CN112778423B

CN112778423B - 猪蓝耳病亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112778423B
Application number: CN202011450875.3A
Authority: CN
Inventors: 丁国伟
Original assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112778423A

Abstract

本发明公开了一种猪蓝耳病亚单位疫苗组合物，包括P2‑GP5+M重组蛋白、PEA(ΔⅢ)‑pp1a重组蛋白和PEA(ΔⅢ)‑N重组蛋白；P2‑GP5+M重组蛋白是P2‑GP5融合蛋白与猪蓝耳病毒M蛋白的融合，且P2‑GP5融合蛋白是破伤风类毒素通用CD4⁺T细胞抗原表位P2蛋白和猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的融合；PEA(ΔⅢ)‑pp1a重组蛋白是绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白与猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段的融合；PEA(ΔⅢ)‑N重组蛋白是绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白与猪蓝耳病毒N蛋白片段的融合。本发明还公开了该疫苗组合物的制备方法和应用。该疫苗组合物生产成本低、生产效率高且免疫效果好。

Description

猪蓝耳病亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，特别涉及一种猪蓝耳病亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的新传染病。临床上以妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。最初由于不知其病原被称为“神秘病”。该病自1987年首次在美国发现以来，随后的2～3年间，加拿大和欧洲一些国家也相继报道了该病的发生，几年之内便席卷了北美洲和欧洲大陆，现已蔓延至许多亚太国家和地区。尽管我国1995年才首次爆发此病，但根据临床和血清学调查，该病在我国普遍存在，而且近年来还呈流行态势。免疫接种仍然是预防和控制该病的主要措施，但现有的商品化疫苗(弱毒苗和灭活苗)均存在一定程度的缺陷。其中弱毒苗虽然免疫效果较好，但存在散毒和返强的危险性，并且返强的几率相当高，这一点已从丹麦因广泛使用弱毒苗而导致全国PRRS大面积爆发中得以证实。灭活苗与弱毒苗相比，虽然安全性较好，但产生的保护力不强，需要反复多次免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。可以说，缺少安全、有效的疫苗是目前预防和控制猪繁殖与呼吸综合征发生与流行甚至大爆发的主要障碍，因此迫切需要研发一种安全、有效、廉价的新型疫苗。

蓝耳病毒亚单位疫苗作为新型基因工程亚单位疫苗，其不含有病原微生物核酸物质，安全性较好，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。

因此研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的猪蓝耳病亚单位疫苗的生产方法具有重要的现实意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种猪蓝耳病亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用。该疫苗组合物生产成本低、生产效率高且免疫效果好。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

本发明首先提供一种猪蓝耳病亚单位疫苗组合物，该疫苗组合物抗原蛋白包括P2-GP5+M重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白和PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白；所述P2-GP5+M重组蛋白是P2-GP5融合蛋白与猪蓝耳病毒M蛋白的融合，且所述P2-GP5融合蛋白是破伤风类毒素通用CD4⁺T细胞抗原表位P2蛋白和猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的融合；所述PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白是绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白与猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段的融合；PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白是绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白与猪蓝耳病毒N蛋白片段的融合。

其中的猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的氨基酸序列是以SEQ ID NO.1所示的猪蓝耳病毒NADC30株GP5蛋白氨基酸序列为基准的片段序列；猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中的P2-GP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

其中的猪蓝耳病毒M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

其中的猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

其中的猪蓝耳病毒N蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

其中的所述绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白由SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列编码，其是通过人工合成。

进一步的，该疫苗组合物还包括佐剂。

更进一步的，疫苗组合物中的佐剂为SEPPIC Montanide IMS 1313VG NST佐剂。

在上述疫苗组合物中，P2-GP5融合蛋白、M蛋白、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白的分子数比例为2:2:1:1。

在上述疫苗组合物中，包括P2-GP5+M重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白和PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白的抗原蛋白含量为100～200μg/mL。

本发明还提供了上述猪蓝耳病亚单位疫苗组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)克隆、扩增猪蓝耳病毒GP5蛋白片段基因、M蛋白基因，pp1a蛋白片段基因、N蛋白片段基因；将GP5蛋白片段基因与破伤风类毒素通用CD4⁺T细胞抗原表位P2基因进行连接，得到P2-GP5融合蛋白基因，将P2-GP5融合蛋白基因、M蛋白基因通过口蹄疫2A序列进行连接，构建P2-GP5-2A-M重组蛋白基因；将pp1a蛋白片段基因与绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白基因进行连接，构建PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白基因；将N蛋白片段基因与绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)基因进行连接，构建PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白基因；

(2)构建表达P2-GP5-2A-M重组蛋白基因、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白基因、PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白基因的重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化DH10 Bac感受态细胞，通过转座，获得重组杆粒；

(4)将步骤(3)获得的重组杆粒转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；

(5)将获得的重组杆状病毒接种HF细胞进行大量培养，离心收集培养液上清，得到P2-GP5+M重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白和PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白，再经纯化，加入佐剂，乳化，最后混匀。

本发明进一步提供了上述猪蓝耳病亚单位疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪蓝耳病毒相关疾病或由猪蓝耳病毒感染的相关疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的猪蓝耳病亚单位疫苗组合物采用了P2-GP5+M重组蛋白、P EA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白和PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白，且设计了合适的比例，免疫效果良好，免疫剂量小，生产成本低，可以有效预防和/或治疗猪蓝耳病毒相关疾病或由猪蓝耳病毒感染的其他相关疾病；

(2)本发明制备方法简单，能大量制备猪蓝耳病的抗原蛋白，耗时短，表达量高，大大降低了生产成本，有利于大规模生产。

(3)本发明的方法提供了一种完善预防和/或治疗猪蓝耳病毒感染的途径，避免了传统活疫苗毒力返强及散毒风险的发生，对于净化猪蓝耳病毒有着积极的现实意义。

附图说明

图1是SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物；其中，1：F4代重组杆状病毒rBac-PEA(ΔⅢ)-pp1a表达产物；2：F4代重组杆状病毒rBac-PEA(ΔⅢ)-N表达产物；3：F4代重组杆状病毒rBac-P2-GP5-2A-M表达产物。

图2为不同组别攻毒后肺脏病理切片图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种猪蓝耳病亚单位疫苗组合物，该疫苗组合物抗原蛋白包括免疫量的P2-GP5+M重组蛋白、免疫量的PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白和免疫量的PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白；所述P2-GP5+M重组蛋白是P2-GP5融合蛋白与猪蓝耳病毒M蛋白的融合，且所述P2-GP5融合蛋白是破伤风类毒素通用CD4⁺T细胞抗原表位P2蛋白和猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的融合；所述PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白是绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白与猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段的融合；PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白是绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白与猪蓝耳病毒N蛋白片段的融合。

猪蓝耳病毒GP5蛋白片段氨基酸序列、猪蓝耳病毒M蛋白氨基酸序列、猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段氨基酸序列、猪蓝耳病毒N蛋白片段氨基酸序列均为猪蓝耳病毒NADC 30株相应蛋白的氨基酸序列。

猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的氨基酸序列是以SEQ ID NO.1所示的猪蓝耳病毒NADC30株GP5蛋白氨基酸序列为基准的片段序列；猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

P2-GP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如S EQ IDNO.4所示。

猪蓝耳病毒M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

猪蓝耳病毒N蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。

该疫苗组合物还包括佐剂。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。本实施例的疫苗组合物中的佐剂为SEPPIC Montanide IMS 1313VG NST佐剂。

在该疫苗组合物中，P2-GP5融合蛋白、M蛋白、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白的分子数比例为2:2:1:1。

在该疫苗组合物中，包括P2-GP5+M重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白和PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白的抗原蛋白含量为100～200μg/mL。

实施例

取200μL病毒液，参照TaKaRa公司MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒说明书提取PRRSV总RNA，参照诺唯赞HiScript II One Step RT-PCR试剂盒合成cDNA。

1.猪蓝耳病毒GP5蛋白片段基因的扩增及P2-GP5融合蛋白构建

利用引物GP5F和GP5R扩增编码GP5蛋白片段基因，利用南京金斯瑞合成的破伤风类毒素通用CD4⁺T细胞抗原表位P2基因，并利用Overlap PCR将二者扩增在一起(引物为P2F和GP5R)，将P2基因连接到GP5蛋白片段基因的5'端，构建P2-GP5融合蛋白基因。引物见表1，PCR反应体系见表2，PCR反应条件见表3。

表1 P2-GP5融合蛋白基因构建过程中的PCR引物表

表2 P2-GP5融合蛋白基因构建过程中的PCR体系

表3 P2-GP5融合蛋白基因构建过程中的PCR反应条件

2.猪蓝耳病毒M蛋白基因的扩增及2A-M的构建

以合成的cDNA为模板，参照步骤1中的PCR反应体系及条件，利用引物MF和MR扩增M蛋白基因。利用南京金斯瑞合成的口蹄疫2A基因，并利用Overlap PCR将二者扩增在一起(引物为2AF和MR)，得到2A-M融合基因。引物见表4。

表4 M蛋白基因扩增引物

3.串联表达基因片段P2-GP5-2A-M的扩增

以步骤1、2扩增得到的P2-GP5和2A-M为模板，参照步骤1中的PCR反应体系及条件，利用引物P2F和MR扩增P2-GP5-2A-M基因。

4.猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段基因的扩增及PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白基因的构建

以步骤1中合成的cDNA为模板，参照步骤1中的PCR反应体系及条件，利用引物pp1aF和pp1aR扩增pp1a蛋白片段基因。引物见表5。利用南京金斯瑞合成的绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白基因，并利用Overlap PCR将二者扩增在一起(引物为PEA(ΔⅢ)F和pp1aR)，将PEA(ΔⅢ)蛋白基因连接到pp1a蛋白片段基因的5'端上，构建PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白基因。

表5 PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白基因构建过程的扩增引物

5.猪蓝耳病毒N蛋白基因片段的扩增及PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白基因的构建

以步骤1中合成的cDNA为模板，参照步骤1中的PCR反应体系及条件，利用引物NF和NR扩增N蛋白片段基因。引物见表6。利用南京金斯瑞合成的PEA(ΔⅢ)基因，并利用OverlapPCR将二者扩增在一起(引物为PEA(ΔⅢ)F和NR)，将PEA(ΔⅢ)蛋白基因连接到N蛋白片段基因的5'端上，构建PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白基因。

表6 PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白基因构建过程的扩增引物

6.P2-GP5融合蛋白和M蛋白串联表达转移载体构建

将步骤3扩增的PCR产物利用BamH I和Hind III进行双酶切，与同样双酶切的pFastBacHT A载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，获得的阳性质粒命名为pFastBac-P2-GP5-2A-M。

7.PEA(ΔⅢ)-pp1a蛋白表达转移载体构建

将步骤4扩增的PCR产物利用BamH I和Hind III进行双酶切，与同样双酶切的pFastBacHT A载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，获得的阳性质粒命名为pFastBac-PEA(ΔⅢ)-pp1a。

8.PEA(ΔⅢ)-N蛋白表达转移载体构建

将步骤5扩增的PCR产物利用BamH I和Hind III进行双酶切，与同样双酶切的pFastBacHT A载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得的阳性质粒命名为pFastBac-PEA(ΔⅢ)-N。

9.重组Bacmid的构建

将重组转移质粒pFastBac-P2-GP5-2A-M、pFastBac-PEA(ΔⅢ)-pp1a、pFastBac-PEA(ΔⅢ)-N转化DH10Bac感受态细胞，轻轻混匀，冰上孵育30min，42℃热激转化90s，冰上孵育5min加入LB培养基，37℃ 220rpm培养4h，取100μL培养物涂布于含有抗性的筛选平板上，37℃培养72h，挑选白斑进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的单菌落培养后抽提杆粒，并命名为rBacmid-P2-GP5-2A-M、rBacmid-PEA(ΔⅢ)-pp1a、rBacmid-PEA(ΔⅢ)-N。

10.重组杆状病毒的获得及传代

将重组的rBacmid-P2-GP5-2A-M、rBacmid-PEA(ΔⅢ)-pp1a、rBacmid-PEA(ΔⅢ)-N分别转染昆虫细胞sf9，具体参照Cellfectin^TMII Reagent(Invitrogen^TM)说明书进行转染，培养至可见细胞明显病变后，收获培养上清，该上清即为重组杆状病毒F1代rBac-P2-GP5-2A-M、rBac-PEA(ΔⅢ)-pp1a、rBac-PEA(ΔⅢ)-N。

将上述收获的F1代重组杆状病毒以1％的接毒量接入处于生长对数期的sf9细胞(2.0×10⁶cfu/mL)，27℃ 110rpm培养至细胞病变80％以上收获培养物上清，该上清即为F2代重组杆状病毒。重复上述操作，收获F3\F4代重组杆状病毒。

11.蛋白表达

将步骤10中获得的F4代的重组杆状病毒按照MOI＝5～10的接毒量接入HF细胞，接种后约7d左右收获细胞，离心获得的上清进行SDS-PAGE确认目的蛋白得到表达。如图1所示。目的蛋白经过镍柱纯化，参照上海生工BCA试剂盒进行蛋白定量，结果显示纯化后的目的蛋白浓度分别为P2-GP5+M 2.33mg/mL；PEA(ΔⅢ)-pp1a 1.2mg/mL；PEA(ΔⅢ)-N 1.5mg/mL。

猪蓝耳病毒亚单位疫苗组合物的制备

取获得的纯化的P2-GP5+M重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白，加入佐剂进行乳化，混匀，4℃保存。疫苗具体配比见表7。

表7猪蓝耳病毒亚单位疫苗成分配比

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

猪蓝耳病毒亚单位疫苗免疫原性试验

取14日龄健康仔猪50头(PCV2、PRRSV抗原抗体检测均为阴性，使用世纪元亨试剂盒分别检测抗原抗体)，随机分成10组，每组5头。1～8组分别免疫表7中的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6、疫苗7、疫苗8，第9和第10组注射相同剂量的无菌PBS。隔离饲养观察，免疫后28日，采用JXA1株对第1～9组进行攻毒，颈部肌肉注射3mL/头，毒价10^5.5TICD₅₀/mL。每天观察仔猪临床表现，测量并记录直肠温度。攻毒后第21日分别扑杀头不同实验组仔猪，进行病理学检查。

在该攻毒剂量下第6～8亚单位疫苗免疫组5只猪均获得免疫保护，仅出现发热轻微发热，攻毒后第11天，体温恢复正常，并最终存活；第1～3亚单位疫苗免疫组，攻毒后保护率分别为25％，37.5％，62.5％；第4～5亚单位疫苗免疫组攻毒后，最终保护率分别为62.5％、62.5％；第9组在攻毒后2天开始发烧症状，攻毒3天后仔猪体温达41℃以上，最高至42℃，并且发烧过程持续1周以上，患猪均出现典型的“蓝耳”临床症状，具体表现为精神不振，厌食或食欲废绝，被毛粗乱，扎堆嗜睡，流鼻涕，腹湾，眼睛有粘性分泌物，严重者双眼粘合，站立不稳，并出现严重呼吸困难症状，耳朵及四肢末端发红，第9天试验仔猪全部死亡；第10组未见异常，仔猪全部存活。攻毒保护结果见表8。

表8猪蓝耳病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒保护结果

如图2所示，其中的A图为未免疫攻毒组肺脏病理切片图，B图为免疫后攻毒组肺脏病理切片图(具体为采用疫苗6的免疫组)；C图为未免疫未攻毒对照组肺脏病理切片图。通过病理分析发现，未免疫疫苗的试验仔猪肺脏肉眼主要病变为肺脏间隔增宽，呈广泛性肉变，失去弹性，水肿，气管内分泌物增多；肺门淋巴结水肿出血，肺脏组织病理学变化为有明显的间质性肺炎，肺泡隔增宽并且肺泡壁破坏最严重，肺泡壁见大量巨哩细胞浸润、增生；大部分肺组织的肺泡不张，呈缩瘡状，肺泡隔不均匀，细支气管有大量淋巴细胞浸润。疫苗免疫组攻毒后试验仔猪肺脏肉眼未见明显病变，肺脏组织病变观察只见轻微淋巴细胞浸润，食欲正常，精神状态良好，未见呼吸困难症状，无死亡；这表明该毒株对仔猪安全性较好。未攻毒试验仔猪肺脏肉眼及组织病理学观察均正常。

由表8和病理切片图可知，采用本发明的方法制备的疫苗(疫苗6、疫苗7和疫苗8)具有良好的免疫效果。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的修改或等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 扬州优邦生物药品有限公司

<120> 猪蓝耳病亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用

<130> 2020

<141> 2020-12-09

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> PRT

<213> PRRSV NADC 30株GP5蛋白氨基酸序列(PRRSV NADC 30 strains GP5 proteinamino acid sequence)

<400> 1

Met Gly Lys Cys Thr Ala Gly Cys Cys Ser Trp Cys Ile Val Ser Cys

1 5 10 15

Val Ala Val Ser Ala Asn Ser Asn Ser Ser Ser Asn Ile Tyr Asn Thr

20 25 30

Cys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Asn Lys Asp Trp Ala Val Cys Val Ile

35 40 45

Val Thr His Ile Val Ser Tyr Gly Ala Thr Thr Ser His Asp Thr Val

50 55 60

Gly Val Thr Val Ser Thr Ala Gly Val His Gly Arg Tyr Val Ser Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Ala Val Cys Ala Ala Ala Ile Cys Val Ile Arg Ala Lys Asn

85 90 95

Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Asp Ser Lys

100 105 110

Gly Arg Tyr Arg Trp Arg Ser Val Ile Ile Lys Arg Gly Lys Val Val

115 120 125

Gly Ile Asp Lys Arg Val Val Asp Gly Ser Ala Ala Thr Val Thr Arg

130 135 140

Val Ser Ala Trp Gly Arg

145 150

<210> 2

<211> 507

<212> DNA

<213> GP5蛋白片段核苷酸序列(Nucleotide sequence of GP5 protein fragment)

<400> 2

aacagcaaca gcagctccca tctacagttg atttataacc tgacgatatg tgagctgaat 60

ggcacagatt ggctgaacga aagattttac tgggcagtgg agactttcgt tatctttcct 120

gtgttgactc atattgtctc ttacggcgcc cttaccacta gccattttct tgacacggtc 180

ggcctgatca ctgtgtccac cgccggatat tatcacaggc ggtatgtatt gagtagcatc 240

tacgctgtct gtgccctggc tgcgttgatt tgcttcgcca ttaggttggc gaaaaattgc 300

atgtcctggc gctactcatg caccagatat accaattttc ttctggatac taagggcaaa 360

ctctaccgct ggcggtcacc cgtcatcata gagaaggggg gtaaagttga tgttgggggt 420

catttaatcg acctcaaaag agttgtgctt gatggttccg cggcaacccc tgtaaccaag 480

atttcagcgg aacaatgggg tcgtcca 507

<210> 3

<211> 149

<212> PRT

<213> P2-GP5融合蛋白氨基酸序列(The amino acid sequence of p2-GP5 fusionprotein)

<400> 3

Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Ile Gly Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Asn Ser Asn Ser Ser Ser His Ile Tyr Asn Thr Ile Cys Asn Gly Thr

20 25 30

Asp Trp Asn Arg Tyr Trp Ala Val Thr Val Ile Val Thr His Ile Val

35 40 45

Ser Tyr Gly Ala Thr Thr Ser His Asp Thr Val Gly Ile Thr Val Ser

50 55 60

Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Ser Ser Ile Tyr Ala Val

65 70 75 80

Cys Ala Ala Ala Ile Cys Ala Ile Arg Ala Lys Asn Cys Met Ser Trp

85 90 95

Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Asp Thr Lys Gly Lys Tyr Arg

100 105 110

Trp Arg Ser Val Ile Ile Lys Gly Gly Lys Val Asp Val Gly Gly His

115 120 125

Ile Asp Lys Arg Val Val Asp Gly Ser Ala Ala Thr Val Thr Lys Ile

130 135 140

Ser Ala Trp Gly Arg

145

<210> 4

<211> 567

<212> DNA

<213> P2-GP5融合蛋白核苷酸序列(Nucleotide sequence of p2-GP5 fusion protein)

<400> 4

cagtatataa aagcaaattc taaatttata ggtataactg aactaggctc cggctcaggc 60

aacagcaaca gcagctccca tctacagttg atttataacc tgacgatatg tgagctgaat 120

ggcacagatt ggctgaacga aagattttac tgggcagtgg agactttcgt tatctttcct 180

gtgttgactc atattgtctc ttacggcgcc cttaccacta gccattttct tgacacggtc 240

ggcctgatca ctgtgtccac cgccggatat tatcacaggc ggtatgtatt gagtagcatc 300

tacgctgtct gtgccctggc tgcgttgatt tgcttcgcca ttaggttggc gaaaaattgc 360

atgtcctggc gctactcatg caccagatat accaattttc ttctggatac taagggcaaa 420

ctctaccgct ggcggtcacc cgtcatcata gagaaggggg gtaaagttga tgttgggggt 480

catttaatcg acctcaaaag agttgtgctt gatggttccg cggcaacccc tgtaaccaag 540

atttcagcgg aacaatgggg tcgtcca 567

<210> 5

<211> 133

<212> PRT

<213> M蛋白氨基酸序列(Amino acid sequence of M protein)

<400> 5

Met Gly Ser Ser Ile Asp Asp Cys Asn Asp Ser Thr Ala Val Lys Val

1 5 10 15

Ala Ser Ile Thr Tyr Thr Ile Met Ile Tyr Ala Lys Val Ser Arg Gly

20 25 30

Arg Gly His Ile Asn Cys Ala Thr Gly Tyr Met Thr Val His Ser Thr

35 40 45

Asn Lys Val Ala Thr Met Gly Ala Val Val Ala Trp Gly Val Tyr Ser

50 55 60

Ala Met Thr Trp Arg Ile Thr Ser Arg Cys Arg Cys Gly Arg Lys Tyr

65 70 75 80

Ile Ala Ala His His Val Ser Ala Ala Gly His Ile Thr Ala Ser Asp

85 90 95

Asn His Ala Val Val Arg Arg Gly Ser Thr Thr Val Asn Gly Thr Val

100 105 110

Gly Lys Ser Val Gly Gly Arg Arg Ala Val Lys Arg Gly Val Val Asn

115 120 125

Val Lys Tyr Ala Lys

130

<210> 6

<211> 525

<212> DNA

<213> M蛋白核苷酸序列(M protein nucleotide sequence)

<400> 6

atggggtcgt ccatagacga cttctgcaat gacagcacgg ctgtacaaaa ggtgcttttg 60

gcgttttcta tcacctacac gccaataatg atatatgcct taaaggtaag tcgcggtcga 120

ctgctggggc tcttgcacct cttaattttc ctgaattgtg ctttcacttt tgggtatatg 180

acatttgttc attttcagag tacaaacaag gtcgcactta ccatgggggc agtagtcgct 240

ctcctctggg gggtgtattc agccatggaa acctggagat tcatcacctc cagatgccgg 300

ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgttga aagtgccgca 360

ggctttcatc cgataacggc aagtgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggttcc 420

actacggtca acggcacact ggtgcccggg tttaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaga 480

gctgttaaac gaggagtggt gaaccttgtt aaatatgcca aataa 525

<210> 7

<211> 174

<212> PRT

<213> pp1a蛋白片段氨基酸序列(Amino acid sequence of pp1A protein fragment)

<400> 7

Asp Val Asn Asn Lys Glu Cys Thr Val Ala Gln Ala Leu Gly Asn Gly

1 5 10 15

Asp Lys Phe Arg Ala Thr Asp Lys Arg Val Val Asp Ser Leu Arg Ala

20 25 30

Ile Cys Ala Asp Leu Glu Gly Ser Ser Ser Pro Leu Pro Lys Val Ala

35 40 45

His Asn Leu Gly Phe Tyr Phe Ser Pro Asp Leu Thr Gln Phe Ala Lys

50 55 60

Leu Pro Ile Glu Leu Asp Pro His Trp Pro Val Val Ser Thr Gln Asn

65 70 75 80

Asn Glu Lys Trp Pro Asp Arg Leu Val Ala Ser Leu Arg Pro Leu Asp

85 90 95

Lys Tyr Ser Arg Ala Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Met Val Gly Pro Ser

100 105 110

Val Phe Leu Gly Thr Pro Gly Val Val Ser Tyr Tyr Leu Thr Lys Phe

115 120 125

Val Lys Gly Glu Ala Gln Val Leu Pro Glu Thr Val Phe Ser Thr Gly

130 135 140

Arg Ile Glu Val Asp Cys Arg Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Glu Arg Glu

145 150 155 160

Val Ala Ala Ser Leu Pro His Glu Phe Leu Glu Tyr Leu Lys

165 170

<210> 8

<211> 534

<212> DNA

<213> Pp1a蛋白片段核苷酸序列(Nucleotide sequence of Pp1a protein fragment)

<400> 8

gactcaggtg acgacgtcaa caacaaggaa tgcaccgtgg cccaggctct gggaaacggt 60

gacaagttcc gcgctactga caagcgtgtg gtcgactccc tgagggctat ctgcgccgac 120

ctggagggat cttcatcccc tctgcccaag gtcgcccaca acctgggttt ctacttcagc 180

cccgacctga cccagttcgc taagctgcca atcgagctgg acccccactg gccagtggtc 240

tctactcaga acaacgaaaa gtggcctgac aggctggtcg ctagcctgag acccctggac 300

aagtactctc gtgcctgcat cggcgctgga tacatggtgg gtcccagcgt cttcctgggt 360

accccaggcg tggtctctta ctacctgact aagttcgtga agggcgaggc tcaggtgctg 420

ccagaaaccg tcttctcaac tggacgcatc gaggtcgact gccgtgaata cctcgacgac 480

agggagaggg aggtggctgc ttccctgcct cacgagttcc tggaatacct gaag 534

<210> 9

<211> 135

<212> PRT

<213> N蛋白片段氨基酸序列(Amino acid sequence of N protein fragment)

<400> 9

Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly

1 5 10 15

Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe

20 25 30

Ser Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser

35 40 45

Pro Ser Ala Lys Asp Glu Leu Arg Val Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser

85 90 95

Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His

100 105 110

His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala Lys Asp

115 120 125

Glu Leu Arg Val Glu Leu Lys

130 135

<210> 10

<211> 405

<212> DNA

<213> N蛋白片段核苷酸序列(N protein fragment nucleotide sequence)

<400> 10

caattgtgtc tgtcgtcaat ccagaccgcc tttaatcaag gcgctgggac ttgcaccctg 60

tcagattcag ggaggataag ttacactgtg gagtttagtt tgcctacgca tcatactgtg 120

cgcctgatcc gcgttacagc atcaccctca gcaaaagacg aactgcgtgt agaactgaaa 180

ggcggaggcg gaagcggagg cggaggaagc ggcggtggcg gcagccaatt gtgtctgtcg 240

tcaatccaga ccgcctttaa tcaaggcgct gggacttgca ccctgtcaga ttcagggagg 300

ataagttaca ctgtggagtt tagtttgcct acgcatcata ctgtgcgcct gatccgcgtt 360

acagcatcac cctcagcaaa agacgaactg cgtgtagaac tgaaa 405

<210> 11

<211> 1236

<212> DNA

<213> PEA(ΔⅢ蛋白片段核苷酸序列)

<400> 11

atgcacctga caccccattg gatccccctg gtcgccagcc tcggcctgct cgccggcggc 60

tcgttcgcgt ccgccgccga ggaagccttc gacctctgga acgaatgcgc caaggcctgc 120

gtgctcgacc tcaaggacgg cgtgcgttcc agccgcatga gcgtcgaccc ggccatcgcc 180

gacaccaacg gccagggcgt gctgcactac tccatggtcc tggagggcgg caacgacgcg 240

ctcaagctgg ccatcgacaa cgccctcagc atcaccagcg acggcctgac catccgcctc 300

gaaggtggcg tcgagccgaa caagccggtg cgctacagct acacgcgcca ggcgcgcggc 360

agttggtcgc tgaactggct ggtgccgatc ggccacgaga agccttcgaa catcaaggtg 420

ttcatccacg aactgaacgc cggtaaccag ctcagccaca tgtcgccgat ctacaccatc 480

gagatgggcg acgagttgct ggcgaagctg gcgcgcgatg ccaccttctt cgtcagggcg 540

cacgagagca acgagatgca gccgacgctc gccatcagcc atgccggggt cagcgtggtc 600

atggcccagg cccagccgcg ccgggaaaag cgctggagcg aatgggccag cggcaaggtg 660

ttgtgcctgc tcgacccgct ggacggggtc tacaactacc tcgcccagca gcgctgcaac 720

ctcgacgata cctgggaagg caagatctac cgggtgctcg ccggcaaccc ggcgaagcat 780

gacctggaca tcaagcccac ggtcatcagt catcgcctgc atttccccga gggcggcagc 840

ctggccgcgc tgaccgcgca ccaggcctgc cacctgccgc tggagacctt cacccgtcat 900

cgccagccgc gcggctggga acaactggag cagtgcggct atccggtgca gcggctggtc 960

gccctctacc tggcggcgcg gctgtcgtgg aaccaggtcg accaggtgat ccgcaacgcc 1020

ctggccagcc ccggcagcgg cggcgacctg ggcgaagcga tccgcgagca gccggagcag 1080

gcccgtctgg ccctgaccct ggccgccgcc gagagcgagc gcttcgtccg gcagggcaca 1140

ggcaacgacg aggccggcgc ggccagcgcc gacgtggtga gcctgacctg cccggtcgcc 1200

gccggtgaat gcgcgggccc ggcggacagc ggcgac 1236

Claims

1.一种猪蓝耳病亚单位疫苗组合物，其特征在于，该疫苗组合物抗原蛋白包括P2-GP5+M重组蛋白、PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白和PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白；所述P2-GP5+M重组蛋白是P2-GP5融合蛋白与猪蓝耳病毒M蛋白的融合，且所述P2-GP5融合蛋白是破伤风类毒素通用CD4⁺T细胞抗原表位P2蛋白和猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的融合；所述PEA(ΔⅢ)-pp1a重组蛋白是绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白与猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段的融合；PEA(ΔⅢ)-N重组蛋白是绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白与猪蓝耳病毒N蛋白片段的融合；

其中，猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的氨基酸序列是以SEQ ID NO.1所示的猪蓝耳病毒NADC30株GP5蛋白氨基酸序列为基准的片段序列；猪蓝耳病毒GP5蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

P2-GP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

猪蓝耳病毒M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

猪蓝耳病毒pp1a蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；

猪蓝耳病毒N蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；

所述绿脓杆菌外毒素PEA(ΔⅢ)蛋白由SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列编码。

2.根据权利要求1所述的一种猪蓝耳病亚单位疫苗组合物，其特征在于，该疫苗组合物还包括佐剂。

3.一种制备权利要求1至2任一项所述的猪蓝耳病亚单位疫苗组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.一种权利要求1至2任一项所述的猪蓝耳病亚单位疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪蓝耳病毒相关疾病或由猪蓝耳病毒感染的相关疾病的药物中的应用。