KR20230055855A - 수용체 결합 도메인 단백질 항원 및 면역증강제를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 스파이크(Spike) 영역의 Receptor binding domain(RBD) 단백질 항원 및 면역증강제를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제와 단백질 항원 간의 최적의 조합을 통해서 항체 생성을 효과적으로 유도할 수 있을 뿐만 아니라 세포성 면역 유도 활성을 크게 증진시킴으로써 질환의 예방에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

수용체 결합 도메인 단백질 항원 및 면역증강제를 포함하는 백신 조성물 {VACCINE COMPOSITION COMPRISING RECEPTOR BINDING DOMAIN PROTEIN ANTIGEN AND ADJUVANT}

본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 스파이크(Spike) 영역의 Receptor binding domain(RBD) 단백질 항원을 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 단백질 항원; 및 만니드 올레이트(mannide oleate) 및 미네랄 오일(mineral oil)을 포함하는 면역증강제를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

코로나바이러스감염증-19(corona virus disease-19, COVID-19)는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의한 호흡기 감염증이다. 이러한 SARS-CoV-2의 감염 경로는 아직 명확하게 규명되지 않았으나, 일부 연구에 따르면 박쥐로부터 사람에게 감염되는 것으로 보고되고 있다.

SARS-CoV-2의 유전체는 비분절 형태이며 크기는 약 30 kb로 10개의 단백질을 encoding하고 있다. 10개의 단백질은 한 개의 복제 polyproteins(open reading frames 1ab), 4개의 구조 단백질(Spike, envelope, membrane and nucleocapsid), 5개의 non-structural 단백질(open reading frames 3a, 6, 7a, 8 and 10)로 구성되어 있다.

SARS-CoV-2는 사람 간 전염이 가능하며 상당히 높은 치사율을 보이고 있어 국내외로 큰 문제가 되고 있다.

한편, SARS-CoV-2의 유전체는 비분절 형태이며 크기는 약 30 kb로 10개의 단백질을 encoding하고 있다. 10개의 단백질은 한 개의 복제 polyproteins(open reading frames 1ab), 4개의 구조 단백질 (spike, envelope, membrane and nucleocapsid), 5개의 non-structural 단백질(open reading frames 3a, 6, 7a, 8 and 10)로 구성되어 있다.

이 중 spike protein의 리셉터 결합도메인(receptor binding domain, RBD)은 숙주 세포의 리셉터인 ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하여 세포내 진입을 매개하며 바이러스의 중화항체의 주요 표적으로써, 중화항체를 생산할 수 있는 에피토프(epitope)로 알려져 왔다. SARS-CoV-2의 경우 많은 그룹들이 리셉터 결합도메인을 이용하여 백신 후보물질을 개발하고 있으며, spike protein의 전장 단백질과 리셉터 결합도메인을 백신 항원으로 이용할 경우 중화항체의 형성 및 백신 효능은 많이 다른 양상을 보인다.

백신 개발 초기에는 생백신 또는 사백신의 형태로 개발되었으나 이들 백신은 면역 저하자에서 질병을 일으키거나 전신 혹은 국소 부작용을 일으키는 단점이 있어 재조합 단백질을 항원으로 사용하는 형태의 백신이 증가하였다. 그러나 대체적인 재조합단백질 기반의 항원은 생백신 혹은 사백신에 비하여 면역원성이 낮아 면역증강제를 혼합하여 사용하는 것을 고려한다. 사람 백신에 처음 사용된 면역증강제는 알루미늄 염으로써 1920년대에 도입된 후 지금까지 대부분의 백신에 사용되고 있으나, 일반적으로 체액성 면역 반응 활성은 우수한 반면 세포성 면역 유도 활성은 낮은 단점이 있다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 백신으로 바이러스의 스파이크(Spike) 영역의 Receptor binding domain(RBD) 단백질 항원과 특정 면역증강제로 세포성 면역과 더불어 체액성 면역 유도 활성이 우수한 Montanide ISA 계열 면역증강제의 조합을 통하여 백신으로서 우수한 작용 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료 용도를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

스파이크의 리셉터 결합 도메인 단백질 (receptor binding domain, RBD)은 숙주 세포의 리셉터인 ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하여 세포내 진입을 매개하며 바이러스의 중화 항체의 주요 표적으로 이용될 수 있다. 즉, 중화항체를 생산할 수 있는 에피토프(epitope)로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 잔기의 명명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 단백질의 전장 서열을 기초로 하여 언급되는 것을 기초로 한다.

본 발명에 따른 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 단백질 및/또는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 리셉터 결합 도메인 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 전장 서열을 의미하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 리셉터 결합 도메인 단백질은 구조 분석을 통해 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 리셉터 결합 도메인 단백질의 전체 서열 중 안정한 형태의 2차 구조를 갖는 RBD 단백질을 선택한 것으로, RBD 단백질의 단편일 수 있다. 이러한 서열은 스파이크 리셉터 결합 도메인 단백질의 전장 서열인 서열번호 2의 아미노산 서열의 323 내지 532 번째 아미노산 서열이다.

이러한 선택된 아미노산 서열은 RBD의 다른 영역과 대비하여 구조적 안정성이 매우 우수할 뿐만 아니라 항원으로써 작용 효과 또한 타 부위와 대비하여 현저히 우수하다는 차이점을 가진다. 특히, 본 발명에 따른 상기 단백질 항원은 전장 서열에 비하여 작은 크기를 가짐으로써 생산이 매우 용이하며 중화 항체 생성능이 현저히 우수하다. 또한, 3차원 구조상 N 말단과 C말단에 flexible 한 loop 영역을 최소화하여 안정성을 증가시킴으로써 안정적으로 항원이 유지될 수 있다.

즉, 일반적으로 단백질 항원은 면역원성이 낮거나 생산이 어렵거나 안정성 낮은 등의 문제가 있으나, 본 발명에 따른 항원 단백질은 이러한 문제를 해소하고 항원으로 우수한 작용을 가질 수 있다.

필요에 따라, 본 발명에 따른 상기 단백질 항원은 Fc 단편(Fc antibody fragment)과 융합될 수 있다. Fc 단편(Fc antibody fragment)은 항체 Fc 단편 유래 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하며, 항원-제시세포(antigen-presenting cell, APC)와 결합할 수 있는 부분을 지칭한다. Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 것 일 수 있으며, 바람직하게 IgG 유래의 Fc 단편일 수 있다. 상기 IgG는 다시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나뉠 수 있으며, 본 발명의 Fc 단편은 가장 바람직하게 IgG1 유래의 Fc 단편일 수 있다. 'Fc 단편'은 면역글로불린(Ig) 분자를 파파인으로 분해시킬 때 얻어지는 분절로, 경쇄의 가변 영역(VL)과 불변 영역(CL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 중쇄 불변영역 1(CH1)이 제거된 영역이다. 즉, 상기 Fc 단편은 두 개의 CH2-CH3 도메인 사슬의 이량체(dimer of two CH2-CH3 chain)를 의미하는 것으로 상기 두 사슬은 이황화결합에 의해 이량체 구조를 형성한다. 또한, 상기 Fc 단편은 중쇄 불변영역에 경첩영역(hinge region) 펩타이드의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 또한, 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)의 일부 또는 전체를 포함하는 확장된 Fc 단편일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 단편일 수도 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 포함하는 백신 조성물의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 백신 조성물은 높은 역가의 중화항체를 유도한다. 본 발명의 백신 조성물은 기타의 사스 코로나바이러스 2 유래 단백질과 대비하여 더 높은 역가의 중화항체를 유도한다. 특히 이러한 작용은 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제와의 조합을 통해 이루어진다.

본 발명의 백신 조성물은 효과적인 중화항체 반응을 나타낸다. 또한 구조적으로 안정적인 단백질을 항원 단백질로 선정하여 사용함으로써 안정적으로 백신의 작용 효과를 나타낼 수 있다. 즉, 강력한 숙주 항체 반응 또는 방어 면역(protective immunity)을 유도할 수 있는 장점을 가진다.

본 발명에 있어서, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염에 따른 질환은 호흡기 질환일 수 있다. 상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환은 예를 들어 바이러스 감염 후 2일 내지 14일의 잠복기를 거친 뒤 증상이 나타날 수 있다. 이러한 증상은 예를 들어, 고열, 기침, 숨가쁨, 폐렴, 설사와 같은 위-장관 증상, 기관 기능 부전(신부전, 신장 기능장애 등), 패혈성 쇼크, 심한 경우 사망을 포함하여, 상기 바이러스 감염에 의해 발생되는 증상이라면 어떠한 것이라도 포함된다.

본 발명의 조성물은 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 포함한다. 이는 항원의 유중수 에멀젼(Water-in-oil emusion)을 생산하기 위하는 데 사용된다. Water-in-oil emusion은 지속적인 유제 상태를 가지며 높은 수준의 지속적인 면역반응을 유도한다. 특히, 본 발명에 따른 조성에서는 체액성 면역의 유도가 월등히 우수하며 항체 지속능 또한 매우 우수한 장점을 가진다.

만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제는 주로 Th₂ 항체 생성 형질 세포의 자극과 함께 주사 부위에 저장소를 형성함으로써 편향된 반응을 나타낼 수 있다.

이는 항원의 느린 방출을 허용하고 T 세포가 형질 세포에 의해 분비되도록 자극한다. 특히, 높은 T-세포 면역반응을 유발하는 특징을 가진다.

또한, 면역 후 방어능을 결정하는 GC B세포(Germinal center　B cell)와 Tfh세포(Follicular helper T cell)의 발현 수준이 높으며, 이는 체액성 면역 측면에서 항체 형성이 매우 우수함을 보여준다.

또한, 어떤 형태의 유기체도 포함하지 않아 독성이 적으면서 강력한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 즉, Depot 효과를 나타내며 항원을 오래 유출시키고 보다 높은 면역 반응을 유도한다. 또한 림프구 침윤과 수지상세포 및 대식세포의 항원 표현 기능도 향상시키는데 장점을 가질 수 있다.

즉, 중화능 및 면역원성 측면에서 위 조성을 통해 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제는 면역증강제 총 조성물에 대하여 만니드 올레이트를 대략 6 내지 25 %(w/w)를 포함하여, 미네랄 오일을 대략 80 내지 96 %(w/w)로 포함한다. 즉, 면역증강제 총 조성에 대하여 만니드 올레이트를 6 내지 25 %(w/w) 및 미네랄 오일을 80 내지 96 %(w/w)로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 위 면역증강제는 만니드 올레이트 및 미네랄 오일로만 구성된 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 면역증강제는 프랑스 파리에 소재한 세픽 (Seppic) SA에 의해 제조 및 공급된 Montanide ISA 면역증강제이다. 보다 구체적으로, Montanide™ ISA 면역증강제는 MONTANIDE™ ISA51이다. 즉, 본 명세서에 있어서 언급하는 MONTANIDE™ ISA51 면역증강제는 구체적인 제품일 수 있다.

MONTANIDE™ ISA51 면역증강제를 위한 계면활성제는 만니드 올레이트(mannide oleate)이며, 오일 성분은 미네랄 오일이다.

즉, 몬타니드™ ISA 51은 고순도의 미네랄 오일 및 계면활성제로 mannide oleate의 혼합물을 포함한다.

몬타니드™ ISA 51의 제품은 beef tallow에서 단리된 만니드 올레이트으로부터 올리브에서 단리된 만니드 올레이트으로 변경된 제품인 몬타니드™ ISA 51 VG가 또한 존재한다.

본 명세서에 있어서 몬타니드™ ISA 51는 현재 시판되고 있는 몬타니드™ ISA 51 및 이로부터 유도되는 (예를 들면 올리브에서 단리된 올레산을 다른 기원부터 단리되거나, 또는 합성물로 치환함으로써) 생물학적으로 동등한 모든 면역증강제를 의미한다.

몬타니드™ ISA 51을 이용하여 유화된 항원(RBD 단백질 항원)을 얻기 위해, 통상의 알려진 혼합 방식을 이용할 수 있다. 예를 들어, Impeller가 있는 교반기, homogenizer등을 이용하여 에멀전을 제조할 수 있다. 예를 들어, seppic사에서 제공하는 방법으로 600 내지 2,000 rpm agitation 하면서, 몬타니드™ ISA 51를 투입하고 천천히 항원을 첨가하면서 1 내지 12분 동안 3,000 내지 5,000 rpm에서 mixing과 같은 과정을 거칠 수 있다. 반응기의 크기 및 impeller에 따라 교반속도 및 시간은 달라질 수 있다.

또한, 혼합 후 즉시 사용을 위해서 커넥터(I 또는 T-커넥터)에 의해 접속된 실리콘 프리의 2개의 주사기가 이용되어 이들을 혼합할 수 있다. 이어서 그 혼합물을 예를 들면 I-커넥터에 의해 접속된 실리콘 프리의 2개의 주사기로 이루어진 디바이스에 장전하고 그것을 20회의 저속 사이클의 유화 전공정, 계속하여 40회의 급속 사이클의 유화 공정을 수행하여 현탁액을 제조한다.

일반적으로 항원은 1배(0.9 % Nacl) 내지 2배 농도의 생리 식염수(예를 들어 대략 1.8 % NaCl). PBS 등에 용해되고 이 용액의 대략 1 용량이 몬타니드™ ISA 51의 대략 1 용량과 혼합된다.

즉, 0.8 내지 2.0 %(w/w) 의 NaCl 수용액과 1:1 용량으로 몬타니드™ ISA 51이 혼합될 수 있다.

바람직하게는 1:1 혼합 후 생리 식염수의 농도를 가질 수 있도록 2배 농도(1.8 % NaCl)의 생리 식염수를 사용한다.

즉, 본 발명에 따른 항원은 바람직하게 1.7 내지 1.9 % (w/w)의 NaCl 수용액에 용해되는 것이 바람직하다. 이에 따라, 몬타니드™ ISA 51와 혼합후 적절한 삼투압 조건 및 생리 식염수와 같은 체액 수준을 맞출 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원 및 몬타니드™ ISA 51은 사용 전(즉, 체내 투여 전) 혼합되어 조성물을 형성하는 것일 수 있다.

여기서, 수상(즉, 0.8 내지 2.0 %(w/w) 의 NaCl 수용액 등)과 유상의 50/50 비율이 변경되는 경우, 전체 용액에 있어서 어느 일방(즉, 항원 또는 몬타니드™ ISA 51)이 대략 60 %까지 차지할 수 있다. 그러므로 그 밖에 별도의 설명이 없으면 항원을 포함하는 수상의 1 용량과 몬타니드™ ISA 51의 1 용량을 혼합한다는 것은 대략 60:40 내지 40:60(v/v)의 사이의 비로 수상과 몬타니드™ ISA 51을 혼합하는 것을 의미할 수 있다.

즉, 부피비로 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원을 포함하는 0.8 내지 2.0 %(w/w) 의 NaCl 수용액와 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 4:6 내지 6:4의 비율로 혼합한 것일 수 있다.

이 공정이 10~40℃의 사이의 온도에서 수행될 때, 완전한 용해를 얻을 수 있는데 수초 내지 2분이 필요하다. 필요하면 2개의 손가락으로 바이알을 사이에 두어, 느슨한 교반이 적용될 수 있다. 이 용해 공정은 더욱 낮은 온도, 예를 들면 냉장고 중(1~4℃)에서도 수행될 수 있다.

특정 양태에 의하면 항원을 포함하는 수상은 최종 농도가 0.1 ~ 0.5 mg/ml 사이, 바람직하게는 0.2 ~ 0.4 mg/ml의 범위가 되도록 제조된다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원을 포함하는 0.8 내지 2.0 %(w/w) 의 NaCl 수용액 내 최종 농도가 0.1~0.5 mg/ml 사이, 바람직하게는 0.2~0.4 mg/ml의 범위가 되도록 항원 단백질을 포함한다.

그리고 나서, 이를 몬타니드™ ISA 51와 비가 60:40 내지 40:60의 사이에 포함되도록, 제1 주사기 중에 항원을 포함하는 수상 대략 1 용량을 제2 주사기 중에 몬타니드™ ISA 51 대략 1 용량을 장전하여 이어서 커넥터에 의해 2개의 주사기를 가교함으로써 수행된다.

바이알에서 액체를 이동시키기 위한 가장 단순한 방법은 주사기와 바늘을 사용하는 것이다. 다만, 필요에 따라 바이알 어댑터를 사하여 혼합 공정을 수행할 수 있다.

본 발명의 백신이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 닭, 오리, 칠면조, 페럿 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 "치료"는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염을 원인으로 하는 질환에 걸린 개체에서 바이러스에 대한 면역반응을 활성화 시킴으로써 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 면역증강제로 적용될 수도 있다.

이에, 본 명세서에서 용어 "치료" 또는 "치료제"는 "치료 보조" 또는 "치료 면역증강제"의 의미를 포함한다.

본 발명에서의 용어 "면역 반응"은 세포-매개된(T-세포) 면역 반응 및/또는 항체(B-세포) 반응을 지칭한다.

본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

즉, 본 발명의 백신 조성물은 항원인 단백질 이외에도 백신 조성물을 구성하는데 적절한 하나 이상의 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체, 특히 항원 단백질을 담을 수 있는 조성물 상의 담체는 약학적으로 허용 가능한 담체일 수 있고, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체의 예로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등이 있다.

본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판(Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체예에서, 상기 백신 조성물은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 그 이상의 간격으로 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상 접종하는 것이 더 바람직하다. 1 내지 6주 간격, 바람직하게 2 내지 5주, 보다 바람직하게 4주 간격으로 2 또는 3회 투여하는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로, 위 생산된 몬타니드™ ISA 51과 혼합되어 생성된 에멀젼을 0.2 내지 1.0 ml, 바람직하게 0.3 내지 0.8 ml, 바람직하게 대략 0.5 ml로 통상의 성인에게 투여할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 백신 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 백신 조성물은 근육내(intramuscular), 정맥내(Intravenous), 피하(subcutaneous), 피내(Intradermal) 및 비강내(intranasal)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 백신 조성물은 투여 시 전달 효율을 높이기 위하여 물리적인 자극을 가하는 방법을 통해 투여할 수 있으며, 그 예로는 전기천공(electroporation)법, 유전자 총(gene gun)법 및 제트 분사(Jet injection)법 등이 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.

또한 본 발명에 따른 백신 조성물은 그 투여 방법이나 제형으로써 바람직하게 용해 면역증강제와 혼합된 형태, 즉 몬타니드™ ISA 51과 같은 면역증강제 등을 0.8 내지 2.0 %(w/w)의 NaCl 수용액 등의 수상과 혼합하여 즉시 사용할 수 있다.

상기 백신 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다.

아울러, 본 발명의 백신 조성물은 치료적으로 유효한 양으로 투여된다.

본 발명에 있어서, 치료적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물의 투여량은 1 일 0.0001 내지 1,000 mg/kg(체중)의 양의 범위이나, 개체의 종류에 따라 달라 질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다

한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 백신 조성물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자의 질병 또는 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

본 발명의 백신 조성물의 최적의 투여량은 피검체에서 적합한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신화 후, 피검체는 적당한 간격을 두고 1회 또는 수 차례의 부스터 면역화 처리될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 그 범위가 다양하며, 상기 사항을 고려하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 인간을 제외한 동물에 주입하는 단계; 및 (b) 상기 동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 단백질; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제의 도입은 피내, 피하 또는 근육 조직 내로 주사하여 수행될 수 있다.

상기 용어 "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 성분으로서 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원-항체반응을 일으키는 단백질이다. 항원-항체 반응은 각 항원에 대하여 높은 특이성을 갖는다. 이는 림프구의 B세포에서 항체가 만들어질 때 특정항원에 의해 생성된 항체는 원칙적으로 다른 항원과 반응하지 않는다. 이러한 높은 특이성은 면역, 알레르기, 각종 병 및 감염의 종류·형의 결정 등의 검사에 사용된다.

이 때 상기 동물은 인간을 제외한 포유동물 일 수 있다. 예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터, 돼지, 토끼, 말, 당나귀, 염소, 양, 기니 피그, 라마 등을 비제한적으로 포함한다. 예를 들어, 마우스, 랫트는 단클론성 항체를 제조하기 위해 사용되기 바람직하다.

일 실시양태에서, 비-인간 포유동물에서 제조된 중화항체는 인간화 항체로 변환될 수 있다. 이 경우 본 발명의 상기 방법은 비-인간 포유동물에서 생성된 중화항체를 인간화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다

본 발명의 중화항체는 포유동물에서 바이러스 감염에 의한 질병을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 중화항체는 바이러스를 중화시키기에 충분한 용량으로 사용된다.

또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

본 발명에 따른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단편 단백질 항원은 안정한 형태의 단백질 구조와 높은 중화능을 가지며 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제와 함께 우수한 방어 능력을 통해 백신으로 현저히 우수한 효과를 나타낸다. 특히 면역증강제로 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 몬타니드™ ISA 51 과 단백질 항원 간의 최적의 조합을 통해서 항체 생성을 효과적으로 유도할 수 있을 뿐만 아니라 세포성 면역 유도 활성을 크게 증진시킴으로써 질환의 예방에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 SARS-CoV-2 스파이크의 수용체 결합 도메인 단백질의 발현을 위한 동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.4-SARS-CoV-RBD를 나타낸 도이다.
도 2는 SDS-PAGE로 SARS-CoV-2 스파이크의 수용체 결합 도메인 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 면역증강제로 Alum, Montanide™ ISA 51, glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE)의 종류에 따른 항체 형성능을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 Alum 면역증강제의 농도별 처리에 따른 항체 형성능 차이를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 면역증강제로 Alum, Montanide™ ISA 51, glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE)와 RBD 항원의 처리에 따른 항체 형성능을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 면역증강제로 Alum 또는 Montanide™ ISA 51와 RBD 항원의 처리에 의한 마우스 및 헴스터에서의 중화항체 생성능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 Montanide™ ISA 51와 RBD 항원의 처리를 통하여 hACE2 형질전환 마우스에서 항체 형성능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 SARS-CoV-2의 중화능 평가 시스템을 나타낸다.
도 9는 시리안 햄스터, hACE2 형질전환 마우스 그리고 일반마우스에서 항혈청에 대한 중화능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 시리안 햄스터, hACE2 형질전환 마우스 코로나19 백신 후 바이러스 방어 효능을 평가하기 위한 모식도를 나타낸다.
도 11은 시리안 햄스터에서 공격접종 후 체중변화와 폐조직에서의 바이러스 증식 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 시리안 햄스터의 바이러스 공격 접종 후 조직 병리학 및 IHC 분석을 통해 염증 반응의 감소를 확인한 결과를 나타낸다.
도 13는 hACE2 형질전환 마우스 모델에서 SARS-CoV-2 공격 접종 후 날짜별 체중 변화 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 hACE2 형질전환 마우스 모델에서 SARS-CoV-2 공격 접종 후 2일, 5일, 7일에 중화항체 형성능 및 폐의 육안 관찰을 수행한 결과를 나타낸다.
도 15은 페조직의 병리학적 분석을 진행한 결과로써 Montanide™ ISA 51와 RBD 항원을 처리한 실험 군에서 염증 세포의 침윤, 부종, 모세혈관 확장 병변들의 유의적으로 감소한 것을 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 형질 전환 CHO 세포주의 제조 (ExpiCHO-S cell line 형질감염 방법)

SARS-CoV-2의 RBD 단백질(210개 아미노산)은 SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 염기서열을 이용하여 제조되었다. 구체적으로, RBD 전장 단백질의 323 내지 532 아미노산 서열(서열번호 1)에 대한 염기서열을 CHO 세포주에 맞게 codon optimization 하여 ㈜바이오니아를 통해 합성하였다. 항원 단백질 제조를 위해 선택된 SARS-CoV-2의 RBD 단백질의 단편에 대하여 CHO 세포주에 맞게 codon optimization 하여 제조된 염기서열을 서열번호 3에 나타내었다.

상기 서열번호 1의 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 단편을 modified pcDNA3.4 vector를 modified pcDNA3.4 vector의 BamHI 과 XhoI 부위에 서브클론(subclone)하여 재조합 plasmid를 제작하였다. 벡터 내 삽입을 위한 서열은 323 내지 532 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 3을 포함하도록 설계 되었으며, 이의 서열을 서열번호 5에 나타내었다.

이와 같이, 제조된 재조합 플라스미드의 모식도를 도 1에 나타내고 전장 서열을 서열번호 4에 나타내었다.

형질 전환을 위해 ExpiCHO-S세포를 준비하였다. 재조합 plasmid는 CHO 세포주(Chinese hamster ovary)에 Expi CHO transfection kit를 이용하여 형질주입하였다.

그리고 나서, 위 형질전환된 CHO 세포를 배양하여 배양 상층액은 반투과성 막을 이용하여 배지 성분을 제거한 후, 니켈-친화성 크로마토그래피로 일차 정제하였다. 이 후 단백질은 2X PBS 완충용액을 사용하여 HiPrep 16/60 Superdex S-200 겔-여과 크로마토그래피로 한번 더 정제하여, RBD 단백질을 얻었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 (a) 및 (b)를 통해 크로마토그래피에 의하여 순도 95%이상으로 정제되고 RBD 단백질이 제조된 것을 확인하였고, 도 (c)를 통해 농도에 따라 RBD 단백질이 SDS-PAGE 상에서 발현이 증가된 것을 확인하였다.

실시예 2. 백신 조성물의 제조

(1)Montanide™ ISA 51 면역 증강제 사용

상기 실시예 1에서 제조된 RBD 단백질 항원을 각각 10, 25, 50 μg으로 2배 농도의 생리식염수 0.25 ml에 용해시켰다. 그리고 나서, Montanide™ ISA 51 면역 증강제 0.25 ml와 1:1의 비율로 혼합하여 백신 조성물을 제조하였다.

(2) 비교예 1: Alum의 사용

상기 실시예 1에서 제조된 RBD 단백질 항원을 각각 10, 25, 50, 100, 200 μg으로 2배 농도의 생리식염수 0.25 ml에 용해시켰다. Alum 0.25 ml과 1:1로 혼합하여 백신 조성물을 제조하였다.

(3) 비교예 2: glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE) 의 사용

상기 실시예 1에서 제조된 RBD 단백질 항원을 각각 10, 25, 50 μg으로 2배 농도의 생리식염수 0.25 ml에 용해시켰다. 그리고 나서, glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE)을 각각 2, 5, 10 μg과 혼합하여 백신 조성물을 제조하였다.

실시예 3. SARS-CoV-2 RBD 단백질 항원의 SARS-CoV-2 항체 생성 확인(C57B/c 마우스 대상)

상기 실시예 1에서 제조된 RBD 단백질 항원이 효과적으로 항체 생성을 유도하는지 여부를 확인하기 위하여, 이의 항체 생성 효과를 확인하였다.

먼저 정제된 RBD 단백질 항원을 마우스에 주사하기 전에 전-면역 혈청(pre-immune serum)을 채취하여 이를 음성 대조군으로 사용하였다.

일차적 면역화(Primary immunize)를 위하여 상기 실시예 2와 같이 항원 10 μg을 Alum, Montanide™ ISA 51, 또는 glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE) adjuvant와 혼합한 조성물을 근육주사하고, 2주 후 Alum, Montanide™ ISA 51, 또는 glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE)와 혼합한 백신 조성물을 이용하여 부스팅(boosting)을 하였다.

2주 후 1차 혈액을 채취하여 ELISA 테스트를 진행하고, 부스팅 2주 후 쥐에서 채혈하고 최종 혈청을 분리하여 ELISA 실험을 수행하였다. ELISA 테스트에서 항원은 웰 당 100ng을 사용하였으며, 면역 혈청은 1X PBS로 1:100 내지 1:500 내지 1:1,000 내지 1:5,000 내지 1:10,000 내지 1:50,000 1:100,000 내지 1:500,000 비율로 희석하였고, 2차 확인을 위하여 항-마우스 IgG-HRP(ABC5001)을 1:5,000 비율로 희석하여 사용하였다. 광학 밀도 450 nm에서 발색을 검출하여 우선적으로 면역 항체 생성 여부를 확인하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, Montanide™ ISA 51이 가장 좋은 항체 형성을 보였으며, Alum, glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE)의 경우 충분한 항체 형성능을 나타내지 못하였다.

실시예 4. SARS-CoV-2 RBD 단백질 항원 처리 농도 차이에 따른 SARS-CoV-2 항체 생성 확인(C57B/c 마우스 대상)

실시예 2의 조성물을 사용하여 Alum 면역증강제에 대하여 백신 항원 농도를 증가시켰을 때의 항체 형성능의 변화를 확인하여, 위 Alum 면역증강제의 이용가능성을 검토하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, Alum 면역증강제에서는 SARS-CoV-2 RBD 단백질 항원 처리가 50 μg 정도까지는 일부 증가하는 패턴을 나타냈으나 약 4배 정도에 이르는 200 μg에 도달하더라도 항체 형성에 큰 변화가 없는 것을 확인하였다. 즉, 50 μg 정도가 적정 항원 농도로 Montanide™ ISA 51보다는 훨씬 떨어지는 항체 형성능을 보였으며, 이러한 결과로부터 Alum 면역증강제로 충분히 작용할 수 없음을 확인하였다.

실시예 5. SARS-CoV-2 RBD 단백질 항원의 SARS-CoV-2 항체 생성 확인(Syrian hamster 대상)

상기 실시예 1에서 제조된 RBD 단백질 항원과 면역 증강제의 조합이 효과적으로 항체 생성을 유도하는지 여부를 확인하기 위하여, 이의 항체 생성 효과를 햄스터 모델에서 확인하였다.

먼저 상기 실시예 1에서 정제된 RBD 단백질 항원을 햄스터에 주사하기 전에 전-면역 혈청(pre-immune serum)을 채취하여 이를 음성 대조군으로 사용하였다.

일차적 면역화(Primary immunize)를 위하여 실시예 2에서와 같이 항원 25 μg (WT25) 또는 50 μg (WT50)을 Alum, Montanide™ ISA 51, 또는 glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE) adjuvant와 혼합하여 조성물을 제조하여 근육주사하고, 3주 후 Alum, Montanide™ ISA 51, 또는 glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion (GLA-SE)와 혼합하여 조성물을 제조하고 이를 주사하여 부스팅(boosting)을 하였다.

3주 후 1차 혈액을 채취하여 ELISA 테스트를 진행하고, 부스팅 3주 후 쥐에서 채혈하고 최종 혈청을 분리하여 ELISA 실험을 수행하였다. ELISA 테스트에서 항원은 웰 당 100 ng을 사용하였으며, 면역 혈청은 1X PBS로 1:100 내지 1:500 내지 1:1,000 내지 1:5,000 내지 1:10,000 내지 1:50,000 1:100,000 내지 1:500,000 비율로 희석하였고, 2차 확인을 위하여 항-마우스 IgG-HRP(ABC5001)을 1:5,000 비율로 희석하여 사용하였다. 광학 밀도 450 nm에서 발색을 검출하여 우선적으로 면역 항체 생성 여부를 확인하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, Montanide™ ISA 51이 가장 좋은 항체 형성을 보였다. 특히 이러한 결과는 25, 50 μg 농도 모두에서 동일하게 우수하였으며, 25 μg 농도에서 최적항체가 형성되었다. 반면, Alum과 GLA-SE를 이용한 결과에서는 항체가 전혀 형성되지 않음을 확인하였다.

실시예 6. SARS-CoV-2 RBD 단백질 항원의 SARS-CoV-2 중화항체 생성 확인 및 중화능 비교

SARS-CoV-2 (BetaCoV/ South Korea/ KUMC01/2020) 바이러스를 분양 받고, 이를 이용하여 중화항체 생성능 평가를 수행하였다.

구체적으로, SARS-CoV-2 중화능을 평가하기 위하여, 최적의 면역증강제와 항원 용량에서의 중화능을 비교하였다. 실시예 3(마우스에서 10 μg 단백질 항원) 및 실시예 5(햄스터에서 25 μg 단백질 항원)에서의 면역을 통해 얻어진 항혈청을 처리하여 VERO E6 세포가 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 발생된 세포 변성에 대하여 얼마만큼 방어하는지에 대한 평가를 진행하였다

RBD 단백질의 항혈청을 일정 비율(1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1,280)로 희석시킨 후 바이러스를 각각 100 TCID₅₀과 혼합하여, Vero E6 세포에 1시간 동안 처리한 후에 제거하고, 새로운 배양액에서 72시간 후에 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)가 나타나기 직전의 희석 배율의 값을 판독하여 중화능으로 평가하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, Montanide™ ISA 51 면역증강제를 사용한 실험군에서 모두 우수한 중화 항체 형성능을 보였다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 Montanide™ ISA 51 면역증강제와 RBD 항원의 조합이 우수한 중화 효능을 통해 백신으로 작용효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. hACE2형질전환 마우스를 이용한 코로나19 재조합 단백질 백신의 항체 형성능 평가 (인간 ACE2가 형질전환된 SARS-CoV-2 감염 마우스 대상)

인간 ACE2가 형질전환된 SARS-CoV-2 감염 마우스(B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J)를 이용하여, 항체 형성능을 평가하고 백신의 중화능 및 공격 접종 효능 평가를 위한 감염 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 항체 형성이 잘 이루어졌던 Montanide™ ISA 51 면역증강제를 이용하여 실시예 2에서와 유사하게 백신 조성물을 제조한 후 마리당 10 μg을 2 주 간격으로 2회 면역한 후 항혈청을 취하여 항체 형성을 평가하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 9마리의 hACE2 형질 전환 마우스에 상기 RBD 단백질 및 Montanide™ ISA 51 면역증강제를 이용한 면역을 통해 3마리의 음성 항혈청과 비교하여 높은 항체 형성을 확인하였다.

실시예 8. hACE2형질전환 마우스를 이용한 코로나19 재조합 단백질 백신의 중화항체 효능 평가 (인간 ACE2가 형질전환된 SARS-CoV-2 감염 마우스 대상)

바이러스 중화능 평가 시스템을 이용하여 중화항체의 효능을 평가하였다. 구체적으로, SARS-CoV-2 바이러스에 의한 VERO E6 세포 변성이 백신에 의해 생성된 중화항체에 의해 얼마만큼 방어되는지 대한 평가를 수행하였고, 관련 시스템에 대한 모식도를 도 8에 나타내었다.

구체적으로, 앞서는 실시예 5 및 7과 같이, hACE2 형질전환 마우스에 대하여 2주 간격으로 그리고 시리안 햄스터는 3주 간격으로 2회 접종 후 채혈하여 SARS-CoV-2 바이러스를 중화하는 능력을 혈청을 희석하면서 Vero E6 세포가 변성되기 직전의 희석 비율로 중화 항체가를 결정하였다.

그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시리안 햄스터의 경우 중화 항체가가 약 90 정도 나온 반면에, hACE2 형질전환 마우스는 약 311정도로 3배 이상 높은 중화능을 보임을 확인하였다. 또한, 일반마우스의 경우는 450 정도로 더 높은 중화항체가 결과를 나타내어, 면역 동물 간 그리고 형질전환 마우스 간의 백신에 대한 면역반응의 차이가 있음을 확인하였다.

실시예 9. 공격 접종(감염 모델)에서의 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 예방 효능 평가

hACE2 형질전환 마우스와 시리안 햄스터 동물 모델을 이용하여 바이러스 공격 접종을 통하여 백신의 효능평가를 수행하였다.

구체적으로, 앞서는 실시예 5 또는 7과 같이, hACE2 형질전환 마우스(B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J))에 대하여 백신 접종을 2주 간격으로 2회 수행하고, 시리안 햄스터는 3주 간격으로 2회 접종하고 채혈을 수행하였다. 그리고 나서, SARS-CoV-2 각각 10⁴ TCID₅₀ 와 10⁵ TCID₅₀ dose로 감염 후, 2일, 4일(햄스터는 5일), 7일, 9일 그리고 14일에 체중 변화와 기관기와 폐 등에서 바이러스 증식여부를 관찰하고 페조직의 병리학적인 분석을 진행하였다.

이의 실험 방법 및 스케쥴에 대한 모식도를 도 10에 나타내었다.

(1) 시리안 햄스터 동물 모델에서의 효과 확인

시리안 햄스터 동물 모델에서 감염후 체중 변화와 폐조직에서 바이러스 증식 억제 효과를 확인하여, 이를 도 11에 나타내었다.

도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시리안 햄스터의 경우 2회 반복 실험을 통하여 백신군의 체중이 비백신군의 체중 보다 적게 감소하였고, 감염 후 폐 조직에서 바이러스 증식은 5일째부터 현저히 줄어들어 9일 이후에는 유의적으로 바이러스가 거의 검출되지 않음을 확인하였다.

또한, 조직 병리학적 분석 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비백신에 비해 감염 5일 후에는 염증반응이 백신군에서 현저히 감소하였다. 또한, 7일 이후에는 비 감염의 정상의 폐조직과 유사한 정도 회복되는 양상을 보임을 확인하였다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 Montanide™ ISA 51 면역증강제와 RBD 항원이 우수한 질환 치료 효과를 나타내는 것을 보여준다.

(2) hACE2 형질전환 마우스 모델에서 효과 확인

본 발명에 따른 Montanide™ ISA 51 면역증강제와 RBD 항원을 처리한 그룹과 그렇지 않은 그룹 간의 생존율 및 체중 변화를 확인하였다.

그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비백신군의 경우에는 감염 후 5일부터 급격하게 체중이 감소하며, 8일에는 모든 개체가 폐사하였으나, 백신군의 경우에는 6일 이후 체중이 감소하는 개체가 일부 관찰되었지만, 90% 이상의 생존율을 보임을 확인하였다.

또한, 바이러스 공격접종 후 2일, 5일, 7일(Dpi)에 폐조직을 취하여 바이러스 증식을 RT-PCR 확인하여 titer를 확인한 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 비백신군의 경우에는 모든 개체에서 바이러스 증식이 관찰되었지만, 백신군에서는 5일 이후 7일째부터는 바이러스 증식이 현저히 감소한 경향을 보임을 확인하였다. 또한, 이러한 경향은 폐의 육안상 병변을 통해서도 확인되었다. 도면에서 확인할 수 있는 바와 같이, 5일째 폐의 육안 병변으로 보면 비백신군의 전체적으로 염증반응으로 인해 붉은색은 병변이 보이지만, 백신군의 경우에는 거의 병변을 관찰 할 수 없었다.

또한, 페 조직의 병리학적 분석을 진행한 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 감염 5일째부터 7일째까지 비백신군에서는 다수의 염증 세포가 다발성으로 혈관 및 기관지에 침윤되어 있으며, 폐포강 및 폐포벽에서 소수에서 중정도 수의 염증 세포의 침윤이 다발성으로 관찰되고, 혈관 주변에 중정도 수준에서 심각한 수준의 부종 소견이 빈번히 관찰되었으며, 심각한 수준의 모세혈관 확장 소견이 관찰되었다. 반면, 백신군의 경우 폐에서 관찰되는 염증 세포의 침윤, 부종, 모세혈관 확장 병변들의 유의한 감소가 관찰되었다.

상기 결과들을 통해서 본 발명에 따른 RBD 항원과 Montanide™ ISA 51 면역증강제 간의 조합이 SARS-Cov2 감염에 의한 질환 치료에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

이러한 결과를 기초로 본 발명에 따른 항원 및 면역증강제 조합물이 우수한 질환 예방 효과를 나타냄을 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> HuVet bio, Inc. Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> VACCINE COMPOSITION COMPRISING RECEPTOR BINDING DOMAIN PROTEIN ANTIGEN AND ADJUVANT <130> P21164 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov2 RBD 323-532 <400> 1 Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe 1 5 10 15 Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 20 25 30 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn 35 40 45 Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 50 55 60 Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile 65 70 75 80 Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile 85 90 95 Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile 100 105 110 Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn 115 120 125 Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg 130 135 140 Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly 145 150 155 160 Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln 165 170 175 Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser 180 185 190 Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser 195 200 205 Thr Asn 210 <210> 2 <211> 1273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov2 S protein <400> 2 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val 1025 1030 1035 1040 Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1045 1050 1055 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu 1060 1065 1070 Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His 1075 1080 1085 Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val 1090 1095 1100 Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1125 1130 1135 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1140 1145 1150 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 1155 1160 1165 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp 1170 1175 1180 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1185 1190 1195 1200 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile 1205 1210 1215 Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile 1220 1225 1230 Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 3 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov2 RBD 323-532 <400> 3 accgagtcta tcgtgcggtt ccccaacatc accaacctgt gtcctttcgg cgaggtgttc 60 aacgccacca gattcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc taactgcgtg 120 gccgactact ccgtgctgta caactccgcc tccttcagca ccttcaagtg ctacggcgtg 180 tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc cttcgtgatc 240 agaggcgacg aagtgcggca gatcgctcct ggacagaccg gcaagatcgc cgactacaac 300 tacaagctgc ccgacgactt caccggctgt gtgatcgctt ggaactccaa caacctggac 360 tccaaagtcg gcggcaacta caattacctg taccggctgt tccggaagtc caacctgaag 420 cctttcgagc gggacatctc caccgagatc taccaggctg gcagcacccc ttgtaatggc 480 gtggaaggct tcaactgcta cttcccactg cagtcctacg gcttccagcc tacaaacggc 540 gtgggctacc agccttacag agtggtggtg ctgtccttcg agctgctgca tgctcctgct 600 accgtgtgcg gccctaagaa atctaccaac 630 <210> 4 <211> 6010 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA3.4 vector <400> 4 gttaggcgtt ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta 60 ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 120 ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 180 ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 240 cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 300 atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 360 cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 420 attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 480 cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 540 caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 600 cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg 660 agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgg 720 actctagagg atcgaaccct taagggttcg atccctaccg gttagtaatg agtttgatat 780 ctcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 840 gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 900 tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 960 gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 1020 cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 1080 ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 1140 cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg 1200 ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 1260 gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 1320 cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctgga 1380 aacgggggag gctaactgaa acacggaagg agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga 1440 cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg ggtgttgggt cgtttgttca taaacgcggg 1500 gttcggtccc agggctggca ctctgtcgat accccaccga gaccccattg gggccaatac 1560 gcccgcgttt cttccttttc cccaccccac cccccaagtt cgggtgaagg cccagggctc 1620 gcagccaacg tcggggcggc aggccctgcc atagcagatc tgcgcagctg gggctctagg 1680 gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 1740 agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 1800 tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcggggcat ccctttaggg 1860 ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 1920 cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 1980 tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 2040 tttgatttat aagggatttt ggggatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 2100 caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc 2160 caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt 2220 gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt 2280 cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg 2340 cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct 2400 ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca 2460 aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggatctga tcaagagaca ggatgaggat 2520 cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 2580 ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 2640 ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga 2700 atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg 2760 cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc 2820 cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 2880 atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga 2940 aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc 3000 tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca 3060 tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 3120 tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct 3180 atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg 3240 accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc 3300 gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gcgaaatgac cgaccaagcg 3360 acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 3420 ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg 3480 gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 3540 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 3600 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg 3660 taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 3720 atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 3780 ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 3840 taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 3900 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 3960 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 4020 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 4080 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 4140 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 4200 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 4260 tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 4320 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 4380 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 4440 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 4500 tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 4560 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 4620 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 4680 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 4740 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 4800 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 4860 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 4920 acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 4980 tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 5040 ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 5100 agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 5160 tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 5220 acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 5280 agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 5340 actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 5400 tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 5460 gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 5520 ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 5580 tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 5640 aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 5700 tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 5760 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 5820 gacgtcgacg gatcgggaga tctcccgatc ccctatggtc gactctcagt acaatctgct 5880 ctgatgccgc atagttaagc cagtatctgc tccctgcttg tgtgttggag gtcgctgagt 5940 agtgcgcgag caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga 6000 atctgcttag 6010 <210> 5 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov2 RBD insertion <400> 5 gccaccatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60 actggtgacg gatccaccga gtctatcgtg cggttcccca acatcaccaa cctgtgtcct 120 ttcggcgagg tgttcaacgc caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg 180 atctctaact gcgtggccga ctactccgtg ctgtacaact ccgcctcctt cagcaccttc 240 aagtgctacg gcgtgtcccc taccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc 300 gactccttcg tgatcagagg cgacgaagtg cggcagatcg ctcctggaca gaccggcaag 360 atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat cgcttggaac 420 tccaacaacc tggactccaa agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg 480 aagtccaacc tgaagccttt cgagcgggac atctccaccg agatctacca ggctggcagc 540 accccttgta atggcgtgga aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttc 600 cagcctacaa acggcgtggg ctaccagcct tacagagtgg tggtgctgtc cttcgagctg 660 ctgcatgctc ctgctaccgt gtgcggccct aagaaatcta ccaacctcga gtga 714

Claims (12)

1. 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원; 및 만니드 올레이트 및 미네랄 오일을 포함하는 면역증강제를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열의 323 내지 532 번째 아미노산 서열인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원은 0.8 % 내지 2.0 %(w/w) NaCl 수용액에 용해된 것인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원은 1.7 % 내지 1.9 %(w/w) NaCl 수용액에 용해된 것인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
5. 제1항에 있어서, 면역증강제 총 조성에 대하여 만니드 올레이트를 6 내지 25 %(w/w) 및 미네랄 오일을 80 내지 96 %(w/w)로 포함하는 것인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 면역 증강제는 MONTANIDE™ ISA51인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
7. 제3항에 있어서, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원을 포함하는 0.8 % 내지 2.0 %(w/w) NaCl 수용액과 면역증강제를 부피비로 4:6 내지 6:4의 비율로 혼합한 것인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
8. 제7항에 있어서, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원을 포함하는 0.8 % 내지 2.0 %(w/w) NaCl 수용액 내 단백질 항원의 농도는 0.1~0.5 mg/ml인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
9. 제8항에 있어서, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원을 포함하는 1.7 % 내지 1.9 %(w/w) 수용액 내 단백질 항원의 농도는 0.1~0.5 mg/ml인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
10. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원 및 면역증강제는 체내 투여 전에 혼합되어 조성물을 형성하는 것인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 1 내지 6주 간격으로 2 또는 3회 투여하는 것인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물.
12. 서열번호 1의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 단백질 항원 및 면역증강제를 인간을 제외한 동물에 주입하는 단계; 및 (b) 상기 동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 제조 방법.

Images