CN113652405A - pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113652405A
CN113652405A CN202110968210.XA CN202110968210A CN113652405A CN 113652405 A CN113652405 A CN 113652405A CN 202110968210 A CN202110968210 A CN 202110968210A CN 113652405 A CN113652405 A CN 113652405A
Authority
CN
China
Prior art keywords
psfv
plasmid
replicon
gene
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110968210.XA
Other languages
English (en)
Inventor
方倪冉
郑航辉
温良海
杨斌
徐婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd filed Critical Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110968210.XA priority Critical patent/CN113652405A/zh
Publication of CN113652405A publication Critical patent/CN113652405A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种pSFV‑p54复制子颗粒及其制备方法与应用。所述pSFV‑p54复制子颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)以pSFV‑sp6‑EGFP质粒和flag‑p54基因为材料，构建得到pSFV‑sp6‑p54质粒；所述flag‑p54基因如SEQ ID NO：1所示；(2)分别将SFV‑helper辅助质粒和所述pSFV‑sp6‑p54质粒线性化并进行体外转录，将所得mRNA共电转入BHK细胞或Vero细胞中，得到pSFV‑p54复制子颗粒。本发明通过以塞姆利基森林病毒为载体，插入非洲猪瘟p54基因，所制得的pSFV‑p54复制子颗粒能够高效表达非洲猪瘟病毒p54蛋白，且具有较高的生物安全性，可应用于研制非洲猪瘟相关疫苗。

Description

pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)在病毒分类中属于DNA病毒目(dsDNA)、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，是非洲猪瘟病毒科中唯一的成员，家猪和各种野猪感染非洲猪瘟病毒会引起一种急性、出血性、烈性传染病-非洲猪瘟。非洲猪瘟临床症状以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为主要特征，目前尚无有效的疫苗用于预防，一经发现只能大规模扑杀，对养猪业造成巨大损失。非洲猪瘟病毒的病毒粒子呈二十面体对称，平均直径约为200nm。病毒粒子结构由内到外分别为核质体、核衣壳、囊膜(分为外层与内层)：核质体主要由病毒基因组、DNA结合蛋白(p10、p14、p37、p34等)及基因早期转录所需的酶组成；核衣壳主要含有结构蛋白p72和p17，由大约2000个壳粒组成；内侧囊膜来源于宿主的内质网，结合着p12、p22、p54、p54及CD2v蛋白，外层囊膜为病毒出芽附带产物，松散环绕在四周。ASFV基因组为线性双链DNA分子，不同毒株全长大小不一，大致范围在170-193kb，编码150-175个蛋白。基因组由中央保守区(约125kb)、两侧可变区(分别为38-48kb、13-22kb)及基因组末端的反向重复序列(约2.1-2.5kb)组成。其中p54是由ASFV开放阅读框E183L基因编码的蛋白，是一种I型跨膜蛋白，横跨病毒粒子的内层囊膜，通过腔内的半胱氨酸形成同源二聚体。p54蛋白帮助病毒快速结合到易感细胞，刺激机体产生特异性抗体，具有一定的抗原性。在ASFV感染的细胞中，p54蛋白与内质网结合，促进内质网膜转变为病毒粒子包膜前体。p54蛋白与细胞质动力蛋白DLC8可发生特殊的交叉反应介导病毒的细胞内运输。在细胞对病毒内摄过程和病毒在细胞内的加工过程中都起着重要作用。除此之外，p54蛋白从微管中替代Bim(bcl-2interacting mediator of celldeath)，使其重新定位至线粒体，激活细胞内凋亡途径，从而引起凋亡。
近20年来，ASFV亚单位疫苗和重组疫苗得到了广泛的研究，多种参与ASFV感染机体的病毒蛋白，如p72、p54、p54等成为研究的靶蛋白，但是目前研制的亚单位疫苗和重组疫苗仍不能对机体产生足够的保护力，只能在一定程度上降低病毒血症水平，延缓临床症状出现的时间。因此，本发明希望提出一种能高效表达病毒蛋白，且安全性高的方法，以期获得性能更佳的疫苗类产品。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用。通过以塞姆利基森林病毒(Semliki forestvirus，SFV)为载体，插入非洲猪瘟p54基因，所制得的pSFV-p54复制子颗粒能够高效表达非洲猪瘟病毒p54蛋白，且具有较高的生物安全性，可应用于研制非洲猪瘟相关疫苗。
本发明提供一种pSFV-p54复制子颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)以pSFV-sp6-EGFP质粒和flag-p54基因为材料，构建得到pSFV-sp6-p54质粒；所述flag-p54基因如SEQ ID NO：1所示；
(2)分别将SFV-helper辅助质粒和所述pSFV-sp6-p54质粒线性化并进行体外转录，将所得mRNA共电转入BHK细胞或Vero细胞中，得到pSFV-p54复制子颗粒。
本发明以塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus，SFV，属于甲病毒的一种)作为复制子载体，构建得到一种包装体系。该包装体系包括两个独立的RNA分子，一个RNA分子是包含插入有flag-tag以及p54融合蛋白基因的RNA复制子载体(由pSFV-sp6-p54质粒转录得到)；另一个RNA分子是辅助RNA(由SFV-helper辅助质粒转录得到)，其包括5’-3’复制信号和亚基因组启动子和编码结构蛋白的基因。这两个mRNA分子共转染细胞即包装成复制子颗粒，可进行自主复制并高效表达非洲猪瘟病毒p54蛋白(ASFV p54)，且不会与基因组发生整合，因而具有良好的生物安全性。
优选的，所述步骤(1)包括以下步骤：
使用BamHI/SmaI内切酶对pSFV-sp6-EGFP质粒进行双酶切，将酶切产物与flag-p54基因进行同源重组，得到重组产物；将所述重组产物导入感受态细胞，鉴定，提取得到pSFV-sp6-p54质粒。
更优选的，采用如SEQ ID NO：2-3所示的引物tongyong-F、引物p54-R对重组产物进行所述鉴定。
更优选的，所述感受态细胞为DH5α细胞或Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞。
优选的，步骤(1)还包括对所述pSFV-sp6-p54质粒进行酶切鉴定及测序的操作。
优选的，步骤(2)中采用SpaI酶切使所述pSFV-sp6-p54质粒线性化，采用SpeI酶切使所述SFV-helper辅助质粒线性化。
本发明还提供了一种pSFV-p54复制子颗粒，由上述制备方法所制得。
本发明还提供了上述pSFV-p54复制子颗粒在表达非洲猪瘟病毒p54蛋白中的应用。
本发明还提供了上述pSFV-p54复制子颗粒在制备RNA疫苗中的应用。
本发明还提供了一种非洲猪瘟疫苗，包含所述pSFV-p54复制子颗粒。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明将SFV复制子作为表达载体，插入非洲猪瘟p54基因，所得到pSFV-p54复制子颗粒具有宿主选择范围广、表达效率高等优点，能够进行自主复制并高效表达非洲猪瘟病毒p54蛋白(ASFV p54)，且不会与基因组发生整合，因而具有良好的生物安全性。所述pSFV-p54复制子颗粒疫苗可应用于制备非洲猪瘟疫苗，能有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。
附图说明
图1为pSFV-SP6-p54质粒图谱；
图2为对pSFV-sp6-EGFP进行双酶切的结果；
图3为重组质粒菌液鉴定结果；
图4为重组质粒酶切鉴定结果；
图5为线性化的pSFV-sp6-p54及pSFV-helper体外转录结果；
图6为检测ASFV p54蛋白表达的间接免疫荧光实验结果
图7为ASFV p54的Wersternblot实验结果；
图8为ASFV p54的SDS-PAGE实验结果；
图9为采用BCA法对纯化后的ASFV p54蛋白浓度的测定结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实验试剂
Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、MgCl2(25mM)、dNTP(1mM)、Marker、6×DNA上样缓冲液、10×TAE、一步法快速感受态细胞制备试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA少量抽提试剂盒、琼脂糖、DNA柱式胶回收试剂盒，均购自生工生物工程股份有限公司；4S Red Plus核酸染色剂，购自BBI公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、胰酶(0.25％Trypsin-EDTA)、DMEM培养基(DMEM/High glucose)、0.25％Trypsin-EDTA，均购自Gibco公司；组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根；2×qPCR Mix，购自诺唯赞；
Figure BDA0003224693870000041
Vector、SYBR PremixExTaqTM(Tli RNAseH plus)(RR420A)、PrimescriptTM RT reagent kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(RR047A)、胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)、Stbl3感受态细胞、BamHI/AscI限制性内切酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司；RNAprep pureTissue Kit(DP431)，购自TIANGEN；质粒提取试剂盒(Plasmid Mini Kit)，购自OMEGA公司；转染试剂Lipofectamine 3000Regeant，购自Invitrogen公司；pSFVCs-lacz(#92076)，购自addgene；EGFP-C1载体质粒(获取自华南农业大学9号楼114实验室)，Anti-Flag AffinityGel(碧云天)；pSFV-sp6-EGFP质粒(根据申请号为2021108223525的发明专利所制得，其序列如SEQ ID NO：4所示)；SFV-helper(根据申请号为2021108224072的发明专利所制得，其序列如SEQ ID NO：5所示)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天)；FITC标记的山羊抗猪IgG；非洲猪瘟阳性血清(肇庆大华农生物药品有限公司)。PageRuler PrestainedProtein Ladder(26619，Thermo)；BeyoBlueTM考马斯亮蓝超快染色液(Beyotime)；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(Taraka)。
实验仪器
生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司)；恒温水浴锅DK-8D(一恒/上海)；二氧化碳培养箱Forma 371(Thermo公司)；生化培养箱DHP-9162(一恒/上海)；高性能高速台式冷冻离心机5804R(Eppendorf/德国)；电热恒温培养箱DHP-9162(一恒/上海)；涡旋振荡器Vortex(Thermo公司)；移液器Research plus(Eppendorf/德国)；倒置显微镜DMI1(德国徕卡)；countstar细胞计数仪IC-1000(上海睿钰生物科技有限公司)；MicroAmp Optical96-Well Reaction PlateN8010560(ABI)；MicroAmpTM Optical Adhesive Film4311971(ABI)；洁净工作台SW-CJ-2FD(苏净安泰)；荧光显微镜(Leica，德国)；CO2培养箱HF240(力康)；离心机NeoFuge 1600R(力康)；高速离心机centrifuge 5840R(Eppendorf公司，德国)；DYY-6C型稳流稳压电泳仪(北京六一)；H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；FR980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)；SMA4000微量分光光度计(merinton)；PCR反应扩增仪(BIO公司)。
实施例1：pSFV-SP6-p54质粒的构建
本实施例提供了一种pSFV-SP6-p54质粒，其图谱如图1所示。上述pSFV-SP6-p54质粒的构建方法，包括以下步骤：
(1)基因合成及引物设计
根据GenBank中登陆的ASFV p54的基因序列合成flag-p54片段(其序列如SEQ IDNO：1所示)，该序列由金维智生物科技有限公司合成；采用同源重组技术设计引物tongyong-F，p54-R，用于对重组产物进行所述鉴定，其核苷酸序列见表1所示。
表1重组产物鉴定引物
引物名称 引物序列(5’-3’) 序号
tongyong-F ggtttaatgatcctcgaagatc SEQ ID NO：2
p54-R ttcaattaattacccgggttacaattctgcttttg SEQ ID NO：3
引物tongyong-F、p54-R由金唯智科技有限公司(苏州)合成。
(2)BamHI/SmaI酶切质粒pSFV-sp6-EGFP
用BamHI/SmaI内切酶对pSFV-sp6-EGFP质粒(其序列如SEQ ID NO：4所示)进行双酶切，酶切体系共300μL，分成6管，每管50μL，体系见表2所示。
表2酶切体系
Figure BDA0003224693870000051
Figure BDA0003224693870000061
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，酶切结果如图2所示(M：从上至下条带大小依次是15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500)，经双酶切后，在726bp、11045bp左右出现明显目的条带，于紫外光下将11045bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2mL的EP管中，进行胶回收，并测定DNA浓度。
(3)同源重组
将上述基因合成的flag-p54片段与经双酶切所得到的酶切载体大片段进行同源重组，于冰上配置以下反应体系，体系见表3所示：
表3同源重组反应体系
成分 体积(μL)
flag-p54片段 1
酶切载体大片段 2
5×CE 4
En 2
ddH<sub>2</sub>0 11
将上述体系轻柔摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却，得到重组产物；
(4)重组产物转化
在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞DH5α细胞，取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。
用42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μL SOC，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应含氯霉素抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀，于37℃培养箱中倒置培养12-16h。
(5)重组产物鉴定
过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中10个菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的LP培养基的2mL EP管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定，鉴定片段为1310bp，鉴定PCR体系如表4所示：
表4菌液鉴定PCR体系
成分 体积(μL)
菌液 1
tongyong-F 1
p54-R 1
Ex Taq 10
ddH<sub>2</sub>0 7
取鉴定阳性的菌液100μL于加有含氯霉素抗性的LP培养基的50mL离心管中进行大摇，过夜培养。测定结果如图3所示(M：从上至下条带大小依次是2000、1000、750、500、250、100)，其中泳道1、2、4、5、6、7、9和10的大小均为1310bp左右，与理论值大小相符合。
(6)提取质粒
1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2.取15mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
4.向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5.向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，以12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
7.向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；重复操作一次本步骤。
8.将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
9.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min，将含有重组质粒(pSFV-sp6-p54质粒)的溶液收集到离心管中。
(7)酶切鉴定及测序：
使用SmaI、BamHI内切酶对所得含有重组质粒(pSFV-sp6-p54质粒)的溶液进行双酶切，酶切体系共20μL，其体系如表5所示：
表5酶切体系
成分 体积(μL)
SmaI 0.25
BamHI 0.25
重组质粒 1.5
Quicker buffer 2
ddH<sub>2</sub>O 20
酶切结束后，进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图4所示(M：从上至下条带大小依次是8000、5000、3000、1500、1000、500)，所得片段大小分别为563bp、11557bp，与理论值大小相符合；送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果完全相同。
实施例2：复制子质粒pSFV-sp6-p54和辅助质粒SFV-heleper(其序列如SEQ IDNO：5所示)的体外转录
(1)采用SpaI酶切使pSFV-sp6-p54质粒线性化，采用SpeI酶切使SFV-helper辅助质粒线性化，反应体系如表6-7所示：
表6 SpaI酶切pSFV-sp6-p54质粒
成分 体积(μL)
SpeI 8
pSFV-sp6-p54质粒 49.1
Quicker buffer 30
ddH<sub>2</sub>0 212.9
表7 SpeI酶切SFV-helper辅助质粒
成分 体积(μL)
SpeI 9
SFV-helper辅助质粒 53
Quicker buffer 30
ddH<sub>2</sub>0 208
(2)将线性化后的pSFV-sp6-p54及SFV-heleper进行体外转录，得到相应的mRNA；使用mMESSAGE mMACHINE SP6转录试剂盒(AM1340，购自赛默飞)进行体外转录，反应体系如下表8-9所示：
表8 pSFV-sp6-p54体外转录体系
成分 体积(μL)
Nuclease-free Water 3
2×NTP/CAP 10
10×Reaction Buffer 2
线性化pSFV-sp6-p54 2
Enzyme Mix 2
表9 SFV-helper体外转录体系
成分 体积(μL)
Nuclease-free Water 4
2×NTP/CAP 10
10×Reaction Buffer 2
线性化SFV-helper 1
Enzyme Mix 2
将上述体系配好后37℃转录40min，然后加入1μL GTP，于37℃继续转录2h；随后再加入1μL TURBO DNase，于37℃反应15min。转录结束后分别吸取1μL转录产物，加入4μL的Nuclease-free Water及6×loading buffer进行稀释，无菌操作以防止RNA降解，然后在1％SDS-page中进行电泳实验，验证条带正确与否。
测试结果如图5所示(M:8000、5000、3000、1500、1000、500)，泳道3为pSFV-sp6-p54复制子质粒体外转录结果，泳道4、5为pSFV-helper辅助质粒体外转录结果，以上结果显示转录结果与理论值相符合。
(3)将pSFV-SP6-p54及SFV-heleper体外转录的mRNA共电转入BHK细胞
1.将BHK细胞提前传至T75方瓶中，当细胞汇合度达到80％时，进行实验；
2.在冰上预冷1.5mL EP管和PBS，在-20℃冰箱中预冷4mm比色杯(电极杯)；
3. 37℃预热6毫升培养基(含1％FBS DMEM)；
4.胰蛋白酶消化T25方瓶中细胞并用5毫升完全培养基重新悬浮；
5. 500g、4℃离心5分钟；
6.弃去上清液，并用10mL冰冷PBS清洗细胞颗粒；
7.500g、4℃离心5分钟，再次重复PBS清洗；
8.弃去上清液并完全去除残留的PBS，并用预冷的260μL PBS重悬细胞，混匀后分别吸取260μL的PBS细胞重悬液置于预冷的1.5mL EP管中；
9.在PBS细胞重悬液中分别加入10μL的pSFV-sp6-p54和SFV-heleper经体外转录后的mRNA，放置于冰上；
10.将上述体系转移到预冷的电极杯(4mm)中，设置电转仪条件同为100V，20ms，电击一次，电击后置于冰上1min；
11.分别向电极杯中加入约400μL的含1％FBS DMEM并吹打混匀，随即转至T25方瓶中，并加入6mL含1％FBS DMEM，放置在37℃、5％CO2培养箱中进行培养至过夜；
12.电穿孔后观察细胞生长情况，待36h后收取上清液保存于-80℃，所得细胞可产生pSFV-p54复制子颗粒。
实施例3间接免疫荧光实验
1.收集实施例2中共电转入mRNA的细胞并加入至培养板中，用预冷至4℃的甲醇固定过夜，PBST洗涤三次；正常BHK细胞用作空白对照；
2.继续加入5％1mL的BSA，37℃孵育1h后，使用PBST洗涤三次；
3.每孔加入1500倍稀释的非洲猪瘟血清，37℃孵育1h后，使用PBST洗涤三次；
4.每孔加入200倍稀释的FITC标记的山羊抗猪IgG，37℃孵育1h后，使用PBST洗涤三次,注意避光；
5.培养板置于荧光显微镜(×200)下进行观察，并与正常细胞进行对比。
测试结果如图6所示(A为实验组，B为阴性对照组)，结果发现有实验组有较强荧光表达，而阴性对照组却无荧光表达，以上结果表明ASFV p54蛋白得到表达。
实施例4pSFV-p54复制子颗粒TCID50(半数组织培养感染剂量)的测定
使用DMEM培养基将pSFV-p54复制子颗粒作连续10倍稀释，即10-1、10-2、…、10-8每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25％胰酶消化的BHK-21细胞100μL(细胞含量以105/mL左右为宜)，每个稀释度作8个重复，并设空白细胞培养对照。置37℃、5％CO2培养箱中。逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止。按照Reed-Muench法计算该病毒的TCID50，得到滴度为10-3.5TCID50/0.1mL，滴度足以满足实验要求。
实施例5 ASFV p54蛋白表达
从-80℃冰箱中取出pSFV-p54复制子颗粒，在室温下放置至完全融化，取10μLpSFV-p54复制子颗粒接种于10cm细胞培养皿中提前培养至长满80％的BHK细胞中，36h后去除细胞上清液，PBS清洗3次后，加入600μL IP细胞裂解液(碧云天，含PMSF)，用移液器轻轻吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，在冰上用枪头刮取并收集细胞，取50μL用于总蛋白Westernblot实验(其中一抗是非洲猪瘟血清，稀释倍数为1：1000，二抗为FITC标记的山羊抗猪IgG,稀释倍数为1：600)；剩余550μL用于后续Flag融合蛋白的纯化等实验，均保存于-80℃冰箱待用。
Westernblot实验测试结果如图7所示，泳道1为目的蛋白条带，约30KDa，与理论值相符合。
实施例6ASFV p54蛋白纯化
1.充分重悬Anti-Flag Affinity Gel(碧云天)，尽量形成均匀的凝胶悬液。
2.取实施例5中保存于-80℃冰箱的剩余550μL的样品，并加入120μL混合均匀的凝胶悬液。
3.冰浴并摇晃孵育，置于4℃下过夜。
4.于4℃，6000g条件下离心30s，小心去除上清。
5.加入0.5mL TBS洗涤3次，置于摇床上进行冰浴，每次5min，然后以6000g离心30s，小心去除上清。
7.在所得样品中加入100μL，3×Flag多肽洗脱液(150μg/mL)，冰浴并摇晃孵育2小时后，于4℃，6000g条件下离心30s，小心转移上清至新管中，上清即为洗脱的Flag融合蛋白；
8.将洗脱的Flag融合蛋白置于-80℃长期保存，用于后续的SDS-PAGE及Westernblot实验。取-80℃冰箱保存的纯化蛋白15μL，与等量的Loading buffer(2×)混合均匀，并置于100℃沸水中煮沸10min，然后以12000rpm、4℃离心5min，取上清20μL上样用于SDS-PAGE实验。SDS-PAGE实验结果如图8所示：泳道1为目的蛋白条带，条带大小为30KDa上下，符合理论大小范围，条带比较亮且单一无杂带。
实施例7BCA法测定纯化后的ASFV p54蛋白浓度
使用碧云天试剂盒BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定纯化后的ASFV p54蛋白浓度，包括以下步骤：
(1)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL的用量加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL，即标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。
(2)加适当体积待测ASFV p54蛋白样品到96孔板的样品孔中，若样品体积不足20μL，加标准品稀释液补足到20μL，记录样品体积具体加入量。
(3)在各孔加入200μL BCA工作液，37C放置20-30min。也可以室温放置2h，或60℃放置30min。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。
(4)用酶标仪测定A562的吸光度。
(5)根据标准曲线和使用的样品体积计算出待测ASFV p54蛋白样品的蛋白浓度。
通过BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白浓度进行测试，测试结果如图9所示。所测得标准曲线为y＝0.8935x-0.1153(R2＝0.9973)，从而得知纯化后ASFV p54蛋白浓度为300μg/mL。可用于后续包被ELISA板来检测血清样品IgG，以及作为刺激物进行ELISPOT实验来检测细胞因子。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司
<120> pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gactacaagg acgacgatga taagtccgga tccatggatt ctgaattttt tcaaccggtt 60
tatccgcggc attatggtga gtgtttgtca ccagtcacta caccaagctt cttctccaca 120
catatgtata ctattctcat tgctatcgtg gtcttagtca tcattatcat cgttctaatc 180
tatctattct cttcaagaaa gaaaaaagct gctgctattg aggaggaaga tatacagttt 240
ataaatcctt atcaagatca gcagtgggta gaagtcactc cacaaccagg tacctctaaa 300
ccagctggag cgactacagc aagtgtaggc aagccagtca cgggcagacc ggcaacaaac 360
agaccagcaa caaacaaacc agttacggac aacccagtta cggacagact agtcatggca 420
actggcgggc cggcggccgc acctgcggcc gcgagtgctc ctgctcatcc ggctgagcct 480
tacacgacag tcactactca gaacactgct tcacaaacaa tgtcggctat tgaaaattta 540
cgacaaagaa acacctatac gcataaagac ctagaaaact ccttgtaa 588
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtttaatga tcctcgaaga tc 22
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcaattaat tacccgggtt acaattctgc ttttg 35
<210> 4
<211> 11771
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggccgcca aagtgcatgt tgatattgag gctgacagcc cattcatcaa gtctttgcag 60
aaggcatttc cgtcgttcga ggtggagtca ttgcaggtca caccaaatga ccatgcaaat 120
gccagagcat tttcgcacct ggctaccaaa ttgatcgagc aggagactga caaagacaca 180
ctcatcttgg atatcggcag tgcgccttcc aggagaatga tgtctacgca caaataccac 240
tgcgtatgcc ctatgcgcag cgcagaagac cccgaaaggc tcgtatgcta cgcaaagaaa 300
ctggcagcgg cctccgggaa ggtgctggat agagagatcg caggaaaaat caccgacctg 360
cagaccgtca tggctacgcc agacgctgaa tctcctacct tttgcctgca tacagacgtc 420
acgtgtcgta cggcagccga agtggccgta taccaggacg tgtatgctgt acatgcacca 480
acatcgctgt accatcaggc gatgaaaggt gtcagaacgg cgtattggat tgggtttgac 540
accaccccgt ttatgtttga cgcgctagca ggcgcgtatc caacctacgc cacaaactgg 600
gccgacgagc aggtgttaca ggccaggaac ataggactgt gtgcagcatc cttgactgag 660
ggaagactcg gcaaactgtc cattctccgc aagaagcaat tgaaaccttg cgacacagtc 720
atgttctcgg taggatctac attgtacact gagagcagaa agctactgag gagctggcac 780
ttaccctccg tattccacct gaaaggtaaa caatccttta cctgtaggtg cgataccatc 840
gtatcatgtg aagggtacgt agttaagaaa atcactatgt gccccggcct gtacggtaaa 900
acggtagggt acgccgtgac gtatcacgcg gagggattcc tagtgtgcaa gaccacagac 960
actgtcaaag gagaaagagt ctcattccct gtatgcacct acgtcccctc aaccatctgt 1020
gatcaaatga ctggcatact agcgaccgac gtcacaccgg aggacgcaca gaagttgtta 1080
gtgggattga atcagaggat agttgtgaac ggaagaacac agcgaaacac taacacgatg 1140
aagaactatc tgcttccgat tgtggccgtc gcatttagca agtgggcgag ggaatacaag 1200
gcagaccttg atgatgaaaa acctctgggt gtccgagaga ggtcacttac ttgctgctgc 1260
ttgtgggcat ttaaaacgag gaagatgcac accatgtaca agaaaccaga cacccagaca 1320
atagtgaagg tgccttcaga gtttaactcg ttcgtcatcc cgagcctatg gtctacaggc 1380
ctcgcaatcc cagtcagatc acgcattaag atgcttttgg ccaagaagac caagcgagag 1440
ttaatacctg ttctcgacgc gtcgtcagcc agggatgctg aacaagagga gaaggagagg 1500
ttggaggccg agctgactag agaagcctta ccacccctcg tccccatcgc gccggcggag 1560
acgggagtcg tcgacgtcga cgttgaagaa ctagagtatc acgcaggtgc aggggtcgtg 1620
gaaacacctc gcagcgcgtt gaaagtcacc gcacagccga acgacgtact actaggaaat 1680
tacgtagttc tgtccccgca gaccgtgctc aagagctcca agttggcccc cgtgcaccct 1740
ctagcagagc aggtgaaaat aataacacat aacgggaggg ccggccgtta ccaggtcgac 1800
ggatatgacg gcagggtcct actaccatgt ggatcggcca ttccggtccc tgagtttcaa 1860
gctttgagcg agagcgccac tatggtgtac aacgaaaggg agttcgtcaa caggaaacta 1920
taccatattg ccgttcacgg accgtcgctg aacaccgacg aggagaacta cgagaaagtc 1980
agagctgaaa gaactgacgc cgagtacgtg ttcgacgtag ataaaaaatg ctgcgtcaag 2040
agagaggaag cgtcgggttt ggtgttggtg ggagagctaa ccaacccccc gttccatgaa 2100
ttcgcctacg aagggctgaa gatcaggccg tcggcaccat ataagactac agtagtagga 2160
gtctttgggg ttccgggatc aggcaagtct gctattatta agagcctcgt gaccaaacac 2220
gatctggtca ccagcggcaa gaaggagaac tgccaggaaa tagtcaacga cgtgaagaag 2280
caccgcggac tggacatcca ggcaaaaaca gtggactcca tcctgctaaa cgggtgtcgt 2340
cgtgccgtgg acatcctata tgtggacgag gctttcgctt gccattccgg tactctgcta 2400
gccctaattg ctcttgttaa acctcggagc aaagtggtgt tatgcggaga ccccaagcaa 2460
tgcggattct tcaatatgat gcagcttaag gtgaacttca accacaacat ctgcactgaa 2520
gtatgtcata aaagtatatc cagacgttgc acgcgtccag tcacggccat cgtgtctacg 2580
ttgcactacg gaggcaagat gcgcacgacc aacccgtgca acaaacccat aatcatagac 2640
accacaggac agaccaagcc caagccagga gacatcgtgt taacatgctt ccgaggctgg 2700
gtaaagcagc tgcagttgga ctaccgtgga cacgaagtca tgacagcagc agcatctcag 2760
ggcctcaccc gcaaaggggt atacgccgta aggcagaagg tgaatgaaaa tcccttgtat 2820
gcccctgcgt cggagcacgt gaatgtactg ctgacgcgca ctgaggatag gctggtgtgg 2880
aaaacgctgg ccggcgatcc ctggattaag gtcctatcaa acattccaca gggtaacttt 2940
acggccacat tggaagaatg gcaagaagaa cacgacaaaa taatgaaggt gattgaagga 3000
ccggctgcgc ctgtggacgc gttccagaac aaagcgaacg tgtgttgggc gaaaagcctg 3060
gtgcctgtcc tggacactgc cggaatcaga ctcactgcag aagagtggag cacgattatt 3120
acagcattta aggaggacag agcttactct ccagtggtgg ccttgaatga aatttgcacc 3180
aagtactatg gagttgacct ggacagtggc ctgttttctg ccccgaaggt gtccctgtat 3240
tacgagaaca accactggga taacagacct ggtggaagga tgtatggatt caatgccgca 3300
acagctgcca ggctggaagc tagacatacc ttcctgaagg ggcagtggca tacgggcaag 3360
caggcagtta tcgcagaaag aaaaatccaa ccgctttctg tgctggacaa tgtaattcct 3420
atcaaccgca ggctgccgca cgccctggtg gctgagtaca agacggttaa aggcagtagg 3480
gttgagtggc tggtcaataa agtaagaggg taccacgtcc tgctggtgag tgagtacaac 3540
ctggctttgc ctcgacgcag ggtcacttgg ttgtcaccgc tgaatgtcac aggcgccgat 3600
aggtgctacg acctaagttt aggactgccg gctgacgccg gcaggttcga cttggtcttt 3660
gtgaacattc acacggaatt cagaatccac cactaccagc agtgtgtcga ccacgccatg 3720
aagctgcaga tgcttggggg agatgcgcta cgactgctaa aacccggcgg cagcctcttg 3780
atgagagctt acggatacgc cgataaaatc agcgaagccg ttgtttcctc cttaagcaga 3840
aagttctcgt ctgcaagagt gttgcgcccg gattgtgtca ccagcaatac agaagtgttc 3900
ttgctgttct ccaacttcga taacggaaag aggccctcaa ccttacacca gatgaatacc 3960
aagctgagtg ccgtgtatgc cggagaagcc atgcacacgg ccgggtgtgc accatcctac 4020
agagttaaga gagcagacat agccacgtgc acagaagcgg ctgtggttaa cgcagctaac 4080
gcccgtggaa ctgtagggga tggcgtatgc agggccgtgg cgaagaaatg gccgtcagcc 4140
tttaagggag aagcaacacc agtgggcaca attaaaacag tcatgtgcgg ctcgtacccc 4200
gtcatccacg ctgtagcgcc taatttctct gccacgactg aagcggaagg ggaccgcgaa 4260
ttggccgctg tctaccgggc agtggccgcc gaagtaaaca gactgtcact gagcagcgta 4320
gccatcccgc tgctgtccac aggagtgttc agcggcggaa gagataggct gcagcaatcc 4380
ctcaaccatc tattcacagc aatggacgcc acggacgctg acgtgaccat ctactgcaga 4440
gacaaaagtt gggagaagaa aatccaggaa gccatagaca tgaggacggc tgtggagttg 4500
ctcaatgatg acgtggagct gaccacagac ttggtgagag tgcacccgga cagcagcctg 4560
gtgggtcgta agggctacag taccactgac gggtcgctgt actcgtactt tgaaggtacg 4620
aaattcaacc aggctgctat tgatatggca gagatactga cgttgtggcc cagactgcaa 4680
gaggcaaacg aacagatatg cctatacgcg ctgggcgaaa caatggacaa catcagatcc 4740
aaatgtccgg tgaacgattc cgattcatca acacctccca ggacagtgcc ctgcctgtgc 4800
cgctacgcaa tgacagcaga acggatcgcc cgccttaggt cacaccaagt taaaagcatg 4860
gtggtttgct catcttttcc cctcccgaaa taccatgtag atggggtgca gaaggtaaag 4920
tgcgagaagg ttctcctgtt cgacccgacg gtaccttcag tggttagtcc gcggaagtat 4980
gccgcatcta cgacggacca ctcagatcgg tcgttacgag ggtttgactt ggactggacc 5040
accgactcgt cttccactgc cagcgatacc atgtcgctac ccagtttgca gtcgtgtgac 5100
atcgactcga tctacgagcc aatggctccc atagtagtga cggctgacgt acaccctgaa 5160
cccgcaggca tcgcggacct ggcggcagat gtgcatcctg aacccgcaga ccatgtggac 5220
ctcgagaacc cgattcctcc accgcgcccg aagagagctg cataccttgc ctcccgcgcg 5280
gcggagcgac cggtgccggc gccgagaaag ccgacgcctg ccccaaggac tgcgtttagg 5340
aacaagctgc ctttgacgtt cggcgacttt gacgagcacg aggtcgatgc gttggcctcc 5400
gggattactt tcggagactt cgacgacgtc ctgcgactag gccgcgcggg tgcatatatt 5460
ttctcctcgg acactggcag cggacattta caacaaaaat ccgttaggca gcacaatctc 5520
cagtgcgcac aactggatgc ggtcgaggag gagaaaatgt acccgccaaa attggatact 5580
gagagggaga agctgttgct gctgaaaatg cagatgcacc catcggaggc taataagagt 5640
cgataccagt ctcgcaaagt ggagaacatg aaagccacgg tggtggacag gctcacatcg 5700
ggggccagat tgtacacggg agcggacgta ggccgcatac caacatacgc ggttcggtac 5760
ccccgccccg tgtactcccc taccgtgatc gaaagattct caagccccga tgtagcaatc 5820
gcagcgtgca acgaatacct atccagaaat tacccaacag tggcgtcgta ccagataaca 5880
gatgaatacg acgcatactt ggacatggtt gacgggtcgg atagttgctt ggacagagcg 5940
acattctgcc cggcgaagct ccggtgctac ccgaaacatc atgcgtacca ccagccgact 6000
gtacgcagtg ccgtcccgtc accctttcag aacacactac agaacgtgct agcggccgcc 6060
accaagagaa actgcaacgt cacgcaaatg cgagaactac ccaccatgga ctcggcagtg 6120
ttcaacgtgg agtgcttcaa gcgctatgcc tgctccggag aatattggga agaatatgct 6180
aaacaaccta tccggataac cactgagaac atcactacct atgtgaccaa attgaaaggc 6240
ccgaaagctg ctgccttgtt cgctaagacc cacaacttgg ttccgctgca ggaggttccc 6300
atggacagat tcacggtcga catgaaacga gatgtcaaag tcactccagg gacgaaacac 6360
acagaggaaa gacccaaagt ccaggtaatt caagcagcgg agccattggc gaccgcttac 6420
ctgtgcggca tccacaggga attagtaagg agactaaatg ctgtgttacg ccctaacgtg 6480
cacacattgt ttgatatgtc ggccgaagac tttgacgcga tcatcgcctc tcacttccac 6540
ccaggagacc cggttctaga gacggacatt gcatcattcg acaaaagcca ggacgactcc 6600
ttggctctta caggtttaat gatcctcgaa gatctagggg tggatcagta cctgctggac 6660
ttgatcgagg cagcctttgg ggaaatatcc agctgtcacc taccaactgg cacgcgcttc 6720
aagttcggag ctatgatgaa atcgggcatg tttctgactt tgtttattaa cactgttttg 6780
aacatcacca tagcaagcag ggtactggag cagagactca ctgactccgc ctgtgcggcc 6840
ttcatcggcg acgacaacat cgttcacgga gtgatctccg acaagctgat ggcggagagg 6900
tgcgcgtcgt gggtcaacat ggaggtgaag atcattgacg ctgtcatggg cgaaaaaccc 6960
ccatattttt gtgggggatt catagttttt gacagcgtca cacagaccgc ctgccgtgtt 7020
tcagacccac ttaagcgcct gttcaagttg ggtaagccgc taacagctga agacaagcag 7080
gacgaagaca ggcgacgagc actgagtgac gaggttagca agtggttccg gacaggcttg 7140
ggggccgaac tggaggtggc actaacatct aggtatgagg tagagggctg caaaagtatc 7200
ctcatagcca tggccacctt ggcgagggac attaaggcgt ttaagaaatt gagaggacct 7260
gttatacacc tctacggcgg tcctagattg gtgcgttaat acacagaatt ctgattatag 7320
cgcactatta tagcaccgga tcccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 7380
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 7440
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 7500
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 7560
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 7620
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 7680
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 7740
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 7800
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 7860
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 7920
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 7980
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 8040
ggcatggacg agctgtacaa gcccgggtaa ttaattgaat tacatcccta cgcaaacgtt 8100
ttacggccgc cggtggcgcc cgcgcccggc ggcccgtccc tggccgttgc aggccactcc 8160
ggtggctccc gtcgtccccg acttccaggc ccagcagatg cagcaactca tcagcgccgt 8220
aaatgcgctg acaatgagac agaacgcaat tgctcctgct aggcctccca aaccaaagaa 8280
gaagaagaca accaaaccaa agccgaaaac gcagcccaag aagatcaacg gaaaaacgca 8340
gcagcaaaag aagaaagaca agcaagccga caagaagaag aagaaacccg gaaaaagaga 8400
aagaatgtgc atgaagattg aaaatgactg tatctatgcg gctagccaca gtaacgtagt 8460
gtttccagac atgtcgggca ccgcactatc atgggtgcag aaaatctcgg gtggtctggg 8520
ggccttcgca atcggcgcta tcctggtgct ggttgtggtc acttgcattg ggctccgcag 8580
ataagttagg gtaggcaatg gcattgatat agcaagaaaa ttgaaaacag aaaaagttag 8640
ggtaagcaat ggcatataac cataactgta taacttgtaa caaagcgcaa caagacctgc 8700
gcaattggcc ccgtggtccg cctcacggaa actcggggca actcatattg acacattaat 8760
tggcaataat tggaagctta cataagctta attcgacgaa taattggatt tttattttat 8820
tttgcaattg gtttttaata tttccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactagt ctgcattaat gaatcggcca 8940
acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 9000
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 9060
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 9120
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 9180
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 9240
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 9300
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 9360
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 9420
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 9480
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 9540
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 9600
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 9660
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 9720
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 9780
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 9840
cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 9900
aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 9960
atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 10020
cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 10080
tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 10140
atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 10200
taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 10260
tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 10320
gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 10380
cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 10440
cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 10500
gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 10560
aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 10620
accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 10680
ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 10740
gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 10800
aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 10860
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 10920
cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc 10980
gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc 11040
ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg 11100
cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca 11160
ttcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc 11220
cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc 11280
cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc 11340
gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg 11400
cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat ctggctagcg atgaccctgc 11460
tgattggttc gctgaccatt tccgggtgcg ggacggcgtt accagaaact cagaaggttc 11520
gtccaaccaa accgactctg acggcagttt acgagagaga tgatagggtc tgcttcagta 11580
agccagatgc tacacaatta ggcttgtaca tattgtcgtt agaacgcggc tacaattaat 11640
acataacctt atgtatcata cacatacgat ttaggtgaca ctatagatgg cggatgtgtg 11700
acatacacga cgccaaaaga ttttgttcca gctcctgcca cctccgctac gcgagagatt 11760
aaccacccac g 11771
<210> 5
<211> 8192
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atttaggtga cactatagat ggcggatgtg tgacatacac gacgccaaaa gattttgttc 60
cagctcctgc cacctccgct acgcgagaga ttaaccaccc acgatggccg ccaaagtgca 120
tgttgatatt gaggctgaca gcccattcat caagtctttg cagaaggcat ttccgtcgtt 180
cgaggtggag tcattgcagg tcacaccaaa tgaccatgca aatgccagag cattttcgca 240
cctggctacc aaattgatcg agcaggagac tgacaaagac acactcatct tggatatcgg 300
cagtgcgcct tccaggagaa tgatgtcgac atgaaacgag atgtcaaagt cactccaggg 360
acgaaacaca cagaggaaag acccaaagtc caggtaattc aagcagcgga gccattggcg 420
accgcttacc tgtgcggcat ccacagggaa ttagtaagga gactaaatgc tgtgttacgc 480
cctaacgtgc acacattgtt tgatatgtcg gccgaagact ttgacgcgat catcgcctct 540
cacttccacc caggagaccc ggttctagag acggacattg catcattcga caaaagccag 600
gacgactcct tggctcttac aggtttaatg atcctcgaag atctaggggt ggatcagtac 660
ctgctggact tgatcgaggc agcctttggg gaaatatcca gctgtcacct accaactggc 720
acgcgcttca agttcggagc tatgatgaaa tcgggcatgt ttctgacttt gtttattaac 780
actgttttga acatcaccat agcaagcagg gtactggagc agagactcac tgactccgcc 840
tgtgcggcct tcatcggcga cgacaacatc gttcacggag tgatctccga caagctgatg 900
gcggagaggt gcgcgtcgtg ggtcaacatg gaggtgaaga tcattgacgc tgtcatgggc 960
gaaaaacccc catatttttg tgggggattc atagtttttg acagcgtcac acagaccgcc 1020
tgccgtgttt cagacccact taagcgcctg ttcaagttgg gtaagccgct aacagctgaa 1080
gacaagcagg acgaagacag gcgacgagca ctgagtgacg aggttagcaa gtggttccgg 1140
acaggcttgg gggccgaact ggaggtggca ctaacatcta ggtatgaggt agagggctgc 1200
aaaagtatcc tcatagccat ggccaccttg gcgagggaca ttaaggcgtt taagaaattg 1260
agaggacctg ttatacacct ctacggcggt cctagattgg tgcgttaata cacagaattc 1320
tgattatagc gcactattat agcaccatga attacatccc tacgcaaacg ttttacggcc 1380
gccggtggcg cccgcgcccg gcggcccgtc cctggccgtt gcaggccact ccggtggctc 1440
ccgtcgtccc cgacttccag gcccagcaga tgcagcaact catcagcgcc gtaaatgcgc 1500
tgacaatgag acagaacgca attgctcctg ctaggcctcc caaaccaaag aagaagaaga 1560
caaccaaacc aaagccgaaa acgcagccca agaagatcaa cggaaaaacg cagcagcaaa 1620
agaagaaaga caagcaagcc gacaagaaga agaagaaacc cggaaaaaga gaaagaatgt 1680
gcatgaagat tgaaaatgac tgtatcttcg aagtcaaaca cgaaggaaag gtcactgggt 1740
acgcctgcct ggtgggcgac aaagtcatga aacctgccca cgtgaaagga gtcatcgaca 1800
acgcggacct ggcaaagcta gctttcaaga aatcgagcaa gtatgacctt gagtgtgccc 1860
agataccagt tcacatgagg tcggatgcct caaagtacac gcatgagaag cccgagggac 1920
actataactg gcaccacggg gctgttcagt acagcggagg taggttcact ataccgacag 1980
gagcgggcaa accgggagac agtggccggc ccatctttga caacaagggt agggtagtcg 2040
ctatcgtcct gggcggggcc aacgagggct cacgcacagc actgtcggtg gtcacctgga 2100
acaaagatat ggtgactaga gtgacccccg aggggtccga agagtggtcc gccccgctga 2160
ttactgccat gtgtgtcctt gccaatgcta ccttcccgtg cttccagccc ccgtgtgtac 2220
cttgctgcta tgaaaacaac gcagaggcca cactacggat gctcgaggat aacgtggata 2280
ggccagggta ctacgacctc cttcaggcag ccttgacgtg ccgaaacgga acaagacacc 2340
ggcgcagcgt gtcgcaacac ttcaacgtgt ataaggctac acgcccttac atcgcgtact 2400
gcgccgactg cggagcaggg cactcgtgtc atagccccgt agcaattgaa gcggtcaggt 2460
ccgaagctac cgacgggatg ctgaagattc agttctcggc acaaattggc atagataaga 2520
gtgacaatca tgactacacg aagataaggt acgcagacgg gcacgccatt gagaatgccg 2580
tccggtcatc tttgaaggta gccacctccg gagactgttt cgtccatggc acaatgggac 2640
atttcatact ggcaaagtgc ccaccgggtg aattcctgca ggtctcgatc caggacacca 2700
gaaacgcggt ccgtgcctgc agaatacaat atcatcatga ccctcaaccg gtgggtagag 2760
aaaaatttac aattagacca cactatggaa aagagatccc ttgcaccact tatcaacaga 2820
ccacagcgaa gaccgtggag gaaatcgaca tgcatatgcc gccagatacg ccggacagga 2880
cgttgctatc acagcaatct ggcaatgtaa agatcacagt cggaggaaag aaggtgaaat 2940
acaactgcac ctgtggaacc ggaaacgttg gcactactaa ttcggacatg acgatcaaca 3000
cgtgtctaat agagcagtgc cacgtctcag tgacggacca taagaaatgg cagttcaact 3060
cacctttcgt cccgagagcc gacgaaccgg ctagaaaagg caaagtccat atcccattcc 3120
cgttggacaa catcacatgc agagttccaa tggcgcgcga accaaccgtc atccacggca 3180
aaagagaagt gacactgcac cttcacccag atcatcccac gctcttttcc taccgcacac 3240
tgggtgagga cccgcagtat cacgaggaat gggtgacagc ggcggtggaa cggaccatac 3300
ccgtaccagt ggacgggatg gagtaccact ggggaaacaa cgacccagtg aggctttggt 3360
ctcaactcac cactgaaggg aaaccgcacg gctggccgca tcagatcgta cagtactact 3420
atgggcttta cccggccgct acagtatccg cggtcgtcgg gatgagctta ctggcgttga 3480
tatcgatctt cgcgtcgtgc tacatgctgg ttgcggcccg cagtaagtgc ttgacccctt 3540
atgctttaac accaggagct gcagttccgt ggacgctggg gatactctgc tgcgccccgc 3600
gggcgcacgc agctagtgtg gcagagacta tggcctactt gtgggaccaa aaccaagcgt 3660
tgttctggtt ggagtttgcg gcccctgttg cctgcatcct catcatcacg tattgcctca 3720
gaaacgtgct gtgttgctgt aagagccttt cttttttagt gctactgagc ctcggggcaa 3780
ccgccagagc ttacgaacat tcgacagtaa tgccgaacgt ggtggggttc ccgtataagg 3840
ctcacattga aaggccagga tatagccccc tcactttgca gatgcaggtt gttgaaacca 3900
gcctcgaacc aacccttaat ttggaataca taacctgtga gtacaagacg gtcgtcccgt 3960
cgccgtacgt gaagtgctgc ggcgcctcag agtgctccac taaagagaag cctgactacc 4020
aatgcaaggt ttacacaggc gtgtacccgt tcatgtgggg aggggcatat tgcttctgcg 4080
actcagaaaa cacgcaactc agcgaggcgt acgtcgatcg atcggacgta tgcaggcatg 4140
atcacgcatc tgcttacaaa gcccatacag catcgctgaa ggccaaagtg agggttatgt 4200
acggcaacgt aaaccagact gtggatgttt acgtgaacgg agaccatgcc gtcacgatag 4260
ggggtactca gttcatattc gggccgctgt catcggcctg gaccccgttc gacaacaaga 4320
tagtcgtgta caaagacgaa gtgttcaatc aggacttccc gccgtacgga tctgggcaac 4380
cagggcgctt cggcgacatc caaagcagaa cagtggagag taacgacctg tacgcgaaca 4440
cggcactgaa gctggcacgc ccttcacccg gcatggtcca tgtaccgtac acacagacac 4500
cttcagggtt caaatattgg ctaaaggaaa aagggacagc cctaaatacg aaggctcctt 4560
ttggctgcca aatcaaaacg aaccctgtca gggccatgaa ctgcgccgtg ggaaacatcc 4620
ctgtctccat gaatttgcct gacagcgcct ttacccgcat tgtcgaggcg ccgaccatca 4680
ttgacctgac ttgcacagtg gctacctgta cgcactcctc ggatttcggc ggcgtcttga 4740
cactgacgta caagaccgac aagaacgggg actgctctgt acactcgcac tctaacgtag 4800
ctactctaca ggaggccaca gcaaaagtga agacagcagg taaggtgacc ttacacttct 4860
ccacggcaag cgcatcacct tcttttgtgg tgtcgctatg cagtgctagg gccacctgtt 4920
cagcgtcgtg tgagcccccg aaagaccaca tagtcccata tgcggctagc cacagtaacg 4980
tagtgtttcc agacatgtcg ggcaccgcac tatcatgggt gcagaaaatc tcgggtggtc 5040
tgggggcctt cgcaatcggc gctatcctgg tgctggttgt ggtcacttgc attgggctcc 5100
gcagataagt tagggtaggc aatggcattg atatagcaag aaaattgaaa acagaaaaag 5160
ttagggtaag caatggcata taaccataac tgtataactt gtaacaaagc gcaacaagac 5220
ctgcgcaatt ggccccgtgg tccgcctcac ggaaactcgg ggcaactcat attgacacat 5280
taattggcaa taattggaag cttacataag cttaattcga cgaataattg gatttttatt 5340
ttattttgca attggttttt aatatttcca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac tagtctgcat taatgaatcg 5460
gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 5520
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 5580
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 5640
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 5700
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 5760
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 5820
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 5880
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 5940
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 6000
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 6060
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 6120
gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 6180
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 6240
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 6300
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 6360
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 6420
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 6480
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 6540
agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 6600
cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 6660
ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 6720
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 6780
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 6840
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 6900
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 6960
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 7020
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 7080
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 7140
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 7200
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 7260
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 7320
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 7380
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 7440
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 7500
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 7560
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 7620
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 7680
accattcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag tagtaggttg 7740
aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt 7800
cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag 7860
tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct 7920
gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatctggct agcgatgacc 7980
ctgctgattg gttcgctgac catttccggg tgcgggacgg cgttaccaga aactcagaag 8040
gttcgtccaa ccaaaccgac tctgacggca gtttacgaga gagatgatag ggtctgcttc 8100
agtaagccag atgctacaca attaggcttg tacatattgt cgttagaacg cggctacaat 8160
taatacataa ccttatgtat catacacata cg 8192

Claims (10)

1.一种pSFV-p54复制子颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以pSFV-sp6-EGFP质粒和flag-p54基因为材料，构建得到pSFV-sp6-p54质粒；所述flag-p54基因如SEQ ID NO：1所示；
(2)分别将SFV-helper辅助质粒和所述pSFV-sp6-p54质粒线性化并进行体外转录，将所得mRNA共电转入BHK细胞或Vero细胞中，得到pSFV-p54复制子颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：
使用BamHI/SmaI内切酶对pSFV-sp6-EGFP质粒进行双酶切，将酶切产物与flag-p54基因进行同源重组，得到重组产物；将所述重组产物导入感受态细胞，鉴定，提取得到pSFV-sp6-p54质粒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，采用如SEQ ID NO：2-3所示的引物对重组产物进行所述鉴定。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述感受态细胞为DH5α细胞或Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)还包括对所述pSFV-sp6-p54质粒进行酶切鉴定及测序的操作。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中采用SpaI酶切使所述pSFV-sp6-p54质粒线性化，采用SpeI酶切使所述SFV-helper辅助质粒线性化。
7.一种pSFV-p54复制子颗粒，其特征在于，由权利要求1-6中任一项所述的制备方法所制得。
8.权利要求7所述的pSFV-p54复制子颗粒在表达非洲猪瘟病毒p54蛋白中的应用。
9.权利要求7所述的pSFV-p54复制子颗粒在制备RNA疫苗中的应用。
10.一种非洲猪瘟疫苗，其特征在于，包含权利要求7所述的pSFV-p54复制子颗粒。
CN202110968210.XA 2021-08-23 2021-08-23 pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用 Pending CN113652405A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110968210.XA CN113652405A (zh) 2021-08-23 2021-08-23 pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110968210.XA CN113652405A (zh) 2021-08-23 2021-08-23 pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113652405A true CN113652405A (zh) 2021-11-16

Family

ID=78492015

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110968210.XA Pending CN113652405A (zh) 2021-08-23 2021-08-23 pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113652405A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115094088A (zh) * 2022-04-19 2022-09-23 华南农业大学 一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050221493A1 (en) * 2002-12-04 2005-10-06 Crucell Holland B.V. Recombinant virus production for the manufacturing of vaccines
IN2012DE03411A (zh) * 2012-11-06 2015-06-26 M S Indian Council Of Medical Res
CN105176936A (zh) * 2015-10-23 2015-12-23 中国科学院武汉物理与数学研究所 复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用
CN111004330A (zh) * 2019-12-13 2020-04-14 天津大学 一种制备非洲猪瘟病毒p30、p54酵母疫苗的方法
CN111662916A (zh) * 2020-06-15 2020-09-15 畜科生物工程有限公司 表达非洲猪瘟病毒p54、p30、E248R蛋白的重组腺病毒及构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050221493A1 (en) * 2002-12-04 2005-10-06 Crucell Holland B.V. Recombinant virus production for the manufacturing of vaccines
IN2012DE03411A (zh) * 2012-11-06 2015-06-26 M S Indian Council Of Medical Res
CN105176936A (zh) * 2015-10-23 2015-12-23 中国科学院武汉物理与数学研究所 复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用
CN111004330A (zh) * 2019-12-13 2020-04-14 天津大学 一种制备非洲猪瘟病毒p30、p54酵母疫苗的方法
CN111662916A (zh) * 2020-06-15 2020-09-15 畜科生物工程有限公司 表达非洲猪瘟病毒p54、p30、E248R蛋白的重组腺病毒及构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI N 等: "A Semliki Forest virus replicon vectored DNA vaccine expressing the E2 glycoprotein of classical swine fever virus protects pigs from lethal challenge", 《VACCINE》, vol. 25, no. 15, pages 2908 *
MURGIA 等: "Evaluation of an African swine fever (ASF) vaccine strategy incorporating priming with an alphavirus-expressed antigen followed by boosting with attenuated ASF virus", 《ARCH VIROL》, vol. 164, no. 2, pages 360 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115094088A (zh) * 2022-04-19 2022-09-23 华南农业大学 一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101405389A (zh) 新型蛋白质表达系统
CN108715861B (zh) 一种碱基编辑工具及其应用
CN101984061B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆疫苗株及其应用
CN113549618B (zh) 基于RAA扩增和CRISPR-Cas13a系统的SARS-CoV-2核酸检测方法
US20050260625A1 (en) Process and system for crosslinking polynucleotide molecules
CN113481327B (zh) 基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法
CN108395996B (zh) 一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途
CZ24196A3 (en) Vaccine preparations
CN100475964C (zh) Hcv复制子穿梭载体
CN113604505A (zh) pSFV-p32病毒样颗粒及其制备方法和应用
CN113652405A (zh) pSFV-p54复制子颗粒及其制备方法与应用
CN104651402B (zh) 通用型基因打靶载体
CN107937428B (zh) 一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法
KR20230136172A (ko) 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물
CN107661496A (zh) 一种猪细小病毒免疫组合物及其制备方法与应用
CN113862299B (zh) 一种用于同源重组的载体及其应用
CN114533862B (zh) 一种鱼用dna疫苗及其制备方法与应用
CN113073097B (zh) 一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子及其应用
CN112301059A (zh) 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-nk转基因载体及其构建方法和应用
CN112725211A (zh) 一种毕赤酵母重组菌、培养方法及用途
US20220307050A1 (en) Non-viral transgenesis
CN113549652A (zh) SFV-helper质粒、pSFVCs-LacZ病毒样颗粒及其制备方法和应用
CN111378718A (zh) 一种基因测序文库的构建方法
CN114836461B (zh) 表达胶原蛋白酶的重组质粒、酵母菌株及其发酵培养基和发酵培养方法
CN110607380B (zh) 桑树植原体ltrA基因及其在桑树植原体分子检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination