CN117295815A - 减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的用途 - Google Patents

Abstract

发明涉及一种减毒非洲猪瘟(ASF)病毒，其中：基因MGF 360‑12L、360‑13L、360‑14L、505‑2R、505‑3R已缺失或中断或突变，使得这些基因不被转录和/或翻译，·ASFV_G_ACD_00520的ORF已缺失或中断或突变，使得该基因不被转录和/或翻译，并且·与对应的非减毒病毒的基因组相比，基因MGF 505‑1R和505‑4R被截短。本发明还涉及一种包含该减毒ASF病毒的疫苗及其在受试者中预防非洲猪瘟方面的用途。本发明还涉及一种用于获得该减毒ASF病毒的体外方法，该方法包括以下中的至少一个步骤：选自Georgia 2007/1、Pig/HLJ/2018、基因型II的ASF病毒株或基因相近的ASF病毒株的强毒ASFV病毒株的热减毒，以及通过接种无特定病原体的猪的扩增和选择所述减毒ASF病毒。本发明还涉及一种用于差分检测该减毒ASF病毒和该对应的非减毒ASF病毒的体外方法。

Description

减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的用途

技术领域

本发明涉及减毒非洲猪瘟(ASF)病毒及其作为含有该减毒非洲猪瘟病毒的疫苗用于预防ASF的用途，以及用于差分检测减毒ASF病毒和对应的非减毒ASF病毒的体外方法。

因此，本发明在药物、特别是兽医领域中具有效用。

在以下描述中，括号([])中的参考文献是指位于文本末尾处的参考文献列表。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是一种病毒性疾病，其在家养和野生猪科中引起通常致命的急性形式的出血综合征。它在欧洲猪中具有接触传染性，但在野生非洲猪科(南非野猪和疣猪)中不明显并且不能传播给人类。

这种疾病在来自撒哈拉以南非洲的野生猪科(南非野猪、疣猪和其他猪)中已经存在了至少一个世纪，但是它们未出现任何症状。1921年在肯尼亚首次记述，ASF通过软蜱叮咬在非洲从个体猪到个体猪传播，并在撒哈拉以南非洲已变成地方流行性疾病。

其首次对非洲以外的地区的侵袭追溯至20世纪60年代，与国际贸易的发展有关。美国爆发如欧洲爆发一样相当快速地被根除，除了直到1995年才根除该疾病的伊比利亚半岛和自其1978年引入以来ASF已经变成地方性动物病的撒丁岛。在2007年，欧洲大陆再次受到感染，并且在格鲁吉亚的养猪场中首次检测到爆发。在2008年，该疾病逐渐在欧亚大陆(亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯南部)盛行，影响野生猪和家养猪两者。其通过在管理不善的小农场中局部传播而继续向西传播。在2014年，ASF重返欧洲联盟，首先在波兰和波罗的海国家传播，自此其在这些国家变成野猪中的地方性动物病，然后在摩尔多瓦(2016年)、罗马尼亚和捷克共和国(2017年)、匈牙利和比利时(2018年)以及在德国(2020年)传播。最后，自从2018年8月以来，亚洲大陆已经受到很大影响：中国，然后蒙古和越南、菲律宾(2019年)和印度(2020年)。扩散的风险已经在全球范围出现。

取决于病毒株的毒力和猪宿主的易感性，ASF可以作为具有不同毒力水平的疾病呈现：急性形式、亚急性形式和慢性形式。

症状和病变类似于针对经典猪瘟所描述的那些，即过高热、血液学紊乱、皮肤发红、厌食、嗜睡、协调障碍、呕吐和腹泻。

急性形式的死亡在4天至13天内以100％的比率发生，亚急性形式的死亡在30天至40天内以较低死亡率发生。该疾病可以以慢性形式进展数月。

导致ASF的病毒是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是非常复杂和大的包膜双链DNA病毒。它感染单核细胞-巨噬细胞谱系的细胞并将免疫应答转向对其有利的方向。近年来，仅其基因组被完全测序，而尚未鉴定出所有和毒力或保护作用有关的基因，这延迟了可靠且有效疫苗的发展。

根据目前施行的与动物健康相关的健康危害等级，ASF在法国被分类为第一类健康危害。在动物健康中，第一类危害涉及严重的公共健康问题或对环境或法国生产能力的主要风险。为了大众利益，它们需要强制性的预防、监测或控制措施。这种疾病因其高死亡率和强加于受感染国家的贸易限制而导致重大经济损失。

对这种疾病的诊断是复杂的，迄今为止只有实验室测试(病毒学和/或血清学)才能提供诊断并将ASF与经典猪瘟区分开来。可通过血清学ELISA和病毒学PCR，使用充分验证的方法进行用于快速检测(在24小时内)的一线诊断，其中一些方法可作为商业试剂盒获得。

最后，迄今为止，不存在治疗或疫苗来控制这种疾病，并且控制这种疾病的唯一手段仍然是检疫和宰杀。洲联盟内的挑战是具有可口服(例如通过饵料，如针对经典猪瘟所采取的手段)递送至野猪，或递送至小型家庭农场中的猪的疫苗。在全球层面的挑战是具有用于种猪的疫苗，特别是对于世界的主要生产商—亚洲来说。

使用受感染的细胞提取物、受感染的猪外周血白细胞的上清液、纯化且灭活的病毒体、受感染的戊二醛固定的巨噬细胞或经去污剂处理的受感染的肺泡巨噬细胞给动物接种疫苗的尝试不能诱导保护性免疫。在病毒感染后存活的猪中确实产生同源保护性免疫。被中等毒力或减毒的ASFV变体急性感染后存活的猪产生对同源病毒攻击的长期抗性但很少对异源病毒攻击产生长期抗性。当用同源亲本病毒攻击时，用含有工程化的特定ASFV毒力相关基因缺失的减毒活ASF病毒免疫的猪受到保护。具体地，来自致病性ASF病毒(MalawiLil-20/1、Pretoriuskop/96/4和E70)的基因组的UK(DP69R)、23-NL(DP71L)、TK(A240L)或9GL(B119L)基因的单独缺失显著地减弱猪中的病毒，并且用这些减毒病毒免疫的动物免于受到同源病毒的攻击。

在不同的ASFV分离物之间观察到基因组大小和限制性片段模式的变化，并且这种差异在于末端基因组区域中。这些可变区包含ASFV基因组的左35kb末端和右15kb末端，并含有至少五个多基因家族(MGF)：MGF 100、MGF 110、MGF 300、MGF 360和MGF 505。这些基因被分组在这些MGF中，因为它们共享序列和结构同一性两者。这些基因的功能尚不完全清楚，但这些功能与巨噬细胞宿主范围、先天宿主免疫应答的调节和毒力相关。

最近，已经创建重组ASFV-G(非洲猪瘟病毒—Georgia 2007分离物)突变体“ASFV-G-ΔMGF”，其包含7,559个核苷酸(在核苷酸位置27,928-35,487之间)的缺失并导致MGF360基因12L、13L和14L连同MGF505 1R、2R和3R的缺失(O'Donnell等人：“African SwineFever Virus Georgia Isolate Harboring Deletions of MGF360 and MGF505 Genes IsAttenuated in Swine and Confers Protection against Challenge with VirulentParental Virus”，J Virol.，2015年6月，第89卷第11期：第6048-6056页([1])；US20160130562([2]))。然而，如果该突变病毒从临床上保护猪免于ASF Georgia株的致死攻击，则免疫猪的很大一部分(10只中有4只)未从病毒学上得到保护，因为它们在攻击后表现出病毒血症。

因此，需要替代的减毒疫苗。本发明满足这种需要和其他需要。

发明内容

作为大量工作的结果，申请者已经开发出一种新型减毒非洲猪瘟病毒(内部参考PPA/dp/FR-22/2018/180172-2，被进一步命名为ASFV-989)，其与现有减毒病毒相比，特别是与ASFV-G-AMGF相比，通过在受攻击的个体中完全预防病毒血症，令人惊讶地显示出优异的疫苗效力。

令人惊讶的是，本发明人发现当在猪肺泡巨噬细胞上培养时，本发明的减毒ASFV-989显示出与非减毒的Georgia 2007/1相似的复制速率。

本发明人已经显示在用本发明的减毒病毒(通过肌内或口鼻途径)接种的动物中特定于ASF病毒的细胞应答，在用本发明的减毒病毒ASFV-989接种的动物中血清转化和病毒血症比在用Georgia 2007/1株接种的动物中低100倍至1000倍。有趣的是，在接种ASFV-989 2周后立即用Georgia株攻击时，动物未表现出任何ASF相关症状，并且在先前用本发明的减毒病毒免疫的动物中未检测到该毒株引起的病毒血症。另外，在先前通过肌内途径用本发明的减毒病毒免疫的动物的组织中未检测到Georgia株的基因组。

此外，申请人已经开发出一种用于在样本中差分检测本发明的减毒ASFV和对应的非减毒ASFV的分子方法。

因此，在第一方面，本发明提供了一种减毒非洲猪瘟(ASF-989)病毒，其中：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已缺失或中断或突变，使得这些基因不被转录和/或翻译，

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已缺失或中断或突变，使得该基因不被转录和/或翻译，并且

·与对应的非减毒病毒的基因组相比，基因MGF 505-1R和505-4R被截短。

“对应的非减毒病毒的基因组”在本文中是指来自不含以上列出的修饰的相应病毒的基因组。它可以是选自Georgia 2007/1谱系的强毒ASFV病毒株，例如Pig/HLJ/2018(Xuexia Wen等人(2019年)，Genome sequences derived from pig and dried blood pigfeed samples provide important insights into the transmission of Africanswine fever virus in China in 2018，Emerging Microbes&Infections，第8卷第1期：第303-306页([3]))、ASFV-SY18(Xuexia Wen等人([3]))、China/2018/AnhuiXCGQ(Bao,J等人，Genome comparison of African swine fever virus China/2018/AnhuiXCGQ strainand related European p72 Genotype II strains，Transbound Emerg Dis.，2019年，第66卷：第1167-1176页([4]))、ASFV/POL/2015/Podlaskie(Mazur-Panasiuk N.等人，Thefirst complete genomic sequences of African swine fever virus isolated inPoland，Sci Rep，第9卷：第4556页(2019年)([5]))、Odintsovo 2/2014、Kashino 04/13、ASFV-Belgium2018/1(Forth JH等人，Comparative Analysis of Whole-Genome Sequenceof African Swine Fever Virus Belgium 2018/1，Emerg Infect Dis.，2019年6月，第25卷第6期：第1249-1252页([6]))或ASFV/Kyiv/2016/131(Kovalenko,G.等人，CompleteGenome Sequence of a Virulent African Swine Fever Virus from a Domestic Pigin Ukraine，Microbiology resource announcements，2019年，第8卷，第e00883-00819页([7]))、基因型II的ASF病毒株或基因相近的ASF病毒株。

根据本发明，缺失可以通过本领域技术人员已知的任何手段进行。缺失可以是其中每个基因或ORF的至少一部分被切除的突变。可以缺失任何数目的核苷酸，从单个碱基到整个基因或ORF，只要该基因或ORF不被转录和/或翻译即可。优选地，缺失整个基因和ORF，即：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已完全缺失；并且

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已完全缺失。

根据本发明，中断可以通过本领域技术人员已知的任何手段进行。手段可以是例如通过缺失或以其他方式修饰基因的ATG起始密码子，或通过修饰翻译起始位点，或移码；或在基因的开放阅读框中引入一个或多个终止密码子。

根据本发明，突变可以通过本领域技术人员已知的任何手段进行，例如，通过改变基因的结构，从而影响一至几个核苷酸。它可以是取代突变，即至少一个核苷酸被另一个核苷酸替换；或插入突变，即一个或多个核苷酸的添加；或缺失突变，即一个或多个核苷酸的损失；或反转突变，即2个相邻脱氧核糖核苷酸的交换。在任何情况下，为了进行表达，突变是被一个或多个核苷酸取代，产生编码与初始核苷酸所提供的氨基酸不同的氨基酸的密码子，否则该突变被称为是沉默的。在任何情况下，突变可导致基因不被转录和/或翻译。

根据本发明，短语“不被转录和/或翻译”意指在所有对应的基因或ORF处都不存在转录和/或翻译。

根据本发明，截短可以是基因的任何部分的缺失，可以通过本领域技术人员已知的任何手段进行，例如通过在至少一个基因中插入无义点突变，即DNA序列中产生提前终止密码子以及截短的、不完全的和任选的非功能性蛋白质产物的点突变。优选地，MGF 505-1R基因开始处的起始密码子ATG和MGF 505-4R基因结束处的终止密码子被保留，因此不是截短部分的一部分。在这种情况下，MGF 505-1R和505-4R基因的这两个部分形成2个较短的蛋白1R和4R。

在实施方案中，其中：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已缺失，

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已缺失，并且

·基因MGF 505-1R和505-4R被截短，其中MGF 505-1R基因开始处的起始密码子ATG和MGF 505-4R基因结束处的终止密码子被保留；

·与Georgia 2007/1株的基因组(FR682468.2)相比，缺失了7458个核苷酸。在该实施方案中，MGF基因的核苷酸序列是SEQ ID NO:1。所缺失区域的7458个核苷酸序列表示为SEQ ID NO:2，并且Georgia株2007/1的MGF基因核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明的减毒ASF病毒可通过定向诱变，例如通过同源重组或CRISPR-Cas9获得。另选地，本发明的减毒ASF病毒可通过如下所述的强毒ASFV病毒株的热减毒获得。因此，本发明的另一个目的是用于获得本发明的减毒ASF病毒的体外方法，该方法包括以下步骤：

·使基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R缺失、中断或突变，使得这些基因不被转录和/或翻译，

·使ASFV_G_ACD_00520的ORF缺失、中断或突变，因此该基因不被转录和/或翻译，

·与对应的非减毒病毒的基因组相比，将基因MGF 505-1R和505-4R截短。

显然，在定向诱变过程中实施的任何经典步骤都可以作为本发明方法的一部分例如PCR、克隆、序列分析和扩增进行。为此，它可以是如O'Donnell V等人(([1]))或Rathakrishnan A等人(Production of Recombinant African Swine Fever Viruses:Speeding Up the Process，Viruses，2020年6月5日，第12卷第6期：第615页([8]))所述的过程。

优选地，如上已经描述的：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已缺失，并且

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已缺失。

另选地：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已中断，使得这些基因不被转录和/或翻译，

ASFV_G_ACD_00520的ORF已中断，使得该基因不被转录和/或翻译。

本发明的另外一个目的是提供用于获得本发明的减毒ASF病毒的体外方法，该方法包括以下中的至少一个步骤：选自Georgia 2007/1、Pig/HLJ/2018、基因型II的ASF病毒株或基因相近的ASF病毒株的强毒ASFV病毒株的热减毒，以及扩增和选择所述减毒ASF病毒。

有利地，热减毒可以在一个或多个步骤中实现，并因此是连续或不连续的过程。取决于热减毒的每个步骤的持续时间，可使强毒ASFV病毒株经受处于55℃至65℃之间的温度范围。本领域的技术人员根据其常识并通过序列分析验证本发明病毒的获得，将能够根据热灭活的持续时间改变温度。

扩增和选择的步骤可以通过本技术领域的技术人员通常使用的方法实现，例如通过接种无特定病原体的猪(被称为高度易受感染影响)以扩增减毒病毒，并进行序列分析以选择它。

如上所述，无论本发明的病毒是通过定向诱变还是通过热灭活获得，它都不含任何报道基因。这是优于现有技术的减毒病毒的一个优点，现有技术的减毒病毒含有这种报道基因，特别是赋予疫苗或药物组合物GMO状态的GUS或p72-cherry。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的减毒ASF病毒的疫苗。

如本文所用，术语“疫苗”是指当施用于受试者时在已递送疫苗的动物中诱导或刺激保护性免疫应答的制剂。疫苗可使得生物体对特定疾病(在这种情况下为ASF)免疫。因此，本发明的疫苗在受试者中诱导免疫应答，保护其免受随后的ASF病毒攻击。因此，该疫苗可用于预防接种动物的非洲猪瘟。术语“预防”旨在是指避免、延迟、阻止或阻碍ASF的感染。疫苗可例如预防或降低感染性ASFV进入细胞的可能性、疾病的临床症状的发生和死亡率。在一个实施方案中，疫苗可包含所述减毒ASF病毒的不同毒株。这种疫苗能够诱导针对多种ASF病毒株的交叉保护性免疫应答。

本发明的疫苗可以是药物组合物的形式。

本发明的疫苗或药物组合物可包含本发明的减毒ASF病毒和任选的通常用于本发明领域的一种或多种助剂、赋形剂、载体和稀释剂。

载体可包括稳定剂、防腐剂和缓冲剂。合适的稳定剂为例如SPGA(蔗糖、磷酸盐、谷氨酸盐和人白蛋白)、碳水化合物(诸如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、谷氨酸盐或葡萄糖)、蛋白质(诸如乳清粉、白蛋白或酪蛋白)或它们的降解产物。合适的缓冲剂为例如碱金属磷酸盐。合适的防腐剂为乙基汞硫代水杨酸钠、硫柳汞和庆大霉素。稀释剂包括水、水性缓冲液(诸如缓冲盐水)、醇和多元醇(诸如甘油)。

优选地，作为医药产品的本发明的组合物还可包含免疫助剂；这些助剂可以是本领域技术人员已知的任何类型，只要当它们与有效量的根据本发明的减毒活ASFV混合时，它们使得该组合物的抗原能力增加并促进更强的免疫反应。

根据本发明的疫苗或药物组合物可通过常规方法，诸如通常用于可商购获得的活减毒病毒疫苗的那些方法制备。简言之，将易感底物接种本发明的ASF病毒并增殖直至该病毒已复制到期望的滴度，然后收获含病毒材料。随后，将所收获的材料配制成具有免疫特性的药物制剂。

在另一方面，本发明提供了根据本发明的减毒ASF病毒或根据本发明的疫苗，用于在受试者中预防非洲猪瘟。

有利地，本发明的减毒ASF病毒或疫苗可在受试者中诱导对抗强毒ASFV病毒株Georgia 2007/1或对抗其他基因相近的ASF病毒株的保护性免疫应答。

优选地，疫苗或减毒ASF病毒可作为单剂量施用，对应于初免方案。另选地，本发明的疫苗可作为几个剂量施用。

本发明的疫苗可通过任何方便的途径施用，特别是通过选自口鼻途径和肠胃外途径的途径，特别是肌内途径施用。在一个实施方案中，口服施用包括将疫苗添加到动物饲料或饮用水中。在另一个实施方案中，可以将疫苗添加到野生动物的饵料，例如适用于野猪、野生猪、南非野猪或疣猪的饵料中。优选地，施用是通过口鼻途径的初免施用。

本发明还提供了一种用于在受试者中预防非洲猪瘟的方法，该方法包括将有效量的减毒ASF病毒施用于对其有需要的受试者的步骤。

在另一个方面，本发明提供了用于在样本中差分检测本发明的减毒ASF病毒和对应的非减毒ASF病毒的体外方法，该方法包括通过分子方法诸如PCR利用特定于每种毒株的引物/探针组进行核酸链的差分扩增，其中以下序列的引物/探针：

Del_Fow TGCTTTCAAGCCTACAACTCC(SEQ ID NO:4)、

Del_Rev ATTCTCAGGGCCTCATTGGT(SEQ ID NO:5)和

Del_Probe AGCGATCCTTTGGCTGCCACC(SEQ ID NO:6)允许减毒ASF病毒的特异性扩增，而以下序列的引物/探针：

505_3R_L1 TGGCAAGATCATGGTTCCCT(SEQ ID NO:7)、

505_3R_R1 ATCTGCCTCCCATGACAACA(SEQ ID NO:8)和

505_3R_P1 CCCTTCCGATGCTGCTACTTTGAGTGC(SEQ ID NO:9)允许对应的非减毒ASF病毒的特异性扩增。

差分扩增可以在本技术领域通常使用的实验条件下实现。

有利地，本发明的方法允许将被非减毒ASF病毒感染的动物与接种本发明的减毒ASF病毒的动物区分开来。

该方法中使用的动物的样本可以是可在其中检测到病毒的任何样本，例如血液样本或组织样本，诸如脾、扁桃体或淋巴结。

本发明的另一个目的是提供可将接种动物与感染由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的至少一条序列组成的非减毒ASF病毒的动物区分开来的遗传标记。

本发明通过以下实施例参照附图进一步说明，这些附图不应被解释为限制性的。

附图说明

—图1：表示缺失位点处的Georgia 2007/1和ASFV-989基因组的比较。

—图2：表示Georgia 2007/1和ASFV-989株在猪肺泡巨噬细胞中的病毒复制(滴度表示为Log10 HAD50/mL，时间表示为接种后的天数)。

—图3：表示用于检测Georgia 2007/1株的PCR 505(L1、P1和R1)和检测ASFV-989的PCR 989(Del_Fow、Del_probe和Del_Rev)的引物和探针的位置。

—图4：表示用Georgia或ASFV-989株IM免疫后直肠温度(℃)的变化(时间以免疫后的天数表示)。对照：来自组A1的数据；989IM：来自组C和D的数据；Geo IM：来自组E的数据。

—图5：表示用Georgia或ASFV-989株IM接种(时间以接种后的天数表示)后的猪存活率(％)。对照：来自组A1的数据；989IM：来自组C和D的数据；Geo IM：来自组E的数据。

—图6表示用Georgia或ASFV-989株IM接种后生长性能的变化。接种后平均日增重(Kg/D)。对照：来自组A1和A2的数据；989IM：来自组C和D的数据；Geo IM：来自组E的数据。

—图7表示用Georgia或ASFV-989株ON免疫后直肠温度(℃)随天数的变化。对照：来自组A1的数据；989ON：来自组B、H和I的数据；Geo ON：来自组F的数据。

—图8：表示用Georgia或ASFV-989株ON接种后随天数的猪存活率(％)。对照：来自组A1的数据；989ON：来自组B、H和I的数据；Geo ON：来自组F的数据。

—图9表示用Georgia或ASFV-989株ON接种后生长性能(平均日增重(Kg/D))的变化。对照：来自组A1和A2的数据；989ON：来自组B、H和I的数据；Geo ON：来自组F的数据。

—图10表示在用Georgia或ASFV-989株接种后ASFV病毒血症(Log10eq HAD50/mL)的变化(接种后的天数)。Geo IM：来自组E和F的数据；GeoON：来自组F和J的数据；989IM：来自组C和D的数据；989ON：来自组B、H和I的数据。

—图11表示在用ASFV-989株接种后ASFV病毒血症(PCR 989，Log10eq HAD50/mL)的变化(天数)。989IM：来自组C和D的数据；989ON：来自组B、H和I的数据。

—图12表示用Georgia或ASFV-989株接种后(接种后天数)的抗体应答(通过ELISA检测，竞争％)。989IM：来自组C的数据；989ON：来自组B的数据；Geo IM：来自组E的数据；GeoON：来自组F的数据。

—图13表示在用ASFV-989株接种后(接种后天数)的特异性细胞介导的应答(IFNg分泌细胞的数量/10⁶PBMC)。989IM：来自组C和D的数据；989ON：来自组B、H和I的数据。

—图14表示用Georgia ASFV株IM攻击后(攻击后天数)直肠温度(℃)的变化。对照：来自组A2的数据；989IM/Geo IM：来自组D的数据；989ON/GeoIM：来自组I的数据；GeoIM：来自组G的数据。

—图15表示用Georgia ASFV株ON攻击后(攻击后天数)直肠温度(℃)的变化。对照：来自组A2的数据；989ON/Geo ON：来自组H的数据；GeoON：来自组J的数据。

—图16表示在用Georgia ASFV株攻击后(攻击后天数)生长性能(平均日增重(Kg/D))的变化。对照：来自组A1和A2的数据；989IM/Geo IM：来自组D的数据；989ON/Geo ON：来自组H的数据；989ON/Geo IM：来自组I的数据；Geo IM：来自组G的数据；Geo ON：来自组J的数据。

—图17表示在用ASFV-989株IM或ON接种后和通过相同途径用Georgia ASFV株攻击2周后直肠温度(℃)随天数的变化。对照：来自组A3的数据；989ON/Geo ON-14：来自组L的数据；989IM/Geo IM-14：来自组K的数据。

—图18表示在用ASFV-989株IM或ON接种后和通过相同途径用Georgia ASFV株攻击2周后生长性能(平均日增重(Kg/D))的变化。对照：来自组A3的数据；989ON/Geo ON-14：来自组L的数据；989IM/Geo IM-14：来自组K的数据。

—图19表示在用ASFV-989株IM或ON接种后和通过相同途径用Georgia ASFV株攻击2周后ASFV病毒血症(PCR 989，Log10 eq HAD50/mL)随天数的变化。989 ON/Geo ON-14：来自组L的数据；989 IM/Geo IM-14：来自组K的数据。

具体实施方式

实施例

实施例1：ASFV-989株的制备和体内表征

1.材料和方法

1.1病毒和细胞

最初在2007年从原产于格鲁吉亚的家猪分离出的Georgia 2007/1 ASFV株由Linda Dixon博士(OIEreference laboratory，Pirbright Institute，UK)友情提供。PPA/dp/FR-22/2018/180172-2 ASFV株此后被命名为ASFV-989(或“989”)，是从用热减毒的ASFVGeorgia 2007/1株接种的无特定病原体(SPF)猪上收集的血液样本中分离的。将Georgia2007/1和ASFV-989株在猪肺泡巨噬细胞(PAM)上分别培养3代和1代，然后接种到猪中。将病毒在RPMI培养基中稀释以将接种剂量调节至对于肌内(IM)接种每只猪10³红细胞吸附剂量50％(HAD₅₀)和对于口鼻(ON)接种每只猪10⁴HAD₅₀。通过红细胞吸附测定进行病毒滴定(Carrascosa,A.L.等人，Methodsfor growing and titrating African swinefevervirus:field and laboratory samples，Curr Protoc Cell Biol，2011年，第26章第26 14单元([9]))。

1.2全基因组测序

用高纯度PCR模板制备试剂盒(Roche Diagnostics，Meylan，France)从ASFV-989株中提取DNA。对于文库制备，使用Ion Xpress Plus片段文库试剂盒(Thermo FischerScientific，Frederick，Maryland，USA)，并用Ion Xpress条形码接头1-96试剂盒(ThermoFischer Scientific，Frederick，Maryland，USA)对250bp至290bp之间的DNA片段进行大小选择。对于DNA纯化步骤，使用来自Agencourt AMPure XP试剂盒(Beckman Coulter，Villepinte，France)的磁珠。采用Proton Ion Torrent技术(Thermofischer Scientific，Frederick，Maryland，USA)对所有样本进行测序。用Trimmomatic(Bolger,A.M.、M.Lohse和B.Usadel，Trimmomatic:a flexible trimmer for Illumina sequence data，Bioinformatics，2014年，第30卷第15期：第2114-2120页([10]))0.36软件清洁读段(ILLUMINACLIP:oligos.fasta:2:30:5:1:true；LEADING:3；TRAILING:3；MAXINFO:40:0.2；MINLEN:36)。然后用经清洁的读段对比NCBI参考FR682468.2进行bwa(Li,H.和R.Durbin，Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform，Bioinformatics，2009年，第25卷第14期：第1754-1760页([11]))(2.2.5版)比对。共有序列是用samtools(Li,H.等人，The Sequence Alignment/Map format and SAMtools，Bioinformatics，2009年，第25卷第16期：第2078-2079页([12]))(1.8版)和seqtk(1.2版)(https://qithub.com/lh3/seqtk)创建的。

1.2体内研究

六十五只6周龄的无特定病原体(SPF)大白猪用于表1中所述的三个试验中。如Lacasta and al(Lacasta等人：“Expression library immunization can conferprotection against lethal challenge with African swine fever virus”，J Virol，2014年11月；第88卷第22期：第13322-13332页)所报道的，我们的SPF猪对ASFV感染特别敏感，并且可表达在农场猪中显示为减毒的ASFV株的临床征象。这种敏感性可能与它们的PRR的低多态性和它们的先天免疫系统的低刺激/成熟有关。在试验#1和试验#2中，在DO时通过肌内(IM)途径或口鼻(ON)途径用ASFV-989或Georgia株接种各组猪。在用ASFV-989株接种(免疫)的组中，两组未受到攻击(989ON和989IM长期：LT)，而其他组在接种ASFV-989 28天后用Georgia株攻击。对照猪(未免疫、未攻击)也包括在每个试验中。在试验#3中，为了评价由于ASFV-989接种诱导的保护作用的开始，在免疫14天后用Georgia株攻击猪，并且通过与第一次接种相同的途径(IM或ON)进行攻击。

表1：用于体内研究的实验设计

ON：口鼻；IM：肌内；LT：长期；种菌：989 ON/5Georgia ON：10⁴HAD50/猪-989 IM/Georgia IM：10³HAD50/猪

单独鉴定猪，将每组猪圈养在位于Anses Ploufragan的3级生物安全性空气过滤动物设施中的独立房间中。每天监测所有猪的直肠温度和ASFV感染的临床征象，并且每周对它们称重一次。在接种或攻击前收集血液样本，然后在接种/攻击后的最初2周内每周收集两次，最后在剩余的随访期间每周收集一次。将血液收集在盛有用于ELISPOT IFNg和病毒分离的肝素锂、用于ASFV基因组检测的EDTA的试管中，并收集在干燥试管中以获得用于抗体检测的血清。在实验结束时，或在出于动物福利原因的更早期阶段，通过过量麻醉剂处死猪，然后放血。

伦理声明

动物实验由法国研究部资助(项目号2019030418445731)并由国家伦理委员会批准(授权号19-018#19585)。

病毒学和免疫学测定

实时PCR：如先前所述(Tignon,M.等人，Development and inter-laboratoryvalidation study of an improved new real-time PCR assay with internal controlfor detection and laboratory diagnosis of African swine fever virus，J VirolMethods，2011年，第178卷第1-2期：第161-170页([13])，使用8病毒(Macherey-Nagel)，使用从100pL EDTA血液样本中提取的DNA，通过实时PCR进行接种后第一周内ASFV病毒血症的评估(图10)。猪β-肌动蛋白用作从猪样本中提取DNA的内参。根据结果部分中描述的方法，分别用PCR 989和PCR 505进行ASFV-989病毒血症的长期随访(图11)和受到免疫然后攻击的猪中ASFV-989或Georgia基因组的特异性检测(表2、表3和表4)。

ELISA：根据制造商的说明书使用竞争ELISA试剂盒(ID Screen ASFV竞争试剂盒，IDVET，France)测量血清中对抗ASFV的蛋白P32的抗体。

ELISPOT：如先前所述(King,K.等人，Protection of European domestic pigsfrom virulent African isolates of African swine fever virus by experimentalimmunisation，Vaccine，2011年，第29卷第28期：第4593-4600页([14]))，对于Georgia株，使用4×10⁵个PBMC的16h ASFV刺激，以0.2的感染倍数来定量ASFV特异性IFNg分泌细胞(IFNg-SC)。使用ImmunoSpot S6 UV分析仪(CTL，Shaker Heights，OH，USA)对每孔的斑点数量计数。

2.结果

2.1基因组序列和体外表征

+ASFV-989株的全基因组序列

ASFV-989株是从用热减毒的ASFV Georgia株接种的SPF猪(989号猪)上收集的血液样本中分离的。将ASFV-989株在PAM上进一步扩增一次，并进行全基因组测序。ASFV-989和Georgia全基因组序列(FR682468.2)的比较显示，对于ASFV-989株，7458个核苷酸的缺失(在核苷酸位置29439和36898之间)对应于MGF 505-1R和505-4R的部分缺失和MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R和ASFV_G_ACD_00520的完全缺失。图1

+ASFV-989和Georgia株的体外复制

为了表征ASFV-989株与其亲本毒株Georgia相比的体外复制，用两种毒株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)并跟踪4天内的复制动力学。如图2所描绘的，ASFV-989和Georgia株的复制动力学是相似的，并且病毒滴度从接种后DO至D2增加，随后从D2至D4处于平台期。

+特异性PCR系统的设计以检测ASFV-989和Georgia株

为了具有能够特异性地检测生物样本中的ASFV-989或Georgia株的PCR工具，我们为这些毒株中的每一种毒株设计了PCR系统。PCR 505靶向Georgia株的MGF 505-3R基因，其中引物和探针序列如下：505_3R_L1TGGCAAGATCATGGTTCCCT(SEQ ID NO:7)、505_3R_R1ATCTGCCTCCCATGACAACA(SEQ ID NO:8)和505_3R_P1CCCTTCCGATGCTGCTACTTTGAGTGC(SEQID NO:9)。PCR 989靶向由于MGF 505-1R的近端部分和MGF 505-4R的远端部分融合产生的989株的嵌合基因(图3)。用于PCR 989的引物和探针序列如下：Del_FowTGCTTTCAAGCCTACAACTCC(SEQ ID NO:4)、Del_Rev ATTCTCAGGGCCTCATTGGT(SEQ ID NO:5)和Del_Probe AGCGATCCTTTGGCTGCCACC(SEQ ID NO:6)。

首先，我们证实PCR 505可检测Georgia株但不检测ASFV-989株，并且PCR 989可检测ASFV-989株但不检测Georgia株。使用标准范围的ASFV-989或Georgia株，我们确定了每种PCR的PCR功效、线性和定量限。两种PCR都呈现出高于90％的功效，非常好的线性(对于五种稀释液，R²高于0.99)，并且定量限为10E3.8当量HAD₅₀/mL。

2.2与Georgia株相比，毒力和对ASFV-989株接种的免疫应答的体内表征

为了表征在用ASFV-989株接种的猪中诱导的毒力水平和免疫应答，我们进行了三个体内试验，在该三个试验期间我们通过肌内(IM)或口鼻(ON)途径用ASFV-989或Georgia株接种猪。(表1)

在第一步中，我们比较了通过ON或IM途径用ASFV-989株接种的猪与通过相同途径接受强毒Georgia株的猪的临床、病毒学和免疫学参数。为了增加每种条件下猪的数量，编译了来自不同实验组的数据。每幅图中均提及对应于每种条件的实验组。

+临床和畜牧学数据

—肌内接种：

在IM接种Georgia株后，感染的猪(Geo IM：组E)在接种后D3(PI)时表现出首次过高热，然后它们在2天后显示出过高热峰值(在D5 PI时为41.0℃±0.3℃，图4)并出现典型的ASF相关症状。它们必须在D6 PI时被安乐死(图5)。

肌内用ASFV-989株接种的猪(989IM：组C和组D)在D3 PI时也显示出首次过高热，但出现较低的过高热(在D5 PI时为40.2℃±0.6℃，图4)和有限的症状。

在用ASFV-989株IM接种的11只猪中，仅有两只动物在ASFV-989接种后的前2周内出现ASF相关症状，并且不得不被安乐死(图5)。接种IM 989的猪的直肠温度的升高伴随着接种后2周内生长性能的降低(图6)：平均日增重(ADWG)处于D0/D7 PI：0.36kg/D±0.12kg/D(对于989IM来说)对比0.64kg/D±0.10kg/D(对于对照来说)之间，以及ADWG处于D7/D14PI：0.41kg/D±0.24kg/D(对于989IM来说)对比0.69kg/D±0.16kg/D(对于对照来说)之间。

—口鼻接种：

在ON接种Georgia株之后，猪(Geo ON：组F)表现出与IM接种相同的严重症状，并且在D4 PI时出现过高热峰值(41.0℃±0.4℃)(图7)。所有猪另外必须在D6 PI时被安乐死(图8)。在另一个方面，用ASFV-989株ON接种的猪(989ON：组B、H和I)出现低烧(在D6 PI时为40.6℃±0.5℃)(图7)、有限的症状，并且所有猪在感染后均存活(图8)。用ASFV-989株ON接种的猪也表现出生长性能下降(ADWG处于D0/D7 PI：0.27kg/D±0.11kg/D(对于989ON来说)对比0.64kg/D±0.10kg/D(对于对照来说)之间)，但仅在接种后第一周内(图9)。

+病毒学数据

为了进一步表征ASFV-989株的减毒性质，然后我们评价了在感染的第一周内通过IM或ON途径接种ASFV-989株的猪的病毒血症水平与接种Georgia的猪的病毒血症水平的比较。如图10所描绘的，接种ASFV-989株的病毒血症水平显著低于接种Georgia株的病毒血症水平，并且ASFV-989株的病毒载量也低100倍。对于用Georgia株IM接种的猪，在D5 PI时的ASFV病毒血症为8.5Iog10 eq HAD₅₀/mL±0.2Iog10 eq HAD₅₀/mL，但对于通过相同途径用ASFV-989株接种的动物仅为5.9Iog10 eq HAD₅₀/mL±0.3Iog10 eq HAD₅₀/mL。有趣的是，通过ON途径用ASFV-989株接种的猪表现出比通过IM接种的猪更低的病毒血症(在D5 PI时，对于ON途径为4.7Iog10 eq HAD₅₀/mL±1.6Iog10 eq HAD₅₀/mL，对于IM接种途径为5.9Iog10eq HAD₅₀/mL±0.3Iog10 eq HAD₅₀/mL)。

为了更精确地描述用ASFV-989株(IM或ON)接种的猪的ASFV病毒血症特征，我们用989PCR跟踪用ASFV-989株接种的组B和C的动物的病毒血症长达100天。图11中示出的数据证实了通过ON接种途径的病毒血症的水平更低(在D7 PI时：IM途径为6.2Iog10 eq HAD₅₀/mL±0.3Iog10 eq HAD₅₀/mL对比ON途径为5.5Iog10 eq HAD₅₀/mL±0.4Iog10 eq HAD₅₀/mL)，并且ON接种途径的病毒血症消失更早(在D76 PI时：ON途径为0/4只猪患有病毒血症对比IM途径为3/4只猪仍患有病毒血症)。

+ASFV特异性免疫应答

—抗体应答

在接种Georgia株后，受感染的猪在它们必须被安乐死之前未产生ASF特异性抗体。对于接种ASFV-989株的猪，ON或IM两种途径接种的猪都产生ASF特异性抗体，并且在D7和D11 PI之间发生血清转化(图12)。

—细胞介导的应答

在用ASFV-989株IM或ON接种的猪中，通过ELISPOT IFNg评价特定于ASFV的细胞介导的免疫(CMI)应答。在D13 PI时就检测到特定于ASFV病毒的CMI应答，并在D27 PI时证实了这种应答(图13)。与IM组(在D27 PI时为35IFNg SC/10E6 PBMC±23IFNg SC/10E6 PBMC)相比，ON组(在D27 PI时为122IFNg SC/10E6 PBMC±67IFNg SC/10E6 PBMC)的CMI应答水平似乎更强。

2.3ASFV-989株免疫对4周后发生的Georgia株攻击的保护作用

在已经表征由于ASFV-989株接种诱导的免疫应答之后，我们评价了免疫的猪是否可以受到保护以免受在免疫后1个月发生的用强毒Georgia株进行的ASFV攻击(表1)。

+临床和畜牧学数据

如先前所示，通过ON或IM途径的Georgia株攻击在未免疫的猪中诱导快速的过高热(图14和图15)，并伴有严重的症状，这强加给猪(组G和J)仁爱安乐死。相反，用ASFV-989株免疫的猪在用Georgia攻击后都未出现过高热或ASF相关症状，并且在用Georgia攻击后所有猪都存活下来(组D、H和I)。

在生长性能方面，与未免疫的动物相比，Georgia攻击对ASFV-989免疫的猪没有影响，而未免疫的动物表现出平均日增重的快速下降(图16)。

+病毒学数据

已经确定用ASFV-989株免疫的猪从临床的角度来看完全免于受到Georgia攻击，然后我们在病毒学水平上评估了ASFV-989免疫的效果。使用PCR 505(检测Georgia株)和PCR 989(检测ASFV-989株)两者，我们评价了用Georgia株攻击的猪(先前用或不用ASFV-989免疫)中的Georgia和ASFV-989病毒血症。

如表2和表3所示，两组未免疫的猪在攻击后都表现出Georgia病毒血症的快速增加(在D5 PC时：对于Georgia IM为8.9Iog10 eq HAD50/mL±0.2Iog10eq HAD50/mL，并且对于Georgia ON为9.0Iog10 eq HAD50/mL±0.4Iog10 eq HAD50/mL)。相反，在任一只ASFV-989免疫的猪的血液中均未检测到Georgia基因组，无论免疫途径或攻击途径如何。如先前所示，PCR 989结果证实在免疫后至少3周内可检测到ASFV-989病毒血症。

/>

在尸检时收集的组织样本上，在通过IM途径攻击的任一只ASFV-989 IM免疫的猪中均未检测到Georgia基因组(表4)。在通过ON途径用ASFV-989株免疫的猪中，在12只猪中的4只猪(组H中的2只和组I中的2只)的组织(扁桃体、脾脏或肝-胃淋巴结)中检测到Georgia基因组。

表4：在用Georgia株攻击后，免疫或未免疫的猪的组织中Georgia ASFV基因组的 检测

ND：未检出；数值：PCR 505的Ct值。组织在D40 PC时进行的尸检期间收集

2.4ASFV-989株接种对2周后发生的Georgia株攻击的保护作用

已经证明ASFV-989接种能够诱导对4周后发生的Georgia攻击的强保护作用，然后我们怀疑是否在免疫2周后就能获得相同的保护作用。因此通过IM或ON途径用ASFV-989株接种两组猪，然后在2周后通过相同的途径用Georgia株攻击(表1，组K和L)。

如在试验#1和#2中所见，用ASFV-989株接种猪诱导了在接种后第3天开始并且持续约1周的时间段的过高热(图17)。这种过高热伴随着在1至2周内生长性能的降低(图18)。在肌内接种ASFV-989株的猪中，一只动物出现亚急性形式的ASF(体重减轻、颤抖和共济失调)并在接种后D12时死亡。

在免疫14天后用Georgia攻击后，对于任一只ASFV-989免疫的猪均未记录到症状、过高热以及对生长性能的影响(图17和图18)。

从病毒学的角度来看，在ASFV-989接种后，所有猪都表现出减毒株的可检测病毒血症，与ON接种的猪相比，在IM接种的猪中更快地并且以稍微更高的水平检测到该病毒血症(图19)。在Georgia攻击后，所有免疫的猪都完全免于受到攻击株的影响，因为在免疫的猪的血液中(表5)或组织中(表6)未检测到Georgia株的基因组(PCR 505)。

表6：在免疫14天后用Georgia株攻击的免疫猪的组织中ASFV-989和Georgia ASFV 基因组的检测

参考文献列表

1.O'Donnell et al.:“African Swine Fever Virus Georgia IsolateHarboring Deletions of MGF360 and MGF505 Genes Is Attenuated in Swine andConfers Protection against Challenge with Virulent Parental Virus”,JVirol.2015 Jun；89(11):6048-56。

2.US20160130562

3.Xuexia Wen et al.(2019)Genome sequences derived from pig and driedblood pig feed samples provide important insights into the transmission ofAfrican swine fever virus in China in 2018,Emerging Microbes&Infections,8:1,303-306。

4.Bao,J et al.Genome comparison of African swine fever virus China/2018/AnhuiXCGQ strain and related European p72 Genotype II strains.TransboundEmerg Dis.2019；66:1167-1176。

5.Mazur-Panasiuk N.et al.The first complete genomic sequences ofAfrican swine fever virus isolated in Poland.Sci Rep 9,4556(2019)。

6.Forth JH et al.Comparative Analysis of Whole-Genome Sequence ofAfrican Swine Fever Virus Belgium 2018/1.Emerg Infect Dis.2019 Jun；25(6):1249-1252。

7.Kovalenko,G.et al.Complete Genome Sequence of a Virulent AfricanSwine Fever Virus from a Domestic Pig in Ukraine.Microbiology resourceannouncements 2019,8。

8.Rathakrishnan A et al.Production of Recombinant African Swine FeverViruses:Speeding Up the Process.Viruses.2020 Jun 5；12(6):615。

9.Carrascosa,A.L.et al.Methods for growing and titrating Africanswine fever virus:field and laboratory samples.Curr Protoc Cell Biol,2011.Chapter 26:p.Unit 26 14。

10.Bolger,A.M.,M.Lohse,and B.Usadel,Trimmomatic:a flexible trimmerfor Illumina sequence data.Bioinformatics,2014.30(15):p.2114-20。

11.Li,H.and R.Durbin,Fast and accurate short read alignment withBurrows-Wheeler transform.Bioinformatics,2009.25(14):p.1754-60。

12.Li,H.,et al.,The Sequence Alignment/Map format andSAMtools.Bioinformatics,2009.25(16):p.2078-9。

13.Tignon,M.,et al.,Development and inter-laboratory validation studyof animproved new real-time PCR assay with internal control for detection andlaboratorydiagnosis of African swine fever virus.J Virol Methods,2011.178(1-2):p.161-70。

14.King,K.,et al.,Protection of European domestic pigs from virulentAfricanisolates of African swine fever virus by experimentalimmunisation.Vaccine,2011.29(28):p.4593-600。

15.Lacasta et al.:“Expression library immunization can conferprotectionagainst lethal challenge with African swine fever virus”,J Virol2014,Nov；88(22):13322-32。

序列表

<110> 国家食品安全环境及劳工局

<120> 减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的用途

<130> BNT229559PC00

<160> 9

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 2126

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒

<400> 1

atgttctctc tccagaactt atgtcgaaaa acattaccta accgtaaact tcctgaattt 60

tttgacgaat atatattaca actgctggga ttatactggg aaaaccatgg aactattcaa 120

cgagcaggaa acaactgtgt gcttatacag caacataccc tcattcccgt aaatgaagcc 180

ctgagaacag cagcatctga agaaaattat gagatcgtga gccttttatt agcgtgggag 240

gggaaccttt actatgctat tataggggct ctagagggca accgccacga cttaattcgt 300

aaatatgatg accaaatcaa ggaccatcat gaaattctgc cattcattga cgatccagtc 360

atatttcaca aatgccatat catgcggcaa tgcttttttg attgtatttt atatcaagct 420

gtaaaatata gtaagtttcg cgttcttctt tactttaaac atagattaga ggatgatttg 480

cccttcactc atttacttat tgaaaaggca tgtaaagatc ataattatga agttattaaa 540

tggatatatg aaaacctaca tatctacaat atgatagata cctttgaatg tgctattgcc 600

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gcagccaaag gatcgctgtg tttgtacagc gaaacatcgt cctttctacc aatgaggccc 780

tgagaatcgc agcctcagag ggaaacgaaa gggtaataaa acttctgtta tcatgggagg 840

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<213> 非洲猪瘟病毒

<400> 2

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ttctgttatc atgggaggga aattttcatt atgtgatcat aggagctcta gagggtgacc 8340

aatatgacct aattcataag tatgatagtc aaattaaaga ctaccacatg attttatcat 8400

tgatccaaaa tgcaaatacc tttgaaaagt gtcatcagtt atccaatagt aatatgtggt 8460

gtcttataca gaatgctata aaatataata tgctccctat tctccaaaaa cacagaaata 8520

ttctgacaca tgagggagag aatcaggaat tgtttgagat ggcatgtgag gaacagaaat 8580

atgacatagt tttatggata ggacaaaccc taatgttaaa tgagccggag tttatttttg 8640

atatcgcctt cgaacggata gatttttctt tattaacaat gggttatagc cttctttttg 8700

ataacaagat gagtagtata gacattcatg atgaagaaga tcttacttca ttaccaacag 8760

aacacctcga aaaagcagcc actaagggat gtttcttctt tatgctagaa actttaaaac 8820

atggtggaaa tgtaaatatg gcagtcttat ctaaagctgt tgagtataat catagaaaaa 8880

ttttagacca ttttattcgg cggcaaaaat gtttatcacg tgaagagatt gaaaacctat 8940

tattaaccgc cataaccaat tgtgcatcca taaaaacgtt aaacttactc ttgtcttacc 9000

taaactattc cgtaaaaaat atcattggaa aaatagtaca acatgtcata aaagatggtg 9060

attataccat catattactt ttaaaaaaaa agaaaataaa cctagtggaa cctgttttaa 9120

caggttttat agattattac tatagctatt gttttataaa acattttatc caagagtttg 9180

ctattcgtcc ggaaaaactg attaaaatgg ccgcgcgaaa aggtaaacta aatatgatta 9240

tcgaattcct taacgaaaaa tatgttcata aagatgatct tggaactata tttaaatatc 9300

tcaaaaccct agtatgtacc atgaaacata aaaaaggaaa agagacatta attgttctta 9360

ttcataaaat atatcaagat attcatctgg agactaaaga aaaatttaaa ttattaagat 9420

tttatgtcat gcatgatgca actatccaat ttctatctat gtgcaaagac tgttttaatt 9480

tagccggttt taaaccattt gttttagaat gtttggatat tgctattaaa aaaaattacc 9540

ctgatatgat acaatatata gaaattctat cgaaatctga gtaa 9584

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

tgctttcaag cctacaactc c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

attctcaggg cctcattggt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 6

agcgatcctt tggctgccac c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

tggcaagatc atggttccct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

atctgcctcc catgacaaca 20

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 9

cccttccgat gctgctactt tgagtgc 27

Claims (20)

1.一种减毒非洲猪瘟(ASF)病毒，其中：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已缺失或中断或突变，使得所述基因不被转录和/或翻译，

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已缺失或中断或突变，使得所述基因不被转录和/或翻译，并且

·与对应的非减毒病毒的基因组相比，基因MGF 505-1R和505-4R被截短。

2.根据权利要求1所述的减毒ASF病毒，其中在所述截短的基因MGF 505-1R和505-4R中，MGF 505-1R基因开始处的起始密码子ATG和MGF 505-4R基因结束处的终止密码子被保留。

3.根据权利要求1或2所述的减毒ASF病毒，其中：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已缺失，并且

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已缺失。

4.根据任一项前述权利要求所述的减毒ASF病毒，其中：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已中断，使得所述基因不被转录和/或翻译，

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已中断，使得所述基因不被转录和/或翻译。

5.根据任一项前述权利要求所述的减毒ASF病毒，其中所述中断包括所述基因的所述ATG起始密码子的缺失或修饰；或翻译起始位点的修饰；或移码；或在所述基因的所述开放阅读框中引入一个或多个终止密码子。

6.根据任一项前述权利要求所述的减毒ASF病毒，其中所述基因组的其余部分对应于来自选自Georgia 2007/1谱系的强毒ASFV病毒株的基因组，例如Pig/HLJ/2018、ASFV-SY18、China/2018/AnhuiXCGQ、ASFV/POL/2015/Podlaskie、Odintsovo 2/2014、Kashino04/13、ASFV-Belgium2018/1、ASFV/Kyiv/2016/131、基因型II的ASF病毒株或基因相近的ASF病毒株。

7.根据任一项前述权利要求所述的减毒ASF病毒，其中所述基因组的其余部分对应于来自所述强毒ASFV病毒株Georgia 2007/1的所述基因组。

8.根据任一项前述权利要求所述的减毒ASF病毒，所述减毒ASF病毒不含任何报道基因。

9.一种疫苗，所述疫苗包含根据任一项前述权利要求所述的减毒ASF病毒。

10.根据权利要求9所述的疫苗，所述疫苗包含所述减毒ASF病毒的不同毒株。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的减毒ASF病毒，或根据权利要求9至10中任一项所述的疫苗，用于在受试者中预防非洲猪瘟。

12.一种用于根据权利要求11所述的用途的减毒ASF病毒或疫苗，方式为在所述受试者中诱导对抗所述强毒ASFV病毒株Georgia 2007/1或对抗所述Georgia 2007/1谱系中的其他基因相近的ASF病毒株的保护性免疫应答。

13.一种用于根据权利要求11或12所述的用途的减毒ASF病毒或疫苗，其中所述减毒ASF病毒或所述疫苗通过选自口鼻途径和肠胃外途径，特别是肌内途径的途径施用。

14.一种用于根据权利要求11至13所述的用途的减毒ASF病毒或疫苗，其中所述受试者是猪或野猪，并且/或者其中所述疫苗在初免方案后施用。

15.一种用于获得根据权利要求1至8中任一项所述的减毒ASF病毒的体外方法，所述方法包括以下步骤：

·使基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R缺失或中断，使得所述基因不被转录和/或翻译，

·使ASFV_G_ACD_00520的ORF缺失或中断，因此所述基因不被转录和/或翻译，

·与所述对应的非减毒病毒的所述基因组相比，将基因MGF 505-1R和505-4R截短。

16.根据权利要求15所述的方法，其中：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已缺失，并且

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已缺失。

17.根据权利要求15所述的方法，其中：

·基因MGF 360-12L、360-13L、360-14L、505-2R、505-3R已中断，使得所述基因不被转录和/或翻译，

·ASFV_G_ACD_00520的ORF已中断，使得所述基因不被转录和/或翻译。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述中断包括：所述基因的所述ATG起始密码子的缺失或修饰、或翻译起始位点的修饰；或移码；或在所述基因的所述开放阅读框中引入一个或多个终止密码子。

19.一种用于获得根据权利要求1至8中任一项所述的减毒ASF病毒的体外方法，所述方法包括以下中的至少一个步骤：选自Georgia 2007/1、Pig/HLJ/2018、基因型II的ASF病毒株或基因相近的ASF病毒株的强毒ASFV病毒株的热减毒，以及通过接种无特定病原体的猪的扩增和选择所述减毒ASF病毒。

20.一种用于在样本中差分检测根据权利要求1至8中任一项所述的减毒ASF病毒和所述对应的非减毒ASF病毒的体外方法，所述方法包括通过PCR利用特定于每种毒株的引物/探针组进行核酸链的差分扩增，其中以下序列的引物/探针：

Del_Fow TGCTTTCAAGCCTACAACTCC(SEQ ID NO:4)；

Del_Rev ATTCTCAGGGCCTCATTGGT(SEQ ID NO:5)和

Del_Probe AGCGATCCTTTGGCTGCCACC(SEQ ID NO:6)允许所述减毒ASF病毒的特异性扩增，而以下序列的引物/探针：

505_3R_L1 TGGCAAGATCATGGTTCCCT(SEQ ID NO:7)、

505_3R_R1 ATCTGCCTCCCATGACAACA(SEQ ID NO:8)和

505_3R_P1 CCCTTCCGATGCTGCTACTTTGAGTGC(SEQ ID NO:9)允许所述对应的非减毒ASF病毒的特异性扩增。