體。 PCV2病毒之分離與基因體定序

由感染PCV2之豬場(雲林，台灣)取得病弱豬之脾臟與淋巴結等淋巴器官，以滅菌之剪刀剪碎後，再利用滅菌之研磨缽與研磨棒將淋巴器官磨碎，並加入適量之滅菌磷酸緩衝溶液混合均勻，製成乳劑。利用離心(6,000×g，20分鐘)方式收取上清液，再經濾網過濾去除組織碎片。利用DNA純化套組(DNeasy Blood & Tissue kit；Qiagen,USA)進行病毒DNA之抽取。取100μL的乳劑上清液，加入180μL的ATL Buffer與20μL的蛋白酶K(proteinase K；10mg/mL)，於56℃下作用2小時。之後，加入200μL的絕對酒精並混合均勻。吸取所有溶液至離心分離小管(spin column)，並將離心分離小管放置於收集小管(collection tube)中，於6,000×g下離心1分鐘。將離心分離小管放置於一新的收集小管中，再加入500μL的AW1 Buffer至分離小管中，於6,000×g下離心1分鐘。將離心分離小管放置於一新的收集小管中，再加入500μL的AW2 Buffer至離心分離小管中，於20,630×g下離心5分鐘。將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量無菌去離子水引流DNA。

設計引子PCVF(5’-ACCAGCGCACTTCGGCAGC-3’；SEQ ID NO 05)與PCVR(5’-AATACTTACAGCGCACTTCTTTCGT TTTC-3’；SEQ ID NO 06)，並利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增PCV2基因體DNA。PCR反應混合物的 體積為100μL，其中包括10μL之前述由淋巴器官萃取之DNA，10μL 10X Taq buffer，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子及2.5U DreamTaq DNA Polymerase(Thermo,USA)。PCR反應條件為94℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、59℃反應30秒、72℃反應1分鐘30秒(35個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。

PCR產物經PCR-M^TM Clean Up kit(GMbiolab,Taiwan)回收後，利用益生yT&A選殖載體試劑組(Yeastern,Taiwan)進行TA選殖。實驗步驟參考廠商提供之yT&A選殖載體試劑組操作手冊進行。取5μL回收純化之PCR產物與2μL yT&A載體、1μL接合緩衝液A(ligation buffer A)、1μL接合緩衝液B和1μL T4 DNA接合酶(2 unit/μL)混合均勻後，於22℃下作用30分鐘。取1μL接合混合物(ligation mixture)轉形入大腸桿菌ECOS 9-5(Yeastern,Taiwan)。轉形後之菌體加入1mL SOC再生培養液中，於37℃與250rpm之條件下震盪60分鐘。之後，取適量菌液塗佈於含氨苄西林(ampicillin)(最終濃度為100μg/mL)之固態培養基上，於37℃下培養16小時。

之後，以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。菌落聚合酶連鎖反應實驗步驟如下所述。首先，先準備一微量離心管加入50μL的2倍Premix反應緩衝液(GMbiolab,Taiwan)、0.5μL的100mM PCVF引子、0.5μL的100mM PCVR引子及49μL的滅菌水，混合均勻後，再將PCR反應液分裝於PCR小管(10μL/管)中。以牙籤將菌落點至PCR小管後，即可進行PCR反應。PCR反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、59℃反應30秒、72℃，反應1分鐘30秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA(insert DNA)後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)，將含有PCV2 DNA之質體命名為pTA-PCV2。

ORF2基因(即外鞘蛋白質之基因)擴增與密碼子最適化 (1)ORF2基因之擴增：

以前述pTA-PCV2作為模板，利用ORF2F/ORF2R引子組合(ORF2F；5’-CAATATGGATCCATGA CGTATCCAAGGAGGCGT TTC-3’；SEQ ID NO 07與ORF2R；5’-GATATAGTCGACTTAGGGT TTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’；SEQ ID NO 08)進行ORF2基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pTA-PCV2及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、60℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。利用瓊脂醣膠體電泳確認PCR產物中是否含有預估大小的DNA片段。接著，利用PCR-M^TM Clean Up kit進行PCR產物之回收。根據定序結果，前述ORF2基因的序列如SEQ ID NO 09所示。

(2)密碼子最適化ORF2(OPTORF2)基因之合成：

依據大腸桿菌的偏好密碼子(preferred codons)將ORF2之胺基酸序列反向推導為核苷酸序列。依據前述核苷酸序列設計引子：OPTORF2-T1、OPTORF2-T2、OPTORF2-T3、OPTORF2-T4、OPTORF2-T5、OPTORF2-T6、OPTORF2-T7、OPTORF2-T8、OPTORF2-T9、OPTORF2-T10、OPTORF2-T11、OPTORF2-T12、OPTORF2F及OPTORF2R，其序列如下表一所示。

以OPTORF2-T1~OPTORF2-T12作為模板引子，OPTORF2與OPTORF2R則作為擴增引子。利用重疊延伸聚合酶連鎖反應(overlapping-extension polymerase chain reaction,OEPCR)大量擴增密碼子最適化之ORF2基因。在50μL的PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM的各引子及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。根據定序結果，前述密碼子最適化的ORF2基因的序列如SEQ ID NO 24所示。

SUMO基因之擴增與密碼子最適化 (1)SUMO基因之擴增：

將由日正食品DIY速發酵母所分離之麵包酵母(Saccbaromyces cerevisiae)接種於YPD(20%peptone,10%yeast extract,20%glucose；pH 6.5)培養基中，於30℃與200rpm之條件下進行振盪培養16小時後，利用YeaStar^TM Genomic DNA kit(Zymo Research,USA)進行酵母菌基因體之抽取。取1.5mL隔夜培養之菌液至微量離心管中，離心(2,000×g，5分鐘，室溫)收集菌體部分，並加入120μL YD Digestion Buffer與5μL R-Zymolase充分混合後，於37℃下作用一小時。接著加入120μL YD Lysis Buffer，緩和混合數次後，再加入250μL氯仿並進行震盪1分鐘。離心(10,000×g，2分鐘，室溫)收集上清液。將離心分離小管放置於收集小管上，並將上清液置入離心分離小管中，經離心(10,000×g，1分鐘，室溫)後，倒除濾液。加入300μL DNA清洗緩衝液至離心分離小管中，離 心(10,000×g，1分鐘，室溫)後，倒除濾液，並重複此步驟一次。將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量之溶離溶液(elution solution)至離心分離小管中並離心(10,000×g，2分鐘，室溫)以引流基因體DNA。

以前揭段落中獲得之麵包酵母基因體作為模板，利用SUMOF(5’-GATATAGGTACCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAG-3’；SEQ ID NO 25)/SUMOR(5’-CAATATGGATCCACCACCAATCTG TTCTCTGTGAGC-3；SEQ ID NO 26)引子組合進行SUMO基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，200ng麵包酵母基因體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

(2)密碼子最適化SUMO(OPTSUMO)基因之合成：

依據大腸桿菌的偏好密碼子將SUMO之胺基酸序列反向推導為核苷酸序列。依據前述核苷酸序列設計引子：OPTSUMO-T1、OPTSUMO-T2、OPTSUMO-T3、OPTSUMO-T4、OPTSUMO-T5、OPTSUMO-T6、OPTSUMO-T7、OPTSUMO-T8、OPTSUMOF及OPTSUMOR，其序列如下表二所示。

以OPTSUMO-T1~OPTSUMO-T8作為模板引子，OPTSUMOF與OPTSUMOR則作為擴增引子。利用重疊延伸聚合酶連鎖反應大量擴增密碼子最適化之SUMO基因。在50μL的PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM的各引子及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。根據定序結果，前述密碼子最適化的SUMO基因的序列如SEQ ID NO 37所示。

ORF2融合蛋白質表現載體之建構 (1)pET-DRAHIS之建構：

以pET29a作為模板，利用DRAF(5’-GATATACATATGAAAAAAAAATTCGTATCGCATCACCATCACCA TCACAGCGGTGGTGGTACCCCAGATCTGGGTACCCTGG-3’；SEQ ID NO 38)/T7 terminator(GCTAGTTATTGCTCAGCGG；SEQ ID NO 39)引子組合進行PCR反應。在50μL PCR反應混合物中包含1倍Ex Taq^TM緩衝液，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pET29a及1.25U TakaRa Ex Taq^TM DNA聚合酶(Takara,Japan)。PCR之反應條件為94℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應50秒(35個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

PCR產物以NdeI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將黏合產物轉形入大腸桿菌XL1-blue(Protech,Taiwan)中。隨機挑選轉形株進行DNA定序確認。將DNA序列正確無誤之質體命名為pET-DRAHIS。此質體之起始碼後帶有下游序列(downstream sequence,DS)AAAAAAAAATTCGTATCG(SEQ ID NO 40)與His tag之DNA序列CATCACCATCACCATCAC(SEQ ID NO 41)。

(2)pET-SUMO-ORF2表現載體之建構：

自麵包酵母基因體擴增之SUMO基因以KpnI與BamHI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET-DRAHIS中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-SUMO。

自PCV2雲林病毒基因體擴增之ORF2基因以BamHI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET-SUMO中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-SUMO-ORF2，其具有如SEQ ID NO 42所示序列。

(3)pET-OPTSUMO-ORF2表現載體之建構：

將合成之OPTSUMO基因以KpnI與BamHI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET-DRAHIS中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-OPTSUMO。

自PCV2雲林病毒基因體擴增之ORF2基因以BamHI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET-OPTSUMO中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-OPTSUMO-ORF2，其具有如SEQ ID NO 43所示序列。

(4)pET-SUMO-OPTORF2表現載體之建構：

將合成之OPTORF2基因以BamHI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET-SUMO中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有 外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-SUMO-OPTORF2，其具有如SEQ ID NO 44所示序列。

(5)pET-OPTSUMO-OPTORF2表現載體之建構：

將合成之OPTORF2基因以BamHI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET-OPTSUMO中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-OPTSUMO-OPTORF2，其具有如SEQ ID NO 45所示序列。

(6)pBA-OPTSUMO-OPTORF2表現載體之建構：

本實驗中所建構之pBA-OPTSUMO-OPTORF2係將OPTSUMO-OPTORF2之DNA片段嵌入一新穎之阿拉伯糖誘導表現載體pBCM-araM11所得。pBCM-araM11係採用本發明之申請人於中華民國發明專利申請案第103146225號案(申請日：西元2014年12月30日)及第103142753號案(申請日：西元2014年12月9日)所揭露的阿拉伯糖誘導表現元件及pBRCMMCS(SEQ ID NO 100)進行建構。有關表現載體之建構過程描述如下。

將pARABM11-GFPT以EcoRI與NdeI剪切後，利用Gel-M^TM gel extraction system kit(GMbiolab,Taiwan)回收含有araC與araB-M11表現元件之DNA片段。利用T4 DNA連接酶將araC與araB-M11表現元件接入以相同限制酶剪切之pBRCMMCS中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將序列正確無誤之質體命名為pBCM-araM11，其具有SEQ ID NO 98所示序列。

pET-OPTSUMO-OPTORF2以NdeI與SalI剪切後，利用Gel-M^TM gel extraction system kit回收含有OPTSUMO-OPTORF2之DNA片段。利用T4 DNA連接酶將OPTSUMO-OPTORF2接入以相同限制酶剪切之pBCM-araM11中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將序列正確無誤之質體命名為pBA-OPTSUMO-OPTORF2，其具有如SEQ ID NO 46所示序列。

前述含有araB-M11表現元件之DNA片段即本發明之阿拉伯糖誘導表現元件，其包含一啟動子(其-16部位如SEQ ID NO 03所示)、一T7噬菌體轉譯增強元件(SEQ ID NO 01)、及一核糖體結合部位(SEQ ID NO 02)。前述阿拉伯糖誘導表現元件係如中華民國發明專利申請案第103146225號案(申請日：西元2014年12月30日)所示，其具有如SEQ ID NO 04所示序列。

小結

綜上所述，本實施例共製得5個豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質表現載體，分別為：pET-SUMO-ORF2(SEQ ID NO 42)、pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO 43)、pET-SUMO-OPTORF2(SEQ ID NO 44)、pET-OPTSUMO-OPTORF2(SEQ ID NO 45)、及pBA-OPTSUMO-OPTORF2(SEQ ID NO 46)，並請參第一圖所載示意圖。

實施例二：製備本發明之豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質。

如前所述，實施例一所製得之各個載體(SEQ ID NO 42至46)含有外鞘蛋白質ORF2之DNA，可應用於外鞘蛋白質之生產。並且，為了純化及水溶性表現的需要，該目標蛋白質係與SUMO蛋白質及His tag合成為融合蛋白質，本文中將此融合蛋白質稱之為SUMO-ORF2融合蛋白質，並不再贅述該融合蛋白質係帶有His tag。本實施例將利用實施例一中所述之表現載體進行本發明SUMO-ORF2融合蛋白質之製備。

大腸桿菌之轉形與重組SUMO-ORF2融合蛋白質之誘導表現 (1)實驗步驟：

將pET-SUMO-ORF2、pET-OPTSUMO-ORF2、pET-SUMO-OPTORF2及pET-OPTSUMO-OPTORF2等表現載體分別轉形入E.coli BL21(DE3)(Yeastern,Taiwan)中。將pET-SUMO-ORF2轉形至E.coli Rosetta2(EMD Millipore,USA)中。將pBA-OPTSUMO-OPTORF2轉形入E.coli BL21(New England Biolabs,USA)中。轉形之方法參照廠商提供之操作步驟進行。

將E.coli BL21(DE3)轉形株接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中。於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。將細菌培養至以分光光度計量測細胞濃度達OD₆₀₀約0.4~0.6，加入0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)進行蛋白質之誘導表現。誘導4小時後，離心(8,000×g，30分鐘，4℃)收集菌體部分並以蛋白質電泳與西方墨漬法觀察SUMO-ORF2融合蛋白質之表現情形。西方墨漬法中所使用之一級抗體與二級抗體分別為兔抗His tag多株抗體(rabbit anti-6×His polyclonal antibody；Protech,Taiwan)與鹼性磷酸酵素共軛山羊抗兔抗體【alkaline phosphatase-conjugated goat anti-rabbit IgG(H+L)】；所使用之呈色劑為NBT/BCIP(Thermo,USA)。另亦針對菌體進行可溶性蛋白質與不可溶性蛋白質之劃分(即，可溶性與否)並以蛋白質電泳觀察SUMO-ORF2融合蛋白質之可溶性表現情形。

將E.coli Rosetta2轉形株接種於含有氯黴素(chloramphenicol)(最終濃度為34μg/mL)與康那黴素(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有氯黴素(最終濃度為34μg/mL)與康那黴素(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中。於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。將細菌培養至以分光光度計量測細胞濃度達OD₆₀₀約0.4~0.6，加入0.1mM IPTG進行蛋白質之誘導表現。誘導4小時後，離心(8,000×g，30分鐘，4℃)收集菌體部分並以蛋白質電泳與西方墨漬法觀察SUMO-ORF2融合蛋白質之表現情形。另亦針對菌體進行可溶性蛋白質與不可溶性蛋白質之劃分並以蛋白質電泳觀察SUMO-ORF2融合蛋白質之可溶性表現情形。

將E.coli BL21轉形株接種於含氯黴素(25μg/mL)之LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。經隔夜培養後，將菌液以1：100之比例接種至含有氯黴素(25μg/mL)之LB培養基中。於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。將細菌培養至以分光光度計量測細胞濃度達OD₆₀₀約0.4~0.6，加入0.2%阿拉伯糖進行蛋白質誘導表現。誘導4小時後，離心(8,000×g，30分鐘，4℃)收集菌體部分並以蛋白質電泳與西方墨漬法觀察SUMO-ORF2融合蛋白質之表現情形。另亦針對菌體進行可溶性蛋白質與不可溶性蛋白質之劃分並以蛋白質電泳觀察SUMO-ORF2融合蛋白質之可溶性表現情形。

蛋白質電泳膠片經掃描後，使用Image Quant TL 7.0(GE Healthcare Life Sciences,USA)軟體估算重組SUMO-ORF2融合蛋白質之表現百分比，並進一步計算融合蛋白質之產量。

(2)實驗結果：

結果顯示，將pET-SUMO-ORF2與pET-OPTSUMO-ORF2轉形入E.coli BL21(DE3)中並進行誘導，重組SUMO-ORF2融合蛋白質完全不表現(第二圖)。將pET-SUMO-ORF2轉形入可產生 對應罕見密碼子tRNA之E.coli Rosetta2中並進行誘導。結果顯示，重組SUMO-ORF2融合蛋白質可表現(第二圖)，且主要為可溶性蛋白質(第三圖)；可溶性重組SUMO-ORF2融合蛋白質之產量為46.81mg/L。上述ORF2基因無法於E.coli BL21(DE3)中表現之情形說明ORF2所帶有之密碼子嚴重影響SUMO-ORF2融合蛋白質於大腸桿菌中的表現。

將帶有密碼子最適化ORF2基因之pET-SUMO-OPTORF2轉形入E.coli BL21(DE3)中並進行誘導。結果顯示，重組SUMO-ORF2融合蛋白質可順利被表現(第二圖)，且主要為可溶性蛋白質(第三圖)；可溶性重組SUMO-ORF2融合蛋白質之產量為54.62mg/L。此結果說明，ORF2密碼子經最適化後，可提升SUMO-ORF2融合蛋白質於E.coli BL21(DE3)中的表現。

將帶有密碼子最適化之ORF2全長基因與密碼子最適化SUMO基因之pET-OPTSUMO-OPTORF2表現載體轉形入E.coli BL21(DE3)中並進行誘導。結果顯示，重組SUMO-ORF2融合蛋白質可順利被表現(第二圖)，且主要為可溶性蛋白質(第三圖)；可溶性重組SUMO-ORF2融合蛋白質之產量為81.66mg/L。此結果說明，融合伴子基因之密碼子經最適化後，亦可進一步提升ORF2融合蛋白質於大腸桿菌中之表現。過去之研究未有針對SUMO基因密碼子進行最適化以提升融合蛋白質表現量之實例。本發明證實SUMO基因之密碼子經最適化後，可提升SUMO-ORF2融合蛋白質之產量。

將帶有下游序列-His tag DNA-密碼子最適化之SUMO基因-密碼子最適化ORF2基因之DNA片段嵌入阿拉伯糖誘導表現載體pBCM-araM11中並轉形入E.coli BL21中進行重組SUMO-ORF2融合蛋白質之生產。結果顯示，利用阿拉伯糖誘導表現系統亦可生產重組SUMO-ORF2融合蛋白質(第二圖)，且主要為可溶性蛋白質(第三圖)。利用此表現載體進行SUMO-ORF2融合蛋白質之生產，可獲得最高之產量(103.04mg/L)；與T7表現系統之最高產 量(81.66mg/L)相較之下，產量約可提升1.27倍。本發明實施例一之各表現載體於此實驗中表現可溶性SUMO-ORF2融合蛋白質的產量統整於下表三。

利用固定化金屬離子親和性層析進行重組SUMO-ORF2融合蛋白質之純化

利用重組SUMO-ORF2融合蛋白質之N端帶有His tag能與鎳或鈷離子形成配位共價鍵之特性，採用固定化金屬離子親和性層析法進行蛋白質純化。純化之方式係利用蛋白質液相層析系統ÄKTA prime plus(GE Healthcare,Sweden)搭配5mL HiTrap^TM Ni excel管柱(GE Healthcare,Sweden)進行。

將菌體懸浮於Lysis buffer(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH 8.0)中，並利用超音波破碎儀將菌體破碎後，離心(8,000×g,15分鐘)收集上清液部分。以25mL Lysis buffer平衡管柱後，將破菌上清液注入HiTrap^TM Ni excel管柱。待樣品注入完成後，以100mL清洗緩衝液(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,30mM imidazole,pH 8.0)洗除非特異性結合之蛋白質。最後以150mL Elution buffer(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,250mM imidazole,pH 8.0)沖提樹 脂上的重組蛋白質，其係藉助高濃度的imidazole與重組蛋白質競爭樹脂結合部位，致使重組SUMO-ORF2融合蛋白質自樹脂上被沖提下來。利用蛋白質電泳觀察重組SUMO-ORF2融合蛋白質之純化情形。實驗結果如第四圖中所示。

以SUMO蛋白酶剪切本發明之SUMO-ORF2融合蛋白質

本實驗利用SUMO蛋白酶剪切由大腸桿菌表現系統所製得的ORF2融合蛋白質。經剪切後，將可獲得帶有His tag之SUMO融合伴子片段與外鞘蛋白質片段。於本實驗中將透過大腸桿菌表現系統生產SUMO蛋白酶並應用於前揭用途。所屬領域具有通常知識者亦可採用其他方式取得的SUMO蛋白酶進行此步驟。

(1)重組SUMO蛋白酶表現載體pET-SUMOPH之建構：

以麵包酵母基因體作為模板，利用SUMOPF(5’-CAATATGGATCCCTTGTTCCTGAATTAAATGAAAAAGACG-3’；SEQ ID NO 47)/SUMOPENZHISR(5’-GATATACTCGAGT TAGTGATGGTGATGGTGATGACCACTGCCGCTACCTTTTAAAG CGTCGGTTAAAATCAAATG-3；SEQ ID NO 48)引子組合進行SUMO蛋白酶基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，200ng麵包酵母基因體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

自酵母菌基因體擴增之SUMO蛋白酶基因以BamHI與Xb ₀ I剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以BamHI與SalI 剪切之pET29a中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-SUMOPH，其具有SEQ ID NO 49所示序列。

(2)重組D-SUMO蛋白酶表現載體pET-D-SUMOPH之建構：

以Lambda噬菌體DNA(Promega,USA)作為模板，利用DF(5’-GATATAGGTACCATGACGAGCAAAGAAACCTTTACC-3’；SEQ ID NO 50)與DR(5’-CAATATGGATCCAACGATGCTG ATTGCCGTTC-3’；SEQ ID NO 51)引子組合進行D蛋白質基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng Lambda噬菌體DNA及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

自Lambda噬菌體DNA擴增之D蛋白質基因以KpnI與BamHI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-D，其具有SEQ ID NO 99所示序列。

自酵母菌基因體擴增之SUMO蛋白酶基因以BamHI與Xb ₀ I剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以BamHI與SalI 剪切之pET-D中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-D-SUMOPH，其具有SEQ ID NO 52所示序列。

(3)重組蛋白酶之誘導表現與純化：

將pET-SUMOPH與pET-D-SUMOPH等表現載體分別轉形入E.coli BL21(DE3)中。將E.coli BL21(DE3)轉形株接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中。於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。將細菌培養至以分光光度計量測細胞濃度達OD₆₀₀約0.4~0.6，加入0.1mM IPTG進行蛋白質之誘導表現。誘導4小時後，離心(8,000×g，30分鐘，4℃)收集菌體部分進行可溶性蛋白質與不可溶性蛋白質之劃分並以蛋白質電泳與西方墨漬法觀察重組蛋白酶之可溶性表現情形。西方墨漬法中所使用之一級抗體與二級抗體分別為兔抗His tag多株抗體與鹼性磷酸酵素共軛山羊抗兔抗體；所使用之呈色劑為NBT/BCIP。重組蛋白酶之純化方法同重組ORF2融合蛋白質之純化方法。

結果顯示，SUMO蛋白酶與D-SUMO蛋白酶皆可於E.coli BL21(DE3)中表現(第五圖)，產量分別為20.55mg/L與46.94mg/L；其中D-SUMO蛋白酶的產量較高，其莫耳數約為SUMO蛋白酶的2.2倍。此結果說明，利用融合表現之策略可增進SUMO蛋白酶於大腸桿菌中的表現量。

接著利用重組蛋白酶之C端帶有His tag之特性，採用固定化金屬離子親和性層析法進行蛋白質純化。結果顯示，利用固定化 金屬離子親和性管柱可進行胞內可溶性重組SUMO蛋白酶與D-SUMO蛋白酶之純化(第六圖)；其中D-SUMO蛋白酶之純化產量較高，由1L培養液中可純化21.50mg之蛋白質，約為SUMO蛋白酶純化產量(15.33mg)的1.4倍。

(4)剪切重組SUMO-ORF2融合蛋白質，並觀察類病毒顆粒的形成：

將純化之重組SUMO-ORF2融合蛋白質與重組蛋白酶(SUMO蛋白酶或D-SUMO蛋白酶)以重量比為1：0.05之比例混合(例如1mg重組ORF2融合蛋白質與0.05mg重組蛋白酶)，並使混合物於4℃下作用16小時。將剪切後之蛋白質溶液放入Amicon ultra-15 ultracel-100K離心管(Merck Millipore,USA)中，在4℃以2,600×g離心至適當體積。之後利用100kDa之再生纖維素(regeberated cellulose)過濾膜進行剪切蛋白質之過濾。結果顯示，利用100kDa之過濾膜可有效去除融合伴子，毋需利用管柱層析方法進行ORF2與融合伴子之分離，可有效節省抗原生產成本(第七圖)。

接著，分別將SUMO-ORF2融合蛋白質、經蛋白酶剪切的SUMO-ORF2融合蛋白質、及經蛋白酶剪切再經過濾後所得之ORF2融合蛋白質置於銅網(copper grid)上，於室溫下放置三分鐘。然後以濾紙(filter paper)將多餘水分吸乾後，加入醋酸鈾醯(uranyl acetate)染劑進行負染色(negative stain)，染色時間約為40秒至1分鐘。之後利用濾紙將多餘染劑吸乾，以場發射穿透式電子顯微鏡JEM-2100F(JEOL,Japan)進行類病毒顆粒之觀察。

結果顯示，SUMO-ORF2融合蛋白質無法形成類病毒顆粒，但經蛋白酶剪切的重組SUMO-ORF2融合蛋白質、及經蛋白酶剪切再經過濾後所得之ORF2融合蛋白質皆可形成類病毒顆粒(第八圖)。由穿透式電子顯微鏡圖形計算類病毒顆粒的平均粒徑約為19 nm。

實施例三：製備豬干擾素。

本發明揭露豬干擾素為特別合適作為豬第二型環狀病毒之次單位疫苗的佐劑。是故本實施例中以大腸桿菌宿主細胞生產本發明之次單位疫苗所需的豬干擾素α及豬干擾素γ。

重組豬干擾素α(IFN-α)與γ(IFN-γ)基因之合成 (1)IFN-α基因之合成：

依據大腸桿菌的偏好密碼子將熟成豬干擾素α-6之胺基酸序列反向推導為核苷酸序列。依據前述核苷酸序列設計引子：OPTIFNA-T1、OPTIFNA-T2、OPTIFNA-T3、OPTIFNA-T4、OPTIFNA-T5、OPTIFNA-T6、OPTIFNA-T7、OPTIFNA-T8、OPTIFNAF及OPTIFNAR，其序列如下表四所示。

以OPTIFNA-T1~OPTIFNA-T8作為模板引子，OPTIFNAF與OPTIFNAR則作為擴增引子。利用重疊延伸聚合酶連鎖反應大量擴增密碼子最適化之IFN-α基因。在50μL的PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM的各引子及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、58℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

利用CloneJET PCR Cloning Kit(Thermo,USA)進行基因之選殖，並將黏合混合物(ligation mixture)轉形入大腸桿菌ECOS 9-5。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pJET-IFNA-6，其具有如SEQ ID NO 63所示序列。經定序驗證，密碼子最適化之IFN-α 基因具有SEQ ID NO 64所示序列。

(2)IFN-γ之合成：

依據大腸桿菌的偏好密碼子將熟成豬干擾素γ之胺基酸序列反向推導為核苷酸序列。依據前述核苷酸序列設計引子：OPTIFNR-T1、OPTIFNR-T2、OPTIFNR-T3、OPTIFNR-T4、OPTIFNR-T5、OPTIFNR-T6、OPTIFNR-T7、OPTIFNR-T8、OPTIFNRF及OPTIFNRR，其序列如下表五所示。

以OPTIFNR-T1~OPTIFNR-T8作為模板引子，OPTIFNRF與OPTIFNRR則作為擴增引子。利用重疊延伸聚合酶連鎖反應大量擴增密碼子最適化之IFN-γ基因。在50μL的PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM的各引子及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、57℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

利用CloneJET PCR Cloning Kit進行基因之選殖，並將黏合混合物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pJET-IFNR，其具有如SEQ ID NO 75所示序列。經定序驗證，密碼子最適化之IFN-γ基因具有SEQ ID NO 76所示序列。

豬干擾素α與γ表現載體之建構 (1)pET-OPTPIFNAH表現載體之建構：

以pJET-IFNA-6質體作為模板，利用PIFNANDEIF(5’-CAATATCATATGTGCGATCTGCCGCAAACC-3’；SEQ ID NO 77)/PIFNAHISSALIR(5’-GATATAGTCGACTTATTAGTGATGGTG ATGGTGATGTTCCTTTTTACGCAGGCGGTC-3’；SEQ ID NO 78)引子組合進行IFN-α基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包 含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pJET-IFNA-6及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

PCR產物以NdeI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO 79所示序列。

(2)pBA-OPTPIFNAH表現載體之建構：

利用上述PCR擴增之IFN-α基因以NdeI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段分別接入以相同限制酶剪切之pBCM-araM11中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體分別命名為pBA-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO 80所示序列。

(3)pET-SUMO-OPTPIFNAH表現載體之建構：

以麵包酵母基因體作為模板，利用SUMOF(SEQ ID NO 25)/SUMOR2(5’-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3’；SEQ ID NO 81)引子組合進行SUMO基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP 與dCTP，1μM擴增引子，200ng麵包酵母基因體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用Gel-M^TM gel extraction system kit進行PCR產物之回收。

以pJET-IFNA-6質體作為模板，利用SUMOIFNAF(5’-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTTGCGATCTGCCGCAAACC-3’；SEQ ID NO 82)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO 78)引子組合進行IFN-α基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pJET-IFNA-6及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用Gel-M^TM gel extraction system kit進行PCR產物之回收。

以上述之兩個PCR產物作為模板，利用SUMOF(SEQ ID NO 25)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO 78)引子組合進行聚合酶連鎖反應即可獲得SUMO-IFN-α融合基因。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng SUMO PCR產物，100ng IFN-α PCR產物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

PCR產物以KpnI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將黏合產物轉形進入大 腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-SUMO-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO 83所示序列。

(4)pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH表現載體之建構：

以pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO 43)作為模板，利用OPTSUMOF(SEQ ID NO 35)/OPTSUMOR2(5’-GCCGCC GATTTGTTCACGG-3’；SEQ ID NO 84)引子組合進行OPTSUMO基因之擴增。

在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ngpET-OPTSUMO-ORF2及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用Gel-M^TM gel extraction system kit進行PCR產物之回收。

以pJET-IFNA-6質體(SEQ ID NO 63)作為模板，利用OPTSUMOIFNAF(CCGTGAACAAATCGGCGGCTGCGATCTG CCGCAAACC；SEQ ID NO 85)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO 78)引子組合進行IFN-α基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pJET-IFNA-6及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用Gel-M^TM gel extraction system kit進行PCR產物之回收。

以上述之兩個PCR產物作為模板，利用OPTSUMOF(SEQ ID NO 35)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO 78)引子組合進行聚合酶連鎖反應即可獲得OPTSUMO-IFN-α融合基因。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng OPTSUMO PCR產物，100ng IFN-α PCR產物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

PCR產物以KpnI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO 86所示序列。

(5)pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH表現載體之建構：

pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH以NaeI與SalI剪切後，利用Gel-M^TM gel extraction system kit回收含有OPTSUMO-IFN-α融合基因之DNA片段。利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pBCM-araM11中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO 87所示序列。

(6)pET-OPTPIFNRH表現載體之建構：

以pJET-IFNR質體作為模板，利用PIFNRNDEIF(5’-CAATATCATATGCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3’；SEQ ID NO 88)/PIFNRHISSALIR(5’-GATATAGTCGACTTATTAGTGATG GTGATGGTGATGTTTGCTGGCACGCTGACC-3’；SEQ ID NO 89)引子組合進行IFN-γ基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pJET-IFNR及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

PCR產物以NdeI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-OPTPIFNRH，其具有SEQ ID NO 90所示序列。

(7)pET-SUMO-OPTPIFNRH表現載體之建構：

以麵包酵母基因體作為模板，利用SUMOF(SEQ ID NO 25)/SUMOR2(SEQ ID NO 81)引子組合進行SUMO基因之擴增。擴增條件與PCR回收方式如前所述。

以pJET-IFNR質體(SEQ ID NO 75)作為模板，利用SUMOIFNRF(5’-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTCAAGCC CCGTTTTTCAAAGAA-3’；SEQ ID NO 91)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO 89)引子組合進行IFN-γ基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pJET-IFNR及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用Gel-M^TM gel extraction system kit進行PCR產物之回收。

以上述之兩個PCR產物作為模板，利用SUMOF(SEQ ID NO 25)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO 89)引子組合進行聚合酶連鎖反應即可獲得SUMO-IFN-γ融合基因。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng SUMO PCR產物，100ng IFN-γ PCR產物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

PCR產物以KpnI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-SUMO-OPTPIFNRH，其具有SEQ ID NO 92所示序列。

(8)pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH表現載體之建構：

以pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO 43)作為模板，利用OPTSUMOF(SEQ ID NO 35)/OPTSUMOR2(SEQ ID NO 84) 引子組合進行OPTSUMO基因之擴增。擴增條件與PCR回收方式如前所述。

以pJET-IFNR質體(SEQ ID NO 75)作為模板，利用OPTSUMOIFNRF(5’-CCGTGAACAAATCGGCGGCCAAGCCCC GTTTTTCAAAGAAATC-3’；SEQ ID NO 93)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO 89)引子組合進行豬干擾素γ基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pJET-IFNR及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用Gel-M^TM gel extraction system kit進行PCR產物之回收。

以上述之兩個PCR產物作為模板，利用OPTSUMOF(SEQ ID NO 35)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO 89)引子組合進行聚合酶連鎖反應即可獲得OPTSUMO-IFN-γ融合基因。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng OPTSUMO PCR產物，100ng豬干擾素γ PCR產物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

PCR產物以KpnI與SalI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名 為pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH，其具有SEQ ID NO 94所示序列。

(9)pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH表現載體之建構：

pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH以NdeI與SalI剪切後，利用Gel-M^TM gel extraction system kit回收含有OPTSUMO-IFR-γ融合基因之DNA片段。利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pBCM-araM11中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH，其具有SEQ ID NO 95所示序列。

重組豬干擾素之表現及純化 (1)重組豬干擾素之表現：

將pET-OPTPIFNAH(SEQ ID NO 79)、pBA-OPTPIFNAH(SEQ ID NO 80)、pET-SUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO 83)、pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO 86)及pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO 87)分別轉形至E.coli Shuffle(NEB,USA)中；將pET-OPTPIFNRH(SEQ ID NO 90)、pET-SUMO-OPTPIFNHR(SEQ ID NO 92)、pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH(SEQ ID NO 94)及pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH(SEQ ID NO 95)分別轉形入E.coli BL21(DE3)中。將轉形株接種於含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有康那黴素最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中。於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。將細菌培養至以分光光度計量測細胞濃度達OD600約0.4~0.6，加入0.1mM IPTG於25℃與180rpm之條件下進行蛋白質之誘導表現。誘導4小時 後，離心(8,000×g，30分鐘，4℃)收集菌體部分並以蛋白質電泳觀察重組豬干擾素之表現情形。另亦針對菌體進行可溶性蛋白質與不可溶性蛋白質之劃分並以蛋白質電泳觀察重組豬干擾素之可溶性表現情形。

請參第九圖(A至E)的實驗結果。結果顯示本發明藉由E.coli Shuffle宿主成功生產可溶性重組豬IFN-α與SUMO-IFN-α融合蛋白質，可免除折疊步驟，以避免折疊效率不佳影響生物活性之問題。在SUMO-IFN-α融合蛋白質表現部分，將SUMO基因之密碼子經最適化後，可提升SUMO-IFN-α融合蛋白質之產量。不同表現系統對SUMO-IFN-α融合蛋白質表現之影響結果顯示，利用突變型阿拉伯糖誘導表現系統生產SUMO-IFN-α之產量較高(155.07mg/L；第九圖(E))。又請參第九圖(F至I)的實驗結果。結果顯示利用SUMO融合之策略可增進重組豬IFN-γ的可溶性。SUMO基因之密碼子經最適化後，可提升SUMO-IFN-γ融合蛋白質的產量。不同表現系統對SUMO-IFN-γ融合蛋白質表現之影響結果顯示，利用T7誘導表現系統及突變型阿拉伯糖誘導表現系統生產SUMO-IFN-γ之產量皆相當理想。

(2)重組SUMO蛋白酶表現載體pET-D-SUMOP之建構與表現：

為了剪切前揭段落中所述於大腸桿菌表現系統中表現的豬干擾素，以取得不帶有SUMO蛋白質片段的豬干擾素，本實驗中將透過大腸桿菌表現系統生產SUMO蛋白酶。所屬領域具有通常知識者亦可採用其他方式取得的SUMO蛋白酶進行此步驟。

以麵包酵母基因體作為模板，利用SUMOPF(SEQ ID NO 47)/SUMOPENZR(5’-GATATACTCGAGTTATTTTAAAGCGTCGGT TAAAATCAAATG-3；SEQ ID NO 96)引子組合進行SUMO蛋白酶基因之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引 子，200ng麵包酵母基因體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。然後利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

自酵母菌基因體擴增之SUMO蛋白酶基因以BamHI與Xb ₀ I剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以BamHI與SalI剪切之pET-D中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認轉形株中的重組質體帶有外插DNA後，抽取轉形株中的質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤的質體命名為pET-D-SUMOP，其具有SEQ ID NO 97所示序列。

將pET-D-SUMOP(SEQ ID NO 97)轉形入E.coli BL21(DE3)中。將E.coli BL21(DE3)轉形株接種於含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中。於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養。將細菌培養至以分光光度計量測細胞濃度達OD₆₀₀約0.4~0.6，加入0.1mM IPTG於28℃與180rpm之條件下進行蛋白質之誘導表現。誘導4小時後，離心(8,000×g，30分鐘，4℃)收集菌體部分。

(3)重組豬干擾素之剪切與純化：

將分別帶有SUMO-豬干擾素融合蛋白質表現載體與SUMO蛋白酶表現載體之轉形株經誘導表現後，離心(8,000×g，30分鐘，4℃)收集菌體部分。將收集之菌體懸浮於適量之Lysis buffet(20mM sodium phosphate,500mM NaCl,pH 7.4)中，使其於600nm 下之吸光值達50。利用超音波破碎儀將菌體破碎後，離心(8,000×g，15分鐘，4℃)收集上清液部分。將純化之重組SUMO-豬干擾素融合蛋白質與重組蛋白酶(SUMO蛋白酶)以重量比值為4之比例混合，於4℃靜置16小時；此階段中，SUMO-豬干擾素融合蛋白質會被SUMO蛋白酶剪切成SUMO蛋白質與C端帶有His-tag之豬干擾素。

接著採用固定化金屬離子親和性層析法進行蛋白質純化。純化之方式係利用蛋白質液相層析系統ÄKTA prime plus搭配5mL HiTrap^TM Ni excel管柱進行。以25mL Lysis buffer平衡管柱後，將融合蛋白質剪切溶液注入HiTtap^TM Ni excel管柱。待樣品注入完成後，以100mL清洗緩衝液(20mM sodium phosphate,500mM NaCl,30mM imidazole,pH 7.4)洗除非特異性結合之蛋白質。最後以150mL Elution buffer(20mM sodium phosphate,500mM NaCl,250mM imidazole,pH 7.4)沖提樹脂上的重組豬干擾素並利用蛋白質電泳觀察純化情形(如第十圖中所示)。

實施例四：本發明之防治豬第二型環狀病毒感染的組合物的製備及應用。

本實施例係使用前述實施例二及實施例三所製得的ORF2、SUMO-ORF2融合蛋白質、及豬干擾素製備防治豬第二型環狀病毒感染的組合物。在許多樣品中，該組合物進一步包含MONTANIDE^TM ISA 563 VG佐劑(SEPPIC,France)及/或MONTANIDE^TM GEL 01佐劑(SEPPIC,France)。將各項成分依下列各實驗設計混合，再接種於仔豬，以觀察誘發之免疫反應或是否產生不良反應(如，嘔吐、發抖、精神抑鬱、呼吸急促及施打部位腫脹情形；若出現3種以上的前揭症狀且症狀出現的比例高於50%，則判定該組合物的安全性較低)。

(1)實驗1：豬干擾素含量對本發明組合物之安全性的影響：

選擇3週齡田間仔豬14頭，以隨機方式進行分組，共分為A~G七組，每組豬隻數目為2頭。各組進行1次肌肉注射免疫，免疫劑量為2mL。有關各疫苗成分如下表六。於施打疫苗當天與隔天進行觀察並記錄不良臨床反應出現比例。

實驗結果顯示(表七)，經接種V-001樣品的豬隻呈現精神抑鬱之臨床症狀，但無其他不良反應。經接種V-002樣品的豬隻出現嘔吐與發抖的症狀。此外，V-003樣品的安全性較具疑慮，而經接種V-004樣品、V-005樣品、或V-006樣品的豬隻的不良反應較為輕微。據此後續試驗中豬干擾素的含量將維持於每劑量(2mL)為25μg。

(2)實驗2：佐劑含量對本發明組合物之安全性的影響：

選擇3週齡田間仔豬73頭，以隨機方式進行分組，共分為A與B兩組；A組豬隻數目為38頭，B組則為35頭。各組進行1次肌肉注射免疫，免疫劑量為2mL。有關各疫苗成分如下表八。於施打疫苗當天與隔天進行觀察並記錄不良臨床反應出現比例。實驗結果顯示(表九)，V-009樣品的安全性較高，但V-008樣品的安全性亦可接受。

(3)實驗3：不同佐劑對本發明組合物之免疫誘發效果的影響：

本實驗於家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所基因改造產品(genetically modified organisms,GMOs)動物舍中進行。選擇4週齡無特定病原豬隻11頭，以隨機方式進行分組，共分為A~E五組；A~D為實驗組，每組豬隻數目為2頭，E組為控制組，豬隻 頭數為3頭。A~D組之豬隻於4與6週齡各進行1次肌肉注射免疫，免疫劑量為2mL；E組不進行免疫處理。有關各疫苗成分如下表十。

各組豬隻於8週齡時，進行PCV2攻毒，並於攻毒後4週，全數進行剖檢。於豬隻免疫前(4週齡)、免疫後(6與8週齡)及攻毒後(9、10、11、12週齡)進行血清與血漿樣品之收集。利用市售ELISA套組(BioCheck,Netherlands)測定血清中抗PCV2抗體之力價。利用即時定量聚合酶連鎖反應測定血漿中之病毒含量。

實驗結果顯示V-009、V-010、V-011、及V-012皆能誘發抗ORF2抗體產生(第十一圖)，且能降低實驗豬隻的病毒血症(第十二圖)。從實驗結果亦可觀察到每劑量(2mL)含有67μg ORF2的含量即可產生足夠的免疫效果(V-011及V-012)。

(4)實驗4：採用SUMO-ORF2融合蛋白質或OFR2對本發明組合物之免疫誘發效果的影響：

本實驗於家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所基因改造產品動物舍中進行。選擇4週齡無特定病原豬隻16頭，以隨機方式進行分組，共分為A~E五組；A~D為實驗組，每組豬隻數目為3 頭，E組為控制組，豬隻頭數為4頭。A~D組之豬隻於4與6週齡各進行1次肌肉注射免疫，免疫劑量為2mL；E組不進行免疫處理。有關各疫苗成分如下表十一。

各組豬隻於8週齡時，進行PCV2攻毒，並於攻毒後5週，全數進行剖檢。在特定時間點下進行血清與血漿樣品之收集。利用市售ELISA套組測定血清中抗PCV2抗體之力價。利用即時定量聚合酶連鎖反應測定血漿中之病毒含量。

實驗結果顯示各樣品都能誘發豬隻產生抗PCV2抗體，其中又以V-013樣品(含27μg之ORF2融合蛋白質)的效果最好(第十三圖)。此外，所有樣品都能降低豬隻的病毒血症(第十四圖)。

(5)實驗5：豬干擾素α與豬干擾素γ對本發明組合物之免疫誘發效果的影響：

本實驗於病原污染程度較低且無PCV2感染之牧場中進行。選用無感染PCV2之4週齡1代SPF豬隻20頭。以隨機方式進行分組，共分為A~E五組，每組豬隻數目為4頭；A~D為實驗組，E組為控制組。A~D組之豬隻於4與7週齡各進行1次肌肉注射 免疫，免疫劑量為2mL；E組不進行免疫處理。有關各疫苗成分如下表十二。在特定時間點下進行血清樣品之收集。利用市售ELISA套組測定血清中抗PCV2抗體之力價。

實驗結果顯示，單獨添加IFN-α(V-018)或IFN-γ(V-019)於本發明組合物中對於誘發免疫反應均有增強的效果；其中添加IFN-α的效果優於添加IFN-γ。另一方面，於本發明組合物中同時添加IFN-α與IFN-γ(V-020)可誘發更好的免疫反應，顯示在本發明組合物中，IFN-α與IFN-γ對於增強免疫反應具有協同效果(第十五圖)。

<110> 財團法人農業科技研究院

<120> 豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的製備方法及含該外鞘蛋白質的醫藥組合物

<130>

<160> 99

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

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<213> ENTEROBACTERIA PHAGE T7

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<212> DNA

<213> Escherichia coli

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<223> EXPRESSION CASSETTE

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<213> porcine circovirus

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> PRIMER

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<400> 97

<210> 98

<211> 3662

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PLASMID

<400> 98

<210> 99

<211> 5671

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PLASMID

<400> 99

<210> 100

<211> 2340

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PLASMID

<400> 100

Claims (19)

1. 一種表現一蛋白質的方法，其包含：(a)取得一阿拉伯糖誘導表現載體；其中前述阿拉伯糖誘導表現載體包含一表現元件及一目標蛋白質的核苷酸序列；其中前述表現元件包含：一啟動子；一T7噬菌體轉譯增強元件，其具有SEQ ID NO 01所示之序列；及一核糖體結合部位，其具有SEQ ID NO 02所示序列；(b)將前述阿拉伯糖誘導表現載體轉形至一大腸桿菌宿主中，並進行目標蛋白質之誘導表現；其中前述目標蛋白質為：豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質或豬干擾素。
2. 如請求項第1項所述之方法，其中前述啟動子的-16部位具有SEQ ID NO 03所示之序列。
3. 如請求項第1項所述之方法，其中前述表現元件具有SEQ ID NO 04所示序列。
4. 如請求項第1項所述之方法，其中前述阿拉伯糖誘導表現載體進一步包含一融合伴子的核苷酸序列、及/或一標記分子的核苷酸序列。
5. 如請求項第4項所述之方法，其中前述融合伴子為：大腸桿菌之MsyB、大腸桿菌之YjgD基因、Lambda噬菌體D蛋白質、麵包酵母菌SUMO蛋白質、或其組合。
6. 如請求項第4項所述之方法，其中前述標記分子為：His tag、Strep II tag、Flag tag、或其組合。
7. 如請求項第1項所述之方法，其中前述目標蛋白質為豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質，且其核苷酸序列具有SEQ ID NO 09 或SEQ ID NO 24所示序列。
8. 如請求項第7項所述之方法，其中前述阿拉伯糖誘導表現載體具有SEQ ID NO 46所示序列。
9. 如請求項第1項所述之方法，其中前述豬干擾素為豬干擾素α或豬干擾素γ。
10. 如請求項第9項所述之方法，其中前述目標蛋白質為豬干擾素，且其核苷酸序列具有SEQ ID NO 64或SEQ ID NO 76所示序列。
11. 如請求項第10項所述之方法，其中前述阿拉伯糖誘導表現載體具有SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 87、或SEQ ID NO 95所示序列。
12. 如請求項第11項所述之方法，其不包含前述豬干擾素的折疊步驟。
13. 如請求項第8或11項所述之方法，其中前述步驟(b)之後進一步包含一步驟(c)：純化前述目標蛋白質。
14. 如請求項第13項所述之方法，其中前述步驟(c)之後進一步包含一步驟(d)：以一SUMO蛋白酶處理前述目標蛋白質。
15. 如請求項第14項所述之方法，其中前述步驟(d)之處理中，前述目標蛋白質與前述SUMO蛋白酶的重量比值為4至20。
16. 一種防治豬第二型環狀病毒感染的組合物，其包含：2.5至250μg/mL之豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質；2.5至25μg/mL之豬干擾素α；2.5至25μg/mL之豬干擾素γ；及一醫藥可接受之載劑。
17. 如請求項第16項所述之組合物，其進一步包含一醫藥可接受之佐劑。
18. 如請求項第17項所述之組合物，其中前述醫藥可接受之佐劑為：MONTANIDE^TM ISA 536 VG佐劑、MONTANIDE^TM GEL 01 佐劑、弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子聚合物、肽、油乳液、或其組合。
19. 如請求項第16項所述之組合物，其包含：3.5至170μg/mL之豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質；5至20μg/mL之豬干擾素α；5至20μg/mL之豬干擾素γ；及一醫藥可接受之載劑。