CN111996175B - 缺失e66l、i267l基因的非洲猪瘟减毒及活疫苗 - Google Patents

缺失e66l、i267l基因的非洲猪瘟减毒及活疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缺失E66L、I267L基因的非洲猪瘟减毒及活疫苗公开了一类新的减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒；通过对E66L、I267L部分或全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后，发热和病毒血症未出现或显著减轻，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。

Description

缺失E66L、I267L基因的非洲猪瘟减毒及活疫苗
发明领域
本发明涉及一种非洲猪瘟基因缺失减毒，尤其是公开了一种缺失E66L、I267L基因部分或全部功能的非洲猪瘟减毒，本发明还进一步提供利用该减毒制备的非洲猪瘟基因缺失活疫苗，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
非洲猪瘟（ASF）是非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的高度接触传染性致死性疾病，死亡率接近100％，给养猪业带来重大损失。针对非洲猪瘟的防控，过去主要采取扑杀和清除的方法，迄今为止，尚无研制成功疫苗。非洲猪瘟病毒基因组全长170-190kb,编码150~180个ORFs,至今已发现包括多基因家族基因等在内的大量与病毒毒力、免疫抑制、抑制凋亡等相关的基因，如毒力因子如9GL、UK等(Lewis et al., 2000) (Zsak et al., 1998)，免疫抑制因子如MGF360、MGF505等(Afonso et al., 2004)、血吸附因子如CD2v等(Rodriguez et al., 1993)。
近年来针对ASFV MGF360、MGF505、CD2v等基因进行缺失的减毒疫苗株，以及在自然界中分离的自然弱毒株，在猪体内证实有一定的免疫效果，但在田间试验中发现，这些自然弱毒和人工缺失株疫苗使用后可产生慢性病变，如皮肤溃疡、发热、关节肿胀等不良反应（King et al.，2011；Leitao et al.，2001；Revilla et al.，1992）。因此，阐明更多未知基因功能，进而探索利用其作为更为安全有效的新疫苗，一直是非洲猪瘟防控的重要课题。
发明内容：
本发明提供了一种减毒的非洲猪瘟病毒，即缺失了E66L、I267L部分或全部功能的非洲猪瘟活病毒；在此基础上再缺失其他致病基因片段或全基因可进一步提高其安全性。该类基因缺失活病毒可保护易感猪免受ASFV强毒感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。
本发明公开的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，基因序列如：SEQ No.1所示，缺失以下基因的功能：基因组右端E66L、I267L。
其中，基因组右端的E66L、I267L 1-2个基因的缺失；基因组右端的E66L、I267L每个基因部分缺失或完全缺失。
基因组右端E66L基因序列如：SEQ No.2所示；
基因组右端I267L基因序列如：SEQ No.3所示；
本发明所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：构建的与E66L、I267L联合缺失ASFV其他致病基因如CD2v、MGF360、MGF505、A238L、A224L、EP153R、A276R、DP96R、DP71L、B119L等的重组缺失病毒。
本发明所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：其涉及的基因组包括所有非洲猪瘟病毒（不同基因型）的毒力分离株。
本发明所述的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）E66L、I267L 1个或2个基因缺失病毒的构建
以pUC-EGFP质粒为载体，以E66L、I267L中1个或2个基因为目标（X），分别构建含目的基因（X）左右同源臂的重组质粒，与亲本毒株共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到缺失目的基因的重组病毒△X；
2）E66L、I267L中1个或2个基因与ASFV其他基因联合缺失毒株的构建
以pUC-EGFP质粒为载体，构建含目的基因（Y）左右同源臂的重组质粒，与△X共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到同时缺失E66L、I267L中1个或2个基因与ASFV其他基因的联合缺失病毒；
3) 疫苗的制备
将步骤1）或2）中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以102 TCID50以上的病毒液直接或配合佐剂/免疫增强剂等成分制成疫苗。
本发明所述的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗，可与任何形式的佐剂、免疫调节剂同时使用；也可与其他猪用疫苗联合制备使用。
本发明所述的上述非洲猪瘟基因缺失病毒制备的疫苗免疫试验猪后，未出现明显发热、厌食等临床症状；并在攻毒后28天100%健活，且无病毒血症、发热、厌食等症状。证明该类基因缺失疫苗是一种安全有效的减毒活疫苗。
本发明的积极效果在于：
公开了一类新的减毒基因缺失非洲猪瘟病毒；通过对E66L、I267L部分或全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后，发热和病毒血症未出现或显著减轻，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。
附图说明
图1为本发明p△E66L-EGFP质粒构建示意图；
图2为本发明p△I267L-EGFP质粒构建示意图；
图3为本发明p△E66L-I267L-EGFP质粒构建示意图；
图4为本发明p△CD2v-mCherry质粒构建示意图；
图5为本发明 p△MGF505-mCherry质粒构建示意图。
具体实施方式：
以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但不得以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。同时本发明所用实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
细胞、毒株和质粒的制备
1、猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）及原代骨髓巨噬细胞（BMDM）取自2-3月龄仔猪，分离后的PAM细胞于含10%FBS（TBD）的1640完全培养基（gibco）培养，BMDM需在含终浓度为10ng/ml GM-CSF和10%FBS的1640完全培养基诱导培养；
2、非洲猪瘟病毒SY-18株，Genebank登录号：MH766894.1，由军事兽医研究所流行病学研究室于2018年分离，本研究所使用毒株为PAM细胞第四代扩繁毒，于-80℃分装保存；
3、表达载体pUC-EGFP和pUC-mCherry分别为携带有绿色荧光EGFP和红色荧光mCherry的质粒，其荧光基因均在p72启动子的控制下表达。
实施例2
缺失E66L基因毒株ASFV△E66L的构建
1、同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即E66L基因的左同源臂（E66L基因左侧约1200bp，E66L-Larm）和E66L的右同源臂（E66L基因右侧约1200bp,E66L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图1所示；获得重组质粒p△E66L-EGFP；
2、重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△E66L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存；提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定。所得纯化后的毒株即命名为ASFV△E66L。
实施例3
缺失I267L基因毒株ASFV△I267L的构建
1、同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即I267L基因的左同源臂（I267L基因左侧约1200bp，I267L-Larm）和I267L的右同源臂（I267L基因右侧约1200bp,I267L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图2所示；获得重组质粒p△I267L-EGFP；
2、重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△I267L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存；提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFV△I267L。
实施例4
缺失E66L、I267L基因毒株ASFV△E66L-I267L的构建
1、同源重组载体的构建 利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即E66L基因的左同源臂（E66L基因左侧约1200bp，E66L-Larm）和I267L的右同源臂（I267L基因右侧约1200bp,I267L-Rarm），依次克隆至pUC-EGFP载体，如图3所示。获得重组质粒p△E66L-I267L-EGFP；
2、重组病毒的筛选、纯化和鉴定 将重组质粒 p△E66L-I267L-EGFP转染BMDM细胞，4h后，按照1MOI感染量加入SY-18病毒液，于37℃培养48h后，显微镜下可见约50-100个散在绿色荧光细胞，挑取带有绿色荧光的细胞至新鲜的BMDM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔细胞并保存；提取核酸，使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFV△E66L-I267L。
缺失E66L、I267L 1个或2个基因与ASFV其他基因联合缺失毒株的构建：以E66L、I267L与CD2v、MGF505基因联合缺失毒株的构建为例，CD2v、MGF505以外的其他基因类同：
实施例5
E66L与CD2v基因联合缺失毒株ASFV△E66L△CD2v的构建
因ASFV△E66L携带绿色荧光，为便于纯化，选择以mCherry红色荧光替换目的基因CD2v。以pUC-mCherry质粒为载体，分别将CD2v的左同源臂（CD2v基因左侧约1200bp,CD2v-Larm）和右同源臂（CD2v基因右侧约1200bp,CD2v-Rarm）克隆至图4所示位置，构建得到重组质粒p△CD2v-mCherry。将重组质粒转染BMDM，4h后以1MOI感染ASFV△E66L；培养48h后，挑取同时有红色和绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BMDM细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存；使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFV△E66L△CD2v。
实施例6
E66L、I267L与CD2v基因联合缺失毒株ASFV△E66L-I267L△CD2v的构建
因ASFV△E66L-I267L携带绿色荧光，为便于纯化，选择以mCherry红色荧光替换目的基因CD2v。以pUC-mCherry质粒为载体，分别将CD2v的左同源臂（CD2v基因左侧约1200bp,CD2v-Larm）和右同源臂（CD2v基因右侧约1200bp,CD2v-Rarm）克隆至图4所示位置，构建得到重组质粒p△CD2v-mCherry。将重组质粒转染BMDM，4h后以1MOI感染ASFV△E66L-I267L；培养48h后，挑取同时有红色和绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BMDM细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存；使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFV△E66L-I267L△CD2v。
实施例7
E66L、I267L与MGF505基因联合缺失毒株ASFV△E66L-I267L△MGF505的构建
因ASFV△E66L-I267L为绿色荧光，为便于纯化，选择以mCherry红色荧光替换目的基因CD2v。以pUC-mCherry质粒为载体，分别将MGF505的左同源臂（MGF505基因左侧约1200bp,MGF505-Larm）和右同源臂（MGF505基因右侧约1200bp, MGF505-Rarm）克隆至图5所示位置，构建得到重组质粒p△MGF505-mCherry。将重组质粒转染BMDM，4h后以1MOI感染ASFV△E66L-I267L；培养48h后，挑取同时有红色和绿色荧光的细胞，至新鲜的正常BMDM细胞，完成一轮纯化；以此步骤纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，在BMDM细胞上进行3轮有限稀释，收集末轮有限稀释孔荧光细胞并保存；使用鉴定引物进行纯度鉴定；所得纯化后的毒株即命名为ASFV△E66L-I267L△MGF505。
实施例8
基因缺失非洲猪瘟减毒疫苗的制备及其安全性和免疫原性评价
将实施例2~7中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以102 TCID50以上的病毒液直接或配合佐剂/免疫增强剂等成分制成疫苗：
1）E66L基因缺失的ASFV疫苗（ASFV△E66L）
毒株培养和滴度测定
将实施例2中构建的病毒ASFV△E66L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照；免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性；免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50；观察28日；
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.75TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表1：
表1 ASFV△E66L免疫猪后安全性结果
免疫后攻毒结果如表2：
表2 ASFV△E66L免疫猪攻毒结果
疫苗剂量 免疫头数 攻毒SY18剂量 攻毒后存活头数
105TCID50 5 1000TCID50 5/5
102TCID50 5 1000TCID50 5/5
不免疫对照 5 1000TCID50 0/5
2） I267L基因缺失的ASFV疫苗（ASFV△I267L）
毒株培养和滴度测定
将实施例3中构建的病毒ASFV△I267L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50；观察28日；
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为106.75TCID50/mL。
免疫后的安全性观察和测定结果如表3：
表3 ASFV△I267L免疫猪后安全性结果
免疫攻毒结果如表4：
表4 ASFV△I267L免疫猪攻毒结果
疫苗剂量 免疫头数 攻毒SY18剂量 攻毒后存活头数
105TCID50 5 1000TCID50 5/5
102TCID50 5 1000TCID50 4/5
不免疫对照 5 1000TCID50 0/5
3） E66L、I267L基因缺失的ASFV疫苗（ASFV△E66L-I267L）
毒株培养和滴度测定
将实施例4中构建的病毒ASFV△E66L-I267L接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
疫苗制备及安全性和免疫原性评价
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50；观察28日；
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.25TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表5：
表5 ASFV△E66L-I267L免疫猪后安全性结果
免疫攻毒结果如表6。
表6 ASFV△E66L-I267L免疫猪攻毒结果
疫苗剂量 免疫头数 攻毒SY18剂量 攻毒后存活头数
105TCID50/mL 5 1000TCID50 5/5
102TCID50/mL 5 1000TCID50 5/5
不免疫对照 5 1000TCID50 0/5
4）E66L与CD2v基因联合缺失的疫苗（ASFV△E66L△CD2v株）
毒株培养和滴度测定
将实施例5中构建的病毒ASFV△E66L△CD2v接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50；观察28日；
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为107.25TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表7：
表7 ASFV△E66L△CD2v免疫猪后安全性结果
免疫攻毒结果如表8：
表8 ASFV△E66L△CD2v免疫猪攻毒结果
疫苗剂量 免疫头数 攻毒SY18剂量 攻毒后存活头数
105TCID50 5 1000TCID50 5/5
102TCID50 5 1000TCID50 4/5
不免疫对照 5 1000TCID50 0/5
5）E66L-I267L和CD2v联合缺失的ASFV疫苗（ASFV△E66L-I267L△CD2v）
毒株培养和滴度测定
将实施例6中构建的病毒ASFV△E66L-I267L△CD2v接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50；观察28日；
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为106.75TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表9：
表9 ASFV△E66L-I267L△CD2v免疫猪后安全性结果
免疫攻毒结果如表10：
表10 ASFV△E66L-I267L△CD2v免疫猪攻毒结果
疫苗剂量 免疫头数 攻毒SY18剂量 攻毒后存活头数
105TCID50 5 1000TCID50 5/5
102TCID50 5 1000TCID50 5/5
不免疫对照 5 1000TCID50 0/5
6）E66L、I267L与MGF505基因联合缺失的疫苗（ASFV△E66L-I267L△MGF505株）
毒株培养和滴度测定
将实施例7中构建的病毒ASFV△E66L-I267L△MGF505接种PAM细胞，感染5天后冻融，离心，上清即为PAM细胞上的P1代病毒液。按如下方法测定病毒滴度，将PAM细胞铺于96孔板，将收集的细胞毒按照10倍梯度稀释，接种于已铺好的细胞。感染5天后，80%冷丙酮固定后，加入工作浓度的FITC标记的P30抗体，孵育1h后，PBST洗板三次，加入80%甘油，于镜下观察荧光。按照Reed-Muench法计算病毒的效价，以TCID50/m L为单位；
疫苗制备和免疫
以生理盐水或RPMI1640培养基，将中制备的病毒液稀释分别稀释至105TCID50/mL 、102TCID50/mL，按照9:1比例加入佐剂（A30），分别接种5头猪，同时设置5头不免疫攻毒对照。免疫后观察7日，测定体温，以判断本疫苗的安全性。免疫后28日对所有试验组进行强毒SY-18攻击，使用量为1000TCID50；观察28日；
结果
通过以上培养方法获得的培养物，病毒滴度为106.0TCID50/m L。
免疫后的安全性观察和测定结果如表11：
表11 ASFV△E66L-I267L△MGF505免疫猪后安全性结果
免疫攻毒结果如表12：
表12 ASFV△E66L-I267L△MGF505免疫猪攻毒结果
疫苗剂量 免疫头数 攻毒SY18剂量 攻毒后存活头数
105TCID50 5 1000TCID50 5/5
102TCID50 5 1000TCID50 2/5
不免疫对照 5 1000TCID50 0/5
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 缺失E66L、I267L基因的非洲猪瘟减毒及活疫苗
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> 猪(swine )
<400> 1
ttacatgata tatgtgtaaa catgtgtggt aaacaacata tggttatgct ttataagata 60
aatgcgcata atatatgtaa acaaaatatg gttatgtgtt aaatgcatat aaatgtattt 120
taacgtatat cttgtgataa tggatatatg catttattaa aagaggctgt atttattata 180
aatcttgcta aggatgccat tgtcaacata tatcccatgt tggacaaatt gcgttgcgat 240
ccagttcttt tttttttgat tttgtttaat gctatccttt ttgaagggat ggttgtccac 300
catatttatt cgatgttcaa tgaataggtc tgctttttcg taaggcagtg aaggtcgttc 360
caagactcct tgaacgaagg acgtgttttc ttggatccac ttaaaaagca cgtggcattc 420
aaaaacagga cagtgattgg atccttggat atgctttgga cagccaatgc ttgaagagat 480
gtagtccctt ttctttagga caagcttctc cacgctgggg caacagagat cgttcaagtt 540
ctggacggtc gcatttggaa tgttgaaact tcgtatccat tcaccctcgg gtcctccctt 600
atgaagaagg agtatttgct catggtcctt agtaatctta accaaatgtt ggaagatcat 660
ttttttacct gctttaaagg cctgaagggt gtcagttggc aaagctattg aattcgggag 720
tgggctttca tcaagcgtga aatggtgaat gtgacgcgac tggaaagaaa acgaccgttg 780
atttattttt tcaaagattg ggtcgattcc gccatgaaag aacagctgca agattttaga 840
aggcgtattt ttttcccaat aaaaaatgac cacttctcgt gggattaaaa tcgtctgtgt 900
cccattttca ttatataatt ggcccataaa gccatcaacg tcaatcaaca ccaaaagcat 960
<210> 2
<211> 153
<212> DNA
<213> 猪(swine )
<400> 2
ttacatgata tatgtgtaaa catgtgtggt aaacaacata tggttatgct ttataagata 60
aatgcgcata atatatgtaa acaaaatatg gttatgtgtt aaatgcatat aaatgtattt 120
taacgtatat cttgtgataa tggatatatg cat 153
<210> 3
<211> 804
<212> DNA
<213> 猪(swine )
<400> 3
ttaaaagagg ctgtatttat tataaatctt gctaaggatg ccattgtcaa catatatccc 60
atgttggaca aattgcgttg cgatccagtt cttttttttt tgattttgtt taatgctatc 120
ctttttgaag ggatggttgt ccaccatatt tattcgatgt tcaatgaata ggtctgcttt 180
ttcgtaaggc agtgaaggtc gttccaagac tccttgaacg aaggacgtgt tttcttggat 240
ccacttaaaa agcacgtggc attcaaaaac aggacagtga ttggatcctt ggatatgctt 300
tggacagcca atgcttgaag agatgtagtc ccttttcttt aggacaagct tctccacgct 360
ggggcaacag agatcgttca agttctggac ggtcgcattt ggaatgttga aacttcgtat 420
ccattcaccc tcgggtcctc ccttatgaag aaggagtatt tgctcatggt ccttagtaat 480
cttaaccaaa tgttggaaga tcattttttt acctgcttta aaggcctgaa gggtgtcagt 540
tggcaaagct attgaattcg ggagtgggct ttcatcaagc gtgaaatggt gaatgtgacg 600
cgactggaaa gaaaacgacc gttgatttat tttttcaaag attgggtcga ttccgccatg 660
aaagaacagc tgcaagattt tagaaggcgt atttttttcc caataaaaaa tgaccacttc 720
tcgtgggatt aaaatcgtct gtgtcccatt ttcattatat aattggccca taaagccatc 780
aacgtcaatc aacaccaaaa gcat 804

Claims (6)

1.一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，缺失的基因为E66L和I267L，缺失的基因序列如SEQ No.1所示，基因缺失前亲本毒株为非洲猪瘟病毒SY-18株。
2.一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，缺失的基因为E66L，缺失的基因序列如SEQNo.2所示，基因缺失前亲本毒株为非洲猪瘟病毒SY-18株。
3.一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，缺失的基因为I267L，缺失的基因序列如SEQNo.3所示，基因缺失前亲本毒株为非洲猪瘟病毒SY-18株。
4.一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于：在权利要求1-3任一项所述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株的基础上，构建联合缺失CD2v或MGF505基因的减毒非洲猪瘟病毒株。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株制备的疫苗。
6.权利要求5所述的疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1）基因缺失病毒的构建
以pUC-EGFP质粒为载体，以缺失基因为目标，分别构建含目的基因左右同源臂的重组质粒，与亲本毒株共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到缺失目的基因的重组病毒；
2）疫苗的制备
将步骤1）中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以102 TCID50以上的病毒液直接或配合佐剂或免疫增强剂制成疫苗。
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