CN114272365B

CN114272365B - 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒构建及其作为疫苗的应用

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Publication number: CN114272365B
Application number: CN202111079587.6A
Authority: CN
Inventors: 陈鸿军; 刘英楠; 谢振华; 宋庆庆; 狄栋栋; 龚浪; 王衡
Original assignee: Jinyubaoling Bio Pharmaceutical Co ltd; Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center; South China Agricultural University
Current assignee: Jinyubaoling Bio Pharmaceutical Co ltd; Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center; South China Agricultural University
Priority date: 2021-09-15
Filing date: 2021-09-15
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2041-09-15
Also published as: CN114272365A

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒基因缺失减毒株及由该毒株制备的活疫苗，尤其是公开了一种缺失I73R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，缺失I73R全部基因功能的非洲猪瘟病毒减毒株，本发明还进一步提供了利用该减毒株制备的非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗，可保护易感猪免受ASFV强毒自然感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。下一步计划在此基础上再联合缺失其他致病基因片段或全基因可进一步提高其使用的安全性。

Description

一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒构建及其作为疫苗的应用

发明领域

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒基因缺失减毒株及由该毒株制备的活疫苗，尤其是公开了一种含I73R基因缺失的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，缺失I73R基因功能的非洲猪瘟病毒减毒株，本发明还进一步提供了利用该减毒株制备的非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)感染引起的一种高度接触传染致死性传染病，对于家猪的致死率高达100％，目前尚未有商品化用于防治该病的有效疫苗，针对非洲猪瘟的防控，目前主要采取扑杀和拔牙清除等措施。非洲猪瘟最初于1921年在肯尼亚首次爆发，随后迅速在家猪和野猪中流行。自20世纪50年代进入欧洲，整个欧洲地区用了40年的时间才真正清除该病。然而，非洲猪瘟在2007年再次由东非国家传入格鲁吉亚，并于2018年8月传入中国，仅一年的时间，全国30多个省市自治区均发现并报道爆发非洲猪瘟疫情，生猪产量下降40％，给中国民生造成巨大的影响，成为威胁我国养猪业的头号疫病。基于我国现阶段养猪业遭受重创的基本国情，疫苗免疫是作为防控非洲猪瘟疫情最经济有效的方法。自非洲猪瘟发现100多年以来，各种疫苗研制策略，包括灭活疫苗、传代致弱疫苗或天然弱毒苗、亚单位疫苗、新型佐剂以及载体疫苗等保守疫苗研制方案均在非洲猪瘟的防控上做过尝试，但收效甚微。只有基于活病毒采用基因缺失的手段制备的非洲猪瘟病毒基因缺失重组疫苗才是防控非洲猪瘟最经济，最有效的手段。

ASFV基因组庞大，编码150～170左右个基因，基因排列紧密，双向读码，具有复杂的免疫逃逸机制。目前报道的ASFV毒力基因只要包括：CD2v、DP148R、DP71L、I177L、9GL、UK以及MGF360、MGF110、MGF505等多基因家族，但基于以上毒力基因得到的单基因缺失或多基因缺失得到的重组病毒疫苗候选株或多或少都存在一些安全性、保护效力或毒力残留等问题，对我国目前养猪业的现状以及长远的生物安全防控来看，存在着巨大的挑战。例如，基于中国流行的基因II型病毒进行CD2v或DP148R缺失，减毒效果极其有限；基于MGF360、MGF505、MGF110家族基因的单基因缺失或多基因联合缺失，虽然能够显著降低病毒的毒力，但病毒基因组稳定性会受到影响，存在基因重排的风险，致使田间使用过程中毒力反强风险大大增加，并且田间实验发现基于MGF360和MGF505家族基因的人工缺失疫苗使用后可引起慢性病变，如皮肤溃烂、发热或关节肿胀等不良反应；基于DP71L、9GL、UK或DP96R等缺失构建的减毒重组病毒，免疫动物后出现一过性发热的副反应以及免疫病毒无法被猪体完全清除等问题。另外，在ASFV减毒缺失疫苗的制备过程中，鉴定和阐明基因功能，对靶基因的选择也是至关重要的，往往既要考虑免疫的安全性，又要兼顾足够的保护性能，达到安全性和有效性的平衡。

发明内容

申请人通过多年的研究发现，I73R是一个ASFV编码的早期高表达的非结构蛋白，序列保守，且定位于细胞核中，参与调控宿主基因的转录和宿主蛋白的表达，本发明首先发现ASFV I73R能够抑制宿主抗病毒蛋白Viperin的表达，而后又通过同源重组的方法缺失I73R基因，从而获得一株具有足够安全性和免疫原性的非洲猪瘟病毒株，可作为制备非洲猪瘟疫苗的候选病毒株，并对未来非洲猪瘟疫苗的研制提供了理论依据和实践参考。

本发明提供了一种缺失I73R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，即缺失了I73R全部基因功能的非洲猪瘟活病毒，I73R基因全部缺失后即表现良好的免疫保护作用，可保护易感猪免受ASFV强毒自然感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。在此基础上再联合缺失其他致病基因片段或全基因可进一步提高其使用的安全性。

本发明公开的一种缺失I73R基因的非洲猪瘟病毒减毒株，所述缺失I73R基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

其中，所述缺失是指完全缺失或基因序列的部分缺失或单个核苷酸的突变。

本发明所示的一种基因缺失的减毒的非洲猪瘟病毒，其特征在于：构建的含I73R基因缺失的重组病毒。

进一步的，本发明所示的一种基因缺失的减毒的非洲猪瘟病毒是含有I73R基因缺失，进一步优选的，可以同时联合其他基因的多个基因缺失的非洲猪瘟病毒减毒株。

本发明所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：其涉及的基因组包括所有非洲猪瘟病毒(不同基因型)的毒力分离株。

本发明所述的一种缺失I73R基因的非洲猪瘟病毒减毒株活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)I73R基因缺失病毒的构建

以pUC-19质粒或类似质粒为载体，以I73R基因为目标，构建含该目的基因左右同源臂以及使用p72病毒蛋白启动子调控的EGFP基因替换I73R基因的重组质粒，通过转染BMDM细胞随后感染ASFV亲本毒株的同源重组方式，筛选并纯化得到目的基因缺失的重组病毒ASFV△I73R；

2)疫苗的制备

将步骤1)中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以10³TCID₅₀以上的病毒液制成疫苗。

本发明所述的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗，可与任何形式的佐剂、免疫调节剂同时使用；也可与其他猪用疫苗联合制备使用。

本发明所述的上述非洲猪瘟基因缺失病毒制备的疫苗免疫试验猪后，未出现发热、厌食、精神沉郁等任何异常临床症状；并在攻毒后28天100％健活，且无病毒血症、发热、厌食等症状。证明该类基因缺失疫苗是一种安全有效的减毒活疫苗。

本发明的积极效果在于：

本发明公开了一类新的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒；通过对I73R全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后未引起发热、厌食和精神沉郁等症状，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒的自然感染或人为攻击，可用于非洲猪瘟的预防。且通过对免疫后28天的安全性评价发现，接种I73R缺失重组病毒的实验猪在接种后21天左右，病毒能够被完全清除，证明该类基因缺失疫苗是一种安全有效的减毒活疫苗。这对于我国重点防范的一类动物疫病的非洲猪瘟防控以及生物安全层面来讲是至关重要的。

I73R基因位于ASFV基因组3'端，编码一个73个氨基酸的功能未知的蛋白，I73R蛋白氨基酸序列在不同流行毒株之间的序列对比显示，I73R高度保守，且非洲猪瘟病毒的基因组中或Genbank数据库中没有与其核苷酸序列相似的基因，这表明I73R基因是ASFV编码的一个独特的基因。鉴于此分析，基于I73R基因缺失构建的重组病毒发生基因重组或重排导致毒力反强的风险远远低于MGF多基因家族基因靶点的缺失。此外，I73R基因的病毒复制过程中的表达趋势与ASFV p30基因相似，早期和晚期的表达水平极高，中期表达水平较稳定。一般来讲，病毒复制早期表达的蛋白通常起到调控细胞周期，防止病毒对细胞的毒性作用，并且与病毒的复制、入侵和传播相关；而病毒复制晚期表达的蛋白则被认为是与病毒的组装和病毒粒子的形成、病毒释放以及病毒毒力相关。而本发明涉及的I73R基因在病毒复制周期的早期和晚期都表现出极高的表达水平，无疑对非洲猪瘟病毒是一个至关重要的基因。

另外，本发明基于I73R基因敲除构建的重组病毒在体外多步法生长曲线表明，缺失I73R基因后，病毒的复制水平在感染细胞早期确实受到一定的影响，相同接种剂量下，直至感染后96-120h病毒滴度才达到较高的水平，低于亲本病毒大约10倍左右，这一现象也符合我们的猜想，即I73R基因的早期高水平表达与病毒的早期入侵、传播相关，I73R基因的早期高表达是否与防止病毒对细胞产生毒性作用，有利于病毒复制、扩散和传播，尚需进一步探讨。

此外，本发明通过在细胞系中体外瞬时过表达I73R蛋白，发现ASFV I73R能够抑制宿主抗病毒蛋白Viperin蛋白的表达，这一发现我们猜测与I73R在病毒复制晚期高表达相关，即I73R晚期的高表达，抑制宿主抗病毒蛋白Viperin的表达，起到拮抗宿主先天性免疫的作用。

附图说明

图1ASFV I73R基因在病毒复制周期中的转录时相

图2ASFV I73R蛋白抑制外源抗病毒蛋白Viperin的表达

图3ASFV I73R蛋白抑制宿主细胞内源抗病毒蛋白Viperin的表达

图4用于I73R基因缺失的载体构建示意图

图5ASFV△I73R感染BMDM细胞的荧光图

图6ASFV△I73R重组病毒的多步生长曲线

图7ASFV△I73R免疫后体温监测

图8ASFV△I73R免疫后病毒血症监测

图9ASFV△I73R攻毒后体温监测

图10ASFV△I73R攻毒后生存曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但不得以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。同时本发明所用实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1重组ASFV△I73R缺失病毒的构建

非洲猪瘟病毒中国流行毒株(African swine fever virus,ASFV GZ201801株)，由华南农业大学分离并保存(其全长序列参见GenBank登录号：MT496893.1)。猪原代肺泡巨噬细胞(Primary porcine alveolar macrophages,PAM)和原代骨髓源性巨噬细胞(Bonemarrow-derived macrophages,BMDM)分别分离于30～50日龄的仔猪的肺脏和骨髓腔，具体操作方法如前所述(Zhang et al.,2021)。按照国家标准方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、经典猪瘟传染病病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒1型和2型(PCV-1/2)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)确保分离的PAM和BMDM没有污染以上病毒。将细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％ Pen-Strep和2mM L-谷氨酰胺(Gibco^TM，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)和10ng/mL rpGM-CSF(R&D System，Minneapolis,MN,USA)的RPMI 1640基础培养基中。

真核表达质粒构建和转染

使用BamHI和XhoI限制性位点，将ASFV GZ201801的I73R基因扩增并亚克隆到带有N端血凝素(HA)标签的pCAGGS-HA载体中(pHA-I73R)。构建的质粒通过DNA测序验证。构建完成后，使用lipofectamine 2000转染试剂将重组质粒转染到HEK-293T细胞中。转染的细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解。将细胞裂解物与6×SDS-PAGE上样缓冲液混合并煮沸10分钟，然后通过SDS-PAGE和western blot分析。

I73R蛋白抑制抗病毒蛋白Viperin的表达

将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔中。利用lipofectamine 2000脂质体试剂分别转染不同剂量的pHA-I73R真核表达质粒或pCAGGS空载质粒和编码蝰蛇毒素蛋白(pHA-Viperin)至70％-80％融合度的HEK-293T细胞，转染24h后，制备细胞裂解物，通过SDS-PAGE和western blot分析I73R病毒蛋白对Viperin蛋白表达的影响。结果表明，转染pCAGGS空载质粒和pHA-Viperin质粒后，pHA-Viperin表达水平较高；而共同转染pHA-Viperin质粒(1μg/孔)和不同剂量的pHA-I73R质粒(0.5、1、2μg)后，pHA-Viperin的表达显著降低，且转染pHA-I73R质粒越多，pHA-Viperin表达降低越显著(图2)。说明，非洲猪瘟病毒I73R蛋白能够显著抑制外源蝰蛇毒素蛋白(Viperin)的表达。

为了进一步评估ASFV I73R是否对细胞蝰蛇毒素蛋白(Viperin)同样具有抑制作用，将不同剂量的pHA-I73R真核表达质粒或pCAGGS空载质粒转染HEK-293T细胞，转染后24h，细胞中加入10ng/mL的hIFN-α1，然后再孵育一小时后，制备细胞裂解物并进行westernblot分析，并使用anti-Viperin抗体分析Viperin蛋白的表达。结果表明，I73R蛋白以剂量依赖性的方式显著抑制宿主抗病毒蛋白Viperin的表达(图3)。

这些结果充分说明I73R蛋白可以有效拮抗宿主的抗病毒作用。

同源重组载体构建

将I73R基因ORF左右各1500bp的基因组(作为左右同源臂，左侧同源臂位置相当于全长基因组第170618-172117位，右侧同源臂位置相当于全长基因组第172337-173836位)、ASFV p72启动子和eGFP等4个基因的PCR片段通过融合PCR试剂盒克隆至pUC19载体，其中eGFP基因在ASFV p72晚期启动子的控制下进行表达，从而获得同源重组载体质粒Puc-LR△I73R-eGFP(图4)。

重组ASFV△I73R缺失病毒的构建

使用-macrophage(Polyplus-transfection Inc.,Illkirch,France)将2μg pUC-LR△I73R-eGFP转染至BMDM细胞，然后在转染后6小时，以1moi的剂量感染ASFVGZ201801病毒。感染后24小时后，从单层BMDMs中挑选表达EGFP的细胞并用无菌PBS冲洗3遍，然后接种至新的BMDMs中的盲传代，然后通过8～10轮的噬斑克隆纯化得到ASFV△I73R缺失病毒，如图5所示。为确保得到的ASFV△I73R缺失病毒中不含有亲本毒的残余，再进行一次有限稀释法纯化病毒，获得的最高稀释度阳性孔作为ASFV△I73R缺失病毒种毒。从有限稀释纯化中的最高稀释度阳性空中挑取单个荧光细胞，接种于预先铺好的96孔板的PAM细胞中，每24小时观察一次，直至72小时，荧光细胞比例基本达到50％以上。ASFV△I73R缺失病毒种毒转接BMDMs扩繁一批病毒作为评价用病毒。ASFV△I73R的纯度通过常规PCR程序进行评估和鉴定，引物对如下：pI73R-F:5'-CGGATGGAGACTCAGAAGTTGATT-3'和pI73R-R:5'-CGGTTAGTTTTTCCGTATCCAAAG-3'。

实施例2重组ASFV△I73R缺失病毒的生物活性分析

病毒滴度的测定

非洲猪瘟病毒的滴度测定采用半数组织感染剂量(50％ Tissue CultureInfectious Dose,TCID₅₀)的方法进行。步骤如下：将病毒原液进行10倍系列稀释，每个稀释度接种8个孔，每孔0.1mL；接种后五天，细胞用4％多聚甲醛固定，并用0.1％ Triton X-100(购自上海生物工程有限公司)透化，用2％ BSA封闭1小时，然后在37℃与ASFV p30 mAb(本实验室保存)孵育1小时，然后与山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗Alexa Fluor 488(购自美国ThermoFisher公司)以1:600稀释孵育，然后在徕卡荧光显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)下观察(ASFV△I73R缺失病毒可以观察绿色荧光)。病毒滴度使用Reed-Muench方法计算。为了评估I73R基因在非洲猪瘟病毒复制中的影响，以0.1m.o.i的感染剂量接种BMDMs评估ASFV△I73R在BMDMs上的复制动力学。多步生长曲线结果表明，缺失I73R基因后，显著降低了ASFV GZ201801在BMDMs上的复制能力，与亲本病毒ASFV GZ201801毒株相比，ASFV△I73R的平均滴度在接毒后72或96小时降低10-100倍左右(图6)。因此，I73R基因的缺失显著降低了病毒在原代猪巨噬细胞中的复制能力，但病毒依旧可以有效的复制，证明I73R基因是一种ASFV复制的非必需基因。

动物免疫实验

为了评估I73R基因缺失对ASFV GZ201801毒力的影响，对7～10kg的家猪肌肉注射(IM)接种10⁴TCID₅₀的ASFV△I73R缺失病毒(n＝3，R1-R3)。在内蒙古金宇保灵生物有限公司生物安全三级实验动物房中引进体重7～9kg的杜大长杂交系仔猪(购自内蒙古当地一家生物安全标准和卫生标准均合格的农场)。通过国家标准方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、经典猪瘟传染病病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒1型和2型(PCV-1/2)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)，筛选以上病原阴性猪，按照表1的试验分组进行毒力评价试验。免疫后，持续监测动物体温，每天观察记录动物的精神状态、采食、排便以及直肠温度等。接种后3、5、7、9、11、15、21和28天收集血清、肝素抗凝全血、口腔拭子、鼻拭子和肛门拭子的临床样本，用于检测病毒血症、排毒以及抗体水平等。临床评估后，通过注射戊巴比妥钠对猪实施安乐死，并进行尸检。实验中死亡动物立即进行剖检。记录器官和组织病变(包括扁桃体、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺、肝脏、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、胰腺、脾脏、肾脏、胸腺、膀胱、骨骼肌、脑和淋巴结等)，并进行组织病理学检查以及检测34个脏器中的病毒载量。接种后的体温监测表明(图7)，所有接种ASFV△I73R病毒的家猪，都没有体温明显升高的现象，存活率100％。病毒血症检测结果显示，所有接种ASFV△I73R的动物在免疫后9天内，病毒血症均为阴性，其中R1和R2号猪在第14天检测到低水平的一过性的病毒血症，随后21-28天病毒血症检测均为阴性(图8)。口腔、鼻腔、肛门拭子排毒检测结果表明，所有接种ASFV△I73R的动物在免疫后28天内均未检测到排毒(表2)。综上，ASFV△I73R基因缺失毒株在猪体内充分致弱。

表1试验分组

表2ASFV△I73R免疫猪后排毒监测

注：“N”表示排毒监测为阴性

动物攻毒实验

免疫后28天，ASFV△I73R免疫组的所有动物进行ASFV强毒攻击，攻击剂量为10⁴TCID₅₀/头，攻毒途径为肌肉注射，同时引进3头同一批次的空白猪作为攻毒对照。攻毒后，持续观察动物的精神状况、采食情况，并持续检测动物体温，攻毒后3、5、7、9、14和21天采集抗凝血和分离血清以及口腔、鼻腔和肛门拭子。攻毒后21天，所有存活动物通过注射戊巴比妥钠实施安乐死，并进行尸检。

正如预期，攻击ASFV GZ201801的家猪在接种后1～3天就表现出体温升高(>40℃)(图7)，随后出现与经典ASF相关的临床症状，包括抑郁、食欲不振、皮肤发紫变色、腹泻；随着时间的推移，疾病的迹象逐渐加重，所有接种ASFV GZ201801的猪在第9天全部死亡；而ASFV△I73R免疫组在攻毒后存活率100％(图10)。

ASFV△I73R免疫动物在攻毒后,R1号猪在第10～11天体温升高，仅持续了两天，随后恢复正常；R2号猪在第5-10天出现体温一过性升高，随后恢复正常，体温升高后R2号猪精神状况轻度抑郁，采食略有下降，饮水量变多，但随着体温逐渐恢复正常，精神状况和采食状况也恢复正常；其他猪体温、精神状况和采食情况均无异常(图9)。

攻毒后21天，所有存活动物通过注射戊巴比妥钠实施安乐死，并进行尸检。结果显示，R1号猪的下颌淋巴结、鼠蹊淋巴结和胸腺轻微充血红肿，胃肝淋巴结呈现中度的出血，其余脏器和组织均正常；R2号猪的肠系膜淋巴结、下颌淋巴结以及肩前淋巴结轻微充血，下颌淋巴结和肺门淋巴结中度出血，其余脏器和组织无明显病变；R3号猪下颌淋巴结、胃肝淋巴结、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结轻微红肿，脾脏颜色轻度苍白以及肩前淋巴结中度出血，其余脏器和组织均无异常。

综上表明，ASFV△I73R免疫猪能够对强毒攻击提供充分的免疫保护。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

〈110〉中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

金宇保灵生物药品有限公司

华南农业大学

〈120〉一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒构建及其作为疫苗的应用

〈160〉 3

〈170〉 PatentIn version 3.3

〈210〉 1

〈211〉219

〈212〉 nt

〈213〉缺失I73R基因的基因序列

〈400〉ATGGAGACTCAGAAGTTGATTTCCATGGTTAAGGAAGCCTTAGAAAAATATCAATACCCTCTTACTGCTAAAAATATTAAAGTAGTGATACAAAAAGAGCACAATGTCGTCTTACCTACAGGATCTATAAATAGCATACTGTACAGTAACTCAGAACTTTTTGAGAAGATTGATAAGACAAATACCATTTATCCCCCGCTTTGGATACGGAAAAACTAA

〈210〉2

〈211〉24

〈212〉 nt

〈213〉pI73R-F

〈400〉CGGATGGAGACTCAGAAGTTGATT

〈210〉3

〈211〉 24

〈212〉 nt

〈213〉pI73R-R

〈400〉CGGTTAGTTTTTCCGTATCCAAAG

Claims

1.一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒疫苗，其特征在于，所述减毒非洲猪瘟病毒疫苗是含有I73R基因完全缺失的非洲猪瘟病毒减毒株，其中，完全缺失的I73R基因的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，缺失前的非洲猪瘟病毒亲本毒株为非洲猪瘟病毒ASFVGZ201801株。

2.如权利要求1所述的一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)I73R基因缺失病毒的构建

以pUC-19质粒为载体，以I73R基因为目标，构建含该目的基因左右同源臂以及使用p72病毒蛋白启动子调控的EGFP基因替换I73R基因的重组质粒，通过转染BMDM细胞随后感染ASFV亲本毒株的同源重组方式，筛选并纯化得到目的基因缺失的重组病毒ASFV△I73R，ASFVΔI73R的纯度通过常规PCR程序进行评估和鉴定，引物对如下：pI73R-F:5'-CGGATGGAGACTCAGAAGTTGATT-3'和pI73R-R:5'-CGGTTAGTTTTTCCGTATCCAAAG-3'；

2)疫苗的制备

3.如权利要求1所述的一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒疫苗在制备预防非洲猪瘟的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于该疫苗可与任何形式的佐剂同时使用。

5.一种包含权利要求1所述的一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒疫苗的药物组合物。