KR101647177B1

KR101647177B1 - hCARP를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101647177B1
Application number: KR1020130121530A
Authority: KR
Inventors: 변종회; 김창근
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-11
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2016-08-09
Also published as: KR20150042636A

Abstract

본 발명은 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 숙주세포를 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제 및 상기 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 포함하는 혈관 강화용 또는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 재조합 바이러스, 상기 세포 치료제 또는 상기 약학적 조성물을 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관을 강화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 바이러스는 숙주세포에 형질감염시 hCARP를 발현하는 것을 확인하였으며, 이에 따라 화학적, 물리적 스트레스에 대한 저항성이 증가하여, hCARP이 혈관 강화 효과를 가질 수 있으며 이에 따라 허혈성 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 가질 수 있음을 확인하였는바 이에 대한 유전자 치료 분야에서 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

hCARP를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 및 이의 용도{Recombinant virus comprising polynucleotide encoding hCARP and uses thereof}

본 발명은 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스를 포함하는 혈관 강화용 조성물, 상기 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 숙주세포를 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제 및 상기 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 포함하는 허혈성 질환 또는 연조직 리모델링 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 재조합 바이러스, 상기 세포 치료제 또는 상기 약학적 조성물을 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관을 강화하는 방법에 관한 것이다.

유전자 치료(gene therapy)란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 구체적으로, 유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법이다. 이는, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다.

유전자 치료를 위해서는 숙주세포 내로 핵산을 도입시키는 다양한 바이러스들이 연구되고 있다. 그 중에서 레트로바이러스는 single-stranded RNA 바이러스로 숙주 세포로 감염된 후에 레트로바이러스의 RNA가 reverse transcriptase에 의해 RNA-DNA double-strand로 만들어지게 된다. 그 다음 double-strand DNA가 되며 양 끝에 long terminal repeat sequence를 갖게 되며 integrase에 의해서 숙주의 염색체 사이로 끼어들어가게 된다. 이에 따라, 한번 레트로바이러스에 의하여 핵산이 도입된 세포는 세포분열 시에도 레트로바이러스의 유전자가 유지되며 지속적으로 발현이 일어나게 된다. 이에 따라, 영구적인 유전자 치료를 위하여 레트로바이러스를 이용하는 방안이 연구되고 있다.

한편, Cardiac Ankyrin Repeat Protein(CARP)는 1995년 혈관내피세포에서 cytokine에 의해 유도되는 전사조절인자로서 처음 동정이 되었다. 심근세포, 골격근세포 등 여러 세포에서 발현이 되는 것이 확인이 되었다. Vascular smooth muscle cell에 growth factor인 TGF β-1을 처리하였을 때 농도 및 시간에 따라서 CARP mRNA가 증가됨이 확인이 되었다. Rat wound healing model에서 adenovirus를 이용 CARP gene을 전달해 주었을 때 혈관생성이 촉진되었다. 그리고 CARP는 배아와 태아 단계의 cardiogenesis과정에서 높게 발현되고 YB-1 transcription factor의 cofactor로 이용되는 것으로 알려졌다. 이에 CARP는 혈관생성 signaling pathway에 중요한 factor로 예상되어 많은 연구가 진행되고 있다.

CARP는 특히 배아와 태아 단계에서 심장의 발달이 이루어 질 때 높게 나타난다. 실제로, 심장에서는 YB-1 transcription factor의 cofactor로 이용되며, 성체로 가면서 그 발현량이 감소하게 되는 특징이 있고 postnatal cardiomyocytes에서의 CARP 과발현은 심장 유전자들의 발현을 억제시키는 것으로 나타나 transcriptional co-repressor로도 작용할 것으로 예상되고 있다. 또한, 동맥 경화 과정에서 내피세포와 intimal smooth muscle cell(SMC)에서 CARP가 합성된다는 것이 알려져 있다. CARP는 TGF-β와 Smad3의 target gene임이 밝혀졌으며, wound healing 동안에 발현량이 증가하여 약 2주일간 유지되며, human과 murine의 죽상경화반에서 CARP의 발현이 증가됨을 확인하였다. Neovascularization에도 CARP가 관여한다는 것이 밝혀졌고, 최근에는 CARP의 upstream effector로 p53이 발견되었으며, myogenesis 과정에서 myogenic regulatory factor에 의한 신호를 증폭시켜 세포 주기의 arrest를 조절하는 것으로도 추정되고 있다. 그러나 이런 CARP의 다양한 역할 및 혈관 신생에 관련된 기능들에도 불구하고 CARP의 발현이 혈관 강화와 관련되어 어떤 기작을 가지는 지에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없었다.

한편, 노화 또는 혈관계 질환에 의한 혈관 약화, 즉 혈관벽의 약화는 심장마비, 뇌졸중, 동맥류, 정맥류 등의 위험성을 높이는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 혈관의 건강 특히 혈관 벽의 신축성을 높이고 혈관을 강화하는 것을 통하여 상기 질병에 대한 위험성을 낮출 수 있고, 증상을 완화할 수 있다. 특히, 모세혈관을 강화할 경우에는 모세혈관으로의 혈류를 증가시켜 각종 혈관장애에 의한 질환 및 대사 질환을 예방 또는 치료하는데 효과가 있다. 상기 혈관 약화에 의해서는 각종 허혈성 질환이 발생할 수 있다.

허혈(Ischemia)이란 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 말하며, 궁극적으로 비가역적인 손상, 즉 세포 및 조직의 괴사로 이어지게 된다. 특히, 심장, 신장, 뇌는 혈류 공급 부족에 가장 민감한 신체 기관으로서, 예를 들어, 뇌졸중 또는 두부 손상 등에 의하여 뇌 조직 상에 허혈이 발생하면 허혈성 캐스캐이드라고 불리우는 일련의 과정들이 촉발되어 뇌 조직이 영구적으로 손상된다.

허혈은 여러 가지 원인에 의하여 야기될 수 있으며, 예를 들면, 심장의 비정상적인 빠른 박동, 저혈압, 혈관외부로부터의 혈관 압박(예를 들어, 혈관 외부의 암에 의한 혈관 압박), 혈전, 색전증, 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 일과성 심장발작, 사고로 인한 뇌혈관 손상, 뇌일혈, 뇌경색, 동정맥 기형, 말초 동맥 폐색 질환 등에 의하여 허혈 증상이 나타날 수 있다.

이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 hCARP 유전자를 레트로바이러스를 통하여 세포에 도입하여 화학적, 물리적인 스트레스 등에 대한 세포의 저항성을 확인함으로써, hCARP이 혈관 강화 효과를 가질 수 있으며 이에 따라 허혈성 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 가질 수 있음을 확인하고 이를 이용한 유전자 치료에 대한 가능성을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스를 포함하는 혈관 강화용 조성물

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 숙주세포를 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 이용하여 연조직 리모델링(soft tissue remodeling) 관련 질환을 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 이용하여 혈관을 강화하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈관 강화용 재조합 바이러스 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 용어, "CARP(Cardiac Ankyrin Repeat Protein)"은 319개의 아미노산으로 구성되어 있고 36 kDa의 분자량을 갖는 단백질로, 포유동물에서 아미노산 서열과 기능성 도메인이 잘 보존되어있다. Protein/protein interaction의 중요할 것으로 예상되는 ankyrin 도메인이 4번 반복되어 존재하고 nuclear localization signal을 가지고 있어 전사조절인자로 작용할 수 있는 조건을 갖고 있다. 또한, coiled-coil region이 존재해 in vivo상에서 CARP가 homodimerization을 통해 이량체 형태로 존재한다. Ankyrin repeat 도메인은 NF-kB, p16, p19, DARP 등에서 protein/protein interaction을 담당하는 부위로, 이를 포함하고 있는 CARP는 titin과 같은 cytoplasmic protein 등과 결합한다고 알려져 있으며, 직접적으로 결합하여 생리적 활성을 나타내는 표적 분자들이 점점 밝혀지고 있다. 본 발명에서 CARP는 특히 인간 유래의 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)일 수 있으며, 이를 암호화하는 핵산이 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "혈관 강화"는 혈관벽의 물리적 스트레스에 대한 저항성을 높여, 노화 또는 혈관계 질환 등에 의한 혈관 약화를 예방하거나 치료하는 효과를 지니는 것을 의미하나, 이제 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 혈관 또는 혈관벽이 약화되는 경우에는 심장마비, 뇌졸증, 동맥류, 정맥류 등의 위험성을 높이는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 본 발명의 재조합 바이러스를 이용해 hCARP를 혈관 세포 또는 혈관 주변 세포에 도입하는 것을 통하여 혈관의 건강 특히 혈관 벽의 신축성을 높이고 혈관을 강화할 수 있다. 이를 통하여 상기 질병에 대한 위험성을 낮추거나, 증상을 완화할 수 있다. 특히, 모세혈관을 강화할 경우에는 모세혈관으로의 혈류를 증가시켜 각종 혈관장애에 의한 질환 및 대사 질환을 예방 또는 치료하는데 효과가 있다.

본 발명의 용어, "재조합 바이러스 발현벡터"는 상기 CARP를 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 발현벡터를 의미하며, 상기 핵산을 숙주세포에 형질감염시켜 CARP를 발현시킬 수 있는 한 그 유래 등에 한정되지 않는다. 본 발명의 바이러스 발현벡터는 당업계에 알려진 다양한 발현벡터를 이용할 수 있으며, 특히, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노부속바이러스, 백시니아바이러스 또는 알파바이러스 유래의 발현벡터일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 바이러스 발현벡터는 레트로바이러스 유래 발현벡터일 수 있으며, 특히 도 1에 기재된 pLPC-hCARP의 개열지도를 갖는 재조합 바이러스 발현벡터일 수 있다.

상기 레트로바이러스는 높은 유전자 전달효율, 미분화세포로 유전자를 전달하는 능력 및 높은 역가의 바이러스 저장물 제조의 용이성으로 인해 유망한 유전자 치료용 벡터로 인정받고 있다. 또한 세포의 증식에 관계없이 다양한 세포를 감염시킬 수 있으며 또한 감염 후 숙주의 유전자에 통합되어 한번 형질감염된 세포의 경우에는 지속적으로 치료효과가 유지되는 점에서 유전자 치료 전달 매체로서의 장점을 가지고 있다. 레트로바이러스는 기본적으로 gag, pol과 env 유전자를 공통적으로 가지고 있다. gag 유전자는 바이러스의 코어(core)와 구조단백질(structural protein)을 암호화하며, pol 유전자는 protease, integrase와 reverse transcriptase 등을 암호화하고, env 유전자는 retroviral coat protein을 암호화한다. 레트로바이러스는 double-strand RNA virus로 target 세포로 감여된 후에 숙주세포의 tRNA가 레트로바이러스의 RNA에 붙은 후 reverse transcriptase에 의해 RNA-DNA double strand로 된 후 polymeraseⅡ에 의해 double strand DNA 형태로 바뀐다. 이렇게 생성된 DNA는 양 끝에 long terminal repeat(LTR) sequence를 가지게 되며, integrase에 의해서 숙주의 염색체 사이로 끼어들어가며 외부 유전자가 세포분열 시에도 유지되며, 숙주 세포의 발현기작을 이용하여 지속적인 유전자 발현을 할 수 있게 된다. 이런 장점으로 레트로바이러스는 주로 hematopoietic marrow cell, hepatocytes, keratinocyte, endothelial cell에 적용되고 있다.

레트로바이러스가 감염되기 위해서는 바이러스의 외피 단백질(envelope protein)과 특정 세포막 수용체 단백질(specific cell surface receptor protein)과 결합이 필요하다. VSV-G protein은 대부분의 진핵세포에 존재하는 인지질과 결합을 하기 때문에 레트로바이러스가 넓은 범위의 세포주에 감염이 가능하게 만들어준다. 이러한 특성은 세포막 수용체가 다양하지 않은 줄기세포로의 감염에도 용이하다. 또한 VSV-G는 물리적인 안정성을 가질 수 있도록 하여, 레트로바이러스의 감염 효율을 높이기 위하여 ultracentrifugation을 통하여 농축하여도 레트로바이러스의 역가와 감염효율을 최대화할 수 있다는 장점이 존재한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 pLPCX 기반 레트로바이러스 벡터에 hCARP DNA를 삽입하여 재조합 레트로바이러스 발현벡터를 제조하였다(도 1). 이를 NIH3T3 세포주에 형질감염시켜 hCARP가 발현되는 것을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 발현벡터와 외피 벡터(envelope vector)를 포함하는, 혈관 강화용 재조합 바이러스 생산용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 외피 벡터는 상기 설명한 특정 세포막 수용체 단백질(specific cell surface receptor protein)과 결합할 수 있는 능력을 가지는 외피 단백질을 발현하는 모든 발현벡터를 포함하나, 특히 VSV-G를 발현하는 pVSV-G 벡터일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 생산용 조성물을 동물세포에 처리하는 단계; 및 상기 동물세포를 배양한 배양배지로부터 재조합 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는, 혈관 강화용 예방 또는 치료용 재조합 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "동물세포"는 본 발명의 바이러스를 제조할 수 있는 세포는 제한 없이 포함되나, 포유류 세포 또는 조류 세포일 수 있으며, 예시적 포유류 세포는 돼지류 세포, 인간 세포, 소류 세포 및 조류 세포를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 GP293 세포주를 사용하여 레트로바이러스를 증폭,제작하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 혈관 강화용 조성물을 제공한다.

상기 재조합 바이러스, 혈관 강화 등은 상기 설명한 바와 동일하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 숙주세포를 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제를 제공하는 것이다. 즉, 숙주세포에 hCARP를 암호화하는 핵산을 도입시킨 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 혈관 강화용 세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

본 발명의 도입은 특히 hexadimethrine bromide(polybrene, sigma, USA)을 포함하여 감염의 효율이 증가될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, NIH3T3 세포주를 6-well 배양접시에 본 발명의 재조합 레트로바이러스를 감염시키며, polybrene을 첨가하는 농도를 달리하여 최적 감염 조건을 확인하였다. polybrene을 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 ㎍/㎖로 섞어 감염 효율을 확인한 결과, 최종적으로 8 ㎍/㎖일 때 가장 높은 감염 수치를 보여주는 것을 확인하였다.

본 발명의 숙주세포는 hCARP를 암호화하는 핵산이 도입되어 hCARP를 과발현시킬 수 있으며, 이를 통하여 혈관 약화에 대하여 예방 또는 치료효과를 가질 수 있는 세포는 제한없이 포함한다. 특히, 본 발명의 바이러스를 통하여 형질감염시켜 세포 치료제로 사용할 수 있는 다양한 숙주세포는 혈관내피세포(endothelial cell), 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell), 섬유아세포 (fibroblast), NIH3T3 및 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell) 등을 포함한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 레트로바이러스를 NIH3T3 세포에 감염시켰다. 감염되어 hCARP를 발현하는 것을 확인한 hCARP NIH3T3 세포 및 normal NIH/3T3 세포에 대하여 세로로 scratch를 준 뒤, 광학현미경 및 Real-time cell analyzer(RTCA, xCELLigence, Roche)를 이용하여 인위적인 scratch에 대한 저항성 및 회복력을 확인하였다. 그 결과, hCARP NIH/3T3 cell 이 인위적인 scratch에 대한 저항성이 normal NIH/3T3 cell보다 13% 강하고, scratch 후 상처 회복정도가 상대적으로 65% 빠름을 확인하였다. 또한, RTCA에서 측정되는 Cell Index (CI) 값은 세포가 plate에 붙는 정도에 따라서 결정되는데, hCARP NIH/3T3 cell의 CI 값이 normal NIH/3T3 cell보다 1.8배 높게 측정이 되어, hCARP NIH/3T3 cell이 배양접시 바닥에 normal NIH/3T3 cell보다 넓고 강하게 부착함을 확인하였다. 이에 따라 본 발명의 재조합 바이러스에 형질감염되어 hCARP 유전자가 도입된 숙주세포 및 이를 유효성분으로 하는 세포 치료제는 혈관 강화에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 조성물의 투여로 혈관 약화를 억제시키거나 약화를 지연시키거나 허혈성 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 조성물의 투여로 혈관의 신축성이나 물리적 강도가 호전되거나 허혈성 질환에 의한 후유증이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "허혈성 질환"이란 허혈 증상을 나타내는 질환으로서, 관련되는 신체기관에 따라 뇌허혈, 심장허혈, 망막허혈, 심한사지허혈(critical limb ischemia), 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증 및 심근비대증 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 심장 근육에 혈류 공급이 불충분할 때 발생하는 심장 허혈은 협심증과 같은 가슴 통증, 심부전(cardiac failure)을 일으킬 수 있고, 뇌에 불충분한 혈류 공급으로 인하여 발생하는 뇌 허혈은 급성 허혈성 뇌졸중 또는 만성 뇌 허혈로 인한 혈관성 치매(vascular dementia)의 원인이 될 수 있다. 대장 또는 소장의 허혈은 허혈성 대장염 또는 장간막허혈을 야기할 수 있고, 피부로의 혈류 공급이 감소한 경우 반점성 피부 변색이 발생할 수 있다.

또한, 혈관이 부실함에 기인하여 신체 말단으로의 혈류공급이 불충분하여 사지절단술을 받아야만 하는 심한 사지 허혈(critical limb ischemia)을 야기할 수 있고, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 당뇨성 신경장애(diabetic neuropathy), 당뇨병성 혈관심장질환을 포함할 수 있다. 상기와 같은 허혈성 질환의 치료를 위하여 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈류 공급 감소 상태를 해소하기 위한 혈관생성(angiogenesis)을 이용하는 방법이 주로 연구되어 왔으나, 본 발명에서는 기존에 존재하는 혈관의 강화를 통하여 해결하고자 하였다.

아울러, 본 발명의 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 강황 또는 울금 추출물, 이로부터 분리된 리나로올 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈 또는 락토스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 재조합 바이러스 또는 세포 치료제를 유효성분으로 포함하는 연조직 리모델링(soft tissue remodeling) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "연조직 리모델링 관련 질환"은 연조직이 신축성이나 결합력등이 약해짐에 따라, 조직의 원형태가 변성되는 질환을 의미하며, 특히 심장 리모델링(cardiac remodeling), 동맥 협착(arterial stenosis) 또는 동맥류(aneurysm)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물을 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관을 강화하는 방법 또는 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 국소투여가 바람직하다.

본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 혈관을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 혈관을 효과적으로 강화할 수 있으며 허혈성 질환을 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 혈관을 강화하는 방법은 인간을 제외한 동물을 대상으로 하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 인간의 경우 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 혈관을 가지는 것을 고려할 때, 인간에 대해서도 충분히 사용되어 질 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 1 내지 10 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 5 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 재조합 바이러스, 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 단독으로, 또는 공지의 혈관 강화제 또는 허혈성 질환 치료제를 병용 투여하거나 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용하여 혈관 강화 또는 허혈성 질환 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

본 발명의 재조합 바이러스는 숙주세포에 형질감염시 hCARP를 발현하는 것을 확인하였으며, 이에 따라 화학적, 물리적 스트레스에 대한 저항성이 증가하여, hCARP이 혈관 강화 효과를 가질 수 있으며 이에 따라 허혈성 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 가질 수 있음을 확인하였는바 이에 대한 유전자 치료 분야에서 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 pLPCX 기반 레트로바이러스 벡터에 hCARP DNA를 삽입하여 재조합 레트로바이러스 발현벡터의 개열지도이다.
도 1b는 CARP 단백질 구조의 모식도로, CARP 단백질이 319 아미노산을 가지며, 4개의 ankyrin repeat elements (ANK1-4)를 가지고 nuclear localization signal (NLS)를 가지는 것을 나타낸 도이다.
도 2는 재조합 레트로바이러스 생산 과정과 레트로바이러스의 유전자가 숙주세포에 유전자 삽입하는 과정을 나타낸 개요도이다.
도 3은 감염된 NIH3T3 세포주의 Human CARP의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도이다.
도 4는 normal NIH/3T3 세포주와 CARP NIH/3T3 세포에 대하여 Scratch assay를 하면서, 광학현미경 (CKX41, Olympus)을 이용하여 관찰한 사진이다.
도 5는 Real-time cell analyzer(RTCA, xCELLigence, Roche)의 구성, 작동 원리, 프로그램을 나타낸 사진이다.
도 6은 광학 현미경을 이용하여 Scratch assay의 결과를 확인한 도이다. 도 6의 A는 Scratch의 면적, B는 회복 면적, C는 회복 면적의 세포 숫자, D는 Scratch 부위의 회복 경계의 사진이다.
도 7은 normal NIH/3T3 세포주와 CARP NIH/3T3 세포에 대하여 세포 하나하나의 면적, 즉 세포 크기를 비교한 도면이다.
도 8은 RTCA-based scratch assay의 CI(cell index)를 측정한 것을 나타낸 도표이다.
도 9는 normal NIH/3T3 세포주와 CARP NIH/3T3 세포에 대하여 RTCA를 이용하여 Trypsin-EDTA에 대한 세포독성 실험 결과를 확인한 도표이다.
도 10은 hCARP NIH3T3 세포와 normal NIH3T3 세포에서 claudin-5의 발현을 확인한 도이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: Human CARP 및 nlsLacZ construct 제조

1-1. hCARP 및 nlsLacZ 유전자 수득

Human CARP(hCARP)는 pGEM-T-EASY 벡터(Promega)에 cloning되어 있는 hCARP를 받아(Kong, et al., The Korean Journal of Microbiology, Vol. 44, No. 4, 2008.12., p. 282-288) 이를 주형으로 하여 hCARP 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 hCARP DNA를 증폭하였다. 또한, ACP-nlsLacZ 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 nlsLacZ 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 nlsLacZ DNA를 증폭하였다. 이에 사용된 프라이머는 하기 표 1와 같다.

PCR에 사용된 프라이머

프라이머	서열	크기	제한효소 서열
hCARP forward (서열번호 2)	5'-GAAGATCTATGATGGTACTGAAAGTAGAGGAACTG-3'	984 bp	BglⅡ
hCARP reverse (서열번호 3)	5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAGAATGTAGCTATGCGAGAGG-3'	984 bp	NotⅠ
nlsLacZ forward (서열번호 4)	5'-GAAGATCTGTCGACGGCCTCTGAGCTATTC-3'	3530 bp	BglⅡ
nlsLacZ reverse (서열번호 5)	5'-ATAGTTTAGCGGCCGCGGATCCGCCGAGTTTGTCAGAAA-3'	3530 bp	NotⅠ

구체적으로는, 상기 5' 말단에 BglⅡ 제한효소 서열과 3' 말단에 NotⅠ 제한효소 서열을 삽입하기 위하여, 상기 표 1의 프라이머를 제작하여 XP cycler(Bioer, China)를 이용하여 PCR을 하였다. 40 ng/㎕ DNA 주형 1 ㎕, 10 pmol/㎕ forward 및 reverse 프라이머 1 ㎕, 10x buffer 5 ㎕, 2mM dNTP 5 ㎕, Neotherm Taq 0.5 ㎕, D.W. 36.5 ㎕를 넣고 실시하였다.

hCARP 유전자 증폭은 95 ℃에서 5분간 초기 변성한 후, 95 ℃에서 30초 변성, 어닐링 62 ℃에서 30초 어닐링, 72 ℃에서 1분 증폭의 사이클을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합을 하였다.

nlsLacZ 유전자 증폭은 95 ℃에서 5분간 초기 변성한 후, 95 ℃에서 30초 변성, 어닐링 64 ℃에서 40초 어닐링, 72 ℃에서 3분 40초 증폭의 사이클을 15회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합을 하였다.

1-2. hCARP 및 nlsLacZ 유전자 클로닝

pGEM-T-EASY 벡터와 PCR product를 BglⅡ와 NotⅠ 제한효소로 반응시켜 잘라서, 아가로스 겔에 전기영동으로 분리한 후 gel extraction 방법을 통하여 잘려진 DNA 단편을 수득하였다.

각각 잘려진 벡터 : insert를 1 : 10 (molar ratio)로 섞은 후, T4 ligase(Roche, 독일)로 4℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. ligation product를 CaCl₂를 이용하여 competent cell로 제작된 E. coli(DH5α)에 형질전환하였다. 구체적으로, 상기 ligation 반응물을 competent cell과 섞어준 후, 얼음 상에 30분간 기다린 뒤에 42℃에서 1분간 열충격을 주고, 1 ㎖의 새로운 LB 배지를 넣어주고 37 ℃에서 1시간 동안 shaking incubation하였다. 이를 50 ㎍/㎖의 ampicillin이 첨가된 고체 LB 배지에 plating한 후 37 ℃에서 12~ 16시간 동안 배양하였다. 이후 발생한 colony를 무작위적으로 선택하여 50 ㎍/㎖의 ampicillin이 존재하는 5 ㎖의 LB 배지에 접종하여 16시간 동안 37 ℃에서 shaking incubation하였다.

상기에서 수득한 colony에 대해서 mini-preparation을 하여 제한효소 절단을 통해 유전자 삽입여부를 확인하였고, 염기서열 분석을 하였다.

실시예 2 : pLPCX 기반 레트로바이러스 벡터 construct 제작

pLPCX 기반 레트로바이러스 벡터들은 pLPC-eGFP 벡터를 이용하여 클로닝하였다. 즉, 상기 제작한 pGEM-T-EASY 벡터에 hCARP 및 nlsLacZ를 삽입한 플라스미드 DNA로부터 hCARP 및 nlsLacZ DNA를 수득하여 상기 pLPC 벡터에 삽입하였다.

pGEM-T-EASY 벡터에 hCARP 및 nlsLacZ를 삽입한 플라스미드와 pLPC-eGFP를 BglⅡ 및 NotⅠ로 처리하여 각각의 DNA 절단 단편을 수득하였다(Gel extraction kit, TAKARA, JAPAN). 이후 pLPCX 벡터와 각 insert를 1 : 20 (molar ratio)로 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 cloning을 실시하였으며, 염기서열분석을 하였다.

그 결과, 도 1의 pLPC-hCARP의 벡터를 제작하였다. Packaging cell에 vesicular somatitis virus-G(VSV-G) 단백질 유전자를 암호화하는 pVSV-G 벡터와 레트로바이러스 벡터 pLPCX를 co-transfection시켜 재조합 레트로바이러스를 생산하였다. Packaging cell에서 만들어지는 레트로바이러스에는 packaging signal이 존재하는 RNA만 capsidation이 되는데, pLPC-hCARP에만 packaging signal이 존재한다. 따라서 만들어지는 레트로바이러스 안에는 replication에 필요한 유전자들이 들어가지 못하게 되어 감염은 가능하지만 복제가 불가능한 레트로바이러스가 만들어진다(도 2).

Human CARP와 nlsLacZ를 PCR을 통하여 pLPCX 레트로바이러스 벡터의 MCS(multi-cloning site)에 클로닝하기 위하여 5'에 BglⅡ와 3'에 NotⅠ 제한효소 서열을 넣어 프라이머를 제작하였다. PCR 산물과 레트로바이러스 벡터를 ligation하여 제작하였으며, 클로닝이 되지 않은 벡터는 T-blunt(Solgent, 한국)를 이용하여 클로닝하였다.

pLPCX 벡터에 클로닝된 hCARP는 hCMV 프로모터와 pLPCX 3'LTR 특이적 프라이머를 이용하여 서열을 확인하여 mutation이 없는 것을 확인하였다.

실시예 3 : 형질감염( transfection ) 및 레트로바이러스 생산

3-1. 형질감염( transfection )

형질감염(transfection) 14시간 전에 GP293 세포주를 10%(v/v) FBS를 포함하는 DMEM 배지 10ml을 이용하여 100 mm 세포 배양 접시에 6 x 10⁶ 세포를 접종하였다.

해당 세포에 Lipofectamine^TM 2000(인비트로젠, USA)을 이용하여 형질감염을 수행하였다. 구체적으로는 1.5 ㎖ DMEM(w/o serum)에 레트로바이러스 벡터 pLPCX(23 ㎍)와 envelope vector(pVSV-G) DNA를 1 : 0.1 (molar ratio)가 되도록 넣어주고 가볍게 흔들어 주었다. 다른 tube에서 1.5 ㎖ DMEM에 Lipofectamine^TM 2000을 60 ㎕를 넣어 섞어서 상온에서 5분간 반응시켰다. 5분 후 DNA가 들어있는 DMEM과 Lipofectamine^TM 2000이 들어있는 DMEM을 섞어서 상온에서 20분간 반응시켰다. 이렇게 제조한 혼합액을 100 mm 세포 배양접시에 골고루 뿌리고 동물세포 배양기에서 4시간 동안 형질감염시켰다. 4시간 후에 1xPBS로 1회 세척해준 후 6 ㎖의 항생제가 없는 DMED으로 교체해 주었다. 형질감염의 효율을 높이기 위해 6시간 후에 동일한 방법으로 다시 실시하였다. 이후 새 DMEM 배지로 교체하였다.

3-2. 레트로바이러스 수확

새 DMEM 배지로 교체하고 16~20시간 동물세포 배양기에서 배양하였다. 배양접시에 있는 배지를 모아서 다른 tube로 옮기고 새로운 DMEM 10 ㎖로 교체하였다. Tube에 모은 배지를 0.45 ㎛ filter를 이용하여 천천히 떨어뜨려서 필터링한 후 1 ㎖씩 나누어 -80 ℃에 보관하였다(1차 수확). 배지를 교체한 후 16시간 후 동일한 방법으로 2차 수확을 하였다.

실시예 4. 레트로바이러스 감염 세포주 수득

4-1. 레트로바이러스 감염

감염하기 하루 전에 NIH3T3 세포주를 2 ㎖ DMEM 배지를 이용하여 2x10⁵ 세포/35 mm 세포 농도로 접종한 후 동물세포 배양기에서 배양하였다. 2.5 ㎖ DMEM에 polybrene 72 ㎍을 넣어주고 레트로바이러스가 들어있는 배지 1 ㎖을 상기 하루 전 접종한 NIH3T3 세포에 골고루 뿌려주고, 동물세포 배양기에서 하루 동안 배양시켰다. 감염시킨 레트로바이러스 5 MOI로 동일한 방법으로 2회에 걸쳐 감염시켰다.

4-2. Human CARP 발현조사

상기 감염된 NIH3T3 세포주에 Human CARP의 발현을 확인하였다. NIH3T3 세포에 LPC-hCARP 레트로바이러스를 감염시키고 2, 3, 4일이 지났을 때의 세포에서 각각 단백질을 추출하였다.

우선, 상기 감염된 NIH3T3 세포주를 키우는 배양접시로부터 배지를 제거한 후 PBS로 세척하고, RIPA buffer(25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 500 ㎕ 넣고 5분간 얼음상에서 반응시켰다. 세포를 1.5 ㎖ tube로 옮긴 후, 50 % pulse로 30초간 초음파 분쇄(sonication)하고, 4 ℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리 후, 상층액만 새로운 tube로 옮겨 micro BCA protein assay kit(Thermo, USA)를 이용하여 정량하였다.

상기 추출된 단백질을 SDS-PAGE 전기영동을 통하여 분리하고, PDVF western blotting membrane(Roche, USA)로 옮겨, Human CARP에 대한 항체(카톨릭대학교 이정화 교수 제공)을 이용한 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다(도 3).

실시예 5 : Scratch assay 측정

5-1. Scratch assay

6 well 배양접시에 normal NIH/3T3 세포주와 CARP NIH/3T3 세포 1.5 x 10⁵개를 10% (v/v) FBS와 1% (v/v) 항생제(antibiotics)를 포함한 DMEM 배지 2 ㎖에 접종한 후 48 시간 뒤에 yellow tip을 이용하여 세로로 scratch를 주었다. 하나의 well에 2줄의 scratch를 주었으며 scratch로 인하여 부양되어 버린 cell의 안정화를 위해 2 시간 뒤의 모습부터 23 시간 뒤의 회복중인 scratch를 광학현미경 (CKX41, Olympus)을 이용하여 관찰하고 I'MEASURE 2.0 (INGPLUS) 프로그램을 이용하여 촬영을 하였다(n=5, 4x)(도 4). I'MEASURE 2.0 program을 이용해 촬영된 사진 속의 scratch의 면적을 구하여 scratch의 크기, 회복된 면적을 구하고 각각 비교하여 data를 얻었다.

5-2. 세포의 크기 비교

hCARP NIH3T3 세포(n = 90)와 normal NIH3T3 세포(n = 82)의 세포 면적의 크기를 광학현미경(CKX41, Olympus)을 이용하여 관찰하고 I'MEASURE 2.0 (INGPLUS) 프로그램을 이용하여 데이터를 구하고 비교하였다. 세포 접종 후 48 시간이 지난 다음 세포의 크기를 관찰하였다.

5-3. Real - Time Cell Analyzer 를 이용한 scratch assay

Real-time cell analyzer(RTCA, xCELLigence, Roche)는 바닥이 도금 micro-electrode로 처리된 RTCA 전용 16 well E-plate, E-plate를 장착하여 미세전류를 주기적으로 보내 변화하는 저항값을 측정할 수 있는 RTCA DP와 RTCA DP로부터 전달되는 data를 실시간으로 E-plate에 미세전류를 흘려보내 변화하는 저항값(Cell Index value: CI value)을 측정하여 cell의 증가와 감소, 부착능력 등의 변화를 측정하고 모니터링을 할 수 있는 장치이다(도 5).

RTCA를 이용하여 scratch assay의 저항성과 회복을 실시간으로 측정하였다. E-plate에 hCARP NIH3T3 세포(n = 10)와 normal NIH3T3 세포(n = 10)을 well에 각각 6,000개의 세포를 100 ㎕ 배지와 함께 깔아주고 48 시간 후에 white tip으로 scratch를 주었다. scratch 없는 대조군(n = 4)와 비교하여 측정하였다. 측정 간격은 10 분으로 설정하였고 266시간까지 측정하였다.

5-4. 결과 분석

상기 결과를 통하여 hCARP NIH/3T3 cell 이 인위적인 scratch에 대한 저항성이 normal NIH/3T3 cell보다 13% 강하고, scratch 후 상처 회복정도가 상대적으로 65% 빠름을 확인하였다. 또한, RTCA에서 측정되는 Cell Index (CI) 값은 세포가 plate에 붙는 정도에 따라서 결정되는데, hCARP NIH/3T3 cell의 CI 값이 normal NIH/3T3 cell보다 1.8배 높게 측정이 되었고 이는 hCARP NIH/3T3 cell이 배양접시 바닥에 normal NIH/3T3 cell보다 넓고 강하게 부착함을 의미한다(도 6 내지 도 8).

실시예 6: 세포 생존율 실험

6-1. Trypsin - EDTA 세포독성 실험

RTCA를 이용하여 Trypsin-EDTA에 대한 세포독성 실험을 진행하였다. E-plate에 hCARP 유전자로 형질감염된 NIH3T3 세포(n=4)와 normal NIH3T3 세포(n=4)를 well에 각각 6,000개 세포를 100 ㎕ 배지와 함께 깔아주고 24 시간 후에 1xtrypsin/EDTA를 배지에 40%, 20%, 10%로 희석시켜 100 ㎕를 넣어주었다. 측정 간격은 10 분으로 설정하였고, 276 시간까지 측정하였다. 얻어진 data로 trypsin/EDTA의 IC₅₀ 값을 구하였다(도 9).

6-2. Hypoxia mimetics 세포독성 실험

RTCA를 이용하여 hypoxia mimetics에 대한 세포독성 실험을 진행하였다. Hypoxia mimetics로는 잘 알려진 Cobalt(Ⅲ) chloride hexahydrate(CoCl₂, Sigma-aldrich, co., USA)와 2,2'-bipyridyl(Sigma-aldrich, co., USA)를 사용하였다. E-plate에 hCARP NIH3T3 세포(n = 3)와 normal NIH3T3 세포(n = 3)를 well에 각각 6,000개 세포를 100 ㎕ 배지와 함께 깔아주고 24 시간 후에 CoCl₂를 300 μM, 450 μM, 600 μM의 농도로 처리하였다. 측정 간격은 10분으로 설정하였고, 276 시간까지 측정하였다. 얻어진 data로 CoCl₂와 2,2'-bipyridyl의 IC₅₀ 값을 구하였다.

6-3. 결과 분석

상기 실험을 통하여 측정한 Trypsin/EDTA, CoCl₂ 및 2,2'-bipyridyl의 hCARP NIH3T3와 normal NIH3T3에 대한 IC₅₀은 하기 표 2와 같았다.

	Trypsin/EDTA	CoCl₂	2,2'-bipyridyl
hCARP NIH3T3	3.9917x10%	1.1246x10⁴ M	9.7557x10^-5M
hCARP NIH3T3	R² : 0.99426	R² : 0.87707	R² : 0.9672
Normal NIH3T3	3.1137x10%	1.0888x10³ M	7.8598x10^-5 M
Normal NIH3T3	R² : 0.98468	R² : 0.9581	R² : 0.99148

구체적으로, 측정된 CI(Cell Index) 값은 hCARP NIH/3T3 cell의 경우 mock이 7.5, 40% trypsin/EDTA가 6.4로 1.1의 차이를 보이며 약 15%가 감소하였다. Normal NIH/3T3 cell의 경우 mock이 3.4, 40% trypsin/EDTA가 2.6으로 0.8의 차이를 보이며 약 24%가 감소하였다. hCARP NIH/3T3 cell의 CI 값이 normal NIH/3T3 cell보다 더욱 많이 떨어졌지만 상대적 비율로 계산하면 hCARP NIH/3T3 cell이 normal NIH/3T3 cell보다 약 9% trypsin/EDTA에 더욱 강한 것을 확인하였다. IC₅₀ 값은 hCARP NIH/3T3 cell이 3.9917x10%, normal NIH/3T3 cell이 3.1137x10%으로 측정되었다.

RTCA를 사용하여 hCARP gene이 전달된 NIH/3T3 cell의 hypoxia mimetics cytotoxicity 확인 실험을 진행한 결과, CoCl₂의 경우 hCARP NIH/3T3 cell에서 IC₅₀ 값이 1.1246x10⁴ M, normal NIH/3T3 cell에서 IC₅₀ 값이 1.0888x10³ M로 측정되었다. 이러한 결과는 hCARP NIH/3T3 cell이 normal NIH/3T3 cell보다 CoCl₂의 영향에 더 잘 견딤을 의미하는 결과이다. 2, 2'- bipyridyl에서는 hCARP NIH/3T3 cell에서 IC₅₀ 값이 9.7557x10^-5 M, normal NIH/3T3 cell에서 IC₅₀ 값이 7.8598x10^-5 M로 측정되었다. 이는 2, 2'-bipyridyl에서도 마찬가지로 hCARP NIH/3T3 cell이 normal NIH/3T3 cell보다 2, 2'- bipyridyl의 영향에 잘 견딤을 의미한다. 이러한 결과는 hypoxia 상태에서 hCARP NIH/3T3 cell이 normal NIH/3T3 cell보다 viability가 우수함을 제시한다.

실시예 7: Claudin -5 발현 측정

혈관내벽의 지름이 감소하여 생기는 허혈에 대한 효과적인 치료방법으로는 굵고 튼튼한 혈관형성이 필수적이다. 이러한 혈관은 모세관이 형성된 뒤 자극을 받게 되면 cell-to-cell junction을 이루는 tight junction-related gene의 발현으로 혈관의 integrity를 증가시키는 과정을 거쳐 굵고 튼튼한 혈관으로 발전하게 된다. 내피세포에서 많이 발현되는 tight junction gene중 하나인 claudin-5의 발현을 hCARP를 전달해준 hCARP NIH3T3 세포와 normal NIH3T3 세포에서 확인하였다.

7-1. total RNA 분리( isolation )

hCARP NIH3T3 세포와 normal NIH3T3 세포에서 total RNA를 분리하였다. Reagent는 Trizol(인비트로젠)을 사용하였다. 각각의 세포가 100 mm 배양접시에 가득차게 되었을 때, 1xPBS 5 ㎖로 2회에 걸쳐 세척한 후, Trizol 2 ㎖을 처리하여 5분 동안 상온에서 배양하였다. 파이펫팅을 통하여 cell을 배양접시로부터 분리한 후 클로로포름을 360 ㎕ 첨가하고, vortex하여 4 ℃ 원심분리기에서 10분간 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 새로운 tube에 옮긴 후 동일 volume의 isopropanol을 첨가하여 vortex하고 상온에서 15분간 배양한 뒤 4 ℃ 원심분리시에서 30분간 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 70 %(v/v) 에탄올을 200 ㎕ 첨가하여 7분 동안 4 ℃ 원심분리기에서 13,000 rpm으로 원심분리하고 상층액을 제거하고 DEPC를 처리한 H₂O 12 ㎕에 녹였다.

7-2. Reverse transcription 실험

상기 실시예 7-1에서 분리한 total RNA 중 0.5 ㎍을 10 pmole의 18 mer oligo dT와 섞은 후 65 ℃에서 5분간 배양한 다음, 4 ℃에서 10분간 보관하였다. 그 후, 10x RT buffer, 10 mM의 dNTP mix와 섞은 후 M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, 한국)를 첨가하여 37 ℃에서 1시간 반응하고, 75 ℃에서 5분간 가열하여 역전사 효소의 활성을 완전히 억제한 뒤 4 ℃에서 보관하였다.

7-3. PCR 확인

실시예 7-2에서 얻은 cDNA를 이용하여 10xPCR buffer, dNTP mix, GAPDH 특이적 프라이머와 Diastar Taq polymerase(Solgent, 한국)로 PCR 반응을 수행하였다. 이를 통하여 reverse transcription이 잘 수행되어졌음을 확인하고, mouse claudin-5 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(표 2).

PCR에 사용된 프라이머

프라이머	서열	크기
mClaudin-5 forward (서열번호 6)	5'-GTA GCA CTC TTT GTT ACC TTG A-3'	696 bp
mClaudin-5 reverse (서열번호 7)	5'-CCA GGA TCT CAG TAG GAA CTG TT-3'	696 bp
mGAPDH forward (서열번호 8)	5'-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GA-3'	210 bp
mGAPDH reverse (서열번호 9)	5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'	210 bp

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이, 기존 normal NIH/3T3 cell에서는 claudin-5 발현이 확인되지 않은 반면, hCARP NIH/3T3 cell에서는 mRNA의 발현이 확인되었다.

상술한 결과를 종합하면, 본 발명의 재조합 레트로바이러스를 이용한 hCARP 유전자 형질감염을 통하여 혈관내피세포 등의 세포들의 부착성 향상 및 외부 물리적 및 hypoxia 등의 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 hCARP 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스를 이용하여 혈관 강화 또는 허혈성 질환 유전자 치료 분야에서 널리 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Recombinant virus comprising polynucleotide encoding hCARP and uses thereof <130> PA130802KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> human Cardiac Ankyrin Repeat Protein <400> 1 atgatggtac tgaaagtaga ggaactggtc actggaaaga agaatggcaa tggggaggca 60 ggggaattcc ttcctgagga tttcagagat ggagagtatg aagctgctgt tactttagag 120 aagcaggagg atctgaagac acttctagcc caccctgtga ccctggggga gcaacagtgg 180 aaaagcgaga aacaacgaga ggcagagctc aaaaagaaaa aactagaaca aagatcaaag 240 cttgaaaatt tagaagacct tgaaataatc attcaactga agaaaaggaa aaaatacagg 300 aaaactaaag ttccagttgt aaaggaacca gaacctgaaa tcattacgga acctgtggat 360 gtgcctacgt ttctgaaggc tgctctggag aataaactgc cagtagtaga aaaattcttg 420 tcagacaaga acaatccaga tgtttgtgat gagtataaac ggacagctct tcatagagca 480 tgcttggaag gacatttggc aattgtggag aagttaatgg aagctggagc ccagatcgaa 540 ttccgtgata tgcttgaatc cacagccatc cactgggcaa gccgtggagg aaacctggat 600 gttttaaaat tgttgctgaa 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Sequence <220> <223> mClaudin-5 forward primer <400> 6 gtagcactct ttgttacctt ga 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mClaudin-5 reverse primer <400> 7 ccaggatctc agtaggaact gtt 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH forward primer <400> 8 tgacatcaag aaggtggtga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH reverse primer <400> 9 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 10 <211> 7179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLPC-hCARP <400> 10 tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60 ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120 tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180 gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240 ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300 tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360 taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt 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aagatcaagg tcttttcacc 1260 tggcccgcat ggacacccag accaggtccc ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt 1320 tgacccccct ccctgggtca agccctttgt acaccctaag cctccgcctc ctcttcctcc 1380 atccgccccg tctctccccc ttgaacctcc tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta 1440 tccagccctc actccttctc taggcgccgg aattgatccc ccgggctgca ggtcggccgc 1500 cacgaccggt gccgccacca tcccctgacc cacgcccctg acccctcaca aggagacgac 1560 cttccatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg 1620 ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc 1680 cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc 1740 tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc 1800 cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga 1860 gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca 1920 aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc 1980 tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct 2040 tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca 2100 ccgccgacgt cgagtgcccg aaggaccgcg cgacctggtg catgacccgc aagcccggtg 2160 cctgacgccc gccccacgac ccgcagcgcc cgaccgaaag gagcgcacga ccccatggct 2220 ccgaccgaag ccgacccggg cggccccgcc gaccccgcac ccgcccccga ggcccaccga 2280 ctctagtaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 2340 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 2400 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 2460 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 2520 agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 2580 atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 2640 atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 2700 tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 2760 gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 2820 cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg ctagcgctac 2880 cggactcaga tctatgatgg tactgaaagt agaggaactg 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ctctacccta ttccccacac 7140 tcaccggagc caaagccgcg gcccttccgt ttctttgct 7179

Claims

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hCARP(human Cardiac Ankyrin Repeat Protein)를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스에 의하여 형질감염된 섬유아세포(fibroblast)를 포함하는, 연조직 리모델링 관련 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제로서,
상기 연조직 리모델링 관련 질환은 심장 리모델링(cardiac remodeling)인, 세포 치료제.
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