CN111004330A

CN111004330A - 一种制备非洲猪瘟病毒p30、p54酵母疫苗的方法

Info

Publication number: CN111004330A
Application number: CN201911286530.6A
Authority: CN
Inventors: 黄金海; 张丽琳; 郭艳余; 陈琛
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-04-14

Abstract

本发明公开了一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法。所述疫苗含有非洲猪瘟病毒强免疫原蛋白P30、膜结构蛋白P54、猪IgG1和IgA1的Fc片段即Fcγ、Fcα以及His纯化标签。本发明包括以下步骤：步骤一、将ASFV病毒免疫原蛋白基因p30、p54与Fcγ、Fcα串联；步骤二、分别构建p30‑Fcγ、p54‑Fcα在酵母内融合表达的转录单位；步骤三、经体外酶连、酵母体内转化及同源重组技术，实现2个转录单位串联，并稳定整合入表面展示型酿酒酵母；步骤四、经过基因组水平和蛋白质水平验证，确认获得2种单独表面展示表达P30‑Fcγ、P54‑Fcα融合蛋白的重组酵母菌株，以及1中同时表面展示表达以上两个融合蛋白的串联复合表达型重组酵母菌株。本发明菌株生产技术成熟，适合大规模生产，使用安全，可以诱导靶动物显著的黏膜及体液免疫反应。

Description

一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)引起猪的烈性传染病，急性感染时可引起高达100％的致死率。自1921年在肯尼亚被首次报道以来^[1]，已有数十个国家和地区爆发，我国于2018年8月首次发布非洲猪瘟疫情公告，造成了数十亿元的经济损失，今后也将成为我国猪养殖业的巨大威胁。非洲猪瘟病毒因其基因组大(170-190k bp)，基因型多，对其了解和认知还有很多空白，严重阻碍了有效疫苗的研发。

ASFV关键结构蛋白如P30、P54和P72等，已经确认能够在病毒攻击易感细胞后中和病毒，抑制病毒的依附、复制及内化的过程[2]。因而本发明中筛选了潜在可激发保护性体液免疫及细胞免疫的候选基因p30、p54，有研究证明，针对P72和P54蛋白的抗体能够抑制与病毒附着相关的病毒复制周期的第一步，而抗P30蛋白的抗体抑制与病毒内化相关的第二步^[3]。

免疫球蛋白的Fc段具有活化补体、亲细胞、通过胎盘获取并介导与细菌蛋白结合等生物学活性^[4]。Fc受体属于免疫受体家族成员，广泛表达于各种免疫效应细胞表面。结合特异性抗原的抗体通过其Fc段与细胞表面的Fc受体相互作用，进而激发机体产生各种免疫反应如：吞噬作用、胞吞/胞吐作用、氧化猝发、抗体依赖的细胞毒作用等^[5]。预防感染因子进入人体粘膜表面的疫苗必须诱导粘膜和全身免疫反应，以应对早期感染和病原体扩散。粘膜上皮细胞和固有层内免疫效应细胞之间的密切联系表明，通过粘膜表面输送免疫原是实现粘膜和潜在的系统免疫的理想途径^[6]。Fc受体允许胎儿或新生儿通过胎盘或肠道途径获得母体IgG^[7]。然而，这种受体也能在成人9-12岁时通过粘膜表面转运IgG抗体，并对肠道病原体产生耐药性。Fc受体可以跨黏膜上皮转运IgG，所以利用抗原与IgG Fc片段的融合可能使Fc受体介导抗原跨黏膜屏障转运^[8]，联系起体液免疫与细胞免疫。

酵母表面展示技术(Yeast surface display，YSD)是指外源蛋白通过与细胞壁蛋白融合展示在酵母细胞表面的技术。酿酒酵母表面展示系统作为一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，可以克服真核蛋白在原核细胞表达时活性降低或修饰欠缺的缺点^[9]。酵母展示特别适合于选择抗原结合Fc片段，因为它允许通过缺口修复驱动的同源重组快速组合文库构建，而且能够有效展示与Fcγ受体相互作用的糖基化Fc片段^[10]。

发明内容

本发明的目的是提供一种Fc受体介导表达非洲猪瘟病毒蛋白P30、P54的重组酿酒酵母表面展示疫苗株的制备方法以及疫苗株。

本发明的技术方案包括：

ASFV融合蛋白P30-Fcγ、P54-Fcα，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11。

融合蛋白编码基因的构建包括：将ASFV结构蛋白P30编码基因p30(SEQ ID No.1)与猪免疫球蛋白IgG1的Fc片段编码基因Fcγ(SEQ ID No.2)串联，得到p30-Fcγ。将ASFV结构蛋白P54编码基因p54(SEQ ID No.3)与猪免疫球蛋白IgA1的Fc片段编码基因Fcα(SEQ IDNo.4)串联，得到p54-Fcα。

表达上述蛋白的基因，将ASFV病毒结构蛋白P30编码基因p30与猪免疫球蛋白IgG1的Fc片段编码基因Fcγ串联得到p30-Fcγ编码序列，将非洲猪瘟病毒结构蛋白P54编码基因p54与猪免疫球蛋白IgA1的Fc片段编码基因Fcα连接得到p54-Fcα编码序列，其核苷酸序列分别为：SEQ ID No.5；SEQ ID No.6。

一种载体，其包含所述基因片段。

一种酿酒酵母宿主细胞，其包含所述的载体。

三种非洲猪瘟病毒疫苗株，2株单独表面展示P30-Fcγ、P54-Fcα融合蛋白和1株同时表面展示两种融合蛋白的重组酵母菌株，包括所述融合蛋白中的一种或两种。

制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法，具体包括以下步骤：

(1)猪Fcγ、Fcα片段的PCR扩增：采集猪血液并提取血液外周淋巴细胞的总RNA，通过RT-PCR扩增猪IgG1和IgA 1的Fc片段编码基因即Fcγ、Fcα；

(2)ASFV病毒结构蛋白的筛选与编码基因的合成：参照NCBI人工合成ASFV病毒结构蛋白P30、P54的编码基因p30(GenBank序列号：MK757460.1)与p54(GenBank序列号：MK276918.1)；

(3)猪Fcγ、Fcα片段和ASFV病毒结构蛋白编码基因的串联：应用重叠延伸PCR技术，对ASFV病毒结构蛋白P30、P54的编码基因p30、p54和猪Fcγ、Fcα片段进行串联，扩增出p30-Fcγ、p54-Fcα融合片段；

(4)表达质粒的构建：以PYD1质粒(Addgene货号73447)为模板，扩增包含aga2信号肽和多克隆位点在内的基因片段作为ORF，再与启动子、终止子及POT-RFP载体混进行one-pot反应，制备模块化酿酒酵母表面展示表达载体pGPD-POT-TU^[11]。最后通过BamHI单酶切线性化POT载体，无缝克隆连接p30-Fcγ、p54-Fcα片段至表面展示表达载体pGPD-POT-TU上，转化至E.coli DH5a中，选取阳性克隆进行菌液验证PCR，测序；

(5)重组表达质粒转化酵母细胞：将构建成功的重组表达质粒命名为pGPD-p30-Fcγ-ADH1-POT、pGPD-p54-Fcα-ADH1-POT，分别转化酿酒酵母感受态细胞制备两种单表达菌株，再利用特异性引物扩增出互补的前后缀以串联两个转录单位，共同转化酿酒酵母感受态细胞，制备一种同时表达两种融合蛋白的串联复合表达菌株，最后进行基因组水平及蛋白水平验证。

融合蛋白P30-Fcγ、P54-Fcα在制备非洲猪瘟病毒疫苗中或在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。

本发明有益效果：本发明借助Fc受体联系体液免疫与细胞免疫，制成了Fc受体介导的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗，通过串联复合表达增加表面表达蛋白的数量提高其抗原性，制成一类廉价、安全的口服疫苗，以最大限度地发挥口服疫苗对抗粘膜病原体的潜力，可以同时诱导机体的体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫应答，产生更加全面有效的保护作用。

本发明中所述的Fc受体介导表达非洲猪瘟病毒蛋白P30、P54的重组酿酒酵母表面展示疫苗株在国内尚属首次报道，疫苗的分子设计具有一定的创新性，为非洲猪瘟的防控提供思路与方向。

附图说明

图1：表达质粒pGPD-p30-Fcγ-ADH1-POT和pGPD-p54-Fcα-ADH1-POT的构建过程；A图为非洲猪瘟病毒重组酿酒酵母表面展示疫苗模式图；B图为pGPD-p30-Fcγ-ADH1-POT和pGPD-p54-Fcα-ADH1-POT表达质粒的示意图；C图为pGPD-POT-TU载体构建过程中的Aga2信号肽至多克隆位点之间的DNA片段作为ORF的凝胶电泳图；D图为pGPD-POT-TU载体红白斑筛选平板图；E图为各组分DNA扩增凝胶电泳图，泳道1为p30、泳道2为Fcγ、泳道3为p54、泳道4为Fcα、泳道5为p30-Fcγ、泳道6为p54-Fcα；

图2：三种重组酵母菌疫苗株ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα的验证；A图为pGPD-p30-Fcγ-ADH1-POT和pGPD-p54-Fcα-ADH1-POT整合酵母基因组后的表型验证：在SD-LEU营养缺陷型平板筛选得到表型正确的酵母转化子(每组分左右代表平板正面与反面)；B图是对A 中阳性筛选结果(SD-LEU⁺)进行基因型验证，以基因组为模板扩增p30、Fcγ、p54、Fcα、p30-Fcγ、p54-Fcα基因的检测结果；

图3：三种重组酵母菌疫苗株ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα蛋白水平验证；A图为3种疫苗株培养24h时western blot分析结果，其中泳道1为蛋白Marker，从上至下依次为120、100、70、50、30、25、14kDa，泳道2为首先经过SampleBuffer煮沸处理再经过巯基乙醇处理之后的宿主菌总蛋白离心后的上清(阴性对照)，泳道3为只经过Sample Buffer煮沸处理之后的宿主菌总蛋白离心后的上清，泳道4、5、6首先经过Sample Buffer煮沸处理再经过巯基乙醇处理之后的ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα重组酵母菌总蛋白离心上清；泳道7、8、9为只经过SampleBuffer煮沸处理之后的3株重组酵母菌总蛋白离心上清；B图为3株重组酵母菌中P30-Fcγ、P54-Fcα融合蛋白表达的免疫荧光图；C图为3株重组酵母菌中P30-Fcγ、P54-Fcα融合蛋白表达的流式分析图；

图4：三种重组酵母菌疫苗株ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcαp30、p54基因mRNA表达水平及对酵母菌生长曲线的影响；A图为不同时间点重组菌株中p30、p54基因的mRNA表达水平；B图为3种疫苗株的生长曲线；

图5：对照组与免疫组猪的血清中针对蛋白P30、P54和K145R的特异性IgG和IgA抗体水平的变化情况；P30、P54蛋白可检测三种重组酵母菌疫苗株的免疫效果，K145R蛋白可间接检测猪群的ASFV自然感染水平；

图6：三种重组酵母菌疫苗株ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα对猪小肠上皮细胞和肺泡巨噬细胞吞噬酵母菌能力的影响；A图为猪小肠上皮细胞IPEC-J2和肺泡巨噬细胞PAM在第12、24、36h时表面Fcγ和Fcα受体的mRNA表达水平；B图和C图为下光学显微镜观察猪小肠上皮细胞(第24h)和肺泡巨噬细胞(第12h)对于空白宿主酵母以及三种重组酵母菌疫苗株的吸附吞噬情况(左)和不同组别的吞噬百分比与吞噬指数(右)。

具体实施方式

以下结合实例进一步阐述本发明，其中的内容不应理解为限定该发明的范围。实施例中所述试剂除特别说明，均为商业化试剂。

实施例1

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1酵母菌株：对于酵母表面展示，使用酿酒酵母菌株ST1814G。

本发明中：ST1814G为发明人实验室基于酿酒酵母菌株JDY52^[11]改造构建并保存。

本发明中所用的表面展示型酵母菌株是基于酿酒酵母JDY52构建的组成型表达葡萄糖启动子GPD，同时表面展示Aga1蛋白的宿主菌ST1814G。通过常规分子操作将PIU211质粒(Addgene货号44036)半乳糖启动子LAC替换为葡萄糖启动子GPD，再通过酵母转化构建了组成型葡萄糖启动子GPD控制下的高效展示Aga1宿主菌ST1814G，GPD启动子降低了重组酿酒酵母的诱导表达成本，提高了表达量^[12]。

1.1.2细胞和血清：外周血单核细胞(PBMC)分离自天津宁河原猪场。猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)和猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)均为实验室保存传代。以上细胞生长为含10％胎牛血清(FBS)的DMEM(购自Gibco)。

1.1.3实验动物：河北实验动物基地

1.1.4培养基和试剂：YPD培养基(20％葡萄糖、20％蛋白胨、10％酵母提取物)。磷酸盐缓冲液(PBS)含有8.1g/L NaCl，1.13g/L Na₂HPO₄，0.75g/L KCl和0.27gL-1KH₂PO₄。

1.1.5抗体：实验中使用的His标签抗体购自Cell Signaling Technology(货号9991S)。HRP二抗购自Invitrogen(货号G-21040)。组蛋白H3的抗体购自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz货号CA)。

1.2猪Fcγ、Fcα片段的基因克隆

使用TRIzol试剂(TaKaRa货号9108)从PBMC细胞中提取总RNA。使用逆转录酶(Transgen货号AT341-01)进行第一链cDNA合成。基于预测的IgG1和IgA1序列(GenBank登录号AK405786.1和AB194101.1)，以PBMC细胞cDNA为模板，利用特异性引物合成猪Fcγ、Fcα片段(引物序列见表1)，并连接到克隆载体

-T Easy Vector(Transgen货号CT101-01)中。

1.3荧光定量逆转录PCR

根据制造商的说明，使用First-Strand Synthesis System(Transgen货号AT341-01)试剂盒以ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα重组菌mRNA为模板合成第一链cDNA。使用qPCR试剂盒(Transgen货号AQ132-21)通过ABI 7500实时PCR系统进行qRT-PCR分析，检测相对基因ACT1表达情况。比较循环阈值(CT)方法用于根据制造商的方案(Applied Biosystem)计算相对基因表达水平。根据内源基因ACT1的转录水平评估p30、p54基因的相对表达量，并使用GraphPad Prism 6.0软件导出分析结果，绘制表达曲线(引物序列见表1)。

1.4Western-Blot检测蛋白表达

在培养24h后，收集重组酿酒酵母的菌体沉淀和上清液进行制样，即在缓冲液中加热10min并用12％SDS-PAGE分离。将分离的蛋白质转移至甲醇活化的PVDF(Millipore)。用TBST(0.05％Tween-20)中的5％脱脂奶粉封闭膜1h，并与抗His标签的抗体(以1：5000稀释)在4℃下孵育过夜，进行洗涤后在室温下用HRP缀合的二抗孵育1h。使用Pierce ECLWestern Blot Substrate(Thermo Scientific)显示蛋白条带。

1.5免疫荧光检测蛋白表达

将培养24h后的重组酿酒酵母用4％多聚甲醛固定15min，然后在室温下用PBS洗涤3次，每次10min。之后用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭30min，并在室温下与一抗(抗His)孵育，PBS洗涤3次后再孵育二抗(FITC-缀合的抗小鼠IgG)(以1：5000稀释)。利用Olympus共聚焦显微镜观察P30-Fcγ和P54-Fcα的定位，并拍摄图像。

1.6流式细胞术

在培养24h后收集重组酿酒酵母，用PBS洗涤3次，每次10min；再用4％多聚甲醛固定15min，在室温下用PBS洗涤3次，每次10min。然后用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭30min，再在室温下与一抗(抗His)孵育1h，用PBS洗涤3次，每次10min。使用二抗(FITC-缀合的抗小鼠IgG)室温孵育45min后进行荧光激活细胞分选。酵母细胞处理过程和免疫荧光相同，将偶联了二抗的菌株在FACS LSR II(BD Biosciences，USA)进行计数，进样细胞总量为1.5×10⁵。

1.7ELISA

通过传统的ELISA方法检测猪血清中的特异性抗体，包被抗原为表达纯化的P30、P54和K145R蛋白(P30、P54蛋白可检测三种疫苗株的免疫效果，K145R蛋白可间接检测猪群的ASFV自然感染水平)。首先将包被抗原稀释至2.5μg/ml，4℃过夜包被；5％牛血清白蛋白(BSA)封闭，37℃孵育1h；将采集的实验组血清，按照1：200倍稀释后，加入96孔板，37℃孵育1h；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(FITC-缀合的抗猪IgG和FITC-缀合的抗猪IgA)，37℃孵育45min；加入底物，室温避光反应10min；加入终止液后，在450nm读数。每组设3个复孔，重复实验3次。

2实验结果：

2.1p30-Fcγ和p54-Fcα融合片段展示表达载体的构建

非洲猪瘟病毒表面展示重组酿酒酵母疫苗的示意图如图1A所示，酿酒酵母宿主菌株ST1814G表面表达Aga1通过二硫键与Aga2结合表达外源蛋白。

外源蛋白转录单位包括三种标准化DNA元件，启动子(Promoter，PRO)、阅读框(Open Reading Frame，ORF)和终止子(Terminator，TER)。三个DNA元件组装获得了p30-Fcγ和p54-Fcα表达质粒图谱如图1B。流程包括三种标准DNA元件的获取和转录单位组装，选取GPD启动子与ADHI终止子^[11]，以商业化PYD1质粒为模板，PCR扩增包含Aga2信号肽和多克隆位点在内的基因片段作为ORF，PCR产物凝胶电泳结果如下图1C(Aga2信号肽和多克隆位点在内的基因片段)。再将三种标准元件及POT-RFP载体加入同一反应体系中进行one-pot反应，混合液转化LB(A⁺)平板进行红白斑筛选，红色菌落为POT-RFP载体转化菌落，白色菌落为pGPD-POT-TU载体转化菌，如图1D。经过PCR之后得到扩增的p30、p54与Fcγ、Fcα两基因片段，再通过Overlap PCR得到p30-Fcγ、p54-Fcα串联片段，琼脂糖凝胶电泳结果如图1E所示(引物序列见表1)。最后将p30-Fcγ和p54-Fcα基因片段克隆至表达载体pGPD-POT-TU(SEQ ID No.7)，将2种表达质粒分别命名为pGPD-p30-Fcγ-ADH1-POT(SEQ ID No.8)和pGPD-p54-Fcα-ADH1-POT(SEQ ID No.9)。

2.2三种疫苗株的验证

将2.1获得的p30-Fcγ、p54-Fcα转录单元通过前后缀序列连接同源重组臂和筛选标记基因(LEU，亮氨酸)，构建得到“同源臂-转录单位-筛选标签-同源臂”结构的敲除盒，通过醋酸锂转化法将敲除盒整合到酵母细胞ST1814G基因组，获得整合了ASFV P30、P54蛋白的重组酵母转化子，其中Aga2位于融合蛋白的N端，而His标签位于融合蛋白的C端^[12]。

2.3三种疫苗株表面展示的融合蛋白P30-Fcγ和P54-Fcα的表达特征。

首先，经由醋酸锂转化法将带有p30-Fcγ、p54-Fcα基因的两个转录单位分别转化两株重组酿酒酵母ST1814G，组装好的基因片段定向整合到ST1814G的IV号染色体的HO基因座，使p30-Fcγ、p54-Fcα外源基因分别稳定存在于两株酿酒酵母基因组中；另外将以上两个转录单位共同转化第三株重组酿酒酵母ST1814G，p30-Fcγ、p54-Fcα串联插入酿酒酵母基因组中，以期获得两种单独表达ASFV P30、P54蛋白的表面展示型重组酿酒酵母疫苗株，以及一种同时表达ASFV P30、P54蛋白的串联复合表达型重组酿酒酵母疫苗株。

然后，通过SD-LEU营养缺陷平板筛选酵母转化子。如图2A(平板的正面与反面)，挑取多个在SD-LEU平板生长良好的酵母单菌落至新的SD-LEU选择性平板做进一步纯化，30℃倒置培养48h，挑单克隆转接至3mL YPD中，在30℃和220rpm条件下震荡培养24h，按照试剂盒说明(TIANGEN货号DP307)提取酵母基因组。

最后，以3株重组酵母菌株基因组DNA为模板，对阳性克隆进行PCR鉴定(引物序列见表1，即Overlap PCR引物)，得到的基因片段长度与预期相符，如图2B。以上结果表明p30-Fcγ、p54-Fcα融合片段已成功地整合到ST1814G基因组中。将最终确认正确的3种重组菌株命名为ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα和ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα。

2.4三种疫苗株表面展示的融合蛋白P30-Fcγ和P54-Fcα的表达特征

2.4.1P30-Fcγ和P54-Fcα融合蛋白成功表达

分别收集培养24h后ST1814G(阴性对照)、ST1814G/p30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα的菌体沉淀裂解物，进行western blot分析。结果见图3A，首先经过Sample Buffer煮沸处理再经过巯基乙醇处理之后的宿主菌总蛋白离心后的上清(阴性对照，泳道1)和只经过Sample Buffer煮沸处理之后的宿主菌总蛋白离心后的上清(泳道2)中均未检测到特异性的P30-Fcγ和P54-Fcα融合蛋白条带，在3个重组菌株的裂解物中检测到分子量约为30kDa的特异性条带(泳道4-9)，表明P30-Fcγ和P54-Fcα融合蛋白可以有效地表达在ST1814G酵母细胞表面。泳道4、5、6为首先经过Sample Buffer煮沸处理再经过巯基乙醇处理之后的ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα重组菌总蛋白离心上清，泳道7、8、9为只经过Sample Buffer煮沸处理之后的3株重组酵母菌总蛋白离心上清，对比泳道4、5、6和泳道7、8、9，可以发现首先经过Sample Buffer煮沸处理再经过巯基乙醇处理之后的3株重组菌总蛋白离心上清中蛋白条带更加明显，说明了巯基乙醇能够有效断裂Aga2与Aga1之间的二硫键，增加酵母菌表面展示蛋白的洗脱效率。

2.4.2P30-Fcγ和P54-Fcα融合蛋白表达于细胞表面

分别收集培养24h后ST1814G(阴性对照)、ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα和ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα菌体，以羊抗His为一抗，兔抗羊FITC-IgG为二抗标记，进行免疫荧光显微镜分析。P30-Fcγ和P54-Fcα在细胞内与Aga2细胞表面结合因子融合后，与酵母细胞壁蛋白Aga1结合，展示在酵母细胞表面。通过敲除盒标签抗体His识别蛋白，进行免疫荧光观察。镜检结果显示(见图3B)，在阴性对照中未检测到绿色荧光(右1)，而实验组ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα则检测到明显的特异性绿色荧光(右2-4)，表明P30-Fcγ和P54-Fcα融合蛋白定向表达在ST1814G酿酒酵母的表面。

与免疫荧光显微镜的结果类似，流式细胞仪结果(见图3C)显示与阴性对照(ST1814G)的曲线相比，ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα出现明显右移，进一步证实表明P30-Fcγ和P54-Fcα融合蛋白定向表达在ST1814G酿酒酵母的表面。

2.5三种疫苗株ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcαp30、p54基因mRNA表达水平及对酵母菌生长曲线的影响

基于内参基因ACT1的mRNA水平，设计特异性qPCR引物，通过qPCR技术定量分析p30，p54外源基因的mRNA表达水平，结果如图4A，随着酵母培养时间得推移，单表达菌株ST1814G/P30-Fcγ的p30基因mRNA表达水平逐渐升高，在24h达到顶峰，而串联复合表达菌株ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα中p54基因的mRNA表达水平在36h达到顶点，之后有所下降。

为分析P30-Fcγ和P54-Fcα融合蛋白的表达是否对重组酿酒酵母的生长有影响，使用分光光度计测定培养第12、24、36、48、60、72h时菌液OD600 nm值。以原始菌株ST1814G作为空白对照，利用可见光分光光度计，测定ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα3种重组酵母菌株在诱导培养第12、24、36、48、60、72h时的OD600 nm值，确定重组酵母的生长曲线如图4B。ST1814G/P30-Fcγ和ST1814G/P54-Fcα菌株生长曲线与宿主ST1814相似，0-12h是菌体对数生长期，24h后菌体量达到稳定,诱导培养60h后的菌体量最高；而ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα串联复合型重组菌株的菌体量随着诱导时间持续缓慢升高，至诱导培养72h后菌体量达到最高，但明显低于宿主菌株和2种单表达重组菌株。生长曲线分析表明非洲猪瘟病毒蛋白的表达在一定范围内会影响重组酿酒酵母的生长，说明了ASFV P30-Fcγ和P54-Fcα融合蛋白的表达对菌体生长有抑制作用。

2.6三种疫苗株ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα免疫效力分析

将20头50-60日龄猪随机分为两组，即对照组及口服疫苗免疫组。空白对照组免疫酵母宿主菌，疫苗免疫组拌料口服免疫T1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα，免疫剂量为每头免疫10⁹cfu/头，间隔5天口服一次，共口服3次。口服猪均无任何不良反应。在免疫前及免疫后17、35、55天分别采血，检测免疫组猪血清针对蛋白P30、P54、K145R蛋白的特异性抗体IgG和IgA水平，进行疫苗的安全性和效力检验。统计学分析表明对照组和实验组猪机体的ASFV病毒自然感染水平无明显差异(图5C)。然而，与对照组相比，一免后免疫猪的IgG和IgA抗体水平有所升高，但趋势不明显，二免、三免后实验组的特异性针对P30、P54整体抗体水平明显高于PBS对照组，差异显著(图5A和5B))。另外，P54的IgA抗体水平在免疫进程中持续上升(图5B下)，而P30蛋白的IgA抗体水平在第三次免疫之后有所下降(图5A下)，这可能是由于P54蛋白具有更多的抗原表位，抗原性相对更强。

2.7三种疫苗株ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα对猪小肠上皮细胞和肺泡巨噬细胞吞噬酵母菌能力的影响

猪小肠上皮细胞和成熟的巨噬细胞表面具有Fc受体，该受体能识别经IgG介导的颗粒，并迅速与之结合，促进细胞对相应颗粒的吞噬。为此检测这些受体可间接判断猪小肠上皮细胞和巨噬细胞的吞噬功能正常。如图6A所示，猪小肠上皮细胞和肺泡巨噬细胞上IgG和IgA Fc受体均有显著表达(引物序列见表1)，在培养12h时猪肺泡巨噬细胞上IgG和IgAFc受体表达水平都达到峰值，在培养24h时猪小肠上皮细胞上IgG Fc受体表达水平达到峰值，IgA Fc受体表达水平在不同时间段无明显变化。将培养12h时的猪肺泡巨噬细胞和培养24h时猪小肠上皮细胞分为空白对照组、吞噬空白宿主酵母菌株对照组、吞噬3个疫苗株的实验组，加入酵母菌液ST1814G、ST1814G/P30-Fcγ、ST1814G/P54-Fcα、ST1814G/P30-Fcγ-P54-Fcα，进行吉姆萨染色，光学显微镜(400倍)下拍片并计数200个巨噬细胞及吞噬的酵母菌数量，按下列公式计算吞噬率和吞噬指数:吞噬率＝(200个巨噬细胞中吞噬酵母菌的巨噬细胞数/200)×100％；吞噬指数＝(200个巨噬细胞吞噬的酵母菌总数/200)×100％。如图6B和C所示，与宿主酵母菌株对照组相比，猪小肠上皮细胞和肺泡巨噬细胞对于重组酵母菌株实验组的吞噬阳性细胞百分比与吞噬指数呈现明显上升趋势，其中猪小肠上皮细胞和肺泡巨噬细胞对于串联复合表达酵母菌株的吸附、吞噬能力明显高于基础水平，间接表明P30-Fcγ、P54-Fcα融合蛋白能与猪小肠上皮细胞和肺泡巨噬细胞表面的Fc受体结合，说明Fcγ、Fcα介导ASFV抗原蛋白与猪小肠上皮细胞和巨噬细胞的结合与吞噬。

本发明所涉及的参考文献：

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表1普通PCR、Overlap PCR及qPCR引物

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法

<130> 2020

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgaaaatgg aggtcatctt caaaacggat ttaagatcat cttcacaagt tgtgtttcat 60

gcgggtagcc tgtataattg gttttctgtt gagattatca atagcggtag aattgttacg 120

accgctataa aaacattgct tagtactgtt aagtatgata ttgtgaaatc tgctcgtata 180

tatgcagggc aagggtatac tgaacatcag gctcaagaag aatggaatat gattctgcat 240

gtgctgtttg aagaggagac ggaatcctca gcatcttcgg agaacattca tgaaaaaaat 300

gataatgaaa ccaatgaatg cacatcctcc tttgaaacgt tgtttgagca agagccctca 360

tcgaaggtac ctaaagactc caagctgtat atgcttgcac aaaagactgt gcaacatatt 420

gaacaatatg gaaaggcacc tgattttaac aaggttatta gagcacataa ttttattcaa 480

accatttatg gaacccctct aaaggaagaa gaaaaagagg tggtaagact catggttatt 540

aaacttttaa aaaaaaaa 558

<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 2

atgcaaacat gtcccatatg cccaggctgt gaagtggccg ggccctcggt cttcatcttc 60

cctccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccagaccc ccgaggtcac gtgcgtggtg 120

gtggacgtca gcaaggagca cgccgaggtc cagttctcct ggtacgtgga cggcgtagag 180

gtgcacacgg ccgagacgag accaaaggag gagcagttca acagcaccta ccgtgtggtc 240

agcgtcctgc ccatccagca ccaggactgg ctgaagggga aggagttcaa gtgcaaggtc 300

aacaacgtag acctcccagc ccccatcacg aggaccatct ccaaggctat agggcagagc 360

cgggagccgc aggtgtacac cctgccccca cccgccgagg agctgtccag gagcaaagtc 420

acgctaacct gcctagtcat tggcttctac ccacctgaca tccatgttga gtggaagagc 480

aacggacagc cggagccaga gaacacatac cgcaccaccc cgccccagca ggacgtggac 540

gggaccttct tcctgtacag caaactcgcg gtggacaagg caagatggga ccatggagac 600

aaatttgagt gtgcggtgat gcacgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagtccatc 660

tccaagactc agggtaaata a 681

<210> 3

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggattctg aattttttca accggtttat ccgcggcatt atggtgagtg tttgtcacca 60

gtcactacac caagcttctt ctccacacat atgtatacta ttctcattgc tatcgtggtc 120

ttagtcatca ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt caagaaagaa aaaagctgct 180

gctattgagg aggaagatat acagtttata aatccttatc aagatcagca gtgggtagaa 240

gtcactccac aaccaggtac ctctaaacca gctggagcga ctacagcaag tgtaggcaag 300

ccagtcacgg gcagaccggc aacaaacaga ccagcagcaa acaaaccagt tacggacaac 360

ccagttacgg acagactagt catggcaact ggcgggccgg cggccgcacc tgcggccgcg 420

agtgctcctg ctcatccggc tgagccttac acgacagtca ctactcagaa cactgcttca 480

caaacaatgt cggctattga aaatttacga caaagaaaca cctatacgca taaagaccta 540

gaaaactcct tg 552

<210> 4

<211> 723

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 4

caagtgcagc acctctccaa atccagccag tccgtgaacg tgccctgcaa agttttacct 60

tcagatccat gtccccagtg ctgcaagccc agcctgtccc tgcagccacc agcccttgca 120

gacctgctcc tgggctccaa tgccagcctc acgtgcacac tcagtggcct gaaaaaatcc 180

gagggtgtca gcttcacctg gcagccctca ggtgggaagg atgccgtcca ggcgtccccc 240

acgcgtgatt cctgtggctg ctacagcgtg tccagcatcc tgccaggctg tgctgatcct 300

tggaacaaag gagagacatt ctcctgcacc gccgcccact ctgagttgaa gagcgcgcta 360

accgccacca tcaccaaacc caaagtgaac acgttccggc cccaggtcca cctgctgccg 420

ccgccgtcgg aggagctggc cctcaatgag ctggtgacac tgacatgcct ggtgcggggc 480

ttcagcccca aggatgtgct ggtgcgatgg ctgcaagggg gccaggaact gccccgtgac 540

aagtacctcg tctgggaatc cctgccagag cctggccagg ccatccccac ctacgccgtg 600

accagcgtgc tgcgcgtgga cgccgaggac tggaagcagg gagacacctt ctcctgcatg 660

gtgggccacg aggccctgcc cctggccttc acccagaaga ccatcgaccg cctggcgggt 720

taa 723

<210> 5

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgaaaatgg aggtcatctt caaaacggat ttaagatcat cttcacaagt tgtgtttcat 60

gcgggtagcc tgtataattg gttttctgtt gagattatca atagcggtag aattgttacg 120

accgctataa aaacattgct tagtactgtt aagtatgata ttgtgaaatc tgctcgtata 180

tatgcagggc aagggtatac tgaacatcag gctcaagaag aatggaatat gattctgcat 240

gtgctgtttg aagaggagac ggaatcctca gcatcttcgg agaacattca tgaaaaaaat 300

gataatgaaa ccaatgaatg cacatcctcc tttgaaacgt tgtttgagca agagccctca 360

tcgaaggtac ctaaagactc caagctgtat atgcttgcac aaaagactgt gcaacatatt 420

gaacaatatg gaaaggcacc tgattttaac aaggttatta gagcacataa ttttattcaa 480

accatttatg gaacccctct aaaggaagaa gaaaaagagg tggtaagact catggttatt 540

aaacttttaa aaaaaaaaat gcaaacatgt cccatatgcc caggctgtga agtggccggg 600

ccctcggtct tcatcttccc tccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccagaccccc 660

gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtcagc aaggagcacg ccgaggtcca gttctcctgg 720

tacgtggacg gcgtagaggt gcacacggcc gagacgagac caaaggagga gcagttcaac 780

agcacctacc gtgtggtcag cgtcctgccc atccagcacc aggactggct gaaggggaag 840

gagttcaagt gcaaggtcaa caacgtagac ctcccagccc ccatcacgag gaccatctcc 900

aaggctatag ggcagagccg ggagccgcag gtgtacaccc tgcccccacc cgccgaggag 960

ctgtccagga gcaaagtcac gctaacctgc ctagtcattg gcttctaccc acctgacatc 1020

catgttgagt ggaagagcaa cggacagccg gagccagaga acacataccg caccaccccg 1080

ccccagcagg acgtggacgg gaccttcttc ctgtacagca aactcgcggt ggacaaggca 1140

agatgggacc atggagacaa atttgagtgt gcggtgatgc acgaggctct gcacaaccac 1200

tacacccaga agtccatctc caagactcag ggtaaataa 1239

<210> 6

<211> 1275

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atggattctg aattttttca accggtttat ccgcggcatt atggtgagtg tttgtcacca 60

gtcactacac caagcttctt ctccacacat atgtatacta ttctcattgc tatcgtggtc 120

ttagtcatca ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt caagaaagaa aaaagctgct 180

gctattgagg aggaagatat acagtttata aatccttatc aagatcagca gtgggtagaa 240

gtcactccac aaccaggtac ctctaaacca gctggagcga ctacagcaag tgtaggcaag 300

ccagtcacgg gcagaccggc aacaaacaga ccagcagcaa acaaaccagt tacggacaac 360

ccagttacgg acagactagt catggcaact ggcgggccgg cggccgcacc tgcggccgcg 420

agtgctcctg ctcatccggc tgagccttac acgacagtca ctactcagaa cactgcttca 480

caaacaatgt cggctattga aaatttacga caaagaaaca cctatacgca taaagaccta 540

gaaaactcct tgcaagtgca gcacctctcc aaatccagcc agtccgtgaa cgtgccctgc 600

aaagttttac cttcagatcc atgtccccag tgctgcaagc ccagcctgtc cctgcagcca 660

ccagcccttg cagacctgct cctgggctcc aatgccagcc tcacgtgcac actcagtggc 720

ctgaaaaaat ccgagggtgt cagcttcacc tggcagccct caggtgggaa ggatgccgtc 780

caggcgtccc ccacgcgtga ttcctgtggc tgctacagcg tgtccagcat cctgccaggc 840

tgtgctgatc cttggaacaa aggagagaca ttctcctgca ccgccgccca ctctgagttg 900

aagagcgcgc taaccgccac catcaccaaa cccaaagtga acacgttccg gccccaggtc 960

cacctgctgc cgccgccgtc ggaggagctg gccctcaatg agctggtgac actgacatgc 1020

ctggtgcggg gcttcagccc caaggatgtg ctggtgcgat ggctgcaagg gggccaggaa 1080

ctgccccgtg acaagtacct cgtctgggaa tccctgccag agcctggcca ggccatcccc 1140

acctacgccg tgaccagcgt gctgcgcgtg gacgccgagg actggaagca gggagacacc 1200

ttctcctgca tggtgggcca cgaggccctg cccctggcct tcacccagaa gaccatcgac 1260

cgcctggcgg gttaa 1275

<210> 7

<211> 6337

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg 60

acggatcgct tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg 120

gaatttactc tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa 180

agaaggtaga agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca 240

acaaaaagcg tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata 300

cattcgatta acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca 360

cagacaagat gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt 420

agtatttgtt ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt 480

tctttaattt ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa 540

attataatta tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat 600

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 660

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 720

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 780

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 840

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 900

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 960

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 1020

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 1080

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1140

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1200

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1260

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1320

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1380

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggtagtcg cggtatcatt 1440

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1500

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1560

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1620

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1680

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1740

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1800

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1860

agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1920

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1980

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 2040

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 2100

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2160

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2220

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2280

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2340

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2400

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2460

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 2520

cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 2580

cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag 2640

gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 2700

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 2760

cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg gccgcgaatt ccccgggtct 2820

agaggtctcg gttggcagtg actcggtctc tacctggctt cattatcaat actgccattt 2880

caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt 2940

agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat 3000

atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta aatataatgg 3060

agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa aatattgttt 3120

tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga gaacaggggc 3180

acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat 3240

gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca ccttctatta 3300

ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa 3360

attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt 3420

aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt tttagtttta 3480

aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacaaagatg atgcagttac 3540

ttcgctgttt ttcaatattt tctgttattg cttcagtttt agcacaggaa ctgacaacta 3600

tatgcgagca aatcccctca ccaactttag aatcgacgcc gtactctttg tcaacgacta 3660

ctattttggc caacgggaag gcaatgcaag gagtttttga atattacaaa tcagtaacgt 3720

ttgtcagtaa ttgcggttct cacccctcaa caactagcaa aggcagcccc ataaacacac 3780

agtatgtttt taagcttctg caggctagtg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg 3840

gtggtggtgg ttctgctagc atgactggtg gacagcaaat gggtcgggat ctgtacgacg 3900

atgacgataa ggtaccagga tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc 3960

ggccgctcga gtctagaggg cccttcgaag gtaagcctat ccctaaccct ctcctcggtc 4020

tcgattctac gcgtaccggt catcatcacc atcaccattg atagccgaat ttcttatgat 4080

ttatgatttt tattattaaa taagttataa aaaaaataag tgtatacaaa ttttaaagtg 4140

actcttaggt tttaaaacga aaattcttat tcttgagtaa ctctttcctg taggtcaggt 4200

tgctttctca ggtatagcat gaggtcgctc ttattgacca cacctctacc ggcctctgag 4260

agagacccaa gacactgcgg atcgagacca ctagtaccgg tctgcagctc gagggggggc 4320

ccggtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc gctcactggc cgtcgtttta 4380

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 4440

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 4500

cgcagcctga atggcgaatg gcgcgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4560

gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4620

gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4680

gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4740

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tgcgatggct gcaagggggc caggaactgc cccgtgacaa gtacctcgtc tgggaatccc 5040

tgccagagcc tggccaggcc atccccacct acgccgtgac cagcgtgctg cgcgtggacg 5100

ccgaggactg gaagcaggga gacaccttct cctgcatggt gggccacgag gccctgcccc 5160

tggccttcac ccagaagacc atcgaccgcc tggcgggtgg atccagtgtg gtggaattct 5220

gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg agtctagagg gcccttcgaa ggtaagccta 5280

tccctaaccc tctcctcggt ctcgattcta cgcgtaccgg tcatcatcac catcaccatt 5340

gatagccgaa tttcttatga tttatgattt ttattattaa ataagttata aaaaaaataa 5400

gtgtatacaa attttaaagt gactcttagg ttttaaaacg aaaattctta ttcttgagta 5460

actctttcct gtaggtcagg ttgctttctc aggtatagca tgaggtcgct cttattgacc 5520

acacctctac cggcctctga gagagaccca agacactgcg gatcgagacc actagtaccg 5580

gtctgcagct cgaggggggg cccggtaccc aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg 5640

cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 5700

aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 5760

gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcgacgc gccctgtagc 5820

ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 5880

gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 5940

ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 6000

ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 6060

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 6120

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 6180

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 6240

aaaatattaa cgtttacaat ttcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 6300

tttcacaccg catagggtaa taactgatat aattaaattg aagctctaat ttgtgagttt 6360

agtatacatg catttactta taatacagtt ttttagtttt gctggccgca tcttctcaaa 6420

tatgcttccc agcctgcttt tctgtaacgt tcaccctcta ccttagcatc ccttcccttt 6480

gcaaatagtc ctcttccaac aataataatg tcagatcctg tagacaccac atcatccacg 6540

gttctatact gttgacccaa tgcgtcaccc ttgtcatcta aacccacacc gggtgtcata 6600

atcaaccaat cgtaaccttc atctcttcca cccatgtctc tttgagcaat aaagccgata 6660

acaaaatctt tgtcgctctt cgcaatgtca acagtaccct tagtatattc tccagtagat 6720

agggagccct tgcatgacaa ttctgctaac atcaaaaggc ctctaggttc ctttgttact 6780

tcttctgccg cctgcttcaa accgctaaca atacctgggc ccaccacacc gtgtgcattc 6840

gtaatgtctg cccattctgc tattctgtat acacccgcag agtactgcaa tttgactgta 6900

ttaccaatgt cagcaaattt tctgtcttcg aagagtaaaa aattgtactt ggcggataat 6960

gcctttagcg gcttaactgt gccctccatg gaaaaatcag tcaagatatc cacatgtgtt 7020

tttagtaaac aaattttggg acctaatgct tcaactaact ccagtaattc cttggtggta 7080

cgaacatcca atgaagcaca caagtttgtt tgcttttcgt gcatgatatt aaatagcttg 7140

gcagcaacag gactaggatg agtagcagca cgttccttat atgtagcttt cgacatgatt 7200

tatcttcgtt tcctgcaggt ttttgttctg tgcagttggg ttaagaatac tgggcaattt 7260

catgtttctt caacactaca tatgcgtata tataccaatc taagtctgtg ctccttcctt 7320

cgttcttcct tctgttcgga gattaccgaa tcaaaaaaat ttcaaagaaa ccgaaatcaa 7380

aaaaaagaat aaaaaaaaaa tgatgaattg aattgaaaag ctgtggtatg gtgcactctc 7440

agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct 7500

gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgacaatc 7560

tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagattaa 7618

<210> 10

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 10

Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln

1 5 10 15

Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile

20 25 30

Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser

35 40 45

Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln

50 55 60

Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His

65 70 75 80

Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile

85 90 95

His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu

100 105 110

Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Lys Val Pro Lys Asp Ser Lys

115 120 125

Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly

130 135 140

Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln

145 150 155 160

Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg

165 170 175

Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Lys Met Gln Thr Cys Pro Ile

180 185 190

Cys Pro Gly Cys Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

195 200 205

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys

210 215 220

Val Val Val Asp Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp

225 230 235 240

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu

245 250 255

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln

260 265 270

His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

275 280 285

Val Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly

290 295 300

Gln Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu

305 310 315 320

Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr

325 330 335

Pro Pro Asp Ile His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro

340 345 350

Glu Asn Thr Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr

355 360 365

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His

370 375 380

Gly Asp Lys Phe Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

385 390 395 400

Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys

405 410

<210> 11

<211> 424

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 11

Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr

20 25 30

Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu

50 55 60

Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu

65 70 75 80

Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala

85 90 95

Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala

100 105 110

Ala Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met

115 120 125

Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala

130 135 140

His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser

145 150 155 160

Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr

165 170 175

His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu Gln Val Gln His Leu Ser Lys Ser

180 185 190

Ser Gln Ser Val Asn Val Pro Cys Lys Val Leu Pro Ser Asp Pro Cys

195 200 205

Pro Gln Cys Cys Lys Pro Ser Leu Ser Leu Gln Pro Pro Ala Leu Ala

210 215 220

Asp Leu Leu Leu Gly Ser Asn Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly

225 230 235 240

Leu Lys Lys Ser Glu Gly Val Ser Phe Thr Trp Gln Pro Ser Gly Gly

245 250 255

Lys Asp Ala Val Gln Ala Ser Pro Thr Arg Asp Ser Cys Gly Cys Tyr

260 265 270

Ser Val Ser Ser Ile Leu Pro Gly Cys Ala Asp Pro Trp Asn Lys Gly

275 280 285

Glu Thr Phe Ser Cys Thr Ala Ala His Ser Glu Leu Lys Ser Ala Leu

290 295 300

Thr Ala Thr Ile Thr Lys Pro Lys Val Asn Thr Phe Arg Pro Gln Val

305 310 315 320

His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val

325 330 335

Thr Leu Thr Cys Leu Val Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val

340 345 350

Arg Trp Leu Gln Gly Gly Gln Glu Leu Pro Arg Asp Lys Tyr Leu Val

355 360 365

Trp Glu Ser Leu Pro Glu Pro Gly Gln Ala Ile Pro Thr Tyr Ala Val

370 375 380

Thr Ser Val Leu Arg Val Asp Ala Glu Asp Trp Lys Gln Gly Asp Thr

385 390 395 400

Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln

405 410 415

Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly

420

Claims

1.非洲猪瘟病毒融合蛋白P30-Fcγ、P54-Fcα，其氨基酸序列分别为SEQ No.10、SEQNo.11。

2.表达权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于，将ASFV病毒结构蛋白P30编码基因p30与猪免疫球蛋白IgG1的Fc片段编码基因Fcγ串联得到p30-Fcγ编码序列，将非洲猪瘟病毒结构蛋白P54编码基因p54基因与猪免疫球蛋白IgA1的Fc片段编码基因Fcα连接得到p54-Fcα编码序列，其核苷酸序列分别为：SEQ ID No.5；SEQ ID No.6。

3.一种载体，其包含权利要求2所述基因片段。

4.一种酿酒酵母宿主细胞，其包含权利要求3所述的载体。

5.一种非洲猪瘟病毒疫苗株，其特征在于，包括权利要求1所述融合蛋白中的一种或两种。

6.一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法，其特征在于，将非洲猪瘟病毒结构蛋白编码基因p30、p54与Fcγ、Fcα串联，分别构建p30-Fcγ、p54-Fcα在酵母内融合表达的转录单位，经体外酶连、酵母体内转化及同源重组技术，实现2个转录单位串联，并稳定整合入基因组，通过二硫键展示于酵母细胞表面，获得2种单独表面展示P30-Fcγ、P54-Fcα融合蛋白的重组酵母菌株和1种同时表面展示两种融合蛋白的重组酵母菌株，并利用所得菌株制备疫苗。

7.根据权利要求6所述制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)猪Fcγ、Fcα片段的PCR扩增：采集猪血液并提取血液外周淋巴细胞的总RNA，通过RT-PCR扩增猪IgG1和IgA 1的Fc片段即Fcγ、Fcα；

(4)表达质粒的构建：通过BamHI单酶切线性化POT载体，无缝克隆连接p30-Fcγ、p54-Fcα片段至表面展示表达载体pGPD-POT-TU^[1]上，转化至E.coli DH5a中，选取阳性克隆进行菌液验证PCR，测序；

(5)重组表达质粒转化酵母细胞：将构建成功的重组表达质粒命名为pGPD-p30-Fcγ-ADH1-POT、pGPD-p54-Fcα-ADH1-POT，分别转化酿酒酵母感受态细胞制备两种单表达菌株，再利用特异性引物扩增出互补的前后缀以串联两个转录单位，转化酿酒酵母感受态细胞制备一种同时表达两种融合蛋白的串联复合表达菌株，最后进行基因组水平及蛋白水平验证。

8.权利要求1所述蛋白P30-Fcγ、P54-Fcα在制备非洲猪瘟病毒疫苗中或在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。