TWI750500B

TWI750500B - 防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物

Info

Publication number: TWI750500B
Application number: TW108130084A
Authority: TW
Inventors: 林俊宏; 周和源; 王志鵬; 陳正文; 黃文正; 吳秀慧; 林慧傑; 黃聖翔
Original assignee: 財團法人農業科技研究院
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2021-12-21
Also published as: TW201945021A

Abstract

本發明關於一種防治黴漿菌感染的組合物，其含有NOX、MS53-0285、或其組合之蛋白質作為活性成分。本發明組合物具有減輕黴漿菌感染所引發之病徵的效果，可作為家禽疾病防治的有效工具。

Description

防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物

本發明關於一種用於防治黴漿菌感染的組合物；尤指一種用於防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物。

黴漿菌（Mycoplasmaspp. ）是目前所知能在細胞外自行複製的最小原核微生物，大小從直徑0.3 μm至0.9 μm不等的球形至可長達1 μm的絲狀形。在營養需求上，黴漿菌為營養苛求性菌（fastidious bacteria），難以培養且生長十分緩慢。目前已知數種黴漿菌與多種人類或動物之疾病有關。

依據文獻報導，可感染家禽之黴漿菌達數十種，其中家禽滑膜黴漿菌（Mycoplasma synoviae）是列在世界動物衛生組織（World Organisation for Animal Health；OIE）家禽黴漿菌病文件中的病原微生物，顯示其對於家禽疾病防治的重要性。

家禽滑膜黴漿菌亦與滑膜炎（synovitis）或關節炎（arthritis）之發生有關。肉用雞隻感染家禽滑膜黴漿菌後，會使飼料效率變差、死亡淘汰率以及屠宰次級品率提高；種雞或蛋雞感染後，亦使產蛋率下降與胚胎死亡率增加。而雞隻受黴漿菌感染後，會更易引起其他病毒性或細菌性病原的二次感染，造成養雞業者龐大的經濟損失。全球動物用疫苗廠商雖已開發有活菌與死菌疫苗供養雞產業使用，惟黴漿菌不易培養，且培養的成本高昂，因此領域中對於防治家禽滑膜黴漿菌感染的疫苗仍有需求。

爰是，本發明之一目的為提供適用於家禽滑膜黴漿菌次單位疫苗的抗原，並據以製得次單位疫苗，以降低防疫成本。

本發明之另一目的為提供一種含有多種抗原之用於防治家禽滑膜黴漿菌感染的次單位疫苗，其具有優於單一抗原之疫苗的免疫保護效果。

為達到上述目的，本發明提供一種防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物，其包含：一活性成分，其包含Tuf、NOX、MS53-0285、或其組合；其中前述Tuf具有SEQ ID NO: 01所示序列，前述NOX具有SEQ ID NO: 02所示序列，前述MS53-0285具有SEQ ID NO: 03所示序列；及一醫藥可接受之佐劑。

較佳地，前述活性成分選自由下列蛋白質所組成之群組中的至少兩個：Tuf、NOX及MS53-0285。更佳地，前述活性成分包含Tuf、NOX、及MS53-0285。

較佳地，前述活性成分的濃度為40至900 μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。

可行地，前述醫藥可接受之佐劑為：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。

較佳地，前述組合物進一步包含一醫藥可接受之添加劑。可行地，前述醫藥可接受之添加劑為溶劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑或其組合。

較佳地，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵為氣管病變、氣囊病變、關節炎、或其組合。

較佳地，當前述活性成分包含Tuf時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵至少為關節炎。較佳地，當前述活性成分包含NOX、MS53-0285、或其組合時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵至少為氣囊病變。較佳地，當前述活性成分包含MS53-0285時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵至少為氣管病變。

較佳地，當前述活性成分包含Tuf、NOX、及MS53-0285時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵為氣管病變、氣囊病變、及關節炎。

本發明另提供一種表現載體，其包含：一核苷酸序列，其具有SEQ ID NO: 04、SEQ ID NO: 05、SEQ ID NO: 06、或其組合所示序列；一表現元件，其包含一啟動子及一核糖體結合部位；及一融合夥伴序列。

本發明更提供一種表現載體，一種表現載體，其包含：一核苷酸序列，其轉譯為Tuf、NOX、MS53-0285、或其組合之蛋白質；其中前述Tuf包含SEQ ID NO: 01所示序列，前述NOX包含SEQ ID NO: 02所示序列，前述MS53-0285包含SEQ ID NO: 03所示序列；一表現元件，其包含一啟動子及一核糖體結合部位；及一融合夥伴序列。

較佳地，前述融合夥伴係大腸桿菌之DsbC、大腸桿菌之MsyB、大腸桿菌之FklB、或其組合。

較佳地，前述表現載體具有SEQ ID NO: 07、SEQ ID NO: 08、或EQ ID NO: 09所示序列。

本發明再提供一種蛋白質用於製備防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物的用途，其中前述蛋白質包含Tuf、NOX、MS53-0285、或其組合；其中前述Tuf具有SEQ ID NO: 01所示序列，前述NOX具有SEQ ID NO: 02所示序列，前述MS53-0285具有SEQ ID NO: 03所示序列。

綜上所述，本發明揭露用於防治家禽滑膜黴漿菌感染的抗原，其可作為次單位疫苗的活性成分。本發明的研發成果不僅提供家禽滑膜黴漿菌防疫工作的新選擇，更揭示組合兩種以上抗原的「雞尾酒」次單位疫苗（即含有兩種以上的抗原作為活性成分）具有更加強之免疫誘發效果。

本發明的研發成果證實Tuf、NOX、及MS53-0285可作為防治家禽滑膜黴漿菌感染之次單位疫苗的活性成分。本發明所稱「防治家禽滑膜黴漿菌感染」是指使家禽受家禽滑膜黴漿菌感染的程度降低；例如，降低受家禽滑膜黴漿菌感染所引發的病徵。前述病徵包括，但不限於氣管病變、氣囊病變、或關節炎（例如足墊腫脹、足墊炎症等）。從科學的角度而論，目標個體是否完全不受到任何所指病原菌感染是無法被證實的。因此，所屬領域具有通常知識者應可理解，在疾病防治的領域中，所謂「防治感染」並非指使目標個體完全不受到任何所指病原菌的感染。

本發明的一個面向關於防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物。在本發明的一個較佳實施態樣中，前述組合物為一次單位疫苗。在本發明的一個較佳實施態樣中，該組合物包含Tuf作為活性成分，且前述Tuf具有SEQ ID NO: 01所示序列。在本發明的另一個較佳實施態樣中，該組合物包含NOX作為活性成分，且前述NOX具有SEQ ID NO: 02所示序列。在本發明的又一個較佳實施態樣中，該組合物包含MS53-0285作為活性成分，且前述MS53-0285具有SEQ ID NO: 03所示序列。

所屬領域具有通常知識者理應可以理解，只要不影響前述蛋白質的抗原決定區域，前述胺基酸序列可容許相當程度的變動，而仍屬於本發明的範疇。舉例來說，所屬領域具有通常知識者可能改變前揭序列中的數個胺基酸，但仍可產生本發明所稱之誘發免疫效果；或是，所屬領域具有通常知識者可能視其需求於前揭序列中添加其他序列，以便於生產，但不影響本發明所稱之免疫誘發效果。前揭情況中經修飾後的序列仍應屬於本發明的範疇。

在本發明的一個實施態樣中，當前述活性成分包含Tuf時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵至少為關節炎。惟此並不表示當前述活性成分包含Tuf時，對於其他病徵沒有效果，而是表示當前述活性成分包含Tuf時，對於關節炎之病徵的預防特別有效。

在本發明的一個實施態樣中，當前述活性成分包含NOX、MS53-0285、或其組合時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵至少為氣囊病變。惟此並不表示當前述活性成分包含NOX、MS53-0285、或其組合時，對於其他病徵沒有效果，而是表示當前述活性成分包含NOX、MS53-0285、或其組合時，對於氣囊病變之病徵的預防特別有效。

在本發明的一個實施態樣中，當前述活性成分包含MS53-0285時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵至少為氣管病變。惟此並不表示當前述活性成分包含MS53-0285時，對於其他病徵沒有效果，而是表示當前述活性成分包含MS53-0285時，對於氣管病變之病徵的預防特別有效。

在本發明的一個實施態樣中，當前述活性成分包含Tuf、NOX、及MS53-0285時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵為氣管病變、氣囊病變、及關節炎。

本發明的另一個面向關於防治家禽滑膜黴漿菌感染的雞尾酒疫苗。本發明所稱雞尾酒疫苗是指該疫苗包含有二種以上的抗原。在一較佳實施態樣中，本發明所稱雞尾酒疫苗是指該疫苗包含有二種以上針對同一種病原菌的抗原。一般而言，於單一疫苗中組合兩種以上之抗原並不一定對該疫苗的免疫誘發效果具有加乘的效果。於單一疫苗中組合兩種以上之抗原可能反而會使得該兩種以上之抗原於免疫誘發的能力產生相互抵銷的不利狀況。另從成本的角度來思考，即便該兩種以上之抗原的免疫誘發的能力不會產生抵銷，若不能具有加乘的效果，則也不值得將該兩種以上之抗原混合於單一疫苗中。

在一較佳實施態樣中，前述雞尾酒疫苗的活性成分選自由下列蛋白質所組成之群組中的至少兩個：Tuf、NOX及MS53-0285。更佳地，前述活性成分包含Tuf、NOX、及MS53-0285。在一可行實施態樣中，只要不破壞前述胺基酸序列摺疊（folding）後的抗原決定區域，前述活性成分可為具有任兩個以上之前述胺基酸序列的融合蛋白質。在另一可行實施態樣中，前述雞尾酒疫苗係使用分別獨立之前述蛋白質。

在一較佳實施態樣中，本發明之組合物進一步包含一醫藥可接受之佐劑及/或一醫藥可接受之添加劑。前述醫藥可接受之佐劑係用以增加活性成分的免疫效果、維持活性成分的穩定性、及提升所述組合物於疫苗用途上的安全性。前述醫藥可接受之佐劑可為，但不限於弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。前述醫藥可接受之添加劑可為，但不限於溶劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑或其組合。

在一可行實施態樣中，本發明之組合物可經調劑為經口施予劑型、經鼻吸收劑型、靜脈注射劑型、肌肉注射劑型、或腹腔注射劑型。在一可行實施態樣中，本發明之組合物中活性成分的濃度為40至900 μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。在另一可行實施態樣中，前述活性成分的濃度為40至600 μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。又在本發明雞尾酒疫苗中，前述活性成分的濃度是指前述雞尾酒疫苗所含所有抗原的總濃度。舉例來說，在本發明雞尾酒疫苗的一具體實例中含有前述Tuf抗原及前述NOX抗原作為活性成分，則前述「活性成分的濃度」係指前述Tuf抗原的濃度及前述NOX抗原的濃度的總和。再舉例言之，在本發明雞尾酒疫苗的另一具體實例中含有前述Tuf抗原、前述NOX抗原及前述MS53-0285抗原作為活性成分，則前述「活性成分的濃度」係指前述Tuf抗原的濃度、前述NOX抗原的濃度、及前述MS53-0285抗原的濃度的總和。

另一方面，於原核細胞表現系統中表現前述活性成分的一個障礙是自前述原核細胞表現系統純化出表現所得的前述活性成分。於一原核細胞表現系統中表現所得的重組蛋白質通常不具可溶性，因此使得純化步驟的難度及成本增加。有鑑於此，本發明之抗原表現載體的一個特點在於可表現出具可溶性的重組抗原，從而簡化純化步驟及其成本。

因此，本發明的又一個面向關於一種表現載體，其係用於在製備前述Tuf、前述NOX、或前述MS53-0285。本發明之表現載體包含一核苷酸序列、一表現元件及一融合夥伴序列。前述核苷酸序列可轉譯為前述Tuf、NOX、MS53-0285或其組合。

前述表現元件係指於表現系統中所需之啟動轉錄及轉譯程序所需的元件。前述表現元件至少應包含一啟動子（promoter）及核醣體結合部位。較佳地，前述表現元件可額外包含：操縱子（operator）、轉錄/轉譯的加強子序列（enhancer sequences）、或其組合。在一較佳實施態樣中，前述表現載體係使用於一大腸桿菌表現系統，而前述表現元件可為大腸桿菌所辨識。

在一較佳實施態樣中，為了使於一原核細胞表現系統中取得之重組蛋白質具有可溶性，本發明經研究後證實大腸桿菌之DsbC、大腸桿菌之MsyB、大腸桿菌之FklB、或其組合為用於表現本發明之前述抗原的較佳融合夥伴。在一較佳實施態樣中，為有利於純化步驟的進行，前述表現載體可進一步包含一組胺酸標籤（His-tag）之序列、一麩胺基硫-S-轉移酵素標籤（GST-tag）之序列、或其組合，從而可藉由一鎳離子親和性管柱或一麩胺基硫親和性管柱純化所得之重組蛋白質。

本發明的再一個面向關於前述Tuf、前述NOX、或前述MS53-0285用於製備防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物的用途。前述防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物係如前述段落中所論，於此不再贅述。

以下實施例謹記載本發明研發所進行的試驗，以進一步釋明本發明的特徵與優點。惟需理解的是，所列實施例僅是示範性地例示所請發明，不應用於限制本發明的申請專利範圍。

實驗一： 家禽滑膜黴漿菌抗原基因之選殖。

針對不同之抗原基因設計特異性引子（表一）。以家禽滑膜黴漿菌基因體作為模板，利用特異性引子組合進行標的基因之擴增。

表一：標的基因之擴增所用引子對。

1. 家禽滑膜黴漿菌基因體之抽取。

利用DNA純化套組（Tissue & Cell Genomic DNA Purification kit；GMbiolab, Taiwan）進行家禽滑膜黴漿菌WVU 1853（American Type Culture Collection^® 25204™）基因體之抽取。首先取4.5 mL之培養菌液至離心管中，經離心（5,870×g，5分鐘）後，倒除上清液，收集菌體部分。接著加入20 μL的蛋白酶K（proteinase K；10 mg/mL）及200 μL的萃取試劑，於56℃下作用3小時。之後，加入200 μL的結合試劑（binding solution）並於70℃下作用10分鐘。反應結束後，加入200 μL的無水酒精至微量離心管中並均勻混合，吸取所有溶液（包括沉澱物）至離心分離小管（spin column），並將離心分離小管放置於收集小管（collection tube）中。經離心2分鐘（17,970×g）後，倒除流出液，再加入300 μL的結合試劑至離心分離小管。經離心2分鐘（17,970×g）後，倒除流出液。之後，再加入700 μL的清洗試劑（wash solution）至離心分離小管，經離心2分鐘（17,970×g）後，倒除流出液，並重複上述步驟一次。最後以17,970×g之條件離心5分鐘，去除殘留酒精。將離心分離小管放入一滅菌之微量離心管中，加入適量無菌去離子水引流基因體DNA。

2. 以聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction; PCR）進行標的基因之擴增。

以家禽滑膜黴漿菌基因體作為模板，分別使用針對tuf基因、nox基因及ms53_0285基因所設計之引子進行PCR反應，各引子與PCR反應條件係如下表二中所示（引子序列如表一中所示）；其中50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200 μM的dATP、dTTP、dGTP及dCTP，1 μM擴增引子，200 ng 家禽滑膜黴漿菌及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。

表二：PCR反應條件及引子對。

3. PCR產物之回收與選殖。

使用PCR Clean Up system kit（GMbiolab, Taiwan）並依據產品使用說明進行PCR產物之回收。接著使用CloneJET PCR Cloning Kit來進行洋菜酶基因之選殖。選殖之實驗步驟係參考廠商提供之操作手冊進行。將黏合混合物（ligation mixture）轉形入大腸桿菌ECOS^TM 9-5中。轉形的詳細步驟可參酌產品使用說明，或由領域中的標準實驗步驟加以修飾調整。

將轉形後之菌體培養於含安比西林（ampicillin, 100 μg/mL）之LB固態培養基上。待長成菌落後，以菌落聚合酶連鎖反應（colony PCR）篩選轉形株。首先，先配置100 μL PCR反應液，其中包括1倍Taq反應緩衝液，200 μM dNTP（dATP、dTTP、dGTP及dCTP），1 μM擴增引子及2.5 U DreamTaq DNA 聚合酶（Thermo, USA）。將PCR反應液分裝於PCR小管（10 μL/管）中。以牙籤將菌落點至PCR小管後，即可進行PCR反應。PCR反應條件為：95℃反應5分鐘；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃，反應X分鐘（25個循環）；72℃反應7分鐘：其中X分鐘為DNA聚合酶延展時間，針對tuf 基因與nox 基因所設定之時間為1分30秒，針對ms53_0285 基因所設定之時間為2分30秒。PCR反應結束後，以瓊脂醣膠體電泳觀察PCR之結果。利用colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有外插之DNA（insert DNA）後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序（源資國際生物科技股份有限公司）。將含有tuf 基因、nox 基因及ms53_0285 基因之質體分別命名為pJET-TUF、pJET-NOX及pJET-MS53。

4.nox 基因之定點突變。

nox 基因中帶有3個TGA密碼子。TGA密碼子在黴漿菌中可被轉譯為色胺酸（tryptophan），但在大腸桿菌中則被視為停止碼（stop codon）。為了避免無法利用大腸桿菌表現系統生產完整蛋白質，必須針對nox 基因中的TGA密碼子進行點突變，將其替換為大腸桿菌可以辨識並轉譯為色胺酸的密碼子（替換為TGG）。

進行點突變所需之突變引子的設計原則包括突變點位於引子中央及引子之Tm值溫度需高於78℃。突變引子之Tm值以Invitrogene公司提供之公式Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) - 675/N - %mismatch計算，公式中之%GC為GC在引子核苷酸中所佔的百分比；N為引子長度；%mismatch為突變base在引子核苷酸中所佔的百分比。nox 基因中TGA的點突變程序共使用了如下表三中所述的引子對，包括NOXBAMHIF/NOXM2、NOXM1/NOXM4、NOXM3/NOXM6及NOXM5/NOXSALIR之組合。

表三：nox 基因之點突變程序所用引子。

在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，100 ng pJET-NOX及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒（35個循環）；68℃反應5分鐘。

PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物以Gel-M^TM gel extraction system kit進行回收。之後，以回收之四個PCR產物作為模版，利用NOXBAMHIF/NOXSALIR引子組合進行基因增幅。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應45秒（35個循環）；68℃反應5分鐘。經此步驟後，即可獲得全長定點突變之nox 基因。利用PCR Clean Up kit進行PCR產物之回收。

5.ms53_0285 基因之定點突變。

ms53_0285 基因中帶有6個TGA密碼子。針對ms53_0285 基因中TGA的點突變程序共使用了如下表四中所述的引子對，包括MS53BAMHIF/MS53M2、MS53M1/MS53M4、MS53M3/MS53M6、MS53M5/MS53M8、MS53M7/MS53M10、MS53M9/MS53M12及MS53M11/MS53SALIR之組合。

表四：ms53_0285 基因之點突變程序所用引子。

在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，100 ng pJET-MS53及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒（35個循環）；68℃反應5分鐘。

PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物以Gel-M^TM gel extraction system kit進行回收。之後，以回收之七個PCR產物作為模版，利用MS53BAMHIF/MS53SALIR引子組合進行基因增幅。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分15秒（35個循環）；68℃反應5分鐘。經此步驟後，即可獲得全長定點突變之ms53_0285 基因。利用PCR Clean Up kit進行PCR產物回收。

經前述作業後，本發明分別取得tuf 基因（SEQ ID NO: 04）、nox 基因（SEQ ID NO: 05）、及ms53_0285 基因（SEQ ID NO: 06），其分別可轉譯為Tuf（SEQ ID NO: 01）、Nox（SEQ ID NO: 02）、及MS53_028520（SEQ ID NO: 03）蛋白質。

實驗三： 本發明之家禽滑膜黴漿菌抗原表現質體的建構。

以含有大腸桿菌dsbC 基因之質體作為骨架進行家禽滑膜黴漿菌抗原表現質體之建構。表現質體之建構流程如下所述。

1. Tuf表現質體之建構。

將增幅之tuf 基因以Bam HI及Sal I剪切後，利用T4 DNA 接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之DsbC融合表現質體pET-HISDsbC中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體分別命名為pET-HISDsbC-MSTUF（SEQ ID NO: 07）。

2. Nox表現質體之建構。

將突變之nox 基因以Bam HI及Sal I剪切後，利用T4 DNA 接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之DsbC融合表現質體pET-DsbC中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體分別命名為pET-DsbC-MSNOX（SEQ ID NO: 08）。

3. MS53_0285表現質體之建構。

將突變之ms53_0285 基因以Bam HI及Sal I剪切後，利用T4 DNA 接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之DsbC融合表現質體pET-DsbC中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體分別命名為pET-DsbC-MS53（SEQ ID NO: 09）。

實驗四： 重組家禽滑膜黴漿菌抗原之表現及純化。

將抗原表現質體轉形至E. coli BL21（DE3）中。挑選表現菌株之單一菌落，並將其接種於含有康那黴素（kanamycin）（最終濃度為30 μg/mL）之12 mL的LB培養基中，並於37℃與180 rpm之條件下培養隔夜。然後，取10 mL的該培養菌液加入含有康那黴素（最終濃度為30 μg/mL）之1 L的 LB培養基中，振盪培養（37℃, 180 rpm）至OD₆₀₀ 約為0.4~0.6左右。接著於28℃下加入0.1 mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表現。誘導4小時後，離心（10,000×g，10分鐘，4℃）收集菌體部份。再將菌體懸浮於10 mL 的磷酸緩衝溶液（20 mM磷酸鈉，500 mM NaCl，pH 7.4）中，並利用超音波破碎儀將菌體破碎後，進行離心（30,966×g，30分鐘）以收集上清液部分。最後再以0.22 µm過濾膜過濾所收集到的上清液。以蛋白質電泳觀察重組抗原的表現情形及可溶性。

然後，利用重組抗原帶有His tag能與鎳或鈷離子形成配位共價鍵之特性，採用固定化金屬離子親和性層析法（immobilized-metal ion affinity chromatography）進行蛋白質純化。重組抗原之純化之方式係利用蛋白質液相層析系統ÄKTA prime plus（GE Healthcare, Sweden）搭配5 mL HiTrap^TM Ni excel管柱（GE Healthcare, Sweden）進行。首先，以25 mL磷酸緩衝溶液平衡管柱後，將前述上清液注入HiTrap^TM Ni excel管柱。待樣品注入完成後，以100 mL含30 mM咪唑（imidazole）之清洗緩衝液（20 mM 磷酸鈉，500 mM NaCl，30 mM 咪唑，pH 7.4）洗除非特異性結合之蛋白質。最後以150 mL含250 mM咪唑之溶離緩衝液（20 mM磷酸鈉，500 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 7.4）沖提樹脂上的重組抗原，其原理係藉助高濃度的咪唑與重組抗原競爭樹脂結合部位，致使重組抗原自樹脂上被沖提下來。將純化之抗原溶液放入Amicon^TM ultra-15 ultracel-30K離心管（Merck Millipore, USA）中，於4℃下以2,600×g離心至適當體積後，貯存於4℃中備用。

實驗結果如第一圖中所示。第一圖A中顯示本實驗表現的抗原皆具有優異的可溶性，有利於後續純化製程及商業化實施。第一圖B則顯示純化所得的抗原具有可信賴的純度。

實驗五： 本發明單抗原疫苗之製備與雞隻試驗。

取得4週齡之無特定病原雞（購自行政院農業委員會家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所），並飼養於該所之檢定動物舍內。重組家禽滑膜黴漿菌抗原Tuf、NOX及MS53_0285分別與市售佐劑MONTANIDE™ Gel 01（Seppic）依據產品使用說明進行混合，使最終各單抗原疫苗之劑量為50 μg/0.5 mL。雞隻於4週齡時，注射0.5 mL上述單抗原疫苗於其後頸部皮下，於6週齡時進行第二次免疫，免疫後觀察二週並進行血液採集，然後以離心的方式（2,000×g，4℃，15分鐘）收集血清，並使用市售套組（IDEXXMycoplasma synoviae Antibody Test Kit），進行家禽滑膜黴漿菌抗體之測定。

實驗結果如下表五及第二圖中所示。經施予本發明Tuf、NOX、及MS53_0285單抗原疫苗的雞隻的平均血清抗體皆呈現陽性反應，且陽性率分別達57%、71%、及75%。

表五：單抗原疫苗的抗體陽性率記錄。

接著，於雞隻8週齡時以家禽滑膜黴漿菌進行氣管及足墊攻毒，使用之攻毒株為ATRI 2014 (以下簡稱為MS-f1)，其係自台灣商業土雞場分離之菌株。將菌株接種於黴漿菌培養基中，並於37℃與75 rpm之條件下培養32小時。

針對氣管感染的組別，將雞隻保定，然後以餵食針插入雞隻氣管，再使用針筒灌入1 mL含有10⁶ CCU菌量之攻毒菌液，最後輕揉雞隻頸部讓菌液均勻擴散；針對足墊感染的組別，先以酒精棉擦拭雞隻足墊後，使用針頭插入雞隻足墊，再注入0.5 ml含有10³ CCU菌量之攻毒菌液。攻毒後除採集血液樣本分離血清以評估家禽滑膜黴漿菌之特異性抗體外，亦記錄各時間點之雞隻體重、臨床足墊溫度與厚度，於試驗結束後進行解剖並觀察雞隻氣管、氣囊及足墊腫脹等病徵，依照臟器病變評估指標進行評分紀錄。病變評分標準如下表六。

表六：家禽解剖病變評分標準。

於觀察雞隻足墊厚度時察知，經施予本發明單抗原疫苗的雞隻的足墊腫脹程度將未處理的組別來得輕微（第三圖）。另一方面，量測雞隻足墊的溫度顯示，本發明單抗原疫苗改善了雞隻足墊的炎症的程度（第四圖）。進一步評量並記錄足墊病變評分顯示，經施予本發明單抗原疫苗的雞隻的足墊病變較少，其中尤以Tuf疫苗的效果為佳（第五圖）。

氣囊病變亦是家禽滑膜黴漿菌感染後之典型病變。正常雞隻之氣囊應是清澈透明，且無分泌物黏著。第六圖A顯示未經施予本發明單抗原疫苗的雞隻的氣囊明顯有增厚及黃色乾酪性纖維蛋白附著的情形。反觀經施予本發明單抗原疫苗可有效預防氣囊病變，且實驗結果顯示本發明NOX疫苗及MS53_0285疫苗的效果尤其顯著。

進一步將雞隻氣管切片並進行組織染色（H&E staining）以觀察氣管環黏膜厚度的變化。結果顯示相較於未經施予本發明單抗原疫苗的雞隻，本發明單抗原疫苗可有效預防氣管黏膜病變，尤以MS53_0285之次單位疫苗的效果最佳（第六圖B）。

依據前揭結果可知，本發明Tuf疫苗、NOX疫苗及MS53_0285疫苗雖然在效果上略有差異，但整體上都能達到減緩受家禽滑膜黴漿菌所引發的病徵。

實驗六： 本發明多抗原疫苗（雞尾酒疫苗）之製備與雞隻 試驗。

取得4週齡之無特定病原雞（購自行政院農業委員會家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所），並飼養於該所之檢定動物舍內。以不同抗原組合（Tuf + NOX、Tuf + MS53_0285、NOX + MS53_0285及Tuf + NOX + MS53_0285）混合市售佐劑製得多個本發明雞尾酒疫苗。每劑疫苗（0.5 mL）中各抗原的含量為50 μg。

於雞隻4週齡時，注射0.5 mL上述組合抗原疫苗於其後頸部皮下，於6週齡時進行第二次免疫，免疫後觀察二週記錄雞隻體重並進行血液採集，然後以離心的方式（2,000×g，4℃，15分鐘）收集血清，並以市售套組（IDEXX Mycoplasma synoviae Antibody Test Kit）偵測特異性抗體。

實驗結果如下表七及第七圖中所示。結果顯示雙抗原疫苗及三抗原疫苗都增強了雞隻體內的抗體表現。換言之，本發明重組抗原在組合使用下不僅不會產生互相干擾的缺點，反而有協同作用而提高免疫誘發效果的潛力。

表七：

實驗七：本發明多抗原疫苗（雞尾酒疫苗）之製備與雞隻試驗。

取得4週齡之無特定病原雞（購自行政院農業委員會家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所），並飼養於該所之檢定動物舍內。將本發明重組抗原，Tuf、NOX及MS53_0285，與市售佐劑MONTANIDE™ ISA 71 VG（Seppic）混合製得本發明的雞尾酒疫苗。每劑疫苗（0.5 mL）中各抗原的含量為50 μg。前述佐劑與前述抗原是以重量比7:3調劑。前述佐劑的比重為約0.816，因此本實驗所製得的疫苗中約有0.37 mL為佐劑。

於雞隻4週齡時，注射0.5 mL上述組合抗原疫苗於其後頸部皮下，於6週齡時進行第二次免疫，免疫後觀察二週記錄雞隻體重並進行血液採集，然後以離心的方式（2,000×g，4℃，15分鐘）收集血清，並以市售套組（IDEXXMycoplasma synoviae Antibody Test Kit）偵測特異性抗體。

實驗結果如下表八及第八圖中所示。結果顯示三抗原疫苗誘發雞隻體內的抗體表現。換言之，本發明重組抗原在組合使用下不僅不會產生互相干擾的缺點，反而有協同作用而提高免疫誘發效果的潛力。此實驗結果與前揭第七圖中所示結果一致。

表八：

接著，於雞隻8週齡時以家禽滑膜黴漿菌MS-f1進行氣管及足墊攻毒，攻毒後除採集血液樣本分離血清以評估家禽滑膜黴漿菌之特異性抗體外，亦記錄各時間點之雞隻體重、足墊溫度與厚度，於試驗結束後進行解剖並觀察雞隻氣囊及足墊腫脹病徵，依照表六之臟器病變評估指標進行評分紀錄。

實驗結果顯示，本發明三抗原疫苗可減輕雞隻受感染後體重減輕的情況（第九圖）。此外，在足墊腫脹及足墊溫度之病徵上，本發明三抗原疫苗也展現了顯著的效果（第十圖及第十一圖）。進一步將雞隻犧牲解剖後，觀察足墊與氣囊病變評分結果發現，本發明三抗原疫苗有降低足墊病變及氣囊病變之趨勢，請參下表九。

表九：

實驗八：本發明三抗原疫苗的劑量測試 。

將本發明重組抗原與市售佐劑MONTANIDE™ ISA 71 VG（Seppic）混合，分別製成每劑量（0.5 mL）含有150 μg、100 μg、50 μg、20 μg等四種不同濃度重組抗原之次單位疫苗，前述佐劑與前述抗原是以重量比7:3調劑。前述佐劑的比重為約0.816，因此本實驗所製得的疫苗中約有0.37 mL為佐劑。組別設計如表十所示。

表十：

取得4週齡之無特定病原雞（購自行政院農業委員會家畜衛生試驗所動物用藥品檢定分所），並飼養於該所之檢定動物舍內。雞隻分別進行上述組合抗原疫苗兩次間隔二週之免疫注射。接著於二週後以家禽滑膜黴漿菌MS-f1進行氣管及足墊攻毒。攻毒後除採集血液樣本分離血清以評估家禽滑膜黴漿菌之特異性抗體外，亦記錄各時間點之雞隻體重、足墊溫度與厚度，於試驗結束後進行解剖並觀察雞隻的氣囊病徵，依照表五之臟器病變評估指標進行評分紀錄。

實驗結果如下表十一及第十二圖中所示。結果顯示本實驗的4種劑量皆能誘發雞隻體內的抗體表現。此外，在本實驗中測試的4種劑量皆有效緩和體重及足墊溫度等病徵（第十三圖及第十四圖）。進一步將雞隻犧牲解剖觀察氣囊病變。結果顯示本實驗中測試的4種劑量皆有效改善氣囊病變（表十二）。

表十一：

表十二：

無

第一圖顯示本發明實驗四的實驗結果。（A）以蛋白質電泳檢視本發明生產之重組抗原的可溶性（T表示全細胞裂解物，S表示可溶性部分）。（B）以蛋白質電泳檢視本發明純化之重組抗原的純度。

第二圖顯示本發明實驗五的雞隻血清中，家禽滑膜黴漿菌特異性抗體陽性反應情形。

第三圖顯示本發明實驗五中雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的足墊厚度增加程度。

第四圖顯示本發明實驗五中雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的足墊溫度增加程度。

第五圖顯示本發明實驗五中雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的足墊病變評分。

第六圖顯示本發明實驗五中雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的氣囊病變評分（A），以及實驗五中雞隻氣管黏膜厚度（B）。統計標計顯示本發明疫苗相較於正向控制組具統計上顯著意義（T-test，†：p>0.1 ）。

第七圖顯示本發明實驗六的雞隻血清中，家禽滑膜黴漿菌特異性抗體陽性反應情形。

第八圖顯示本發明實驗七的雞隻血清中，家禽滑膜黴漿菌特異性抗體陽性反應情形。

第九圖顯示本發明實驗七的雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的體重變化。

第十圖顯示本發明實驗七的雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的足墊厚度變化。統計標計顯示本發明疫苗相較於正向控制組具統計上顯著意義（T-test，†：p>0.1 ）。

第十一圖顯示本發明實驗七的雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的足墊溫度變化。統計標計顯示本發明疫苗相較於正向控制組具統計上顯著意義（T-test，*：p>0.05 ）。

第十二圖顯示本發明實驗八的雞隻血清中，家禽滑膜黴漿菌特異性抗體陽性反應情形。

第十三圖顯示本發明實驗八的雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的體重變化。統計標計顯示本發明疫苗相較於正向控制組具統計上顯著意義（T-test，*：p>0.05 ）。

第十四圖顯示本發明實驗八的雞隻經家禽滑膜黴漿菌感染後的足墊溫度變化。統計標計顯示本發明疫苗相較於正向控制組具統計上顯著意義（T-test，†：p>0.1 ；*：p>0.05 ）。

無

<110> 財團法人農業科技研究院

<120> 防治家禽滑膜黴漿菌感染的組合物

<140> TW 108130084

<141> 2017-11-01

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 394

<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<220>

<223> primer

<400> 37

Claims

一種用於減輕因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵的組合物，其包含：一活性成分，其包含：MS53-0285，或NOX與MS53-0285之組合；其中前述NOX包含SEQ ID NO：02所示序列，前述MS53-0285包含SEQ ID NO：03所示序列；及一醫藥可接受之佐劑。
如請求項1所述之組合物，其中前述活性成分的濃度為40至900μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。
如請求項1所述之組合物，其中前述醫藥可接受之佐劑為：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
如請求項1所述之組合物，其進一步包含一醫藥可接受之添加劑。
如請求項4所述之組合物，其中前述醫藥可接受之添加劑為溶劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑或其組合。
如請求項1所述之組合物，其中前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵為氣管病變、氣囊病變、關節炎、或其組合。
如請求項1所述之組合物，當前述活性成分包含NOX、MS53-0285、或其組合時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵至少為氣囊病變。
如請求項1所述之組合物，當前述活性成分包含MS53-0285時，前述因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵至少為氣管病變。
一種表現載體，其包含：一核苷酸序列，其具有：SEQ ID NO：06，或SEQ ID NO：05與SEQ ID NO：06之組合所示序列；一表現元件，其包含一啟動子及一核糖體結合部位；及一融合夥伴序列。
一種表現載體，其包含：一核苷酸序列，其轉譯為：MS53-0285，或NOX與MS53-0285之組合之蛋白質；其中前述NOX包含SEQ ID NO：02所示序列，前述MS53-0285包含SEQ ID NO：03所示序列；一表現元件，其包含一啟動子及一核糖體結合部位；及一融合夥伴序列。
如請求項9或10所述之表現載體，其中前述融合夥伴係大腸桿菌之DsbC、大腸桿菌之MsyB、大腸桿菌之FklB、或其組合。
如請求項9或10所述之表現載體，其包含SEQ ID NO：09所示序列。
一種蛋白質用於製備減輕因家禽滑膜黴漿菌感染所引發之病徵的組合物的用途，其中前述蛋白質包含：MS53-0285，或NOX與MS53-0285之組合；其中前述NOX具有SEQ ID NO：02所示序列，前述MS53-0285具有SEQ ID NO：03所示序列。