KR20230136172A - 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한, 특히 동물 숙주에서 내인성 시토카인, 특히 내인성 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31 및 IL-33 단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백신 조성물은 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA 및 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 폴리단백질은 숙주의 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 적어도 2개의 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함한다. 본 발명은 추가로 소양성 상태 및/또는 알레르기성 상태의 예방 및/또는 치료를 포함한, 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 조성물의 용도에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물로 생성될 수 있는 자기-단백질에 대한 자가항체의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한, 특히 포유동물 숙주에서 내인성 시토카인, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 및 TNF-알파 단백질로부터 유래된 시토카인, 특히 내인성 IL-31 단백질을 포함하는 시토카인의 조합에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 소양성 상태 및/또는 알레르기성 상태의 예방 및/또는 치료를 포함한, 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 자기-단백질로부터 유래되고 백신 조성물에서 면역원으로서 사용되는 폴리단백질에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물로 생성될 수 있는 자기-단백질에 대한 자가항체의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
백신은 감염성 질환의 예방 및/또는 치료에 가장 중요하다. 그러나, 백신 기술은 또한 비감염성, 종종 만성 질환, 예컨대 알레르기, 자가면역 질환 및 암의 예방 및/또는 치료에 점점 더 중요해지고 있다. 이들 질환에 대한 표적은 일반적으로 외래 분자가 아니라, 대신 자기-단백질 또는 다른 자기-항원이다. 면역계는 모든 자기-단백질 및 자기-항원에 대한 관용을 보장하도록 진화하였기 때문에, 자기-단백질에 대해 백신접종하는 것은 매우 어렵다. 본 발명의 기저 연구는 자기-관용을 회피하거나 파괴하는 방식을 찾는 것을 목표로 하였다.
자가반응성 B 세포는 순환계에 낮은 수준으로 존재할 수 있지만, 주로 T-세포 도움의 결여로 인해 확장하지 않거나 어떠한 해도 유발하지 않는다. 대조적으로, 발생하는 임의의 자기-반응성 T 세포는 흉선에서 클론 결실되거나 또는 말초에서 무반응화된다. 그러나, 자기-항원이 외래 (비-자기) 단백질 또는 그의 부분에 공유 커플링된 경우 (자기 및 비-자기 단백질 또는 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질이 제공된다는 것을 의미함), 비-자기-단백질 (부분)에 특이적인 T-세포가 동원되고 활성화된다는 것이 공지되어 있다.
동시에, 자가반응성 B 세포는 자기 및 비-자기 단백질/단백질 부분을 함유하는 융합 단백질을 선택적으로 흡수할 수 있고, 따라서 자기 및 외래 펩티드 둘 다를 MHC 부류 II 분자 상에 제시할 수 있다. 이어서, 자가반응성 B 세포에 의해 제시된 비-자기 펩티드는 활성화된 T-세포에 의해 인식되며, 이는 자가반응성 B 세포를 자극하여 확장시키고, 자기-단백질/자기-항원에 대한 면역 반응을 개시한다. 면역 반응이 충분히 강한 경우에, 이들 자기-생산된 항체는 표적 자기-단백질의 수준을 감소시키는 능력을 갖는다. 자기-단백질이 질환의 원인이 되거나 또는 질환에 기여하는 표적으로서 선택되는 경우에, 생체내 생성된 자가항체는 표적 자기-단백질을 중화시킴으로써 치료 항체로서 작용할 수 있다. 그러나, 이러한 강건한 면역 반응은 얻기 어렵다.
알레르기, 자가면역, 암 및 AIDS를 포함한 다양한 병리상태에서, 시토카인의 비정상적 방출은 발병기전 및/또는 질환 진행에 기여한다. 전형적으로, 다수의 상이한 시토카인이 병리상태에 관여한다.
아토피성 피부염은, 예를 들어 인터류킨 (IL)-4, IL-5, IL-13 및 IL-31을 포함한 유형 2 시토카인의 강건한 발현, 및 다른 시토카인, 특히 IL-22 및 IL-33, 뿐만 아니라 IL-17, IL-9 및 IFN-γ의 가변적 활성화와 함께, 이상 및 과도한 Th2 세포 및 ILC2 활성화를 특징으로 하는 빈번한 알레르기성 피부 장애이다 (Moyle et al. (2019) Experimental Dermatology, 28:756-768; Renert-Yuval & Guttman-Yassky (2019) Dermatol Clin 37:205-213). 아토피성 피부염은 인간에서뿐만 아니라 동물, 특히 개에서도 빈번한 장애이다. 실제로, 아토피성 피부염은 개에서 가장 흔한 알레르기이고, 개 집단의 대략 10%에 영향을 미쳐, 유럽 및 미국 단독에서만 그 질환을 앓고 있는 개가 1천5백만 내지 2천만마리이다 (Griffin, et al. (2001), "The ACVD task force on canine atopic dermatitis (XIV): clinical manifestations of canine atopic dermatitis", Veterinary immunology and immunopathology, 81(3-4), 255-269). 이러한 알레르기성 피부 질환에 의해 유발되는 가려움증 또는 소양증은 통상적으로 재발성 또는 만성이다. 이는 개 및 그의 소유자 둘 다에 대한 삶의 질에 깊게 영향을 미친다.
특히, 내인성 소양증유발원인 인터류킨-31 (IL-31)은 아토피성 가려움증에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. IL-31은 인간 및 개의 아토피성 피부염에서의 소양증의 주요 조절인자인 것으로 보이기 때문에 (Sonkoly et al., "IL-31: a new link between T cells and pruritus in atopic skin inflammation", Journal of Allergy and Clinical Immunology 117.2 (2006): 411-417; Furue et al., "Emerging role of interleukin-31 and interleukin-31 receptor in pruritus in atopic dermatitis", Allergy 73.1 (2018): 29-36; Gonzales et al., "Interleukin-31: its role in canine pruritus and naturally occurring canine atopic dermatitis." Veterinary dermatology 24.1 (2013): 48-e12), IL-31 그 자체 및 그의 수용체 결합은 아토피성 피부염과 관련하여 가려움증을 약리학적으로 중재하는 데 주요 초점이 되어 왔다.
천식은 유형 2뿐만 아니라 유형 1 둘 다의 시토카인의 비정상적 방출과 연관된 병리생리상태를 갖는 또 다른 고도로 만연한 상태이다. 천식-관련 치료 연구의 주요 표적은 IL-4, IL-5 및 IL-13뿐만 아니라 IL-33을 포함한다.
이상 시토카인 생산과 연관된 상태를 치료하기 위한 상이한 전략이 추구되어 왔다. 아토피성 피부염에서, 예를 들어 전략 중 하나는, 예를 들어 키나제 억제제를 사용하여 하류 신호 전달을 억제하는 것에 초점을 맞추었다. 그러나, 이러한 전략은 억제제가 인간 또는 동물 환자에게 짧은 시간 간격으로 반복해서 주어져야 한다는 단점을 갖는다. 폭넓게 사용되어 온 또 다른 전략은 특정한 관심 시토카인에 대한 중화 모노클로날 항체를 개발하여 순환 리간드 수준을 감소시키고/거나 달리 그의 수용체 결합 및 그에 따른 생물학적 활성을 억제하는 것이다. 아토피성 피부염에서, 예를 들어 항-4, 항-5, 항-13, 항-17A, 항-17C, 항-22, 항-31 및 항-33 항체가 이러한 상태를 예방 및/또는 치료하기 위해 개발되어 왔다 (Moyle et al. (2019) Experimental Dermatology, 28:756-768; Renert-Yuval & Guttman-Yassky (2019) Dermatol Clin 37:205-213). 그러나, 이러한 전략은 세포 배양에서의 고가의 항체 생산 절차 및 짧은 간격으로 항체 치료를 반복할 필요성으로 인해 높은 생산 비용이 든다는 단점을 갖는다. 이러한 전략의 또 다른 단점은 전형적으로 모노클로날 치료 항체에 대한 진행성 면역화가 환자에서 발생하여, 결국에는 치료 항체의 치료가 더 이상 효과적이지 않다는 것이다.
바크만(Bachmann) 등은 2018년에 오이 모자이크 바이러스로부터 유래되고 보편적 T-세포 에피토프를 함유하는 바이러스-유사 입자 (VLP)에 화학적으로 커플링된 천연 전장 IL-31을 함유하는 백신을 투여함으로써 IL-31 시토카인에 대한 백신접종을 시도하였다 (Bachmann et al., "Vaccination against IL-31 for the treatment of atopic dermatitis in dogs", Journal of Allergy and Clinical Immunology 142.1 (2018): 279-281). VLP에 대한 천연 IL-31의 화학적 커플링은 IL-31 및 VLP 코트 단백질을 유도체화함으로써 달성되었다. IL-31을 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트로 유도체화하고, 이어서 탈아세틸화하여 반응성 SH-기를 IL-31에 도입하였다. VLP 코트 단백질을 숙신이미딜-6-((베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트)로 유도체화하여 SH-반응성 화학적 모이어티를 도입하였다. IL-31 및 VLP의 유도체화된 제제를 서로 반응시키고 정제하였다. 그러나, 이러한 전략은 IL-31-VLP 접합체의 생산이 고도로 복잡하고 고가이며, 정제된 VLP 및 IL-31, 유도체화 및 화학적 커플링 및 후속 정제를 위한 다수의 화학적 단계를 요구한다는 단점을 갖는다. 더욱이, 잘-정의된 화학적 생성물은 이러한 생산 방법에 의해 수득되지 않는다. 수득된 IL-31-VLP 접합체는 또한 생분해성이 문제가 될 수 있는 비-천연 성분 및 화학적 연결을 함유한다.
본 발명의 기저 연구의 목적은 특히 유해한 시토카인에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 치료 백신 형태의 인간 및 수의학적 의약을 제공하는 것이었다.
상기 언급된 배경기술에 대해, 본 발명의 목적은 관련 기술분야에 공지된 수단과 비교하여 질환-유발 또는 질환-기여 표적 자기-단백질의 기능을 억제하거나 교란시키는 효과적인 약리학적 수단을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 숙주에서 표적 자기-단백질에 대한 오래 지속되는 효과를 유도하는 약리학적 수단을 제공하여 약리학적 수단이 오랜 시간 간격, 바람직하게는 수주의 범위, 가장 바람직하게는 수개월의 범위 후에만 재투여될 필요가 있도록 하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 경제적 방식으로 생산될 수 있고 그의 성분이 화학적으로 잘 정의되어 있는 약리학적 수단을 제공하는 것이다.
상기 목적과 관련하여, 본 발명의 또 다른 목적은 질환-관여 또는 질환-유발 표적 자기-단백질의 기능을 억제하거나 교란시키는 본 발명의 약리학적 수단의 효과를 조사하는 간단하고 효과적인 방법을 제공하는 것이다.
이들 목적은 청구항 1에 따른 백신 조성물, 청구항 17에 따른 폴리단백질, 청구항 18 및 19에 따른 용도 및 청구항 23에 따른 방법에 의해 달성된다.
본 발명은 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위해 백신 조성물에 사용하기 위한 폴리단백질, 이러한 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 이러한 폴리단백질을 코딩하는 RNA로서, 여기서 폴리단백질은 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 적어도 2개의 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함하는 것인, 폴리단백질, 이러한 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 이러한 폴리단백질을 코딩하는 RNA를 제공한다. 특히, 이는 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프에 추가로, 숙주의 하나의 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 동일한 숙주의 또 다른 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 폴리단백질은 숙주의 하나의 자기-단백질의 2 또는 3개의 카피, 동일한 숙주의 또 다른 자기-단백질의 2 또는 3개의 카피 및 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1 또는 2종의 T-세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 기저 연구는 놀랍게도 자기-단백질 절편 및 이들 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 T-세포 에피토프를 포함하는 폴리단백질이 폴리단백질의 자기-단백질 절편에 대한 숙주의 자기-관용을 파괴하거나 회피할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 폴리단백질의 설계는 면역학적 이점을 가질 뿐만 아니라, 그의 정상적 생물학적 및/또는 질환-유발 기능을 발휘하는 폴리단백질 내의 자기-단백질 절편에 의해 유발되는 유의한 부정적 영향을 일으키지 않으면서 다량의 본 발명의 폴리단백질의 투여, 특히 피하로의 투여를 가능하게 한다. 이는 본 발명에 따른 폴리단백질을 백신 조성물에 특히 적합한 항원으로 만든다.
본 발명의 백신 조성물은 본 발명에 따른 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA를 포함한다. 보다 정확하게, 본 발명은 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물로서, 여기서 백신 조성물은 숙주에게 백신 조성물이 투여되는 경우에 상기 자기-단백질에 대한 자가항체를 생성시킬 수 있는 것인 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 백신 조성물은 하기를 포함한다:
a) - 숙주의 제1 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편;
- 숙주의 제2 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편;
- 임의로 숙주의 제3 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 및
- 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프
를 포함하는 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA;
및
b) 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드.
본 발명자들은 놀랍게도 자기-단백질 절편 및 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 T-세포 에피토프를 함유하는 폴리단백질을 아주반트로서의 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 조합하여 포함하는 백신이, 백신 조성물이 투여되는 숙주에서 폴리단백질의 자기-단백질 절편에 대해 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 숙주에서의 이러한 강력한 면역 반응은 폴리단백질의 자기-단백질 절편에 대한 자가항체의 생산을 포함한다. 본 발명자들의 실험은 본 발명에 따른 백신 조성물로의 백신접종 후에 생산된 자가항체가 또한, 자기-단백질 절편이 유래된 천연 자기-단백질에도 결합한다는 것을 보여주었다. 본 발명자들은 생산된 자가항체가 수주 동안 숙주의 순환계에 존재하고, 결합된 자기-단백질의 기능을 교란시키거나 심지어 중화시킬 수 있다는 것을 추가로 관찰하였다. 이는 단지 1종의 유형의 자기-단백질로부터의 2개 이상의 절편이 폴리단백질에 포함된 경우뿐만 아니라, 1종 초과의 상이한 유형의 자기-단백질로부터의 2개 이상의 절편이 폴리단백질에 포함된 경우에도 그러하였다. 따라서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 생체내에서 오래 지속되는 치료 자가항체 반응의 유도를 가능하게 한다.
폴리단백질에 포함된 각각의 자기-단백질에 대해 적어도 2개의 절편 (용어 "자기-단백질 절편"과 상호교환가능하게 사용됨)이 존재하는 것이 중요하다. 이들 절편은 전형적으로 높은 수준의 서열 동일성을 갖고, 가장 바람직하게는 서로의 정확한 카피이다. 그러나, 상이한 스플라이싱 사건이 발생할 수 있으며, 이는 보다 낮은 서열 동일성을 유도하지만, 절편 또는 전체로서의 폴리단백질의 기능에 대해 영향을 미치지는 않는다. 이러한 의미에서, 동일한 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편은 서로 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 가질 수 있다. 100% 미만의 서열 동일성의 경우, 서열 동일성의 차이는 2개의 절편이 개별적으로 시험되는 경우에, 즉 폴리단백질의 형태가 아닌 경우에 여전히 유사한 생물학적 활성을 생성하도록 해야 한다.
본 발명은 또한 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 폴리단백질의 용도로서, 여기서 자기-관용은 숙주에게 폴리단백질이 투여되는 경우에 자가항체의 생산에 의해 파괴되고, 여기서 폴리단백질은 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 적어도 2개의 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함하고; 특히 여기서 폴리단백질은 숙주의 하나의 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편, 동일한 숙주의 또 다른 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함한다. 이러한 용도는 특히 예방적 및 치료적 의학적 적용, 특히 다수의 자기-단백질이 병리상태에 관여하는 적용에 관련된다.
추가로, 본 발명은 대상체에게 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 백신 조성물에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 중화 자가항체를 검출하기 위한 효소-연결 면역흡착 검정에 관한 것이다:
a) 시험 표면 상에 항원을 흡착시키는 단계;
b) 시험 표면 상의 자유 결합 부위를 차단하는 단계;
c) 항원-코팅되고 차단된 시험 표면을, 항원에 대한 표지된 중화 항체 및 항원에 대한 시험될 중화 자가항체를 포함하는 혼합물과 함께 인큐베이션하는 단계; 및
d) 표지된 중화 항체의 결합을 검출하는 단계.
본 발명에 따른 검정은 특히 숙주를 본 발명에 따른 백신 조성물로 백신접종한 후에 관심 항원에 대한 중화 자가항체의 존재를 강건하고 명확한 방식으로 결정하는 것을 가능하게 한다.
예시적 실시양태의 상세한 설명
폴리단백질
본 발명의 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA는, 예를 들어 본 발명의 백신 조성물로 숙주에게 투여되는 경우에 상기 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하도록 설계된다. 폴리단백질은 숙주의 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 숙주의 적어도 2개의 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함한다. 특히, 이는 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프에 추가로, 숙주의 하나의 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 동일한 숙주의 또 다른 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 폴리단백질은 숙주의 하나의 자기-단백질의 2 또는 3개의 카피, 동일한 숙주의 또 다른 자기-단백질의 2 또는 3개의 카피 및 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1 또는 2종의 T-세포 에피토프를 포함한다.
숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하는 것은 숙주의 자기-단백질에 대한 자가항체, 바람직하게는 중화 자가항체의 생산을 포함하는 숙주에서의 면역 반응을 도출하는 것을 의미한다. 따라서, "숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하는 것"은 "숙주의 자기-단백질에 대한 자가항체, 바람직하게는 중화 자가항체의 생산을 도출하는 것"을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "자가항체"는 숙주의 자기-단백질에 결합하는, 이러한 숙주에 의해 생산된 항체를 지칭한다. "중화 자가항체"는 그가 결합하는 숙주의 자기-단백질의 생물학적 기능을 교란시키고, 바람직하게는 완전히 억제한다. 예로서, IL-31에 대한 중화 자가항체는 숙주에서 그의 생물학적 기능을 교란시키고, 바람직하게는 실질적으로 완전히 억제한다. 특히, IL-31에 대한 중화 자가항체는 소양증의 유도 및 발병에서의 IL-31의 역할을 교란시키고, 바람직하게는 완전히 억제한다.
본 발명의 폴리단백질은 2종의 중요한 구조적 요소를 포함한다: 숙주의 자기-단백질 절편 및 비-숙주 기원의 T-세포 에피토프.
본 발명의 폴리단백질은 폴리단백질에 포함된 각각의 자기-단백질의 적어도 2개의 절편, 바람직하게는 2 또는 3개의 절편을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO): 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 동일성을 갖는 제1 자기-단백질로부터 유래된 2 또는 3개의 절편, 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 동일성을 갖는 제2 자기-단백질로부터 유래된 2 또는 3개의 절편 및 임의로 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 동일성을 갖는 제3 자기-단백질로부터 유래된 2 또는 3개의 절편을 포함하며, 특히 여기서 제1, 제2 및 임의로 제3 자기-단백질은 동일한 숙주의 상이한 단백질이다.
본 발명자들의 실험은 숙주의 2 또는 3종의 상이한 자기-단백질의 적어도 2개의 절편을 함유하는 폴리단백질이 숙주에게 투여되는 경우에, 폴리단백질의 각각의 개별 자기-단백질에 대한 및 그에 따라 또한 폴리단백질의 자기-단백질 절편이 유래된 숙주의 천연 자기-단백질에 대한 숙주에서의 자가항체의 생산을 도출하는 데 매우 강력하다는 것을 보여주었다.
동일한 자기-단백질로부터 유래된 자기-단백질 절편은 동일하거나 상이할 수 있다. 특히, 자기-단백질 절편은 길이 및/또는 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 동일한 자기-단백질로부터 유래된 자기-단백질 절편이 폴리단백질에서 동일한 경우에 우수한 결과가 달성되었다. 이들 경우에, 폴리단백질은 숙주에게 투여되는 경우에, 각각의 유형의 자기-단백질 또는 심지어 각각의 유형의 자기-단백질 절편에 대한 자가항체의 생산에 초점을 맞춘 숙주에서의 면역 반응을 유도하며, 이들 둘 다는 단백질 절편이 유래된 숙주의 천연 자기-단백질에 대한 자가면역 반응을 유발한다.
본 발명에 따른 폴리단백질의 자기-단백질 절편은 적어도 1종의 B-세포 에피토프를 포함한다. 본원에 사용된 용어 B-세포 에피토프는 자가항체가 결합하는 자기-단백질 절편의 선형 또는 입체형태적 부분을 의미한다.
본원에 사용된 "절편"은 구별가능하고 별개인 단백질 개체 또는 도메인을 의미한다. 따라서, 숙주의 단일 인접 자기-단백질 서열은 단지 자기 단백질 서열 내에서 절편이 개재 서열 (예를 들어, T-세포 에피토프)에 의해 분리된 경우에만 본 발명에 따른 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 구성하는 것으로 간주될 수 있다. 다수의 동일한 단백질 절편 또는 상이한 단백질 절편은 또한 임의의 개재 서열이 존재하지 않으면서 서로 직접 융합될 수 있다. 바람직하게는, 개재 서열은 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
숙주의 자기-단백질 절편은 하기일 수 있다:
(i) 전장 자기-단백질; 또는
(ii) B-세포 에피토프를 함유하는 말단절단된 자기-단백질; 또는
(iii) 전장 자기-단백질에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 자기-단백질의 유도체.
본 발명에 따른 폴리단백질에 함유된 자기-단백질 절편은 모두 동일한 자기-단백질 절편 유형 또는 상이한 자기-단백질 절편 유형일 수 있으며, 여기서 자기-단백질 절편 유형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 전장 자기-단백질; 또는
(ii) B-세포 에피토프를 함유하는 말단절단된 자기-단백질; 또는
(iii) 자기-단백질에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 자기-단백질의 유도체.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질의 자기-단백질 절편은 전장 자기-단백질, 바람직하게는 동일한 전장 자기-단백질, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 또는 TNF-알파의 다중 카피이다. 전장 형태가 성숙 형태와 상이한 자기-단백질의 경우, 본 발명의 목적상 용어 "전장"은 상기 자기-단백질의 전장 성숙 형태를 지칭한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 3개의 자기-단백질 절편을 함유하며, 여기서 자기-단백질 절편은 모두 전장 자기-단백질이다. 본 발명에 따른 폴리단백질에서의 전장 자기-단백질의 사용 (옵션 (i))은 개별 자기-단백질 절편이 원칙적으로 그의 천연 폴드를 적합화할 수 있다는 이점을 갖는다. 이 때문에, 자기-단백질 절편은 숙주의 자기-단백질 절편이 유래된 천연 자기-단백질과 동일한 선형 에피토프뿐만 아니라 동일한 입체형태적 B-세포 에피토프를 제공한다. 이는 본 발명에 따른 폴리단백질 내의 이러한 유형의 자기-단백질 절편을 표적 자기-단백질에 대한 숙주의 자기-관용을 파괴하는 데 특히 효과적이게 한다.
본 발명에 따른 폴리단백질에 함유된 자기-단백질 절편(들)은 또한 말단절단된 자기-단백질일 수 있다. 이 경우에, 말단절단은 나머지 단백질 절편이 적어도 1종의 기능성 B-세포 에피토프를 여전히 함유하는 방식으로 수행되어야 한다. 본 발명에 따른 폴리단백질에서의 B-세포 에피토프를 함유하는 말단절단된 자기-단백질의 사용 (옵션 (ii))은 자기-단백질 절편이 관련 B-세포 에피토프(들)를 주로 함유하도록 그의 크기가 감소될 수 있다는 이점을 갖는다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 폴리단백질은 크기가 감소될 수 있으며, 이는 클로닝능력 및 전달을 보조할 수 있고/거나, 폴리단백질의 특정 크기 한계를 초과하지 않으면서 본 발명에 따른 폴리단백질에 훨씬 더 많은 자기-단백질 절편을 추가하는 것이 가능해진다.
본 발명에 따른 폴리단백질에 함유된 자기-단백질 절편(들)은 전장 자기-단백질에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 자기-단백질의 유도체일 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 자기-단백질의 유도체는 전장 자기-단백질에 대해 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 본 발명에 따른 자기 단백질 절편은 말단절단된 자기-단백질 및 본 발명에 따른 자기-단백질의 유도체의 정의를 동시에 충족시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 단지 자기-단백질만 및/또는 각각의 전장 자기-단백질에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 자기-단백질의 유도체를 함유한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 각각의 자기-단백질의 2개의 자기-단백질 절편을 함유하며, 여기서 자기-단백질 절편은 전장 자기-단백질 및/또는 전장 자기-단백질에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 자기-단백질의 유도체이다. 본 발명에 따른 폴리단백질에서의 유도체 자기-단백질의 사용 (옵션 (iii))은 다수의 이유로 유리할 수 있으며, 예를 들어 본 발명에 따른 보다 안정한 또는 보다 가용성인 폴리단백질의 발현을 가능하게 할 수 있다. 유도체 자기-단백질의 생물학적 기능의 손상 또는 완전한 억제로 이어지는 돌연변이를 보유하는 이들 유도체 자기-단백질을 본 발명에 따른 폴리단백질에 사용하는 것이 또한 유리하다. 이와 관련하여, 수용체 결속 및/또는 신호 전달 잠재력의 상실로 이어지는 돌연변이를 보유하는 자기-단백질을 사용하는 것이 특히 구상될 수 있다. 이러한 유도체 자기-단백질은, 예를 들어 수용체 결합에 중요한 잔기의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리단백질에서 자기-단백질 절편이 유래된 자기-단백질 중 적어도 1종, 적어도 2종 또는 적어도 3종은 시토카인이다. 바람직하게는, 자기-단백질 절편이 유래된 모든 자기-단백질은 시토카인이다. 본원에 정의된 바와 같은 시토카인은 관련 기술분야에서의 그의 통상의 의미를 갖는다. 시토카인은, 예를 들어 구조에 의해 패밀리, 예를 들어 IL-1 패밀리, 헤마토포이에틴 슈퍼패밀리, 인터페론 및 종양 괴사 인자 패밀리로 군분류될 수 있다. IL-1 패밀리의 경우, 이 패밀리의 대부분의 구성원은, 절단되어 (아미노-말단 펩티드를 제거함) 성숙 시토카인을 생산하는 불활성 전구단백질로서 생산되는 것으로 공지되어 있다. 이러한 경우에, 전장 단백질은 상기 자기-단백질의 성숙 형태를 지칭한다. 이러한 규칙에 대한 예외는 IL-1-알파로, 이는 전구단백질 및 그의 절단된 형태 둘 다가 생물학적으로 활성이다. 시토카인의 헤마토포이에틴 슈퍼패밀리는 비-면역계 성장 및 분화 인자, 예컨대 에리트로포이에틴 및 성장 호르몬, 뿐만 아니라 선천성 및 적응성 면역에서 역할을 하는 인터류킨을 포함한다. 활성화된 T 세포에 의해 만들어진 다수의 가용성 시토카인은 헤마토포이에틴 패밀리의 구성원이다. TNF-알파가 원형인 TNF 패밀리는 적응성 및 선천성 면역에서 중요한 기능을 갖는 17종 초과의 시토카인을 함유한다. 시토카인은 또한 콜로니-자극 인자를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리단백질에서 자기-단백질 절편이 유래된 자기-단백질 중 적어도 1종, 적어도 2종 또는 적어도 3종은 인터류킨 패밀리 구성원, 종양 괴사 인자 패밀리 구성원, 인터페론 패밀리 구성원 및/또는 콜로니-자극 인자 패밀리 구성원으로 이루어진 시토카인의 군으로부터 선택된다. 인터류킨 패밀리 구성원의 예는 IL-1-알파, IL-1-베타, IL-1 RA, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17A-F, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A,B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36-알파, 베타 또는 감마, IL-36 Ra, IL-37, IL-38, IL-39, IL-40, IL-41 및 IL-42로 이루어진 군으로부터 선택된 인터류킨, TSLP, 백혈병 억제 인자 및 온코스타틴 또는 그의 패밀리 구성원이다. TNF 패밀리 구성원 자기-단백질의 예는 TNF-알파, 림프독소 (LT)-알파, LT-베타, CD40 리간드, Fas 리간드, APRIL, LIGHT, TWEAK 및 BAFF로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질이다. IFN 패밀리 구성원 자기-단백질의 예는 IFN-알파, IFN-베타 및 IFN-감마로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질이다. 콜로니-자극 인자 시토카인의 예는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)이다. 바람직하게는, 자기-단백질 절편은 단량체, 동종이량체, 동종삼량체 또는 동종사량체인 자기-단백질, 특히 시토카인으로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리단백질은 적어도 2개, 특히 2 또는 3개의 자기-단백질 절편을 포함하며, 여기서 자기-단백질 절편은 IL-1-알파, IL-1-베타, IL-1 RA, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17A-F, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-24, IL-25, IL-26, IL-28A,B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-36-알파, 베타 또는 감마, IL-36 Ra, IL-37, IL-38, IL-40, IL-41 및 IL-42, TSLP, 백혈병 억제 인자, 온코스타틴, TNF-알파, IFN-알파, IFN-베타 및 IFN-감마, G-CSF 및 GM-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인으로부터 유래된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리단백질의 적어도 2개의 자기-단백질 절편은 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 또는 TNF-알파, 특히 개 IL-4, 개 IL-5, 개 IL-13, 개 IL-31, 개 IL-33 또는 개 TNF-알파로부터 유래된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 모두 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 및 TNF-알파로 이루어진 군, 특히 개 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 및 TNF-알파로 이루어진 군 (이 경우에 숙주는 개 종임)으로부터 선택된 동일한 자기-단백질로부터 유래된 3개의 동일한 자기-단백질 절편을 포함한다. 동일한 자기-단백질로부터 유래된 자기-단백질 절편은 동일할 것이 요구되지는 않지만, 전형적으로 서로 높은 수준의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 동일한 자기-단백질로부터 유래된 자기-단백질 절편은 서로 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하거나 또는 100% 동일하다.
특히 바람직한 실시양태에서, 자기-단백질 절편이 유래된 자기-단백질 중 적어도 1종, 적어도 2종 또는 적어도 3종은 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 또는 TNF-알파, 특히 개 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 또는 TNF-알파로 이루어진 군으로부터 유래되거나 또는 선택된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 각각의 상이한 자기-단백질의 2개의 카피를 포함한다.
또 다른 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리단백질에서 자기-단백질 절편이 유래된 자기-단백질 중 적어도 1종은 IL-31, 특히 개 IL-31이다. 바람직하게는, 따라서, 폴리단백질은 IL-31 단백질, 특히 개 IL-31로부터 유래된 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 절편을 포함하며, 이러한 경우에 숙주는 개 종이다. 본 발명의 폴리단백질이 IL-31 자기-단백질, 특히 개 IL-31의 2개의 절편을 포함하는 실시양태가 가장 바람직하며, 이러한 경우에 숙주는 개 종이다.
용어 "로부터 유래된"은 자기-단백질 절편이 (i) 전장 단백질, (ii) B-세포 에피토프를 함유하는 전장 단백질의 말단절단된 형태 또는 (iii) 전장 단백질에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 단백질의 유도체로부터 선택된다는 것을 의미한다.
본 발명자들의 실험은 숙주에게 IL-31로부터 유래된 3개의 자기-단백질 절편, 특히 개 숙주에게 개 IL-31로부터 유래된 3개의 자기-단백질 절편을 포함하는 폴리단백질을 투여함으로써, (개) IL-31 단백질에 대한 자가항체가 효율적으로 생성될 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 폴리단백질은 (개) IL-31에 대한 자기-관용을 특히 효율적으로 파괴할 수 있는 것으로 입증되었다. 특히 개 IL-4, 개 IL-5, 개 IL-13 또는 개 IL-33-CS로부터 유래되고 개 숙주에게 투여된 자기-단백질 절편, 뿐만 아니라 고양이 IL-31로부터 유래되고 고양이 숙주에게 투여된 자기-단백질 절편을 갖는 폴리단백질을 투여함으로써, 수많은 다른 자기-단백질 절편에서 동일한 결과가 나타났다. 각각의 (개/고양이) IL 단백질에 대한 자가항체는 효율적으로 생성되었고, 그에 대한 자기-관용은 효율적으로 파괴되었다. 토끼를 3개의 TNF-알파 반복부를 포함하는 본 발명에 따른 폴리단백질로 면역화시켰을 때 TNF-알파에 대한 항체가 또한 생성되었으며, 이는 원리가 특정한 단백질 또는 종에 결코 제한되지 않는다는 것을 보여준다.
추가로, 폴리단백질 구축물이 각각의 2 또는 3종의 상이한 자기-단백질의 적어도 2개의 절편을 포함하는 경우에, 각각의 개별 자기-단백질 (예를 들어 cIL-4, cIL-13 및 cIL-31)에 대한 자가항체는 효율적으로 생성될 수 있고, 각각의 개별 자기-단백질에 대한 자기-관용은 효율적으로 파괴된다. 따라서, 본 발명은 단지 하나의 구축물을 사용하여 다수의 자기-단백질에 대한 자가항체를 효율적으로 생성시키기 위한 가요성 플랫폼을 제공한다. 본 발명은 자기-단백질의 특정한 군에 제한되는 것이 아니라, 모든 자기-단백질에 적합하고, 자기-단백질의 다양한 조합을 표적화하는 가요성 플랫폼을 제공한다.
아미노산 서열과 관련하여 본원에 사용된 "퍼센트 서열 동일성" 등의 용어는 2개 이상의 아미노산 서열 사이의 서열 관계를 기재하는 데 사용되고, a) 참조 서열, b) 비교 윈도우, c) 서열 동일성 및 d) 서열 동일성의 백분율을 포함한 용어와 관련하여 및 그와 함께 이해된다.
a) "참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 정의된 서열이다. 참조 서열은 명시된 서열의 하위세트 또는 전체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 경우에, 개 IL-31에 대한 참조 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 3이고; 개 IL-4에 대한 참조 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 56이고; 개 IL-5에 대한 참조 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 41이고; 개 IL-13에 대한 참조 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 46이고; 개 IL-33에 대한 참조 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 50 또는 서열식별번호: 51이고; 고양이 IL-31에 대한 참조 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 60이고; 소 TNF-알파에 대한 참조 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 64이다. 서열식별번호: 50 및 51은 단지 서열식별번호: 50 ("IL-33-WT")의 3개의 시스테인 잔기가 서열식별번호: 51 ("IL-33-CS")에서 세린에 의해 대체되었다는 점에서만 상이하다. 이러한 방식으로 시스테인 잔기를 세린으로 대체하는 것은 유전자 생성물의 안정성을 추가로 개선시키는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
b) "비교 윈도우"는 아미노산 서열의 인접하고 명시된 부분에 대한 참조를 포함하며, 여기서 아미노산 서열은 참조 서열과 비교될 수 있고, 비교 윈도우 내의 아미노산 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가, 치환 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 서열에의 갭의 포함으로 인한 참조 서열에 대한 잘못된 높은 유사성을 피하기 위해 갭 페널티가 전형적으로 도입되고 매치 수로부터 차감된다는 것을 이해한다.
c) 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 많은 쌍별 서열 정렬 (PSA) 방법, 예컨대 EMBOSS (Rice et al., "EMBOSS: the European molecular biology open software suite", (2000): 276-277), BLAST (Johnson et al., "NCBI BLAST: a better web interface", Nucleic acids research 36.suppl_2 (2008): W5-W9.), CD-HIT (Li et al., "Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences", Bioinformatics 22.13 (2006): 1658-1659), ESPRIT (Sun et al., "ESPRIT: estimating species richness using large collections of 16S rRNA pyrosequences", Nucleic acids research 37.10 (2009): e76-e76.), 및 UCLUST (Edgar, Robert, "Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST", Bioinformatics 26.19 (2010): 2460-2461.) 등이 개발되었다.
d) "퍼센트 동일성"은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하며, 여기서 비교 윈도우 내의 아미노산 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가, 치환 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 아미노산이 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
본 발명에 따른 폴리단백질은 제2 구조적 성분으로서 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "T-세포 에피토프"는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합하여 그에 의해 제시될 수 있는 짧은 펩티드를 지칭한다. MHC 부류 I 분자는 8 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 펩티드에 결합할 수 있고, MHC 부류 II 분자는 13 내지 17개 아미노산 길이의 펩티드에 결합할 수 있다. T-세포는 항원의 세포내 프로세싱으로부터 유래된 펩티드 에피토프에 결합한 MHC 분자를 인식하는 것으로 널리 공지되어 있다. 주어진 에피토프의 면역원성은 3종의 인자에 의존한다: 항원으로부터의 적절한 펩티드 단편의 생성, 이러한 단편에 결합하는 MHC 분자의 존재 및 복합체를 인식할 수 있는 T-세포의 존재.
T-세포 에피토프와 관련하여 용어 "1종 이상"은 동일하거나 상이한 T-세포 에피토프가 본 발명에 따른 폴리단백질에 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 폴리단백질에 함유된 T-세포 에피토프는 길이 및/또는 서열이 서로 상이할 수 있다.
1종 이상의 T-세포 에피토프는 인공 T-세포 에피토프 펩티드 서열 및 비-자기 단백질, 특히 병원성 단백질로부터 유래된 T-세포 에피토프 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이는 종종 특히 강력한 T-세포 에피토프를 보유한다. T-세포 에피토프가 유래될 수 있는 적합한 인공 T-세포 에피토프 또는 적합한 병원성 단백질은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이러한 T-세포 에피토프는 숙주에게 투여 시 특히 면역원성이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 비-숙주 기원의 1종 이상의 보편적 T-세포 에피토프를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 모든 T-세포 에피토프가 보편적인 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "보편적 T-세포 에피토프"는 보편적으로 면역원성이고 다수의 부류 II MHC 분자와 회합되어 인식될 수 있는 T-세포 에피토프를 지칭한다. 본 발명에 따른 폴리단백질에서 보편적 T-세포 에피토프를 사용하는 것은 T-세포 에피토프가 선택된 숙주와 독립적으로 특히 면역원성이라는 이점을 갖는다.
가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질에 함유된 1종 이상의 T-세포 에피토프는 파상풍 독소 T-세포 에피토프, 특히 (i) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 39와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하거나 또는 (ii) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 39로 이루어진 군으로부터 선택된 파상풍 독소 T-세포 에피토프이다. 보다 더 바람직하게는, 1종 이상의 T-세포 에피토프는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2로부터 유래되거나 또는 그와 동일하다. 이들 T-세포 에피토프는 특히 면역원성 보편적 T-세포 에피토프이다 (Panina-Bordignon et al., "Universally immunogenic T cell epitopes: promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells", European journal of immunology 19.12 (1989): 2237-2242).
보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질에 함유된 T-세포 에피토프는 파상풍 독소 T-세포 에피토프, 특히 (i) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 또는 서열식별번호: 2와 적어도 96, 보다 바람직하게는 97, 가장 바람직하게는 98 또는 99% 서열 동일성을 포함하거나 또는 (ii) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 파상풍 독소 T-세포 에피토프이다.
본 발명에 따른 폴리단백질에서, 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프는 적어도 2개의 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 위치한다. 바람직하게는, 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프는 적어도 2개의 자기-단백질 절편들 사이에 및 임의로 추가적으로 또한 그에 인접하여 위치한다. 이와 관련하여 용어 "인접한"은 "가장 N-말단의 단백질 절편의 상류 및/또는 가장 C-말단의 단백질 절편의 하류"를 의미한다.
본 발명에 따른 폴리단백질은 추가의 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 추가의 성분의 한 예는 적어도 2개의 자기-단백질 절편과 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프 사이의 1개 이상의 링커이다. 이들 링커는 특히 4 내지 50개 아미노산 길이, 바람직하게는 4 내지 30개 아미노산 길이, 가장 바람직하게는 4 내지 20개 아미노산 길이일 수 있다. 링커의 사용은 가요성 링커가 본 발명에 따른 폴리단백질 내의 개별 자기-단백질 절편의 독립적인 폴딩을 용이하게 할 수 있기 때문에 유리하다.
폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA가 폴리단백질 그 자체 대신에 사용되는 경우에, DNA 및/또는 RNA는 또한 1개 이상의 ER-유입 신호를 추가적으로 코딩할 수 있다. 인공 ER 신호에 대한 아미노산 서열의 예는 서열식별번호: 67이다. 이는 숙주에서 DNA 또는 RNA로부터의 폴리단백질의 발현 시 폴리단백질이 ER 내로 유입되고 이후에 분비되는 것을 보장한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리단백질은 자기-단백질로부터의 자기-단백질 절편을 포함하며, 여기서 자기-단백질 중 적어도 1종, 적어도 2종 또는 모두는 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 및 68-201로 이루어진 군으로부터 선택된 자기-단백질(들)이고, 바람직하게는 여기서 적어도 1종의 자기-단백질은 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 실시양태에서, 폴리단백질은 바람직하게는 그에 포함된 각각의 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 1종 이상의 T-세포 에피토프를 추가적으로 포함하며; 여기서 1종 이상의 T-세포 에피토프는 (i) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하거나 또는 (ii) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 파상풍 독소 T-세포 에피토프이다. 가장 바람직하게는, 1종 이상의 T-세포 에피토프는 (i) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하거나 또는 (ii) 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 파상풍 독소 T-세포 에피토프이다.
본 발명의 폴리단백질에 대한 적어도 2종의 상이한 자기-단백질의 바람직한 조합은 IL-31과 IL-4, IL-5, IL-13 및 IL-33으로부터 선택된 군의 어느 1 또는 2종의 자기-단백질의 조합, 바람직하게는 개 IL-31과 개 IL-4, 개 IL-5, 개 IL-13 및 개 IL-33-CS로부터 선택된 군 중 어느 1 또는 2종의 조합이다. 예를 들어, 각각의 2종의 상이한 자기-단백질의 적어도 2개의 절편을 포함하는 본 발명의 폴리단백질의 바람직한 실시양태는 (개) IL-31과 (개) IL-5, (개) IL-31과 (개) IL-4, (개) IL-31과 (개) IL-13 또는 (개) IL-31과 (개) IL-33-CS의 조합을 포함한다. 어느 단백질이 폴리단백질을 개시하는지는 폴리단백질 구축물의 면역원성에 대해 영향을 미치지 않는다. 발현 목적을 위해, 개시 자기-단백질이 선택 발현 시스템에서 잘 발현되는 것이 바람직하다. 예를 들어, cIL-31을 포함하는 실시양태에서, 본 발명자들은 cIL-31 단백질이 그 자체로 매우 잘 발현되고 또한 폴리단백질의 높은 발현을 유도하기 때문에 제1 자기-단백질 절편이 cIL-31로부터 유래되는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
본 발명의 폴리단백질에 대한 또 다른 바람직한 조합은 IL-4 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편과 IL-5, IL-13, IL-31 및 IL-33으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 1 또는 2종의 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편의 조합, 바람직하게는 개 IL-4로부터 유래된 적어도 2개의 절편과 cIL-5, cIL-13, cIL-31 및 cIL-33-CS로부터 선택된 군 중 어느 1 또는 2종으로부터 유래된 적어도 2개의 절편의 조합이다. 예를 들어, 2종의 상이한 자기-단백질의 적어도 2개의 절편을 포함하는 본 발명의 바람직한 실시양태는 (개) IL-4와 (개) IL-13, (개) IL-4와 (개) IL-33-CS, (개) IL-4와 (개) IL-5 및 이미 언급된 (개) IL-4와 (개) IL-31의 조합을 포함하는 구축물이다.
본 발명의 폴리단백질에 대한 또 다른 바람직한 조합은 IL-5 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편과 IL-4, IL-13, IL-31 및 IL-33으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 1 또는 2종의 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편의 조합, 바람직하게는 개 IL-5로부터 유래된 적어도 2개의 절편과 cIL-4, cIL-13, cIL-31 및 cIL-33-CS로부터 선택된 군 중 어느 1 또는 2종으로부터 유래된 적어도 2개의 절편의 조합이다. 예를 들어, 2종의 상이한 자기-단백질의 적어도 2개의 절편을 포함하는 본 발명의 바람직한 실시양태는 (개) IL-5와 (개) IL-13, (개) IL-5와 (개) IL-33-CS, (개) IL-5와 (개) IL-5 및 (개) IL-4와 (개) IL-31의 조합을 포함하는 구축물이다.
본 발명의 폴리단백질에 대한 또 다른 바람직한 조합은 IL-13 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편과 IL-4, IL-5, IL-31 및 IL-33으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 1 또는 2종의 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편의 조합, 바람직하게는 개 IL-13으로부터 유래된 적어도 2개의 절편과 cIL-4, cIL-5, cIL-31 및 cIL-33-CS로부터 선택된 군 중 어느 1 또는 2종으로부터 유래된 적어도 2개의 절편의 조합이다. 예를 들어, 2종의 상이한 자기-단백질의 적어도 2개의 절편을 포함하는 본 발명의 바람직한 실시양태는 (개) IL-13과 (개) IL-4, (개) IL-13과 (개) IL-5, (개) IL-13과 (개) IL-31 및 (개) IL-13과 (개) IL-33(-CS)의 조합을 포함하는 구축물이다.
3종의 상이한 자기-단백질의 적어도 2개의 절편을 포함하는 특히 바람직한 실시양태는 IL-31, IL-4 및 IL-13; IL-31, IL-4 및 IL-5; IL-31, IL-4 및 IL-33; IL-31, IL-5 및 IL-13; IL-31 또는 IL-13 및 IL-33을 포함하는 구축물이다. 바람직한 실시양태는 또한 IL-4, IL-5 및 IL-13; IL-4, IL-5 및 IL-33; IL-4, IL-13 및 IL-33; 또는 IL-5, IL-13 및 IL-33을 포함하는 폴리단백질을 포함한다.
본 발명자들은 cIL-4 및 cIL-13을 포함하는 폴리단백질 구축물 조합, 뿐만 아니라 cIL-31, cIL-13 및 cIL-4를 포함하는 폴리단백질 구축물 조합 둘 다가 각각의 폴리단백질에 포함된 각각의 개별 자기-단백질에 대해 잘 발현되고 높은 자가항체 역가를 유발한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 본 발명의 폴리단백질은 TNF-알파 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편을 포함하고, 바람직하게는 IL-6, IL-8 또는 IL-1-베타 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리단백질은 TNF-알파 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편 및 IL-8 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편; TNF-알파 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편 및 IL-1-베타 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편; 또는 TNF-알파 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편 및 IL-6 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리단백질은 TNF-알파 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편, IL-1-베타 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편 및 TNF-알파 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편 및 IL-8 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 절편을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 자기-관용을 파괴하기 위해 백신 조성물에 사용하기 위한 폴리단백질 내의 제1 및 제2 및 임의로 제3 자기-단백질은 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31 및 IL-33으로 이루어진 군, 가장 바람직하게는 IL-31, IL-4, IL-13 및 IL-33으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 폴리단백질은 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함하며, 여기서 1종 이상의 T-세포 에피토프는 (i) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하거나 또는 (ii) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 파상풍 독소 T-세포 에피토프이다. 가장 바람직하게는, 1종 이상의 T-세포 에피토프는 (i) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하거나 또는 (ii) 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 파상풍 독소 T-세포 에피토프이다.
본 발명자들의 실험은 개 숙주에게 이러한 폴리단백질을 투여함으로써, 폴리단백질에 포함된 모든 자기-단백질에 대한, 특히 개 IL-4, IL-13 및 IL-31 단백질에 대한 자가항체, 특히 중화 자가항체가 특히 B 부류 효율적인 방식으로 생성될 수 있다는 것을 보여주었다. 실험은 또한 개 IL-4, IL-13 및 IL-31에 대해서 뿐만 아니라 IL-5, IL-33 및 TNF-알파에 대해서도, 본 발명의 기저를 이루는 반복적 모듈 폴리단백질 구조에 포함된 개별 자기-단백질에 대해 동일한 결과를 보여주었다. 따라서, 본 발명에 따른 이러한 폴리단백질은 본원에 명백하게 제시된 예를 포함하나 이에 제한되지는 않는 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하는 데 매우 효율적이다.
한 실시양태에서, 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위해 백신 조성물에 사용하기 위한 폴리단백질은 (i) 서열식별번호: 203 또는 205와 적어도 85% 서열 동일성을 갖거나 또는 (ii) 서열식별번호: 203 또는 205의 서열을 갖는다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리단백질은 (i) 서열식별번호: 203 또는 서열식별번호: 205와 적어도 90%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖거나 또는 (ii) 서열식별번호: 203 또는 서열식별번호: 205의 서열을 갖는다. 본 발명자들의 실험은 서열식별번호: 203 또는 서열식별번호: 205를 코딩하는 폴리단백질 또는 상기 언급된 서열 동일성을 갖는 그의 유도체를 사용하여 개 숙주에게 투여 시 시토카인 cIL-4 및 cIL-13에 대한 및 서열식별번호: 205의 경우에는 또한 cIL-31에 대한 자가항체, 특히 중화 항체의 생산을 포함한 고도로 효율적인 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다.
통상의 기술자는 본 발명의 폴리단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열을 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하는 방법 및 본 발명의 폴리단백질을 생산하는 방법을 알고 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리단백질은 배양된 세포, 예를 들어 예컨대 HEK293 세포, 특히 HEK293 세포주의 빠른-성장 변이체 (HEK293-F), 예를 들어 Expi293F 세포에서의 발현에 의해 생산된다. 진핵 세포에서의 발현은 발현된 폴리단백질이 숙주의 것과 유사하거나 동일한 글리코실화 패턴을 구비한다는 이점을 갖는다. 바람직하게는, (개) IL-4, (개) IL-5, (개) IL-13 및/또는 (개 또는 고양이) IL-31을 포함하는 폴리단백질은 포유동물 발현을 사용하여 생산된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리단백질은 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 (이.) 콜라이에서의 발현에 의해 생산된다. 임의의 적합한 박테리아 균주가 사용될 수 있다. 적합한 박테리아 균주는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 통상의 기술자는 그의 시스템에 상용성인 것을 선택할 수 있다. 적합한 균주는 BL21(DE3), BL21(DE3)-pLysS, BL21-AI, 튜너(Tuner), 오리가미(Origami), 로제타(Rosetta), BL21 코돈플러스(BL21 CodonPlus), BL21trxB, C41(DE3), JM109, XL1-블루(XL1-Blue), NEB익스프레스(NEBexpress) 및 M15를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 폴리단백질, 특히 본 발명의 (개) IL-33 및 소 TNF-알파 폴리단백질의 발현에 특히 적합한 균주는 BL21(DE3) 및 그의 변이체이다. 박테리아 세포에서의 발현은 덜 복잡한 박테리아 생리학, 비교적 낮은 비용, 짧은 생성 시간 및 높은 생성물 수율로 인해 간단한 절차의 이점을 갖는다.
본 발명의 폴리단백질은 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 핵산은 또한 변형된 핵염기를 갖는 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어 사용된 핵산을 뉴클레아제의 공격에 대해 특히 안정하게 만들 수 있다. 폴리단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA는, 특히 적합한 벡터에 포함되는 경우에, 본 발명의 백신 조성물에 직접 사용될 수 있다. 이어서, 다른 DNA 및 RNA 백신에 대해 널리 공지된 바와 같이, 폴리단백질이 숙주 내부에서 발현된다.
본 발명의 폴리단백질을 코딩하는 핵산은 관심 진핵 세포 또는 숙주에서 폴리단백질의 효율적인 번역을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 예를 들어, 코돈은 인간, 소, 돼지, 고양이, 개, 박테리아 등에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다 (www.kazusa.or.jp/codon/의 코돈 용법 데이터베이스 참조). 코돈 최적화를 위한 프로그램은 프리웨어로서 이용가능하다 (예를 들어, genomes.urv.es/OPTIMIZER의 옵티마이저(OPTIMIZER); www.genscript.com/codon_opt.html의 젠스크립트(GenScript)로부터의 옵티멈진(OptimumGene)™). 상업적 코돈 최적화 프로그램이 또한 이용가능하다.
본 발명의 폴리단백질을 코딩하는 DNA는 적어도 1개의 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. DNA 코딩 서열은 관심 진핵 세포 또는 숙주에서의 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터 제어 서열은 구성적 프로모터 제어 서열일 수 있다.
진핵 세포, 예를 들어 HEK293 세포에서의 발현에 적합한 구성적 프로모터 제어 서열은 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터 (CMV), 원숭이 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 신장 인자 (ED1)-알파 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 이뮤노글로불린 프로모터, 그의 단편 또는 상기 중 어느 것의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포에서의 발현에 적합한 프로모터 제어 서열은 lac 프로모터, trc 및 tac 프로모터, T7 RNA 폴리머라제, 파지 프로모터 pL, tetA 프로모터/오퍼레이터, PPBAD 프로모터, PBAD 프로모터, 그의 단편 또는 상기 중 어느 것의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 폴리단백질을 코딩하는 DNA는 또한 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, SV40 폴리A 신호, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리A 신호 등) 및/또는 적어도 1개의 전사 종결 서열에 연결될 수 있다. 이는 포유동물 발현 시스템을 사용하는 경우에 특히 유리하다.
본 발명의 폴리단백질을 코딩하는 DNA는 벡터에 존재할 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 적합한 플라스미드 벡터의 비제한적 예는 pUC, pBR322, pET, p블루스크립트(pBluescript), pcDNA, pCI, pCMV 및 그의 변이체를 포함하며, 여기서 pcDNA-유형 벡터가 특히 적합하다. 벡터는 추가의 발현 제어 서열 (예를 들어, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선택 마커 서열 (예를 들어, 항생제 저항성 유전자), 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 추가의 정보는 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 폴리단백질을 코딩하는 핵산은 또한 RNA, 특히 mRNA일 수 있다. mRNA는 5' 캡핑 및/또는 3' 폴리아데닐화될 수 있다.
추가로, 본 발명의 폴리단백질을 코딩하는 핵산은 자기-복제 RNA일 수 있다. 면역화에 적합한 자기-복제 RNA는 RNA 백신 분야에 널리 공지되어 있다. 자기-복제 RNA 분자는, 진핵 세포로 전달되는 경우에, 그 자체의 전사에 의한 다수의 딸 RNA의 생산으로 이어질 수 있다. 자기-복제 RNA 분자는 전형적으로 세포로의 전달 후에 직접 번역될 수 있는 +-가닥 분자이다. 자기-복제 RNA 분자의 번역은 본 발명의 코딩된 폴리단백질 옆에 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 또한 제공하며, 이는 이어서 초기에 전달된 RNA로부터 안티센스 및 센스 전사체 둘 다를 생산한다. 이러한 전사 서열의 전체 결과는 도입된 자기-복제 RNA의 수의 증폭이다. 이러한 방식으로, 코딩된 폴리단백질은 전달된 자기-복제 RNA를 보유하는 세포의 주요 폴리펩티드 생성물이 된다. 적합한 알파바이러스 자기-복제 RNA는, 예를 들어 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스로부터의 레플리카제를 사용할 수 있다.
따라서, 바람직한 자기-복제 RNA 분자는 (i) 자기-복제 RNA 분자로부터 RNA를 전사할 수 있는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 (ii) 본 발명의 폴리단백질을 코딩한다. 폴리머라제는 알파바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제일 수 있다. 천연 알파바이러스 게놈은 RNA-의존성 RNA 폴리머라제에 추가로 구조적 비리온 단백질을 코딩하는 반면, 자기-복제 RNA 분자는 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하지 않는 것이 본 발명에 바람직하다. 따라서, 본 발명에 사용되는 바람직한 자기-복제 RNA는 그 자체의 RNA 카피의 세포 생산으로 이어질 수 있지만, RNA-함유 비리온의 생산으로 이어지지는 않는다. RNA 백신 분야로부터 공지된 바와 같이, 감염성 비리온을 생산하는 데 필요한 알파바이러스 구조 단백질은 본 발명에 사용된 자기-복제 RNA에는 부재하고, 그의 위치는 본 발명의 폴리단백질을 코딩하는 구축물에 의해 취해진다. 따라서, 본 발명에 적합한 자기-복제 RNA는 2개의 오픈 리딩 프레임을 가질 수 있다. 하나의 오픈 리딩 프레임은 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 코딩하고; 다른 오픈 리딩 프레임은 본 발명의 폴리단백질을 코딩한다. 자기-복제 RNA는, 예를 들어 본 발명의 1종 이상의 추가의 폴리단백질을 코딩하기 위해 추가의 (예를 들어 하류) 오픈 리딩 프레임을 가질 수 있다.
백신 조성물
본 발명은 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 2종의 필수적 성분을 포함한다:
a) - 숙주의 제1 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편;
- 숙주의 제2 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편;
- 임의로 숙주의 제3 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 및
- 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프
를 포함하는 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA;
및
b) 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드.
백신 조성물은 숙주에게 백신 조성물이 투여되는 경우에 자기-단백질에 대한 자가항체를 생성시킬 수 있다.
폴리단백질은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 백신 조성물은 아주반트로서 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드와 관련하여 사용된 용어 "1종 이상"은 화학적으로 상이한 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 백신 조성물의 일부일 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 상이한 길이, 염기 서열 또는 상이한 당 포스페이트 백본의 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. "1종 이상"에서 "1종"은 단일 올리고뉴클레오티드 분자를 지칭하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 "면역자극 올리고뉴클레오티드"는 척추동물의 선천성 면역계에 의해 외래로서 검출되어 선천성 면역 반응 경로를 활성화시킴으로써 척추동물에서 면역 반응을 도출하는 올리고뉴클레오티드이다.
전형적으로, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 합성 기원의 것이다. 따라서, 이들은 당 포스페이트 백본에서 임의의 목적하는 서열 및/또는 변형으로 합성될 수 있다.
1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 선형, 적어도 부분적으로 단일-가닥 DNA 분자이다. 그러나, 단일-가닥 DNA 면역자극 올리고뉴클레오티드는 특히 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성에 의해 그들 자신과 또는 서로 상호작용하여 2차 구조 및 응집체를 형성할 수 있다. 그러나, 단일-가닥 스트레치는 항상 면역자극 올리고뉴클레오티드에 존재할 것이다.
바람직하게는, 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 CpG 올리고데스옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)이다. 이들은 시토신 트리포스페이트 데옥시뉴클레오티드 ("C")에 이어서 구아닌 트리포스페이트 데옥시뉴클레오티드 ("G")를 함유하는 짧은 단일-가닥 합성 DNA 분자이다. "p"는 연속 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 연결을 지칭하며, 다만 본 발명에 따른 ODN은 대신 변형된 포스포로티오에이트 백본을 가질 수 있다. 면역자극 올리고뉴클레오티드로서 CpG ODN을 사용하는 것은 CpG 디뉴클레오티드가 톨-유사 수용체 (TLR) 9에 의해 감지되는 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP)을 나타낸다는 이점을 갖는다. TLR9의 활성화는, 예를 들어 활성화된 B-세포의 핵 인자 '카파-경쇄-인핸서' (NF-κB)에 의존성인 상이한 염증유발 신호전달 경로의 활성화로 이어진다. NF-κB의 활성화는 전형적으로 염증유발 시토카인의 발현으로 이어진다. 따라서, CpG ODN은 본 발명에 따른 백신 조성물에서 특히 강력한 백신 아주반트이다.
바람직하게는, 면역자극 올리고뉴클레오티드는 A-부류, B-부류 및 C-부류 면역자극 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 면역자극 올리고뉴클레오티드의 "A-부류", "B-부류" 및 "C-부류"로의 분류는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Vollmer, Joerg. "CpG motifs to modulate innate and adaptive immune responses", International reviews of immunology 25.3-4 (2006): 125-134]에 기재되어 있다.
A-부류 면역자극 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 중앙 포스포디에스테르 CpG-함유 팔린드롬 모티프 및 부분적으로 포스포로티오에이트-변형된 백본, 특히 포스포로티오에이트 3' 폴리-G 스트레치를 특징으로 한다.
B-부류 면역자극 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 1개 이상의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 전체 포스포로티오에이트 백본을 특징으로 한다.
C-부류 면역자극 올리고뉴클레오티드는 부류 A 및 부류 B 면역자극 올리고뉴클레오티드의 특성을 나타낸다. 이들은 전체 포스포로티오에이트 백본 및 1개 이상의 팔린드롬 CpG-함유 모티프(들)를 함유한다.
본 발명에 따른 면역자극 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 14 내지 500개 뉴클레오티드, 바람직하게는 14 내지 400개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 14 내지 300개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 14 내지 200개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 16 내지 40개, 가장 바람직하게는 18 내지 30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 이러한 크기의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 시험관내에서 용이하게 합성될 수 있고, 백신 아주반트로서 효과적인 것으로 밝혀졌다.
바람직하게는, 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 B-부류 면역자극 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 기저 연구는 본 발명에 따른 백신 조성물 중 B-부류 면역자극 올리고뉴클레오티드가 본 발명에 따른 백신 조성물에 사용된 폴리단백질의 면역원성을 증진시키는 데 특히 효율적이라는 것을 입증하였다.
1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 또한 바람직하게는 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6과 적어도 75% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 85% 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 90%, 95% 또는 97% 서열 동일성을 포함할 수 있다.
핵산 서열과 관련하여 본원에 사용된 "퍼센트 서열 동일성" 등의 용어는 2개 이상의 핵산 사이의 서열 관계를 기재하는 데 사용되고, a) 참조 서열, b) 비교 윈도우, c) 서열 동일성 및 d) 서열 동일성의 백분율을 포함한 용어와 관련하여 및 그와 함께 이해된다.
a) "참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 정의된 서열이다. 참조 서열은 명시된 서열의 하위세트 또는 전체; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 절편 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 본 발명의 경우에, 참조 서열은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6이다.
b) "비교 윈도우"는 폴리뉴클레오티드 서열의 인접하고 명시된 절편에 대한 참조를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 비교될 수 있고, 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가, 치환 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 폴리뉴클레오티드 서열에의 갭의 포함으로 인한 참조 서열에 대한 잘못된 높은 유사성을 피하기 위해 갭 페널티가 전형적으로 도입되고 매치 수로부터 차감된다는 것을 이해한다.
c) 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981]의 국부 상동성 알고리즘에 의해; 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988]의 유사성 검색 방법에 의해; 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현, 예컨대 비제한적으로: 인텔리제네틱스(Intelligenetics) (캘리포니아주 마운틴 뷰)에 의한 PC/유전자 프로그램에서의 CLUSTAL, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; GCG) (미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 7)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지에서의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA에 의해 수행될 수 있으며; CLUSTAL 프로그램은 문헌 [Higgins and Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Corpet, et al., Nucleic Acids Research, 16:881-90, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:1-6, 1992; 및 Pearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24:7-331, 1994]에 잘 기재되어 있다. 데이터베이스 유사성 검색에 사용될 수 있는 BLAST 패밀리의 프로그램은 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 질의 서열을 위한 BLASTN; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 질의 서열을 위한 BLASTX; 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 단백질 질의 서열을 위한 TBLASTN; 및 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 질의 서열을 위한 TBLASTX를 포함한다. 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995]을 참조한다. 상기 프로그램의 새로운 버전 또는 새로운 프로그램은 모두 의심할 여지없이 미래에 이용가능해질 것이고, 본 개시내용과 함께 사용될 수 있다.
d) "퍼센트 동일성"은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하며, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가, 치환 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
바람직하게는, 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실험 연구는 본 발명에 따른 백신 조성물 중 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6을 코딩하는 면역자극 올리고뉴클레오티드의 사용이 개 세포에서 NF-κB 염증유발 반응 경로를 활성화시키는 데 특히 효율적이고, 따라서 본 발명에 따른 백신 조성물 중 폴리단백질의 면역원성을 강하게 증진시킨다는 것을 보여주었다.
바람직하게는, 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 당-포스페이트 백본 내 포스포로티오에이트, 즉 부분적으로 포스포로티오에이트-변형된 백본을 포함한다. 보다 바람직하게는, 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 전체 포스포로티오에이트 백본을 포함한다. 포스포로티오에이트 변형은 면역자극 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호된다는 이점을 갖는다. 그 결과, 이들 면역자극 올리고뉴클레오티드의 면역자극 활성이 증가된다.
본 발명의 백신 조성물은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 백신 조성물에 함유된 폴리단백질 및/또는 면역자극 올리고뉴클레오티드에 데포 효과를 부여하는 아주반트 c)를 추가적으로 포함한다. 용어 "데포 효과"는 주사 부위로부터의 폴리단백질 및/또는 면역자극 올리고뉴클레오티드의 지속 방출을 지칭한다. 본 발명에 따른 백신 조성물에 이러한 아주반트를 사용하는 것은 백신 조성물 중 폴리단백질 및 면역자극 올리고뉴클레오티드의 면역원성이 추가로 증가되어 폴리단백질 내의 자기-단백질에 대한 자기-관용이 특히 효율적으로 파괴된다는 이점을 갖는다.
가장 바람직하게는, 데포 효과를 부여하는 아주반트는 용액 중에서 가교된 고분자량 겔을 형성할 수 있는 공중합체 아주반트이다. 이러한 아주반트의 예는 폴리젠(Polygen)™이다. 데포 효과를 부여하는 적합한 아주반트는 또한 계면활성제 시스템과 조합된 미네랄 또는 대사성 오일일 수 있다. 본 발명자들의 실험은 용액 중에서 가교된 고분자량 겔을 형성할 수 있는 공중합체 아주반트가 본 발명에 따른 백신 조성물의 다른 성분과 고도로 상용성이고 그에 적합한 담체이며, 동시에 반려 동물 및 가축에서 특히 높은 정도의 안전성을 제공한다는 것을 보여주었다.
본 발명에 따른 백신 조성물은, 특히 폴리단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 함유하는 경우에, 리포솜, 양이온성 단백질, 양이온성 중합체 또는 양이온성 세포 관통 펩티드 및/또는 도입된 핵산의 반감기, 세포 흡수 및 번역가능성을 증진시키는 다른 화학적 수단을 함유할 수 있다.
따라서, 바람직하게는, 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 본 발명에 따른 백신 조성물로서, 여기서 백신 조성물은 숙주에게 백신 조성물이 투여되는 경우에 상기 자기-단백질에 대한 자가항체를 생성시킬 수 있고, 여기서 백신 조성물은 하기를 포함한다:
a) - 숙주의 제1 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편;
- 숙주의 제2 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편;
- 임의로 숙주의 제3 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 및
- 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프
를 포함하는 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA;
및
b) 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드;
및
c) 데포 효과를 부여하는 아주반트.
보다 더 바람직하게는, 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 본 발명에 따른 백신 조성물로서, 여기서 백신 조성물은 숙주에게 백신 조성물이 투여되는 경우에 상기 자기-단백질에 대한 자가항체를 생성시킬 수 있고, 여기서 백신 조성물은 하기를 포함한다:
a) - 숙주의 제1 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편 (여기서 제1 자기-단백질은 시토카인, 바람직하게는 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 또는 TNF-알파, 가장 바람직하게는 IL-31임);
- 숙주의 제2 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편 (여기서 제2 자기-단백질은 시토카인, 바람직하게는 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 또는 TNF-알파임);
- 임의로 숙주의 제3 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편 (여기서 제3 자기-단백질은 시토카인, 바람직하게는 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 또는 TNF-알파임); 및
- 적어도 2개의 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프이며, (i) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하거나 또는 (ii) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 파상풍 독소 T-세포 에피토프인 1종 이상의 T-세포 에피토프; 바람직하게는 (i) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하거나 또는 (ii) 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된 파상풍 독소 T-세포 에피토프인 1종 이상의 T-세포 에피토프
를 포함하는 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA;
및
b) 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드이며, 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6과 적어도 75% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 85% 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 90%, 95% 또는 97% 서열 동일성을 포함하거나 또는 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드;
및
c) 데포 효과를 부여하는 아주반트이며, 용액 중에서 가교된 고분자량 겔을 형성할 수 있는 공중합체 아주반트인 데포 효과를 부여하는 아주반트.
본 발명자들의 실험은 개 숙주에게 이러한 폴리단백질을 투여함으로써, 폴리단백질에 포함된 모든 자기-단백질에 대한, 특히 개 IL-4, IL-13 및 IL-31 단백질에 대한 자가항체, 특히 중화 자가항체가 특히 B 부류 효율적인 방식으로 생성될 수 있다는 것을 보여주었다. 실험은 또한 단일 자기-단백질로부터 유래된 3개의 절편을 포함하는 백신 조성물이 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, IL-33 및 TNF-알파, 특히 개 IL-5, IL-13, IL-31 및 IL-33, 뿐만 아니라 고양이 IL-31 및 소 TNF-알파에 대한 자기-관용을 파괴하는 데 특히 효과적이라는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명에 따른 이러한 폴리단백질은 본원에 명백하게 제시된 예를 포함하나 이에 제한되지는 않는 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하는 데 매우 효율적이다.
통상의 기술자는 백신 조성물의 개별 성분을 확인하고 분석하는 방법을 알고 있다. 청구된 백신 조성물을 분석하기 위해, 통상의 기술자는 전형적으로 먼저 추출 및/또는 분리 절차를 수행하여, 예를 들어 액체 크로마토그래피, 특히 HPLC를 사용함으로써 개별 성분을 서로 분리한다. 청구된 백신 조성물에 사용된 핵산은, 예를 들어 질량 분광측정법 및/또는 서열 분석에 의해 분석될 수 있다. 백신 조성물 중 단백질은 또한, 예를 들어 질량 분광측정법에 의해 분석될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물에 함유된 올리고뉴클레오티드의 면역자극 특성은 리포터 세포주, 예를 들어 개 단핵구 세포주 (DH82)를 사용하여 평가될 수 있으며, 이는 이들 올리고뉴클레오티드의 NFkB-자극 잠재력을 평가하는 것을 가능하게 한다.
폴리단백질의 용도
본 발명은 또한 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물 중 본원에 기재된 바와 같은 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA의 용도로서, 여기서 폴리단백질은 숙주의 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 적어도 2개의 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 용도에 관한 것이다. 본 발명에 이른 연구에서, 본 발명에 따른 폴리단백질의 사용은 폴리단백질의 자기-단백질 절편 및 따라서 폴리단백질의 자기-단백질 절편이 유래된 숙주의 천연 자기-단백질에 대한 자가항체, 특히 중화 자가항체의 생산을 효율적으로 유도하는 것을 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 폴리단백질 내의 비-숙주 기원의 T-세포 에피토프의 존재, 특히 파상풍 독소 T-세포 에피토프의 존재는 숙주의 자기-단백질 절편에 대한 자기-관용을 효율적으로 파괴하는 것을 가능하게 하는 것으로 보인다.
바람직한 용도에서, 폴리단백질은 상기 본 발명에 따른 폴리단백질에 대해 정의된 특징 중 하나 이상을 갖는다.
백신 조성물의 용도
본원에 기재된 백신 조성물은 대상체에게 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기에 적합하다. 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 면역자극 백신을 투여하여 대상체에서 면역 반응을 도출하는 것을 포함한다. 면역 반응은 대상체의 표적화된 자기-단백질에 대한 자가항체, 바람직하게는 중화 항체의 유도를 포함한다. 용어 "대상체" 및 "숙주"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
특히 (개) IL-4, L-5, IL-13, IL-31, IL-33 및/또는 TNF-알파로부터 유래된 자기-단백질 절편을 함유하는 폴리단백질을 갖는 본원에 기재된 백신 조성물을 사용할 때, 관심 대상체에서 모든 각각의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하는 것이 가능하다.
질환-유발 자기-단백질에 대한 대상체의 자기-관용의 파괴는, 자가항체가 자기-단백질의 기능을 중화시키고/거나 대상체에서 자기-단백질의 이용가능한 수준을 감소시키는 것을 돕기 때문에, 이러한 자기-단백질에 의해 유발되거나 또는 영향을 받는 질환을 예방 또는 치료하는 것을 가능하게 하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 폴리단백질 내의 자기-단백질 절편이 유래된 자기-단백질은 숙주에서의 표적화된 자기-단백질로 본원에서 또한 지칭된다.
본원에 사용된 대상체는 특히 포유동물 종, 예컨대 인간 및 비-인간 동물을 의미할 수 있다. 따라서, 대상체는 인간 및 비-인간 동물을 포함한 포유동물이다. 바람직하게는, 대상체는 비-인간 동물, 특히 소, 가금류, 돼지 및 반려 동물, 예컨대 고양이 및 개로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인간 동물이다. 가장 바람직하게는, 대상체는 동물, 특히 소, 가금류, 돼지 및 반려 동물, 예컨대 고양이 및 개로 이루어진 군으로부터 선택된 동물이다. 보다 더 바람직하게는, 대상체는 개이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 백신 조성물은 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 자가면역 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 만성 질환; 또는
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
용어 "알레르기성 상태"는 면역계와 신체에 외래인 물질 사이의 상호작용에 의해 유발된 질환 또는 장애로서 본원에 정의된다.
용어 "소양성 상태"는 완화를 얻기 위해 피부를 문지르거나 긁고 싶은 충동을 일으키는 강한 가려움증 감각을 특징으로 하는 질환 또는 장애로 본원에서 정의된다.
보다 바람직하게는, 본원에 기재된 백신 조성물은 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
가장 바람직하게는, 본원에 기재된 백신 조성물은 아토피성 피부염을 예방 또는 치료하는 데 사용된다.
바람직한 실시양태에서, (개) IL-31로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하는 본원에 기재된 백신 조성물, 특히 (개) IL-31로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편 및 (개) IL-4, (개) IL-13 및/또는 (개) IL-33으로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하는 것은 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 자가면역 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 만성 질환; 또는
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
가장 바람직하게는, 본원에 기재된 백신 조성물은 바람직하게는 (개) IL-4, (개) IL-13 및/또는 (개) IL-33으로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편에 추가로, (개) IL-31로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 아토피성 피부염을 예방 또는 치료하는 데 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 백신 조성물은 개 IL-5로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 하기를 예방 및/또는 치료하는 데 사용된다:
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 및/또는
- 호산구성 장애, 특히 호산구성 천식, 호산구성 식도염, 과다호산구성 증후군 및 만성 비부비동염, 특히 비강 폴립을 동반한 만성 비부비동염.
보다 바람직하게는, 본원에 기재된 백신 조성물은 개 IL-5로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 하기를 예방 및/또는 치료하는 데 사용된다:
- 아토피성 피부염; 또는
- 호산구성 천식 또는 비강 폴립을 동반한 만성 비부비동염.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 백신 조성물은 개 IL-4로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 자가면역 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 만성 질환; 또는
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
보다 바람직하게는, 본원에 기재된 IL-4를 포함하는 백신 조성물은 개 IL-4로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
가장 바람직하게는, 본원에 기재된 백신 조성물은 개 IL-4로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 아토피성 피부염을 예방 또는 치료하는 데 사용된다.
추가의 실시양태에서, 본원에 기재된 백신 조성물은 개 IL-13으로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 자가면역 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 만성 질환; 또는
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
보다 바람직하게는, 본원에 기재된 IL-13을 포함하는 백신 조성물은 개 IL-13으로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
가장 바람직하게는, 본원에 기재된 백신 조성물은 개 IL-13으로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 아토피성 피부염을 예방 또는 치료하는 데 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 백신 조성물은 개 IL-33으로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 자가면역 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 만성 질환; 또는
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
보다 바람직하게는, 본원에 기재된 IL-33을 포함하는 백신 조성물은 개 IL-33으로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 하기를 예방 또는 치료하는 데 사용된다:
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 알레르기성 천식, 호산구성 천식 및 호중구성 천식, 비염, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태.
가장 바람직하게는, 본원에 기재된 백신 조성물은 개 IL-33으로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편을 포함하고, 아토피성 피부염 및/또는 알레르기성 비염을 예방 또는 치료하는 데 사용된다.
"치료", "치료하는" 등은 치유적 치료를 지칭한다. 용어 "예방" 및 "예방하는"은 예방적 또는 방지적 조치를 지칭한다. 치료 또는 예방을 필요로 하는 동물은 이미 장애 또는 질환 상태를 갖는 동물뿐만 아니라 장애 또는 질환 상태가 예방되어야 하는 동물을 포함한다. 용어 질환 또는 장애를 "치료하는" 또는 "예방하는"은 질환 또는 장애에 대해 예방 또는 보호하는 것 (즉, 임상 증상이 발생하지 않도록 하는 것), 질환 또는 장애를 억제하는 것 (즉, 임상 증상의 발생을 정지 또는 억제하는 것) 및/또는 질환 또는 장애를 완화시키는 것 (즉, 임상 증상의 퇴행을 유발하는 것)을 포함한다. 질환 또는 장애를 "예방하는 것"과 "억제하는 것"을 구별하는 것이 항상 가능한 것은 아닌데, 이는 궁극적인 유도 사건 또는 사건들이 알려지지 않거나 잠재성일 수 있기 때문이다. 따라서, 용어 "예방"은 또한 "예방하는" 및 "억제하는" 둘 다를 포괄하는 "치료"의 유형을 구성하는 것으로 이해될 수 있다. 용어 "치료"는 따라서 "예방"을 포함한다.
다양한 투여 경로가 본 발명의 백신 조성물을 투여하는 데 이용가능하다. 선택된 특정한 방식은 선택된 특정한 대상체 군, 대상체의 연령 및 전반적 건강 상태, 치료될 특정한 상태 및 치료적 및/또는 예방적 효능에 요구되는 투여량에 좌우될 것이다. 본 발명의 방법은 임상적으로 허용되지 않는 유해 효과를 유발하지 않으면서 유효 수준의 면역 반응을 생성하는 임의의 투여 방식을 사용하여 실시될 수 있다.
치료는 유효량의 본원에 기재된 백신 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 유효량은 수용자 대상체의 표적화된 자기-단백질에 대한 자가항체의 생산을 특징으로 하는 면역 반응을 도출하기에 충분하다. 이러한 유효량은 수용자 대상체에서 자가항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 유발하는 임의의 양이다. 자가항체의 생산을 포함하여, 본 발명의 백신 조성물에 의해 도출되는 면역 반응의 강도 및 품질을 측정하는 방법이 또한 본 발명의 일부이다 (하기 참조). 통상의 기술자는 유효량이 숙주 인자, 예컨대 동물 종, 연령, 체중, 질환의 병기, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 인자에 좌우된다는 것을 알고 있다. 용어 "백신 조성물의 적합한 유효량"은 단백질, DNA 또는 RNA 형태의 폴리단백질, 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 임의로 본 발명의 백신 조성물에 함유된 데포 효과를 부여하는 아주반트의 μg 단위의 합계를 지칭한다.
적합한 유효량은 대상체당 약 0.1 μg 내지 5000 μg의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량은 약 0.5 μg 내지 약 4500 μg, 약 약 0.5 μg 내지 약 4500 μg, 약 0.5 μg 내지 약 4500 μg, 약 1 μg 내지 약 4000 μg, 약 1 μg 내지 약 3500 μg, 약 1 μg 내지 약 3000 μg, 약 1 μg 내지 약 2500 μg, 약 1 μg 내지 약 2000 μg, 약 1 μg 내지 약 1500 μg, 약 1 μg 내지 약 1000 μg, 약 1 μg 내지 약 900 μg, 약 1 μg 내지 약 800 μg, 약 1 μg 내지 약 700 μg, 약 1 μg 내지 약 600 μg, 약 1 μg 내지 약 500 μg, 약 1 μg 내지 약 400 μg, 약 1 μg 내지 약 300 μg의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 반응은 인간 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 백신 조성물을 투여함으로써 인간에서 도출될 수 있다. 유효량은 수용자 대상체에서 표적화된 자기-단백질에 대한 자가항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 도출하기에 충분하다. 예를 들어, 인간에 대한 백신 조성물의 유효량은 대상체당 약 0.1 μg 내지 약 5000 μg, 대상체당 약 0.5 μg 내지 약 5000 μg, 대상체당 약 1 μg 내지 약 4500 μg, 대상체당 약 1 μg 내지 약 4000 μg 또는 대상체당 약 1 μg 내지 약 3500 μg일 수 있다. 예로서, 인간 대상체에 대한 적합한 유효량은 약 5000 μg, 약 4750 μg, 약 4500 μg, 약 4250 μg, 약 4000 μg, 약 3750 μg, 약 3500 μg, 약 3250 μg, 약 3000 μg, 약 2750 μg, 약 2500 μg, 약 2250 μg, 약 2000 μg, 약 1750 μg, 약 1500 μg, 1250 μg, 약 1000 μg, 약 500 μg, 약 100 μg, 약 75 μg, 약 50 μg, 약 25 μg, 약 10 μg, 약 1 μg 또는 약 0.1 μg일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 반응은 비-인간 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 백신 조성물을 투여함으로써 비-인간 동물, 특히 개에서 도출될 수 있다. 유효량은 수용자 대상체, 특히 개에서 자가항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 도출하는 데 충분하다. 예를 들어, 비-인간 동물, 특히 개에 대한 백신 조성물의 유효량은 대상체당 약 0.1 μg 내지 약 5000 μg, 대상체당 약 0.5 μg 내지 약 5000 μg, 대상체당 약 1 μg 내지 약 4500 μg, 대상체당 약 1 μg 내지 약 4000 μg 또는 대상체당 약 1 μg 내지 약 3500 μg일 수 있다. 예로서, 비-인간 대상체에 대한 적합한 유효량은 약 5000 μg, 약 4750 μg, 약 4500 μg, 약 4250 μg, 약 4000 μg, 약 3750 μg, 약 3500 μg, 약 3250 μg, 약 3000 μg, 약 2750 μg, 약 2500 μg, 약 2250 μg, 약 2000 μg, 약 1750 μg, 약 1500 μg, 1250 μg, 약 1000 μg, 약 500 μg, 약 100 μg, 약 75 μg, 약 50 μg, 약 25 μg, 약 10 μg, 약 1 μg, 0.5 μg 또는 약 0.1 μg일 수 있다.
본원에서 수치 값과 관련하여 용어 "약"의 사용은 수치 값이 전형적으로 수치 값을 ± 5% 이하만큼 변화시키는 측정 오차에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 나타낸다. 용어 "약"과 함께 본원에 개시된 수치 값은 또한 그 자체, 즉 용어 "약" 없이 개시된 것으로 의도된다. 추가로, 본원에 언급된 바와 같은 수치 범위는 그 범위 내의 각각의 및 모든 값을 포함하고 개시하는 것으로 의도된다. 본원에 개시된 동일한 파라미터에 대한 범위의 모든 상한 및 하한 종점은 서로 조합가능하다. 본원에 개시된 상이한 파라미터에 대한 모든 범위는 서로 조합가능하다. 특히, 상이한 또는 동일한 "선호 수준"의 범위는 특히 서로 상용성이다.
백신 조성물은 정맥내로, 근육내로, 피내로, 복강내로, 피하로, 분무에 의해, 우포 방법에 의해 난내로, 경구로, 안내로, 기관내로, 비강내로 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 투여될 수 있다. 백신 조성물은 피하로 투여될 수 있다. 백신 조성물은 또한 근육내로 투여될 수 있다. 백신 조성물은 또한 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 대상체에서 질환이 예방 또는 치료되도록 대상체에서 면역 반응을 도출한다.
투여는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 바늘 (예를 들어, 피하 바늘)을 통한 주사가 특히 근육내, 피하, 안내, 복강내 또는 정맥내 투여에 사용될 수 있다. 무바늘 주사가 대안으로서 사용될 수 있다.
효소-연결 면역흡착 검정
본 발명의 백신 조성물, 폴리단백질 및 용도는 본 발명자들이 숙주에서 본 발명의 폴리단백질 또는 백신 조성물을 사용할 때 생산된 자가항체를 특이적으로 검출하기 위해 개발한 검정에 의해 보충된다. 이러한 검정 방법은 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)이고, 하기 단계를 포함한다:
a) 시험 표면 상에 항원을 흡착시키는 단계;
b) 시험 표면 상의 자유 결합 부위를 차단하는 단계;
c) 항원-코팅되고 차단된 시험 표면을, 항원에 대한 표지된 항체 및 항원에 대한 시험될 자가항체를 포함하는 혼합물과 함께 인큐베이션하는 단계; 및
d) 표지된 항체의 결합을 검출하는 단계.
자가항체, 특히 시토카인에 대한 자가항체의 검출은 전형적으로 어려움 투성이지만, 이는 본 발명의 검정에 의해 극복된다. 예를 들어, 선행 기술 검정은 무손상 IgG 분자와 플라스틱 또는 니트로셀룰로스 막에 부착된 (재조합) 항원 사이에 발생하는 비특이적 및 저친화도 결합 때문에 종종 가양성 시험 결과를 전달하였다. 검출을 위해 진핵 세포에서 생산된 글리코실화된 항원, 예컨대 시토카인을 사용하는 것은 또한 시험된 혈청 중 항폴리사카라이드 항체 때문에 가양성 결과로 이어질 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 검정은 관심 표적화된 숙주 단백질에 대한 표지된 공지된 항체와 시험될 자가항체의 경쟁에 대한 그의 의존 때문에 이들 어려움을 극복하는 것으로 보인다. 검정의 이러한 경쟁 원리는 가양성 결과를 최소화한다.
본 발명에 따른 검정의 단계 a)에서, 항원은 시험 표면에 흡착된다. 본원에 사용된 용어 "흡착시키는"은 "시험 표면을 항원과 함께 인큐베이션하여 시험 표면에 항원이 점착되도록 하는 것"을 의미한다. 이와 관련하여 "에 점착된"은 "에 결합된" 또는 "에 부착된"의 의미로 의도된다. 시험 표면은 ELISA 포맷에 전형적으로 사용되는 임의의 표면, 예컨대 웰 플레이트의 표면, 특히 플라스틱 웰 플레이트, 바람직하게는 폴리스티렌 웰 플레이트의 표면일 수 있다.
본원에 사용된 "항원"은 숙주가 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하도록 추가적으로 유도할 수 있는, 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다. 항원은 1종 또는 1종 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 바람직하게는, 단계 a)에서 사용된 항원은 본 발명의 폴리단백질, 그의 단일 단백질 절편 또는 본 발명의 폴리단백질 내의 단백질 절편이 유래된 표적화된 자기-단백질이거나 또는 그를 포함한다.
본 발명에 따른 검정의 단계 b)에서, 시험 표면 상의 자유 결합 부위가 차단된다. 이는 시험 표면에 대한 표지된 항체 및 시험될 자가항체의 비특이적 결합을 방지한다. 단계 b)를 달성하기 위한 적합한 용액, 소위 차단 용액은 다른 전형적인 ELISA 포맷으로부터 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 차단 용액은 항상 차단제를 함유한다. 차단제는 단백질 또는 단백질의 혼합물일 수 있다. 특히, 차단제는 소 혈청 알부민 (BSA), 신생 송아지 혈청 (NBCS), 카세인, 탈지 분유 또는 젤라틴일 수 있다. 바람직하게는, 차단제는 젤라틴이다. 본 발명의 검정에서 차단제로서 젤라틴을 사용하였을 때, 본 발명자들의 실험은 배경 신호가 특히 낮음을 보여주었다.
본 발명에 따른 검정의 단계 c)는 검정의 경쟁 원리를 반영한다. 단계 c)는 단계 a)의 시험-표면-흡착된 항원에의 결합에 대한 표지된 항체와 시험될 자가항체의 경쟁을 수반한다. 바람직하게는, 표지된 항체는 표지된 중화 항체이다. 검정을 위해 관심 항원에 대한 표지된 항체가 사용되기 때문에, 이 항체는 단지 시험될 자가항체가 사용된 항원에 대해 표지된 항체와 적어도 유사하게 높은 결합 친화도를 갖는 경우에만 대체되거나 능가될 수 있다. 표지된 항체 및 시험될 자가항체를 포함하는, 단계 c)에서 사용된 혼합물은 규정된 양의 표지된 항체를 함유한다. 이와 관련하여 용어 "규정된 양"은 통상의 기술자가 검정에 사용된 표지된 항체의 양 또는 농도를 알고 있다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 25 내지 200 ng/ml의 표지된 항체, 보다 바람직하게는 50 내지 150 ng/ml의 표지된 항체, 가장 바람직하게는 75 내지 125 ng/ml의 표지된 항체가 단계 c)의 혼합물에 사용된다. 본 발명자들의 실험은 본 발명의 검정에서 이러한 농도의 표지된 항체를 사용할 때, 시험될 자가항체와의 경쟁이 특히 잘 검출될 수 있다는 것을 보여주었다.
바람직하게는, 단계 c)의 2종의 항체 사이의 경쟁은 시험될 자가항체의 희석률이 상이한 일련의 혼합물을 제공함으로써 시험된다. 시험될 자가항체는 1:1 내지 1:20.000, 바람직하게는 1:1 내지 1:15.000, 가장 바람직하게는 1:1 내지 1:10.000의 희석물로 사용될 수 있다.
용어 "표지된 항체"는 무손상 이뮤노글로불린 분자, 뿐만 아니라 그의 부분, 단편, 펩티드 및 유도체, 예컨대, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fse, CDR 영역, 파라토프 또는 단계 a)의 항원에 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분 또는 펩티드 서열 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 표지된 항체는 항원 분자와 특이적으로 반응하여 항원 분자가 항체에 결합하도록 할 수 있는 경우에 단계 a)의 항원에 "결합할 수 있는" 것으로 언급된다.
표지된 항체는 또한 임의의 공지된 기술, 예컨대 비제한적으로 효소적 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기술에 의해 제공되는, 키메라 항체 또는 헤테로키메라 항체, 뿐만 아니라 그의 단편, 부분, 영역, 펩티드 또는 유도체를 포함한다.
본 발명의 검정의 단계 d)는 항원-결합된 표지된 항체의 검출에 관한 것이다. 표지된 항체의 검출은 그의 표지에 기초한다. 항원-결합된 표지된 항체의 양은 궁극적으로 시험될 자가항체가 시험 표면-결합된 항원에 대한 결합에서 표지된 항체를 얼마나 효과적으로 능가하는 지에 의존한다.
항체의 적합한 표지는 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 통상의 기술자는 표지 방사성 동위원소, 예컨대 14C 또는 태그, 예컨대 비오틴을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 비오틴이 표지로서 사용된다. 표지로서의 비오틴은 기존 단백질에 직접 부착될 수 있다는 이점을 갖는다.
방사성표지된 항체는, 예를 들어 방사측정 검출기로 방사능을 측정함으로써 또는 섬광 칵테일 및 섬광 계수기를 사용함으로써 직접 검출될 수 있다.
태그 형태의 항체의 표지는 리포터에 커플링된 적합한 표지-결합 모이어티로 검출될 수 있다. 비오틴에 적합한 표지-결합 모이어티는, 예를 들어 아비딘 또는 스트렙타비딘일 수 있다. 비오틴-스트렙타비딘 또는 비오틴-아비딘의 매칭 시스템은 2종의 매칭 파트너의 결합이 특히 특이적이고 강하다는 이점을 갖는다.
표지-결합 모이어티에 커플링된 적합한 리포터는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 형광 태그, 예컨대 GFP일 수 있다. 형광 태그는 그의 형광을 측정함으로써 직접 검출될 수 있지만, 리포터 효소가 측정가능한 착색 생성물을 유도하는 반응을 촉매하는 데 사용될 수 있다.
알칼리성 포스파타제에 적합한 비색 기질은, 예를 들어 4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물 (pNPP)이다. pNPP의 탈인산화 시, 405 nm에서 강한 흡수를 갖는 수용성 황색 생성물이 수득된다. 405 nm에서의 흡수는 ELISA 판독기, 예를 들어 에포크 판독기 (150115E) 또는 시너지 H1 판독기 (180427C)로 측정될 수 있다. 알칼리성 포스파타제에 대한 다른 적합한 비색 기질은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 (BCIP)이고, 니트로블루 테트라졸륨 (NBT)은 자주색 착색 침전물을 생산한다.
양고추냉이 퍼옥시다제에 적합한 비색 기질은, 예를 들어 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 2,2'-아지노-디 [3-에틸벤즈티아졸린] 술포네이트 (ABTS)이다.
본 발명의 검정은 단계 a) 내지 d) 사이에 추가의 단계, 예컨대 시험-표면 흡착된 항원에 결합되지 않은 임의의 항체 물질을 제거하기 위한 세척 단계를 함유할 수 있다.
본 발명자들의 실험은 본 발명의 검정이 IL-31, 특히 개 IL-31에 대한 자가항체를 검출하는 데 특히 매우 적합하다는 것을 보여주었다. 이 경우에, (개) IL-31을 함유하는 상기 기재된 바와 같은 폴리단백질 또는 이 폴리단백질의 (개) IL-31 단백질 절편이 항원으로서 사용되고, 표지된 항체로서 (개) IL-31의 기능을 교란시키거나 또는 심지어 중화시키는 표지된 항체가 사용된다.
바람직하게는, 하기로 이루어진 군 중 적어도 하나를 포함하는, 개 IL-31에 대한 표지된 항체가 본 발명의 검정에 사용된다:
- 아미노산 서열 YYDIN (서열식별번호: 8), SYDMS (서열식별번호: 9) 또는 NYGMS (서열식별번호: 10)를 갖는 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)1;
- 아미노산 서열 WIFPGDGGTKYNETFKG (서열식별번호: 11), TITSGGGYTYSADSVKG (서열식별번호: 12) 또는 TISYGGSYTYYPDNIKG (서열식별번호: 13)를 갖는 가변 중쇄 CDR2; 및
- 아미노산 서열 ARGGTSVIRDAMDY (서열식별번호: 14), ARQNWVVGLAY (서열식별번호: 15) 또는 VRGYGYDTMDY (서열식별번호: 16)를 갖는 가변 중쇄 CDR3.
보다 바람직하게는, 하기로 이루어진 군 중 적어도 하나를 포함하는, 개 IL-31에 대한 표지된 항체가 본 발명의 검정에 사용된다:
- 아미노산 서열 RASESVDNYGISFMH (서열식별번호: 17), KSSQSLLNSGNQKNYLA (서열식별번호: 18) 또는 KASQSVSFAGTGLMH (서열식별번호: 19)를 갖는 상보성 결정 영역 (CDR) 1을 포함하는 가변 경쇄 (VL);
- 아미노산 서열 RASNLES (서열식별번호: 20), GASTRES (서열식별번호: 21) 또는 RASNLEA (서열식별번호: 22)를 갖는 가변 경쇄 CDR2; 및
- 아미노산 서열 QQSNKDPLT (서열식별번호: 23), QNDYSYPYT (서열식별번호: 24) 또는 QQSREYPWT (서열식별번호: 25)를 갖는 가변 경쇄 CDR3.
보다 바람직하게는, 하기로 이루어진 군 중 적어도 하나를 포함하는, 개 IL-31에 대한 표지된 항체가 본 발명의 검정에 사용된다:
a) (서열식별번호: 26), (서열식별번호: 27), (서열식별번호: 28), (서열식별번호: 29), (서열식별번호: 30), (서열식별번호: 31) 또는 (서열식별번호: 32)를 포함하는 가변 경쇄;
b) (서열식별번호: 33), (서열식별번호: 34), (서열식별번호: 35), (서열식별번호: 36), (서열식별번호: 37) 또는 (서열식별번호: 38)을 포함하는 가변 중쇄.
이러한 표지된 중화 항체는 개 IL-31에 매우 효율적으로 결합한다 (WO2013/011407 A1 참조). 상업용 항체 로키베트맙은 개 IL-31에 대한 중화 자가항체를 검출하기 위한 본 발명에 따른 검정 방법에 사용하기에 특히 적합하다.
서열 목록
본 출원은 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상기 서열 목록 파일은 파일명이 220057WO_Sequence listing_FINAL.txt이고, 크기가 343 KB이다.
서열식별번호: 1은 파상풍 독소 T-세포 에피토프 p2의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 39는 파상풍 독소 T-세포 에피토프 p4의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 2는 파상풍 독소 T-세포 에피토프 p30의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 3은 개 IL-31의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 4는 실시예 13a의 백신에 사용된 cIL-31 폴리단백질의 아미노산 서열의 한 버전이다.
서열식별번호: 40은 실시예 13a의 백신에 사용된 cIL-31 폴리단백질의 아미노산 서열의 또 다른 버전이다.
서열식별번호: 40은 단지 그의 N-말단에서만 서열식별번호: 4와 상이하다. 서열식별번호: 4와 비교하여, 서열식별번호: 40은 N-말단에 3개의 추가의 아미노산 ("SHM")을 갖는다. 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 40에 의해 코딩되는 폴리단백질의 상이한 N-말단은 N-말단 ER-신호 서열의 상이한 절단 사건으로부터 생성된다.
서열식별번호: 5는 면역자극 올리고뉴클레오티드 1668-PTO의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 6은 면역자극 올리고뉴클레오티드 2006-PTO의 핵산 서열이다:
서열식별번호: 7은 실시예 1a의 cIL-31 폴리단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-cIL31-폴리의 핵산 서열이다.
하기 서열은 본 발명에 따른 검정 방법에 적합한 항-개 IL-31 표지된 중화 항체와 관련된 아미노산 서열에 관한 것이다: 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37 및 서열식별번호: 38.
서열식별번호: 41은 개 IL-5의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 42는 실시예 13b의 백신 구축물에 사용된 cIL-5 폴리단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 43은 실시예 13b의 백신 구축물에 사용될 수 있는 cIL-5 폴리단백질의 대안적 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 44는 실시예 1b의 cIL-5 폴리단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-5-폴리의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 45는 실시예 3b의 cIL-5 단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-5의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 46은 개 IL-13의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 47은 실시예 13c의 백신 구축물에 사용된 cIL-13 폴리단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 48은 실시예 1c의 cIL-13 폴리단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-13-폴리의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 49는 실시예 3c의 cIL-13 단백질 구축물을 코딩하는 박테리아 발현 플라스미드 pET30a-cIL-13의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 50은 전장 개 IL-33 단백질 (유니프롯(Uniprot) O97863) 개 IL-33-WT의 아미노산 110-263의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 51은 전장 개 IL-33 단백질 (유니프롯 O97863)의 아미노산 110-263이며, 여기서 유전자 생성물의 안정성을 개선시키기 위해 3개의 시스테인 잔기가 세린에 의해 대체된 (IL-33-CS), 개 IL-33-CS의 변경된 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 52는 실시예 3d의 cIL-33_WT 단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pET30a(+)-canIL33-WT의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 53은 실시예 3e의 cIL-33_CS 단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pET30a(+)-canIL33-CS의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 54는 실시예 13d의 백신 구축물에 사용된 cIL-33-CS 폴리단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 55는 실시예 1d의 cIL-33-CS 폴리단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pET30a-cIL33-(CS-)폴리의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 56은 개 IL-4의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 57은 실시예 13e의 백신 구축물에 사용된 cIL-4 폴리단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 58은 실시예 1e의 cIL-4 폴리단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-5-폴리의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 59는 실시예 3f의 cIL-4 단백질 구축물을 코딩하는 박테리아 발현 플라스미드 pET30a-cIL-4의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 60은 고양이 IL-31의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 61은 실시예 13f의 백신 구축물에 사용된 고양이 IL-31 폴리단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 62는 실시예 1g의 고양이 IL-31 폴리단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-felIL31-폴리의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 63은 실시예 3g의 고양이 IL-31 단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-fel-IL31의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 64는 소 TNF-알파의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 65는 실시예 6h의 면역화에 사용된 소 TNF-알파 폴리단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 66은 실시예 6h의 면역화에 사용된 소 TNF-알파 폴리단백질을 코딩하는 박테리아 발현 플라스미드 pET30a-bov-TNF-알파-폴리의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 67은 주어진 실시예에서 포유동물 발현에 사용된 인공 ER 유입 신호의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 68 내지 201은 서열 목록에 기재된 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 202는 실시예 1h의 cIL-13-cIL-4 폴리단백질 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-13-cIL-4-폴리의 핵산 서열이다. 이 서열은 인간 코돈-최적화되고, cIL-4-폴리-His6 폴리펩티드 구축물로부터 유래된다.
서열식별번호: 203은 실시예 13h의 백신 구축물에 사용된 cIL-13-cIL-4 폴리단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 204는 실시예 1i의 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리-His6 구축물을 코딩하는 플라스미드 pcDNA3.4-cIL31-cIL-13-cIL-4-폴리의 핵산 서열이다.
서열식별번호: 205는 실시예 13i의 백신 구축물에 사용된 cIL-31-cIL-13-cIL-4 폴리단백질의 아미노산 서열이다.
실시예
실시예 1a: cIL-31의 3개의 절편을 포함하는 IL-31 폴리단백질의 설계
성숙 개 IL-31 단백질의 3개의 카피를 포함하는 폴리단백질을 코딩하며, 여기서 성숙 개 IL-31 (cIL-31) 단백질은 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 의해 서로 분리되고, C-말단 성숙 cIL-31에 이어서 2종의 추가의 파상풍 독소 T-세포 에피토프가 존재하는 것인 DNA 구축물을 설계하였다 (도 1 참조). 코딩된 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호 및 C-말단에 His6-태그를 추가로 함유한다 (도 1 참조). 이 DNA 구축물을, 포유동물 세포에서의 발현을 개선시키기 위해 폴리단백질의 개시 코돈의 상류에 코작 서열을 함유하도록 및 간단한 클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위를 함유하도록 추가로 설계하였다. 이 DNA 구축물을 합성한 후, DNA 구축물을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하여, 7637 bp 크기의 벡터 pcDNA3.4-cIL31-폴리 (서열식별번호: 7 및 도 2에서의 플라스미드 맵)를 생성하였다. Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
실시예 1b: cIL-5의 3개의 절편을 포함하는 IL-5 폴리단백질의 설계
실시예 1a에서의 개 IL-31 폴리단백질에 대한 것과 동일한 방식으로 성숙 개 IL-5 단백질의 3개의 카피를 포함하는 폴리단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 설계하였다 (도 39 참조). cIL-5-폴리단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하여, 7430 bp 크기의 벡터 pcDNA3.4-cIL-5-폴리 (서열식별번호: 43 및 도 40에서의 플라스미드 맵)를 생성하였다. Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
실시예 1c: cIL-13의 3개의 절편을 포함하는 IL-13 폴리단백질의 설계
실시예 1a에서의 개 IL-31 폴리단백질에 대한 것과 동일한 방식으로 성숙 개 IL-13 단백질의 3개의 카피를 포함하는 폴리단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 설계하였다 (도 47 참조). cIL-13-폴리단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하여, 7418 bp 크기의 벡터 pcDNA3.4-cIL-13-폴리 (서열식별번호: 48 및 도 48에서의 플라스미드 맵)를 생성하였다. Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
실시예 1d: cIL-33-CS의 3개의 절편을 포함하는 IL-33-CS 폴리단백질의 설계
성숙 개 IL-33-CS 단백질의 3개의 카피를 포함하는 cIL-33-CS 폴리단백질 (폴리단백질 - 서열식별번호: 54)을 코딩하며, 여기서 성숙 개 IL-33-CS (cIL-33) 단백질은 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 의해 서로 분리되고, C-말단 성숙 cIL-33-CS에 이어서 2종의 추가의 파상풍 독소 T-세포 에피토프가 존재하는 것인 DNA 구축물을 설계하였다 (도 63 참조). 폴리단백질은 도 63에 제시된 바와 같이 인공 개시 메티오닌 및 His6 태그를 추가로 함유한다.
이러한 폴리펩티드 서열에 기초하여, Hi6-cIL33-CS-폴리 (서열식별번호: 55)를 코딩하며, 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 개선시키기 위한 개시 ATG 코돈 및 박테리아 발현 벡터 pET30a 내로의 간단한 서브클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위 (NdeI 및 HindIII)를 포함하는 DNA를 설계하고 합성하였다.
DNA 구축물을 pET30a 박테리아 발현 벡터 내로 서브클로닝하여, 6954 bp 크기의 벡터 pET30a-cIL-33-폴리 (즉, pET30a-cIL-33-CS 폴리)를 생성하였다 (도 64에서의 플라스미드 맵).
본 발명자들은 기초 단백질로서 cIL-33-WT 대신에 cIL-33-CS를 갖는 cIL-33 폴리-형태를 구축하였다. 본 발명자들은, 인간 IL-33-WT가 HEK-블루(HEK-Blue)™ IL-33 세포에 의해 민감하게 인식되는 것으로 공지되어 있지만, 개 IL-33-WT는 cIL-33-CS에서와 같이 단지 유리 시스테인이 세린으로 돌연변이된 후에만 민감하게 인식된다는 것을 발견하였다 (하기 실시예 12c 참조). 이론에 얽매이지는 않지만, 돌연변이는 cIL-33-폴리 구축물에서 불리할 수 있는 유리 시스테인의 잠재적 구조적 문제를 극복한 것으로 보인다. 유리 시스테인의 이러한 돌연변이가 모든 IL-33 구축물에 대해 요구되는 것은 아니지만, 이는 유리하고 본 발명의 바람직한 실시양태이다.
실시예 1e: cIL-4의 3개의 절편을 포함하는 IL-4 폴리단백질의 설계
실시예 1a에서의 개 IL-31 폴리단백질에 대한 것과 동일한 방식으로 성숙 개 IL-4 단백질의 3개의 카피를 포함하는 폴리단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 설계하였다 (도 68 참조). cIL-4-폴리단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하여, 7373 bp 크기의 벡터 pcDNA3.4-cIL-4-폴리 (서열식별번호: 58 및 도 69에서의 플라스미드 맵)를 생성하였다. Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
실시예 1f: fel-IL-31의 3개의 절편을 포함하는 고양이 IL-31 폴리단백질의 설계
성숙 고양이 (펠리스 카투스(Felis catus); 펠리스 실베스트리스 카투스(Felis silvestris catus)) IL-31 단백질 (서열식별번호: 60)의 3개의 카피를 포함하는 폴리단백질 (서열식별번호: 61)을 코딩하며, 여기서 성숙 고양이 IL-31 (fel-IL-31) 단백질은 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 의해 서로 분리되고, C-말단 성숙 fel-IL-31에 이어서 2종의 추가의 파상풍 독소 T-세포 에피토프가 존재하는 것인 DNA 구축물 (서열식별번호: 62)을 설계하였다 (도 74 참조). 코딩된 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호 및 C-말단에 His6-태그를 추가로 함유한다 (도 74 참조). 이 DNA 구축물을, 포유동물 세포에서의 발현을 개선시키기 위해 폴리단백질의 개시 코돈의 상류에 코작 서열을 함유하도록 및 간단한 클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위를 함유하도록 추가로 설계하였다. 이 DNA 구축물을 합성한 후, DNA 구축물을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 발현 플라스미드 pcDNA3.4-felIL31-폴리 (7597 bp)를 생성하였다. Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
실시예 1g: 본 발명에 따른 폴리단백질 실시양태의 설계
실시예 1a에서의 개 IL-31 폴리단백질에 대한 것과 동일한 방식으로 2 또는 3종의 상이한 자기-단백질의 2개의 카피를 포함하는 폴리단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 설계할 수 있다. 즉, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 구축물을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하고, Expi293F 세포 발현을 위해 형질감염 등급 플라스미드를 제조한다.
2종의 상이한 자기-단백질의 2개의 카피를 포함하는 폴리단백질의 설계는 하기와 같이 달성될 수 있다:
폴리단백질을 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201의 서열 중 하나를 갖는 제1 자기-단백질의 2개의 카피 및 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201의 서열 중 하나를 갖는 제2 자기-단백질의 2개의 카피를 포함하도록 설계하며, 여기서 제1 및 제2 자기-단백질은 동일한 것이 아니라, 동일한 숙주 유기체로부터의 것이다.
이들 예는 제1 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30), 이어서 제2 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30), 이어서 제1 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30), 이어서 제2 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 1 또는 2종의 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (p2, p4 또는 p30)를 포함하는 본 발명에 따른 폴리단백질 구축물을 예견한다. 파상풍 독소 T 세포 에피토프를 교대하는 것 (예를 들어, 먼저 p2, 이어서 p30, 이어서 p2, 이어서 p30)이 유리하다.
예를 들어, 본 발명에 따른 폴리단백질 구축물을 제1 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2), 이어서 제2 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2 (서열식별번호: 1), 이어서 제1 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2), 이어서 제2 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 1 또는 2종의 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 및/또는 p2 (각각 서열식별번호: 2 및 1)를 포함하도록 설계할 수 있다. 링커, 태그 및 ER 유입 신호에 관한 동일한 원리가 이들 예에 적절하게 적용된다.
대안적으로, 제1 자기-단백질의 제2 카피 및 제2 자기-단백질의 제2 카피는 융합될 수 있고, 단지 테트라글리신 스페이서에 의해서만 분리된 다음, 이어서 여분의 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30)가 존재하고, 모든 다른 구축물 세부사항은 동일하게 유지된다.
3종의 상이한 자기-단백질의 2개의 카피를 포함하는 폴리단백질의 설계가 또한 이들 예에서 예견되고, 이는 하기와 같이 달성될 수 있다:
3종의 상이한 자기-단백질로부터의 적어도 2개의 절편을 포함하는 폴리단백질 구축물을, 제1의 2종의 자기-단백질과 동일한 숙주의 것인 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201로부터 선택된 제3의 (상이한) 자기-단백질의 제1 및 제2 카피를 추가적으로 코딩하도록 하고, 첨가된 자기-단백질 카피당 1종의 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4, p30) 뿐만 아니라 필요한 링커를 포함시킴으로써 설계할 수 있다.
이들 예는 제1 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30), 이어서 제2 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30), 이어서 제3 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30), 이어서 제1 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30), 이어서 제2 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (예를 들어 p2, p4 또는 p30), 이어서 제3 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 1 또는 2종의 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (p2, p4 또는 p30)를 포함하는 본 발명에 따른 폴리단백질 구축물을 예견한다. 파상풍 독소 T 세포 에피토프를 교대하는 것 (예를 들어, 먼저 p2, 이어서 p30, 이어서 p2, 이어서 p30 등)이 유리하다.
특정한 예로서, 본 발명에 따른 폴리단백질 구축물은 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201로부터 선택된 제1 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2), 이어서 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201로부터 선택된 제2 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2 (서열식별번호: 1), 이어서 서열식별번호: 3, 41, 46, 50, 51, 56, 60, 64 또는 서열식별번호: 68-201로부터 선택된 제3 자기-단백질의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2), 이어서 제1 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2 (서열식별번호: 1), 이어서 제2 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2), 이어서 제3 자기-단백질의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2), 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2 (서열식별번호: 1)를 포함한다. 링커, 태그 및 신호 서열의 동일한 원리가 적용된다.
실시예 1h: 본 발명에 따른 IL-13-IL-4-폴리단백질 실시양태의 설계
cIL-13 (서열식별번호: 46) 및 cIL-4 (서열식별번호: 56) 성숙 폴리펩티드의 연속 배열을 설계하였으며, 여기서 제1 cIL-13 및 cIL-4 절편은 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2 (서열식별번호: 1)에 의해 분리된다. 이에 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2)이 존재한다 (도 77). 이러한 제1 배열에 부착된 제2 cIL-13 (서열식별번호: 46) 및 제2 cIL-4 (서열식별번호: 56) 절편은 융합되고, 단지 테트라글리신 스페이서에 의해서만 분리된 다음, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2)의 2개의 카피 및 1종의 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2 (서열식별번호: 1)가 존재하였다. 모든 개별 요소는 G/S/A-함유 테트라펩티드 가교에 의해 분리되었다. N-말단에 내형질 세망 및 분비 경로 내로의 유입을 위한 신호 서열을 부착하고 (서열식별번호: 63), C-말단에 간단한 정제를 위한 태그 (His6)를 첨가하였다. 주목할 것은, 순서가 실제로 중요하지는 않지만, 이들 실험에 사용된 순서는 cIL-13-cIL-4였다. 그에 대한 라벨링 또는 참조에서의 임의의 차이는 오류이며, 이러한 정확한 순서를 지칭하는 것으로 의도되었다.
실시예 1i: 본 발명에 따른 삼중 (IL-31-IL4-IL-13) 폴리단백질 실시양태의 설계
성숙 폴리펩티드 cIL-31 (서열식별번호: 3), cIL-13 (서열식별번호: 46) 및 cIL-4 (서열식별번호: 56)의 반복적 모듈 배열을 설계하였으며, 여기서 제1 cIL-31 및 cIL-13 절편은 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 (서열식별번호: 2)에 의해 분리된다. 이에 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2 (서열식별번호: 2) 및 제1 cIL-4 절편이 존재한다 (도 84 참조). [cIL-31]-[p2]-[cIL-13]-[p30]-[cIL-4] 모듈의 제2 카피는 p30 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (서열식별번호: 2)에 의해 제1 모듈로부터 분리된다. C-말단은 p30 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (서열식별번호: 2)에 이어서 p2 파상풍 독소 T 세포 에피토프 (서열식별번호: 1)의 배열에 의해 형성된다. 모든 개별 요소는 G/S/A-함유 테트라펩티드 가교에 의해 분리된다. N-말단에 내형질 세망 및 분비 경로 내로의 유입을 위한 신호 서열이 부착되고, C-말단에 간단한 정제를 위한 태그 (His6)가 첨가된다.
주목할 것은, 순서가 실제로 중요하지는 않지만, 이들 실험에 사용된 순서는 cIL-31-cIL-13-cIL-4였다. 그에 대한 라벨링 또는 참조에서의 임의의 차이는 오류이며, 이러한 정확한 순서를 지칭하는 것으로 의도되었다.
실시예 1j: 소 TNF-알파의 3개의 절편을 포함하는 소 TNF-알파 폴리단백질의 설계
TNF-알파 (서열식별번호: 64) 단백질의 3개의 카피를 포함하는 소 TNF-알파 폴리단백질 (폴리단백질 - 서열식별번호: 65)을 코딩하며, 여기서 TNF-알파 단백질은 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 의해 서로 분리되고, C-말단 TNF-알파에 이어서 2종의 추가의 파상풍 독소 T-세포 에피토프가 존재하는 것인 DNA 구축물 (서열식별번호: 66)을 설계하였다 (도 92 참조). 폴리단백질은 도 92에 제시된 바와 같이 인공 개시 메티오닌 및 His6 태그를 추가로 함유한다. 헥사-G/S-링커를 이 구축물에 사용하였다.
이 폴리펩티드 서열에 기초하여, Hi6-bov-TNF-알파-폴리 (서열식별번호: 66)를 코딩하며, 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 개선시키기 위한 개시 ATG 코돈 및 박테리아 발현 벡터 pET30a 내로의 간단한 서브클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위 (NdeI 및 HindIII)를 포함하는 DNA를 설계하고 합성하였다.
DNA 구축물을 pET30a 박테리아 발현 벡터 내로 서브클로닝하여, 7017 bp 크기의 벡터 pET30a(+)-bov-TNF-알파-폴리를 생성하였다.
실시예 2a: Expi293F 세포에서의 cIL-31의 3개의 절편을 포함하는 cIL-31 폴리단백질의 발현 및 발현된 폴리단백질의 정제
Expi293F 세포를 무혈청 Expi293™ 발현 배지 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에서 성장시켰다. Expi293F 세포를 삼각 플라스크 (코닝 인크.(Corning Inc.)) 내에 넣어 오비탈 진탕기 (VWR 사이언티픽(VWR Scientific)) 상에서 8% CO2 하에 37℃에서 유지하였다. 형질감염 1일 전에, 세포를 코닝 삼각 플라스크에 적절한 밀도로 시딩하였다. 형질감염 당일에, 플라스미드 pcDNA3.4-cIL31-폴리 및 형질감염 시약을 최적 비로 혼합한 다음, 형질감염을 위해 준비된 세포가 있는 플라스크 내로 첨가하였다. 제6일에 수집된 세포 배양 상청액을 pcDNA3.4-cIL31-폴리 (서열식별번호: 7 및 도 2에서의 플라스미드 맵)로부터 발현된 폴리단백질의 정제에 사용하였다. 생산된 성숙 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호를 더 이상 포함하지 않을 것으로 예상되고, 따라서 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 40의 서열을 갖는다. 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 40은 ER 유입 신호의 상이한 절단 사건으로 인해 그의 N-말단에서 서로 상이하다.
발현된 폴리단백질의 정제 및 분석을 하기와 같이 수행하였다:
세포 배양 브로쓰를 원심분리하였다. 그 후에, 세포 배양 상청액을 적절한 유량으로 Ni2+-NTA 친화도 정제 칼럼 상에 로딩하였다. 적절한 완충제로 세척하고 용리한 후, 용리된 분획을 풀링하고, 완충제를 PBS, pH 7.2인 최종 제제 완충제로 교환하였다.
정제된 폴리단백질을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하여 그의 분자량 및 순도를 결정하였다. 그렇게 하기 위해, 정제된 폴리단백질의 농도를 보정 곡선에 대한 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 검정에 의해 결정하였다. 대략 16 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 (cIL-31)-p4-(cIL-31)-p30-(cIL-31)-p30-p4-His6 폴리단백질 (하기 실시예에서 cIL-31 폴리단백질 또는 cIL-31 폴리로 지칭됨)을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
SDS-PAGE 분석을 위해, 하기 로딩 완충제를 사용하였다:
- 환원 로딩 완충제: 300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, 250 mM DTT, pH 6.8.
- 비-환원 로딩 완충제: 300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, pH 6.8.
환원 및 비-환원 로딩 완충제를 각각 폴리단백질 샘플에 첨가하였다. 환원 또는 비-환원 로딩 완충제를 함유하는 폴리단백질 샘플은 0.5 mg/ml에 근접한 농도를 가졌다.
폴리단백질 샘플을 환원 로딩 완충제와 혼합한 후, 100℃에서 5-10분 동안 가열을 수행하였다.
환원 또는 비-환원 로딩 완충제를 함유하는 폴리단백질 샘플을 10000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 다음, 프리캐스트 겔 (젠스크립트, 카탈로그 번호 M42012)의 겔 챔버에 로딩하였다. 이들 겔을 사용한 SDS-PAGE를 제조업체에 의해 약술된 바와 같이 수행하였다 (대략 60분 동안 140 V). 그 후에, 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 염색된 겔이 도 3에 제시된다.
도 3에서 쿠마시 블루-염색된 겔의 레인 1에서의 우세한 밴드는 단백질 서열로부터 예상된 것 (56865.04 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 약간 더 크다. 이러한 차이는 cIL-31 단백질 서열이 8개의 N-글리코실화 부위를 함유하기 때문에 (이 중 7개는 NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여 변형될 가능성이 있음) 광범위한 N-글리코실화로부터 일어날 가능성이 있다.
비-환원 조건 하에 (도 3에서 쿠마시 블루-염색된 겔의 레인 2), 로딩된 단백질의 단지 대략 절반만이 밴드로 이동하였으며, 이는 단량체를 나타낸다. 많은 비율은 이량체 및 다량체 형태인 것으로 보인다.
실시예 2b: Expi293F 세포에서의 cIL-5의 3개의 절편을 포함하는 cIL-5 폴리단백질의 발현 및 발현된 폴리단백질의 정제
cIL-5 폴리단백질의 발현을 실시예 2a의 cIL-31 폴리단백질의 발현에 대한 것과 동일하게 수행하였으며, 예외로 pcDNA3.4-cIL31-폴리 (서열식별번호: 7) 대신 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-5-폴리 (서열식별번호: 43; 도 40에서의 플라스미드 맵 참조)를 사용하였다.
실시예 2a에서와 같이, 생산된 성숙 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호를 더 이상 포함하지 않을 것으로 예상되고, 따라서 서열식별번호: 42의 서열을 갖는다.
대략 0.23 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 (cIL-5)-p2-(cIL-5)-p30-(cIL-5)-p30-p2-His6 폴리단백질 (하기 실시예에서 cIL-5 폴리단백질 또는 cIL-5 폴리로 지칭됨)을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
염색된 겔이 도 41에 제시된다.
도 41에서 SDS-PAGE/웨스턴 블롯의 레인 1에서의 우세한 밴드는 단백질 서열로부터 예상된 것 (50477.67 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 훨씬 더 크다. 이러한 차이는 단백질 서열이 8개의 N-글리코실화 부위를 함유하기 때문에 (이 중 5개는 NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여 변형될 가능성이 있음) 광범위한 N-글리코실화로부터 일어날 가능성이 있다.
비-환원 조건 하에 (도 41에서 SDS-PAGE의 레인 2), 로딩된 단백질의 외관은 환원 조건 하의 것과 비교하여 변화하였으며, 이는 디술피드 연결된 올리고머 또는 중합체 형태를 나타낸다.
실시예 2c: Expi293F 세포에서의 cIL-13의 3개의 절편을 포함하는 cIL-13 폴리단백질의 발현 및 발현된 폴리단백질의 정제
cIL-13 폴리단백질의 발현을 실시예 2a의 cIL-31 폴리단백질의 발현에 대한 것과 동일하게 수행하였으며, 예외로 pcDNA3.4-cIL31-폴리 (서열식별번호: 7) 대신 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-13-폴리 (서열식별번호: 48; 도 48에서의 플라스미드 맵 참조)를 사용하였다.
실시예 2a에서와 같이, 생산된 성숙 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호를 더 이상 포함하지 않을 것으로 예상되고, 따라서 서열식별번호: 47의 서열을 갖는다.
대략 0.6 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 (cIL-13)-p2-(cIL-13)-p30-(cIL-13)-p30-p2-His6 폴리단백질 (하기 실시예에서 cIL-13 폴리단백질 또는 cIL-13 폴리로 지칭됨)을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
염색된 겔이 도 49에 제시된다.
도 49에서 SDS-PAGE/웨스턴 블롯의 레인 1에서의 우세한 밴드는 단백질 서열로부터 예상된 것 (47496.39 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 훨씬 더 크다. 이러한 차이는 단백질 서열이 14개의 N-글리코실화 부위를 함유하기 때문에 (이 중 13개는 NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여 변형될 가능성이 있음) 광범위한 N-글리코실화로부터 일어날 가능성이 있다.
비-환원 조건 하에 (도 49에서 SDS-PAGE의 레인 2), 로딩된 단백질의 외관은 환원 조건 하의 것과 매우 유사하며, 이는 대체로 단량체 형태를 나타낸다.
실시예 2d: 이. 콜라이 세포에서의 cIL-33의 3개의 절편을 포함하는 cIL-33 폴리단백질의 발현 및 발현된 폴리단백질의 정제
이. 콜라이 균주 BL21 스타(BL21 Star)™ (DE3)를 재조합 플라스미드로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 관련 항생제를 함유하는 리소제니 브로쓰 (LS) 배지 내로 접종하였다. 배양물을 37℃에서 200 rpm으로 인큐베이션한 다음, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 유도하였다. SDS-PAGE를 사용하여 발현을 모니터링하였다.
발현을 하기와 같이 규모 확대하였다: 글리세롤에 저장된 재조합 BL21(DE3)을 관련 항생제를 함유하는 테리픽 브로쓰 (TB) 배지 내로 접종하고, 37℃에서 배양하였다. OD600이 약 1.2에 도달하였을 때, 세포 배양물을 IPTG로 15℃에서 16시간 동안 유도하였다. 박테리아를 원심분리에 의해 수거하였다.
발현된 단백질의 정제를 하기와 같이 수행하였다: 박테리아 펠릿을 용해 완충제로 재현탁시키고, 이어서 초음파처리하였다. 원심분리 후 침전물을 변성제를 사용하여 용해시켰다. 표적 단백질을 Ni 칼럼을 사용하여 1-단계 정제에 의해 수득하였다. 표적 단백질을 0.22 μm 필터에 의해 멸균한 후, 분취물로 저장하였다. 농도를 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 단백질 검정에 의해 결정하였다. 단백질 순도 및 분자량을 표준 SDS-PAGE에 의해 결정하였다.
발현된 단백질의 SDS-PAGE 분석을 실시예 2a에 기재된 바와 같이 수행하였다. 염색된 겔이 도 65에 제시된다.
대략 0.9 mg의 가용성 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) cIL-13-His6을 1 L 배양물의 박테리아 펠릿으로부터 수득하였다. 도 65에 도시된 SDS-PAGE의 레인 2에서의 우세한 밴드의 크기는 단백질 서열로부터 예상된 예측치 (63604.11 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)와 잘 일치한다.
실시예 2e: Expi293F 세포에서의 cIL-4의 3개의 절편을 포함하는 cIL-4 폴리단백질의 발현 및 발현된 폴리단백질의 정제
cIL-4 폴리단백질의 발현을 실시예 2a의 cIL-31 폴리단백질의 발현에 대한 것과 동일하게 수행하였으며, 예외로 pcDNA3.4-cIL31-폴리 (서열식별번호: 7) 대신 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-4-폴리 (서열식별번호: 58; 도 69에서의 플라스미드 맵 참조)를 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석은 환원 샘플에서 100 kDa 내지 120 kDa의 넓은 밴드로서 재조합 생성물을 드러낸 반면, 비-환원 샘플에서는 100-120 kDa 및 >> 120 kDa에서의 2개의 흐릿한 밴드 구역이 가시적이었다.
실시예 2a에서와 같이, 생산된 성숙 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호를 더 이상 포함하지 않을 것으로 예상되고, 따라서 서열식별번호: 47의 서열을 갖는다.
대략 4.5 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 (cIL-4)-p2-(cIL-4)-p30-(cIL-4)-p30-p2-His6 폴리단백질 (하기 실시예에서 cIL-4 폴리단백질 또는 cIL-4 폴리로 지칭됨)을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
염색된 겔이 도 49에 제시된다.
환원 조건 하의 우세한 밴드는 단백질 서열로부터 예상된 것 (51039.30 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 훨씬 더 크다. 이러한 차이는 단백질 서열이 20개의 N-글리코실화 부위를 함유하기 때문에 (이 중 17개는 NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여 변형될 가능성이 있음) 광범위한 N-글리코실화로부터 일어날 가능성이 있다.
잠재적으로 및 가능하게는 불균질한 대량의 글리코실화는 웨스턴 블롯에서의 단백질의 넓은 밴드 외관 및 아미노산 조성에 의해 예측된 것보다 더 큰 크기를 설명할 수 있다.
실시예 2f: Expi293F 세포에서의 fel-IL-31의 3개의 절편을 포함하는 fel-IL-31 폴리단백질의 발현 및 발현된 폴리단백질의 정제
Expi293F 세포를 무혈청 Expi293™ 발현 배지 (써모 피셔 사이언티픽)에서 성장시켰다. Expi293F 세포를 삼각 플라스크 (코닝 인크.) 내에 넣어 오비탈 진탕기 (VWR 사이언티픽) 상에서 8% CO2 하에 37℃에서 유지하였다. 형질감염 1일 전에, 세포를 코닝 삼각 플라스크에 적절한 밀도로 시딩하였다. 형질감염 당일에, 플라스미드 pcDNA3.4-fel-IL31-폴리 및 형질감염 시약을 최적 비로 혼합한 다음, 형질감염을 위해 준비된 세포가 있는 플라스크 내로 첨가하였다. 제6일에 수집된 세포 배양 상청액을 pcDNA3.4-fel-IL31-폴리로부터 발현된 폴리단백질의 정제에 사용하였다. 생산된 성숙 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호를 더 이상 포함하지 않을 것으로 예상되고, 따라서 서열식별번호: 61의 서열을 갖는다.
발현된 폴리단백질의 정제 및 분석을 하기와 같이 수행하였다:
세포 배양 브로쓰를 원심분리하였다. 그 후에, 세포 배양 상청액을 적절한 유량으로 Ni2+-NTA 친화도 정제 칼럼 상에 로딩하였다. 적절한 완충제로 세척하고 용리한 후, 용리된 분획을 풀링하고, 완충제를 PBS, pH 7.2인 최종 제제 완충제로 교환하였다.
정제된 폴리단백질을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하여 그의 분자량 및 순도를 결정하였다. 그렇게 하기 위해, 정제된 폴리단백질의 농도를 보정 곡선에 대한 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 검정에 의해 결정하였다. 대략 7.29 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 fel-IL-31-폴리-His6을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
SDS-PAGE 분석을 위해, 하기 로딩 완충제를 사용하였다:
- 환원 로딩 완충제: 300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, 250 mM DTT, pH 6.8.
- 비-환원 로딩 완충제: 300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, pH 6.8.
환원 및 비-환원 로딩 완충제를 각각 폴리단백질 샘플에 첨가하였다. 환원 또는 비-환원 로딩 완충제를 함유하는 폴리단백질 샘플은 0.5 mg/ml에 근접한 농도를 가졌다. 폴리단백질 샘플을 환원 로딩 완충제와 혼합한 후, 100℃에서 5-10분 동안 가열을 수행하였다. 환원 또는 비-환원 로딩 완충제를 함유하는 폴리단백질 샘플을 10000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 다음, 프리캐스트 겔 (젠스크립트, 카탈로그 번호 M42012)의 겔 챔버에 로딩하였다. 이들 겔을 사용한 SDS-PAGE를 제조업체에 의해 약술된 바와 같이 수행하였다 (대략 60분 동안 140 V). 그 후에, 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다.
쿠마시 블루 염색된 SDS-겔에서, fel-IL-31-폴리는 환원 겔에서 약 80 kDa의 우세한 밴드로 나타난다. 이는 예상된 것 (성숙 폴리펩티드의 계산된 분자량: 55615.65 Da)보다 더 크며, N-글리코실화에 의해 유발될 수 있다. NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여, 6개 이하의 위치가 변형될 가능성이 있다.
비-환원 겔 레인에서, fel-IL-31-폴리 밴드의 이동성은 환원 레인에서보다 다소 더 빠르며, 이는 보다 치밀한 구조를 유도하는 쇄내 디술피드 결합에 전형적이다. 우세한 밴드의 상단에 있는 일부 얼룩은 응집된 물질을 나타낸다. 그러나, 전체 SDS-PAGE 분석은 fel-IL-31-폴리가 대체로 단량체라는 것을 시사한다.
실시예 2g: 단일 자기-단백질의 3개의 절편을 포함하는 추가의 폴리단백질의 발현 및 정제
실시예 1g에서 설계된 폴리단백질의 발현을 실시예 2a 또는 실시예 2d의 cIL-31 폴리단백질의 발현에 대한 것과 동일하게 수행할 수 있다. 생산된 성숙 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호 (구축물에 포함된 경우)를 더 이상 포함하지 않을 것으로 예상되고, 상응하는 아미노산 서열 서열식별번호: 68 내지 201을 가질 것으로 예상된다.
실시예 2h: Expi293F 세포에서의 본 발명에 따른 cIL-13-cIL-4 폴리단백질의 발현 및 발현된 폴리단백질의 정제
실시예 1h의 cIL-13-cIL-4-폴리-His6 폴리단백질을 코딩하는 DNA (서열식별번호: 202)를, 포유동물 세포에서의 발현을 개선시키기 위해 개시 ATG의 상류에 코작 서열을 포함하도록 및 간단한 서브클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위 (EcoRI 및 HindIII)를 포함하도록 설계하고 합성하였다. 완전한 cIL-13-cIL-4-폴리 DNA 서열을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하고 (도 78), Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
cIL-13-cIL-4 폴리단백질의 발현을 실시예 2a의 cIL-31 폴리단백질의 발현에 대한 것과 동일하게 수행하였으며, 예외로 pcDNA3.4-cIL31-폴리 (서열식별번호: 7) 대신 플라스미드 pcDNA3.4-cIL-13-cIL-4-폴리 (서열식별번호: 202; 도 78에서의 플라스미드 맵 참조)를 사용하였다.
실시예 2a에서와 같이, 생산된 성숙 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호를 더 이상 포함하지 않을 것으로 예상되고, 따라서 서열식별번호: 203의 서열을 갖는다.
대략 5.4 mg의 가용성 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) cIL-13-cIL-4-폴리-His6 단백질을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
웨스턴 블롯 분석은 환원 샘플에서 120 kDa에 근접한 넓은 밴드로서 재조합 생성물을 드러낸 반면, 비-환원 샘플에서는 > 120 kDa에서의 흐릿한 밴드가 가시적이었다. SDS-PAGE/웨스턴 블롯의 레인 R에서의 우세한 밴드는 단백질 서열로부터 예상된 것 (66094.30 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 훨씬 더 크다. 이러한 차이는 단백질 서열이 23개의 N-글리코실화 부위를 함유하기 때문에 (이들 중 20개는 NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여 변형될 가능성이 있음) 광범위한 N-글리코실화에 의해 설명될 가능성이 있다. 이러한 잠재적으로 대량이고, 가장 가능하게는 불균질한 글리코실화는 웨스턴 블롯에서의 단백질의 넓은 밴드 외관 및 아미노산 조성에 의해 예측된 것보다 더 큰 크기를 설명한다.
실시예 2i: Expi293F 세포에서의 본 발명에 따른 cIL-31-cIL-13-cIL-4 폴리단백질의 발현 및 발현된 폴리단백질의 정제
실시예 1i의 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리-His6 폴리단백질을 코딩하는 DNA (서열식별번호: 204)를, 포유동물 세포에서의 발현을 개선시키기 위해 개시 ATG의 상류에 코작 서열을 포함하도록 및 간단한 서브클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위 (EcoRI 및 HindIII)를 포함하도록 설계하고 합성하였다. DNA 서열을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하고 (도 85), Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
cIL-31-cIL-13-cIL-4 폴리단백질의 발현을 실시예 2a의 cIL-31 폴리단백질의 발현에 대한 것과 동일하게 수행하였으며, 예외로 상응하는 플라스미드를 사용하였다. 실시예 2a에서와 같이, 생산된 성숙 폴리단백질은 N-말단에 인공 ER 유입 신호를 더 이상 포함하지 않을 것으로 예상되고, 따라서 서열식별번호: 205의 서열을 갖는다. 대략 2.73 mg의 가용성 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리-His6을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
쿠마시 블루-염색된 겔 (데이터는 제시되지 않음)에서, 150 kDa 마커 위의 우세한 밴드가 환원 샘플에서 가시적이다. 비-환원 샘플은 > 150 kDa 위의 얼룩이 겔의 상단까지 연장되도록 하였다. 웨스턴 블롯 분석은 환원 샘플에서 120 kDa에 근접한 넓은 밴드로서 재조합 생성물을 드러낸 반면, 비-환원 샘플에서는 > 120 kDa에서의 얼룩이 겔의 상단까지 연장된 것이 가시적이었다. SDS-PAGE/쿠마시 블루 및 SDS-PAGE/웨스턴 블롯의 레인 R에서의 우세한 밴드는 단백질 서열로부터 예상된 것 (99987.98 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 훨씬 더 크다. 이러한 차이는 단백질 서열이 28개의 N-글리코실화 부위를 함유하기 때문에 (이들 중 21개는 NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여 변형될 가능성이 있음) 광범위한 N-글리코실화에 의해 설명될 가능성이 있다. 이러한 잠재적으로 대량이고, 가장 가능하게는 불균질한 글리코실화는 웨스턴 블롯에서의 단백질의 넓은 밴드 외관 및 아미노산 조성에 의해 예측된 것보다 더 큰 크기를 설명한다.
실시예 3a: 포유동물 세포에서의 적절하게 폴딩된 천연 cIL-31의 발현
N-말단에 인공 ER 유입 신호 및 C-말단에 His6-태그를 갖는 cIL-31을 코딩하는 DNA 구축물을 설계하였다. 이 cIL-31-DNA 구축물을, 포유동물 세포에서의 발현을 개선시키기 위해 단백질의 개시 코돈의 상류에 코작 서열을 함유하도록 및 간단한 클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위를 함유하도록 추가로 설계하였다. 이 DNA 구축물을 합성한 후, DNA 구축물을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하여 6521 bp 크기의 벡터 pcDNA3.4-cIL31을 생성하였다. Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
pcDNA3.4-cIL31로부터의 cIL-31 구축물의 발현을 하기와 같이 달성하였다:
Expi293F 세포를 무혈청 Expi293™ 발현 배지 (써모 피셔 사이언티픽)에서 성장시켰다. 세포를 삼각 플라스크 (코닝 인크.) 내에 넣어 오비탈 진탕기 (VWR 사이언티픽) 상에서 8% CO2 하에 37℃에서 유지하였다. 형질감염 1일 전에, 세포를 코닝 삼각 플라스크에 적절한 밀도로 시딩하였다. 형질감염 당일에, 플라스미드 pcDNA3.4-cIL31 및 형질감염 시약을 최적 비로 혼합한 다음, 형질감염을 위해 준비된 세포가 있는 플라스크 내로 첨가하였다. 제6일에 수집된 세포 배양 상청액을 정제에 사용하였다.
발현된 단백질의 정제 및 분석을 하기와 같이 수행하였다:
세포 배양 브로쓰를 원심분리하였다. 세포 배양 상청액을 적절한 유량으로 Ni2+-NTA 친화도 정제 칼럼 상에 로딩하였다. 적절한 완충제로 세척하고 용리한 후, 용리된 분획을 풀링하고, 완충제를 PBS, pH 7.2인 최종 제제 완충제로 교환하였다.
정제된 단백질을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하여 그의 분자량 및 순도를 결정하였다. 그렇게 하기 위해, 정제된 폴리단백질의 농도를 보정 곡선에 대한 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 검정에 의해 결정하였다. 대략 2.61 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 cIL31-His6 (하기 실시예에서 cIL-31로 지칭됨)을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
SDS-PAGE 분석을 위해, 하기 로딩 완충제를 사용하였다:
- 환원 로딩 완충제: 300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, 250 mM DTT, pH 6.8.
- 비-환원 로딩 완충제: 300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, pH 6.8.
환원 및 비-환원 로딩 완충제를 각각 단백질 샘플에 첨가하였다. 환원 또는 비-환원 로딩 완충제를 함유하는 단백질 샘플은 0.5 mg/ml에 근접한 농도를 가졌다.
단백질 샘플을 환원 로딩 완충제와 혼합한 후, 100℃에서 5-10분 동안 가열을 수행하였다.
환원 또는 비-환원 로딩 완충제를 함유하는 단백질 샘플을 10000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 다음, 프리캐스트 겔 (젠스크립트, 카탈로그 번호 M42012)의 겔 챔버에 로딩하였다. 이들 겔을 사용한 SDS-PAGE를 제조업체에 의해 약술된 바와 같이 수행하였다 (대략 60분 동안 140 V). 그 후에, 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 염색된 겔이 도 4에 제시된다.
SDS-PAGE의 레인 1에서의 우세한 밴드는 단백질 서열로부터 예상된 것 (16196.54 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 상당히 더 크다. 이러한 차이는 단백질 서열이 2개의 N-글리코실화 부위를 함유하기 때문에 (이들 둘 다는 NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여 변형될 가능성이 있음) 광범위한 N-글리코실화에 의해 설명될 가능성이 있다.
비-환원 조건 하에 (SDS-PAGE에서 레인 2), 로딩된 단백질의 벌크가 밴드로 이동하였으며, 이는 단량체를 나타낸다. 단지 미미한 비율만이 이량체 및 다량체 형태로 존재하는 것으로 보인다.
실시예 3b: 포유동물 세포에서의 적절하게 폴딩된 천연 cIL-5의 발현
cIL-5를 코딩하는 DNA 구축물의 설계, 합성 및 서브클로닝을 실시예 3a에서 cIL-31에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 6452 bp 크기의 벡터 pcDNA3.4-cIL-5 (서열식별번호: 45)가 도 42에 도시된다. Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
pcDNA3.4-cIL-5로부터의 cIL-5 구축물의 발현, 뿐만 아니라 발현된 단백질의 정제 및 분석을 실시예 3a에서의 cIL-31 구축물에 대한 것과 같이 달성하였다.
대략 7.28 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 cIL-5-His6 (하기 실시예에서 cIL-5로 지칭됨)을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
환원 SDS-PAGE에서 관찰된 겉보기 분자 크기 (도 43, 레인 "1")는 예측치로부터 예상된 것 (13921.91 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 약간 더 높으며, 이는 한 위치에서의 N-글리코실화에 의해 설명될 수 있다. 비-환원 SDS-PAGE (도 43의 레인 "2")는 단백질이 이량체로서 발현된다는 것을 시사하며, 이는 다른 종으로부터의 IL-5에 대한 문헌 지식과 일치한다.
실시예 3c: 박테리아 (이. 콜라이) 세포에서의 적절하게 폴딩된 천연 cIL-13의 발현
N-말단에 개시 메티오닌 (M) 및 C-말단에 His6-태그를 갖는 서열식별번호: 46의 cIL-13을 코딩하는 DNA 구축물을 설계하였다. 이 cIL-13-DNA 구축물을, 인공 개시 코돈 ATG, 간단한 서브클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위 (NdeI 및 HindIII) 및 정지 코돈 TGA를 함유하도록 추가로 설계하였다.
이 DNA 구축물을 합성한 후, DNA 구축물을 제한 부위 NdeI 및 HindIII를 통해 pET30(+) 이. 콜라이 발현 벡터 내로 서브클로닝하여, 5619 bp 크기의 벡터 pET30a-cIL-13 (서열식별번호: 49; 도 50에 제시된 플라스미드 맵)을 생성하였다. 형질감염 등급 플라스미드를 이. 콜라이 발현을 위해 제조하였다.
pET30a-cIL-13으로부터의 cIL-13 구축물의 발현을 하기와 같이 달성하였다: 이. 콜라이 균주 BL21 스타™ (DE3)를 재조합 플라스미드로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 관련 항생제를 함유하는 리소제니 브로쓰 (LS) 배지 내로 접종하였다. 배양물을 37℃에서 200 rpm으로 인큐베이션한 다음, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 유도하였다. SDS-PAGE를 사용하여 발현을 모니터링하였다.
발현을 하기와 같이 규모 확대하였다: 글리세롤에 저장된 재조합 BL21(DE3)을 관련 항생제를 함유하는 테리픽 브로쓰 (TB) 배지 내로 접종하고, 37℃에서 배양하였다. OD600이 약 1.2에 도달하였을 때, 세포 배양물을 IPTG로 15℃에서 16시간 동안 유도하였다. 박테리아를 원심분리에 의해 수거하였다.
발현된 단백질의 정제를 하기와 같이 수행하였다: 박테리아 펠릿을 용해 완충제로 재현탁시키고, 이어서 초음파처리하였다. 원심분리 후 침전물을 변성제를 사용하여 용해시켰다. 표적 단백질을 Ni 칼럼을 사용하여 1-단계 정제에 의해 수득하였다. 표적 단백질을 0.22 μm 필터에 의해 멸균한 후, 분취물로 저장하였다.
농도를 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 단백질 검정에 의해 결정하였다. 대략 10.5 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 cIL-13-His6 (하기 실시예에서 cIL-13으로 지칭됨)을 1L 이. 콜라이 배양물의 박테리아 펠릿으로부터 수득하였다.
발현된 단백질의 단백질 순도 및 분자량을 환원 로딩 완충제를 사용하는 표준 SDS-PAGE에 의해 결정하였다. BSA를 대조군으로서 사용하였다. 환원 로딩 완충제 (300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, 250 mM DTT, pH 6.8)를 단백질 샘플에 첨가하여, 단백질 샘플이 0.5 mg/ml에 근접한 농도를 갖도록 하였다.
단백질 샘플을 환원 로딩 완충제와 혼합한 후, 이들을 100℃에서 5-10분 동안 가열하고, 10000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 다음, 프리캐스트 겔 (젠스크립트, 카탈로그 번호 M42012)의 겔 챔버에 로딩하였다 (BSA 2 μg; cIL-13 1.86 μg). 이들 겔을 사용한 SDS-PAGE를 제조업체에 의해 약술된 바와 같이 수행하였다 (대략 60분 동안 140 V). 그 후에, 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다.
염색된 겔이 도 51에 제시된다. 레인 1은 BSA의 크기를 도시한다. 레인 2는 cIL-13 단백질의 크기를 도시한다.
도 51의 SDS-PAGE의 레인 1에서의 밴드는 BSA의 예상된 66 kDa 분자량과 잘 일치한다. 도 51의 SDS-PAGE의 레인 2에서의 우세한 밴드의 크기는 단백질 서열로부터 예상된 예측치 (13394.39 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)와 잘 일치한다.
실시예 3d: 박테리아 (이. 콜라이) 세포에서의 적절하게 폴딩된 천연 cIL-33-WT의 발현
cIL-33-WT 단백질 서열 (서열식별번호: 50)은 마우스 IL-33 (유니프롯 Q8BVZ5)의 널리 기재된 아미노산 109-266 형태와 유사하게, 전장 개 IL-33 단백질 (유니프롯 O97863)의 아미노산 110-263에 상응한다.
cIL-33-WT (서열식별번호: 50)를 코딩하는 DNA 구축물 (서열식별번호: 52)을 또한, N-말단에 개시 메티오닌 (M) 및 His6-태그를 코딩하도록 설계하였다. 이 구축물을, 인공 개시 코돈 ATG, 간단한 서브클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위 (NdeI 및 HindIII) 및 정지 코돈 TGA를 함유하도록 설계하였다.
이 DNA 구축물을 합성한 후, 제한 부위 NdeI 및 HindIII를 통해 pET30(+) 이. 콜라이 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 5742 bp 크기의 벡터 pET30a-canIL33-CS를 생성하였다 (도 57에 제시된 플라스미드 맵).
pET30a(+)-canIL33-WT로부터의 His6-cIL-33-WT 구축물의 발현을 하기와 같이 달성하였다: pET30a(+)-canIL-33-WT-형질전환된 BL21(DE3) 이. 콜라이를 카나마이신을 함유하는 테리픽 브로쓰 (TB) 배지 내로 접종하고, 37℃에서 배양하였다. OD600이 약 1.2에 도달하였을 때, 세포 배양물을 IPTG로 15℃에서 16시간 동안 유도하였다. 세포를 원심분리에 의해 수거하였다.
cIL-33-WT 단백질의 정제는 Ni2+ 칼럼을 사용하는 전형적인 His-태그 단백질 정제 계획을 따랐다. 세포 펠릿을 용해 완충제로 재현탁시키고, 이어서 초음파처리하였다. 원심분리 후 상청액 (가용성 발현물)을 칼럼 크로마토그래피에 사용하였다. 표적 단백질을 투석하고, 0.22 μm 필터에 의해 멸균한 후, 분취물로 저장하였다. 농도를 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 단백질 검정에 의해 결정하였다.
농도를 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 단백질 검정에 의해 결정하였다. 대략 10.01 mg의 가용성 (50 mM 트리스-HCl, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, pH 8.0 중) His6-cIL-33-WT (하기 실시예에서 cIL-33-WT로 지칭됨)를 1 L 배양물의 박테리아 펠릿으로부터 수득하였다.
발현된 단백질의 단백질 순도 및 분자량을 실시예 3c에서 cIL-13에 대해 기재된 바와 같이 환원 로딩 완충제 및 대조군으로서의 BSA를 사용하는 표준 SDS-PAGE에 의해 결정하였다 (각각 2.00 μg을 겔 챔버에 로딩함). 염색된 겔이 도 58에 제시된다. 레인 1은 BSA의 크기를 도시하고, 그의 예상된 66 kDa 분자량과 잘 일치한다. 레인 2는 cIL-33-WT 단백질의 크기를 도시하고, 단백질 서열로부터 예상된 예측치 (18578.54 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)와 잘 일치한다.
실시예 3e: 박테리아 (이. 콜라이) 세포에서의 적절하게 폴딩된 천연 cIL-33-CS의 발현
cIL-33-CS를 코딩하는 DNA 구축물을 cIL-33-WT로부터 시작하여 설계하였다. IL-33-WT (서열식별번호: 50)에 존재하는 3개의 시스테인 잔기 각각을 유전자 생성물의 안정성을 개선시키기 위해 세린 잔기로 대체하여 IL-33-CS (서열식별번호: 51)를 생성하였다.
cIL-33-CS를 코딩하는 DNA 구축물 (서열식별번호: 53)을 N-말단에 개시 메티오닌 (M) 및 His6-태그를 갖도록 설계하였다. 이 구축물을, 인공 개시 코돈 ATG, 간단한 서브클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위 (NdeI 및 HindIII) 및 정지 코돈 TGA를 함유하도록 설계하였다.
이 DNA 구축물을 합성한 후, 제한 부위 NdeI 및 HindIII를 통해 pET30(+) 이. 콜라이 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 5742 bp 크기의 벡터 pET30a-canIL33-CS를 생성하였다 (도 60에 제시된 플라스미드 맵).
pET30a-cIL33-CS로부터의 cIL-33-CS 구축물의 발현을 하기와 같이 달성하였다: pET30a(+)-canIL-33-CS-형질전환된 BL21(DE3) (이. 콜라이)을 카나마이신을 함유하는 테리픽 브로쓰 (TB) 배지 내로 접종하고, 37℃에서 배양하였다. OD600이 약 1.2에 도달하였을 때, 세포 배양물을 IPTG로 15℃에서 16시간 동안 유도하였다. 세포를 원심분리에 의해 수거하였다. His6-canIL33-CS 단백질의 정제는 Ni2+ 칼럼을 사용하는 전형적인 His-태그 단백질 정제 계획을 따랐다. 세포 펠릿을 용해 완충제로 재현탁시키고, 이어서 초음파처리하였다. 원심분리 후 침전물 (봉입체)을 변성제를 사용하여 용해시킨 다음, 칼럼 크로마토그래피에 적용하였다. 표적 단백질을 0.22 μm 필터에 의해 멸균한 후, 분취물로 저장하였다.
농도를 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 단백질 검정에 의해 결정하였다. 상기 절차에 의해, 대략 10.4 mg의 가용성 (포스페이트 완충 염수 [PBS], 10% 글리세롤, 0.5 M L-아르기닌, pH 7.4 중) His6-cIL-33-CS를 1 L 배양물의 박테리아 펠릿으로부터 수득하였다.
발현된 단백질의 단백질 순도 및 분자량을 실시예 3c에서 cIL-13에 대해 기재된 바와 같이 환원 로딩 완충제 및 대조군으로서의 BSA를 사용하는 표준 SDS-PAGE에 의해 결정하였다 (각각 2.00 μg을 겔 챔버에 로딩함). 염색된 겔이 도 61에 제시된다. 레인 1은 BSA의 크기를 도시하고, 그의 예상된 66 kDa 분자량과 잘 일치한다. 레인 2는 cIL-33-CS 단백질의 크기를 도시하며, 여기서 우세한 밴드는 cIL-33-CS의 단백질 서열로부터 예상된 예측치 (18530.36 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)와 잘 일치한다.
실시예 3f: 박테리아 (이. 콜라이) 세포에서의 적절하게 폴딩된 천연 cIL-4의 발현
cIL-4 (서열식별번호: 56)를 코딩하는 DNA 구축물 (서열식별번호: 59)을 또한, N-말단에 개시 메티오닌 (M) 및 His6-태그를 코딩하도록 설계하였다. 이 구축물을, 인공 개시 코돈 ATG, 간단한 서브클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위 (NdeI 및 HindIII) 및 정지 코돈 TGA를 함유하도록 설계하였다.
이 DNA 구축물을 합성한 후, 제한 부위 NdeI 및 HindIII를 통해 pET30(+) 이. 콜라이 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 5601 bp 크기의 벡터 pET30a-cIL-4를 생성하였다 (도 70에 제시된 플라스미드 맵).
pET30a-cIL-4로부터의 cIL-4 구축물의 발현을 하기와 같이 달성하였다: 이. 콜라이 균주 BL21 스타™ (DE3)를 재조합 플라스미드로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 관련 항생제를 함유하는 리소제니 브로쓰 (LS) 배지 내로 접종하였다. 배양물을 37℃에서 200 rpm으로 인큐베이션한 다음, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 유도하였다. SDS-PAGE를 사용하여 발현을 모니터링하였다.
발현을 하기와 같이 규모 확대하였다: 글리세롤에 저장된 재조합 BL21(DE3)을 관련 항생제를 함유하는 테리픽 브로쓰 (TB) 배지 내로 접종하고, 37℃에서 배양하였다. OD600이 약 1.2에 도달하였을 때, 세포 배양물을 IPTG로 15℃에서 16시간 동안 유도하였다. 박테리아를 원심분리에 의해 수거하였다.
발현된 단백질의 정제를 하기와 같이 수행하였다: 박테리아 펠릿을 용해 완충제로 재현탁시키고, 이어서 초음파처리하였다. 원심분리 후 침전물을 변성제를 사용하여 용해시켰다. 표적 단백질을 Ni 칼럼을 사용하여 1-단계 정제에 의해 수득하였다. 표적 단백질을 0.22 μm 필터에 의해 멸균한 후, 분취물로 저장하였다.
농도를 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 단백질 검정에 의해 결정하였다. 대략 10.78 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 cIL-4-His6 (하기 실시예에서 cIL-4로 지칭됨)을 1L 이. 콜라이 배양물의 박테리아 펠릿으로부터 수득하였다.
발현된 단백질의 단백질 순도 및 분자량을 환원 로딩 완충제를 사용하는 표준 SDS-PAGE에 의해 결정하였다. BSA를 대조군으로서 사용하였다. 환원 로딩 완충제 (300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, 250 mM DTT, pH 6.8) 및 비-환원 로딩 완충제 (300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, pH 6.8)를 각각 단백질 샘플에 첨가하여, 단백질 샘플이 0.5 mg/ml에 근접한 농도를 갖도록 하였다.
단백질 샘플을 환원 로딩 완충제와 혼합한 후에, 100℃에서 5-10분 동안 가열하였다. 단백질 샘플을 10000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 다음, 프리캐스트 겔 (젠스크립트, 카탈로그 번호 M42012) 및 적절한 구동 완충제의 겔 챔버에 로딩하였다 (BSA 2 μg; cIL-4 2 μg). 전기영동을 140 V에서 대략 60분 동안 수행하였다. 쿠마시 블루-염색된 겔은 레인 1에서 BSA의 예상된 66 kDa 분자량과 잘 일치하는 밴드를 나타냈다. SDS-PAGE의 레인 2에서의 우세한 밴드의 크기는 cIL-4 단백질 서열로부터 예상된 예측치 (13585.88 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)와 잘 일치한다.
실시예 3g: 포유동물 세포에서의 적절하게 폴딩된 천연 fel-IL-31의 발현
N-말단에 인공 ER 유입 신호 및 C-말단에 His6-태그를 갖는 fel-IL-31을 코딩하는 DNA 구축물 (서열식별번호: 63)을 설계하였다. 이 fel-IL-31-DNA 구축물을, 포유동물 세포에서의 발현을 개선시키기 위해 단백질의 개시 코돈의 상류에 코작 서열을 함유하도록 및 간단한 클로닝을 위한 플랭킹 고유 제한 효소 부위를 함유하도록 추가로 설계하였다. 이 DNA 구축물을 합성한 후, DNA 구축물을 pcDNA3.4 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하여 벡터 pcDNA3.4-fel-IL31을 생성하였다. Expi293F 세포 발현을 위해 다량의 형질감염 등급 플라스미드를 제조하였다.
pcDNA3.4-fel-IL31로부터의 cIL-31 구축물의 발현을 하기와 같이 달성하였다:
Expi293F 세포를 무혈청 Expi293™ 발현 배지 (써모 피셔 사이언티픽)에서 성장시켰다. 세포를 삼각 플라스크 (코닝 인크.) 내에 넣어 오비탈 진탕기 (VWR 사이언티픽) 상에서 8% CO2 하에 37℃에서 유지하였다. 형질감염 1일 전에, 세포를 코닝 삼각 플라스크에 적절한 밀도로 시딩하였다. 형질감염 당일에, 플라스미드 pcDNA3.4-fel-IL31 및 형질감염 시약을 최적 비로 혼합한 다음, 형질감염을 위해 준비된 세포가 있는 플라스크 내로 첨가하였다. 제6일에 수집된 세포 배양 상청액을 정제에 사용하였다.
발현된 단백질의 정제 및 분석을 하기와 같이 수행하였다:
세포 배양 브로쓰를 원심분리하였다. 세포 배양 상청액을 적절한 유량으로 Ni2+-NTA 친화도 정제 칼럼 상에 로딩하였다. 적절한 완충제로 세척하고 용리한 후, 용리된 분획을 풀링하고, 완충제를 PBS, pH 7.2인 최종 제제 완충제로 교환하였다.
정제된 단백질을 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하여 그의 분자량 및 순도를 결정하였다. 그렇게 하기 위해, 정제된 폴리단백질의 농도를 보정 곡선에 대한 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 검정에 의해 결정하였다. 대략 7.29 mg의 (포스페이트-완충 염수, PBS 중) 가용성 fel-IL31-His6 (하기 실시예에서 fIL-31로 지칭됨)을 100 ml 조 세포 배양 상청액으로부터 수득하였다.
SDS-PAGE 분석을 위해, 하기 로딩 완충제를 사용하였다:
- 환원 로딩 완충제: 300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, 250 mM DTT, pH 6.8.
- 비-환원 로딩 완충제: 300 mM 트리스-HCl, 10% SDS, 30% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, pH 6.8.
환원 및 비-환원 로딩 완충제를 각각 단백질 샘플에 첨가하였다. 환원 또는 비-환원 로딩 완충제를 함유하는 단백질 샘플은 0.5 mg/ml에 근접한 농도를 가졌다. 단백질 샘플을 환원 로딩 완충제와 혼합한 후, 100℃에서 5-10분 동안 가열을 수행하였다. 환원 또는 비-환원 로딩 완충제를 함유하는 단백질 샘플을 10000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 다음, 프리캐스트 겔 (젠스크립트, 카탈로그 번호 M42012)의 겔 챔버에 로딩하였다. 이들 겔을 사용한 SDS-PAGE를 제조업체에 의해 약술된 바와 같이 수행하였다 (대략 60분 동안 140 V). 그 후에, 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다.
쿠마시 블루-염색된 레인 1에서의 우세한 밴드는 단백질 서열로부터 예상된 것 (16196.54 Da, https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam을 사용하여 성숙 서열로부터 계산됨)보다 상당히 더 크다. 이러한 차이는 fel-IL-31 단백질 서열이 2개의 N-글리코실화 부위를 함유하기 때문에 (이들 둘 다는 NetNGlyc 분석 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)에 기초하여 변형될 가능성이 있음) 광범위한 N-글리코실화로부터 일어날 가능성이 있다.
비-환원 조건 하에, 로딩된 단백질의 벌크가 밴드로 이동하였으며, 이는 단량체를 나타낸다. 단지 미미한 비율만이 이량체 및 다량체 또는 응집된 형태로 존재하는 것으로 보인다.
실시예 4: 생체내 cIL-31 활성 시험 (개에서의 소양증/가려움증 유도)의 수행
16마리의 개에게 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 정제된 cIL-31을 1.75 μg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내로 투여하였다. 이를 위해, cIL-31을 멸균 NaCl 용액 중 액체 제제로서 제조하였다. 투여된 용량 부피는 개당 1 ml였다.
소양성 행동을 120분 동안 cIL-31 액체 제제의 투여 대략 20-40분 후에 비디오 기록하였다.
120분의 전체 관찰 기간을 1-분 간격 (120개 간격)으로 분할하였다. 하기와 같이 관찰자에 의해 카테고리 예/아니오 ("1/0") 결정이 이루어졌다: 개에 의해 적어도 1회의 소양성 행동이 나타난 모든 간격을 "1"로 카운팅하였다. 소양성 행동이 없는 모든 간격을 "0"으로 카운팅하였다.
소양성 행동의 유형을 각각의 간격에서 발생하는 제1 행동에 의해 정의하였다. 120분의 각각의 관찰 기간 내 누적 카운트는 소양증 점수를 제공하였다. 소양증 유도는 개가 60회 초과의 간격 동안 소양성 행동을 나타낸 경우에 성공적인 것으로 간주하였다.
소양증은 cIL-31 액체 제제의 투여 후 모든 개에서 관찰되었다. 상기-정의된 기준에 따라, 소양증은 16마리의 개 중 13마리에서 성공적으로 유도되었다. 이 연구 동안 유해 사건은 관찰되지 않았다. 따라서 요약하면, 이 연구는 발현된 cIL-31 구축물이 생물학적으로 활성이라는 증거를 제공한다.
실시예 5: cIL-31의 3개의 절편을 포함하는 cIL-31 폴리단백질이 또한 개에서 소양증을 도출하는지 여부의 시험
3마리의 개에게 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제된 cIL-31 폴리단백질을 200 μg의 단일 용량으로 피하로 투여하였다. 이를 위해, cIL-31 폴리단백질을 아주반트로서 폴리젠을 함유하는 PBS 중 액체 제제로서 제조하였다. 용량 부피는 개당 1 mL였다.
주사된 폴리단백질에 대한 개의 국부 및 전신 관용을 평가하기 위해, 직장 온도를 측정하고, 종창, 통증, 발적 및 증가된 열의 임상 징후에 대한 주사 부위의 검사 및 촉진을 수행하였다. 임상 증상이 발견된 경우에, 임상 발견이 사라질 때까지 또는 연구가 종료될 때까지 상기 기재된 국부 및 전신 관용 평가를 매주 1회 수행하였다.
어떠한 개도 소양증 징후를 나타내지 않았다. 주사 부위에서 발적 및 찰상과 같은 경도 임상 징후가 관찰되었고, 제1 투여 후 모든 개에서 및 제2 투여 후 2마리의 개에서 증가된 체온이 관찰되었으며, 이는 폴리단백질에 대해 유도된 면역 반응을 나타낸다.
실시예 6a: cIL-31에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청의 생성 및 특징화
대략 500 μg cIL-31을 뉴질랜드 백색 토끼에서 하기 63일 면역화 요법 (데이비즈 바이오테크놀로지(Davids Biotechnology), 레겐스부르크/FRG)을 위한 항원으로서 사용하였다:
제1일: 면역전 혈청의 수집, 제1 면역화
제14일: 제2 면역화
제28일: 제3 면역화
제35일: 중간 ELISA 역가를 위한 혈청 시험
제42일: 제4 면역화
제56일: 제5 면역화
제63일: 항혈청의 수거
실시예 6b: cIL-5에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청의 생성 및 특징화
대략 500 μg cIL-5를 상기 실시예 6a에 기재된 63일 면역화 요법에서 항원으로서 사용하였다.
실시예 6c: cIL-13에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청의 생성 및 특징화
대략 500 μg cIL-13을 상기 실시예 6a에 기재된 63일 면역화 요법에서 항원으로서 사용하였다.
실시예 6d: cIL-33-WT에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청의 생성 및 특징화
대략 500 μg cIL-13-WT를 상기 실시예 6a에 기재된 63일 면역화 요법에서 항원으로서 사용하였다.
실시예 6e: cIL-4에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청의 생성 및 특징화
대략 500 μg cIL-4를 상기 실시예 6a에 기재된 63일 면역화 요법에서 항원으로서 사용하였다.
실시예 6f: cIL-13-cIL-4-폴리에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청의 생성 및 특징화
대략 500 μg cIL-13-cIL-4-폴리 (서열식별번호: 203)를 상기 실시예 6a에 기재된 63일 면역화 요법에서 항원으로서 사용하였다.
실시예 6g: cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청의 생성 및 특징화
대략 500 μg cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리 (서열식별번호: 205)를 이 면역화 요법에서 항원으로서 사용하였다.
실시예 6h: bov-TNF-알파-폴리에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청의 생성 및 특징화
대략 500 μg bov-TNF-알파 폴리단백질 (서열식별번호: 65)을 상기 실시예 6a에 기재된 63일 면역화 요법에서 항원으로서 사용하였다.
실시예 7: 난황으로부터의 cIL-31에 대한 닭 IgY 제제의 생성
대략 500 μg cIL-31을 닭에서 하기 63일 면역화 요법 (데이비즈 바이오테크놀로지, 레겐스부르크/FRG)을 위한 항원으로서 사용하였다:
제1일: 면역전 난황 IgG/IgY의 수집, 대략 90% 순도
제1일: 제1 면역화
제14일: 제2 면역화
제28일: 제3 면역화
제35일: 제4 면역화
제45일-제55일: 알의 수집
제63일: 독점회사 (데이비즈 바이오테크놀로지, 레겐스부르크; Prep I)에 의한 알의 준비, 토끼로부터의 항혈청과 대등한 순도 및 품질을 산출하는 IgY 제제
실시예 8a: 토끼 혈청 항체 및 닭 난황 IgY 역가 결정을 위한 항-cIL-31 및 항-cIL-31 폴리단백질 ELISA 포맷의 설정, 천연 cIL-31 및 cIL-31의 3개의 절편을 포함하는 cIL-31 폴리단백질에 대한 결합 연구
폴리스티렌 ELISA 플레이트 (384 웰: 써모 맥시소르프(Thermo Maxisorp), 카탈로그 번호 464718)를 코팅 완충제 (50 mM NaHCO3 pH 9.6) 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질 (cIL-31: 0.29 mg/ml 또는 cIL-31 폴리단백질: 0.4 mg/ml)로 코팅하였다. 웰당 10 μl 부피의 코팅 용액을 사용하였다. 이어서, 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 폐쇄 뚜껑을 덮어 4℃에서 밤새 (O/N) 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 제거한 후, PBS (써모피셔 포스페이트-완충 염수, pH 7.2, 카탈로그 번호 20012-019), 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰당 50 μl의 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 (냉수 어피로부터, H2O 중 40-50%, 시그마(Sigma) C 7765)을 사용하여 비-특이적 결합 부위의 차단을 수행하였다. 이 차단 단계를 실온 (RT)에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. 차단 용액을 제거한 후, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 토끼 항혈청 또는 닭 난황 제제의 연속 희석물 (비-흡착성 복제 플레이트로부터)을 첨가하였다 (웰당 20 μl). 연속 희석물과의 인큐베이션을 실온에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. 그 후에, 토끼 항혈청 또는 닭 난황 제제의 연속 희석물을 꺼내고, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 이어서, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 항-토끼 IgG (전체 분자), 염소에서 생산된 F(ab')2 단편-알칼리성 포스파타제 (AP) 항체 (시그마 A3937 또는 등가물)의 1:15,000 희석물 또는 토끼에서 생산된 항-닭 IgY (IgG) (전체 분자)-AP 항체 (시그마 A9171 또는 등가물)의 1:5000 희석물 (웰당 20 μl)을 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이들 항체 용액을 꺼낸 후, 다시 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰을 AP 완충제 (50 mM NaHCO3/Na2CO3, 2 mM MgCl2, pH 9.6, 웰당 50 μl)로 1회 세척하였다. 최종적으로, AP 완충제 중 5 mM 4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물 (pNPP, 어플라이켐(Applichem), 시그마를 통함, A1442,0050 또는 등가물) (웰당 90 μl)을 첨가하였다. 405 nm/분에서의 광학 밀도 (OD)의 증가 (mOD/분)를 실온에서 ELISA 판독기, 예를 들어 에포크 판독기 (150115E) 또는 시너지 H1 판독기 (180427C)에서 기록하고, 곡선 기울기를 선형 증가 범위로부터 결정하였다.
토끼 면역전 혈청 및 항혈청에 대한 항원으로서 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과가 도 5에 도시된다. 이 도면은 토끼 항혈청이 cIL-31 및 cIL-31 폴리단백질 구축물 둘 다를 인식한 반면, 면역전 혈청은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성하였다는 것을 보여준다. 선형 신호 상은 두 항원에 대해 1:160의 항혈청 희석물까지 관찰되었으며, 이어서 전형적인 ELISA 적정 곡선이 이어졌다. 종점 역가 (배경 신호보다 더 높은 신호 플러스 2 표준 편차를 갖는 마지막 희석률)는 cIL-31에 대해 > 1:40,000 및 cIL-31 폴리단백질에 대해 > 1:80,000이었다. 이들 데이터는 이 연구에서 생성된 토끼 항-cIL-31 혈청이 우수한 품질이라는 것을 시사한다.
cIL-31 폴리단백질이 후자의 단백질에 대해 생성된 항혈청에 의해 cIL-31로서 동등하게 잘 인식된다는 사실은 폴리단백질 내의 cIL-31의 카피가 인공 반복 도메인 구조 및 파상풍 독소 스페이서 서열에도 불구하고 적절하게 폴딩된다는 것을 시사한다. 이 결과는 놀라웠고 예상할 수 없었다.
닭 면역전 혈청 및 난황 제제에 대한 항원으로서 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과가 도 6에 도시된다. 이 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 닭 난황 제제는 cIL-31 및 cIL-31 폴리단백질을 인식한 반면, 닭 면역전 혈청은 1:250으로 희석되었을 때 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성하였다 (데이터는 제시되지 않음). 선형 신호 상은 cIL-31 폴리단백질에 대해 62.5 μg/ml의 난황 제제 희석물까지 관찰되었으며, 이어서 전형적인 ELISA 적정 곡선이 이어졌다. cIL-31의 경우, 선형 상은 125 μg/ml 난황 단백질에서 종료되었다. 난황 단백질 제제의 종점 역가 (배경 신호보다 더 높은 신호 플러스 2 표준 편차를 갖는 마지막 희석률)는 cIL-31에 대해 122 ng/ml 및 cIL-31 폴리단백질에 대해 61 ng/ml였다. 이들 데이터는 이 연구에서 생성된 닭 난황 제제가 우수한 품질이라는 것을 시사한다.
cIL-31 폴리단백질이 후자의 단백질에 대해 생성된 닭 난황 항체에 의해 cIL-31로서 거의 동등하게 잘 인식된다는 사실은 다시 폴리단백질 내의 cIL-31의 카피가 인공 반복 도메인 구조 및 파상풍 독소 스페이서 서열에도 불구하고 적절하게 폴딩된다는 것을 지지한다. 이 결과는 놀라웠고 예상할 수 없었다.
실시예 8b: 토끼 혈청 항체 역가 결정을 위한 항-cIL-5 및 항-cIL-5 폴리단백질 ELISA 포맷의 설정, 천연 cIL-5 및 cIL-5의 3개의 절편을 포함하는 cIL-5 폴리단백질에 대한 결합 연구
cIL-31에 대한 실시예 8a에서와 동일한 방식으로 cIL-5에 대해 생성된 항혈청을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였다. 그러나, 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 1-5 μg/ml의 cIL-5 또는 0.5 μg/ml의 cIL-31-폴리로 코팅하였다.
토끼 항-cIL-5 항혈청의 역가 결정 결과가 그의 상응하는 면역전 혈청과 비교하여 도 44에 제시된다. 토끼 항혈청은 cIL-5를 인식하는 반면, 면역전 혈청은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다. 선형 신호 상은 약 1:500의 항혈청 희석물까지 가시적이었으며, 이어서 전형적인 ELISA 적정 곡선이 이어졌다. 종점 역가 (신호 > 배경 + 2 표준 편차를 갖는 마지막 희석률)는 1:200,000에 근접하였다. 이들 데이터는 이 연구에서 생성된 토끼 항-cIL-5 혈청이 우수한 품질이라는 것을 시사한다.
토끼 면역전 혈청 및 항혈청에 대한 항원으로서 cIL-5 또는 cIL-5 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과가 도 45에 도시된다. 이 도면은 토끼 항혈청이 cIL-5 및 cIL-5 폴리단백질 구축물 둘 다를 인식한 반면, 면역전 혈청은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성하였다는 것을 보여준다. 절대 신호 강도는 cIL-5와 비교하여 cIL-5-폴리의 경우에 더 낮지만, 곡선 형상은 도 45에서 매우 유사하다. 이는 인공 반복 도메인 구조 및 파상풍 독소 스페이서 서열에도 불구하고, cIL-5-폴리에서의 cIL-5 폴리펩티드의 적어도 한 부분이 천연-유사 입체형태로 존재한다는 것을 시사한다. 이 결과는 놀라웠고 예상할 수 없었다.
실시예 8c: 토끼 혈청 항체 역가 결정을 위한 항-cIL-13 및 항-cIL-13 폴리단백질 ELISA 포맷의 설정, 천연 cIL-13 및 cIL-13의 3개의 절편을 포함하는 cIL-13 폴리단백질에 대한 결합 연구
cIL-31에 대한 실시예 8a에서와 동일한 방식으로 cIL-13에 대해 생성된 항혈청을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였다. 그러나, 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 5 μg/ml의 cIL-13 또는 5 μg/ml의 cIL-13-폴리로 코팅하였다.
토끼 항-cIL-13 항혈청의 역가 결정 결과가 그의 상응하는 면역전 혈청과 비교하여 도 53a에 제시된다. 토끼 항혈청은 cIL-13을 인식하는 반면, 면역전 혈청은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다. 선형 신호 상은 약 1:5000의 항혈청 희석물까지 가시적이었으며, 이어서 전형적인 ELISA 적정 곡선이 이어졌다. 종점 역가 (신호 > 배경 + 2 표준 편차를 갖는 마지막 희석률)는 1:500,000을 초과한다. 이들 데이터는 이 연구에서 생성된 토끼 항-cIL-13 혈청이 우수한 품질이라는 것을 시사한다.
코팅 항원으로서의 cIl-13-폴리의 경우에, 종점 역가는 1:100,000에 근접하였으며 (도 53b), 이는 백신 항원 구축물 상의 항-cIL-13 항체 결합 부위의 풍부한 존재를 확인시켜 준다.
실시예 8d: 토끼 혈청 항체 역가 결정을 위한 항-cIL-33-WT 및 항-cIL-33-CS 폴리단백질 ELISA 포맷의 설정, 천연 cIL-33 및 cIL-33-CS의 3개의 절편을 포함하는 cIL-33-CS 폴리단백질에 대한 결합 연구
cIL-31에 대한 실시예 8a에서와 동일한 방식으로 cIL-33-WT에 대해 생성된 항혈청을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였다. 그러나, 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 5 μg/ml의 cIL-33-WT 또는 cIL-33-CS-폴리로 코팅하였다.
토끼 항-cIL-13-WT 항혈청의 역가 결정 결과가 그의 상응하는 면역전 혈청과 비교하여 도 59에 제시된다. 토끼 항혈청은 cIL-33-WT를 인식하는 반면, 면역전 혈청은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다. 종점 역가 (신호 > 배경 + 2 표준 편차를 갖는 마지막 희석률)는 1:10,000을 초과한다. 이들 데이터는 이 연구에서 생성된 토끼 항-cIL-33-WT 혈청이 양호한 품질이라는 것을 시사한다.
토끼 항-cIL-13-CS-폴리 항혈청의 역가 결정 결과가 그의 상응하는 면역전 혈청과 비교하여 도 66에 제시된다. cIL-33-WT에 대해 생성된 토끼 항혈청은 cIL-33-CS-폴리를 인식하는 반면, 면역전 혈청은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다. 선형 신호 상은 약 1:320의 항혈청 희석물까지 가시적이었으며, 이어서 전형적인 ELISA 적정 곡선이 이어졌다. 종점 역가 (신호 > 배경 + 2 표준 편차를 갖는 마지막 희석률)는 1:100,000을 초과한다. 이들 데이터는 cIL-33-CS-폴리가 실제로 모 항원보다 항-cIL-33-WT 혈청에 대해 더 우수한 결합 파트너라는 것을 시사한다. cIL-33-CS-폴리의 중합체 성질이 이러한 특성에 기여할 가능성이 있다. 또한, 결과는 C→S 돌연변이가 cIL-33-WT와 비교하여 cIL-33-CS의 항원성을 큰 정도로 변화시키지는 않았다는 것을 시사한다.
실시예 8e: 토끼 혈청 항체 역가 결정을 위한 항-cIL-4 및 항-cIL-4 폴리단백질 ELISA 포맷의 설정, 천연 cIL-4, cIL-4의 3개의 절편을 포함하는 cIL-4 폴리단백질 및 cIL-13에 대한 결합 연구
cIL-31에 대한 실시예 8a에서와 동일한 방식으로 cIL-4에 대해 생성된 항혈청을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였다. 그러나, 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-4 (도 71a) 또는 2.5 μg/ml의 cIL-4-폴리 (도 71b)로 코팅하였다.
토끼 면역전 혈청 및 항혈청에 대한 항원으로서 cIL-4 또는 cIL-4 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과가 도 71a에 도시된다.
토끼 항혈청은 cIL-4를 인식하는 반면, 면역전 혈청은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다. 선형 신호 상은 ~ 1:80의 항혈청 희석물까지 가시적이며, 이어서 전형적인 ELISA 적정 곡선이 이어진다. 종점 역가 (신호 > 배경 + 2 표준 편차를 갖는 마지막 희석률)는 1:150,000을 초과한다. 이들 데이터는 이 연구에서 생성된 토끼 항-cIL-4 혈청이 우수한 품질이라는 것을 시사한다.
코팅 항원으로서의 cIL-4-폴리의 경우에, 종점 역가는 1:50,000에 근접하였으며 (도 71b), 이는 백신 항원 구축물 상의 항-cIL-4 항체 결합 부위의 풍부한 존재를 확인시켜 준다.
추가로, cIL-13에 대해 생성된 토끼 혈청을 시험하였다. 이 혈청은 특이적 항-cIL-4 항혈청의 것보다 수십배 더 낮은, 낮은 희석물에서 단지 미미한 신호만을 생성하였다 (도 71b). 이들 데이터는 cIL-4-폴리 구축물이 개 IL-4의 항원 결정기를 함유한다는 것을 입증한다.
실시예 8f: 토끼 혈청 항체 역가 결정을 위한 항-cIL-4, 항-cIL-13 및 항-cIL-13-cIL-4-폴리단백질 ELISA 포맷의 설정, 본 발명에 따른 cIL-13-cIL-4 폴리단백질에 대한 결합 연구
cIL-31에 대한 실시예 8a에서와 동일한 방식으로 cIL-4 (실시예 8e) 및 cIL-13 (실시예 8c)에 대해 생성된 항혈청을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였다. cIL-4 및 cIL-13에 대한 토끼 항혈청이 cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 얼마나 강하게 인식하는지를 시험하기 위해, 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 2.5 μg/ml의 cIL-13-cIL-4-폴리로 코팅하고, cIL-4 및 cIL-13에 대해 생성된 항혈청의 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 결과가 도 79에 도시된다.
cIL-4에 대해 생성된 토끼 항혈청 (도 79, 삼각형) 및 cIL-13에 대해 생성된 토끼 항혈청 (도 79, 정사각형) 둘 다는 cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 강하게 인식하는 반면, 면역전 cIL-4 혈청 (도 79, 원형)은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다. 선형 신호 상은 ~ 1:80의 항혈청 희석물까지 가시적이며, 이어서 전형적인 ELISA 적정 곡선이 이어진다. 종점 역가 (신호 > 배경 + 2 표준 편차를 갖는 마지막 희석률)는 1:50,000을 초과한다. 이들 데이터는 cIL-13-cIL-4-폴리 구축물이 시토카인 cIL-4 및 cIL-13 둘 다의 항원 결정기를 함유한다는 것을 입증한다.
실시예 8g: 토끼 혈청 항체 역가 결정을 위한 항-cIL-13-cIL-4-폴리단백질 ELISA 포맷의 설정.
cIL-31에 대한 실시예 8a에서와 동일한 방식으로 본 발명에 따른 cIL-13-cIL-4 폴리단백질에 대해 생성된 항혈청을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였다. 그러나, 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-4 (도 80a), 1 μg/ml의 cIL-13 (도 80b) 또는 1 μg/ml의 cIL-13-cIL-4-폴리단백질 (도 80c)로 코팅하였다. ELISA의 결과가 도 80에 도시된다.
토끼 cIL-13-cIL-4-폴리 항혈청 (삼각형)은 cIL-4 (도 80a) 및 cIL-13 (도 80b)을 강하게 인식하며, ~ 1:300까지의 플래토 상 및 1:200,000에 도달하거나 이를 초과하는 종점 역가를 갖는 반면, 면역전 혈청 (원형)은 적용된 ELISA 포맷 둘 다에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다 (도 80a,b). ELISA 플레이트를 면역원 cIL-13-cIL-4-폴리로 코팅하는 경우에 (도 80c), 인식의 플래토 상은 1:2000을 초과하고, 종점 역가는 명확히 1:300,000을 초과한다. 이들 데이터는 토끼에서 cIL-13-cIL-4-폴리 구축물의 높은 면역원성을 입증한다.
실시예 8h: 토끼 혈청 항체 역가 결정을 위한 항-cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질 ELISA 포맷의 설정.
cIL-31에 대한 실시예 8a에서와 동일한 방식으로 cIL-31 (실시예 8a), cIL-4 (실시예 8e) 및 cIL-13 (실시예 8c)에 대해 생성된 항혈청을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였다. cIL-31, cIL-4 및 cIL-13에 대한 토끼 항혈청이 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 얼마나 강하게 인식하는지를 시험하기 위해, 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리로 코팅하고, cIL-31, cIL-4 및 cIL-13에 대해 생성된 항혈청의 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 결과가 도 86에 도시된다.
cIL-31에 대해 생성된 토끼 항혈청 (정사각형), cIL-4에 대해 생성된 토끼 항혈청 (채워진 원형) 또는 cIL-13에 대해 생성된 토끼 항혈청 (삼각형)은 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 강하게 인식하는 반면, 면역전 cIL-4 혈청 (빈 원형)은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다. 이들 데이터는 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리 구축물이 모든 시토카인, 즉 cIL-31, cIL-13 및 cIL-4의 항원 결정기를 함유한다는 것을 입증한다.
추가로, cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질에 대해 생성된 토끼 항혈청 (실시예 6f)을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였으며 (결과가 도 87에 도시됨), 이는 실시예 8a의 설정과 또한 유사하되, 예외로 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-4 (도 87, 큰 원형), 1μg/ml의 cIL-13 (도 87, 큰 정사각형), 1μg/ml의 cIL-31 (도 87, 큰 마름모형) 또는 1 μg/ml의 cIL-31-cIL-13-cIL-4 폴리단백질 (도 87, 큰 삼각형)로 코팅하고, cIL-31-cIL-13-cIL-14-폴리단백질에 대해 생성된 항혈청의 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 면역전 토끼 혈청의 희석물이 또한 제시된다 (모두 0.0 평균 OD405에 근접하게 유지됨). 결과는 본 발명에 따른 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 사용한 토끼의 면역화가 면역원 그 자체, 뿐만 아니라 모든 3종의 개별 면역원 폴리펩티드 성분 (cIL-31, cIL-4 및 cIL-13)에 대해 높은 역가를 갖는 항혈청을 생성하였다는 것을 보여준다. 이들 결과는 단백질 구축물 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질이 모든 3종의 시토카인에 대해 면역원 특성을 보유한다는 것을 입증한다.
실시예 8i: 토끼 혈청 항체 역가 결정을 위한 항-bov-TNF-알파 폴리단백질 ELISA 포맷의 설정
cIL-31에 대한 실시예 8a에서와 동일한 방식으로 소 TNF-알파의 3개의 절편을 포함하는 소 TNF-알파-폴리단백질에 대해 생성된 항혈청을 시험하기 위해 ELISA를 설정하였다. 그러나, 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 실시예 8a에 기재된 바와 같이 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 bov-TNF-알파 (알앤디 시스템즈(R&D Systems))로 코팅하였다.
토끼 항-bov-TNF-알파-폴리 항혈청의 역가 결정 결과가 그의 상응하는 면역전 혈청과 비교하여 도 93에 제시된다. 토끼 항혈청은 소 TNF-알파를 인식하는 반면, 면역전 혈청은 적용된 ELISA 포맷에서 단지 무시할만한 신호만을 생성한다. 따라서, 토끼를 bov-TNFa-폴리로 면역화시키는 것은 높은 역가의 항-소-TNF-a 항혈청을 생성한다. 이 항혈청의 종점은 1:40,000 희석률을 초과하고, 포화는 1:200 희석률까지 보인다. 이는 bov-TNFa-폴리의 의도된 면역원성이 TNF-알파 단백질의 적어도 2개의 절편을 포함하는 폴리단백질 구축물을 사용하여 달성되었다는 것을 입증한다.
실시예 9: 천연 cIL-31 및 cIL-31의 3개의 절편을 포함하는 cIL-31 폴리단백질에 대한 cIL-31 중화 개 모노클로날 항체 (mAb) 로키베트맙의 결합에 대한 ELISA 포맷의 설정
로키베트맙은 개 IL-31에 대해 지시된 개 모노클로날 항체이고 (Michels et al., "A blinded, randomized, placebo-controlled, dose determination trial of lokivetmab (ZTS-00103289), a caninized, anti-canine IL-31 monoclonal antibody in client owned dogs with atopic dermatitis", Veterinary dermatology 27.6 (2016): 478-e129), 수의학적 약물 사이토포인트(Cytopoint)®의 활성제를 형성한다.
cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질에 대한 로키베트맙의 결합을 시험하기 위한 하기 ELISA 포맷을 개발하였다:
폴리스티렌 ELISA 플레이트 (384 웰: 써모 맥시소르프, 카탈로그 번호 464718)를 코팅 완충제 (50 mM NaHCO3 pH 9.6) 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질 (cIL-31: 0.29 mg/ml 또는 cIL-31 폴리단백질: 0.4 mg/ml)로 코팅하였다. 웰당 10 μl 부피의 코팅 용액을 사용하였다. 이어서, 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 폐쇄 뚜껑을 덮어 4℃에서 밤새 (O/N) 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 제거한 후, PBS (써모피셔 포스페이트-완충 염수 (PBS), pH 7.2, 카탈로그 번호 20012-019), 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰당 50 μl의 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 (냉수 어피로부터, H2O 중 40-50%, 시그마 C 7765)을 사용하여 비-특이적 결합 부위의 차단을 수행하였다. 이 차단 단계를 실온에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. 차단 용액을 제거한 후, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 로키베트맙의 연속 희석물 (비-흡착성 복제 플레이트로부터)을 첨가하였다 (웰당 20 μl). 로키베트맙의 연속 희석물과의 인큐베이션을 실온에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. 그 후에, 로키베트맙의 연속 희석물을 꺼내고, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 이어서, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 단백질 A-AP (P7488 시그마)의 1:5000 희석물 또는 항-개-IgG-AP (시그마 로트 RI6082 0.61mg/ml)의 1:2000 희석물 (웰당 20 μl)을 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이들 용액을 꺼낸 후, 다시 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰을 AP 완충제 (50 mM NaHCO3/Na2CO3, 2 mM MgCl2, pH 9.6, 웰당 50 μl)로 1회 세척하였다. 최종적으로, AP 완충제 중 5 mM 4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물 (pNPP, 어플라이켐, 시그마를 통함, A1442,0050 또는 등가물) (웰당 90 μl)을 첨가하였다. 405 nm/분에서의 광학 밀도 (OD)의 증가 (mOD/분)를 실온에서 ELISA 판독기에서 기록하고, 곡선 기울기를 선형 증가 범위로부터 결정하였다.
로키베트맙에 대한 항원으로서 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과가 도 7에 도시된다. 이들 결과는 로키베트맙이 cIL-31에 결합하고, 항-개-IgG 시약에 의해 검출될 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, cIL-31에 결합된 로키베트맙은 단백질 A에 의해 단지 약하게 인식된다.
로키베트맙에 대한 항원으로서 cIL-31 및 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과가 도 8에 도시된다. 이들 결과는 로키베트맙이 cIL-31 및 cIL-31 폴리단백질에 결합한다는 것을 입증한다. 이는 폴리단백질 내의 cIL-31의 카피가 천연 폴드를 갖는다는 것을 시사한다.
실시예 10: 비오티닐화된 로키베트맙의 생성 및 특징화
비오티닐화된 로키베트맙을 위해, 제바 0.5 ml 스핀 탈염 칼럼 (40K)을 먼저 50 mM NaHCO3, 150 mM NaCl, pH 8.5로 평형화시켰다. 이어서, 100 μl 로키베트맙 (10 mg/ml)을 평형화된 칼럼에 2회 통과시켰다. 그 후에, 20 μl 10 mM EZ-링크(EZ-Link)™ 술폰-NHS-LC-LC-비오틴 (써모 사이언티픽 21338)을 로키베트맙-함유 용액에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 후에, 1 μl 1 M 트리스 pH 8.0을 첨가하였다. 추가의 제바 0.5 ml 스핀 탈염 칼럼을 PBS pH 7.2로 평형화시킨 후에, 로키베트맙을 함유하는 반응 혼합물을 PBS-평형화된 칼럼에 통과시키고, PBS로 200 μl의 최종 부피까지 채우고, 5 mg/ml 비오티닐화된 로키베트맙의 농도를 가정하였다.
이어서, 비오티닐화된 로키베트맙의 cIL-31 결합을 시험하기 위한 ELISA 포맷을 개발하였다:
폴리스티렌 ELISA 플레이트 (384 웰: 써모 맥시소르프, 카탈로그 번호 464718)를 코팅 완충제 (50 mM NaHCO3 pH 9.6) 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질 (cIL-31: 0.29 mg/ml 또는 cIL-31 폴리단백질: 0.4 mg/ml)로 코팅하였다. 웰당 10 μl 부피의 코팅 용액을 사용하였다. 이어서, 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 폐쇄 뚜껑을 덮어 4℃에서 밤새 (O/N) 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 제거한 후, PBS (써모피셔 포스페이트-완충 염수 (PBS), pH 7.2, 카탈로그 번호 20012-019), 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰당 50 μl의 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 (냉수 어피로부터, H2O 중 40-50%, 시그마 C 7765)을 사용하여 비-특이적 결합 부위의 차단을 수행하였다. 이 차단 단계를 실온에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. 차단 용액을 제거한 후, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 로키베트맙의 연속 희석물 (비-흡착성 복제 플레이트로부터)을 첨가하였다 (웰당 20 μl). 비오티닐화된 로키베트맙의 연속 희석물과의 인큐베이션을 실온에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. 그 후에, 비오티닐화된 로키베트맙의 연속 희석물을 꺼내고, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 이어서, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 엑스트라비딘(ExtrAvidin)®-AP (시그마 E2636)의 1:17.000 희석물 (웰당 20 μl)을 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 용액을 꺼낸 후, 다시 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰을 AP 완충제 (50 mM NaHCO3/Na2CO3, 2 mM MgCl2, pH 9.6, 웰당 50 μl)로 1회 세척하였다. 최종적으로, AP 완충제 중 5 mM 4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물 (pNPP, 어플라이켐, 시그마를 통함, A1442,0050 또는 등가물) (웰당 90 μl)을 첨가하였다. 405 nm/분에서의 광학 밀도 (OD)의 증가 (mOD/분)를 실온에서 ELISA 판독기에서 기록하고, 곡선 기울기를 선형 증가 범위로부터 결정하였다.
비오티닐화된 로키베트맙에 대한 항원으로서 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과가 도 9에 도시된다. 이들 결과는 사용된 ELISA 설정에서 강한 적정가능한 신호가 관찰되었기 때문에 로키베트맙의 비오티닐화가 성공적이었다는 것을 시사한다.
실시예 11: 비오티닐화된 로키베트맙 경쟁 검정 포맷의 설정.
토끼 면역전 혈청, 토끼 항-cIL-31 항혈청 (실시예 6 참조), cIL-31 폴리단백질 0.4 mg/ml (젠스크립트), cIL-31 0.29 mg/ml (젠스크립트) 및 로키베트맙-비오틴 (실시예 10 참조)을 사용하여 로키베트맙 경쟁 검정을 설정하였다.
비오티닐화된 로키베트맙 경쟁 검정 포맷을 하기와 같이 설계하였다:
폴리스티렌 ELISA 플레이트 (384 웰: 써모 맥시소르프, 카탈로그 번호 10192781)를 코팅 완충제 (50 mM NaHCO3 pH 9.6) 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질 (PBS 중 원액: cIL-31: 0.29 mg/ml 또는 cIL-31 폴리단백질: 0.4 mg/ml)로 코팅하였다. 웰당 10 μl 부피의 코팅 용액을 사용하였다. 이어서, 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 폐쇄 뚜껑을 덮어 4℃에서 밤새 (O/N) 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 제거한 후, PBS (써모피셔 포스페이트-완충 염수 (PBS), pH 7.2, 카탈로그 번호 20012-019), 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 35 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰당 35 μl의 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 (냉수 어피로부터, H2O 중 40-50%, 시그마 C 7765)을 사용하여 비-특이적 결합 부위의 차단을 수행하였다. 이 차단 단계를 폐쇄 뚜껑을 덮어 실온에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙 중 토끼 면역전, 토끼 항-cIL-31 면역 혈청 또는 닭 난황 IgY 제제의 연속 희석물을 별개의 비-흡수성 ELISA 플레이트에서 제조하고, 실온에서 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질 코팅된 ELISA 플레이트로부터 차단 용액을 제거한 후, 사전인큐베이션된 연속 항체 희석물을 첨가하였다 (웰당 20 μl). 연속 항체 희석물과의 인큐베이션을 실온에서 약 1시간 동안 수행하였다. 그 후에, 연속 항체 희석물을 꺼내고, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 35 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 이어서, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 엑스트라비딘®-AP (시그마 E2636)의 1:17.000 희석물 (웰당 20 μl)을 첨가하고, 폐쇄 뚜껑을 덮어 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 용액을 꺼낸 후, 다시 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 35 μl)으로 2회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰을 AP 완충제 (50 mM NaHCO3/Na2CO3, 2 mM MgCl2, pH 9.6, 웰당 50 μl)로 1회 세척하였다. 최종적으로, AP 완충제 중 5 mM 4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물 (pNPP, 어플라이켐, 시그마를 통함, A1442,0050 또는 등가물) (웰당 90 μl)을 첨가하였다. 405 nm/분에서의 광학 밀도 (OD)의 증가 (mOD/분)를 실온에서 ELISA 판독기에서 기록하고, 곡선 기울기를 선형 증가 범위로부터 결정하였다.
토끼 면역전 혈청 + 비오티닐화된 로키베트맙의 혼합물 또는 토끼 면역 혈청 + 비오티닐화된 로키베트맙의 혼합물을 사용한 ELISA 설정은 cIL-31 중화 항체로서의 비오티닐화된 로키베트맙과 ELISA 플레이트 상에 고정화된 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질 사이의 상호작용을 프로빙한다. 도 10 및 11의 결과는 토끼 면역전 혈청이 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질에 대한 로키베트맙의 결합을 방해하지 않는다는 것을 보여준다. 그러나, 항-cIL-31 토끼 면역혈청은 1:128 내지 1:64의 희석물에서 시작하여 이러한 상호작용에 대한 억제 활성을 나타내고, 1:2의 희석물에서 로키베트맙 결합의 완전한 억제를 유도한다.
닭 난황 IgY 제제 + 비오티닐화된 로키베트맙의 혼합물을 사용한 ELISA 설정은 cIL-31 중화 항체로서의 비오티닐화된 로키베트맙과 ELISA 플레이트 상에 고정화된 cIL-31 사이의 상호작용을 프로빙한다. 도 12의 결과는 항-cIL-31 닭 난황 IgY 제제가 122 내지 244 μg/ml에서 시작하여 이러한 상호작용에 대한 억제 활성을 나타내고, 15.6 mg/ml에서 비오티닐화된 로키베트맙 결합의 완전한 억제를 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 12a: 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG-ODN)의 NFkB-자극 잠재력을 평가하도록 하는 개 단핵구 세포주 (DH82)의 생성
개 단핵구 세포주 DH82 (Wellman et al. 1988)를 pcDNA3.1(+)-bsd-NFkB-SEAP로 형질감염시켰다 (플라스미드 맵은 도 13에 포함됨). 이는 블라스티시딘 S-선택된 세포주가 다수의 NFkB 경로 활성화 리간드 (예컨대 LPS 또는 TNF-α)에 의해 분비형 배아 알칼리성 포스파타제 (SEAP)를 분비하도록 자극될 수 있게 하였다. 단일 세포 클로닝을 수행하여 클론 세포주를 수득하였다.
이 클론 세포주 (DH82-bsd-NFSEAP)를 상이한 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (PTO-ODN)에 노출시켰다. 강한 농도-의존성 SEAP 신호가 효력 1668-PTO>>2006-PTO>2007-PTO의 순서로 3종의 상이한 PTO-ODN에 대해 관찰되었다 (도 14 참조).
도 14의 결과는 DH82가 기능적 톨-유사 수용체 9 (TLR9)를 발현한다는 것을 시사하며, 이는 이것이 PTO-ODN을 인식하고 NFkB 신호전달을 유도하는 유일한 공지된 수용체이기 때문이다. 더욱이, 도 14의 결과는 놀랍게도 특히 1668-PTO (서열 A)가 개 TLR9의 강력한 활성화제라는 것을 보여준다.
실시예 12b: HEK-블루™ IL-13 세포에서의 cIL-13의 자극 잠재력
HEK-블루™ IL-4/IL-13 세포 (인비보젠(Invivogen), hkb-il413)를 인간 STAT6 유전자로 안정하게 형질감염시켜 완전 활성 STAT6 경로를 수득한다. 추가로, 세포를 STAT6-유도성 SEAP 리포터 유전자로 형질감염시킨다. 수용체 서브유닛 IL4Rα 및 IL-13Rα1뿐만 아니라 신호전달 경로의 다른 유전자는 충분한 양으로 자연적으로 발현된다.
이들 세포는 인간 IL-4 및 인간 Il-13에 대해 반응성이다 (https://www.invivogen.com/hek-blue-il4-il13, 데이터는 제시되지 않음).
cIL-13을 사용한 이들 세포의 시험은 이 시토카인이 HEK-블루™ IL-4/IL-13 세포에 의해 민감하게 인식되고, ~ 2 ng/ml (2000 pg/ml) EC50을 갖는 SEAP 리포터 효소 판독치를 생성한다는 것을 밝혀냈다 (도 52 참조).
실시예 12c: HEK-블루™ IL-33 세포에서의 cIL-33-WT 및 cIL-33-CS의 자극 잠재력
HEK-블루™ IL-33 세포 (인비보젠, hkb-hiL33)를 사용하여 cIL-33-WT 및 cIL-33-CS 단백질의 자극 잠재력을 평가하였다. 세포는 인간 배아 신장 HEK293-유래 세포를 인간 IL1RL1 유전자로 안정하게 형질감염시켜 생성된 것이다. 추가로, TNF-α 및 IL-1β 반응을 차단하였다. 따라서, HEK-블루™ IL-33 세포는 IL-33에 특이적으로 반응한다. 이들 세포는 NF-κB/AP-1-유도성 SEAP 리포터 유전자를 발현한다. 이들 세포의 표면 상의 이종이량체 IL-1RL1 / IL-1RAcP에 대한 인간 IL-33의 결합은 신호전달 캐스케이드를 촉발하여 NF-κB의 활성화 및 SEAP의 후속 생산으로 이어지는 것으로 공지되어 있다.
이들 세포는 인간 IL-33 (https://www.invivogen.com/hek-blue-il33)에 대해 반응성이다. 개 IL-33을 사용한 이들 세포의 시험은 상이한 공급원으로부터의 cIL-33-WT가 가변적으로 인식되고 (도 62, 채워진 삼각형을 갖는 "cIL-33-WT 배치1" 및 채워진 정사각형을 갖는 "cIL-33-WT 배치2"), 아마도 티올-함유 시스테인 잔기의 산화로 인해 시간 경과에 따라 자극 활성을 상실하는 것으로 보인다는 것 (본 발명자들 자신의 관찰, 데이터는 제시되지 않음)을 밝혀냈다.
그러나, cIL-33-CS는 HEK-블루™ IL-33 세포에 의해 민감하게 인식되고, cIL-33-WT 내의 3개의 시스테인이 세린으로 돌연변이된 (cIL-33-CS) 후 ~ 10 ng/ml EC50을 갖는 SEAP 리포터 효소 판독치를 생성한다 (도 62, 채워진 원형).
실시예 13a: cIL-31의 3개의 절편을 포함하는 cIL-31-폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화 연구
cIL-31 폴리단백질 백신은 하기를 함유하는 것으로 규정하였다:
200 μg cIL-31-폴리 (서열식별번호: 4 및/또는 서열식별번호: 40)
50 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
50 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
900 μl PBS 중
+ 100 μl 폴리젠
하기와 같이 피하 주사에 의해 개의 면역화를 수행하였다:
제0일: 상기 정의된 바와 같은 cIL-31 폴리단백질 백신으로의 1차 면역화 및 혈액 샘플 (면역전 샘플)의 수집
제7일: 혈액 샘플의 수집
제14일: 혈액 샘플의 수집
제21일: 혈액 샘플의 수집
제28일: 상기 정의된 바와 같은 cIL-31 폴리단백질 백신으로의 2차 면역화 및 혈액 샘플의 수집
제35일: 혈액 샘플의 수집
제42일: 혈액 샘플의 수집
제49일: 혈액 샘플의 수집
제56일: 혈액 샘플의 수집
제63일: 혈액 샘플의 수집
제70일: 혈액 샘플의 수집
실시예 13b: cIL-5의 3개의 절편을 포함하는 cIL-5-폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화 연구
cIL-5 폴리단백질 백신은 하기를 함유하는 것으로 규정하였다:
23 μg cIL-5-폴리 (서열식별번호: 42)
50 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
50 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
1000 μl PBS 중
+ 110 μl 폴리젠
3마리의 개 (개 1 (0368), 개 2 (9641), 개 3 (0852))의 면역화 및 혈액 샘플링 계획을 실시예 13a에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으며, 예외로 샘플링은 제70일을 포함하지 않았다.
실시예 13c: cIL-13의 3개의 절편을 포함하는 cIL-13-폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화 연구
cIL-5 폴리단백질 백신의 1회 주사 용량은 하기를 함유하는 것으로 규정하였다:
50 μg cIL-13-폴리 (서열식별번호: 47)
50 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
50 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
900 μl PBS 중
+ 100 μl 폴리젠
3마리의 개 (개 cIL-13-1 (0521), 개 cIL-13-2 (2579), 개 cIL-13-3 (6048))의 면역화 및 혈액 샘플링 계획을 실시예 13a에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으며, 예외로 샘플링은 제70일을 포함하지 않았다.
실시예 13d: cIL-33의 3개의 절편을 포함하는 cIL-33-폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화 연구
cIL-33-CS 폴리단백질 백신은 하기를 함유하는 것으로 규정하였다:
100 μg cIL-33-CS-폴리 (서열식별번호: 54)
50 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
50 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
900 μl PBS 중
+ 100 μl 폴리젠
1마리의 개 (개 402)의 면역화 및 혈액 샘플링 계획을 실시예 13a에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으며, 예외로 샘플링은 제70일을 포함하지 않았다. 특이적 항-cIL-33 항체의 존재를 전형적 플레이트-결합된 항원 ELISA 설정에서 평가하였다. cIL-33의 야생형 형태를 이 분석에 사용하여 C→S 돌연변이에 특이적인 임의의 효과를 배제하였다.
실시예 13e: cIL-4의 3개의 절편을 포함하는 cIL-4-폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화 연구
cIL-4 폴리단백질 백신의 1회 주사 용량은 하기를 함유하는 것으로 규정하였다:
200 μg cIL-4-폴리 (서열식별번호: 57)
50 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
50 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
900 μl PBS 중
+ 100 μl 폴리젠
3마리의 개 (개 5365, 개 6523, 개 7104)의 면역화 및 혈액 샘플링 계획을 실시예 13a에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으며, 예외로 샘플링은 제70일을 포함하지 않았다.
실시예 13f: fel-IL-31의 3개의 절편을 포함하는 fel-IL-31-폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화 연구
fel-IL-31 폴리단백질 백신의 1회 주사 용량은 하기를 함유하는 것으로 규정하였다:
100 μg fel-IL-31-폴리 (서열식별번호: 61)
25 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
25 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
900 μl PBS 중
+ 100 μl 폴리젠
3마리의 고양이 (고양이 3132, 고양이 0487, 고양이 5674)의 면역화 및 혈액 샘플링 계획을 실시예 13a에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으며, 예외로 2차 면역화를 제35일에 수행하고, 혈액 샘플을 또한 제77일, 제84일, 제91일, 제98일, 제105일, 제112일, 제119일 및 제126일에 채취하였다.
실시예 13g: 단일 자기-단백질의 3개의 절편을 포함하는 추가의 폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화
추가의 폴리단백질 백신은 1회 용량에 대해 하기를 함유하는 것으로 규정할 수 있다:
200 μg의 서열식별번호: 68 내지 201 중 하나
50 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
50 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
900 μl PBS 중
+ 100 μl 폴리젠
면역화 및 혈액 샘플링을 실시예 13a에 대해 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
실시예 13h: 본 발명에 따른 cIL-13-cIL-4-폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화
cIL-13-cIL-4-폴리단백질 백신의 1회 주사 용량은 하기를 함유하는 것으로 규정하였다:
200 μg cIL-13-cIL-4-폴리단백질 (서열식별번호: 203)
50 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
50 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
900 μl PBS 중
+ 100 μl 폴리젠
3마리의 개 (개 8322, 개 6504, 개 6043)의 면역화 및 혈액 샘플링 계획을 실시예 13a에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으며, 예외로 2차 면역화를 제35일에 수행하고, 샘플링은 제70일을 포함하지 않고, 혈액을 제28일 대신 제27일에 샘플링하였다.
실시예 13i: 본 발명에 따른 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질/PTO-ODN/폴리젠 백신 제제의 설계 및 면역화
cIL-13-cIL-4-폴리단백질 백신의 1회 주사 용량은 하기를 함유하는 것으로 규정하였다:
200 μg cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질 (서열식별번호: 205)
50 μg 1668-PTO (서열식별번호: 5)
50 μg 2006-PTO (서열식별번호: 6)
900 μl PBS 중
+ 100 μl 폴리젠
3마리의 개 (개 0720, 개 6731, 개 9214)의 면역화 및 혈액 샘플링 계획을 실시예 13a에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으며, 예외로 샘플링은 제70일을 포함하지 않았다.
실시예 14a: 면역화된 개에서의 항-cIL-31 역가의 결정
면역화된 개로부터 수득된 개 혈청 (실시예 13a 참조)을 하기 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-31 항체의 존재에 대해 시험하였다:
폴리스티렌 ELISA 플레이트 (384 웰: 써모 맥시소르프, 카탈로그 번호 464718)를 코팅 완충제 (50 mM NaHCO3 pH 9.6) 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질 (cIL-31: 0.29 mg/ml 또는 cIL-31 폴리단백질: 0.4 mg/ml)로 코팅하였다. 웰당 10 μl 부피의 코팅 용액을 사용하였다. 이어서, 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 폐쇄 뚜껑을 덮어 4℃에서 밤새 (O/N) 인큐베이션하였다. 코팅 용액을 제거한 후, PBS (써모피셔 포스페이트-완충 염수 (PBS), pH 7.2, 카탈로그 번호 20012-019), 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰당 50 μl의 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 (냉수 어피로부터, H2O 중 40-50%, 시그마 C 7765)을 사용하여 비-특이적 결합 부위의 차단을 수행하였다. 이 차단 단계를 실온에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. 차단 용액을 제거한 후, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 개 혈청의 연속 희석물 (비-흡착성 복제 플레이트로부터)을 첨가하였다 (웰당 20 μl). 개 혈청의 연속 희석물과의 인큐베이션을 실온에서 적어도 1시간 동안 수행하였다. 그 후에, 개 혈청의 연속 희석물을 꺼내고, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다.
이어서, PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20, 3% (v/v) 젤라틴 중 토끼 IgG 항-개 IgG (Fc)-알크. 포스., 민엑스 논(MinX none) (디아노바 게엠베하(Dianova GmbH), SKU 304-055-008 또는 등가물)의 1:2,000 희석물 (웰당 20 μl)을 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 용액을 꺼낸 후, 다시 PBS, 0.05% (v/v) 트윈 20 (웰당 50 μl)으로 3회 세척을 수행하였다. 후속적으로, 웰을 AP 완충제 (50 mM NaHCO3/Na2CO3, 2 mM MgCl2, pH 9.6, 웰당 50 μl)로 1회 세척하였다. 최종적으로, AP 완충제 중 5 mM 4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물 (pNPP, 어플라이켐, 시그마를 통함, A1442,0050 또는 등가물) (웰당 90 μl)을 첨가하였다. 405 nm/분에서의 광학 밀도 (OD)의 증가 (mOD/분)를 실온에서 ELISA 판독기에서 기록하고, 곡선 기울기를 선형 증가 범위로부터 결정하였다.
도 15a-c 내지 17a-c는 면역화된 개가 면역화 후 이미 14일에 항-cIL-31 항체를 상당한 양으로 생산하였다는 것을 보여주는 이들 ELISA의 결과를 도시한다. 높은 항-cIL-31 역가는 또한 모든 3마리의 개에서 균일하게 1차 면역화 후 제112일에 여전히 관찰될 수 있었다.
실시예 14b: 면역화된 개에서의 항-cIL-5 역가의 결정
면역화된 개로부터 수득된 개 혈청 (실시예 13b 참조)을 항-cIL-31 항체에 대한 실시예 14a에 기재된 바와 동일한 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-5 항체의 존재에 대해 시험하였다. 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 중에 용해된 1-5 μg/ml의 cIL-5로 코팅하였다.
도 46 (a-f)은 2마리의 cIL-5-폴리 면역화된 개가 면역화 후 이미 28일에 항-cIL-5 항체를 상당한 양으로 생산하였다는 것을 나타내는 이들 ELISA의 결과를 도시한다 (도 46a 및 46e). 제28일에서의 부스터 면역화는 이들 2마리의 개에서 추가의 대량의 항-cIL-5 항체 역가 증가를 유도하였으며, 이는 제42일에 피크였다 (도 46b 및 46f). 역가는 마지막 샘플링 시점인 제63일에 및 가능하게는 그 이후까지 연장되어 높게 유지되었다. 1마리의 개는 cIL-5-폴리 백신접종에 대해 전체적으로 불량한 반응을 나타냈지만 (도 46c-d), 제28일에서의 부스터 면역화의 효과가 가시적이었다 (도 46d).
실시예 14c: 면역화된 개에서의 항-cIL-13 역가의 결정
면역화된 개로부터 수득된 개 혈청 (실시예 13c 참조)을 항-cIL-31 항체에 대한 실시예 14a에 기재된 바와 동일한 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-13 항체의 존재에 대해 시험하였다. 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 중에 용해된 1-5 μg/ml의 cIL-13 (원액: cIL-13: 0.15 mg/mL)으로 코팅하였다.
도 54는 이들 ELISA의 결과를 도시한다. cIL-13-폴리 면역화된 개는 제28일까지 1차 면역화에서 단지 미미한 항-cIL-13 항체 발생만을 나타냈다 (도 54a-c). 그러나, 제28일에서의 부스터 면역화는 모든 3마리의 개에서 대량의 항-cIL-13 항체 역가 증가를 유도하였으며, 이는 약 제35일-제42일에 피크였고, 제63일까지 및 가능하게는 그 이후까지 지속되었다 (도 54a-c).
실시예 14d: 면역화된 개에서의 항-cIL-33-CS 역가의 결정
면역화된 개로부터 수득된 개 혈청 (실시예 13d 참조)을 항-cIL-33 항체에 대한 실시예 14c에 기재된 바와 동일한 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-33 항체의 존재에 대해 시험하였다. 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 중에 용해된 1-5 μg/ml의 cIL-33-WT (임의의 C → S 이상을 배제하기 위함)로 코팅하였다.
도 67은 이들 ELISA의 결과를 도시한다. cIL-33-CS-폴리 면역화된 개는 제28일까지 1차 면역화에서 항-cIL-33-WT 항체 발생을 나타내지 않았다 (도 67, 빈 기호). 그러나, 제28일에서의 부스터 면역화는 항-cIL-33-WT 항체 역가의 증가를 유도하였으며, 이는 제42일에 피크였고, 제63일까지 지속되었으며, 시간 경과에 따라 거의 감소하지 않았다 (도 67, 채워진 기호).
이들 결과는 설계된 cIL-33-CS-폴리 항원이 cIL-33-WT에 대한 자기-관용의 파괴를 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 14e: 면역화된 개에서의 항-cIL-4 역가의 결정
면역화된 개로부터 수득된 개 혈청 (실시예 13e 참조)을 항-cIL-31 항체에 대한 실시예 14a에 기재된 바와 동일한 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-4 항체의 존재에 대해 시험하였다. 유일한 예외는 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-4 (예: 젠스크립트 cIL-4, 0.84 mg/ml)로 코팅한 것이었다.
도 72는 이들 ELISA의 결과를 도시한다. cIL-4-폴리 면역화된 개는 제35일까지 1차 면역화에서 단지 미미한 항-cIL-4 항체 발생만을 나타냈다 (도 72a-c). 그러나, 제35일에서의 부스터 면역화는 1마리의 개 (개 5365; 도 72a)에서 대량의 항-cIL-4 항체 역가 증가를 유도하였으며, 이는 약 제42일에 피크였고, 제63일까지 및 가능하게는 그 이후까지 지속되었다. 2마리의 개 (개 6523, 도 72b 및 개 7104, 도 72c)는 본질적으로 동일한 사진을 보였지만, 부스트 후에 개 5365보다 더 약한 역가를 가졌다. 이 실험은 선택된 제제에서 설계된 cIL-4-폴리 항원이 cIL-4에 대한 자기-관용의 파괴를 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 14f: 면역화된 고양이에서의 항-fel-IL-31 역가의 결정
면역화된 고양이로부터 수득된 고양이 혈청 (실시예 13f 참조)을 개에서의 항-cIL-31 항체에 대한 실시예 14a에 기재된 바와 동일한 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-31 항체의 존재에 대해 시험하였다. 유일한 예외는 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 fel-IL-4 (예: 젠스크립트 U6344FL160-4, fel-IL-31, 0.54 mg/ml)로 코팅한 것이었다.
도 75 및 76은 이들 ELISA의 결과를 도시한다. 3마리의 fel-IL-31-폴리 면역화된 고양이 중 2마리 (고양이 3132 및 고양이 5674)는 제27일까지 1차 면역화에서 항-fel-IL-31 항체 발생을 단지 미미하게만 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않았다 (도 75a-c). 그러나, 제27일에서의 부스터 면역화는 모든 3마리의 고양이에서 대량의 항-fel-IL-31 항체 역가 증가를 유도하였으며, 이는 제35일부터 제63일까지 높게 유지되었다 (도 75a-c). 제126일까지 혈액 샘플의 추가의 ELISA 분석 (도 76)은 특이적 항체 역가가 단지 매우 느리게만 감소하며, 유의한 역가는 1차 면역화 4개월 후 및 2차 면역화 3개월 후에 여전히 존재한다는 것을 보여주었다 (도 76a-c).
이 실험은 설계된 fel-IL-31-폴리 항원이 고양이에서 fel-IL-31에 대한 자기-관용의 파괴와 오래-지속되는 항-fel-IL-31 항체 역가를 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 14g: 본 발명에 따른 cIL-13-cIL-4-폴리단백질-면역화된 개에서의 항-cIL-4 역가의 결정
cIL-13-cIL-4-폴리단백질로 면역화된 3마리의 개로부터 수득된 개 혈청 (실시예 13h 참조)을 항-cIL-31 항체에 대한 실시예 14a에 기재된 바와 동일한 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-4 항체의 존재에 대해 시험하였다. 유일한 예외는 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-4 (예: 젠스크립트 cIL-4)로 코팅한 것이었다.
도 81은 이들 ELISA의 결과를 도시한다. 1마리의 cIL-13-cIL-4-폴리 면역화된 개 (6504)는 제35일까지 1차 면역화에서 항-cIL-4 항체 발생을 단지 미미하게만 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않은 반면 (도 81b), 2마리의 다른 개 (8322, 6043)는 제14일, 제21일, 제27일 및 제35일에 이미 상당한 역가를 나타냈다 (각각 도 81a, c). 그러나, 제35일에서의 부스터 면역화는 모든 개에서 대량의 항-cIL-4 항체 역가 증가를 유도하였으며 (도 81a-c), 이는 제42일 및 제49일에 피크였고, 제63일까지 및 가능하게는 그 이후까지 지속되었다.
이 실험은 선택된 제제 중 설계된 cIL-13-cIL-4-폴리단백질 항원이 cIL-4에 대한 자기-관용의 파괴를 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 14h: 본 발명에 따른 cIL-13-cIL-4-폴리단백질-면역화된 개에서의 항-cIL-13 역가의 결정
cIL-13-cIL-4-폴리단백질로 면역화된 3마리의 개로부터 수득된 개 혈청 (실시예 13h 참조)을 항-cIL-31 항체에 대한 실시예 14a에 기재된 바와 동일한 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-13 항체의 존재에 대해 시험하였다. 유일한 예외는 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml의 cIL-13으로 코팅한 것이었다.
도 82는 이들 ELISA의 결과를 도시한다. 1마리의 cIL-13-cIL-4-폴리단백질-면역화된 개 (6504)는 제35일까지 1차 면역화에서 항-cIL-13 항체 발생을 단지 미미하게만 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않은 반면 (도 82b), 2마리의 다른 개 (8322, 6043)는 제14일, 제21일, 제27일 및 제35일에 이미 상당한 역가를 나타냈다 (각각 도 82a, c). 그러나, 제35일에서의 부스터 면역화는 모든 개에서 대량의 항-cIL-13 항체 역가 증가를 유도하였으며, 이는 제42일 및 제49일에 피크였고, 제63일까지 및 가능하게는 그 이후까지 지속되었다 (도 82a-c).
이 실험은 선택된 제제 중 설계된 cIL-13-cIL-4-폴리단백질 항원이 또한 cIL-13에 대한 자기-관용의 파괴를 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 14i: 본 발명에 따른 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질-면역화된 개에서의 항-cIL-4 및 항-cIL-13 역가의 결정
cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질로 면역화된 3마리의 개로부터 수득된 개 혈청 (실시예 13i 참조)을 항-cIL-31 항체에 대한 실시예 14a에 기재된 바와 동일한 ELISA 포맷에 기초하여 항-cIL-13 항체의 존재에 대해 시험하였다. 유일한 예외는 384-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 중에 용해된 1 μg/ml cIL-4 (예: 젠스크립트 cIL-4, U1119GH110-3 0.84 mg/ml) 또는 cIL-13 (예: 젠스크립트 U842WEG100-1, cIL-13, 0.15 mg/ml) 또는 cIL-31-폴리 (예: 젠스크립트 U935DEG100-5, 0.29 mg/ml)로 코팅한 것이었다.
도 88은 코팅 항원으로서 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 모든 3마리의 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리 면역화된 개는 cIL-31 면역원 성분에 대해 높은 항체 역가를 생성하였다. 역가는 1차 면역화 단계 (제SD-1일 - 제SD28일)에서 이미 분명하였다.
도 89는 코팅 항원으로서 cIL-4를 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 모든 3마리의 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리 면역화된 개는 cIL-4 면역원 성분에 대해 항체 역가를 생성하였다. 역가는 1차 면역화 단계 (제SD-1일 - 제SD 28일)에서 단지 약하게만 존재하였지만, 부스터 면역화 (제SD 35일 - 제SD 63일) 후에는 현저하게 분명해졌다.
도 90은 코팅 항원으로서 cIL-13을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 모든 3마리의 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리 면역화된 개는 cIL-13 면역원 성분에 대해 항체 역가를 생성하였다. 역가는 1차 면역화 단계 (제SD-1일 - 제SD 28일)에서 단지 약하게만 존재하였지만, 부스터 면역화 (제SD 35일 - 제SD 63일) 후에는 현저하게 분명해졌다.
실시예 15: 개 혈청에서 cIL-31 중화 항체의 존재를 분석하기 위한 폴리클로날 개 항체와 비오티닐화된 로키베트맙과의 경쟁에 대한 시험
실시예 11에 기재된 바와 같이, 그러나 PBS 중 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙 중 개 혈청의 혼합물을 사용하여 ELISA 검정을 수행하였다.
도 18 내지 23은 면역화 후 제42일부터의 개 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대해 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 도 18, 20 및 22에서 반응의 단위는 "mOD405/분"이고, 따라서 리포터 반응으로부터의 직접 판독치인 반면, 도 19, 21 및 23은 반응의 단위로서 제0일의 면역전 혈청에 대한 "mOD405/분"의 최고 판독치에 기초하여 계산된 "% 로키베트맙 결합"을 사용한다.
도 24 내지 29는 면역화 후 제42일부터의 개 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대해 항원으로서의 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 도 24, 26 및 28에서 반응의 단위는 "mOD405/분"이고, 따라서 리포터 반응으로부터의 직접 판독치인 반면, 도 25, 27 및 29는 반응의 단위로서 제0일의 면역전 혈청에 대한 "mOD405/분"의 최고 판독치에 기초하여 계산된 "% 로키베트맙 결합"을 사용한다.
개의 면역전 혈청은 cIL-31에 대한 로키베트맙 결합에 대해 일부 억제 활성을 나타냈지만, 이 효과는 면역화 42일 후에 수득된 개 혈청의 억제 활성과 비교하여 훨씬 더 약하였고, 1:2 희석물에서 40-70%로 제한되었다. 이는 다양한 시토카인, 예컨대 인터페론 알파 및 감마, 종양 괴사 인자 알파, 인터류킨 1 베타 및 10 등에 대해 인간에서 이전에 기재된 바와 같이, 개에서 cIL-31 시토카인 자가항체의 존재를 반영하는 것으로 보인다 (Bendtzen et al., "High-avidity autoantibodies to cytokines", Immunology today 19.5 (1998): 209-211).
그러나, 중화 활성은 cIL-31 폴리단백질로의 면역화에 의해 크게 증가되었다. 실시예 13에 기재된 요법에 따라 면역화된 모든 3마리의 개의 제42일로부터의 혈청 샘플은 1:2로 희석되는 경우에 cIL-31에 대한 로키베트맙 결합을 95%만큼 억제한 항체를 함유하였다 (도 21 내지 26 참조). 이러한 억제는 혈청 샘플이 추가로 희석된 경우에 (적정) 덜 현저해졌지만, 1:16 희석물에서는 모든 3마리의 개에서 부분 효과가 여전히 가시적이었다.
cIL-31 폴리가 로키베트맙 결합제로서 사용된 경우에 유사한 결과가 수득되었다 (도 24 내지 29).
로키베트맙이 cIL-31 중화 항체이기 때문에, 기재된 cIL-31 폴리단백질 면역화 계획을 사용한 로키베트맙-경쟁 자가항체의 성공적인 유도는 자가항체가 개에서 cIL-31 기능을 중화시킬 수 있다는 명확한 잠재력을 나타낸다.
로키베트맙의 치료 작용이 널리 확립되어 있기 때문에, 본 발명에 따라 숙주에서 유도된 로키베트맙-경쟁 자가항체가 유사한 치료 효능을 나타낼 것으로 예상될 수 있다.
실시예 16: 실시예 13의 백신 제제를 사용한 제2 면역화 연구
제2 면역화 연구에서, 소양증을 앓고 있는 개를 하기와 같이 실시예 13에 따른 백신 제제를 피하 주사하여 면역화시켰다:
제-7일: cIL-31 (기준선 평가를 위한 1.75μg/kg 체중 정맥내 주사)로의 챌린지
제0일: 실시예 13에 정의된 바와 같은 cIL-31 폴리단백질 백신으로의 1차 피하 면역화. 1차 면역화 전에, 면역전 혈액 샘플을 모든 시험된 개로부터 채취하였다.
제6일: 혈액 샘플의 수집
제14일: 혈액 샘플의 수집
제21일: 혈액 샘플의 수집 및 cIL-31 (1.75 μg/kg 정맥내 주사 cIL-31)로의 챌린지
제28일: cIL-31 폴리단백질 백신으로의 제1 피하 부스터 면역화 및 혈액 샘플의 수집
제35일: 혈액 샘플의 수집
제42일: cIL-31 (1.75 μg/kg 정맥내 주사 cIL-31)로의 챌린지 및 혈액 샘플의 수집
제49일: 혈액 샘플의 수집
제56일: 혈액 샘플의 수집
제63일: cIL-31 (0.85 μg/kg 정맥내 주사 cIL-31)로의 챌린지 및 혈액 샘플의 수집
제70일: 혈액 샘플의 수집
제77일: 혈액 샘플의 수집
제84일: cIL-31 폴리단백질 백신으로의 제2 피하 부스터 면역화 및 혈액 샘플의 수집
제91일: 혈액 샘플의 수집
제98일: cIL-31 (0.85 μg/kg 정맥내 주사 cIL-31)로의 챌린지 및 혈액 샘플의 수집
제105일: 혈액 샘플의 수집
제112일: 혈액 샘플의 수집
제119일: 혈액 샘플의 수집
제126일: 혈액 샘플의 수집
제28일 및 제84일에 부스터 면역화 동안, 시험된 개는 실시예 13에 따른 백신 제제를 다시 받았다.
혈청 샘플을 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용하여 실시예 14에 기재된 바와 같은 ELISA 검정으로 분석하였다. 1:20 내지 1:20480의 개 혈청의 연속 희석물을 사용하였다. 도 30a-b 내지 37a-b는 이들 ELISA의 결과를 도시하고, 면역화된 개가 항-cIL-31 항체를 상당한 양으로 생산하였다는 것을 보여준다. 제28일에서의 부스터 면역화는 시험된 개에서 항-cIL-31 항체 역가의 증가를 유도하였다. 높은 항-cIL-31 항체 역가는 제42일 이후에도 여전히 관찰되었다. 시험된 개에서 제2 부스터 면역화까지 항-cIL-31 항체 역가의 단지 부분 상실만이 발생하였다. 종합하면, 이들 결과는 시험된 개에서 cIL-31에 대한 자기-관용의 성공적인 파괴를 보여준다.
상기 기재된 면역화 계획에 적용된 개를 하기 면역화 계획의 상이한 시점에서 실시예 4에 기재된 바와 같은 임의의 소양성 행동의 존재에 대해 분석하였다: 면역화 연구의 시작 전 (제-7일), 제1 면역화 3주 후 (제21일), 제1 부스트 2주 후 (제42일), 제1 부스트 5주 후 (제63일) 및 제2 부스트 2주 후 (제98일). 3마리의 시험된 개로부터의 소양성 행동 분석의 예시적인 결과가 도 38에 도시된다. 도 38의 결과는 소양증 점수가 적용된 면역화 계획에 의해 감소될 수 있고, 따라서 본 발명에 따른 백신 조성물을 사용하는 성공적인 예방적/치료적 백신 치료에 대한 개념 증명을 제공할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 17: 본 발명에 따른 폴리단백질을 코딩하는 mRNA를 사용한 백신 제제
최근 수년간, mRNA 백신의 생산이 다소 간단하다는 사실로 인해 mRNA를 사용한 백신접종이 점점 더 주목받고 있다. 이러한 백신의 경우, 종종 백신 생산의 비용 및 속도의 관점에서 장애물인 단백질 항원의 발현 및 정제 단계가 더 이상 필요하지 않다 (문헌 [Zhang C, Maruggi G, Shan H, Li J. Advances in mRNA Vaccines for Infectious Diseases. Front Immunol. 2019 Mar 27;10:594. doi: 10.3389/fimmu.2019.00594. eCollection 2019.] 참조). mRNA 백신은 도입된 mRNA에 기초한 숙주 자신의 세포에 의한 항원 생산에 의존한다.
개의 그 자신의 IL-31에 대한 백신접종이 cIL-31의 적어도 2개의 절편을 포함하는 폴리단백질을 코딩하는 mRNA를 함유하는 백신으로 또한 달성될 수 있다는 것이 구상될 수 있다. 이는 하기와 같이 달성될 수 있다:
실시예 1에 기재된 cIL-31-폴리 구축물을 시험관내 전사 벡터 내로 전달한다. 이 목표를 위해, cIL-31-폴리를 코딩하는 삽입물을 제한 효소 EcoRI 및 HindIII를 사용하여 pcDNA3.4로부터 pcDNA3.1(+)로 클로닝한다. pcDNA3.1(+)은 EcoRI 클로닝 부위의 상류에 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 보유한다. 이 벡터로부터 캡핑된 런-오프 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하기 위해, pcDNA3.1(+)-cIL-31-폴리 벡터를 삽입물의 3'에 선형화한다. 이어서, 전사체 특성을 변형시키기 위해 캡 뉴클레오티드, 4개의 정규 dNTP 및/또는 비정규 dNTP의 존재 하에 T7-RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사를 수행한다. 후속 단계에서, 수득된 런-오프 전사체를 폴리-A 폴리머라제를 사용하여 폴리아데닐화한다. 대안적으로, cIL-31-폴리 구축물 내 정지 코돈의 3'에 폴리-dT 테일을 포함시키는 것이 또한 가능하다.
이어서, 캡핑되고 폴리아데닐화된 mRNA를 백신접종에 사용할 수 있다. 개에게, 예를 들어 네이키드 mRNA를 청구된 백신 조성물의 나머지 성분과 함께 근육내로, 피하로 또는 피내로 또는 유전자 총을 사용하여 주사함으로써, 1 μg 내지 1 mg, 보다 바람직하게는 10 μg 내지 300 μg의 양의 mRNA를 투여할 수 있다. 폴리단백질을 코딩하는 mRNA를 청구된 백신 조성물의 나머지 성분과 함께 리포솜 제제의 형태로, 양이온성 단백질, 양이온성 중합체 또는 양이온성 세포 관통 펩티드와의 복합체를 포함하는 제제의 형태로, 또는 도입된 mRNA의 반감기, 세포 흡수 및 번역가능성을 증진시키는 다른 형태로 주사하는 것이 또한 가능하다.
이어서, mRNA 주사를 2-6주 간격으로 반복한다. 항-cIL-31 항체의 존재를 실시예 14에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다.
일반적으로, 자기-복제 mRNA에 의해, 예를 들어 알파 바이러스 유래 자기-복제 mRNA에 의해 cIL-31-폴리 구축물을 코딩하는 것이 또한 가능하다. 자기-복제 mRNA의 사용은 숙주에게 투여 시 RNA 구축물로부터 보다 긴 단백질 생산이 달성되어 또한 보다 높은 항-cIL-31 항체 역가가 수득될 수 있다는 이점을 가질 수 있다.
동일한 방식으로 본 발명에 따른 cIL-13-cIL-4-폴리 및 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리 구축물에 대해 동일한 결과가 달성될 수 있다.
실시예 18: 폴리단백질을 코딩하는 DNA를 사용한 백신 제제
DNA 백신은 DNA, 통상적으로 플라스미드 DNA를 함유한다. 플라스미드 DNA는 종종 주사 또는 유전자 총을 통해 네이키드 형태로 숙주에게 투여된다. 그러나, 플라스미드 DNA를 숙주에게, 예를 들어 양이온성 지질을 갖는 리포플렉스로서, 리포솜 제제로서 또는 양이온성 중합체와의 복합체로서 전달하는 것이 또한 가능하다. 때때로 DNA는 또한 바이러스와 유사한 단백질 쉘 내에 캡슐화되며, 이는 세포에 의한 효율적인 흡수를 보장한다. (검토를 위해: 문헌 [Ghaffarifar F. Plasmid DNA vaccines: where are we now? Drugs Today (Barc). 2018 May;54(5):315-333. doi: 10.1358/dot.2018.54.5.2807864]).
개의 그 자신의 자기-단백질 중 하나, 예를 들어 시토카인, 특히 바람직하게는 IL-31로부터 유래된 인터류킨에 대한 백신접종이 cIL-31의 적어도 2개의 절편을 포함하는 폴리단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 백신으로 또한 달성될 수 있다는 것이 구상될 수 있다.
예로서, 개의 그 자신의 IL-31에 대한 백신접종이 cIL-31의 적어도 2개의 절편을 포함하는 폴리단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 백신으로 또한 달성될 수 있다는 것이 구상될 수 있다. 이는 하기와 같이 달성될 수 있다:
실시예 1a에 기재된 cIL-31-폴리 구축물을 포유동물 발현 벡터 내로 전달한다. 이 목표를 위해, cIL-31-폴리를 코딩하는 삽입물을 제한 효소 EcoRI 및 HindIII를 사용하여 pcDNA3.4로부터 pcDNA3.1(+)로 클로닝한다. pcDNA3.1(+)은 숙주 세포에서의 cIL-31-폴리의 발현에 필요한 모든 요소: 인간 시토메갈로바이러스 극초기 (CMV) 프로모터 형태의 강한 포유동물 프로모터 및 소 성장 호르몬 BGH 유전자 형태의 강한 폴리아데닐화/종결 신호를 보유한다.
개에게, 예를 들어 네이키드 플라스미드 DNA를 청구된 백신 조성물의 나머지 성분과 함께 근육내로, 피하로 또는 피내로 또는 유전자 총을 사용하여 주사함으로써, 10 μg 내지 3 mg, 보다 바람직하게는 50 μg 내지 1000 μg의 양의 고도로 정제된 pcDNA3.1(+)-cIL-31-폴리 (LPS-무함유)를 투여할 수 있다. 폴리단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA를 청구된 백신 조성물의 나머지 성분과 함께 리포솜 제제의 형태로, 양이온성 단백질, 양이온성 중합체 또는 양이온성 세포 관통 펩티드와의 복합체를 포함하는 제제의 형태로, 또는 도입된 mRNA의 반감기, 세포 흡수 및 번역가능성을 증진시키는 다른 형태로 주사하는 것이 또한 가능하다.
이어서, 플라스미드 DNA 주사를 2-6주 간격으로 반복한다. 항-cIL-31 항체의 존재를 실시예 14a에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다.
다른 시토카인, 특히 본원에 예시된 것 (예를 들어 IL-4, IL-5, IL-13, IL-33-CS 및 TNF-알파)에 대해, 특히 이들이 본 발명에 따른 폴리단백질 구축물에 포함되는 경우에 유사한 프로토콜이 고려된다. 이들 프로토콜은 본 발명에 따른 cIL-13-cIL-4-폴리 및 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리 구축물에 대해 구체적으로 고려된다.
실시예 19a: 특이적 토끼 항-cIL-13 혈청을 사용한 cIL-13 신호 전달의 중화 검정
HEK블루 IL4/IL13 (인비보젠, hek-il413)을 37℃, 5% CO2에서 DMEM (써모 피셔, 616965-026), 10% iFCS 중에서 성장시켰다. 선택 목적을 위해, 배양 배지를 10 μg/ml 블라스티시딘 (인비보젠, ant-bl-5b) 및 100 μg/ml 제오신 (인비보젠, ant-zn-5)으로 보충하였다.
토끼 항-cIL-13 혈청 (실시예 6a)의 희석을 10 ng/ml cIL-13으로 보충된 384 웰 세포 배양 플레이트 내 40 μl 완전 성장 배지 중에서 수행하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. HEK블루 IL4/IL13 세포를 수거하고, 완전 성장 배지 중 2.2x105개 세포/mL로 조정하고, 40 μl 세포 현탁액을 각각의 혈청 희석물에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% (v/v) CO2에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양 상청액 샘플을 사용하여, 이들을 384 웰 플레이트에 대해 AP 완충제 (50 mM NaHCO3/Na2CO3, 2 mM MgCl2, pH 9.6) 중 5 mM 파라-니트로페닐 포스페이트 (pNPP), 90 μl/웰에 첨가함으로써 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 활성을 측정하였다. ELISA 판독기에서 실온에서 405 nm에서의 광학 밀도 (OD)의 측정을, 선형 영역에서의 곡선 기울기 (= mOD405nm/분)를 결정함으로써 동역학적 모드 (mOD/분)로, 또는 고정된 시점에서의 광학 밀도를 결정함으로써 종점 모드 (OD)로 수행하였다.
HEK블루 IL4/IL13 세포에 대한 토끼 cIL-13 항혈청의 중화 효과의 ELISA 결과가 도 55에 도시된다. 토끼 cIL-13 항혈청은 이미 1:320의 희석물에서 시작하여, HEK블루 IL-4/IL-13 세포의 cIL-13 자극을 억제하였다. 완전한 억제는 1:20의 희석물에서 달성되었다. 이 실험은 cIL-13의 생물학적 효과의 항체 중화 검정을 확립하였다.
실시예 19b: 면역전 및 항-cIL-13 개 혈청을 사용한 cIL-13 신호 전달의 중화 검정
실시예 19a의 동일한 중화 검정을 실시예 14c의 cIL-13-폴리 백신접종 연구의 제0일 (면역전, SD-1) 및 제42일에 수집된 3마리의 개 (개 0521, 2579 및 6048)로부터의 혈청에 대해 수행하였다. ELISA 결과가 도 56a-c에 도시된다.
면역전 혈청 ("SD-1")의 희석물은 HEK블루 IL-4/IL-13 세포에서 cIL-13 신호 강도의 감소를 유도하지 않았지만, 모든 3마리의 개로부터의 제42일 cIL-13-폴리 항혈청은 각각 1:320, 1:20 및 1:40 희석물에서 신호의 완전한 억제 및 이들 희석물 후 억제의 적정 곡선을 유도하였다 (도 56a-c 참조).
실시예 19c: 면역전 및 항-cIL-4 개 혈청을 사용한 cIL-4 신호 전달의 중화 검정
IL-4는 mRNA 및 단백질 수준에서 흉선- 및 활성화-조절된 케모카인 (TARC 또는 CCL17)의 발현을 유도하는 것으로 공지되어 있고, 개에서 아토피성 피부염에서의 TARC의 상향조절이 문서화되었다. 따라서, TARC를 IL-4에 대한 개 혈액 노출의 양성 마커 (강한 mRNA 상향조절)로서 사용하였다.
하기와 같이 cIL-4-폴리 백신접종 후 중화 항체의 존재에 대해 프로빙하기 위해 TARC mRNA 상향조절의 억제를 평가하였다: EDTA-안정화된 혈액 샘플을 제49일 (부스터 면역화 2주 후)에 IL-4-폴리-면역화된 동물 (개 5365, 개 6523 및 개 7104)로부터 채취하고, 혈액 샘플을 대조군 동물로부터 풀링하였다. 500 μl의 혈액을 cIL-4 (알앤디 시스템즈, 754-CL-025/CF)로 1 ng/ml까지 보충한 다음, 혈액을 35℃, 5% CO2 및 96% 상대 습도에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 혈액 용해 및 RNA 안정화를 RNA보호 동물 혈액 튜브(RNAprotect Animal Blood Tube) 500μl (퀴아젠(Qiagen) 76554)로 수행하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
이어서, RN이지 보호 동물 혈액 키트(RNeasy Protect Animal Blood Kit) (퀴아젠 73224)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 단리된 RNA를 분석하고, 임플렌 나노포토미터(Implen NanoPhotometer)®, 유형 NP80을 사용하여 정량화하였다. 정량적 RT-PCR (qPCR)을, 개 CCL-17에 대한 프로브 및 프라이머 (TARC)를 사용한 택맨(TaqMan)® 검정 Cf02622128_m1 (써모) 및 제조업체에 의해 약술된 프라이머, 반응 혼합물 및 조건을 사용한 퀀티노바 프로브 RT-PCR 키트(QuantiNova Probe RT-PCR Kit) (퀴아젠 208354)로 수행하였다. 자체제작 개 β-액틴 택맨 프로브 및 PCR 프라이머를 하우스키핑 유전자 대조군으로서 사용하였다. 전형적으로 25 ng 총 RNA를 주형으로서 사용하였다. qPCR을 CFX96 실시간 시스템 (바이오라드(BioRad))을 사용하여 수행하였다.
실험의 결과가 도 73에 도시된다.
대조군 개의 풀링된 혈액은 TARC/CCL-17 mRNA 유도와 관련하여 1 ng/ml cIL-4와의 인큐베이션에 대해 고도로 반응성이었다 (도 73a에서의 ΔΔCq 참조). 대조적으로, cIL-4-폴리로 백신접종된 모든 3마리의 개는 cIL-4 인큐베이션에서 TARC/CCL-17 mRNA 유도가 강하게 억제되었고, 선형 스케일 그래프에서 모든 3마리의 개에 대해 분명히 완전 억제되었다 (도 73a). 로그 스케일 그래프에서, cIL-4-유도된 TARC mRNA 생산의 억제는 개 5365 및 7104에 대해 99.99% 및 개 6523에 대해 99%를 초과한다 (도 73b). cIL-4 자극의 부재 하에 TARC의 일부 미미한 배경 mRNA 발현이 모든 개에서 검출되었다 (도 73b, 조건 "w/o").
종합하면, 데이터는 cIL-4에 대한 자기 관용이 cIL-4-폴리 백신으로 면역화된 모든 3마리의 개에서 파괴되었고, 천연 cIL-4에 대한 항체 역가가 존재하였다는 것을 입증한다. 이들 항체는 cIL-4 작용에 대한 세포 배양 검정 시스템에서 중화 잠재력을 보유하고, 면역화된 개의 생체외 혈액 검정에 첨가된 cIL-4를 중화한다.
실시예 19d: 본 발명에 따른 면역전 및 항-cIL-13-cIL-4-폴리단백질 개 혈청을 사용한 cIL-4 및 cIL-13 신호 전달의 중화 검정
실시예 19c에서 cIL-4-폴리-백신접종된 개 및 cIL-4에 대해 기재된 바와 동일한 방식으로 cIL-13-cIL-4-폴리단백질 백신접종 후 cIL-4 (1 ng/mL) 또는 cIL-13 (1 ng/mL)에 대한 중화 항체의 존재에 대해 프로빙하기 위해 TARC mRNA 상향조절의 억제를 평가하였다.
실험의 결과가 도 83에 도시된다. 도 83a는 선형 스케일로 결과를 도시하고, 도 83b는 보다 양호한 가시화를 위해 로그 스케일로 동일한 결과를 도시한다. 도면은 TARC/CCL-17 mRNA 유도에 대한 ΔΔCq 값을 도시하며, 여기서 x-축은 샘플 (즉, 개의) 정체 (예를 들어 6504, 8322 또는 6043 또는 풀링된 나이브 혈액) 및 자극 단백질 ("+IL4"= cIL-4로 자극됨; "+IL13" = cIL-13으로 자극됨; "w/o" = 동일한 방식으로 인큐베이션 및 가공되었으나 cIL-4 또는 cIL-13을 받지 않은 혈액 샘플을 나타냄, 대조군 값)을 정의한다.
대조군 개의 풀링된 혈액은 TARC/CCL-17 mRNA 유도와 관련하여 cIL-4 또는 cIL-13과의 인큐베이션에 대해 고도로 반응성이었다 (도 83a에서의 ΔΔCq, "+IL4" 및 "+IL33" 참조). 대조적으로, cIL-13-cIL-4-폴리단백질로 백신접종된 모든 3마리의 개는 cIL-4 및 cIL-13 인큐베이션에서 TARC/CCL-17 mRNA 유도가 강하게 억제되었고, 선형 스케일 그래프에서 모든 3마리의 개에 대해 분명히 완전 억제되었다 (도 83a, 6504, 8322 및 6043, 조건 "+IL4" 및 "+IL13"). 로그 스케일 그래프 (도 83b)에서, cIL-4- 또는 cIL-13-유도된 TARC mRNA 생산의 억제는 개 8022 및 6043의 경우 둘 다의 시토카인에 대해 99.9%를 초과하고, 개 6504의 경우 cIL-4에 대해 99.9% 및 cIL-13에 대해 >99%를 초과한다. cIL-4 및 cIL-13의 부재 하에 TARC의 일부 미미한 배경 mRNA 발현이 모든 개에서 검출되었다 (도 83b, "w/o").
종합하면, 데이터는 백신 구축물 cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 사용하여, cIL-4 및 cIL-13 둘 다에 대한 자기 관용이 이 연구에서 면역화된 모든 3마리의 개에서 파괴되었고, 천연 cIL-4 및 천연 cIL-13에 대한 높은 항체 역가가 존재하였다는 것을 입증한다. 이들 개 자기-항체는 또한 cIL-4 및 cIL-13 작용 둘 다에 대한 개 단핵구 세포 배양 검정 시스템에서 중화 잠재력을 보유하는 것으로 관찰되었고 (데이터는 제시되지 않음), 여기서 면역화된 개의 혈액 샘플을 사용한 생체외 혈액 검정에서 첨가된 cIL-4 및 첨가된 cIL-13 둘 다의 중화를 매개하는 것으로 제시된다.
실시예 19e: 본 발명에 따른 면역전 및 항-cIL-31-cIL-13-cIL4-폴리단백질 개 혈청을 사용한 cIL-4 및 cIL-13 신호 전달의 중화 검정
실시예 19c에서 cIL-4-폴리-백신접종된 개 및 cIL-4에 대해 기재된 바와 동일한 방식으로 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질 백신접종 후 cIL-4 (1 ng/mL) 또는 cIL-13 (1 ng/mL)에 대한 중화 항체의 존재에 대해 프로빙하기 위해 TARC mRNA 상향조절의 억제를 평가하였다.
실험의 결과가 도 91에 도시된다. 도 91a는 선형 스케일로 결과를 도시하고, 도 91b는 보다 우수한 가시화를 위해 로그 (log10) 스케일로 동일한 결과를 도시한다. 도면은 TARC/CCL-17 mRNA 유도에 대한 ΔΔCq 값을 도시하며, 여기서 x-축은 샘플 (즉, 개의) 정체 (예를 들어 0720, 6731 또는 9214 또는 풀링된 나이브 혈액) 및 자극 단백질 ("+IL4"= cIL-4로 자극됨; "+IL13" = cIL-13으로 자극됨; "w/o" = 동일한 방식으로 인큐베이션 및 가공되었으나 cIL-4 또는 cIL-13을 받지 않은 혈액 샘플을 나타냄, 대조군 값)을 정의한다.
대조군 개의 풀링된 혈액은 TARC/CCL-17 mRNA 유도와 관련하여 cIL-4 또는 cIL-13과의 인큐베이션에 대해 고도로 반응성이었다. 대조적으로, cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리로 백신접종된 모든 3마리의 개는 cIL-4 및 cIL-13 인큐베이션에서 TARC/CCL-17 mRNA 유도가 강하게 억제되었고, 선형 스케일 그래프에서 모든 3마리의 개에 대해 분명히 완전 억제되었다 (도 91a). 로그 스케일 그래프에서, cIL-4- 또는 cIL-13-유도된 TARC mRNA 생산의 억제는 모든 개의 경우 두 시토카인에 대해 99%를 초과한다 (도 91b). cIL-4 및 cIL-13의 부재 하에 TARC의 일부 미미한 배경 mRNA 발현이 모든 개에서 검출되었다 (도 91b, 샘플 "w/o").
종합하면, 데이터는 백신 구축물 cIl-31-cIL-14-cIL-4-폴리를 사용하여, 개 IL-31, 개 IL-4 및 개 IL-13에 대한 자기 관용이 이 연구에서 면역화된 모든 3마리의 개에서 파괴되었고, 천연 cIL-31, 천연 cIL-4 및 천연 cIL-13에 대한 높은 항체 역가가 존재하였다는 것을 입증한다. 이들 개 자기-항체는 cIL-4 및 cIL-13 작용 둘 다에 대한 개 단핵구 세포 배양 검정 시스템에서 중화 잠재력을 보유하고 (데이터는 제시되지 않음), 또한 면역화된 개의 혈액 샘플을 사용한 생체외 혈액 검정에서 첨가된 cIL-4 및 첨가된 cIL-13 둘 다의 중화를 매개한다.
도면의 간단한설명
도 1은 본 발명에 따른 폴리단백질의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 ER-유입하여 HEK 293 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 인공 신호 서열로 시작한다. 이에 이어서 성숙 개 IL-31 (서열식별번호: 3)의 제1 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-31의 제1 카피 뒤에, 파상풍 독소 p2 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 1273-1284, 서열식별번호: 1)가 포함되고, 이어서 성숙 개 IL-31의 제2 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-31의 제2 카피 뒤에, 파상풍 독소 p30 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 947-968, 서열식별번호: 2)가 부착되고, 이어서 성숙 개 IL-31의 제3 카피가 존재한다. 그 뒤에, 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프 (p30 및 p2)가 포함된다. 이들 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 이어서 단백질 정제를 위한 His-태그가 존재한다.
도 2는 도 1에 따른 cIL-31 폴리단백질을 코딩하는 벡터 pcDNA3.4-cIL31-폴리의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 3은 cIL-31-폴리의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 2에 추가로 설명된다. 레인 M1은 단백질 마커 (TaKaRa, 카탈로그 번호 3452)를 도시한다. 레인 1은 환원 조건 하의 cIL-31 폴리단백질의 크기를 도시하고, 레인 2는 비-환원 조건 하의 것을 도시한다.
도 4는 cIL-31의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 3에 추가로 설명된다. 레인 M1은 단백질 마커 (TaKaRa, 카탈로그 번호 3452)를 도시한다. 레인 1은 환원 조건 하의 cIL-31 단백질의 크기를 도시하고, 레인 2는 비-환원 조건 하의 것을 도시한다.
도 5는 토끼 면역전 혈청 및 cIL-31에 대해 생성된 항혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 8에 추가로 설명된다.
도 6은 cIL-31에 대해 생성된 닭 난황 제제에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 또는 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 8에 추가로 설명된다.
도 7은 로키베트맙에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시하며, 이는 실시예 9에 추가로 설명된다.
도 8은 로키베트맙에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 및 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 9에 추가로 설명된다.
도 9는 비오티닐화된 로키베트맙에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 10에 추가로 설명된다.
도 10은 cIL-31 중화 항체로서의 비오티닐화된 로키베트맙과 ELISA 플레이트 상에 고정화된 cIL-31 사이의 상호작용을 프로빙하기 위해 토끼 면역전 혈청 + 비오티닐화된 로키베트맙의 혼합물 또는 토끼 면역 혈청 + 비오티닐화된 로키베트맙의 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 11에 추가로 설명된다.
도 11은 cIL-31 중화 항체로서의 비오티닐화된 로키베트맙과 ELISA 플레이트 상에 고정화된 cIL-31 폴리단백질 사이의 상호작용을 프로빙하기 위해 토끼 면역전 혈청 + 비오티닐화된 로키베트맙의 혼합물 또는 토끼 면역 혈청 + 비오티닐화된 로키베트맙의 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 11에 추가로 설명된다.
도 12는 cIL-31 중화 항체로서의 로키베트맙과 ELISA 플레이트 상에 고정화된 cIL-31 사이의 상호작용을 프로빙하기 위해 닭 난황 IgY 제제 + 비오티닐화된 로키베트맙의 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 11에 추가로 설명된다.
도 13은 구축물 pcDNA3.1(+)-bsd-NFkB-SEAP의 플라스미드 맵을 도시하며, 여기서
- 181 bp-448 bp는 5개의 NFkB 결합 부위에 이어서 최소 ELAM 프로모터 (NFkB-5-ELAM)를 코딩하고,
- 454 bp-2022 bp는 NFkB 리포터 유전자로서의 SEAP 유전자를 코딩하고,
- 3214 bp-3613 bp는 진핵 세포 선택을 가능하게 하는 블라스티시딘 저항성 유전자 (bsd-R)를 코딩하고,
- 5961 bp-5100 bp는 이. 콜라이 선택을 가능하게 하는 암피실린 저항성 유전자 (amp-R)를 코딩한다.
도 14는 클론 세포주 DH82-bsd-NFSEAP를 PTO-ODN으로 처리 시 NFkB 신호 활성화의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 12에 추가로 기재된다.
도 15a-c는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 4315의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 14에 추가로 설명된다.
도 16a-c는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 6962의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 14에 추가로 설명된다.
도 17a-c는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 8523의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 14에 추가로 설명된다.
도 18은 개 4315의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 "mOD405/분" 및 그에 따라 리포터 반응으로부터의 직접적 판독치로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 19는 개 4315의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 제0일의 면역전 혈청에 대한 "mOD405/분"의 최고 판독치에 기초하여 계산된 "% 로키베트맙 결합"으로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 20은 개 6962의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 "mOD405/분" 및 그에 따라 리포터 반응으로부터의 직접적 판독치로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 21은 개 6962의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 제0일의 면역전 혈청에 대한 "mOD405/분"의 최고 판독치에 기초하여 계산된 "% 로키베트맙 결합"으로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 22는 개 8523의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 "mOD405/분" 및 그에 따라 리포터 반응으로부터의 직접적 판독치로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 23은 개 8523의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 제0일의 면역전 혈청에 대한 "mOD405/분"의 최고 판독치에 기초하여 계산된 "% 로키베트맙 결합"으로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 24는 개 4315의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 "mOD405/분" 및 그에 따라 리포터 반응으로부터의 직접적 판독치로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 25는 개 4315의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 제0일의 면역전 혈청에 대한 "mOD405/분"의 최고 판독치에 기초하여 계산된 "% 로키베트맙 결합"으로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 26은 개 6962의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 "mOD405/분" 및 그에 따라 리포터 반응으로부터의 직접적 판독치로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 27은 개 6962의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 제0일의 면역전 혈청에 대한 "mOD405/분"의 최고 판독치에 기초하여 계산된 "% 로키베트맙 결합"으로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 28은 개 8523의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 "mOD405/분" 및 그에 따라 리포터 반응으로부터의 직접적 판독치로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 29는 개 8523의 면역화 후 제42일로부터의 혈청 및 100 ng/ml 비오티닐화된 로키베트맙을 포함하는 혼합물에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 반응의 단위는 제0일의 면역전 혈청에 대한 "mOD405/분"의 최고 판독치에 기초하여 계산된 "% 로키베트맙 결합"으로서 표시된다. 이들 결과는 실시예 15에 추가로 설명된다.
도 30a-b는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 1672의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 31a-b는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 5096의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 32a-b는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 5583의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 33a-b는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 7918의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 34a-b는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 9351의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 35a-b는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 8779의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 36a-b는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 1368의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 37a-b는 상이한 샘플링 시점에서의 동물 3432의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 38은 실시예 16에 기재된 면역화 계획에 적용된 3마리의 시험된 개의 소양성 행동 분석의 예시적인 결과를 도시한다. 결과는 실시예 16에 추가로 설명된다.
도 39는 본 발명에 따른 폴리단백질의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 ER-유입하여 HEK 293 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 인공 신호 서열로 시작한다. 이에 이어서 성숙 개 IL-5 (서열식별번호: 41)의 제1 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-5의 제1 카피 뒤에, 파상풍 독소 p2 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 1273-1284, 서열식별번호: 1)가 포함되고, 이어서 성숙 개 IL-5의 제2 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-5의 제2 카피 뒤에, 파상풍 독소 p30 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 947-968, 서열식별번호: 2)가 부착되고, 이어서 성숙 개 IL-5의 제3 카피가 존재한다. 그 뒤에, 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프 (p30 및 p2)가 포함된다. 이들 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 이어서 단백질 정제를 위한 His6-태그가 존재한다.
도 40은 도 39에 따른 cIL-5 폴리단백질을 코딩하는 벡터 pcDNA3.4-cIL-5-폴리의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 41은 cIL-5-폴리의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 2b에 추가로 설명된다. 레인 "M2"는 단백질 마커 (젠스크립트, 카탈로그 번호 M00521)를 도시한다. 레인 "R"은 환원 조건 하의 cIL-5 폴리단백질의 크기를 도시하고, 레인 "NR"은 비-환원 조건 하의 것을 도시한다. 레인 "P"는 양성 대조군으로서의 다중-태그 단백질 (젠스크립트, 카탈로그 번호 M0101)을 도시한다. 1차 항체는 마우스-항-His6 mAb (젠스크립트, 카탈로그 번호 A00186)였다.
도 42는 cIL-5 단백질을 코딩하는 벡터 pcDNA3.4-cIL-5의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 43은 cIL-5의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 3b에 추가로 설명된다. 레인 M1은 단백질 마커 (TaKaRa, 카탈로그 번호 3452)를 도시한다. 레인 1은 환원 조건 하의 cIL-5 단백질의 크기를 도시하고, 레인 2는 비-환원 조건 하의 것을 도시한다.
도 44는 토끼 면역전 혈청 및 cIL-5에 대해 생성된 항혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-5를 사용한 ELISA의 역가 결정 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 8b에 추가로 설명된다.
도 45는 토끼 면역전 혈청 및 cIL-5에 대해 생성된 항혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-5 또는 cIL-5 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 8b에 추가로 설명된다.
도 46a-f는 도 46a 및 46b의 동물 "개 1", 도 46c 및 46d의 동물 "개 2" 및 도 46e 및 46f의 동물 "개 3"의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-5를 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 14b에 추가로 설명된다.
도 47은 본 발명에 따른 폴리단백질의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 ER-유입하여 HEK 293 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 인공 신호 서열로 시작한다. 이에 이어서 성숙 개 IL-13 (서열식별번호: 46)의 제1 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-13의 제1 카피 뒤에, 파상풍 독소 p2 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 1273-1284, 서열식별번호: 1)가 포함되고, 이어서 성숙 개 IL-13의 제2 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-13의 제2 카피 뒤에, 파상풍 독소 p30 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 947-968, 서열식별번호: 2)가 부착되고, 이어서 성숙 개 IL-13의 제3 카피가 존재한다. 그 뒤에, 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프 (p30 및 p2)가 포함된다. 이들 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 이어서 단백질 정제를 위한 His6-태그가 존재한다.
도 48은 cIL-13 단백질을 코딩하는 벡터 pcDNA3.4-cIL-13의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 49는 cIL-13-폴리의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 2b에 추가로 설명된다. 레인 M1은 단백질 마커 (TaKaRa, 카탈로그 번호 3452)를 도시한다. 레인 1은 환원 조건 하의 cIL-13 폴리단백질의 크기를 도시하고, 레인 2는 비-환원 조건 하의 것을 도시한다.
도 50은 cIL-13 단백질을 코딩하는 벡터 pET30a-cIL-13의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 51은 cIL-13의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 3c에 추가로 설명된다. 레인 M1은 단백질 마커 (TaKaRa, 카탈로그 번호 3452)를 도시한다. 레인 1은 소 혈청 알부민 (BSA, 2 μg)의 크기를 도시한다. 레인 2는 cIL-13 단백질의 크기 (1.86 μg)를 도시한다.
도 52는 SEAP 리포터 유전자 판독치에 기초한, cIL-13에 의한 HEK블루 IL-4/IL-13 세포 자극의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 12b에 추가로 기재된다.
도 53은 토끼 면역전 혈청 (빈 기호) 및 cIL-13에 대해 생성된 항혈청 (채워진 기호)에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-13 단백질 (a) 또는 cIL-13 폴리단백질 (b)을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 8c에 추가로 설명된다.
도 54a-c는 동물 "개 0521" (a), 동물 "개 2579" (b) 및 동물 "개 6048" (c)의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-13을 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 14c에 추가로 설명된다.
도 55는 토끼 항-cIL-13 혈청으로 처리된 HEK블루 IL-4/IL-13 세포의 cIL-13 자극 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 19a에 추가로 기재된다.
도 56 a-c는 cIL-13-폴리를 사용한 면역화 후 제0일 (면역전, 빈 기호, "SD-1") 또는 제42일 (채워진 기호, "SD42")에서의 개 0521 (a), 개 3579 (b) 및 개 6048 (c)로부터 수집된 개 혈청으로 처리된 HEK블루 IL-4/IL-13 세포의 cIL-13 자극 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 19b에 추가로 기재된다.
도 57은 cIL-33-WT 단백질을 코딩하는 벡터 pET30a(+)-canIL33-WT의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 58은 cIL-33-WT의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 3d에 추가로 설명된다. 레인 M1은 단백질 마커 (TaKaRa, 카탈로그 번호 3452)를 도시한다. 레인 1은 소 혈청 알부민 (BSA)의 크기를 도시한다. 레인 2는 환원 조건 하의 cIL-33-WT 단백질의 크기를 도시한다.
도 59는 토끼 면역전 혈청 (빈 기호) 및 cIL-33-WT에 대해 생성된 항혈청 (채워진 기호)에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-33-WT 단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 8d에 추가로 설명된다.
도 60은 cIL-33-CS 단백질을 코딩하는 벡터 pET30a-canIL33-CS의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 61은 cIL-33-CS의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 3e에 추가로 설명된다. 레인 M1은 단백질 마커 (TaKaRa, 카탈로그 번호 3452)를 도시한다. 레인 1은 소 혈청 알부민 (BSA)의 크기를 도시한다. 레인 2는 환원 조건 하의 cIL-33-CS 단백질의 크기를 도시한다.
도 62는 SEAP 리포터 유전자 판독치에 기초한, 상이한 형태의 cIL-33에 의한 HEK블루 IL-4/IL-13 세포 자극의 결과를 도시한다. 사용된 상이한 형태는 IL-33-WT-노보프로 (https://novoprolabs.com/p/human-il33-c9orf26-il1f11-nfhev-519146.html; 빈 원형), cIL-33-WT 배치1 (채워진 삼각형), cIL-33-WT 배치2 (채워진 정사각형) 및 cIL-33-CS (채워진 원형)이다. 이들 결과는 실시예 12c에 추가로 기재된다.
도 63은 본 발명에 따른 폴리단백질의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 ER-유입하여 HEK 293 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 인공 신호 서열로 시작한다. 이에 이어서 성숙 개 IL-33 (cIL-33-CS를 의미함; 서열식별번호: 51)의 제1 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-33-CS의 제1 카피 뒤에, 파상풍 독소 p2 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 1273-1284, 서열식별번호: 1)가 포함되고, 이어서 성숙 개 IL-33-CS의 제2 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-33-CS의 제2 카피 뒤에, 파상풍 독소 p30 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 947-968, 서열식별번호: 2)가 부착되고, 이어서 성숙 개 IL-33-CS의 제3 카피가 존재한다. 그 뒤에, 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프 (p30 및 p2)가 포함된다. 이들 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 이어서 단백질 정제를 위한 His6-태그가 존재한다.
도 64는 cIL-33-CS 단백질을 코딩하는 벡터 pET30a-cIL33-폴리의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 65는 cIL-33-CS-폴리 (본원에서 cIL-33-폴리로도 또한 지칭됨)의 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석의 결과를 도시하며, 이는 실시예 2d에 추가로 설명된다. 레인 M1은 단백질 마커 (TaKaRa, 카탈로그 번호 3452)를 도시한다. 레인 1은 환원 조건 하의 cIL-33-CS 폴리단백질의 크기를 도시하고, 레인 2는 비-환원 조건 하의 것을 도시한다.
도 66은 토끼 면역전 혈청 (빈 기호) 및 cIL-33-WT에 대해 생성된 항혈청 (채워진 기호)에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-33-CS 폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 8d에 추가로 설명된다.
도 67은 cIL-33-CS 폴리단백질을 사용하여 면역화된 동물 "개 402"의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-33-WT를 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. 시점은 면역전 혈청 (빈 원형), 면역화 후 제28일 (빈 정사각형), 면역화 후 제35일 (채워진 원형), 면역화 후 제42일 (채워진 정사각형); 면역화 후 제49일 (채워진 삼각형); 면역화 후 제56일 (채워진 마름모형); 면역화 후 제63일 (빈 삼각형)이다. 이들 결과는 실시예 14d에 추가로 설명된다.
도 68은 본 발명에 따른 폴리단백질 (서열식별번호: 57)의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 ER-유입하여 HEK 293 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 인공 신호 서열로 시작한다. 이에 이어서 성숙 개 IL-4 (서열식별번호: 56)의 제1 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-4의 제1 카피 뒤에, 파상풍 독소 p2 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 1273-1284, 서열식별번호: 1)가 포함되고, 이어서 성숙 개 IL-4의 제2 카피가 존재한다. 이러한 성숙 개 IL-4의 제2 카피 뒤에, 파상풍 독소 p30 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 947-968, 서열식별번호: 2)가 부착되고, 이어서 성숙 개 IL-4의 제3 카피가 존재한다. 그 뒤에, 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프 (p30 및 p2)가 포함된다. 이들 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 이어서 단백질 정제를 위한 His6-태그가 존재한다.
도 69는 cIL-4 단백질을 코딩하는 벡터 pcDNA3.4-cIL-4의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 70은 cIL-4 단백질을 코딩하는 벡터 pET30a-cIL-4의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 71은 토끼 면역전 혈청 (원형) 및 cIL-4에 대해 생성된 항혈청 (삼각형)에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-4 단백질 (a) 또는 cIL-4 폴리단백질 (b)을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. cIL-13에 대해 생성된 토끼 항혈청 (정사각형)에 대한 코팅 항원으로서의 cIL-4-폴리단백질을 사용한 결과가 또한 제시된다. 이들 결과는 실시예 8e에 추가로 설명된다.
도 72a-c는 동물 "개 5365" (a), 동물 "개 6523" (b) 및 동물 "개 7104" (c)의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-4를 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과는 실시예 14e에 추가로 설명된다.
도 73은 제49일에서의 3마리의 IL-4-폴리-면역화된 개 (개 5365, 개 6523 및 개 7104)로부터 채취한 EDTA-안정화된 혈액 또는 백신 노출이 없는 대조군 개로부터 풀링된 혈액 샘플 ("풀링된 나이브 혈액")의 cIL-4 자극 ("+IL4") 후 TARC mRNA 발현에 대한 qPCR 결과를 도시한다. ΔΔCq 값은 낮은 값의 보다 우수한 가시화를 위해 선형 (a) 또는 log10 스케일 (b)로 주어진다. "w/o"는 동일한 방식으로 인큐베이션 및 가공되었으나 cIL-4를 받지 않은 혈액 샘플을 나타낸다. 결과는 실시예 19c에 추가로 기재된다.
도 74는 본 발명에 따른 폴리단백질의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 ER-유입하여 HEK 293 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 인공 신호 서열로 시작한다. 이에 이어서 성숙 고양이 IL-31 (fel-IL-31을 의미함; 서열식별번호: 61)의 제1 카피가 존재한다. 이러한 성숙 고양이 IL-31 (서열식별번호: 60)의 제1 카피 뒤에, 파상풍 독소 p2 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 1273-1284, 서열식별번호: 1)가 포함되고, 이어서 성숙 고양이 IL-31의 제2 카피가 존재한다. 이러한 성숙 고양이 IL-31의 제2 카피 뒤에, 파상풍 독소 p30 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 947-968, 서열식별번호: 2)가 부착되고, 이어서 성숙 고양이 IL-31의 제3 카피가 존재한다. 그 뒤에, 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프 (p30 및 p2)가 포함된다. 이들 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프에 이어서 단백질 정제를 위한 His6-태그가 존재한다.
도 75a-c는 fel-IL-31 폴리단백질을 사용하여 면역화된 동물 "고양이 3132", "고양이 0487" 및 "고양이 5674"의 고양이 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 fel-IL-31을 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. 시점은 제2일 혈청 (빈 원형), 면역화 후 제7일 (빈 마름모형), 면역화 후 제14일 (빈 삼각형), 면역화 후 제21일 ("x"), 면역화 후 제27일 (별형), 면역화 후 제35일 (채워진 원형); 면역화 후 제42일 (채워진 마름모형), 면역화 후 제49일 (채워진 삼각형), 면역화 후 제56일 (볼드 "x") 및 면역화 후 제63일 (채워진 정사각형)이다. 이들 결과는 실시예 14f에 추가로 설명된다.
도 76a-c는 fel-IL-31 폴리단백질을 사용하여 면역화된 동물 "고양이 3132", "고양이 0487" 및 "고양이 5674"의 고양이 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 fel-IL-31을 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. 시점은 혈청 면역화 후 제63일, 제70일, 제77일, 제84일, 제91일, 제98일, 제105일, 제112일, 제119일 및 제126일이다 (기호에 대한 범례 참조). 이들 결과는 실시예 14f에 추가로 설명된다.
도 77은 본 발명에 따른 폴리단백질 이중 구축물 cIL-13-cIL-4-폴리의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 ER-유입하여 HEK 293 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 인공 신호 서열로 시작한다. 이에 이어서 성숙 cIL13의 제1 카피, 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2, 성숙 cIL-4의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30, 성숙 cIL13의 제2 카피, 성숙 cIL-4의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30의 2개의 카피 및 1종의 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2가 존재한다. cIL13의 제2 카피 및 성숙 cIL-4의 제2 카피는 융합되고, 단지 테트라글리신 스페이서에 의해서만 분리되었다. 모든 다른 개별 요소는 G/S/A-함유 테트라펩티드 가교에 의해 분리되었다. C-말단에 간단한 정제를 위한 태그 (His6)가 첨가되었다.
도 78은 cIL-13-cIL-4 폴리단백질을 코딩하는 벡터 pcDNA3.4-cIL-13-cIL-4-폴리의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 79는 토끼 면역전 혈청 (원형) 및 cIL-4에 대해 생성된 항혈청 (삼각형) 또는 cIL-13에 대해 생성된 항혈청 (정사각형)에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-4-IL-13-폴리단백질을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과가 실시예 8f에 추가로 설명된다.
도 80은 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 (a) cIL-4, (b) cIL-13 또는 (c) cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 사용한 토끼 항-cIL-13-cIL-4-폴리단백질 항혈청 (삼각형)의 사용을 그의 상응하는 면역전 혈청 (원형)과 비교하여 제시한 ELISA의 결과를 도시한다. 결과가 실시예 8g에 추가로 설명된다.
도 81은 연구 제1일 및 제35일에 cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 사용하여 면역화된 동물 (a) "개 8322," (b) "개 6504" 및 (c) "개 6403"의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL4를 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. "SD"는 샘플이 수집된 연구 일을 나타내며, 여기서 SD-1은 면역전 혈청이다. 이들 결과가 실시예 14g에 추가로 설명된다.
도 82는 연구 제1일 및 제35일에 cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 사용하여 면역화된 동물 (a) "개 8322," (b) "개 6504" 및 (c) "개 6403"의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL13을 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. "SD"는 샘플이 수집된 연구 일을 나타내며, 여기서 SD-1은 면역전 혈청이다. 이들 결과가 실시예 14h에 추가로 설명된다.
도 83은 제49일에서의 3마리의 cIL-13-cIL-4-폴리-면역화된 개 (개 6504, 개 8322 및 개 6403)로부터 채취한 EDTA-안정화된 혈액 또는 백신 노출이 없는 대조군 개로부터 풀링된 혈액 샘플 ("풀링된 나이브 혈액")의 cIL-4 자극 ("+IL4") 또는 cIL-13 자극 ("+IL13") 후 TARC mRNA 발현에 대한 qPCR 결과를 도시한다. ΔΔCq 값은 낮은 값의 보다 우수한 가시화를 위해 선형 (a) 또는 log10 스케일 (b)로 주어진다. "w/o"는 동일한 방식으로 인큐베이션 및 가공되었으나 cIL-4 또는 cIL-13을 받지 않은 혈액 샘플을 나타낸다. 결과가 실시예 19d에 추가로 기재된다.
도 84는 본 발명에 따른 폴리단백질 삼중 구축물 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 ER-유입하여 HEK 293 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 인공 신호 서열로 시작한다. 이에 이어서 성숙 cIL-31의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30, 이어서 성숙 cIL13의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2, 이어서 성숙 cIL-4의 제1 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30, 이어서 성숙 cIL-31의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2, 이어서 성숙 cIL13의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30, 이어서 성숙 cIL-4의 제2 카피, 이어서 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p30 및 파상풍 독소 T 세포 에피토프 p2가 존재한다. 모든 개별 요소는 G/S/A-함유 테트라펩티드 가교에 의해 분리된다. C-말단에 간단한 정제를 위한 태그 (His6)가 첨가된다.
도 85는 cIL-31-cIL-13-cIL4 폴리단백질을 코딩하는 벡터 pcDNA3.4-cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리 (도면에서 잘못 라벨링됨)의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 86은 토끼 면역전 혈청 (빈 원형) 및 cIL-4에 대해 생성된 항혈청 (채워진 원형), cIL-13에 대해 생성된 항혈청 (삼각형) 또는 cIL-31에 대해 생성된 항혈청 (정사각형)에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31-cIL-13-IL-4-폴리단백질 (도면 텍스트에서 잘못 라벨링됨)을 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 이들 결과가 실시예 8h에 추가로 설명된다.
도 87은 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-4 (큰 원형), cIL-13 (큰 정사각형), cIL-31 (마름모형) 또는 cIL-31-cIL-13-cIL-4 폴리단백질 (큰 삼각형)을 사용한 토끼 항-cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질 항혈청의 사용을, 동일한 코팅 항원 (모두 작은 원형)을 사용한 그의 상응하는 면역전 혈청과 비교하여 제시한 ELISA의 결과를 도시한다. 결과가 실시예 8h에 추가로 설명된다.
도 88은 연구 제1일 및 제28일에 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 사용하여 면역화된 동물 (a) "개 0720," (b) "개 6731" 및 (c) "개 9214"의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-31을 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. "SD"는 샘플이 수집된 연구 일을 나타내며, 여기서 SD-1은 면역전 혈청이다. 이들 결과가 실시예 14i에 추가로 설명된다.
도 89는 연구 제1일 및 제28일에 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 사용하여 면역화된 동물 (a) "개 0720," (b) "개 6731" 및 (c) "개 9214"의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-4를 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. "SD"는 샘플이 수집된 연구 일을 나타내며, 여기서 SD-1은 면역전 혈청이다. 이들 결과가 실시예 14i에 추가로 설명된다.
도 90은 연구 제1일 및 제28일에 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리단백질을 사용하여 면역화된 동물 (a) "개 0720," (b) "개 6731" 및 (c) "개 9214"의 개 혈청에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 cIL-13을 사용한 상이한 샘플링 시점에서의 ELISA의 결과를 도시한다. "SD"는 샘플이 수집된 연구 일을 나타내며, 여기서 SD-1은 면역전 혈청이다. 이들 결과가 실시예 14i에 추가로 설명된다.
도 91은 제49일에서의 3마리의 cIL-31-cIL-13-cIL-4-폴리-면역화된 개 (개 0720, 개 6731 및 개 9214)로부터 채취한 EDTA-안정화된 혈액 또는 백신 노출이 없는 대조군 개로부터 풀링된 혈액 샘플 ("풀링된 나이브 혈액")의 cIL-4 자극 ("+IL4") 또는 cIL-13 자극 ("+IL13") 후 TARC mRNA 발현에 대한 qPCR 결과를 도시한다. ΔΔCq 값은 낮은 값의 보다 우수한 가시화를 위해 선형 (a) 또는 log10 스케일 (b)로 주어진다. "w/o"는 동일한 방식으로 인큐베이션 및 가공되었으나 cIL-4 또는 cIL-13을 받지 않은 혈액 샘플을 나타낸다. 결과가 실시예 19e에 추가로 기재된다.
도 92는 본 발명에 따른 폴리단백질의 한 실시양태를 도시한다. 폴리단백질의 N-말단은 이. 콜라이 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위한 개시 메티오닌 및 His6 태그로 시작한다. 이에 이어서 성숙 소 TNF-알파 (서열식별번호: 64를 의미함)의 제1 카피가 존재한다. 이러한 성숙 소 TNF-알파의 제1 카피 뒤에, 파상풍 독소 p30 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 947-968, 서열식별번호: 2)가 포함되고, 이어서 성숙 소 TNF-알파의 제2 카피가 존재한다. 이러한 성숙 소 TNF-알파의 제2 카피 뒤에, 파상풍 독소 p2 T-세포 에피토프 (파상풍 독소의 아미노산 1273-1284, 서열식별번호: 1)가 부착되고, 이어서 성숙 소 TNF-알파의 제3 카피가 존재한다. 그 뒤에, 2종의 파상풍 독소 T-세포 에피토프 (p30 및 p2)가 포함된다.
도 93은 토끼 면역전 혈청 ("x") 및 소-TNF-알파-폴리단백질에 대해 생성된 항혈청 (원형)에 대한 ELISA 플레이트 코팅 항원으로서의 소-TNF-알파를 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 결과가 실시예 8i에 추가로 설명된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Bayer Animal Health GmbH
<120> Vaccine composition for breaking self-tolerance
<130> 220057WO
<150> 21154244.4
<151> 2021-01-29
<160> 205
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Bacteria <prokaryote>
<220>
<223> SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the Tetanus Toxin
T-cell epitope p2
<400> 1
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Bacteria <prokaryote>
<220>
<223> SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the Tetanus Toxin
T-cell epitope p30
<400> 2
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu
20
<210> 3
<211> 136
<212> PRT
<213> Canis
<220>
<223> SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of canine IL-31
<400> 3
Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys
1 5 10 15
Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr
20 25 30
Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu
35 40 45
Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile
50 55 60
Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile
65 70 75 80
Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro
85 90 95
Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe
100 105 110
Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe
115 120 125
Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln
130 135
<210> 4
<211> 507
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 4 is one version of the amino acid sequence of the
cIL-31 polyprotein used for the vaccine composition of Example 13
<400> 4
Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys
20 25 30
Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr
35 40 45
Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr
50 55 60
Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile
65 70 75 80
Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu
85 90 95
Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr
100 105 110
Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu
115 120 125
Asn Ser Gly Pro Gln Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser
130 135 140
Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gly Ser His Met Ala
145 150 155 160
Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu
165 170 175
Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu
180 185 190
Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser
195 200 205
Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe
210 215 220
Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile
225 230 235 240
Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile
245 250 255
Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile
260 265 270
Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn
275 280 285
Ser Gly Pro Gln Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe
290 295 300
Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Gly
305 310 315 320
Ser Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg
325 330 335
Lys Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp
340 345 350
Tyr Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu
355 360 365
Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala
370 375 380
Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile
385 390 395 400
Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu
405 410 415
Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser
420 425 430
Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val
435 440 445
Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn
450 455 460
Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
465 470 475 480
Leu Glu Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile
485 490 495
Gly Ile Thr Glu Leu His His His His His His
500 505
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 5 is the nucleic acid sequence of the
immunostimulatory oligonucleotide 1668-PTO
<400> 5
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 6 is the nucleic acid sequence of the
immunostimulatory oligonucleotide 2006-PTO
<400> 6
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 7
<211> 7637
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 7 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-cIL31-poly encoding the cIL-31 plyprotein construct of
Example 1
<400> 7
gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta 60
ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 120
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 180
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 240
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 300
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 360
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 420
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 480
cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 540
caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 600
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg 660
agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgg 720
actctagagg atcgaaccct tgaattcccg ccgccaccat gctgtctcac acaggccctt 780
ctagattcgc cctgttcctg ctgtgcagca tggaaaccct gctgagcagc cacatggccc 840
ctacacatca gctgcctcca tccgacgtgc ggaagatcat cctggaactg cagcctctga 900
gcagaggcct gctggaagat taccagaaaa aagaaaccgg cgtgcccgag agcaacagga 960
ccctgctgct gtgtctgacc agcgatagcc agcctcctag actgaacagc agcgccatcc 1020
tgccttactt cagagccatc agacccctga gcgacaagaa catcatcgac aagatcatcg 1080
agcagctgga caagctgaag ttccagcacg agcccgagac agagattagc gtgcccgccg 1140
ataccttcga gtgcaagagc ttcatcctga ccatcctgca gcagttcagc gcctgcctgg 1200
aaagcgtgtt caagagcctg aacagcggcc ctcaaggatc tggcggccag tacatcaagg 1260
ccaacagcaa gttcatcggc atcaccgagc tggccggctc tggatctcat atggctccaa 1320
ctcaccagct gccacctagt gatgtgcgca agattattct cgagctgcag cccctgtcta 1380
ggggcctgct tgaggactat caaaagaaag agacaggcgt ccccgagtcc aatcgcacac 1440
tgctgctttg cctgacatcc gacagccagc cacctcggct gaatagctct gccattctgc 1500
cctactttcg ggccattagg cccctgtccg ataagaatat cattgataag attattgaac 1560
agctcgataa gctcaaattt cagcacgaac cggaaaccga gatctccgtg cctgccgaca 1620
catttgaatg caagtctttt atcctcacga ttctccagca gttttccgcc tgtctggaat 1680
ccgtgtttaa gtccctgaat agcggacccc aggccggcag cggcttcaac aatttcaccg 1740
tgtccttttg gctgcgggtg cccaaagtgt ctgccagcca tcttgagtct ggcggcagct 1800
cacacatggc acccactcat caactcccac cttcagatgt gcggaaaatc atacttgagc 1860
tgcaaccact gagccgggga ctgttggagg attaccaaaa gaaagaaact ggggtcccag 1920
aaagcaatcg gactctgctc ctgtgcctca cctccgactc tcagcctcca aggctcaact 1980
cctccgctat cctgccatat ttccgggcca tccggcctct gtctgacaaa aacattattg 2040
acaaaattat cgaacaactt gacaaactca agtttcaaca tgagcccgaa accgaaattt 2100
ctgtgcccgc tgacactttt gagtgtaaat ccttcattct cacgatcctg caacaattct 2160
ctgcctgcct cgagtctgtg ttcaagtctc tgaactcagg ccctcaggcc ggctccgggt 2220
ttaacaactt tacagtgtct ttctggctca gagtccccaa ggtgtccgcc tctcaccttg 2280
aaggttccgg cggacagtat attaaggcta actctaagtt tatcgggatt acagagctgc 2340
accaccacca tcaccactga taagcttaag ggttcgatcc ctaccggtta gtaatgagtt 2400
tgatatctcg acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 2460
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 2520
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 2580
tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 2640
gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 2700
ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 2760
ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 2820
ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 2880
ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 2940
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cctggaaacg ggggaggcta actgaaacac ggaaggagac aataccggaa ggaacccgcg 3060
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
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Asp Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu
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Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe
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<223> Sequence related to the labeled neutralizing antibody suitable
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Asp Trp Met
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Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe
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<223> Sequence related to the labeled neutralizing antibody suitable
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115
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence related to the labeled neutralizing antibody suitable
for the assay of the invention (cf. WO2013/011407 A1)
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Asn Trp Val Val Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence related to the labeled neutralizing antibody suitable
for the assay of the invention (cf. WO2013/011407 A1)
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence related to the labeled neutralizing antibody suitable
for the assay of the invention (cf. WO2013/011407 A1)
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Val Val Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> Bacteria <prokaryote>
<220>
<223> SEQ ID NO: 39 is the amino acid sequence of the Tetanus Toxin
T-cell epitope p4
<400> 39
Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu
1 5 10
<210> 40
<211> 510
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 40 is another version of the amino acid sequence of
the cIL-31 polyprotein used for the vaccine of Example 13
<400> 40
Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys
1 5 10 15
Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr
20 25 30
Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu
35 40 45
Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile
50 55 60
Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile
65 70 75 80
Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro
85 90 95
Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe
100 105 110
Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe
115 120 125
Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys
130 135 140
Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile
165 170 175
Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln
180 185 190
Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys
195 200 205
Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu
210 215 220
Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp
225 230 235 240
Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu
245 250 255
Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile
260 265 270
Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys
275 280 285
Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr
290 295 300
Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
305 310 315 320
Ser Gly Gly Ser Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser
325 330 335
Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu
340 345 350
Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg
355 360 365
Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn
370 375 380
Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp
385 390 395 400
Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe
405 410 415
Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu
420 425 430
Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu
435 440 445
Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Ala Gly Ser Gly
450 455 460
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
465 470 475 480
Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser
485 490 495
Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu His His His His His His
500 505 510
<210> 41
<211> 115
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> SEQ ID NO: 41 is the amino acid sequence of canine IL-5 protein.
<400> 41
Phe Ala Val Glu Asn Pro Met Asn Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Trp Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met
20 25 30
Ile Pro Thr Pro Glu Asn Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Lys Glu Val
35 40 45
Phe Gln Gly Ile Asp Thr Leu Lys Asn Gln Thr Ala His Gly Glu Ala
50 55 60
Val Asp Lys Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Glu His Ile Glu
65 70 75 80
Arg Gln Lys Lys Arg Cys Ala Gly Glu Arg Trp Arg Val Thr Lys Phe
85 90 95
Leu Asp Tyr Leu Gln Val Phe Leu Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr
100 105 110
Pro Glu Ser
115
<210> 42
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 42 is the amino acid sequence of the cIL-5 polyprotein
used for the vaccine construct of Example 13b.
<400> 42
Val Glu Asn Pro Met Asn Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Thr His Arg Thr Trp Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met Ile Pro
20 25 30
Thr Pro Glu Asn Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Lys Glu Val Phe Gln
35 40 45
Gly Ile Asp Thr Leu Lys Asn Gln Thr Ala His Gly Glu Ala Val Asp
50 55 60
Lys Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Glu His Ile Glu Arg Gln
65 70 75 80
Lys Lys Arg Cys Ala Gly Glu Arg Trp Arg Val Thr Lys Phe Leu Asp
85 90 95
Tyr Leu Gln Val Phe Leu Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr Pro Glu
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
115 120 125
Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gly Phe Ala Val Glu Asn Pro Met Asn
130 135 140
Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Trp
145 150 155 160
Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met Ile Pro Thr Pro Glu Asn Lys Asn
165 170 175
His Gln Leu Cys Ile Lys Glu Val Phe Gln Gly Ile Asp Thr Leu Lys
180 185 190
Asn Gln Thr Ala His Gly Glu Ala Val Asp Lys Leu Phe Gln Asn Leu
195 200 205
Ser Leu Ile Lys Glu His Ile Glu Arg Gln Lys Lys Arg Cys Ala Gly
210 215 220
Glu Arg Trp Arg Val Thr Lys Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Val Phe Leu
225 230 235 240
Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr Pro Glu Ser Ala Gly Ser Gly Phe
245 250 255
Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
260 265 270
Ser His Leu Glu Ser Gly Gly Ser Phe Ala Val Glu Asn Pro Met Asn
275 280 285
Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Trp
290 295 300
Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met Ile Pro Thr Pro Glu Asn Lys Asn
305 310 315 320
His Gln Leu Cys Ile Lys Glu Val Phe Gln Gly Ile Asp Thr Leu Lys
325 330 335
Asn Gln Thr Ala His Gly Glu Ala Val Asp Lys Leu Phe Gln Asn Leu
340 345 350
Ser Leu Ile Lys Glu His Ile Glu Arg Gln Lys Lys Arg Cys Ala Gly
355 360 365
Glu Arg Trp Arg Val Thr Lys Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Val Phe Leu
370 375 380
Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr Pro Glu Ser Ala Gly Ser Gly Phe
385 390 395 400
Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
405 410 415
Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys
420 425 430
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu His His His His His His
435 440 445
<210> 43
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 43 is an alternative amino acid sequence of the cIL-5
polyprotein that can be used for the vaccine construct of Example
13b.
<400> 43
Phe Ala Val Glu Asn Pro Met Asn Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Trp Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met
20 25 30
Ile Pro Thr Pro Glu Asn Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Lys Glu Val
35 40 45
Phe Gln Gly Ile Asp Thr Leu Lys Asn Gln Thr Ala His Gly Glu Ala
50 55 60
Val Asp Lys Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Glu His Ile Glu
65 70 75 80
Arg Gln Lys Lys Arg Cys Ala Gly Glu Arg Trp Arg Val Thr Lys Phe
85 90 95
Leu Asp Tyr Leu Gln Val Phe Leu Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr
100 105 110
Pro Glu Ser Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
115 120 125
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gly Phe Ala Val Glu Asn Pro
130 135 140
Met Asn Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr Leu Leu Ser Thr His Arg
145 150 155 160
Thr Trp Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met Ile Pro Thr Pro Glu Asn
165 170 175
Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Lys Glu Val Phe Gln Gly Ile Asp Thr
180 185 190
Leu Lys Asn Gln Thr Ala His Gly Glu Ala Val Asp Lys Leu Phe Gln
195 200 205
Asn Leu Ser Leu Ile Lys Glu His Ile Glu Arg Gln Lys Lys Arg Cys
210 215 220
Ala Gly Glu Arg Trp Arg Val Thr Lys Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Val
225 230 235 240
Phe Leu Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr Pro Glu Ser Ala Gly Ser
245 250 255
Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val
260 265 270
Ser Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Gly Ser Phe Ala Val Glu Asn Pro
275 280 285
Met Asn Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr Leu Leu Ser Thr His Arg
290 295 300
Thr Trp Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met Ile Pro Thr Pro Glu Asn
305 310 315 320
Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Lys Glu Val Phe Gln Gly Ile Asp Thr
325 330 335
Leu Lys Asn Gln Thr Ala His Gly Glu Ala Val Asp Lys Leu Phe Gln
340 345 350
Asn Leu Ser Leu Ile Lys Glu His Ile Glu Arg Gln Lys Lys Arg Cys
355 360 365
Ala Gly Glu Arg Trp Arg Val Thr Lys Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Val
370 375 380
Phe Leu Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr Pro Glu Ser Ala Gly Ser
385 390 395 400
Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val
405 410 415
Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn
420 425 430
Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu His His His His His His
435 440 445
<210> 44
<211> 1419
<212> DNA
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> SEQ ID NO: 44 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-cIL-5-poly encoding the cIL-5 polyprotein construct of Example 1b.
<400> 44
gaattcccgc cgccaccatg ggatggagct gcatcatcct gttcctggtc gctacagcca 60
ccggcgtgca cagcgtggaa aaccccatga atagactggt ggccgaaacc ttgacactcc 120
tgagcaccca cagaacatgg ctgatcggcg acggaaacct gatgattcct acccctgaga 180
acaagaacca ccagctgtgt atcaaggagg tgttccaggg catagacaca ctgaagaatc 240
agaccgctca cggcgaggcc gtggataagc tgttccaaaa tttaagcctg atcaaggagc 300
acatcgagag acagaagaaa agatgcgccg gcgagagatg gagagtgacc aagttcctgg 360
actacctgca agtgttcctg ggagttatca ataccgagtg gacccctgaa tccggcagcg 420
gcggccagta catcaaggcc aatagcaagt tcatcggcat tacagaactg gccggcagcg 480
gcttcgccgt cgagaaccct atgaaccgcc tggtggctga aaccctgacc ctgctctcta 540
cccacagaac ctggctgatc ggcgacggca acctgatgat cccaacacca gagaacaaga 600
accaccagct gtgcattaaa gaggtgttcc agggtatcga taccctgaaa aaccagacag 660
cccatggaga agccgtggac aagctgttcc aaaacctgtc cctgatcaaa gaacacatcg 720
agcggcagaa aaaaagatgt gccggagaga ggtggcgggt caccaagttc ctggattacc 780
tgcaggtgtt tctgggcgtg atcaacacgg agtggacacc tgagagcgct ggcagcggct 840
ttaacaactt caccgtgtcc ttttggctga gagttcctaa ggtgtccgcc agccacctgg 900
aaagcggcgg atcttttgcc gtggaaaatc ccatgaaccg gctggtggcc gagaccctga 960
cactgctgtc tacacaccgg acctggctga tcggcgatgg caatctgatg atccccacac 1020
ctgagaacaa gaaccaccag ctgtgcatca aggaagtgtt ccagggcatc gacaccctta 1080
agaaccagac cgcccacggc gaggctgtgg acaagctgtt ccagaacctg tctctgatca 1140
aggaacacat cgagcggcag aagaagcggt gcgccggcga aagatggaga gtgacaaagt 1200
tcctggacta tctgcaggtg ttcctgggcg ttatcaacac cgagtggacc cctgagagcg 1260
ccggcagcgg tttcaacaac ttcaccgtga gcttctggct tagagtgccc aaggtgtctg 1320
catctcacct ggaaggcagc ggaggccagt acatcaaagc caacagcaag tttatcggca 1380
tcaccgagct gcaccatcat caccaccact gataagctt 1419
<210> 45
<211> 441
<212> DNA
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> SEQ ID NO: 45 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-cIL-5 encoding the cIL-5 protein construct of Example 3b.
<400> 45
gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gttcctggtc gccaccgcca 60
caggcgtgca cagcgtggaa aatcctatga acagactggt ggctgaaacc ctcaccctgc 120
tgagcacaca cagaacctgg ctgatcggcg acggcaacct gatgatcccc acccctgaga 180
acaagaatca ccagctgtgt atcaaagagg tgttccaagg catcgacacc ctgaagaacc 240
agacagccca cggcgaggcc gtggacaagc tgtttcagaa cctgtctctg attaaggaac 300
acatcgagag acagaaaaag cggtgcgccg gagaaagatg gcgggtgaca aagttcctgg 360
attacctgca ggtgttcctg ggagtgatca acaccgagtg gaccccagag agccaccacc 420
accaccatca ctgataagct t 441
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> SEQ ID NO: 46 is the amino acid sequence of canine IL-13.
<400> 46
Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Thr Leu Lys Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Gly Ser
20 25 30
Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu
35 40 45
Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Ser Ala Ile Gln Arg Thr Gln
50 55 60
Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser Gln Lys Pro Ala Ala Gly Gln Ile
65 70 75 80
Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ile Gln Leu Val
85 90 95
Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg Gly Val Tyr Arg His Gly Asn Phe
100 105 110
Arg
<210> 47
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 47 is the amino acid sequence of the cIL-13
polyprotein used for the vaccine construct of Example 13c.
<400> 47
Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Thr Leu Lys Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Gly Ser
20 25 30
Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu
35 40 45
Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Ser Ala Ile Gln Arg Thr Gln
50 55 60
Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser Gln Lys Pro Ala Ala Gly Gln Ile
65 70 75 80
Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ile Gln Leu Val
85 90 95
Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg Gly Val Tyr Arg His Gly Asn Phe
100 105 110
Arg Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
115 120 125
Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gly Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser
130 135 140
Pro Thr Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn
145 150 155 160
Gln Ala Ser Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr
165 170 175
Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp
180 185 190
Cys Ser Ala Ile Gln Arg Thr Gln Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser
195 200 205
Gln Lys Pro Ala Ala Gly Gln Ile Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr
210 215 220
Lys Ile Glu Val Ile Gln Leu Val Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg
225 230 235 240
Gly Val Tyr Arg His Gly Asn Phe Arg Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn
245 250 255
Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
260 265 270
Leu Glu Ser Gly Gly Ser Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Thr
275 280 285
Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Ala
290 295 300
Ser Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Ala Gly
305 310 315 320
Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Ser
325 330 335
Ala Ile Gln Arg Thr Gln Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser Gln Lys
340 345 350
Pro Ala Ala Gly Gln Ile Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile
355 360 365
Glu Val Ile Gln Leu Val Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg Gly Val
370 375 380
Tyr Arg His Gly Asn Phe Arg Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr
385 390 395 400
Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
405 410 415
Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
420 425 430
Thr Glu Leu His His His His His His
435 440
<210> 48
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 48 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-cIL-13-poly encoding the cIL-13 polyprotein construct of
Example 1c.
<400> 48
gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gttcctggtc gccacagcca 60
ccggcgtgca cagcagccca tctcctgtga cccctagccc taccctgaag gagctgatcg 120
aggaactggt gaatatcacc cagaaccagg cctctctgtg caacggcagc atggtgtggt 180
ccgtgaacct gacagccgga atgtactgcg ccgccctgga aagcctgatc aacgtgtcag 240
attgcagcgc catccaaaga acacagagaa tgctgaaagc cctgtgctct cagaagcctg 300
ctgccgggca gatcagctct gagagaagcc gggacacaaa aatcgaggtg atccagctgg 360
tgaagaacct gctgacctac gttagaggcg tgtacagaca cggcaacttc cggggctctg 420
gaggacagta catcaaggca aatagcaagt tcatcggcat cacagagctg gccggcagcg 480
gctctccttc acccgtgacc cctagcccta ctctgaagga actcattgag gaactggtga 540
atatcacaca aaatcaagcc agcctgtgta acggctccat ggtctggagt gtgaacctga 600
ccgctggcat gtactgcgcc gctctggaat ctctgatcaa cgtgtccgac tgcagcgcca 660
tccagcgaac ccagagaatg ctgaaggctc tgtgttccca gaaacctgcc gccggccaga 720
tcagcagcga gagaagcaga gatacaaaga tcgaggtgat ccagctggtg aagaacctgc 780
tgacctacgt gcggggcgtg tacagacacg gaaactttcg ggccggcagc ggatttaaca 840
acttcaccgt gtccttctgg ctgagagtgc ctaaggtgtc tgcttctcac ctggaaagcg 900
gaggctccag cccatctcct gtgacaccca gccccaccct gaaagagctg atcgaagagc 960
tggtgaacat cacccagaat caggccagcc tgtgcaacgg cagcatggtg tggagcgtga 1020
acctgacagc cggaatgtat tgtgccgctc tggagagcct gattaacgtg agcgactgca 1080
gcgctatcca gagaacccag cggatgctga aagccctgtg ttctcagaag cccgccgccg 1140
gccagatcag cagcgagcgg agccgcgaca ccaagatcga ggtgatccaa ctggtcaaga 1200
atctcctgac ctacgtgagg ggcgtttacc ggcacggcaa cttcagagcc ggcagcggct 1260
tcaacaactt caccgtgtct ttttggctca gagtgcccaa ggtgtccgcc agccacctgg 1320
aaggcagcgg cggccagtac atcaaggcca acagcaagtt catcggcatc accgagctgc 1380
accaccatca ccaccactga taagctt 1407
<210> 49
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 49 is the nucleic acid sequence of the bacterial
expression plasmid pET30a-cIL-13 encoding the cIL-13 protein
construct of Example 3c.
<400> 49
catatgtcac ccagtccagt aacaccctca ccaactctaa aggaactaat agaagaactg 60
gtgaacatta cccaaaacca agcgagcctg tgcaacggta gcatggtgtg gagcgttaac 120
ctgaccgcgg gcatgtactg cgcggcgctg gagagcctga tcaacgtgag cgactgcagc 180
gcgattcagc gtacccaacg tatgctgaag gcgctgtgca gccagaaacc ggcggcgggt 240
caaatcagca gcgagcgtag ccgtgatacc aagatcgaag tgattcagct ggttaaaaac 300
ctgctgacct atgttcgcgg cgtttatcgc cacggcaact ttcgtcacca ccatcatcac 360
cattaatgaa agctt 375
<210> 50
<211> 154
<212> PRT
<213> Canis
<220>
<223> SEQ ID NO: 50 is the amino acid sequence of amino acids 110-263
of the full length dog IL-33 protein (Uniprot O97863) canine IL-33-WT.
<400> 50
Ser Ile Gln Glu Tyr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser
1 5 10 15
Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp
20 25 30
Leu Arg Lys Gly Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Phe Arg Tyr Tyr Asp
35 40 45
Ser Gln Ser Pro Ser His Glu Thr Gly Asp Asp Val Asp Gly Gln Thr
50 55 60
Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu His
65 70 75 80
Ala Asn Asn Glu Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Cys Glu Asn Gln
85 90 95
Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Leu Leu His Arg Lys Ser Ser Glu Cys
100 105 110
Val Ser Phe Glu Cys Lys Asn Asn Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys
115 120 125
Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Gly Asp Gln Thr Lys Asp Ser
130 135 140
Tyr Ile Glu Lys Thr Ile Phe Lys Leu Ser
145 150
<210> 51
<211> 154
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 51 is the altered amino acid sequence of canine
IL-33-CS , which is amino acids 110-263 of the full length dog
IL-33 protein (Uniprot O97863), where the 3 cysteine residues are
replaced by serine (IL-33-CS) to improve stability of the gene
<400> 51
Ser Ile Gln Glu Tyr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser
1 5 10 15
Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp
20 25 30
Leu Arg Lys Gly Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Phe Arg Tyr Tyr Asp
35 40 45
Ser Gln Ser Pro Ser His Glu Thr Gly Asp Asp Val Asp Gly Gln Thr
50 55 60
Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu His
65 70 75 80
Ala Asn Asn Glu Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Ser Glu Asn Gln
85 90 95
Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Leu Leu His Arg Lys Ser Ser Glu Ser
100 105 110
Val Ser Phe Glu Ser Lys Asn Asn Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys
115 120 125
Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Gly Asp Gln Thr Lys Asp Ser
130 135 140
Tyr Ile Glu Lys Thr Ile Phe Lys Leu Ser
145 150
<210> 52
<211> 498
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 52 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pET30a(+)-canIL33-WT encoding the cIL-33_WT protein construct of
Example 3d.
<400> 52
catatgcacc accatcatca tcacagcatc caagaataca gcgcgagcct gagcacctac 60
aacgaccaga gcatcacctt cgtgtttgaa gatggtagct acgagatcta tgtggaagac 120
ctgcgtaaag gccaggagaa ggataaagtt ctgttccgtt actatgacag ccaaagcccg 180
agccacgaaa ccggtgacga tgtggacggc cagaccctgc tggttaacct gagcccgacc 240
aaggacaaag attttctgct gcacgcgaac aacgaggaac acagcgtgga gctgcaaaag 300
tgcgaaaacc agctgccgga tcaagcgttc tttctgctgc accgtaagag cagcgagtgc 360
gttagcttcg aatgcaaaaa caacccgggt gtgtttattg gcgttaagga caaccacctg 420
gcgctgatca aagtgggcga ccaaaccaag gacagctaca tcgagaagac cattttcaaa 480
ctgagctaat gaaagctt 498
<210> 53
<211> 498
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 53 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pET30a(+)-canIL33-CS encoding the cIL-33_CS protein construct
construct of Example 3e.
<400> 53
catatgcacc accaccacca ccactcaata caagaatact cagctagtct atcaacctat 60
aacgaccaga gcattacctt tgtttttgaa gatggtagct acgagatcta tgtggaagac 120
ctgcgtaaag gccaggagaa ggataaagtt ctgttccgtt actatgacag ccaaagcccg 180
agccacgaaa ccggtgacga tgtggatggc cagaccctgc tggttaacct gagcccgacc 240
aaggacaaag attttctgct gcacgcgaac aacgaggaac acagcgtgga gctgcaaaag 300
agcgaaaacc agctgccgga tcaagcgttc tttctgctgc accgtaagag cagcgagagc 360
gttagcttcg aaagcaaaaa caacccgggt gtgtttattg gcgttaagga caaccacctg 420
gcgctgatca aggttggcga ccagaccaaa gatagctaca tcgagaagac cattttcaaa 480
ctgagctaat gaaagctt 498
<210> 54
<211> 564
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 54 is the amino acid sequence of the cIL-33-CS
polyprotein used for the vaccine construct of Example 13d.
<400> 54
Ser Ile Gln Glu Tyr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser
1 5 10 15
Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp
20 25 30
Leu Arg Lys Gly Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Phe Arg Tyr Tyr Asp
35 40 45
Ser Gln Ser Pro Ser His Glu Thr Gly Asp Asp Val Asp Gly Gln Thr
50 55 60
Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu His
65 70 75 80
Ala Asn Asn Glu Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Ser Glu Asn Gln
85 90 95
Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Leu Leu His Arg Lys Ser Ser Glu Ser
100 105 110
Val Ser Phe Glu Ser Lys Asn Asn Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys
115 120 125
Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Gly Asp Gln Thr Lys Asp Ser
130 135 140
Tyr Ile Glu Lys Thr Ile Phe Lys Leu Ser Gly Ser Gly Gly Gln Tyr
145 150 155 160
Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser
165 170 175
Gly Ser Ile Gln Glu Tyr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln
180 185 190
Ser Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu
195 200 205
Asp Leu Arg Lys Gly Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Phe Arg Tyr Tyr
210 215 220
Asp Ser Gln Ser Pro Ser His Glu Thr Gly Asp Asp Val Asp Gly Gln
225 230 235 240
Thr Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu
245 250 255
His Ala Asn Asn Glu Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Ser Glu Asn
260 265 270
Gln Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Leu Leu His Arg Lys Ser Ser Glu
275 280 285
Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Asn Asn Pro Gly Val Phe Ile Gly Val
290 295 300
Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Gly Asp Gln Thr Lys Asp
305 310 315 320
Ser Tyr Ile Glu Lys Thr Ile Phe Lys Leu Ser Ala Gly Ser Gly Phe
325 330 335
Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
340 345 350
Ser His Leu Glu Ser Gly Gly Ser Ser Ile Gln Glu Tyr Ser Ala Ser
355 360 365
Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly
370 375 380
Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Arg Lys Gly Gln Glu Lys Asp
385 390 395 400
Lys Val Leu Phe Arg Tyr Tyr Asp Ser Gln Ser Pro Ser His Glu Thr
405 410 415
Gly Asp Asp Val Asp Gly Gln Thr Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr
420 425 430
Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu His Ala Asn Asn Glu Glu His Ser Val
435 440 445
Glu Leu Gln Lys Ser Glu Asn Gln Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Leu
450 455 460
Leu His Arg Lys Ser Ser Glu Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Asn Asn
465 470 475 480
Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys
485 490 495
Val Gly Asp Gln Thr Lys Asp Ser Tyr Ile Glu Lys Thr Ile Phe Lys
500 505 510
Leu Ser Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
515 520 525
Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Gly Gln
530 535 540
Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu His His
545 550 555 560
His His His His
<210> 55
<211> 1710
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 55 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pET30a-cIL33-(CS-)poly encoding the cIL-33-CS polyprotein
construct of Example 1d.
<400> 55
catatgcacc accatcatca ccactccatc caagaatact ccgcttccct gagcacctat 60
aacgaccaat ccattacctt tgtgtttgaa gatggcagtt atgaaattta cgtcgaagat 120
ctgcgtaagg gtcaggaaaa agacaaagtg ctgtttcgct attacgatag tcaatccccg 180
tcacatgaaa ccggcgatga cgttgatggt cagacgctgc tggtcaacct gagcccgacc 240
aaagataaag acttcctgct gcatgcgaac aatgaagaac actcggtgga actgcagaaa 300
agcgaaaatc agctgccgga ccaagccttt ttcctgctgc atcgtaaaag ctctgaatcg 360
gttagctttg aaagcaaaaa caatccgggc gttttcattg gtgtcaaaga taaccacctg 420
gcactgatca aagtcggcga tcagacgaaa gactcgtaca tcgaaaaaac catcttcaaa 480
ctgtctggca gtggcggtca atacattaaa gcgaactcaa aattcattgg tatcaccgaa 540
ctggcgggct ccggttcaat ccaggaatat tcggccagcc tgtctaccta caatgaccaa 600
tcgattacgt ttgttttcga agatggcagc tatgaaatct acgtcgaaga cctgcgtaaa 660
ggtcaagaaa aagataaagt tctgttccgc tattacgaca gtcagtcccc gtcacacgaa 720
acgggcgatg acgtggatgg tcaaaccctg ctggttaacc tgagcccgac gaaagataaa 780
gactttctgc tgcatgcaaa caatgaagaa cactctgttg aactgcagaa aagtgaaaat 840
cagctgccgg atcaggcgtt tttcctgctg caccgcaaaa gttccgaatc ggtgagcttt 900
gaatctaaaa ataatccggg cgtgttcatt ggtgttaaag ataaccacct ggcgctgatc 960
aaagttggtg atcagaccaa agactcttac atcgaaaaaa cgatcttcaa actgtctgcc 1020
ggcagtggtt ttaacaattt caccgtgtcc ttctggctgc gcgtgccgaa agtttctgca 1080
agtcatctgg aatcaggcgg ttcatcgatt caggaatatt ccgcttcact gtcgacctac 1140
aatgaccaat ctattacgtt tgtgttcgaa gatggcagtt atgaaatcta cgttgaagat 1200
ctgcgtaagg gccaagaaaa agataaagtc ctgttccgct attacgatag ccaatctccg 1260
agtcacgaaa ccggcgatga cgtcgacggc cagacgctgc tggtgaacct gtctccgacg 1320
aaagacaaag actttctgct gcacgccaat aatgaagaac actccgttga actgcagaaa 1380
tcagaaaacc aactgccgga tcaagccttt ttcctgttac accgcaaaag ctctgaatcc 1440
gtctcatttg aatctaaaaa taacccgggc gtcttcattg gtgtgaaaga taatcacctg 1500
gccctgatca aagttggcga ccaaacgaaa gactcctata ttgaaaaaac gatttttaaa 1560
ctgtccgcag gctcaggctt caacaatttc accgtgagtt tctggctgcg cgtcccgaaa 1620
gtgtcggcta gccatctgga aggctcaggc ggtcaataca tcaaagcgaa cagcaaattc 1680
atcggcatca cggaactgta atgaaagctt 1710
<210> 56
<211> 108
<212> PRT
<213> Canis
<220>
<223> SEQ ID NO: 56 is the amino acid sequence of canine IL-4.
<400> 56
His Asn Phe Asn Ile Thr Ile Lys Glu Ile Ile Lys Met Leu Asn Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Arg Asn Asp Ser Cys Met Glu Leu Thr Val Lys Asp Val
20 25 30
Phe Thr Ala Pro Lys Asn Thr Ser Asp Lys Glu Ile Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Ala Thr Val Leu Arg Gln Ile Tyr Thr His Asn Cys Ser Asn Arg Tyr
50 55 60
Leu Arg Gly Leu Tyr Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn Lys Thr Cys
65 70 75 80
Ser Met Asn Glu Ile Lys Lys Ser Thr Leu Lys Asp Phe Leu Glu Arg
85 90 95
Leu Lys Val Ile Met Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg His
100 105
<210> 57
<211> 426
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 57 is the amino acid sequence of the cIL-4 polyprotein
used for the vaccine construct of Example 13e.
<400> 57
His Asn Phe Asn Ile Thr Ile Lys Glu Ile Ile Lys Met Leu Asn Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Arg Asn Asp Ser Cys Met Glu Leu Thr Val Lys Asp Val
20 25 30
Phe Thr Ala Pro Lys Asn Thr Ser Asp Lys Glu Ile Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Ala Thr Val Leu Arg Gln Ile Tyr Thr His Asn Cys Ser Asn Arg Tyr
50 55 60
Leu Arg Gly Leu Tyr Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn Lys Thr Cys
65 70 75 80
Ser Met Asn Glu Ile Lys Lys Ser Thr Leu Lys Asp Phe Leu Glu Arg
85 90 95
Leu Lys Val Ile Met Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg His Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala
115 120 125
Gly Ser Gly His Asn Phe Asn Ile Thr Ile Lys Glu Ile Ile Lys Met
130 135 140
Leu Asn Ile Leu Thr Ala Arg Asn Asp Ser Cys Met Glu Leu Thr Val
145 150 155 160
Lys Asp Val Phe Thr Ala Pro Lys Asn Thr Ser Asp Lys Glu Ile Phe
165 170 175
Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Ile Tyr Thr His Asn Cys Ser
180 185 190
Asn Arg Tyr Leu Arg Gly Leu Tyr Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn
195 200 205
Lys Thr Cys Ser Met Asn Glu Ile Lys Lys Ser Thr Leu Lys Asp Phe
210 215 220
Leu Glu Arg Leu Lys Val Ile Met Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg His Ala
225 230 235 240
Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro
245 250 255
Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Gly Ser His Asn Phe Asn
260 265 270
Ile Thr Ile Lys Glu Ile Ile Lys Met Leu Asn Ile Leu Thr Ala Arg
275 280 285
Asn Asp Ser Cys Met Glu Leu Thr Val Lys Asp Val Phe Thr Ala Pro
290 295 300
Lys Asn Thr Ser Asp Lys Glu Ile Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu
305 310 315 320
Arg Gln Ile Tyr Thr His Asn Cys Ser Asn Arg Tyr Leu Arg Gly Leu
325 330 335
Tyr Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn Lys Thr Cys Ser Met Asn Glu
340 345 350
Ile Lys Lys Ser Thr Leu Lys Asp Phe Leu Glu Arg Leu Lys Val Ile
355 360 365
Met Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg His Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe
370 375 380
Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu
385 390 395 400
Glu Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
405 410 415
Ile Thr Glu Leu His His His His His His
420 425
<210> 58
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 58 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-cIL-5-poly encoding the cIL-4 polyprotein construct of
Example 1e.
<400> 58
gaattcccgc cgccaccatg ggttggagtt gcatcatcct atttctagtg gccacagcca 60
ccggcgtgca ctcgcacaac ttcaacataa caatcaaaga gatcatcaag atgctgaata 120
ttctgaccgc cagaaacgat tcctgcatgg aactgacagt caaggacgtg tttaccgctc 180
caaagaacac ctctgacaag gagatcttct gcagagctgc taccgtgctg cggcaaatct 240
acacccacaa ctgcagcaac cggtacctgc ggggcctgta ccggaacctg tcctctatgg 300
ccaacaagac ctgcagcatg aacgagatca agaagtccac cctgaaggac tttctggagc 360
ggctgaaggt catcatgcag aagaaatatt acaggcacgg cagtggcggc cagtacatca 420
aggccaattc taagttcatc ggcatcaccg agctggccgg ctctggccac aacttcaaca 480
tcaccatcaa agagatcatc aagatgctga acatcctgac cgcacggaac gactcttgca 540
tggaactgac cgtgaaggac gtgttcactg ctcctaagaa cacctctgat aaagaaatct 600
tctgtagagc cgctaccgtg ctgagacaga tctacacaca taactgctcc aacagatacc 660
tgagaggcct gtacagaaat ctgtcctcta tggccaacaa gacctgttcc atgaacgaaa 720
tcaaaaagtc caccctaaag gatttcctgg aacggctgaa ggtgatcatg cagaaaaagt 780
actaccggca cgctggcagc ggctttaaca actttacagt gtccttctgg ctgagagtgc 840
ctaaggtgtc cgcctcccat ttggagtccg gcggatctca caacttcaac atcaccatca 900
aggagatcat caagatgctg aacatcctga ccgctcggaa cgactcctgt atggaactca 960
cagtgaagga cgtgttcacc gcccccaaga atacctccga caaggagatc ttctgcagag 1020
ccgccacagt tctgcggcag atctataccc acaattgctc caacagatac ctcagaggcc 1080
tgtaccgcaa cctgagctcc atggctaaca aaacctgctc catgaacgag atcaagaaga 1140
gcaccctgaa agacttcctg gagagactga aggtgatcat gcagaagaag tactacagac 1200
acgccggatc tggcttcaat aacttcaccg tgtctttctg gctgagagtg cctaaggtgt 1260
ctgctagcca cctggaaggt tctggaggcc agtacatcaa ggccaactcc aagttcatcg 1320
gcattaccga gctgcaccat caccaccacc actgataagc tt 1362
<210> 59
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 59 is the nucleic acid sequence of the bacterial
expression plasmid pET30a-cIL-4 encoding the cIL-4 protein
construct of Example 3f.
<400> 59
catatgcacc accaccacca ccacaacttc aacataacaa taaaggaaat aatcaaaatg 60
ctgaacatcc tgaccgcgcg taacgatagc tgcatggagc tgaccgtgaa ggacgttttc 120
accgcgccga agaacaccag cgataaagaa atcttttgcc gtgcggcgac cgtgctgcgt 180
cagatttaca cccacaactg cagcaaccgt tacctgcgtg gtctgtatcg taacctgagc 240
agcatggcga acaaaacctg cagcatgaac gagatcaaga aaagcaccct gaaggatttc 300
ctggagcgcc tgaaggttat tatgcagaag aagtattacc gccactaatg aaagctt 357
<210> 60
<211> 133
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> SEQ ID NO: 60 is the amino acid sequence of feline IL-31.
<400> 60
Ala Pro Ala His Arg Leu Gln Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu
1 5 10 15
Glu Leu Arg Pro Met Ser Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Val Ser Lys
20 25 30
Glu Ile Gly Leu Pro Glu Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser
35 40 45
Ser Asp Ser Gln Leu Pro His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr
50 55 60
Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile
65 70 75 80
Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys
85 90 95
Val Ser Met Pro Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala
100 105 110
Val Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu
115 120 125
Asn Ser Gly Pro Gln
130
<210> 61
<211> 501
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 61 is the amino acid sequence of the feline IL-31
polyprotein used for the vaccine construct of Example 13f.
<400> 61
Ala Pro Ala His Arg Leu Gln Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu
1 5 10 15
Glu Leu Arg Pro Met Ser Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Val Ser Lys
20 25 30
Glu Ile Gly Leu Pro Glu Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser
35 40 45
Ser Asp Ser Gln Leu Pro His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr
50 55 60
Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile
65 70 75 80
Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys
85 90 95
Val Ser Met Pro Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala
100 105 110
Val Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu
115 120 125
Asn Ser Gly Pro Gln Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser
130 135 140
Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gly Ala Pro Ala His
145 150 155 160
Arg Leu Gln Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Arg Pro
165 170 175
Met Ser Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Val Ser Lys Glu Ile Gly Leu
180 185 190
Pro Glu Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser Asp Ser Gln
195 200 205
Leu Pro His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile
210 215 220
Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu
225 230 235 240
Asp Lys Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val Ser Met Pro
245 250 255
Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val Leu Gln Gln
260 265 270
Phe Ser Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn Ser Gly Pro
275 280 285
Gln Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
290 295 300
Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Gly Ser Ala Pro
305 310 315 320
Ala His Arg Leu Gln Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu
325 330 335
Arg Pro Met Ser Lys Gly Leu Leu Gln Asp Tyr Val Ser Lys Glu Ile
340 345 350
Gly Leu Pro Glu Ser Asn His Ser Ser Leu Pro Cys Leu Ser Ser Asp
355 360 365
Ser Gln Leu Pro His Ile Asn Gly Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg
370 375 380
Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Thr Ile Asp Lys Ile Ile Glu
385 390 395 400
Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln Arg Glu Pro Glu Ala Lys Val Ser
405 410 415
Met Pro Ala Asp Asn Phe Glu Arg Lys Asn Phe Ile Leu Ala Val Leu
420 425 430
Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu His Val Leu Gln Ser Leu Asn Ser
435 440 445
Gly Pro Gln Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
450 455 460
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Gly
465 470 475 480
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu His
485 490 495
His His His His His
500
<210> 62
<211> 7597
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 62 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-felIL31-poly encoding the feline IL-31 polyprotein
construct of Example 1g.
<400> 62
gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta 60
ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 120
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 180
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 240
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 300
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 360
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 420
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 480
cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 540
caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 600
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg 660
agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgg 720
actctagagg atcgaaccct tgaattcccg ccgccaccat gggatggtcc tgcatcattc 780
tgttcctggt ggccaccgcc acaggcgtgc acagcgcccc cgcccacaga ctgcaaccta 840
gcgacgtcag gaaaatcatc ttggagctga gacctatgag caaaggcctg ctgcaggact 900
acgtgtccaa agagattggc ctgccagaat ctaatcactc tagcctgcct tgcctgtcta 960
gcgacagcca gctgccccac atcaacggct ccgccatcct gccctacttt agagccatca 1020
gacctctgtc cgacaaaaac accatcgaca agatcatcga gcagctggac aagctgaagt 1080
tccagcggga acccgaagcc aaggtttcca tgcctgctga taatttcgag agaaagaact 1140
tcatcctggc tgtgctgcag cagttcagcg cttgcctgga gcacgtgctg cagagcctga 1200
atagcggacc tcagggcagc ggcggccagt acatcaaagc caattctaaa ttcatcggca 1260
tcaccgagct ggccggcagc ggcgcccctg ctcacagact gcagcctagc gatgtgcgga 1320
agatcatcct ggagctgaga cctatgagca agggcctgct gcaggactac gtgtccaagg 1380
aaatcggcct gcccgagagc aaccacagta gcctgccatg tctgagcagc gacagccagc 1440
tgccacatat caacggcagc gccatcctgc cttacttcag agccatccgg cctctgagcg 1500
acaagaacac catcgacaag atcatcgagc agctggataa gctgaaattc cagagagagc 1560
ctgaggccaa ggtcagcatg cctgccgaca actttgagcg gaagaatttt atcctggccg 1620
tgctgcagca gttcagcgcc tgcctggaac acgtgctgca atctctgaac agcggccccc 1680
aggccggatc tggcttcaac aacttcacag tgtctttttg gctgcgggtg cccaaggtgt 1740
ccgccagcca cctggaaagc ggcggatctg ctccagctca cagactccag ccttctgatg 1800
tgcggaagat cattctggaa ctcaggccca tgagcaaggg cctgctgcag gattacgtga 1860
gcaaggaaat cggactgcct gagagcaacc acagcagcct gccttgtctg tccagcgata 1920
gccagctgcc acacatcaac ggctctgcca ttctgcctta tttccgggcc attagacccc 1980
tgagcgacaa gaacacaatc gataagatca tcgaacagct ggacaagctg aagttccaaa 2040
gagagcccga ggccaaggtg tccatgcccg ccgacaactt cgagcgcaag aacttcatcc 2100
tggctgtgct ccagcaattt agcgcctgcc tggaacacgt gctgcagagc ctgaacagcg 2160
gacctcaagc cggctctggt tttaacaact tcaccgtgtc cttctggctg agagtgccta 2220
aggtctctgc atctcatctg gaaggcagcg gcggccagta catcaaggcc aacagcaagt 2280
tcatcggcat caccgagctg caccaccacc accaccactg ataagcttaa gggttcgatc 2340
cctaccggtt agtaatgagt ttgatatctc gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt 2400
gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 2460
ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 2520
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 2580
gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 2640
ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 2700
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 2760
tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 2820
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 2880
ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 2940
tccctttggg ccgcctcccc gcctggaacg ggggaggcta actgaaacac ggaaggagac 3000
aataccggaa ggaacccgcg ctatgacggc aataaaaaga cagaataaaa cgcacgggtg 3060
ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc ggtcccaggg ctggcactct gtcgataccc 3120
caccgagacc ccattggggc caatacgccc gcgtttcttc cttttcccca ccccaccccc 3180
caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg ggcggcaggc cctgccatag 3240
cagatctgcg cagctggggc tctagggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa 3300
gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 3360
ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 3420
ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 3480
aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 3540
gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 3600
cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 3660
attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt 3720
gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat 3780
gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 3840
tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 3900
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt 3960
tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 4020
cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg 4080
atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 4140
aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 4200
cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 4260
caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 4320
gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 4380
ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 4440
tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 4500
tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 4560
agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 4620
actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 4680
cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 4740
tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 4800
tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 4860
cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg 4920
gggttcgcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 4980
ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 5040
tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag 5100
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 5160
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac 5220
cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 5280
gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 5340
gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 5400
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 5460
tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 5520
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 5580
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 5640
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 5700
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 5760
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 5820
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 5880
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 5940
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 6000
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 6060
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 6120
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 6180
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 6240
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 6300
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 6360
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 6420
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 6480
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 6540
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 6600
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 6660
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 6720
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 6780
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 6840
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 6900
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 6960
ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 7020
gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 7080
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 7140
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 7200
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 7260
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 7320
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 7380
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct 7440
atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc 7500
tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca 7560
aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct gcttagg 7597
<210> 63
<211> 6511
<212> DNA
<213> Felis catus
<220>
<223> SEQ ID NO: 63 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-fel-IL31 encoding the feline IL-31 protein construct of Example 3g.
<400> 63
gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta 60
ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 120
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 180
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 240
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 300
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 360
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 420
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 480
cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 540
caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 600
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg 660
agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgg 720
actctagagg atcgaaccct tgaattcccg ccgccaccat gggctggagc tgcatcatcc 780
tgttcctggt ggccaccgcc acaggcgtgc acagcgcccc tgcccacaga ctgcagccta 840
gcgacgtgcg caagatcatt ctggagctca gacctatgag caaaggactg ctgcaggact 900
acgtgtccaa ggaaatcggc ctgcctgaga gcaaccactc ttctctgcct tgtctgagca 960
gcgacagcca gctgccccac atcaacggct ccgctatcct tccctacttt agagccatcc 1020
ggccactgtc tgataagaac accatcgaca aaatcatcga gcagctggat aagctgaagt 1080
tccagcggga acctgaggcc aaggtcagca tgccagccga caacttcgag agaaagaatt 1140
tcatcctggc cgtgctgcaa cagttcagcg cttgcctgga acacgtgctg cagagcctga 1200
actccggccc ccagcaccac caccaccatc actgataagc ttaagggttc gatccctacc 1260
ggttagtaat gagtttgata tctcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 1320
ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 1380
cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 1440
tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 1500
actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 1560
tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 1620
gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 1680
aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 1740
tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 1800
ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 1860
tgggccgcct ccccgcctgg aacgggggag gctaactgaa acacggaagg agacaatacc 1920
ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg ggtgttgggt 1980
cgtttgttca taaacgcggg gttcggtccc agggctggca ctctgtcgat accccaccga 2040
gaccccattg gggccaatac gcccgcgttt cttccttttc cccaccccac cccccaagtt 2100
cgggtgaagg cccagggctc gcagccaacg tcggggcggc aggccctgcc atagcagatc 2160
tgcgcagctg gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 2220
cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 2280
ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa 2340
atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac 2400
ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt 2460
tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 2520
accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 2580
taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca 2640
gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 2700
caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca 2760
aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc 2820
cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta 2880
tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt 2940
tggaggccta ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggatctga 3000
tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 3060
tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 3120
ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 3180
cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 3240
cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 3300
gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 3360
gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 3420
cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 3480
tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 3540
cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 3600
ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 3660
gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 3720
gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 3780
gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 3840
gcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 3900
ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc 3960
agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata 4020
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 4080
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga 4140
cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 4200
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 4260
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 4320
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 4380
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4440
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 4500
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 4560
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 4620
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 4680
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 4740
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 4800
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 4860
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 4920
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 4980
agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 5040
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 5100
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5160
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5220
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 5280
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 5340
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 5400
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 5460
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 5520
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 5580
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 5640
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 5700
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 5760
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 5820
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 5880
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 5940
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 6000
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 6060
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 6120
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 6180
gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 6240
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 6300
ttccccgaaa agtgccacct gacgtcgacg gatcgggaga tctcccgatc ccctatggtg 6360
cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatctgc tccctgcttg 6420
tgtgttggag gtcgctgagt agtgcgcgag caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt 6480
gaccgacaat tgcatgaaga atctgcttag g 6511
<210> 64
<211> 157
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> SEQ ID NO: 64 is the amino acid sequence of bovine TNF-alpha.
<400> 64
Leu Arg Ser Ser Ser Gln Ala Ser Ser Asn Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asp Ile Asn Ser Pro Gly Gln Leu Arg Trp Trp Asp Ser Tyr
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Met Ala Asn Gly Val Lys Leu Glu Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr Pro Leu Phe Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Ile Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys His Arg Glu Thr Pro Glu Trp Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro Asp Tyr Leu Asp Tyr
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 65
<211> 586
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 65 is the amino acid sequence of the bovine TNF-alpha
polyprotein used for the immunization of Example 6f.
<400> 65
Met His His His His His His Leu Arg Ser Ser Ser Gln Ala Ser Ser
1 5 10 15
Asn Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asp Ile Asn Ser Pro Gly Gln
20 25 30
Leu Arg Trp Trp Asp Ser Tyr Ala Asn Ala Leu Met Ala Asn Gly Val
35 40 45
Lys Leu Glu Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu
50 55 60
Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Arg Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Phe Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr
85 90 95
Lys Val Asn Ile Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Arg Glu Thr
100 105 110
Pro Glu Trp Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Gln Gly
115 120 125
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
130 135 140
Leu Pro Asp Tyr Leu Asp Tyr Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly
145 150 155 160
Ile Ile Ala Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val
165 170 175
Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Ser Gly Leu Arg Ser Ser Ser Gln Ala Ser Ser Asn Lys
195 200 205
Pro Val Ala His Val Val Ala Asp Ile Asn Ser Pro Gly Gln Leu Arg
210 215 220
Trp Trp Asp Ser Tyr Ala Asn Ala Leu Met Ala Asn Gly Val Lys Leu
225 230 235 240
Glu Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr
245 250 255
Ser Gln Val Leu Phe Arg Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr Pro Leu Phe
260 265 270
Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
275 280 285
Asn Ile Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Arg Glu Thr Pro Glu
290 295 300
Trp Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Val
305 310 315 320
Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro
325 330 335
Asp Tyr Leu Asp Tyr Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile
340 345 350
Ala Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys
355 360 365
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Arg Ser
370 375 380
Ser Ser Gln Ala Ser Ser Asn Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asp
385 390 395 400
Ile Asn Ser Pro Gly Gln Leu Arg Trp Trp Asp Ser Tyr Ala Asn Ala
405 410 415
Leu Met Ala Asn Gly Val Lys Leu Glu Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
420 425 430
Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Arg Gly Gln
435 440 445
Gly Cys Pro Ser Thr Pro Leu Phe Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile
450 455 460
Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Ile Leu Ser Ala Ile Lys Ser
465 470 475 480
Pro Cys His Arg Glu Thr Pro Glu Trp Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
485 490 495
Glu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
500 505 510
Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro Asp Tyr Leu Asp Tyr Ala Glu Ser
515 520 525
Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser
530 535 540
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
545 550 555 560
Ala Ser His Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala
565 570 575
Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
580 585
<210> 66
<211> 7017
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 66 is the nucleic acid sequence of the bacterial
expression plasmid pET30a-bov-TNF-alpha-poly encoding the bovine
TNF-alpha polyprotein construct of Example 1h.
<400> 66
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagctttc 180
attacagctc ggtgatgccg ataaacttgc tattcgcctt gatgtattgg ccgccgccgc 240
taccaccctc caggtggctt gcgctaacct tcggcacacg taaccaaaag ctaacggtga 300
aattattgaa gctgccaccg ctgccaccca gagctataat accaaaataa acttggccgc 360
tttccgcgta gtccaggtaa tccggcaggt taatttccgc agataaacga tcacccttct 420
ccagctggaa aacgccaccc tgataaatcg gctcgtacca cggtttcgct tcagcccatt 480
ccggggtttc gcgatgacaa ggagatttga tcgcgctcag gatattcact ttagtctggt 540
agctcaccgc aatgcggcta atggtatgcg tcagaaacag cggggtacta ggacatccct 600
ggccgcgaaa cagaacttgg ctgtaaatca gatacaggcc gtctgccggc acaaccagct 660
ggttatcctc cagtttcaca ccgttcgcca ttaaagcatt cgcgtagctg tcccaccaac 720
gcagttggcc cgggctgtta atgtccgcaa caacatgcgc caccggtttg ttagagctcg 780
cctgagaact agagcgcagg ccaccgctgc caccgcccag ttcggtaata ccgataaatt 840
tgctgttcgc cttgatatat tgaccgccac cgctgccacc cagagcgata ataccaaaat 900
aaacctgacc gctctccgcg tagtccagat aatccggcag gttgatttcc gcgctcagac 960
ggtcaccttt ttccagttga aacacgccac cctggtaaat cggctcatac cacggtttcg 1020
cttccgccca ctccggggtt tcgcgatggc acgggctctt gatcgcgctc agaatattca 1080
ctttggtctg gtagctcacc gcgatgcggc taatggtatg agtcagaaac agcggggtag 1140
aaggacagcc ctggccgcga aacagcactt ggctgtaaat caggtacagg ccatcagccg 1200
gcacaaccag ctgattatcc tccagtttca cgccattcgc catcagcgca ttcgcgtagc 1260
tatcccacca acgcagctgg cccgggctgt tgatgtccgc aaccacgtgc gcaaccggtt 1320
tgttgctgct cgcctggcta gaagagcgca ggccgctgcc accgctacct tccagatggc 1380
tcgcgctaac cttcggcaca cgcagccaaa agctaacggt aaagttgttg aagctgccac 1440
cgctgccacc cagcgcaatg atgccgaagt acacctgacc gctctccgca taatccaggt 1500
agtccggcag gttaatctcc gcgctcagac gatcaccttt ttccagttgg aacacgccac 1560
cctgatagat cggttcgtac cacggcttcg cctccgccca ttccggggtt tcacggtggc 1620
acgggctttt aatcgcgctc aggatgttaa ccttggtttg atagctcacc gcaatacggc 1680
tgatggtgtg ggtcagaaac agcggggtgc tcgggcaacc ttgaccacga aacagaacct 1740
ggctatagat caggtacagg ccatccgccg gcacaaccag ctggttgtct tccagcttca 1800
caccgttcgc catcagcgcg ttcgcgtagc tgtcccacca acgcagttga cccgggctat 1860
tgatgtccgc cactacgtga gctacgggtt tatttgaact agcttgtgaa cttgacctta 1920
ggtggtgatg gtgatgatgc atatgtatat ctccttctta aagttaaaca aaattatttc 1980
tagaggggaa ttgttatccg ctcacaattc ccctatagtg agtcgtatta atttcgcggg 2040
atcgagatcg atctcgatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 2100
aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 2160
cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg 2220
actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct 2280
caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgagatcc 2340
cggacaccat cgaatggcgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga 2400
gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg 2460
gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 2520
cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac 2580
aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc 2640
acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg 2700
tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc 2760
ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca 2820
ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga 2880
cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc 2940
tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg 3000
cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag 3060
cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga 3120
atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa 3180
tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga catctcggta gtgggatacg 3240
acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc 3300
gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 3360
agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata 3420
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 3480
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagct cactcattag 3540
gcaccgggat ctcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg 3600
gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta 3660
ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg 3720
acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc 3780
gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg 3840
gccccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt 3900
tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc 3960
tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa 4020
agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc accattatgt tccggatctg catcgcagga 4080
tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc 4140
tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt 4200
tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc 4260
atcggtatca ttacccccat gaacagaaat cccccttaca cggaggcatc agtgaccaaa 4320
caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg 4380
gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac 4440
cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 4500
tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 4560
caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 4620
tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 4680
tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg 4740
catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 4800
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 4860
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 4920
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 4980
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 5040
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 5100
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 5160
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 5220
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 5280
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 5340
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 5400
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 5460
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 5520
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 5580
agggattttg gtcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg 5640
ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctctaggcc gcgattaaat tccaacatgg 5700
atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 5760
tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta 5820
gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc 5880
ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg 5940
cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata 6000
ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc 6060
cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt 6120
tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga 6180
aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct 6240
cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag 6300
tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt 6360
ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata 6420
aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaaga attaattcat gagcggatac 6480
atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 6540
gtgccacctg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 6600
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 6660
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 6720
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 6780
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 6840
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 6900
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 6960
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgcca 7017
<210> 67
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 67 is the amino acid sequence of the artificial ER
import signal used for mammalian expression in the given
examples.
<400> 67
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 68
<211> 138
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Pig IL-31 protein.
<400> 68
Met Ala Pro Thr Ser Val Pro Ser Pro Glu Glu Gln Lys Gly Ile Ile
1 5 10 15
Lys Glu Leu Gln Ala Ser Val Lys Lys Val Leu Lys Asp Tyr Glu Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Gly Val Gln Glu Gln Glu Arg Phe Gln Ile Pro Cys Leu
35 40 45
Thr Phe Asn Pro Gln Ser Pro His Asn Ile Glu Ser Ser Ala Ile Leu
50 55 60
Pro Tyr Leu Arg Ala Ile Lys Arg Ser Phe Asp Asn Asp Asp Asp Ile
65 70 75 80
Ile Asp Ile Ile Asn His Leu His Lys Leu Lys Phe Gln Gln Gly Pro
85 90 95
Glu Thr Thr Val Pro Val Pro Thr Asn Ser Phe Glu Gly Lys Ser Phe
100 105 110
Thr Leu Ser Ile Leu Lys Ala Phe Ser Lys Cys Leu Thr Ser Asp Phe
115 120 125
Asn Ser His Asp Pro Arg Arg Gly Gln Ser
130 135
<210> 69
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-31 protein.
<400> 69
Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln
1 5 10 15
Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp
20 25 30
Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro
35 40 45
Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro Asn Asn Ile His Ser Pro Ala
50 55 60
Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val
65 70 75 80
Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala
85 90 95
Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr Asp Thr His Glu Cys Lys Arg
100 105 110
Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala
115 120 125
Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln Gln Ala Thr Thr
130 135 140
<210> 70
<211> 109
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-4 protein.
<400> 70
Gln Asn Phe Asn Asn Thr Leu Lys Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Arg Asn Asp Ser Cys Met Glu Leu Thr Val Met Asp Val
20 25 30
Leu Ala Ala Pro Lys Asn Thr Ser Asp Lys Glu Ile Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Thr Thr Val Leu Arg Gln Ile Tyr Thr His His Asn Cys Ser Thr Lys
50 55 60
Phe Leu Lys Gly Leu Asp Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn Arg Thr
65 70 75 80
Cys Ser Val Asn Glu Val Lys Lys Cys Thr Leu Lys Asp Phe Leu Glu
85 90 95
Arg Leu Lys Ala Ile Met Gln Lys Lys Tyr Ser Lys His
100 105
<210> 71
<211> 109
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Pig IL-4 protein.
<400> 71
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Arg Lys Asn Ser Cys Met Glu Leu Pro Val Thr Asp Val
20 25 30
Phe Ala Ala Pro Glu Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Ser Thr Val Leu Arg His Ile Tyr Arg His His Thr Cys Met Lys Ser
50 55 60
Leu Leu Ser Gly Leu Asp Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn Met Thr
65 70 75 80
Cys Ser Val His Glu Ala Lys Lys Ser Thr Leu Lys Asp Phe Leu Glu
85 90 95
Arg Leu Lys Thr Ile Met Lys Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
100 105
<210> 72
<211> 116
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Chicken IL-4 protein.
<400> 72
Val Pro Met Leu Cys Leu Gln Leu Ser Val Pro Leu Met Glu Ser Ile
1 5 10 15
Arg Ile Val Asn Asp Ile Gln Gly Glu Val Ser Cys Val Lys Met Asn
20 25 30
Val Thr Asp Ile Phe Ala Asp Asn Lys Thr Asn Asn Lys Thr Glu Leu
35 40 45
Leu Cys Lys Ala Ser Thr Ile Val Trp Glu Ser Gln His Cys His Lys
50 55 60
Asn Leu Gln Gly Leu Phe Leu Asn Met Arg Gln Leu Leu Asn Ala Ser
65 70 75 80
Ser Thr Ser Leu Lys Ala Pro Cys Pro Thr Ala Ala Gly Asn Thr Thr
85 90 95
Ser Met Glu Lys Phe Leu Ala Asp Leu Arg Thr Phe Phe His Gln Leu
100 105 110
Ala Lys Asn Lys
115
<210> 73
<211> 111
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine IL-4 protein.
<400> 73
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Ala Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ile
1 5 10 15
Leu Thr Thr Arg Lys Asn Ser Cys Met Glu Leu Pro Val Ala Asp Val
20 25 30
Phe Ala Ala Pro Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Val
35 40 45
Gly Ile Glu Leu Arg Arg Ile Tyr Arg Ser His Thr Cys Leu Asn Lys
50 55 60
Phe Leu Gly Gly Leu Asp Arg Asn Leu Asn Ser Leu Ala Ser Lys Thr
65 70 75 80
Cys Ser Val Asn Glu Ala Lys Thr Ser Thr Ser Thr Leu Lys Asp Leu
85 90 95
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Lys Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
100 105 110
<210> 74
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-4 Isoform 1 protein.
<400> 74
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile
20 25 30
Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg
50 55 60
Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile
65 70 75 80
Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser
115 120 125
Ser
<210> 75
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-4 Isoform 2 protein.
<400> 75
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
20 25 30
Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg
35 40 45
Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile
50 55 60
Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu
65 70 75 80
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe
85 90 95
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser
100 105 110
Ser
<210> 76
<211> 115
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-5 protein.
<400> 76
Ile Ala Val Gln Ser Pro Met Asn Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met
20 25 30
Ile Pro Thr Pro Glu His Asn Asn His Gln Leu Cys Ile Glu Glu Val
35 40 45
Phe Gln Gly Ile Asp Thr Leu Lys Asn Arg Thr Val Pro Gly Asp Ala
50 55 60
Val Glu Lys Leu Phe Arg Asn Leu Ser Leu Ile Lys Glu His Ile Asp
65 70 75 80
Arg Gln Lys Lys Lys Cys Gly Gly Glu Arg Trp Arg Val Lys Lys Phe
85 90 95
Leu Asp Tyr Leu Gln Val Phe Leu Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr
100 105 110
Met Glu Ser
115
<210> 77
<211> 113
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Pig IL-5 protein.
<400> 77
Val Glu Asn Thr Met Asn Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ile His Arg Thr Leu Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met Ile Ser
20 25 30
Thr Pro Val His Thr Asn His Gln Leu Cys Ile Glu Glu Val Phe Gln
35 40 45
Gly Ile Asp Thr Leu Lys Asn Gln Thr Ala Arg Gly Asp Ala Val Glu
50 55 60
Lys Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Glu Tyr Ile Asp Arg Gln
65 70 75 80
Lys Lys Asn Cys Gly Gly Glu Arg Trp Arg Val Thr Gln Phe Leu Asp
85 90 95
Tyr Leu Gln Val Phe Leu Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr Met Glu
100 105 110
Ser
<210> 78
<211> 110
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Chicken IL-5, 126 aa protein.
<400> 78
Thr Pro Leu Arg Ser Asn Leu Ala Glu Leu Gln Thr Trp Leu Gln Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ser Val Asp Met Leu Asn Leu Arg Ile Glu Thr Pro Val
20 25 30
Ser Ala Asp Asp Glu Asn Cys Ile Lys Thr Leu Phe Glu Gly Thr Ala
35 40 45
Leu Leu Lys Asn Asn Pro Glu Met Arg Arg Phe Gly Thr Phe Phe Gln
50 55 60
Ser Phe Asp Lys Leu Arg Pro Ser Leu Thr Ala Gln Leu Thr Gly Glu
65 70 75 80
Gly Glu Cys Asp Thr Glu Arg Lys Asn Val Lys Lys Phe Ile Glu Lys
85 90 95
Leu Arg Thr Phe Ile Arg Lys Leu Ser Arg Asp Ala Arg Val
100 105 110
<210> 79
<211> 120
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Chicken IL-5, 136 aa protein.
<400> 79
Thr Pro Leu Arg Ser Asn Leu Ala Glu Leu Gln Thr Trp Leu Gln Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ser Val Asp Met Leu Val Ser Ser Ile Phe Tyr Phe Cys
20 25 30
Ser Met Asn Leu Arg Ile Glu Thr Pro Val Ser Ala Asp Asp Glu Asn
35 40 45
Cys Ile Lys Thr Leu Phe Glu Gly Thr Ala Leu Leu Lys Asn Asn Pro
50 55 60
Glu Met Arg Arg Phe Gly Thr Phe Phe Gln Ser Phe Asp Lys Leu Arg
65 70 75 80
Pro Ser Leu Thr Ala Gln Leu Thr Gly Glu Gly Glu Cys Asp Thr Glu
85 90 95
Arg Lys Asn Val Lys Lys Phe Ile Glu Lys Leu Arg Thr Phe Ile Arg
100 105 110
Lys Leu Ser Arg Asp Ala Arg Val
115 120
<210> 80
<211> 113
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine IL-5 protein.
<400> 80
Val Glu Ser Thr Met Asn Arg Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ser His Arg Thr Leu Leu Ile Gly Asp Gly Asn Leu Met Ile Pro
20 25 30
Thr Pro Gln His Thr Asn His Gln Leu Cys Ile Glu Glu Val Phe Gln
35 40 45
Gly Ile Asp Thr Leu Lys Asn Gln Thr Ala Gln Gly Asp Ala Val Lys
50 55 60
Lys Ile Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Glu Tyr Ile Asp Leu Gln
65 70 75 80
Lys Arg Lys Cys Gly Gly Glu Arg Trp Arg Val Lys Gln Phe Leu Asp
85 90 95
Tyr Leu Gln Val Phe Leu Gly Val Ile Asn Thr Glu Trp Thr Met Glu
100 105 110
Ser
<210> 81
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-5 protein.
<400> 81
Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
35 40 45
Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
50 55 60
Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp
65 70 75 80
Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe
85 90 95
Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile
100 105 110
Ile Glu Ser
115
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-13 protein.
<400> 82
Ser Pro Gly Pro His Ser Arg Arg Glu Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Val Ser Leu Cys Asn Gly Ser Met
20 25 30
Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Thr Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Thr Ala Ile Gln Arg Thr Gln Arg
50 55 60
Met Leu Lys Ala Leu Cys Thr Gln Lys Pro Ser Ala Gly Gln Thr Ala
65 70 75 80
Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ile Gln Leu Val Lys
85 90 95
Asn Leu Leu Asn His Leu Arg Arg Asn Phe Arg His Gly Asn Phe Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 113
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Pig IL-13 protein.
<400> 83
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro His Ser Thr Ala Leu Lys Glu Leu Ile
1 5 10 15
Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Thr Pro Leu Cys Asn
20 25 30
Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Thr Ser Met Gln Tyr Cys
35 40 45
Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Ile Ser Asp Cys Ser Ala Ile Gln
50 55 60
Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Ala Leu Cys Ser His Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Glu Gln Val Pro Gly Lys His Ile Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala
85 90 95
Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Lys His Leu Arg Met Ile Phe Arg His
100 105 110
Gly
<210> 84
<211> 101
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Chicken IL-13 protein.
<400> 84
Thr Pro Leu Ala Met Asn Leu Ser Lys Leu Lys Leu Ser Asp Ile Thr
1 5 10 15
Gln Gly Ile Gln Lys Leu Asn Arg Gly Val Gln Leu Ser Glu Gln Glu
20 25 30
Leu Leu Cys Gln Ala Ala Thr Val Leu Asp Asn Met Thr Asp Cys Lys
35 40 45
Lys Asp Tyr Glu Pro Leu Ile Thr Ser Leu Lys Ser Leu His Gly Met
50 55 60
Thr Asn Cys Pro Pro Ser Thr Asp Asn Glu Ile Tyr Leu Arg Asn Phe
65 70 75 80
Leu Pro Ala Leu Gly Asn Tyr Thr Gln Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Ser
85 90 95
Ala Thr Ala Ala Asn
100
<210> 85
<211> 114
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine IL-13 protein.
<400> 85
Ser Pro Ser Pro Val Pro Ser Ala Thr Ala Leu Lys Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Val Pro Leu Cys Asn Gly
20 25 30
Ser Met Val Trp Ser Leu Asn Leu Thr Ser Ser Met Tyr Cys Ala Ala
35 40 45
Leu Asp Ser Leu Ile Ser Ile Ser Asn Cys Ser Val Ile Gln Arg Thr
50 55 60
Lys Arg Met Leu Asn Ala Leu Cys Pro His Lys Pro Ser Ala Lys Gln
65 70 75 80
Val Ser Ser Glu Tyr Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Lys Asp Leu Leu Arg His Ser Arg Ile Val Phe Arg Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Asn
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-13 protein.
<400> 86
Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser
1 5 10 15
Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn
20 25 30
Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu
35 40 45
Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser
50 55 60
Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys
65 70 75 80
Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp
85 90 95
Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu
100 105 110
Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
115 120
<210> 87
<211> 246
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-33 canonical isoform protein.
<400> 87
Met Lys Thr Lys Met Glu Tyr Ser Thr Thr Lys Ile Ser Pro Ala Lys
1 5 10 15
Met Asn Ser Ser Ala Gly Lys Ala Leu Val Lys Ser Pro Lys Leu Gly
20 25 30
Lys Ser Gln Gln Lys Ala Glu Glu Val Cys Gln Met Tyr Phe Met Gln
35 40 45
Leu Arg Ser Gly Leu Ile Lys Lys Thr Ala Cys Tyr Phe Lys Lys Glu
50 55 60
Thr Thr Lys Arg His Ser Thr Arg Arg Ala Gly Lys Tyr Lys Glu His
65 70 75 80
Leu Val Phe Thr Ala Arg His Gln Gln Leu Glu Arg Pro Val Glu Gly
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Val Pro Met Val Gln Lys Cys Phe Gly Thr Thr Asp
100 105 110
Val Pro Ser Ile Gln Glu Tyr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp
115 120 125
Gln Ser Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val
130 135 140
Glu Asp Leu Gly Lys Asp Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Phe Arg Tyr
145 150 155 160
Tyr Asp Phe Gln Ser Pro Ser Arg Glu Thr Gly Asp Ala Asp Asp Gly
165 170 175
His Thr Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu
180 185 190
Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Cys Lys
195 200 205
Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Arg Leu His Arg Lys Ser Ser
210 215 220
Lys Cys Val Ser Phe Glu Cys Arg Pro Ala Pro Pro Phe Pro Pro Asp
225 230 235 240
Leu Arg Ile Leu Gly Arg
245
<210> 88
<211> 117
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of alternative form of Cat IL-33 canonical isoform protein.
<400> 88
Ser Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu
1 5 10 15
Asp Leu Gly Lys Asp Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Phe Arg Tyr Tyr
20 25 30
Asp Phe Gln Ser Pro Ser Arg Glu Thr Gly Asp Ala Asp Asp Gly His
35 40 45
Thr Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu
50 55 60
His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Cys Lys Lys
65 70 75 80
Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Arg Leu His Arg Lys Ser Ser Lys
85 90 95
Cys Val Ser Phe Glu Cys Arg Pro Ala Pro Pro Phe Pro Pro Asp Leu
100 105 110
Arg Ile Leu Gly Arg
115
<210> 89
<211> 268
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-33 Isoform 268 aa protein.
<400> 89
Met Lys Thr Lys Met Glu Tyr Ser Thr Thr Lys Ile Ser Pro Ala Lys
1 5 10 15
Met Asn Ser Ser Ala Gly Lys Ala Leu Val Lys Ser Pro Lys Leu Gly
20 25 30
Lys Ser Gln Gln Lys Ala Glu Glu Val Cys Gln Met Tyr Phe Met Gln
35 40 45
Leu Arg Ser Gly Leu Ile Lys Lys Thr Ala Cys Tyr Phe Lys Lys Glu
50 55 60
Thr Thr Lys Arg His Ser Thr Arg Arg Ala Gly Lys Tyr Lys Glu His
65 70 75 80
Leu Val Phe Thr Ala Arg His Gln Gln Leu Glu Arg Pro Val Glu Gly
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Val Pro Met Val Gln Lys Cys Phe Gly Thr Thr Asp
100 105 110
Val Pro Ser Ile Gln Glu Tyr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp
115 120 125
Gln Ser Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val
130 135 140
Glu Asp Leu Gly Lys Asp Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Phe Arg Tyr
145 150 155 160
Tyr Asp Phe Gln Ser Pro Ser Arg Glu Thr Gly Asp Ala Asp Asp Gly
165 170 175
His Thr Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu
180 185 190
Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Cys Lys
195 200 205
Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Arg Leu His Arg Lys Ser Ser
210 215 220
Lys Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Asn Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly
225 230 235 240
Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Glu Asp Gln Thr Glu
245 250 255
Tyr Phe Ser Thr Glu Asn Ile Ile Phe Lys Leu Ser
260 265
<210> 90
<211> 139
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of alternative fomr of Cat IL-33 Isoform 268 aa protein.
<400> 90
Ser Ile Thr Phe Val Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu
1 5 10 15
Asp Leu Gly Lys Asp Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Phe Arg Tyr Tyr
20 25 30
Asp Phe Gln Ser Pro Ser Arg Glu Thr Gly Asp Ala Asp Asp Gly His
35 40 45
Thr Leu Leu Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu
50 55 60
His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Cys Lys Lys
65 70 75 80
Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Arg Leu His Arg Lys Ser Ser Lys
85 90 95
Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Asn Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val
100 105 110
Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Glu Asp Gln Thr Glu Tyr
115 120 125
Phe Ser Thr Glu Asn Ile Ile Phe Lys Leu Ser
130 135
<210> 91
<211> 276
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Pig IL-33 (K7GS29) protein.
<400> 91
Met Lys Pro Glu Val Lys Tyr Ser Thr Thr Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Met Asn Ser Ser Ala Gly Lys Val Ser Ile Lys Ser Pro Lys Leu Arg
20 25 30
Lys Ser Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Gln Met Tyr Phe Met Gln
35 40 45
Leu Arg Ser Gly Leu Ile Ile Glu Lys Lys Ala Cys Tyr Phe Gly Lys
50 55 60
Glu Thr Thr Lys Arg His Ser Pro Thr Lys Gly Lys Lys Cys Lys Lys
65 70 75 80
Gln Pro Leu Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Leu Gly His Leu Glu
85 90 95
Arg Ser Val Glu Gly Phe Thr Phe Thr Asn Thr Met Val Gln Lys Tyr
100 105 110
Thr Thr Ala Thr Asn Leu Leu Ser Ile Lys Glu His Ser Ala Ser Leu
115 120 125
Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Tyr Ile Thr Phe Ala Phe Glu Asp Gly Ser
130 135 140
Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Arg Lys Asp Gln Glu Lys Asp Lys
145 150 155 160
Val Leu Leu Arg Tyr Tyr Asp Ser Gln Ile Pro Ser Ser Glu Thr Asp
165 170 175
Gly Gly Gly Asp His Arg Lys Leu Met Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys
180 185 190
Asp Lys Asp Phe Leu Leu His Ala Asn Ser Lys Glu His Ser Val Glu
195 200 205
Leu Gln Lys Cys Glu Asn Pro Leu Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu
210 215 220
His Glu Gln Pro Ser Lys Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Ser His Pro
225 230 235 240
Gly Val Phe Leu Gly Val Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Ile Lys Leu
245 250 255
Gly Glu His Pro Glu Asp Ser Asn Arg Glu Asn Thr Thr Phe Lys Leu
260 265 270
Ser Asn Leu Met
275
<210> 92
<211> 142
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Pig IL-33 thought to be the probable mature sequence of K7GS29.
<400> 92
Tyr Ile Thr Phe Ala Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu
1 5 10 15
Asp Leu Arg Lys Asp Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Leu Arg Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ser Gln Ile Pro Ser Ser Glu Thr Asp Gly Gly Gly Asp His Arg
35 40 45
Lys Leu Met Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Leu Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu His Glu Gln Pro Ser Lys
85 90 95
Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Ser His Pro Gly Val Phe Leu Gly Val
100 105 110
Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Ile Lys Leu Gly Glu His Pro Glu Asp
115 120 125
Ser Asn Arg Glu Asn Thr Thr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Met
130 135 140
<210> 93
<211> 259
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<223> This is another amino acid sequence of Pig IL-33 (K7GRC7).
<400> 93
Met Lys Pro Glu Val Lys Tyr Ser Thr Thr Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Met Asn Ser Ser Ala Gly Lys Val Ser Ile Lys Ser Pro Lys Leu Arg
20 25 30
Lys Ser Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Gln Met Tyr Phe Met Gln
35 40 45
Leu Arg Ser Gly Leu Ile Ile Glu Lys Lys Ala Cys Tyr Phe Gly Lys
50 55 60
Glu Thr Thr Lys Arg His Ser Pro Thr Lys Gly Lys Lys Cys Lys Lys
65 70 75 80
Gln Pro Leu Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Leu Gly His Leu Glu
85 90 95
Arg Ser Val Glu Gly Phe Thr Phe Thr Asn Thr Met Val Gln Lys Tyr
100 105 110
Thr Thr Ala Thr Asn Leu Leu Ser Ile Lys Glu His Ser Ala Ser Leu
115 120 125
Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Tyr Ile Thr Phe Ala Phe Glu Asp Gly Ser
130 135 140
Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Arg Lys Asp Gln Glu Lys Asp Gly
145 150 155 160
Gly Gly Asp His Arg Lys Leu Met Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp
165 170 175
Lys Asp Phe Leu Leu His Ala Asn Ser Lys Glu His Ser Val Glu Leu
180 185 190
Gln Lys Cys Glu Asn Pro Leu Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu His
195 200 205
Glu Gln Pro Ser Lys Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Ser His Pro Gly
210 215 220
Val Phe Leu Gly Val Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Ile Lys Leu Gly
225 230 235 240
Glu His Pro Glu Asp Ser Asn Arg Glu Asn Thr Thr Phe Lys Leu Ser
245 250 255
Asn Leu Met
<210> 94
<211> 125
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<223> This is another amino acid sequence of Pig IL-33 thought to be the probable mature sequence of K7GRC7.
<400> 94
Tyr Ile Thr Phe Ala Phe Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu
1 5 10 15
Asp Leu Arg Lys Asp Gln Glu Lys Asp Gly Gly Gly Asp His Arg Lys
20 25 30
Leu Met Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu His
35 40 45
Ala Asn Ser Lys Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Cys Glu Asn Pro
50 55 60
Leu Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu His Glu Gln Pro Ser Lys Cys
65 70 75 80
Val Ser Phe Glu Cys Lys Ser His Pro Gly Val Phe Leu Gly Val Lys
85 90 95
Asn Asn Gln Leu Ala Leu Ile Lys Leu Gly Glu His Pro Glu Asp Ser
100 105 110
Asn Arg Glu Asn Thr Thr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Met
115 120 125
<210> 95
<211> 273
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine IL-33.
<400> 95
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Thr Lys Ile Ser Pro Ala Lys
1 5 10 15
Met Lys Cys Ser Ala Gly Lys Ala Leu Val Lys Ser Pro Lys Leu Arg
20 25 30
Lys Ser Gln Gln Lys Ala Glu Glu Val Cys Gln Ile Tyr Tyr Met Gln
35 40 45
Leu Arg Ser Gly Leu Lys Ile Glu Lys Lys Val Cys Tyr Phe Arg Lys
50 55 60
Glu Thr Thr Lys Arg His Ser Leu Thr Ala Glu Lys Tyr Lys Glu His
65 70 75 80
Leu Ala Leu Val Ala Cys Glu Gln Leu Asn His Leu Gln Gln Ser Val
85 90 95
Glu Gln Gly Phe Thr Leu Gly Lys Thr Met Val Pro Tyr Thr Thr Ala
100 105 110
Thr Gly Leu Pro Ser Ile Lys Glu His Ser Ala Ser Leu Ser Thr Tyr
115 120 125
Asn Asp Gln Phe Ile Thr Phe Val Leu Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile
130 135 140
Tyr Val Glu Asp Leu Ile Asp Asn Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Leu
145 150 155 160
Arg Tyr Tyr Asp Ser Gln Phe Pro Ser Ser Glu Thr Asp Asp Gly Gly
165 170 175
Ser His Arg Lys Leu Met Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp
180 185 190
Phe Leu Leu His Ala Asn Ser Lys Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys
195 200 205
Cys Glu Asn Gln Leu Pro Glu Gln Thr Phe Phe Val Leu His Glu Thr
210 215 220
Ser Ser Gln Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Ser Asn Pro Gly Val Phe
225 230 235 240
Leu Gly Val Lys Asp Asn Gln Leu Ala Leu Ile Lys Arg Gly Glu His
245 250 255
Pro Glu Asp Ser Asn Ser Gln Asn Ile Thr Phe Lys Leu Ser Asn Leu
260 265 270
Met
<210> 96
<211> 142
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of the probable mature sequence of Bovine IL-33.
<400> 96
Phe Ile Thr Phe Val Leu Glu Asp Gly Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu
1 5 10 15
Asp Leu Ile Asp Asn Gln Glu Lys Asp Lys Val Leu Leu Arg Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ser Gln Phe Pro Ser Ser Glu Thr Asp Asp Gly Gly Ser His Arg
35 40 45
Lys Leu Met Val Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Asp Phe Leu Leu
50 55 60
His Ala Asn Ser Lys Glu His Ser Val Glu Leu Gln Lys Cys Glu Asn
65 70 75 80
Gln Leu Pro Glu Gln Thr Phe Phe Val Leu His Glu Thr Ser Ser Gln
85 90 95
Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Ser Asn Pro Gly Val Phe Leu Gly Val
100 105 110
Lys Asp Asn Gln Leu Ala Leu Ile Lys Arg Gly Glu His Pro Glu Asp
115 120 125
Ser Asn Ser Gln Asn Ile Thr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Met
130 135 140
<210> 97
<211> 270
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-33 - Full length (1-270).
<400> 97
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr
50 55 60
Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu
65 70 75 80
Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe
85 90 95
Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser
100 105 110
Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr
115 120 125
Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu
130 135 140
Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu
145 150 155 160
Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly
165 170 175
Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe
180 185 190
Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys
195 200 205
Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His
210 215 220
Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile
225 230 235 240
Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu
245 250 255
Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
260 265 270
<210> 98
<211> 176
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-33 - Chain 1(95-270).
<400> 98
Ala Phe Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu
20 25 30
Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser
35 40 45
Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys
50 55 60
Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly
65 70 75 80
Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys
85 90 95
Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His
100 105 110
Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn
115 120 125
Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val
130 135 140
Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser
145 150 155 160
Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
165 170 175
<210> 99
<211> 172
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-33 - Chain 2(99-270).
<400> 99
Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser Ile Thr
1 5 10 15
Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn
20 25 30
Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr
35 40 45
Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser
50 55 60
Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp
65 70 75 80
Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu
85 90 95
His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys
100 105 110
Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn
115 120 125
Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val
130 135 140
Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu
145 150 155 160
Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
165 170
<210> 100
<211> 162
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-33 - Chain 3 (109-270).
<400> 100
His Asp Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala
1 5 10 15
Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp
20 25 30
Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys
35 40 45
Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu
50 55 60
Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro
65 70 75 80
Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu
85 90 95
Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu
100 105 110
His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro
115 120 125
Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val
130 135 140
Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser
145 150 155 160
Glu Thr
<210> 101
<211> 157
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canine TNF-alpha protein.
<400> 101
Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Ser Arg Arg
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Thr Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Ile Val Pro Ser Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Thr Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro Asn Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 102
<211> 157
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Feline TNF-alpha protein.
<400> 102
Leu Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Ser Arg Arg
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Thr Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Lys Val Pro Ser Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Thr Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Thr Glu Ile Asn Leu Pro Ala Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 103
<211> 153
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine IL1-beta protein.
<400> 103
Ala Pro Val Gln Ser Ile Lys Cys Lys Leu Gln Asp Arg Glu Gln Lys
1 5 10 15
Ser Leu Val Leu Ala Ser Pro Cys Val Leu Lys Ala Leu His Leu Leu
20 25 30
Ser Gln Glu Met Asn Arg Glu Val Val Phe Cys Met Ser Phe Val Gln
35 40 45
Gly Glu Glu Arg Asp Asn Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile Lys Asp
50 55 60
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Lys Lys Gly Asp Thr Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Glu Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Asn Met Glu
85 90 95
Lys Arg Phe Val Phe Tyr Lys Thr Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe
100 105 110
Glu Ser Val Leu Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ile Glu
115 120 125
Glu Arg Pro Val Phe Leu Gly His Phe Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr
130 135 140
Asp Phe Arg Met Glu Thr Leu Ser Pro
145 150
<210> 104
<211> 152
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canine IL1-beta protein.
<400> 104
Ala Ala Met Gln Ser Val Asp Cys Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys
1 5 10 15
Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn
20 25 30
Gly Glu Asn Val Asn Lys Gln Val Val Phe His Met Ser Phe Val His
35 40 45
Gly Asp Glu Ser Asn Asn Lys Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln
50 55 60
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu
85 90 95
Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe
100 105 110
Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu
115 120 125
Gly Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr
130 135 140
Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser Ser
145 150
<210> 105
<211> 152
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Feline IL1-beta protein.
<400> 105
Ala Ala Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Thr Phe Arg Asp Ile Ser Gln Lys
1 5 10 15
Ser Leu Val Leu Ser Gly Ser Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn
20 25 30
Gly Gln Asn Met Asn Gln Gln Val Val Phe Arg Met Ser Phe Val His
35 40 45
Gly Glu Glu Asn Ser Lys Lys Ile Pro Val Val Leu Cys Ile Lys Lys
50 55 60
Asn Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Met Leu Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu
85 90 95
Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Thr Glu Ile Lys Gly Asn Val Glu Phe
100 105 110
Glu Ser Ser Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu
115 120 125
Glu Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr
130 135 140
Asp Phe Ile Met Glu Ser Ala Ser
145 150
<210> 106
<211> 135
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-2 protein.
<400> 106
Ala Pro Ile Thr Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr Glu Gln Gln Met Glu
1 5 10 15
Gln Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu Asn Gly Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Glu Asn Pro Gln Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Thr Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Phe Thr His Leu Gln Cys Leu Ala Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Asn Leu Glu Glu Val Leu Gly Leu Pro Gln Ser Lys Asn Val His
65 70 75 80
Leu Thr Asp Thr Lys Glu Leu Ile Ser Asn Met Asn Val Thr Leu Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Tyr Asn Cys Glu Tyr Asp Asp Glu
100 105 110
Thr Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile Thr Phe Cys Gln
115 120 125
Ser Ile Phe Ser Thr Leu Thr
130 135
<210> 107
<211> 134
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-2 protein.
<400> 107
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr Gln Gln Gln Leu Glu Gln
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Leu Leu Asn Gly Val Asn Asn Pro Glu
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Val Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Thr His Leu Gln Cys Leu Val Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Asn His Ile Lys Glu Leu Met Ser Asn Ile Asn Val Thr Val Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Arg Phe Thr Cys Asn Tyr Asp Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Phe Ser Thr Leu Thr
130
<210> 108
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-2 protein.
<400> 108
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-3 protein.
<400> 109
Arg Pro Phe Ser Thr Asp Leu Pro Lys Gln Tyr Phe Thr Met Ile Asn
1 5 10 15
Glu Ile Met Glu Met Leu Asn Lys Ser Pro Ser Pro Ser Glu Glu Pro
20 25 30
Leu Asp Ser Asn Glu Lys Glu Thr Leu Leu Glu Asp Thr Leu Leu Arg
35 40 45
Pro Asn Leu Asp Val Phe Leu Asn Ala Ser Ser Lys Phe His Lys Asn
50 55 60
Gly Leu Leu Ile Trp Asn Asn Leu Lys Glu Phe Leu Pro Leu Leu Pro
65 70 75 80
Thr Pro Thr Pro Arg Gly Glu Pro Ile Ser Ile Met Glu Asn Asn Trp
85 90 95
Gly Asp Phe Gln Arg Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Glu Ala Leu Asp Asn
100 105 110
Phe Leu Asn Phe Lys Asn Lys Pro
115 120
<210> 110
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-3 protein.
<400> 110
Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys
1 5 10 15
Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln Pro Pro Leu
20 25 30
Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln Asp Ile Leu
35 40 45
Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe Asn Arg Ala
50 55 60
Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile Leu Lys Asn
65 70 75 80
Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro
85 90 95
Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr
100 105 110
Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln Thr Thr Leu
115 120 125
Ser Leu Ala Ile Phe
130
<210> 111
<211> 187
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-6 protein.
<400> 111
Phe Pro Thr Pro Gly Pro Leu Ala Gly Asp Ser Lys Asp Asp Ala Thr
1 5 10 15
Ser Asn Ser Leu Pro Leu Thr Ser Ala Asn Lys Val Glu Glu Leu Ile
20 25 30
Lys Tyr Ile Leu Gly Lys Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Met Cys Asp
35 40 45
Lys Phe Asn Lys Cys Glu Asp Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn
50 55 60
Leu His Leu Pro Lys Leu Glu Gly Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly
65 70 75 80
Phe Asn Gln Glu Thr Cys Leu Thr Arg Ile Thr Thr Gly Leu Val Glu
85 90 95
Phe Gln Leu His Leu Asn Ile Leu Gln Asn Asn Tyr Glu Gly Asp Lys
100 105 110
Glu Asn Val Lys Ser Val His Met Ser Thr Lys Ile Leu Val Gln Met
115 120 125
Leu Lys Ser Lys Val Lys Asn Gln Asp Glu Val Thr Thr Pro Asp Pro
130 135 140
Thr Thr Asp Ala Ser Leu Gln Ala Ile Leu Gln Ser Gln Asp Glu Cys
145 150 155 160
Val Lys His Thr Thr Ile His Leu Ile Leu Arg Ser Leu Glu Asp Phe
165 170 175
Leu Gln Phe Ser Leu Arg Ala Val Arg Ile Met
180 185
<210> 112
<211> 181
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-6 protein.
<400> 112
Thr Pro Gly Pro Leu Gly Gly Asp Ala Thr Ser Asn Arg Leu Pro Leu
1 5 10 15
Thr Ser Ala Asp Lys Met Glu Glu Leu Ile Lys Tyr Ile Leu Gly Lys
20 25 30
Ile Ser Ala Leu Lys Lys Glu Met Cys Asp Asn Tyr Asn Lys Cys Glu
35 40 45
Asp Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Leu
50 55 60
Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Gln Glu Thr Cys
65 70 75 80
Leu Thr Arg Ile Thr Thr Gly Leu Gln Glu Phe Gln Ile Tyr Leu Lys
85 90 95
Phe Leu Gln Asp Lys Tyr Glu Gly Asp Glu Glu Asn Ala Lys Ser Val
100 105 110
Tyr Thr Ser Thr Asn Val Leu Leu Gln Met Leu Lys Arg Lys Gly Lys
115 120 125
Asn Gln Asp Glu Val Thr Ile Pro Val Pro Thr Val Glu Val Gly Leu
130 135 140
Gln Ala Lys Leu Gln Ser Gln Glu Glu Trp Leu Arg His Thr Thr Ile
145 150 155 160
His Leu Thr Leu Arg Arg Leu Glu Asp Phe Leu Gln Phe Ser Leu Arg
165 170 175
Ala Val Arg Ile Met
180
<210> 113
<211> 179
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine IL-6 protein.
<400> 113
Gly Pro Leu Gly Glu Asp Phe Lys Asn Asp Thr Thr Pro Gly Arg Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Thr Pro Glu Lys Thr Glu Ala Leu Ile Lys Arg Met Val
20 25 30
Asp Lys Ile Ser Ala Met Arg Lys Glu Ile Cys Glu Lys Asn Asp Glu
35 40 45
Cys Glu Ser Ser Lys Glu Thr Leu Ala Glu Asn Lys Leu Asn Leu Pro
50 55 60
Lys Met Glu Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Gln Ala
65 70 75 80
Ile Cys Leu Ile Arg Thr Thr Ala Gly Leu Leu Glu Tyr Gln Ile Tyr
85 90 95
Leu Asp Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Glu Gly Asn Gln Glu Asn Val Arg
100 105 110
Asp Leu Arg Lys Asn Ile Arg Thr Leu Ile Gln Ile Leu Lys Gln Lys
115 120 125
Ile Ala Asp Leu Ile Thr Thr Pro Ala Thr Asn Thr Asp Leu Leu Glu
130 135 140
Lys Met Gln Ser Ser Asn Glu Trp Val Lys Asn Ala Lys Ile Ile Leu
145 150 155 160
Ile Leu Arg Asn Leu Glu Asn Phe Leu Gln Phe Ser Leu Arg Ala Ile
165 170 175
Arg Met Lys
<210> 114
<211> 183
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-6 protein.
<400> 114
Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln
1 5 10 15
Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu
20 25 30
Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met
35 40 45
Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro
50 55 60
Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu
65 70 75 80
Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr
85 90 95
Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg
100 105 110
Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys
115 120 125
Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala
130 135 140
Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met
145 150 155 160
Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
180
<210> 115
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-7 protein.
<400> 115
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 116
<211> 79
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-8 protein.
<400> 116
Ala Val Leu Ser Arg Val Ser Ser Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys
1 5 10 15
Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Tyr Ile Lys Glu Leu Arg Val
20 25 30
Ile Asp Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser Glu Ile Ile Val Lys Leu
35 40 45
Phe Asn Gly Asn Glu Val Cys Leu Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Gln
50 55 60
Lys Val Val Gln Ile Phe Leu Lys Lys Ala Glu Lys Gln Asp Pro
65 70 75
<210> 117
<211> 79
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-8 protein.
<400> 117
Ala Val Leu Ser Arg Ile Ser Ser Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys
1 5 10 15
Thr His Ser Thr Pro Phe Asn Pro Lys Leu Ile Lys Glu Leu Thr Val
20 25 30
Ile Asp Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser Glu Ile Ile Val Lys Leu
35 40 45
Val Asn Gly Lys Glu Val Cys Leu Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln
50 55 60
Lys Val Val Glu Ile Phe Leu Lys Lys Ala Glu Lys Gln Asn Ala
65 70 75
<210> 118
<211> 79
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine IL-8 protein.
<400> 118
Ala Val Leu Ser Arg Met Ser Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys
1 5 10 15
Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val
20 25 30
Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser Glu Ile Ile Val Lys Leu
35 40 45
Thr Asn Gly Asn Glu Val Cys Leu Asn Pro Lys Glu Lys Trp Val Gln
50 55 60
Lys Val Val Gln Val Phe Val Lys Arg Ala Glu Lys Gln Asp Pro
65 70 75
<210> 119
<211> 79
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-8 - aa 21-99 protein.
<400> 119
Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys
1 5 10 15
Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu
20 25 30
Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val
35 40 45
Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp
50 55 60
Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
65 70 75
<210> 120
<211> 77
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-8 - aa 23-99 protein.
<400> 120
Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys
1 5 10 15
Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val
20 25 30
Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu
35 40 45
Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln
50 55 60
Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
65 70 75
<210> 121
<211> 73
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-8 - aa 27-99 protein.
<400> 121
Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys
1 5 10 15
Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly
20 25 30
Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg
35 40 45
Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu
50 55 60
Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
65 70
<210> 122
<211> 72
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-8 - aa 28-99 protein.
<400> 122
Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro
1 5 10 15
Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro
20 25 30
His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu
35 40 45
Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys
50 55 60
Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
65 70
<210> 123
<211> 71
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-8 - aa 29-99 protein.
<400> 123
Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe
1 5 10 15
His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His
20 25 30
Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe
50 55 60
Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
65 70
<210> 124
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-8 - aa 30-99 protein.
<400> 124
Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His
1 5 10 15
Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys
20 25 30
Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys
35 40 45
Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu
50 55 60
Lys Arg Ala Glu Asn Ser
65 70
<210> 125
<211> 69
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-8 - aa 31-99 protein.
<400> 125
Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro
1 5 10 15
Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala
20 25 30
Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu
35 40 45
Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys
50 55 60
Arg Ala Glu Asn Ser
65
<210> 126
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-9 protein.
<400> 126
Gln Gly Cys Pro Thr Leu Ala Gly Ile Leu Asp Ile Asn Phe Leu Ile
1 5 10 15
Asn Lys Met Gln Glu Asp Pro Ala Ser Lys Cys His Cys Ser Ala Asn
20 25 30
Val Thr Ser Cys Leu Cys Leu Gly Ile Pro Ser Asp Asn Cys Thr Arg
35 40 45
Pro Cys Phe Ser Glu Arg Leu Ser Gln Met Thr Asn Thr Thr Met Gln
50 55 60
Thr Arg Tyr Pro Leu Ile Phe Ser Arg Val Lys Lys Ser Val Glu Val
65 70 75 80
Leu Lys Asn Asn Lys Cys Pro Tyr Phe Ser Cys Glu Gln Pro Cys Asn
85 90 95
Gln Thr Thr Ala Gly Asn Ala Leu Thr Phe Leu Lys Ser Leu Leu Glu
100 105 110
Ile Phe Gln Lys Glu Lys Met Arg Gly Met Arg Gly Lys Ile
115 120 125
<210> 127
<211> 162
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-10 protein.
<400> 127
Ser Arg His Gln Ser Thr Leu Leu Glu Asp Asp Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Ala Ser Leu Pro His Met Leu Arg Glu Leu Arg Ala Ala Phe Gly Arg
20 25 30
Val Lys Ile Phe Phe Gln Met Lys Asp Lys Leu Asp Asn Ile Leu Leu
35 40 45
Thr Gly Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Ser Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Arg Ala
65 70 75 80
Glu Asn His Asp Pro Asp Ile Lys Asn His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
100 105 110
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Ser
115 120 125
Ala Phe Ser Lys Leu Gln Glu Lys Gly Val Tyr Lys Ala Met Ser Glu
130 135 140
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Thr Tyr Met Thr Met Arg Met
145 150 155 160
Lys Ile
<210> 128
<211> 160
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-10 protein.
<400> 128
Ser Arg His Gln Ser Thr Leu Ser Glu Asp Asn Cys Thr His Phe Ser
1 5 10 15
Val Ser Leu Pro His Met Leu Arg Glu Leu Arg Ala Ala Phe Gly Lys
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu His Ser Ile Leu Leu
35 40 45
Thr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Glu Asp Pro Asp Ile Lys Gln His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Val Val Glu Gln Val Lys Ser Thr Phe
115 120 125
Ser Lys Leu Gln Glu Lys Gly Val Tyr Lys Ala Met Gly Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Met Lys Ile
145 150 155 160
<210> 129
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-10 protein.
<400> 129
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 130
<211> 178
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-11 protein.
<400> 130
Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala
1 5 10 15
Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr
20 25 30
Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp
35 40 45
His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu
50 55 60
Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser
85 90 95
Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu
100 105 110
Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu
115 120 125
Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu
145 150 155 160
His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr
165 170 175
Arg Leu
<210> 131
<211> 546
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-14 protein.
<400> 131
Met Lys Asn Gln Asp Lys Lys Asn Gly Ala Ala Lys Gln Ser Asn Pro
1 5 10 15
Lys Ser Ser Pro Gly Gln Pro Glu Ala Gly Pro Glu Gly Ala Gln Glu
20 25 30
Arg Pro Ser Gln Ala Ala Pro Ala Val Glu Ala Glu Gly Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Gln Ala Pro Arg Lys Pro Glu Gly Ala Gln Ala Arg Thr Ala Gln
50 55 60
Ser Gly Ala Leu Arg Asp Val Ser Glu Glu Leu Ser Arg Gln Leu Glu
65 70 75 80
Asp Ile Leu Ser Thr Tyr Cys Val Asp Asn Asn Gln Gly Gly Pro Gly
85 90 95
Glu Asp Gly Ala Gln Gly Glu Pro Ala Glu Pro Glu Asp Ala Glu Lys
100 105 110
Ser Arg Thr Tyr Val Ala Arg Asn Gly Glu Pro Glu Pro Thr Pro Val
115 120 125
Val Asn Gly Glu Lys Glu Pro Ser Lys Gly Asp Pro Asn Thr Glu Glu
130 135 140
Ile Arg Gln Ser Asp Glu Val Gly Asp Arg Asp His Arg Arg Pro Gln
145 150 155 160
Glu Lys Lys Lys Ala Lys Gly Leu Gly Lys Glu Ile Thr Leu Leu Met
165 170 175
Gln Thr Leu Asn Thr Leu Ser Thr Pro Glu Glu Lys Leu Ala Ala Leu
180 185 190
Cys Lys Lys Tyr Ala Glu Leu Leu Glu Glu His Arg Asn Ser Gln Lys
195 200 205
Gln Met Lys Leu Leu Gln Lys Lys Gln Ser Gln Leu Val Gln Glu Lys
210 215 220
Asp His Leu Arg Gly Glu His Ser Lys Ala Val Leu Ala Arg Ser Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ser Leu Cys Arg Glu Leu Gln Arg His Asn Arg Ser Leu Lys
245 250 255
Glu Glu Gly Val Gln Arg Ala Arg Glu Glu Glu Glu Lys Arg Lys Glu
260 265 270
Val Thr Ser His Phe Gln Val Thr Leu Asn Asp Ile Gln Leu Gln Met
275 280 285
Glu Gln His Asn Glu Arg Asn Ser Lys Leu Arg Gln Glu Asn Met Glu
290 295 300
Leu Ala Glu Arg Leu Lys Lys Leu Ile Glu Gln Tyr Glu Leu Arg Glu
305 310 315 320
Glu His Ile Asp Lys Val Phe Lys His Lys Asp Leu Gln Gln Gln Leu
325 330 335
Val Asp Ala Lys Leu Gln Gln Ala Gln Glu Met Leu Lys Glu Ala Glu
340 345 350
Glu Arg His Gln Arg Glu Lys Asp Phe Leu Leu Lys Glu Ala Val Glu
355 360 365
Ser Gln Arg Met Cys Glu Leu Met Lys Gln Gln Glu Thr His Leu Lys
370 375 380
Gln Gln Leu Ala Leu Tyr Thr Glu Lys Phe Glu Glu Phe Gln Asn Thr
385 390 395 400
Leu Ser Lys Ser Ser Glu Val Phe Thr Thr Phe Lys Gln Glu Met Glu
405 410 415
Lys Met Thr Lys Lys Ile Lys Lys Leu Glu Lys Glu Thr Thr Met Tyr
420 425 430
Arg Ser Arg Trp Glu Ser Ser Asn Lys Ala Leu Leu Glu Met Ala Glu
435 440 445
Glu Lys Thr Val Arg Asp Lys Glu Leu Glu Gly Leu Gln Val Lys Ile
450 455 460
Gln Arg Leu Glu Lys Leu Cys Arg Ala Leu Gln Thr Glu Arg Asn Asp
465 470 475 480
Leu Asn Lys Arg Val Gln Asp Leu Ser Ala Gly Gly Gln Gly Ser Leu
485 490 495
Thr Asp Ser Gly Pro Glu Arg Arg Pro Glu Gly Pro Gly Ala Gln Ala
500 505 510
Pro Ser Ser Pro Arg Val Thr Glu Ala Pro Cys Tyr Pro Gly Ala Pro
515 520 525
Ser Thr Glu Ala Ser Gly Gln Thr Gly Pro Gln Glu Pro Thr Ser Ala
530 535 540
Arg Ala
545
<210> 132
<211> 114
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-15 protein.
<400> 132
Asn Trp Gln Asp Val Ile Ser Asp Leu Lys Ile Ile Asp Lys Ile Ile
1 5 10 15
Gln Ser Leu His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Asn Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu His
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Lys Asn Glu Thr Ile His Gln Thr Val Glu
50 55 60
Asn Ile Ile Ile Leu Ala Asn Ser Gly Leu Ser Ser Asn Arg Asn Ile
65 70 75 80
Thr Glu Thr Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 133
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-15 protein.
<400> 133
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 134
<211> 1332
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-16 - 1-1332 aa protein.
<400> 134
Met Glu Ser His Ser Arg Ala Gly Lys Ser Arg Lys Ser Ala Lys Phe
1 5 10 15
Arg Ser Ile Ser Arg Ser Leu Met Leu Cys Asn Ala Lys Thr Ser Asp
20 25 30
Asp Gly Ser Ser Pro Asp Glu Lys Tyr Pro Asp Pro Phe Glu Ile Ser
35 40 45
Leu Ala Gln Gly Lys Glu Gly Ile Phe His Ser Ser Val Gln Leu Ala
50 55 60
Asp Thr Ser Glu Ala Gly Pro Ser Ser Val Pro Asp Leu Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Glu Ala Ala Gln Leu Gln Ala Ala Gly Asn Asp Arg Gly Lys Thr
85 90 95
Cys Arg Arg Ile Phe Phe Met Lys Glu Ser Ser Thr Ala Ser Ser Arg
100 105 110
Glu Lys Pro Gly Lys Leu Glu Ala Gln Ser Ser Asn Phe Leu Phe Pro
115 120 125
Lys Ala Cys His Gln Arg Ala Arg Ser Asn Ser Thr Ser Val Asn Pro
130 135 140
Tyr Cys Thr Arg Glu Ile Asp Phe Pro Met Thr Lys Lys Ser Ala Ala
145 150 155 160
Pro Thr Asp Arg Gln Pro Tyr Ser Leu Cys Ser Asn Arg Lys Ser Leu
165 170 175
Ser Gln Gln Leu Asp Cys Pro Ala Gly Lys Ala Ala Gly Thr Ser Arg
180 185 190
Pro Thr Arg Ser Leu Ser Thr Ala Gln Leu Val Gln Pro Ser Gly Gly
195 200 205
Leu Gln Ala Ser Val Ile Ser Asn Ile Val Leu Met Lys Gly Gln Ala
210 215 220
Lys Gly Leu Gly Phe Ser Ile Val Gly Gly Lys Asp Ser Ile Tyr Gly
225 230 235 240
Pro Ile Gly Ile Tyr Val Lys Thr Ile Phe Ala Gly Gly Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Asp Gly Arg Leu Gln Glu Gly Asp Glu Ile Leu Glu Leu Asn Gly
260 265 270
Glu Ser Met Ala Gly Leu Thr His Gln Asp Ala Leu Gln Lys Phe Lys
275 280 285
Gln Ala Lys Lys Gly Leu Leu Thr Leu Thr Val Arg Thr Arg Leu Thr
290 295 300
Ala Pro Pro Ser Leu Cys Ser His Leu Ser Pro Pro Leu Cys Arg Ser
305 310 315 320
Leu Ser Ser Ser Thr Cys Ile Thr Lys Asp Ser Ser Ser Phe Ala Leu
325 330 335
Glu Ser Pro Ser Ala Pro Ile Ser Thr Ala Lys Pro Asn Tyr Arg Ile
340 345 350
Met Val Glu Val Ser Leu Gln Lys Glu Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile
355 360 365
Gly Leu Cys Ser Val Pro Tyr Phe Gln Cys Ile Ser Gly Ile Phe Val
370 375 380
His Thr Leu Ser Pro Gly Ser Val Ala His Leu Asp Gly Arg Leu Arg
385 390 395 400
Cys Gly Asp Glu Ile Val Glu Ile Ser Asp Ser Pro Val His Cys Leu
405 410 415
Thr Leu Asn Glu Val Tyr Thr Ile Leu Ser His Cys Asp Pro Gly Pro
420 425 430
Val Pro Ile Ile Val Ser Arg His Pro Asp Pro Gln Val Ser Glu Gln
435 440 445
Gln Leu Lys Glu Ala Val Ala Gln Ala Val Glu Asn Thr Lys Phe Gly
450 455 460
Lys Glu Arg His Gln Trp Ser Leu Glu Gly Val Lys Arg Leu Glu Ser
465 470 475 480
Ser Trp His Gly Arg Pro Thr Leu Glu Lys Glu Arg Glu Lys Asn Ser
485 490 495
Ala Pro Pro His Arg Arg Ala Gln Lys Val Met Ile Arg Ser Ser Ser
500 505 510
Asp Ser Ser Tyr Met Ser Gly Ser Pro Gly Gly Ser Pro Gly Ser Gly
515 520 525
Ser Ala Glu Lys Pro Ser Ser Asp Val Asp Ile Ser Thr His Ser Pro
530 535 540
Ser Leu Pro Leu Ala Arg Glu Pro Val Val Leu Ser Ile Ala Ser Ser
545 550 555 560
Arg Leu Pro Gln Glu Ser Pro Pro Leu Pro Glu Ser Arg Asp Ser His
565 570 575
Pro Pro Leu Arg Leu Lys Lys Ser Phe Glu Ile Leu Val Arg Lys Pro
580 585 590
Met Ser Ser Lys Pro Lys Pro Pro Pro Arg Lys Tyr Phe Lys Ser Asp
595 600 605
Ser Asp Pro Gln Lys Ser Leu Glu Glu Arg Glu Asn Ser Ser Cys Ser
610 615 620
Ser Gly His Thr Pro Pro Thr Cys Gly Gln Glu Ala Arg Glu Leu Leu
625 630 635 640
Pro Leu Leu Leu Pro Gln Glu Asp Thr Ala Gly Arg Ser Pro Ser Ala
645 650 655
Ser Ala Gly Cys Pro Gly Pro Gly Ile Gly Pro Gln Thr Lys Ser Ser
660 665 670
Thr Glu Gly Glu Pro Gly Trp Arg Arg Ala Ser Pro Val Thr Gln Thr
675 680 685
Ser Pro Ile Lys His Pro Leu Leu Lys Arg Gln Ala Arg Met Asp Tyr
690 695 700
Ser Phe Asp Thr Thr Ala Glu Asp Pro Trp Val Arg Ile Ser Asp Cys
705 710 715 720
Ile Lys Asn Leu Phe Ser Pro Ile Met Ser Glu Asn His Gly His Met
725 730 735
Pro Leu Gln Pro Asn Ala Ser Leu Asn Glu Glu Glu Gly Thr Gln Gly
740 745 750
His Pro Asp Gly Thr Pro Pro Lys Leu Asp Thr Ala Asn Gly Thr Pro
755 760 765
Lys Val Tyr Lys Ser Ala Asp Ser Ser Thr Val Lys Lys Gly Pro Pro
770 775 780
Val Ala Pro Lys Pro Ala Trp Phe Arg Gln Ser Leu Lys Gly Leu Arg
785 790 795 800
Asn Arg Ala Ser Asp Pro Arg Gly Leu Pro Asp Pro Ala Leu Ser Thr
805 810 815
Gln Pro Ala Pro Ala Ser Arg Glu His Leu Gly Ser His Ile Arg Ala
820 825 830
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile Arg Gln Arg Ile Ser Ser Phe Glu Thr
835 840 845
Phe Gly Ser Ser Gln Leu Pro Asp Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ser Leu
850 855 860
Gln Pro Ser Ser Gly Glu Ala Ala Lys Pro Leu Gly Lys His Glu Glu
865 870 875 880
Gly Arg Phe Ser Gly Leu Leu Gly Arg Gly Ala Ala Pro Thr Leu Val
885 890 895
Pro Gln Gln Pro Glu Gln Val Leu Ser Ser Gly Ser Pro Ala Ala Ser
900 905 910
Glu Ala Arg Asp Pro Gly Val Ser Glu Ser Pro Pro Pro Gly Arg Gln
915 920 925
Pro Asn Gln Lys Thr Leu Pro Pro Gly Pro Asp Pro Leu Leu Arg Leu
930 935 940
Leu Ser Thr Gln Ala Glu Glu Ser Gln Gly Pro Val Leu Lys Met Pro
945 950 955 960
Ser Gln Arg Ala Arg Ser Phe Pro Leu Thr Arg Ser Gln Ser Cys Glu
965 970 975
Thr Lys Leu Leu Asp Glu Lys Thr Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Ser Ser
980 985 990
Gln Val Ser Ser Ala Val Met Lys Ser Leu Leu Cys Leu Pro Ser Ser
995 1000 1005
Ile Ser Cys Ala Gln Thr Pro Cys Ile Pro Lys Glu Gly Ala Ser
1010 1015 1020
Pro Thr Ser Ser Ser Asn Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Ser Ala
1025 1030 1035
Glu Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gly Phe Ser Leu Asn Leu Ser Glu
1040 1045 1050
Leu Arg Glu Tyr Thr Glu Gly Leu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Asp
1055 1060 1065
Asp Gly Asp His Ser Ser Leu Gln Ser Gly Gln Ser Val Ile Ser
1070 1075 1080
Leu Leu Ser Ser Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Glu Val Lys
1085 1090 1095
Val Leu Asp Glu Ala Thr Leu Lys Gln Leu Asp Gly Ile His Val
1100 1105 1110
Thr Ile Leu His Lys Glu Glu Gly Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu
1115 1120 1125
Ala Gly Gly Ala Asp Leu Glu Asn Lys Val Ile Thr Val His Arg
1130 1135 1140
Val Phe Pro Asn Gly Leu Ala Ser Gln Glu Gly Thr Ile Gln Lys
1145 1150 1155
Gly Asn Glu Val Leu Ser Ile Asn Gly Lys Ser Leu Lys Gly Thr
1160 1165 1170
Thr His His Asp Ala Leu Ala Ile Leu Arg Gln Ala Arg Glu Pro
1175 1180 1185
Arg Gln Ala Val Ile Val Thr Arg Lys Leu Thr Pro Glu Ala Met
1190 1195 1200
Pro Asp Leu Asn Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala
1205 1210 1215
Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr Ala Glu Ala Thr Val Cys
1220 1225 1230
Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly Leu Gly Phe Ser Leu
1235 1240 1245
Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys Pro Leu Thr Ile
1250 1255 1260
Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser Glu Thr Val
1265 1270 1275
Gln Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala Met Gln
1280 1285 1290
Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu Pro
1295 1300 1305
Asp Gly Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser
1310 1315 1320
Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser
1325 1330
<210> 135
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-16 - 1212-1332 aa protein.
<400> 135
Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr
1 5 10 15
Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly
20 25 30
Leu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys
35 40 45
Pro Leu Thr Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser
50 55 60
Glu Thr Val Gln Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala
65 70 75 80
Met Gln Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu
85 90 95
Pro Asp Gly Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser
100 105 110
Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser
115 120
<210> 136
<211> 127
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-17A protein.
<400> 136
Phe Pro Gln Asn Pro Gly Cys Arg Asn Thr Glu Asp Lys Asn Phe Pro
1 5 10 15
Gln His Val Lys Val Asn Leu Asn Ile Leu Asn Arg Asn Thr Asn Ser
20 25 30
Arg Arg Pro Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu
35 40 45
His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala
50 55 60
Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Val Asn Asn Glu Gly Asn Ile Asn Tyr
65 70 75 80
His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg
85 90 95
Glu Ser Gln His Cys Pro His Ser Phe Arg Leu Glu Lys Met Leu Val
100 105 110
Ala Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val Arg His Val Ala
115 120 125
<210> 137
<211> 127
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-17A protein.
<400> 137
Phe Pro Gln Asn Pro Gly Cys Pro Thr Thr Glu Asp Lys Asn Phe Pro
1 5 10 15
Gln His Val Lys Val Asn Val Asn Ile Leu Asn Gly Asn Lys Ser Ser
20 25 30
Arg Arg Pro Leu Asp Tyr Tyr Arg Arg Ser Thr Ser Pro Trp Ser Leu
35 40 45
His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala
50 55 60
Lys Cys Leu His Trp Gly Cys Val Asn Thr Glu Gly Lys Glu Asp His
65 70 75 80
His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg
85 90 95
Glu Ser Arg His Cys Pro His Ser Phe Arg Leu Glu Lys Met Leu Val
100 105 110
Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val Arg His Val Val
115 120 125
<210> 138
<211> 158
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-17B protein.
<400> 138
Arg Asn Pro Lys Gly Lys Arg Lys Gly Pro Gly Arg Pro Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Gln Ala Lys
20 25 30
Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Leu Ser Glu Met Val
35 40 45
Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Pro Ala Arg Arg Lys Cys Glu Val
50 55 60
Asn Leu Gln Leu Trp Leu Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly
65 70 75 80
Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Val Pro Ala Asp Leu Pro Glu
85 90 95
Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gln Glu
100 105 110
Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg
115 120 125
Arg Arg Leu Cys Pro Leu Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg
130 135 140
Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe
145 150 155
<210> 139
<211> 158
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-17B protein.
<400> 139
Arg Asn Pro Lys Gly Lys Arg Lys Gly Pro Gly Arg Pro Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Ser Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Gln Ala Lys
20 25 30
Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Leu Gly Glu Met Val
35 40 45
Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Pro Ala Arg Arg Lys Cys Glu Val
50 55 60
Asn Leu Gln Leu Trp Leu Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly
65 70 75 80
Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Ala Asp Leu Pro Glu
85 90 95
Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gln Glu
100 105 110
Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro Val Arg
115 120 125
Arg Arg Leu Cys Pro Leu Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gln Arg
130 135 140
Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe
145 150 155
<210> 140
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-17B protein.
<400> 140
Gln Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gln Gly Arg Pro Gly
1 5 10 15
Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gln Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg
20 25 30
Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu
35 40 45
Met Val Ala Gln Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gln Arg Lys Cys
50 55 60
Glu Val Asn Leu Gln Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro
65 70 75 80
Trp Gly Tyr Ser Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Val Asp Leu
85 90 95
Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met
100 105 110
Gln Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe Ser Gln Val Pro
115 120 125
Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg
130 135 140
Gln Arg Ala Val Met Glu Thr Ile Ala Val Gly Cys Thr Cys Ile Phe
145 150 155 160
<210> 141
<211> 179
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-17C protein.
<400> 141
Arg His Gly Pro Gln Leu Trp Arg Gly Leu His Thr His Gly Thr Pro
1 5 10 15
Arg Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Arg Gly Gln Ala Pro Pro His
20 25 30
Leu Leu Ala Arg Ala Ala Lys Trp Glu Gln Ala Leu Pro Val Ala Leu
35 40 45
Val Ser Ser Leu Glu Ala Gly Gly Arg Gly Arg Glu Gln Asp Gly Pro
50 55 60
Pro Ala Gly Ala Gln Cys Pro Val Leu Gln Pro Glu Glu Val Leu Glu
65 70 75 80
Ala Asp Ile His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val Asp
85 90 95
Thr Asp Glu Ser Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu
100 105 110
Cys Arg Gly Cys Ile Ser Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu
115 120 125
Asn Ser Val Pro Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg Pro
130 135 140
Cys Ser Arg Asp Thr Thr Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ser Phe
145 150 155 160
His Ala Glu Phe Ile Arg Val Pro Ile Gly Cys Thr Cys Val Leu Pro
165 170 175
Arg Ser Thr
<210> 142
<211> 180
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-17C protein.
<400> 142
Arg His Gly Pro Gln Leu Trp Gly Gly Pro His Ala His Gly Thr Pro
1 5 10 15
Arg Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Pro Pro Pro His
20 25 30
Leu Leu Ala Arg Ala Ala Lys Trp Glu Gln Ala Leu Pro Val Ala Leu
35 40 45
Val Ser Ser Leu Glu Ala Gly Gly Arg Arg Arg Arg His Asp Gly Pro
50 55 60
Pro Ala Gly Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Asp Val Leu Glu
65 70 75 80
Ala Gly Ile His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val Asp
85 90 95
Thr Asp Glu Ser Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Gln Cys Leu
100 105 110
Cys Arg Gly Cys Val Ser Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu
115 120 125
Asn Ser Val Pro Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Gln Pro
130 135 140
Cys Ser Arg Glu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ser Phe
145 150 155 160
His Ala Glu Phe Ile Arg Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu Pro
165 170 175
Arg Ser Ala Arg
180
<210> 143
<211> 179
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-17C protein.
<400> 143
His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly Thr Pro
1 5 10 15
His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln Ala Pro Pro His
20 25 30
Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu Pro Val Ala Leu
35 40 45
Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu Arg Pro
50 55 60
Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val Leu Glu
65 70 75 80
Ala Asp Thr His Gln Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Val Asp
85 90 95
Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu
100 105 110
Cys Arg Gly Cys Ile Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu
115 120 125
Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg Pro
130 135 140
Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe
145 150 155 160
His Thr Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu Pro
165 170 175
Arg Ser Val
<210> 144
<211> 185
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-17D protein.
<400> 144
Ala Leu Arg Ala Ser Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys Ala Glu
1 5 10 15
Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala Gly
20 25 30
Val Leu Gly Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg Glu Gln
35 40 45
Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Gly Asp Arg Arg
50 55 60
Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr Arg
65 70 75 80
Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Lys Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr
85 90 95
Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu Asp Leu
100 105 110
Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Ile Leu Arg Arg
115 120 125
Thr Ser Ala Cys Ala Gly Gly Arg Trp Val Tyr Thr Glu Glu Tyr Val
130 135 140
Thr Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Gln Glu Lys Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Val Asn Ser Ser Met Asp Lys Gln Gly Ala Arg Leu Leu Leu
165 170 175
Gly Pro Gly Asp Lys Pro Gly Arg Pro
180 185
<210> 145
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-17D protein.
<400> 145
Ala Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys
1 5 10 15
Ala Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Gly Arg Leu Ala
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gln Leu Gly Pro Arg
35 40 45
Glu Gln Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp
50 55 60
Arg Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala
65 70 75 80
Tyr Arg Ile Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu
85 90 95
Ala Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu
100 105 110
Asp Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu
115 120 125
Arg Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala
130 135 140
Tyr Val Thr Ile Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys
145 150 155 160
Asp Ala Asp Ser Ile Asn Ser Ser Ile Asp Lys Gln Gly Ala Lys Leu
165 170 175
Leu Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro
180 185
<210> 146
<211> 129
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-17F protein.
<400> 146
Arg Lys His Leu Lys Ala Gly Glu Thr Ala Leu Cys Pro Pro Leu Glu
1 5 10 15
Asp Asn Ser Val Arg Val Asp Ile Arg Ile Leu Arg Gln Asn Arg Gly
20 25 30
Ile Ser Ile Ser Asn Asp Phe Gln Asn Arg Ser Ser Ser Pro Trp Asp
35 40 45
Tyr Asn Ile Thr Arg Asp Pro His Arg Phe Pro Ser Glu Ile Ala Glu
50 55 60
Ala Gln Cys Arg His Ser Gly Cys Ile Asn Ala Glu Gly Gln Glu Asp
65 70 75 80
Ser Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Phe Leu Val Leu Arg
85 90 95
Arg Glu Pro Gln Gly Cys Ser Arg Ser Phe Arg Leu Glu Lys Val Leu
100 105 110
Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val Arg Tyr Val Arg
115 120 125
Ala
<210> 147
<211> 130
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-17F protein.
<400> 147
Arg Lys Asn Pro Lys Ala Gly Asp Thr Ala Leu Cys Pro Pro Leu Glu
1 5 10 15
Asp Asn Ser Val Arg Val Asp Ile Arg Ile Leu Arg Gln Asn Gln Gly
20 25 30
Gly Ile Ser Ile Ser Asn Asp Phe Gln Asn Arg Ser Ser Ser Pro Trp
35 40 45
Asp Tyr Asn Val Thr Arg Asp Pro Asn Arg Phe Pro Ser Glu Ile Val
50 55 60
Glu Ala Gln Cys Arg His Ser Gly Cys Ile Asn Ala Glu Gly Gln Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Phe Leu Val Leu
85 90 95
Arg Arg Glu Pro Gln Gly Cys Ser Arg Thr Phe Arg Leu Glu Lys Val
100 105 110
Arg Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val Arg Tyr Val
115 120 125
Arg Ala
130
<210> 148
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-17F protein.
<400> 148
Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser
1 5 10 15
Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile
20 25 30
Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser
35 40 45
Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro
50 55 60
Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala
65 70 75 80
Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu
85 90 95
Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln
100 105 110
Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val
115 120 125
Ile His His Val Gln
130
<210> 149
<211> 157
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-18 protein.
<400> 149
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Pro Lys Leu Ser Ile Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asn Glu Gly Asn Gln Pro Val Phe Glu Asp
20 25 30
Met Pro Asp Ser Asp Cys Thr Asp Asn Ala Pro His Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Leu Thr Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Tyr Lys Thr Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Thr
65 70 75 80
Ile Ser Phe Gln Lys Met Ser Pro Pro Asp Ser Ile Asn Asp Glu Gly
85 90 95
Asn Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asp Lys
100 105 110
Ile Gln Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Lys Gly His Phe Leu Ala Cys Lys
115 120 125
Lys Glu Asn Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Asp Lys Asp Glu Asn
130 135 140
Gly Asp Lys Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Lys Ser
145 150 155
<210> 150
<211> 157
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-18 protein.
<400> 150
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu His Lys Leu Ser Ile Leu Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asn Gln Gly Asp Gln Pro Val Phe Glu Asp
20 25 30
Met Pro Asp Ser Asp Cys Thr Asp Asn Ala Pro Arg Thr Glu Phe Ile
35 40 45
Ile Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Leu Thr Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Asn Tyr Lys Thr Met Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Ser Pro Pro Glu Ser Ile Asn Asp Glu Gly
85 90 95
Asn Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asp Lys
100 105 110
Ile Gln Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Lys Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Lys Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn
130 135 140
Gly Asp Lys Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Lys Asn
145 150 155
<210> 151
<211> 157
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-18 protein.
<400> 151
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 152
<211> 153
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-19 protein.
<400> 152
Leu Arg Arg Cys Leu Ile Ser Thr Asp Met His His Ile Glu Glu Ser
1 5 10 15
Phe Gln Glu Ile Lys Arg Ala Ile Gln Ala Lys Asp Thr Phe Pro Asn
20 25 30
Val Thr Ile Leu Ser Thr Leu Glu Thr Leu Gln Ile Ile Lys Pro Leu
35 40 45
Asp Val Cys Cys Val Thr Lys Asn Leu Leu Ala Phe Tyr Val Asp Arg
50 55 60
Val Phe Lys Asp His Gln Glu Pro Asn Pro Lys Ile Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Ser Ser Ile Ala Asn Ser Phe Leu Tyr Met Gln Lys Thr Leu Arg Gln
85 90 95
Cys Gln Glu Gln Arg Gln Cys His Cys Arg Gln Glu Ala Thr Asn Ala
100 105 110
Thr Arg Val Ile His Asp Asn Tyr Asp Gln Leu Glu Val His Ala Ala
115 120 125
Ala Ile Lys Ser Leu Gly Glu Leu Asp Val Phe Leu Ala Trp Ile Asn
130 135 140
Lys Asn His Glu Val Met Phe Ser Ala
145 150
<210> 153
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-20 protein.
<400> 153
Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln
1 5 10 15
Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Glu Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys
20 25 30
Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln
35 40 45
Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg
50 55 60
Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys
85 90 95
Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr Cys His Cys Gly Glu
100 105 110
Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu
115 120 125
Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu
130 135 140
Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu
145 150
<210> 154
<211> 129
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-21 protein.
<400> 154
His Lys Ser Ser Phe Gln Glu Gln Asp Leu Leu Leu Ile Arg Met Arg
1 5 10 15
Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu
20 25 30
Asp Pro Glu Ser Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Lys Arg His Cys Glu
35 40 45
Arg Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Val Gln Leu Lys Ala Ala Asn
50 55 60
Thr Gly Gly Asn Glu Gln Ile Ile Asn Val Leu Thr Lys Gln Leu Lys
65 70 75 80
Arg Lys Leu Pro Pro Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Pro
85 90 95
Ala Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Ala Pro Pro Lys Glu Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Ser Leu Ile Gln Lys Met Ile His Gln His Leu
115 120 125
Ser
<210> 155
<211> 138
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-21 protein.
<400> 155
His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg
1 5 10 15
Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu
20 25 30
Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu
35 40 45
Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn
50 55 60
Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys
65 70 75 80
Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu
85 90 95
Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu
115 120 125
Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
130 135
<210> 156
<211> 146
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-22 protein.
<400> 156
Leu Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln
1 5 10 15
Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His
35 40 45
Gly Val Asn Met Gly Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Glu Val Leu Asn
50 55 60
Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro
65 70 75 80
Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Lys Leu
85 90 95
Ser Gln Cys His Ile Glu Asn Asp Asp Gln His Ile Gln Arg Asn Val
100 105 110
Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu Gly Glu Asn Gly Glu Ile
115 120 125
Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ala Leu Arg Asn Ala
130 135 140
Cys Val
145
<210> 157
<211> 146
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-22 protein.
<400> 157
Val Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Gly Ser Asn Phe Gln Gln
1 5 10 15
Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe Tyr
35 40 45
Glu Val Asn Met Gly Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn
50 55 60
Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro
65 70 75 80
Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Lys Leu
85 90 95
Ser Gln Cys His Ile Asp Ser Asp Asp Gln His Ile Gln Arg Asn Val
100 105 110
Gln Asn Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Asn Gly Glu Ile
115 120 125
Lys Val Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ala Leu Arg Asn Ala
130 135 140
Cys Asn
145
<210> 158
<211> 146
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-22 protein.
<400> 158
Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln
1 5 10 15
Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu
20 25 30
Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His
35 40 45
Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn
50 55 60
Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro
65 70 75 80
Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu
85 90 95
Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val
100 105 110
Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile
115 120 125
Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala
130 135 140
Cys Ile
145
<210> 159
<211> 102
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-24 protein.
<400> 159
Gln Glu Phe Arg Phe Gly Pro Cys Arg Val Gln Gly Val Ala Leu Arg
1 5 10 15
Glu Leu Arg Glu Ala Phe Trp Thr Val Lys Asp Thr Val Gln Ala Lys
20 25 30
Asp Asn Ile Thr Ser Val Arg Leu Leu Arg Lys Glu Val Leu Gln Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Glu Met Phe Ser Ile Ser Glu Ser Ala Arg Arg
50 55 60
Arg Phe Leu Leu Phe Gln Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp Ile Gln Ala
65 70 75 80
Ala Gln Thr Lys Ala Phe Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met
85 90 95
Glu Lys Phe Tyr Glu Phe
100
<210> 160
<211> 155
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-24 Family Protein.
<400> 160
Gln Glu Phe Arg Phe Gly Pro Cys Arg Val Gln Gly Val Ala Leu Arg
1 5 10 15
Glu Leu Arg Glu Ala Phe Trp Thr Val Lys Asp Thr Val Gln Ala Lys
20 25 30
Asp Asn Ile Thr Ser Val Arg Leu Leu Arg Lys Glu Val Leu Gln Asp
35 40 45
Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Ile Arg Ala Leu Leu Lys Phe
50 55 60
Tyr Leu Asn Thr Val Phe Lys Asn Tyr Leu Asp Glu Ala Ala Asp Val
65 70 75 80
Arg Ile Arg Arg Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Phe Val Ile
85 90 95
Ala Ser Lys Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asp Glu Met Phe Ser Ile Ser
100 105 110
Glu Ser Ala Arg Arg Arg Phe Leu Leu Phe Gln Arg Ala Phe Lys Gln
115 120 125
Leu Asp Ile Gln Ala Ala Gln Thr Lys Ala Phe Gly Glu Val Asp Ile
130 135 140
Leu Leu Thr Trp Met Glu Lys Phe Tyr Glu Phe
145 150 155
<210> 161
<211> 102
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-24 protein.
<400> 161
Gln Glu Phe Gln Phe Gly Pro Cys Arg Val Glu Gly Val Val Leu Gln
1 5 10 15
Glu Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Met Lys Asp Ile Val Gln Ala Lys
20 25 30
Asp Asn Ile Thr Asn Val Arg Leu Leu Arg Lys Glu Val Leu Gln Asn
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Val Ser Asp Ser Ala Arg Arg
50 55 60
Arg Phe Leu Leu Phe Gln Arg Ala Phe Lys Gln Leu Asp Ile Glu Ala
65 70 75 80
Ala Gln Thr Lys Ala Phe Gly Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met
85 90 95
Glu Lys Phe Tyr Gln Leu
100
<210> 162
<211> 155
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-24 Family Protein.
<400> 162
Gln Glu Phe Gln Phe Gly Pro Cys Arg Val Glu Gly Val Val Leu Gln
1 5 10 15
Glu Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Met Lys Asp Ile Val Gln Ala Lys
20 25 30
Asp Asn Ile Thr Asn Val Arg Leu Leu Arg Lys Glu Val Leu Gln Asn
35 40 45
Val Ser Asn Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Ile Arg Ala Leu Leu Lys Phe
50 55 60
Tyr Leu Asn Thr Val Phe Lys Asn Tyr Gln Asp Lys Ala Ala Asp Phe
65 70 75 80
Arg Val Arg Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Val Ile
85 90 95
Val Ser Lys Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Val Ser
100 105 110
Asp Ser Ala Arg Arg Arg Phe Leu Leu Phe Gln Arg Ala Phe Lys Gln
115 120 125
Leu Asp Ile Glu Ala Ala Gln Thr Lys Ala Phe Gly Glu Val Asp Ile
130 135 140
Leu Leu Thr Trp Met Glu Lys Phe Tyr Gln Leu
145 150 155
<210> 163
<211> 155
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-24 protein.
<400> 163
Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val Val Pro Gln
1 5 10 15
Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met Gln Ala Gln
20 25 30
Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val Leu Gln Asn
35 40 45
Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe
50 55 60
Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr Val Glu Val
65 70 75 80
Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile
85 90 95
Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Ile Arg
100 105 110
Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala Phe Lys Gln
115 120 125
Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp Ile
130 135 140
Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu
145 150 155
<210> 164
<211> 145
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-25 protein.
<400> 164
Cys Thr His Trp Pro Asn Cys Cys Pro Ser Lys Arg Gln Asp Pro Thr
1 5 10 15
His Glu Trp Leu Lys Arg Asp Thr Val Leu Lys Phe Pro Gly Glu Thr
20 25 30
Thr Ser Leu Thr His His Pro Glu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asp Gly
35 40 45
Pro Leu Asn Ser Arg Ser Ile Ser Pro Trp Lys Tyr Glu Leu Asp Arg
50 55 60
Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys
65 70 75 80
Gln His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp Pro Leu Gly
85 90 95
Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro
100 105 110
Cys Pro Gly Glu Gln Gly Ala Pro Asp Gly Tyr Cys Leu Glu Gln Arg
115 120 125
Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met
130 135 140
Ala
145
<210> 165
<211> 145
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-25 protein.
<400> 165
Leu Ser His Trp Ser Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln Asn Pro Thr
1 5 10 15
His Glu Trp Leu Thr Glu Asn Thr Val Leu Met Thr Pro Pro Glu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Ile His Ser Leu Glu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Gly
35 40 45
Pro Leu Asn Ser Arg Ser Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu Leu Asp Arg
50 55 60
Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys
65 70 75 80
Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp Pro Leu Gly
85 90 95
Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro
100 105 110
Cys Pro Gly Glu Gln Gly Thr Arg Asp Gly Tyr Cys Leu Glu Gln Arg
115 120 125
Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met
130 135 140
Ala
145
<210> 166
<211> 145
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-25 protein.
<400> 166
Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln Asp Thr Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro Leu Glu Pro
20 25 30
Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Gly
35 40 45
Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu Leu Asp Arg
50 55 60
Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys
65 70 75 80
Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp Pro Arg Gly
85 90 95
Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro
100 105 110
Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu Glu Arg Arg
115 120 125
Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met
130 135 140
Gly
145
<210> 167
<211> 150
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-26 family protein.
<400> 167
Lys His Lys Gln Ser Ser Ser Ala Lys Gly Cys Tyr Pro Arg Gly Thr
1 5 10 15
Leu Ser Gln Ala Val Asp Thr Leu Tyr Val Lys Ala Ala Trp Leu Lys
20 25 30
Ala Thr Ile Pro Glu Asp Arg Ile Lys Asn Ile Arg Leu Leu Arg Lys
35 40 45
Lys Thr Lys Asn Leu Phe Met Lys Asn Cys Arg Phe Gln Glu Gln Leu
50 55 60
Leu Ser Phe Phe Met Glu Asp Val Phe Gly Gln Leu Gln Leu Lys Ile
65 70 75 80
Cys Arg Glu Ile Arg Phe Val Glu Glu Leu His Ser Leu Arg Gln Gln
85 90 95
Leu Ser Arg Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ser Ala Arg Glu Met Lys Thr
100 105 110
Ile Thr Arg Met Lys Ser Thr Phe Tyr Gly Leu Gly Asn Lys Gly Ile
115 120 125
Tyr Lys Ala Ile Ser Glu Leu Asn Ile Leu Leu Ser Trp Ile Lys Gln
130 135 140
Phe Leu Glu Ser Ile Lys
145 150
<210> 168
<211> 127
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-26 protein.
<400> 168
Lys His Lys Gln Ser Ser Ser Ala Lys Gly Cys Tyr Pro Arg Gly Thr
1 5 10 15
Leu Ser Gln Ala Val Asp Arg Leu Tyr Val Lys Ala Ala Trp Leu Lys
20 25 30
Ala Thr Ile Pro Glu Asp Arg Ile Lys Asn Ile Arg Leu Leu Lys Lys
35 40 45
Lys Thr Lys Lys Leu Phe Met Lys Asn Cys Arg Phe Gln Glu Gln Leu
50 55 60
Leu Ser Phe Phe Met Asp Asp Val Phe Gly Gln Leu Gln Leu Gln Val
65 70 75 80
Cys Lys Glu Arg His Phe Val Glu Glu Phe His Ser Leu Arg Gln Gln
85 90 95
Leu Ser Arg Cys Val Leu Ser Trp Val Arg Lys Thr Ser Leu Ile Lys
100 105 110
Ser Pro Val Ser Gly Ala Cys Thr Leu Leu Thr Gly Arg Glu Met
115 120 125
<210> 169
<211> 150
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-26 family protein.
<400> 169
Lys His Lys Gln Ser Ser Ser Ala Lys Gly Cys Tyr Pro Arg Gly Thr
1 5 10 15
Leu Ser Gln Ala Val Asp Arg Leu Tyr Val Lys Ala Ala Trp Leu Lys
20 25 30
Ala Thr Ile Pro Glu Asp Arg Ile Lys Asn Ile Arg Leu Leu Lys Lys
35 40 45
Lys Thr Lys Lys Leu Phe Met Lys Asn Cys Arg Phe Gln Glu Gln Leu
50 55 60
Leu Ser Phe Phe Met Asp Asp Val Phe Gly Gln Leu Gln Leu Gln Val
65 70 75 80
Cys Lys Glu Arg His Phe Val Glu Glu Phe His Ser Leu Arg Gln Gln
85 90 95
Leu Ser Arg Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ser Ala Arg Glu Met Lys Thr
100 105 110
Ile Thr Arg Met Lys Arg Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Asn Lys Gly Ile
115 120 125
Tyr Lys Ala Val Ser Glu Leu Asp Ile Leu Leu Ser Trp Ile Lys Gln
130 135 140
Phe Leu Glu Ser Ile Lys
145 150
<210> 170
<211> 150
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-26 protein.
<400> 170
Lys His Lys Gln Ser Ser Phe Thr Lys Ser Cys Tyr Pro Arg Gly Thr
1 5 10 15
Leu Ser Gln Ala Val Asp Ala Leu Tyr Ile Lys Ala Ala Trp Leu Lys
20 25 30
Ala Thr Ile Pro Glu Asp Arg Ile Lys Asn Ile Arg Leu Leu Lys Lys
35 40 45
Lys Thr Lys Lys Gln Phe Met Lys Asn Cys Gln Phe Gln Glu Gln Leu
50 55 60
Leu Ser Phe Phe Met Glu Asp Val Phe Gly Gln Leu Gln Leu Gln Gly
65 70 75 80
Cys Lys Lys Ile Arg Phe Val Glu Asp Phe His Ser Leu Arg Gln Lys
85 90 95
Leu Ser His Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ser Ala Arg Glu Met Lys Ser
100 105 110
Ile Thr Arg Met Lys Arg Ile Phe Tyr Arg Ile Gly Asn Lys Gly Ile
115 120 125
Tyr Lys Ala Ile Ser Glu Leu Asp Ile Leu Leu Ser Trp Ile Lys Lys
130 135 140
Leu Leu Glu Ser Ser Gln
145 150
<210> 171
<211> 204
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-27 protein.
<400> 171
Phe Pro Arg Pro Pro Gly Arg Ser Pro Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg
1 5 10 15
Arg Glu Phe Lys Val Ser Leu Gln Leu Ala Lys Lys Leu Phe Ser Glu
20 25 30
Val Arg Ile Gln Ala His His Phe Ala Glu Ser Gln Leu Pro Gly Val
35 40 45
Ser Leu Asp Leu Leu Pro Leu Gly Asp Gln Leu Pro Asn Val Ser Leu
50 55 60
Pro Phe Gln Ala Trp His Ser Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe
65 70 75 80
Leu Ser Met Met Leu His Pro Phe His Ala Leu Leu Glu Ser Leu Gly
85 90 95
Ser Gln Gly Gly Trp Thr Ser Ser Glu Lys Met His Leu Trp Thr Met
100 105 110
Arg Leu Asp Leu Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Glu
115 120 125
Tyr Pro Pro Thr Cys Ser Thr Pro Arg Asp Gln His Thr Lys Leu Lys
130 135 140
Leu Ile Gly Ser Leu Leu Lys Thr Ser Pro Ala Gln Arg Leu Gly Lys
145 150 155 160
Phe Gly Gly Arg Cys Ser Arg Ser Ser Val Cys Val Cys Val Cys Val
165 170 175
Cys Val Cys Val Cys Val Cys Pro Arg Pro Arg Leu Cys Ser Leu Asn
180 185 190
Leu Cys Leu Pro Met Glu Ser Trp Ser Glu Gln Leu
195 200
<210> 172
<211> 208
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-27 protein.
<400> 172
Phe Pro Arg Pro Pro Gly Arg Pro Pro Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg
1 5 10 15
Arg Glu Phe Lys Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Phe Ser Glu
20 25 30
Val Arg Thr Gln Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val
35 40 45
Ser Leu Asp Leu Leu Pro Leu Gly Asp Arg Leu Pro Asn Val Ser Leu
50 55 60
Thr Phe Gln Ala Trp His Ser Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe
65 70 75 80
Leu Phe Met Thr Leu Arg Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Ser Leu Gly
85 90 95
Ser Gln Gly Gly Trp Thr Ser Ser Glu Lys Ile Asp Leu Trp Thr Met
100 105 110
Arg Leu Asp Leu Arg Asp Leu Gln Arg His Leu His Phe Gln Val Leu
115 120 125
Ala Ala Gly Leu Asn Leu Pro Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Arg Lys
130 135 140
Glu Pro Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gly Leu Ser Arg Val Ser Gly Gln
145 150 155 160
Pro Ser Trp Pro Gln Leu Leu Tyr Thr Tyr Gln Leu Leu His Ser Leu
165 170 175
Glu Leu Val Leu Ala Arg Ala Val Arg Asp Leu Leu Leu Leu Ser Gln
180 185 190
Ala Gly Asn Pro Ala Pro Ala Ser Gly Ser Ser Phe Gly Ser Trp Pro
195 200 205
<210> 173
<211> 171
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-29 protein.
<400> 173
Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Arg Arg Gly Cys His
1 5 10 15
Met Asp Arg Phe Gln Ser Leu Ser Pro Arg Glu Leu Glu Ala Phe Lys
20 25 30
Lys Thr Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Ser Trp Lys Asn Trp Ser
35 40 45
Cys Ser Ser Arg Leu Phe Pro Arg Ser Arg Asp Leu Arg Leu Leu Gln
50 55 60
Ala Trp Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Asp Leu Thr Leu
65 70 75 80
Lys Val Leu Glu Asn Met Thr Asp Ser Ser Leu Gly Val Thr Leu Asp
85 90 95
Gln Pro Leu Arg Thr Leu His His Ile His Ser Glu Leu Gln Ala Cys
100 105 110
Val Pro Ala Gln Pro Thr Ala Asp Pro Arg Pro His Gly Arg Leu His
115 120 125
His Trp Leu His Arg Leu Gln Lys Ala Pro Lys Glu Ser Gln Gly Cys
130 135 140
Leu Glu Ala Ser Ile Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Cys Val Ala Ser Arg Asp Leu Cys Val
165 170
<210> 174
<211> 170
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Dog IL-29 protein.
<400> 174
Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Met Ala Trp Arg Gly Cys Asp
1 5 10 15
Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Arg Glu Leu Glu Ala Phe Lys
20 25 30
Lys Ala Lys Asp Ala Leu Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Trp Ser Cys Asn
35 40 45
Ser Arg Leu Phe Pro Arg Asn Arg Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Trp
50 55 60
Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val
65 70 75 80
Leu Glu Thr Met Ala Asp Arg Ser Leu Gly Asp Ile Leu Asp Gln Pro
85 90 95
Leu His Thr Leu Arg His Ile His Ser Gln Leu Gln Ala Cys Val Ser
100 105 110
Ala Gln Pro Pro Ala Gly Pro Gln Pro Arg Gly Arg Leu His Pro Trp
115 120 125
Leu His Arg Leu His Glu Ala Ser Lys Lys Glu Ser Gln Gly Cys Leu
130 135 140
Glu Ala Ser Val Leu Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Lys Lys Asp Leu
145 150 155 160
Glu Cys Val Ala Val Gly Asp Leu Cys Val
165 170
<210> 175
<211> 171
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-29 protein.
<400> 175
Gly Pro Val Pro Thr Ser Arg Pro Pro Pro Thr Arg Arg Gly Cys His
1 5 10 15
Val Gly Lys Phe Pro Ser Leu Ser Pro Arg Glu Leu Glu Ala Phe Lys
20 25 30
Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Pro Leu Lys Asn Trp Ser
35 40 45
Cys Gly Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Arg Asp Leu Ile Arg Leu Gln
50 55 60
Ala Trp Glu Arg Pro Ala Ala Leu Glu Ala Glu Leu Asp Leu Thr Leu
65 70 75 80
Lys Val Leu Gly Asn Met Thr Asp Ser Ser Leu Gly Val Val Leu Asp
85 90 95
Gln Pro Leu Arg Val Val Arg His Ile His Ser Glu Leu Gln Ala Cys
100 105 110
Val Arg Ala Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His
115 120 125
His Trp Leu His Arg Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Ser Gln Gly Cys
130 135 140
Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Cys Val Thr Gly Gly Asp Leu Cys Val
165 170
<210> 176
<211> 171
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-29, IFN-lambda1 protein.
<400> 176
Gly Pro Val Pro Thr Ser Arg Pro Pro Pro Thr Arg Arg Gly Cys His
1 5 10 15
Val Gly Lys Phe Pro Ser Leu Ser Pro Arg Glu Leu Glu Ala Phe Lys
20 25 30
Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Pro Leu Lys Asn Trp Ser
35 40 45
Cys Gly Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Arg Asp Leu Ile Arg Leu Gln
50 55 60
Ala Trp Glu Arg Pro Ala Ala Leu Glu Ala Glu Leu Asp Leu Thr Leu
65 70 75 80
Lys Val Leu Gly Asn Met Thr Asp Ser Ser Leu Gly Val Val Leu Asp
85 90 95
Gln Pro Leu Arg Val Leu Arg His Ile His Ser Glu Leu Gln Ala Cys
100 105 110
Val Arg Ala Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His
115 120 125
His Trp Leu His Arg Leu Gln Arg Ala Pro Glu Glu Ser Gln Gly Cys
130 135 140
Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Cys Val Thr Gly Gly Asp Leu Cys Val
165 170
<210> 177
<211> 181
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-29, IFN-lambda1 protein.
<400> 177
Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His
1 5 10 15
Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala Ser Phe Lys
20 25 30
Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser
35 40 45
Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gln
50 55 60
Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu
65 70 75 80
Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp
85 90 95
Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu Gln Ala Cys
100 105 110
Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His
115 120 125
His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly
130 135 140
Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg
145 150 155 160
Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr
165 170 175
His Pro Glu Ser Thr
180
<210> 178
<211> 160
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Cat IL-32 protein.
<400> 178
Met Arg His Gln Met His Gln Leu Val Asp Ile Phe Cys Asp Arg Thr
1 5 10 15
Gln His Gln Ser Arg Gly Ala Pro Gln Gln Arg Leu Arg Leu Gly Glu
20 25 30
Val Glu Asp Gly Phe Asn Glu Ile Met Leu Glu Ala Val Asp Leu His
35 40 45
His His Gln Asn Asp Asp Glu Glu Ser Ser Pro Leu Leu Pro Glu Val
50 55 60
Arg Gln Glu Leu Arg Ser Arg Val Leu Arg Ser Ser Val Leu Asp Leu
65 70 75 80
Glu Glu Lys Glu His Pro Val Val Gln Lys Thr Glu Glu Ser Phe Cys
85 90 95
Asp Arg Ala Leu Arg Leu Phe Arg Arg Leu Leu Tyr Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Lys Trp Gln Ala Ala Leu Ala Trp Leu Arg Glu Lys Val Ala Ala Gly
115 120 125
Phe Gln Ala Phe Cys Asp Ala Val Glu Ala Ile Cys Ser Ala Phe Asn
130 135 140
Ser Phe Cys Thr Ser Val Ala Gln Val Phe Arg Ser Ala Val Gln Ala
145 150 155 160
<210> 179
<211> 214
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine IL-34 protein.
<400> 179
Asn Glu Gly Leu Glu Pro Trp Pro Leu Thr Arg Ser Asp Glu Cys Ala
1 5 10 15
Ile Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Leu Gln
20 25 30
Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Arg Val Ser Val Pro Tyr
35 40 45
Glu Gly Val Leu Arg Thr Ala Asn Val Thr Arg Leu Gln Arg Ala Gln
50 55 60
Val Ser Gln Gln Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu Val Ser Leu Ser
65 70 75 80
Ala Thr Glu Trp Val Gln Glu Val Leu Leu Glu Gly His Pro Ser Trp
85 90 95
Lys Tyr Leu Glu Glu Val His Thr Leu Leu Leu Asp Val Lys Gln Gly
100 105 110
Leu Gly Gly Val Glu Val Ser Pro Gln Val Glu Ala Val Leu Asn Leu
115 120 125
Leu Ser Ala Pro Gly Ser Leu Lys Leu Val Arg Pro Lys Ala Leu Leu
130 135 140
Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Gln Leu Leu Tyr Cys Pro Cys Cys Lys
145 150 155 160
Glu Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu Ala Pro Gln Pro Gln
165 170 175
Pro Arg Ser Pro Ala Ser Ala Gln Cys Glu Ala Ala Gln Leu Tyr Pro
180 185 190
Leu Pro Gln Pro Pro Ser Thr Ser Leu Pro Arg Val Leu Gly Pro Ser
195 200 205
Ala Gly Pro Pro Thr Gln
210
<210> 180
<211> 153
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-36-alpha protein.
<400> 180
Lys Ile Asp Thr Pro Gln Gln Gly Ser Ile Gln Asp Ile Asn His Arg
1 5 10 15
Val Trp Val Leu Gln Asp Gln Thr Leu Ile Ala Val Pro Arg Lys Asp
20 25 30
Arg Met Ser Pro Val Thr Ile Ala Leu Ile Ser Cys Arg His Val Glu
35 40 45
Thr Leu Glu Lys Asp Arg Gly Asn Pro Ile Tyr Leu Gly Leu Asn Gly
50 55 60
Leu Asn Leu Cys Leu Met Cys Ala Lys Val Gly Asp Gln Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Lys Glu Lys Asp Ile Met Asp Leu Tyr Asn Gln Pro Glu Pro
85 90 95
Val Lys Ser Phe Leu Phe Tyr His Ser Gln Ser Gly Arg Asn Ser Thr
100 105 110
Phe Glu Ser Val Ala Phe Pro Gly Trp Phe Ile Ala Val Ser Ser Glu
115 120 125
Gly Gly Cys Pro Leu Ile Leu Thr Gln Glu Leu Gly Lys Ala Asn Thr
130 135 140
Thr Asp Phe Gly Leu Thr Met Leu Phe
145 150
<210> 181
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-36-beta protein.
<400> 181
Arg Glu Ala Ala Pro Lys Ser Tyr Ala Ile Arg Asp Ser Arg Gln Met
1 5 10 15
Val Trp Val Leu Ser Gly Asn Ser Leu Ile Ala Ala Pro Leu Ser Arg
20 25 30
Ser Ile Lys Pro Val Thr Leu His Leu Ile Ala Cys Arg Asp Thr Glu
35 40 45
Phe Ser Asp Lys Glu Lys Gly Asn Met Val Tyr Leu Gly Ile Lys Gly
50 55 60
Lys Asp Leu Cys Leu Phe Cys Ala Glu Ile Gln Gly Lys Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Lys Leu Gln Gly Ser Gln Asp Asn Ile Gly Lys Asp Thr Cys
85 90 95
Trp Lys Leu Val Gly Ile His Thr Cys Ile Asn Leu Asp Val Arg Glu
100 105 110
Ser Cys Phe Met Gly Thr Leu Asp Gln Trp Gly Ile Gly Val Gly Arg
115 120 125
Lys Lys Trp Lys Ser Ser Phe Gln His His His Leu Arg Lys Lys Asp
130 135 140
Lys Asp Phe Ser Ser Met Arg Thr Asn Ile Gly Met Pro Gly Arg Met
145 150 155 160
<210> 182
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-36-gamma protein.
<400> 182
Ser Met Cys Lys Pro Ile Thr Gly Thr Ile Asn Asp Leu Asn Gln Gln
1 5 10 15
Val Trp Thr Leu Gln Gly Gln Asn Leu Val Ala Val Pro Arg Ser Asp
20 25 30
Ser Val Thr Pro Val Thr Val Ala Val Ile Thr Cys Lys Tyr Pro Glu
35 40 45
Ala Leu Glu Gln Gly Arg Gly Asp Pro Ile Tyr Leu Gly Ile Gln Asn
50 55 60
Pro Glu Met Cys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Gly Glu Gln Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Lys Glu Gln Lys Ile Met Asp Leu Tyr Gly Gln Pro Glu Pro
85 90 95
Val Lys Pro Phe Leu Phe Tyr Arg Ala Lys Thr Gly Arg Thr Ser Thr
100 105 110
Leu Glu Ser Val Ala Phe Pro Asp Trp Phe Ile Ala Ser Ser Lys Arg
115 120 125
Asp Gln Pro Ile Ile Leu Thr Ser Glu Leu Gly Lys Ser Tyr Asn Thr
130 135 140
Ala Phe Glu Leu Asn Ile Asn Asp
145 150
<210> 183
<211> 193
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canis IL-37 protein.
<400> 183
Met Ser Phe Leu Glu Asp Ser Gly Val Lys Met Glu Ser Glu Asp Trp
1 5 10 15
Glu Arg Asp Glu Pro His Gly Cys Ser Glu Gly Pro Lys Val Lys Val
20 25 30
Ser Tyr Pro Glu Lys Phe Ser Ile His Asp Arg Asp His Lys Val Leu
35 40 45
Val Leu Asp Cys Asp Thr Leu Arg Ala Val Pro Phe Lys Thr Tyr Ile
50 55 60
Arg Pro Glu Met Phe Phe Val Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser
65 70 75 80
Lys Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Ala Val Cys Lys Gly Glu Leu
85 90 95
Cys Leu Cys Cys Glu Lys Asp Arg Arg Gln Ser Gln Pro Ser Leu Gln
100 105 110
Leu Lys Lys Lys Lys Leu Thr Asn Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala
115 120 125
Arg Gln Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Thr Lys Val Gly Ser Gln Asn Arg
130 135 140
Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Arg Asn
145 150 155 160
Ser Gly Glu Pro Val Gly Val Thr Asn Val Leu Gly Lys Arg Lys His
165 170 175
Thr Glu Phe Ser Phe His Arg Ala Glu Thr Ser Pro Ser Glu Val Ser
180 185 190
Gly
<210> 184
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-38 protein.
<400> 184
Met Cys Ser Leu Pro Met Ala Arg Tyr Tyr Ile Ile Lys Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Gln Lys Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Gly Gln Leu Leu Val Gly Asp Pro
20 25 30
Val Ala Asp Asn Cys Cys Ala Glu Lys Ile Cys Ile Leu Pro Asn Arg
35 40 45
Gly Leu Ala Arg Thr Lys Val Pro Ile Phe Leu Gly Ile Gln Gly Gly
50 55 60
Ser Arg Cys Leu Ala Cys Val Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ser Leu Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asp Val Asn Ile Glu Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Glu Glu Ala
85 90 95
Thr Arg Phe Thr Phe Phe Gln Ser Ser Ser Gly Ser Ala Phe Arg Leu
100 105 110
Glu Ala Ala Ala Trp Pro Gly Trp Phe Leu Cys Gly Pro Ala Glu Pro
115 120 125
Gln Gln Pro Val Gln Leu Thr Lys Glu Ser Glu Pro Ser Ala Arg Thr
130 135 140
Lys Phe Tyr Phe Glu Gln Ser Trp
145 150
<210> 185
<211> 245
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-40 protein.
<400> 185
Arg Glu Glu Glu Ile Thr Pro Val Val Ser Ile Ala Tyr Lys Val Leu
1 5 10 15
Glu Val Phe Pro Lys Gly Arg Trp Val Leu Ile Thr Cys Cys Ala Pro
20 25 30
Gln Pro Pro Pro Pro Ile Thr Tyr Ser Leu Cys Gly Thr Lys Asn Ile
35 40 45
Lys Val Ala Lys Lys Val Val Lys Thr His Glu Pro Ala Ser Phe Asn
50 55 60
Leu Asn Val Thr Leu Lys Ser Ser Pro Asp Leu Leu Thr Tyr Phe Cys
65 70 75 80
Trp Ala Ser Ser Thr Ser Gly Ala His Val Asp Ser Ala Arg Leu Gln
85 90 95
Met His Trp Glu Leu Trp Ser Lys Pro Val Ser Glu Leu Arg Ala Asn
100 105 110
Phe Thr Leu Gln Asp Arg Gly Ala Gly Pro Arg Val Glu Met Ile Cys
115 120 125
Gln Ala Ser Ser Gly Ser Pro Pro Ile Thr Asn Ser Leu Ile Gly Lys
130 135 140
Asp Gly Gln Val His Leu Gln Gln Arg Pro Cys His Arg Gln Pro Ala
145 150 155 160
Asn Phe Ser Phe Leu Pro Ser Gln Thr Ser Asp Trp Phe Trp Cys Gln
165 170 175
Ala Ala Asn Asn Ala Asn Val Gln His Ser Ala Leu Thr Val Val Pro
180 185 190
Pro Gly Gly Asp Gln Lys Met Glu Asp Trp Gln Gly Pro Leu Glu Ser
195 200 205
Pro Ile Leu Ala Leu Pro Leu Tyr Arg Ser Thr Arg Arg Leu Ser Glu
210 215 220
Glu Glu Phe Gly Gly Phe Arg Ile Gly Asn Gly Glu Val Arg Gly Arg
225 230 235 240
Lys Ala Ala Ala Met
245
<210> 186
<211> 247
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canis IL-40 isoform X2 protein.
<400> 186
Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Ala Thr Cys Ser
1 5 10 15
Phe Ser Leu Glu Gln Glu Val Glu Val Thr Pro Glu Thr Phe Ile Ala
20 25 30
Tyr Lys Val Arg Glu Val Phe Pro Ser Ser Arg Arg Val Val Ile Thr
35 40 45
Cys His Ser Pro Arg Ala Pro Pro Pro Ile Thr Tyr Ser Leu Trp Gly
50 55 60
Ser Gln Gly Val Glu Val Ala Lys Lys Val Val Lys Thr Gly Asp Pro
65 70 75 80
Ala Ser Phe Ser Ile Asn Ile Thr Leu Lys Ser Arg Pro Glu Leu Leu
85 90 95
Thr Tyr Ser Cys Arg Ala Ala Ser Leu Arg Gly Glu His Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Leu Gln Met Tyr Trp Glu Leu Trp Ala Lys Pro Met Ala Gln
115 120 125
Pro Arg Ala Asn Phe Val Leu Leu Glu Arg Gly Ser Gly Pro Arg Val
130 135 140
Glu Ile Ser Cys Gln Val Ser Ser Gly Ser Pro Pro Ile Thr Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Val Arg Lys Asp Gly Tyr Val His Arg Gln Gln Arg Pro Thr Tyr
165 170 175
Gly Gln Pro Ala Asn Phe Ser Phe Pro Leu Thr Arg Thr Ser Asn Trp
180 185 190
Leu Arg Cys Gln Ala Ala Asn Asp Ile Ser Val Gln Ser Ser Pro Phe
195 200 205
Arg Leu Val Pro Pro Gly Tyr Leu Pro Gln Gly Pro Val Leu Val Leu
210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ile Ala Ala Val Thr Ser Trp Val Leu Gly
225 230 235 240
Pro Ala Leu Trp Thr Arg Leu
245
<210> 187
<211> 266
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Human IL-41, Meteorin-like protein.
<400> 187
Gln Tyr Ser Ser Asp Arg Cys Ser Trp Lys Gly Ser Gly Leu Thr His
1 5 10 15
Glu Ala His Arg Lys Glu Val Glu Gln Val Tyr Leu Arg Cys Ala Ala
20 25 30
Gly Ala Val Glu Trp Met Tyr Pro Thr Gly Ala Leu Ile Val Asn Leu
35 40 45
Arg Pro Asn Thr Phe Ser Pro Ala Arg His Leu Thr Val Cys Ile Arg
50 55 60
Ser Phe Thr Asp Ser Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Leu Glu Lys Thr Gly
65 70 75 80
Glu Leu Arg Leu Leu Val Pro Asp Gly Asp Gly Arg Pro Gly Arg Val
85 90 95
Gln Cys Phe Gly Leu Glu Gln Gly Gly Leu Phe Val Glu Ala Thr Pro
100 105 110
Gln Gln Asp Ile Gly Arg Arg Thr Thr Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Val
115 120 125
Arg Arg His Arg Ala Ser Asp Leu His Glu Leu Ser Ala Pro Cys Arg
130 135 140
Pro Cys Ser Asp Thr Glu Val Leu Leu Ala Val Cys Thr Ser Asp Phe
145 150 155 160
Ala Val Arg Gly Ser Ile Gln Gln Val Thr His Glu Pro Glu Arg Gln
165 170 175
Asp Ser Ala Ile His Leu Arg Val Ser Arg Leu Tyr Arg Gln Lys Ser
180 185 190
Arg Val Phe Glu Pro Val Pro Glu Gly Asp Gly His Trp Gln Gly Arg
195 200 205
Val Arg Thr Leu Leu Glu Cys Gly Val Arg Pro Gly His Gly Asp Phe
210 215 220
Leu Phe Thr Gly His Met His Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala
225 230 235 240
Pro Arg Phe Lys Asp Phe Gln Arg Met Tyr Arg Asp Ala Gln Glu Arg
245 250 255
Gly Leu Asn Pro Cys Glu Val Gly Thr Asp
260 265
<210> 188
<211> 296
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canine IL-41, Meteorin-like protein.
<400> 188
Met Pro Pro Ser Val Met Ser Gln Met Cys Thr Phe Leu His Arg Gln
1 5 10 15
Gln Phe Cys Thr Asn Arg Ser Phe Phe Gly Phe Ala Val Ala Leu Glu
20 25 30
His Arg Ser Glu Arg Phe Asp Gln Ile Phe Cys Gly Leu Thr His Glu
35 40 45
Ala His Arg Lys Glu Val Glu Gln Val Tyr Leu Arg Cys Ser Ala Gly
50 55 60
Ser Val Glu Trp Met Tyr Pro Thr Gly Ala Leu Ile Val Asn Val Arg
65 70 75 80
Pro Asn Thr Phe Pro Pro Ser Arg His Leu Thr Leu Cys Ile Lys Pro
85 90 95
Leu Lys Asp Ser Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Leu Glu Lys Thr Gly Glu
100 105 110
Leu Lys Leu Leu Val Arg Asp Gly Asp Arg Gly Pro Gly Gln Val Arg
115 120 125
Cys Phe Gly Phe Glu Gln Gly Gly Leu Phe Val Glu Ala Ala Pro Gln
130 135 140
Gln Asp Ile Ser Arg Arg Thr Thr Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Thr Ser
145 150 155 160
Arg His Ala Glu Ser Asp Leu His Thr Leu Ser Ala Pro Cys Arg Pro
165 170 175
Cys Ser Asp Ala Glu Val Leu Leu Ala Val Cys Thr Ser Asp Phe Val
180 185 190
Val Arg Gly Ser Ile Gln Asn Val Thr His Val Pro Glu Gln Gln Glu
195 200 205
Ser Ala Ile His Leu Arg Val Ser Arg Leu Tyr Arg Gln Lys Ser Arg
210 215 220
Val Phe Arg Pro Ala Pro Glu Gly Gly Gly Trp Arg Gly Arg Val Ala
225 230 235 240
Thr Leu Leu Glu Cys Gly Val Arg Pro Gly Arg Gly Glu Phe Leu Phe
245 250 255
Thr Gly His Met His Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg
260 265 270
Phe Lys Asp Phe Gln Arg Met Tyr Gln Asp Ala Glu Glu Arg Gly Leu
275 280 285
Asn Pro Cys Glu Met Gly Lys Asp
290 295
<210> 189
<211> 266
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Feline IL-41, Meteorin-like protein.
<400> 189
Gln Tyr Ser Ser Asp Arg Cys Ser Trp Lys Gly Ser Gly Leu Thr His
1 5 10 15
Glu Ala His Arg Lys Glu Val Glu Gln Val Tyr Leu Arg Cys Ser Ala
20 25 30
Gly Ser Val Glu Trp Met Tyr Pro Thr Gly Ala Leu Ile Val Asn Val
35 40 45
Arg Pro Asn Thr Phe Pro Pro Ser Arg Arg His Leu Thr Leu Cys Ile
50 55 60
Lys Pro Leu Arg Asp Ser Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Leu Glu Lys Thr
65 70 75 80
Gly Glu Leu Gln Leu Leu Val Arg Asp Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gln
85 90 95
Val His Cys Phe Gly Phe Glu Gln Arg Gly Leu Phe Val Glu Ala Thr
100 105 110
Pro Gln Gln Asp Ile Ser Arg Arg Thr Thr Gly Phe Gln Tyr Glu Leu
115 120 125
Thr Ser Arg His Ala Glu Ser Asp Leu Arg Ala Gln Ser Ala Pro Cys
130 135 140
Arg Pro Cys Ser Asp Thr Glu Val Leu Leu Ala Val Cys Thr Ser Asp
145 150 155 160
Phe Val Val Arg Gly Ser Ile Gln Asp Val Thr His Glu Pro Glu Gln
165 170 175
Gln Glu Ser Ala Ile His Leu His Val Asn Arg Leu Tyr Arg Gln Lys
180 185 190
Ser Thr Val Phe Arg Pro Ala Pro Glu Gly Gly Gly Trp Arg Gly His
195 200 205
Val Thr Thr Leu Leu Glu Cys Gly Val Arg Pro Gly Arg Gly Glu Phe
210 215 220
Leu Phe Thr Gly Pro Ile His Phe Gly Glu Ala His Leu Gly Cys Ala
225 230 235 240
Pro Arg Phe Lys Asp Phe Gln Arg Met Tyr Lys Asp Ala Glu Glu Lys
245 250 255
Gly Leu Asn Pro Cys Glu Met Gly Thr Glu
260 265
<210> 190
<211> 143
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine interferon-gamma protein.
<400> 190
Gln Gly Gln Phe Phe Arg Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Ser Ser Pro Asp Val Ala Lys Gly Gly Pro Leu Phe Ser Glu Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Asp Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gln
50 55 60
Val Ile Gln Arg Ser Met Asp Ile Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Lys
65 70 75 80
Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu Glu Asp Phe Lys Lys Leu Ile
85 90 95
Gln Ile Pro Val Asp Asp Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ser Asn Leu Arg Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Met
130 135 140
<210> 191
<211> 143
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canis interferon-gamma protein.
<400> 191
Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile
20 25 30
Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln
50 55 60
Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys
65 70 75 80
Phe Leu Asn Ser Ser Thr Ser Lys Arg Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile
85 90 95
Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Lys
130 135 140
<210> 192
<211> 144
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Felis interferon-gamma protein.
<400> 192
Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu Glu Leu Lys Gly Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Ser Asn Pro Asp Val Ala Asp Gly Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Met Phe Glu Asn Leu Lys Asp Asp Asp
50 55 60
Gln Arg Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile Lys Glu Asp Met Leu Asp
65 70 75 80
Lys Leu Leu Asn Thr Ser Ser Ser Lys Arg Asp Asp Phe Leu Lys Leu
85 90 95
Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val Gln Arg Lys Ala Ile Asn
100 105 110
Glu Leu Phe Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg
115 120 125
Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Lys
130 135 140
<210> 193
<211> 166
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine interferon-alpha A protein.
<400> 193
Cys His Leu Pro His Thr His Ser Leu Ala Asn Arg Arg Val Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Gln Gln Leu Arg Arg Val Ser Pro Ser Ser Cys Leu Gln Asp
20 25 30
Arg Asn Asp Phe Glu Phe Leu Gln Glu Ala Leu Gly Gly Ser Gln Leu
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Val Thr Gln His Thr
50 55 60
Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Pro Ala Thr Trp Asp Lys Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Leu Arg Ala Ala Leu Asp Gln Gln Leu Thr Asp Leu
85 90 95
Gln Ala Cys Leu Thr Gln Glu Glu Gly Leu Arg Gly Ala Pro Leu Leu
100 105 110
Lys Glu Asp Ser Ser Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Arg His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Phe Arg Arg Lys Asp
165
<210> 194
<211> 164
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canine interferon-alpha 1 of 2 protein.
<400> 194
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys
<210> 195
<211> 171
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Feline interferon-alpha protein.
<400> 195
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Gly Leu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Pro Ala Ser Ser Cys Gln Lys Asp
20 25 30
Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe Gly Gly Asp Gln Ser
35 40 45
His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Thr Asn Gln Lys Ile
50 55 60
Phe His Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr
65 70 75 80
Thr Leu Leu Glu Glu Phe Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Arg
85 90 95
Leu Glu Ala Cys Val Leu Gln Glu Val Glu Glu Gly Glu Ala Pro Leu
100 105 110
Thr Asn Glu Asp Ile His Pro Glu Asp Ser Ile Leu Arg Asn Tyr Phe
115 120 125
Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala
130 135 140
Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Tyr Tyr Ser Ser
145 150 155 160
Thr Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys
165 170
<210> 196
<211> 126
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor protein.
<400> 196
Ala Pro Thr Arg Pro Pro Asn Thr Ala Thr Arg Pro Trp Gln His Val
1 5 10 15
Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn His Ser Ser Asp Thr
20 25 30
Asp Ala Val Met Asn Asp Thr Glu Val Val Ser Glu Lys Phe Asp Ser
35 40 45
Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Lys Leu Tyr Lys Asn Gly
50 55 60
Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser Leu Met Gly Ser Leu Thr Met Met Ala
65 70 75 80
Thr His Tyr Glu Lys His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Gly
85 90 95
Thr Gln Phe Ile Ser Phe Lys Asn Phe Lys Glu Asp Leu Lys Glu Phe
100 105 110
Leu Phe Ile Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Ala Gln Lys
115 120 125
<210> 197
<211> 127
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canine Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor protein.
<400> 197
Ala Pro Thr Arg Ser Pro Thr Leu Val Thr Arg Pro Ser Gln His Val
1 5 10 15
Asp Ala Ile Gln Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Asn Asp Val
20 25 30
Thr Ala Val Met Asn Lys Ala Val Lys Val Val Ser Glu Val Phe Asp
35 40 45
Pro Glu Gly Pro Thr Cys Leu Glu Thr Arg Leu Gln Leu Tyr Lys Glu
50 55 60
Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser Leu Lys Asn Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Ser Pro Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Asn Ile Asn Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Phe Asn Ile Pro Phe Asp Cys Trp Lys Pro Val Lys Lys
115 120 125
<210> 198
<211> 127
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Feline GM-CSF protein.
<400> 198
Ala Pro Thr Ser Ser Pro Ser Ser Val Thr Arg Pro Trp Gln His Val
1 5 10 15
Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Ser Glu Ile
20 25 30
Thr Ala Val Met Asn Glu Ala Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Pro Glu Glu Pro Lys Cys Met Gln Thr His Leu Lys Leu Tyr Glu Gln
50 55 60
Gly Leu Arg Gly Ser Leu Ile Ser Leu Lys Glu Pro Leu Arg Met Met
65 70 75 80
Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro Leu Thr Pro Glu Thr Pro Cys
85 90 95
Glu Thr Gln Thr Ile Thr Phe Lys Asn Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Phe Asn Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Asp Gln Lys
115 120 125
<210> 199
<211> 174
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Bovine Granulocyte colony-stimulating factor protein.
<400> 199
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln
20 25 30
Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Met
35 40 45
Leu Leu Arg His Ser Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Gln Ser Leu Gln Leu Thr Ser Cys Leu Asn Gln Leu His Gly
65 70 75 80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp
100 105 110
Phe Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Gly Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Val Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Gln Leu His Arg Phe
145 150 155 160
Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Gly Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170
<210> 200
<211> 175
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Canine Granulocyte colony-stimulating factor protein.
<400> 200
Met Ala Pro Leu Gly Pro Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Met Arg Lys Val Gln Ala Asp Gly Thr Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Thr Leu Cys Ala Thr His Gln Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ala Leu Gly Ile Pro Gln Pro Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Met Gly Cys Leu Arg Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Thr Thr
100 105 110
Asp Phe Ala Ile Asn Ile Trp Gln Gln Met Glu Asp Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Val Pro Pro Thr Gln Gly Thr Met Pro Ala Phe Thr Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Phe Ala Lys Pro
165 170 175
<210> 201
<211> 174
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<223> This is the amino acid sequence of Feline Granulocyte colony-stimulating factor protein.
<400> 201
Thr Pro Leu Gly Pro Thr Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Val Gln Ala Asp Gly Thr Ala Leu Gln
20 25 30
Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ala Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Arg Gln Leu His Ser
65 70 75 80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Met Leu Gln Leu Asp Ile Thr Asp
100 105 110
Phe Ala Ile Asn Ile Trp Gln Gln Met Glu Asp Val Gly Met Ala Pro
115 120 125
Ala Val Pro Pro Thr Gln Gly Thr Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Phe Thr Lys Pro
165 170
<210> 202
<211> 1803
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 202 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-cIL-4-cIL-13-poly encoding the cIL-4 cIL-13 polyprotein
construct of Example 1h.
<400> 202
gaattcccgc cgccaccatg ggttggagtt gcatcatcct atttctagtg gccacagcta 60
ccggcgtgca ctccagcccc tctcctgtga ccccatcccc tacactgaag gagctgatcg 120
aggaactcgt gaacatcacc cagaaccagg cctctctgtg taacggctcc atggtctggt 180
ccgtgaatct gaccgccggc atgtactgtg ccgctctgga atccctcatc aacgtgtctg 240
actgttccgc catccaaaga acccagcgga tgctgaaagc tctgtgctcc cagaagcctg 300
ctgccggcca gatcagctcc gagagatcca gagataccaa gatcgaggtg attcagctgg 360
tgaagaacct gctgacctac gtgcggggag tgtatagaca tggcaatttc agaggctctg 420
gcggacagta catcaaggcc aactccaagt tcatcggcat caccgagctg gcgggctctg 480
gccacaactt caatatcaca atcaaggaga tcatcaagat gctgaacatc ctgaccgccc 540
ggaacgactc ttgcatggaa ctgactgtga aggacgtgtt caccgctccc aagaacacat 600
ctgacaagga aatcttctgc cgggccgcca ccgtgctgag acagatctac acccacaact 660
gctccaacag atacctgagg ggcctgtacc gtaacctgtc ttccatggcc aacaaaacct 720
gctccatgaa cgagatcaag aagtctaccc tgaaggactt cctggaacgg ctgaaggtga 780
tcatgcaaaa gaagtactac cggcacgccg gttctgggtt taacaacttc acagtgtctt 840
tttggctgag agtgcccaaa gtctccgctt cgcacctgga gtccggcggc tcgtctcctt 900
ctcctgtgac ccctagccct accctgaaag agctcatcga ggaactggtc aacatcaccc 960
agaatcaggc ttccctgtgc aacggctcca tggtctggag cgtaaacctg accgctggaa 1020
tgtactgtgc cgccctggaa tctctgatta acgtgtccga ctgctccgct atccagagaa 1080
cacaaagaat gctgaaggcc ctgtgctctc agaagcctgc cgctggccag atctcctctg 1140
agaggtcccg ggacaccaag atcgaagtga tccagctggt gaagaacctg ctgacctacg 1200
tgcggggcgt gtacagacac ggcaacttcc ggggcggcgg cggccataac ttcaacatca 1260
ccatcaaaga gatcatcaag atgctgaaca tcctgaccgc cagaaacgat tcttgcatgg 1320
aactgactgt gaaggacgtg ttcaccgccc ctaagaacac ctccgataag gagatcttct 1380
gcagagctgc taccgtgctg cggcagatct acacccacaa ctgctccaac cggtatctga 1440
gaggcctgta cagaaacctg agctctatgg ccaacaagac ctgtagcatg aacgagatca 1500
agaagtccac cctgaaggat ttcttggaga gactgaaggt gatcatgcag aaaaagtact 1560
acagacacgc tggctctggc ttcaacaact ttacagtgtc cttctggctg cgggtgccaa 1620
aagtgtccgc ctcccacctc gaggccggca gcggcttcaa caattttacc gtcagcttct 1680
ggctgcgcgt ccctaaggtg tccgcttctc acctggaggg cagcggagga cagtacatca 1740
aggccaattc taagttcatc ggcatcaccg agctgcacca ccaccatcat cactgataag 1800
ctt 1803
<210> 203
<211> 573
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 203 is the amino acid sequence of the cIL-13-cIL-4
polyprotein used for the vaccine construct of Example 13h
<400> 203
Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Thr Leu Lys Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Gly Ser
20 25 30
Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu
35 40 45
Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Ser Ala Ile Gln Arg Thr Gln
50 55 60
Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser Gln Lys Pro Ala Ala Gly Gln Ile
65 70 75 80
Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ile Gln Leu Val
85 90 95
Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg Gly Val Tyr Arg His Gly Asn Phe
100 105 110
Arg Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
115 120 125
Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gly His Asn Phe Asn Ile Thr Ile Lys
130 135 140
Glu Ile Ile Lys Met Leu Asn Ile Leu Thr Ala Arg Asn Asp Ser Cys
145 150 155 160
Met Glu Leu Thr Val Lys Asp Val Phe Thr Ala Pro Lys Asn Thr Ser
165 170 175
Asp Lys Glu Ile Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Ile Tyr
180 185 190
Thr His Asn Cys Ser Asn Arg Tyr Leu Arg Gly Leu Tyr Arg Asn Leu
195 200 205
Ser Ser Met Ala Asn Lys Thr Cys Ser Met Asn Glu Ile Lys Lys Ser
210 215 220
Thr Leu Lys Asp Phe Leu Glu Arg Leu Lys Val Ile Met Gln Lys Lys
225 230 235 240
Tyr Tyr Arg His Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe
245 250 255
Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Gly
260 265 270
Ser Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Thr Leu Lys Glu Leu Ile
275 280 285
Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Gly
290 295 300
Ser Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
305 310 315 320
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Ser Ala Ile Gln Arg Thr
325 330 335
Gln Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser Gln Lys Pro Ala Ala Gly Gln
340 345 350
Ile Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ile Gln Leu
355 360 365
Val Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg Gly Val Tyr Arg His Gly Asn
370 375 380
Phe Arg Gly Gly Gly Gly His Asn Phe Asn Ile Thr Ile Lys Glu Ile
385 390 395 400
Ile Lys Met Leu Asn Ile Leu Thr Ala Arg Asn Asp Ser Cys Met Glu
405 410 415
Leu Thr Val Lys Asp Val Phe Thr Ala Pro Lys Asn Thr Ser Asp Lys
420 425 430
Glu Ile Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Ile Tyr Thr His
435 440 445
Asn Cys Ser Asn Arg Tyr Leu Arg Gly Leu Tyr Arg Asn Leu Ser Ser
450 455 460
Met Ala Asn Lys Thr Cys Ser Met Asn Glu Ile Lys Lys Ser Thr Leu
465 470 475 480
Lys Asp Phe Leu Glu Arg Leu Lys Val Ile Met Gln Lys Lys Tyr Tyr
485 490 495
Arg His Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
500 505 510
Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ala Gly Ser Gly Phe
515 520 525
Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
530 535 540
Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys
545 550 555 560
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu His His His His His His
565 570
<210> 204
<211> 2775
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 204 is the nucleic acid sequence of the plasmid
pcDNA3.4-cIL31-cIL-13-cIL-4-poly encoding the
cIL-31-cIL-13-cIL-4-poly-His6 construct of Example 1i.
<400> 204
gaattcccgc cgccaccatg ggatggagct gcatcatcct gttcctggtg gccacagcca 60
ccggcgtgca ctccagccac atggccccta cccaccagct gccaccttct gatgtgcgga 120
agatcatcct ggagctgcag cctctgagca gaggcctgct ggaagattac cagaagaaag 180
aaaccggcgt gcccgagagc aatagaaccc tcctgctgtg tctgaccagc gattcccagc 240
cccctagact gaacagctcc gcaatcctgc cttacttcag agccatccgg cccctgtccg 300
acaagaacat catagacaag atcatcgagc agctggacaa gctgaagttc cagcacgagc 360
ctgagactga gatctccgtg cctgctgata ccttcgagtg taaatccttc atcctgacca 420
tcttgcagca gttcagcgcc tgtctggaat cagtgttcaa gagcctgaac tctggccctc 480
agggcggcgg cggattcaac aacttcacag tgtccttctg gctgagggtg cccaaggtgt 540
ctgcctctca tctggagagc ggaggctcta gccctagccc agtgacccct agccccaccc 600
tgaaggagtt gatcgaggaa ctggtgaata tcacgcagaa ccaggccagc ctgtgcaacg 660
gctccatggt ttggagcgtt aacctgacgg ctgggatgta ctgcgctgct ctggagtccc 720
tgatcaacgt gagcgattgc agcgctatcc agagaactca gcggatgctg aaggccctgt 780
gcagccagaa gcctgccgcc ggtcagatca gctctgagag aagcagagac accaagattg 840
aagtgatcca gctggtgaag aacctcctga cctacgtgcg gggcgtgtac agacacggca 900
atttccgcgg ctctggcggc cagtacatca aggccaactc caagttcatt ggaatcacag 960
agctggccgg ctcgggtcac aacttcaata taacaatcaa agagatcatc aagatgctaa 1020
atatcctgac cgccagaaac gactcctgta tggaactcac agtcaaagac gtctttacag 1080
ccccaaagaa cacctcggac aaggagattt tctgcagagc tgcaaccgtg ctgcggcaga 1140
tctataccca caactgcagc aacagatatc tgcgcggcct gtacagaaac ctgagcagca 1200
tggccaataa gacctgcagc atgaacgaga tcaagaaaag taccctgaaa gacttcctgg 1260
aaagactgaa agtgatcatg cagaagaagt actacaggca tgccggatcc ggttttaaca 1320
acttcacagt tagcttctgg ctgcgggtgc ccaaggtgag cgccagccac ctggagagcg 1380
gcggcagtag ccacatggca ccaacccacc aactgcctcc ttccgacgtg cggaagatca 1440
tcctcgaact gcagcctctg agcagaggac tgctggagga ctaccagaag aaggaaaccg 1500
gagttcctga aagcaacaga accctgctgc tgtgcctgac atctgacagc cagcctcctc 1560
ggctgaacag cagcgctatc cttccatact ttcgggccat cagacccctg agcgacaaga 1620
acatcatcga caagatcatc gaacagctcg acaagctgaa atttcagcat gagcctgaaa 1680
cagaaatcag cgtgcccgcc gatacattcg agtgcaagag cttcattctg accatcctgc 1740
aacagttcag cgcttgcctg gagagcgtct tcaagtctct gaacagcggc ccccagggcg 1800
gcggcggcca atacatcaag gccaacagca agttcatcgg aattacagag ctggccggaa 1860
gcggctctcc cagccctgtg acaccttctc ctacactgaa ggaactgatc gaggaactcg 1920
tcaacatcac ccagaatcag gcctccctgt gtaacggcag catggtgtgg tcggtgaacc 1980
tgactgccgg catgtactgt gccgccctgg agagcctgat caacgtgtct gactgcagcg 2040
ccatccagag aacccagaga atgctcaagg ccctttgttc tcagaaacct gccgccggac 2100
aaatcagcag cgagagatct agagatacca agatcgaggt gatccaactg gtgaagaacc 2160
tgctgacata cgtgcggggc gtgtaccggc acggaaattt tcggggcgga ggcggcttca 2220
acaacttcac cgtgagcttc tggctgagag tgcctaaggt gagcgccagc cacctggaag 2280
gcagcggcgg ccacaacttc aacatcacca tcaaggagat catcaagatg ctgaacatcc 2340
tgacagccag aaacgacagc tgcatggaac tgaccgtgaa ggacgtgttc accgccccta 2400
agaacaccag cgataaagaa atcttttgca gagccgcaac agtgctgaga cagatctaca 2460
cccacaattg ctccaacagg taccttagag gcctgtaccg gaacctgagc tctatggcca 2520
acaagacatg ctcaatgaat gagatcaaga agagtaccct gaaggatttc ctggagcggc 2580
tgaaggtgat catgcagaaa aaatattaca gacacgccgg cagcggcttt aacaatttca 2640
ccgtgagctt ctggctgaga gtgcctaagg tgagcgccag ccacctggag ggcagcggcg 2700
gccaatacat caaagctaat tctaagttta tcggcatcac cgagctgcac caccatcacc 2760
accactgata agctt 2775
<210> 205
<211> 897
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 205 is the amino acid sequence of the
cIL-31-cIL-13-cIL-4 polyprotein used for the vaccine construct of
Example 13i.
<400> 205
Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys
1 5 10 15
Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr
20 25 30
Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu
35 40 45
Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile
50 55 60
Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile
65 70 75 80
Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro
85 90 95
Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe
100 105 110
Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe
115 120 125
Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Gly Gly Gly Gly Phe Asn Asn Phe
130 135 140
Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Ser Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Thr Leu
165 170 175
Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Ala Gly Met
195 200 205
Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Ser Ala
210 215 220
Ile Gln Arg Thr Gln Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser Gln Lys Pro
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gln Ile Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu
245 250 255
Val Ile Gln Leu Val Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg Gly Val Tyr
260 265 270
Arg His Gly Asn Phe Arg Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn
275 280 285
Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gly His Asn Phe
290 295 300
Asn Ile Thr Ile Lys Glu Ile Ile Lys Met Leu Asn Ile Leu Thr Ala
305 310 315 320
Arg Asn Asp Ser Cys Met Glu Leu Thr Val Lys Asp Val Phe Thr Ala
325 330 335
Pro Lys Asn Thr Ser Asp Lys Glu Ile Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val
340 345 350
Leu Arg Gln Ile Tyr Thr His Asn Cys Ser Asn Arg Tyr Leu Arg Gly
355 360 365
Leu Tyr Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn Lys Thr Cys Ser Met Asn
370 375 380
Glu Ile Lys Lys Ser Thr Leu Lys Asp Phe Leu Glu Arg Leu Lys Val
385 390 395 400
Ile Met Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg His Ala Gly Ser Gly Phe Asn Asn
405 410 415
Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
420 425 430
Leu Glu Ser Gly Gly Ser Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro
435 440 445
Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg
450 455 460
Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser
465 470 475 480
Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg
485 490 495
Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu
500 505 510
Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu
515 520 525
Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr
530 535 540
Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala
545 550 555 560
Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
580 585 590
Leu Ala Gly Ser Gly Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Thr Leu
595 600 605
Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Ala Ser
610 615 620
Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asn Leu Thr Ala Gly Met
625 630 635 640
Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Asp Cys Ser Ala
645 650 655
Ile Gln Arg Thr Gln Arg Met Leu Lys Ala Leu Cys Ser Gln Lys Pro
660 665 670
Ala Ala Gly Gln Ile Ser Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu
675 680 685
Val Ile Gln Leu Val Lys Asn Leu Leu Thr Tyr Val Arg Gly Val Tyr
690 695 700
Arg His Gly Asn Phe Arg Gly Gly Gly Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val
705 710 715 720
Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly
725 730 735
Ser Gly Gly His Asn Phe Asn Ile Thr Ile Lys Glu Ile Ile Lys Met
740 745 750
Leu Asn Ile Leu Thr Ala Arg Asn Asp Ser Cys Met Glu Leu Thr Val
755 760 765
Lys Asp Val Phe Thr Ala Pro Lys Asn Thr Ser Asp Lys Glu Ile Phe
770 775 780
Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Ile Tyr Thr His Asn Cys Ser
785 790 795 800
Asn Arg Tyr Leu Arg Gly Leu Tyr Arg Asn Leu Ser Ser Met Ala Asn
805 810 815
Lys Thr Cys Ser Met Asn Glu Ile Lys Lys Ser Thr Leu Lys Asp Phe
820 825 830
Leu Glu Arg Leu Lys Val Ile Met Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg His Ala
835 840 845
Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro
850 855 860
Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Ile Lys
865 870 875 880
Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu His His His His His
885 890 895
His
Claims (24)
- 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 백신 조성물로서, 여기서 백신 조성물은 숙주에게 백신 조성물이 투여되는 경우에 상기 자기-단백질에 대한 자가항체를 생성시킬 수 있고, 여기서 백신 조성물은
a) - 숙주의 제1 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편;
- 숙주의 제2 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편;
- 임의로 숙주의 제3 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 및
- 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프
를 포함하는 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA;
및
b) 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드
를 포함하는 것인 백신 조성물. - 제1항에 있어서, 1종 이상의 T-세포 에피토프가 인공 T-세포 에피토프 펩티드 서열 및 비-자기 단백질, 특히 병원성 단백질로부터 유래된 T-세포 에피토프 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 백신 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 1종 이상의 T-세포 에피토프가 파상풍 독소 T-세포 에피토프, 특히
(i) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 또는 서열식별번호: 2와 적어도 95% 서열 동일성을 포함하거나
또는
(ii) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 39 및 서열식별번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택된
파상풍 독소 T-세포 에피토프인 백신 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리단백질이 제1, 제2 및 임의로 제3 자기-단백질로부터 유래된 2 또는 3개의 자기-단백질 절편을 포함하는 것인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 자기-단백질 절편이
(i) 전장 자기-단백질; 또는
(ii) B-세포 에피토프를 함유하는 말단절단된 자기-단백질; 또는
(iii) 전장 자기-단백질에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 자기-단백질의 유도체
인 백신 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 및/또는 임의로 제3 자기-단백질이 시토카인; 특히 IL-31, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 및 TNF-알파 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인으로부터 유래된 것인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 또는 임의로 제3 자기-단백질이 IL-31 단백질, 특히 개 IL-31 (서열식별번호: 3), 고양이 IL-31 (서열식별번호: 60), 돼지 IL-31 (서열식별번호: 68), 소 IL-31 또는 인간 IL-31 (서열식별번호: 69)인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 또는 임의로 제3 자기-단백질이 IL-5 단백질, 특히 개 IL-5 (서열식별번호: 41), 고양이 IL-5 (서열식별번호: 76), 돼지 IL-5 (서열식별번호: 77), 닭 IL-5 (서열식별번호: 78 또는 79), 소 IL-5 (서열식별번호: 80) 또는 인간 IL-5 (서열식별번호: 81)인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 또는 임의로 제3 자기-단백질이 IL-4 단백질, 특히 개 IL-4 (서열식별번호: 56), 고양이 IL-4 (서열식별번호: 70), 돼지 IL-4 (서열식별번호: 71), 닭 IL-4 (서열식별번호: 72), 소 IL-4 (서열식별번호: 73) 또는 인간 IL-4 (서열식별번호: 74 또는 75)인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 또는 임의로 제3 자기-단백질이 특히 개 IL-13 (서열식별번호: 46), 고양이 IL-13 (서열식별번호: 82), 돼지 IL-13 (서열식별번호: 83), 닭 IL-13 (서열식별번호: 84), 소 IL-13 (서열식별번호: 85) 또는 인간 IL-13 (서열식별번호: 86)으로부터 유래된 것인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 또는 임의로 제3 자기-단백질이 IL-33 단백질, 특히 개 IL-33 (서열식별번호: 50 또는 51), 고양이 IL-33 (서열식별번호: 87, 88, 89 또는 90), 돼지 IL-33 (서열식별번호: 91, 92, 93 또는 94), 소 IL-33 (서열식별번호: 95 또는 96) 또는 인간 IL-33 (서열식별번호: 97, 98, 99 또는 100)인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리단백질이
(i) 서열식별번호: 203 또는 205와 적어도 85% 서열 동일성;
또는
(ii) 서열식별번호: 203 또는 205의 서열
을 갖는 것인 백신 조성물. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드가 A-부류, B-부류 및 C-부류 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드가 B-부류 면역자극 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나 또는 각각이
(i) 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6과 적어도 75% 서열 동일성을 포함하거나; 또는
(ii) 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인
백신 조성물. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 면역자극 올리고뉴클레오티드 내의 적어도 일부 포스포디에스테르 모이어티가 뉴클레아제 저항성을 증가시키도록 화학적으로 변형되었으며, 특히 포스포로티오에이트 모이어티에 의해 대체된 것인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 데포 효과를 부여하는 아주반트를 추가로 포함하는 백신 조성물.
- 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위해 백신 조성물에 사용하기 위한 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA로서, 여기서 폴리단백질은 숙주의 제1 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 숙주의 제2 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 임의로 숙주의 제3 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 및 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함하는 것인, 폴리단백질, 폴리단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 폴리단백질을 코딩하는 RNA.
- 숙주의 자기-단백질에 대한 자기-관용을 파괴하기 위한 폴리단백질의 용도로서, 여기서 자기-관용은 숙주에게 폴리단백질이 투여되는 경우에 자가항체의 생산에 의해 파괴되고, 여기서 폴리단백질은 숙주의 제1 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 숙주의 제2 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 임의로 숙주의 제3 자기-단백질로부터 유래된 적어도 2개의 자기-단백질 절편; 및 자기-단백질 절편들 사이에 및/또는 그에 인접하여 있는 비-숙주 기원의 1종 이상의 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 용도.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 백신 조성물 또는 폴리단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 백신 조성물 또는 폴리단백질.
- 제19항에 있어서, 대상체가 인간 및 비-인간 동물을 포함한 포유동물인 백신 조성물 또는 폴리단백질.
- 제20항에 있어서, 대상체가 소, 가금류, 돼지 및 반려 동물, 예컨대 고양이 및 개로 이루어진 군으로부터 선택된 동물인 백신 조성물 또는 폴리단백질.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이
- 자가면역 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 만성 질환; 또는
- 특히 아토피성 피부염, 습진, 건선, 경피증 및 소양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 소양성 상태; 또는
- 특히 알레르기성 피부염, 여름 습진, 두드러기, 히브, 염증성 기도 질환, 재발성 기도 폐쇄, 기도 과민반응, 만성 폐쇄 폐 질환 및 자가면역으로부터 유발되는 염증 과정으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기성 상태이며,
바람직하게는 질환이 소양성 상태 또는 알레르기성 상태, 특히 아토피성 피부염인 백신 조성물 또는 폴리단백질. - 자가항체, 특히 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 백신 조성물에 함유된 폴리단백질에 대해 수득된 자가항체를 검출하기 위한 효소-연결 면역흡착 검정 방법으로서,
a) 시험 표면 상에 항원을 흡착시키는 단계;
b) 시험 표면 상의 자유 결합 부위를 차단하는 단계;
c) 항원-코팅되고 차단된 시험 표면을, 항원에 대한 표지된 항체 및 항원에 대한 시험될 자가항체를 포함하는 혼합물과 함께 인큐베이션하는 단계; 및
d) 표지된 항체의 결합을 검출하는 단계
를 포함하는 방법. - 제23항에 있어서, 항원이 제17항의 폴리단백질 또는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리단백질 또는 그의 단일 단백질 절편 또는 에피토프-운반 펩티드이거나 또는 이를 포함하는 것인 효소-연결 면역흡착 검정 방법.
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