CN115678856A - 一种肿瘤杀伤细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿瘤杀伤细胞及其应用，属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域。本发明的肿瘤杀伤细胞过表达葡萄糖转运体3，可以提高肿瘤葡萄糖摄取能力，改善肿瘤杀伤细胞在低糖环境中的活化、耗竭、凋亡和扩增能力，进而改善肿瘤杀伤细胞在实体瘤微环境中糖代谢严重抑制的现象，增强其对肿瘤细胞的杀伤力，具有较好的实用价值和推广应用意义。

Description

一种肿瘤杀伤细胞及其应用

技术领域

本发明涉及一种肿瘤杀伤细胞及其应用，属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域。

背景技术

恶性肿瘤在科技日益发达的当下，依然是人类健康的重要威胁，随着肿瘤免疫疗法的发展，细胞治疗成为治疗肿瘤的一种有效方式，是近年来的研究热点，以CAR-T细胞为例，国内也已批准两款治疗产品。在临床治疗中，以CD19等血液瘤靶点制备的CAR-T细胞，在急性淋巴细胞白血病等血液瘤的治疗中展现出较好的治疗效果，但是CAR-T细胞在实体瘤治疗中表现不尽如人意，其功能在实体瘤微环境中受到严重抑制，使得其在临床中的使用中受制。

发明内容

本发明的目的是提供一种在实体瘤低糖微环境中具有较强杀伤力的肿瘤杀伤细胞。

本发明还提供了一种含有上述肿瘤杀伤细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现以上目的，本发明的肿瘤杀伤细胞所采用的技术方案是：

一种肿瘤杀伤细胞，所述肿瘤杀伤细胞过表达葡萄糖转运体3。

本发明的肿瘤杀伤细胞过表达葡萄糖转运体3(Glut3)，可以逆转实体瘤微环境中肿瘤杀伤细胞葡萄糖代谢抑制的途径，提高肿瘤葡萄糖摄取能力，改善肿瘤杀伤细胞在低糖环境中的活化、耗竭、凋亡和扩增能力，进而改善肿瘤杀伤细胞在实体瘤微环境中糖代谢严重抑制的现象，增强其对肿瘤细胞的杀伤力，具有较好的实用价值和推广应用意义。

进一步地，所述肿瘤杀伤细胞的葡萄糖转运体3的过表达效率在30％以上，例如过表达效率为30～50％。本发明中葡萄糖转运体3的过表达效率是指用流式细胞术测定重组有编码葡萄糖转运体3的核苷酸序列的重组质粒的表达效率。通过控制葡萄糖转运体3的过表达效率在30％以上，可以保证肿瘤杀伤细胞具有较好的抗肿瘤效果。

所述葡萄糖转运体3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码葡萄糖转运体3的核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述肿瘤杀伤细胞为肿瘤浸润淋巴细胞、T细胞受体嵌合型T细胞、自然杀伤细胞、Gamma-Delta T细胞、NKT细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-Treg细胞中的一种。

进一步地，所述肿瘤杀伤细胞还表达嵌合受体多肽，所述嵌合受体多肽包含细胞外靶结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。

进一步地，所述嵌合受体多肽为嵌合抗原受体，所述细胞外靶结合结构域为细胞外抗原结合结构域。更进一步地，所述嵌合抗原受体多肽包括依次连接的信号肽、细胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、细胞质信号传导结构域。更进一步地，所述嵌合受体多肽为嵌合抗原受体，所述细胞外靶结合结构域为细胞外抗原结合结构域时，所述肿瘤杀伤细胞为嵌合抗原受体T细胞(即CAR-T细胞)。

进一步地，所述细胞外靶结合结构域为人源化CD276单链抗体。例如，所述细胞外抗原结合结构域为人源化CD276单链抗体时，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域，所述细胞质信号传导结构域为41BB分子胞内区和CD3ζ分子胞内区；进一步地，所述嵌合抗原受体多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述肿瘤杀伤细胞包含DNA片段或DNA片段组；所述DNA片段或DNA片段组共同包含编码葡萄糖转运子3的核苷酸片段和编码所述嵌合受体多肽的核苷酸片段。肿瘤杀伤细胞中上述DNA片段或DNA片段组包含编码葡萄糖转运体3的核苷酸片段可以实现肿瘤杀伤细胞对葡萄糖转运体3和嵌合抗原受体的共表达。

进一步地，所述肿瘤杀伤细胞包含所述DNA片段，所述DNA片段包含编码葡萄糖转运体3的核苷酸片段和编码所述嵌合受体多肽的核苷酸片段；所述DNA片段包含于载体内。例如所述编码葡萄糖转运体3的核苷酸片段和编码所述嵌合抗原受体多肽的核苷酸片段在所述DNA片段中通过编码自剪切多肽的核苷酸片段连接。

进一步地，所述载体为重组有所述DNA片段的慢病毒表达质粒。可以理解的是慢病毒表达质粒通过转染制备成肿瘤杀伤细胞，如CAR-T细胞。对于载体为重组有所述DNA片段以及标签蛋白核苷酸片段的慢病毒表达质粒时，在采用流式细胞术测定重组质粒的表达效率指示葡萄糖转运体3的表达效率时，通过标签蛋白抗体染色后可以指示嵌合抗原受体多肽和Glut3的表达情况。

本发明的肿瘤杀伤细胞在制备抗肿瘤药物中的应用所采用的技术方案为：

上述任意的肿瘤杀伤细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明在制备抗肿瘤药物时应用上述肿瘤杀伤细胞，对肿瘤细胞具有较强的杀伤力。上述肿瘤杀伤细胞在制备抗肿瘤药物中应用的方法，参照现有肿瘤杀伤细胞。

进一步地，所述抗肿瘤药物为抗实体瘤药物。更进一步地，所述实体瘤为食管癌相关肿瘤和/或非小细胞肺癌相关肿瘤。

附图说明

图1为实施例2中制备的CAR-T细胞中CD276-Glut3的CAR分子和对比例中制备的CAR-T细胞的CD276的CAR分子的结构示意图；

图2为实验例中CD276-Glut3 CAR-T细胞和CD276 CAR-T细胞中CAR分子的表达效率结果图；其中，图2a为CD276-Glut3 CAR-T细胞中CAR分子的表达效率结果图，图2b为CD276 CAR-T细胞中CAR分子的表达效率结果图；

图3为实验例中不同糖浓度下CD276 CAR-T细胞对不同靶细胞的体外杀伤能力结果图；其中，图3a为不同糖浓度下CD276 CAR-T细胞在效靶比为1:1时对肺癌细胞系H322的体外杀伤能力图；图3b为不同糖浓度下CD276 CAR-T细胞在效靶比为1:5时对肺癌细胞系H322的体外杀伤能力图；图3c为不同糖浓度下CD276 CAR-T细胞在效靶比为1:1时对食管癌细胞系KYSE150的体外杀伤能力图；图3d为不同糖浓度下CD276 CAR-T细胞在效靶比为1:5时对食管癌细胞系KYSE150的体外杀伤能力图；

图4为实验例中2mM糖浓度下CD276-Glut3 CAR-T细胞和CD276 CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤能力比较图；其中，图4a为效靶比为1:5时两种肿瘤杀伤细胞对食管癌系KYSE150的杀伤能力比较图；图4b为效靶比为1:1时两种肿瘤杀伤细胞对食管癌系KYSE150的杀伤能力比较图；图4c为效靶比为1:5时两种肿瘤杀伤细胞对肺癌细胞系H322的杀伤能力比较图；图4d为效靶比为1:1时两种肿瘤杀伤细胞对肺癌细胞系H322的杀伤能力比较图；

图5为实验例中CD276 CAR-T细胞、CD276-Glut3 CAR-T细胞和CD276-Glut1 CAR-T细胞的肺癌细胞杀伤力比较图；

图6为实验例中2mM糖浓度下CD276-Glut3 CAR-T细胞和CD276 CAR-T细胞的功能、耗竭和抗凋亡能力比较图；其中，图6a为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，T细胞活化标志物CD69的表达情况比较图；图6b为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，T细胞耗竭标志物PD-1的表达情况比较图；图6c为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，T细胞耗竭标志物TIM3的表达情况比较图；图6d为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，细胞凋亡标志物Annexin V的表达情况比较图；

图7为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，培养上清中各类细胞因子的分泌情况比较图；其中，图7a为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，培养上清中IL-2的分泌情况比较图；图7b为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，培养上清中INF-γ的分泌情况比较图；图7c为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，培养上清中GranzymeB的分泌情况比较图，图7d为CAR-T细胞与肺癌细胞系H322共孵育48小时后，培养上清中Perforin的分泌情况比较图；

图8为CAR-T细胞培养过程中的增殖情况和低糖条件下活化后葡萄糖吸收能力检测比较图；图8a为CAR-T细胞转染后48h，细胞增殖标志物KI67的表达情况比较图，图8b为低糖环境中，CAR-T细胞活化后吸收葡萄糖衍生物2NBDG的能力比较图；

图9为小鼠荷瘤并接受CAR-T细胞过继回输治疗40天后肺部肿瘤结节拍照比较图；

图10为小鼠荷瘤并接受CAR-T细胞过继回输治疗40天后肺部肿瘤结节数量比较图。

具体实施方式

本发明中的细胞外抗原结合结构域也可以被称为“单链抗体”(scFv)，是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型。

本发明中编码蛋白的核苷酸片段在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单克隆抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。

本发明中的嵌合抗原受体多肽(CAR)是人工改造受体多肽，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽。

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例和实验例中采用的主要试剂和生物材料来源如下：

主要试剂：

DMEM培养基、1640培养基、PBS缓冲液，为美国sigma公司产品；

胎牛血清为美国Gbico公司产品；

100×青链霉素混合液、0.25％胰蛋白酶消化液，为北京索莱宝公司产品；

Human CD3 microbeads、T cell Transact、MACS buffer均为德国美天旎公司产品；

人外周血淋巴细胞分离液为天津灏洋华科生物技术有限公司产品；

磷酸钙转染试剂盒，为日本Takara公司产品；

Polybrene(10mg/ml)，为北京索莱宝公司产品；

D-荧光素钾盐，为翌圣生物科技公司产品；

PEcy7 anti-human CD3、FITC anti-human CD4、APCcy7 anti-human CD8、PerCPanti-human CD69、APC antihuman CD107a、PEcy7 anti-human PD-1、BV605 anti-humanTim3、APC anti-human Annexin-V、APC anti-human Ki-76，PE anti-myc，均为美国Biolegend公司产品；

IL-2、IFN-γ、Granzyme-B、perforin细胞因子检测试剂盒，均为达科为公司产品。

生物材料：

健康人外周血，来源于河南省红十字会血液中心。

6-8周龄的NTG雌性小鼠，购自北京斯贝福公司；

人非小细胞肺癌相关细胞系：H322，人食管癌相关细胞系：KYSE-150，病毒生产细胞系：293T，购自ATCC；H322细胞培养在高糖DMEM培养基中，KYSE-150培养在1640培养基中，均含有10％胎牛血清，100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素；

感受态大肠杆菌stbl3，购自北京擎科生物有限公司。

实施例1

本实施例的肿瘤杀伤细胞为CAR-T细胞，可表达嵌合抗原受体多肽并过表达葡萄糖转运体3。本实施例的肿瘤杀伤细胞表达的嵌合抗原受体多肽包括信号肽、人源化的CD276单链抗体、铰链区、CD8α跨膜结构域、细胞质信号传导结构域41BB和CD3ζ，编码该嵌合抗原受体多肽的核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本实施例的CAR-T细胞采用实施例2的方法制得。

实施例2

本实施例的肿瘤杀伤细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)共表达Glut 3的CAR分子慢病毒表达质粒的制备：

a)按照中心法则，采用PCR技术获得所述Glut3的编码DNA片段(核苷酸序列如SEQID NO.1所示)；

b)以CAR分子载体为例，在pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A质粒的基础上，对其进行SaII酶切，然后用同源重组酶将步骤a)中所得的编码DNA片段重组进入pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A质粒中，pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

c)将步骤b)中的重组产物转化进DH5α感受态细胞中，通过含氨苄抗生素的平板进行菌落筛选，挑取单克隆扩大培养后通过质粒提取试剂盒提取质粒，保存测序结果正确的pCDH-EF1A-MYC-CD276、pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A-Glut3的重组慢病毒表达质粒。

2)慢病毒制备

293T细胞铺板：取T75培养瓶90％融合度293T细胞一瓶，收集培养基，盐水洗两遍，加入0.8ml 0.05％胰酶，37℃，消化3min，加入培养基终止消化，吸取10μl计数板计数，然后在6孔板每孔铺4×10⁶个293T细胞，共6孔；

14小时后更换转染培养基2.5ml，2小时后用钙转试剂盒将主质粒(pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A-Glut3)和包装质粒psPAX2、pMD2.G加入孔板中，轻轻晃动，放入培养箱中，6小时后换3ml完全培养基；48小时后收取病毒上清。

3)制备纯化的T细胞

将健康人外周血、盐水、淋巴细胞分离液按1:1:1比例混合，2500rpm，升速5，降速5，离心25分钟，然后吸取白膜层，并计数，然后在1500rpm转速下离心5min后弃去上清，按计数结果加入适量的buffer和CD3磁珠，在4℃孵育20分钟，向磁场中固定好的磁分选柱子中加入buffer清洗润湿，加入孵育好的细胞悬液，期间不断加入buffer，至T细胞悬液全部冲出，得到CD3+T细胞，然后进行计数，每1×10^⁷CD3⁺T细胞加入CD3/CD28活化beads 100ul进行活化刺激。

4)T细胞感染

T细胞活化2天后，向步骤2)所收集的病毒上清中加入polybrene(聚凝胺，又名为溴化己二甲铵)，终浓度为25μM，每1×10⁶个肿瘤杀伤细胞加入2ml病毒上清，在3000rpm、32℃，离心1.5h，结束后更换新鲜培养基。

5)培养和扩增CAR-T细胞

感染后CAR-T细胞加入1640培养基(含5％热灭活FBS和200IU/ml IL-2)，放入培养箱中，每24h更换新鲜的1640培养基，即得CAR-T细胞，记为CD276-Glut3 CAR-T细胞，该细胞中CD276-Glut3共表达嵌合抗原受体多肽和葡萄糖转运体3的DNA片段的结构如图1A所示。

对比例

本对比例的CAR-T细胞的制备方法与实施例1的CAR-T细胞的制备方法的区别仅在于：省去实施例1的步骤1)，并将实施例1的步骤2)中主质粒替换为pCDH-EF1A-MYC-CD276质粒，未述及内容完全同实施例1。将本对比例制备的CAR-T细胞记为CD276 CAR-T细胞，该细胞中CD276的CAR分子的结构见图1中B结构。

实验例

1)检测CAR分子的表达效率

分别将实施例2和对比例中制备的CAR-T细胞，培养3天后，利用PE anti-myc标记CAR-T细胞，通过流式细胞术对CAR-T细胞表面基因编辑的表达情况进行检测。结果如图2所示：CAR分子的表达效率为30％～50％，实施例2和对比例中CAR-T细胞有效制备，可以用于后续实验验证。

2)检测不同糖浓度下CAR-T细胞杀伤能力的差异

选择肺癌细胞系H322和食管癌细胞系KYSE150为靶细胞，将对比例制备的CD276CAR-T细胞和肿瘤细胞效靶比设为1:1和1:5，将H322细胞和KYSE150细胞计数后铺入96孔板中，每孔5×10³个细胞，糖浓度分为2μM，5μM，10μM，设置三个复孔，贴壁12小时，按效靶比1:1和1：5，分别加入对比例制备的CD276 CAR-T细胞，分别在0h和24h，每孔加入1μl浓度为100μM D-荧光素钾盐，并以未加入CAR-T细胞的H322细胞和KYSE150细胞作为对照，利用小动物活体成像仪拍照和酶标仪检测560nm激发光，统计OD值，24h，H322细胞效靶比1：5组中，糖浓度为10mM CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：592、467.75、477.25，糖浓度为5mM CD276 CAR-T细胞组,剩余肿瘤细胞OD值为：702.75、592.25、503，糖浓度为2mMCD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：989.5、724.75、721.5，效靶比1：1组中，糖浓度为10mM CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：166.5、172.5、224.5，糖浓度为5mMCD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：301.75、243.25、276，糖浓度为2mM CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：403.25、445.75、380，24h，KYSE150细胞效靶比1：5组中，糖浓度为10mM CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：387、429.75、371.75，糖浓度为5mMCD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：430.25、438.75、413，糖浓度为2mM CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：478.25、465、499.5，效靶比1：1组中，糖浓度为10mM CD276CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：172.25、183.25、252.75，糖浓度为5mM CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：266.25、275、369，糖浓度为2mM CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：348.75、368.5、542.25结果如图3所示，分析后发现低糖浓度下CD276肿瘤杀伤细胞的杀伤能力受到抑制。

3)2mM浓度下检测改造前后CAR-T细胞的杀伤能力

选择肺癌细胞系H322和食管癌细胞系KYSE150为靶细胞，效应细胞为对比例制备的CD276 CAR-T细胞、实施例2制备的CD276-Glut3 CAR-T细胞，并以未加入CAR-T细胞的H322细胞和KYSE150细胞作为对照，将H322细胞和KYSE150细胞计数后铺入96孔板中，每孔5×10³个细胞，培养基糖浓度为2mM，设置三个复孔，贴壁12小时，按效靶比1:1和1：5，分别加入对比例制备的CD276 CAR-T细胞和实施例2制备的CD276-Glut3 CAR-T细胞，分别在0h、24h和48h，每孔加入1μl浓度为100μM D-荧光素钾盐，利用小动物活体成像仪拍照和酶标仪检测560nm激发光，统计OD值，KYSE-150细胞组，效靶比1：5组中，24h，CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：685.25、605.25、494.75，CD276-Glut3 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：116.25、119、114.25，48h，CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：423.75、414.5、413，CD276-Glut3 CAR-T细胞组为，剩余肿瘤细胞OD值：31.75、30.5、35，效靶比1：1组中，CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：195.75、196、236，CD276-Glut3 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：42.75、52.75、62，48h，CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：74.25、71.5、88，CD276-Glut3 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：22、25.25、19，H322细胞组，效靶比1：5组中，24h，CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：847.75、1017.5、861.75，CD276-Glut3 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：98.5、86、96.75，48h，CD276CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：535.25、597.5、566.75，CD276-Glut3 CAR-T细胞组为，剩余肿瘤细胞OD值为：57.5、55、60.75，效靶比1：1组，24h，CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：223.75、210.25、307.5，CD276-Glut3 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：60.25、44、100.5，48h，CD276 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：181.5、146.75、125.5，CD276-Glut3 CAR-T细胞组，剩余肿瘤细胞OD值为：26.5、22、22.25，结果如图4所示，分析后发现CD276-Glut3 CAR-T细胞(图中简记为glut3)在低糖浓度下对肿瘤的杀伤能力明显好于CD276 CAR-T细胞(图中简记为CD276)肿瘤杀伤细胞。

同时，我们对比了CAR-T细胞共表达Glut1和Glut3后的杀伤能力，选择肺癌细胞系H322为靶细胞，效应细胞为对比例制备的CD276 CAR-T细胞、实施例2制备的CD276-Glut3CAR-T细胞和CD276-Glut1 CAR-T细胞，并以加入CD276 CAR-T细胞的H322细胞作为对照，将H322细胞细胞计数后铺入96孔板中，每孔5×10³个细胞，培养基糖浓度为2mM，设置两个复孔，贴壁12小时，按效靶比1:1，分别加入对比例制备的CD276 CAR-T细胞、实施例2制备的CD276-Glut3 CAR-T细胞和CD276-Glut1 CAR-T细胞，分别在0h和24h，每孔加入1μl浓度为100μM D-荧光素钾盐，利用小动物活体成像仪拍照检测，并统计每孔的总光粒子值，0h，CD276 CAR-T细胞组，总光粒子值为：1.32e+009，1.54e+009，CD276-Glut1 CAR-T细胞组，总光粒子值为：1.29e+009，1.66e+009，CD276-Glut3 CAR-T细胞组，总光粒子值为：1.33e+009，1.5e+009，24h，CD276 CAR-T细胞组，总光粒子值为：1.35e+009，1.37e+009，CD276-Glut1 CAR-T细胞组，总光粒子值为：1.56e+009，1.56e+009，CD276-Glut3 CAR-T细胞组，总光粒子值为：6.13e+008，7.54e+008，结果如图5所示，分析后发现，CAR-T细胞过表达Glut1无法增强其在低糖条件下的杀伤能力。

测试采用的CD276-Glut1 CAR-T细胞在制备时，与实施例2的区别仅在于：步骤2)中，将主质粒pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A-Glut3替换为质粒pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A-Glut1；质粒pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A-Glut1是对pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A质粒进行SaII酶切，采用同源重组酶将编码Glut3的DNA片段重组进入pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A质粒中，再将重组产物转化进DH5α感受态细胞中，通过含氨苄抗生素的平板进行菌落筛选，挑取单克隆扩大培养后通过质粒提取试剂盒提取质粒，保存测序结果正确的pCDH-EF1A-MYC-CD276-P2A-Glut1的重组慢病毒表达质粒得到。对制备的CD276-Glut1 CAR-T细胞培养3天后，利用PE anti-myc标记CAR-T细胞，通过流式细胞术对CAR-T细胞表面基因编辑的表达情况进行检测。

GLUT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4)检测2mM浓度下改造前后CAR-T细胞的活化、耗竭和凋亡

选择肺癌细胞系H322为靶细胞，计数后铺入12孔板中，每孔1×10⁵个细胞，设置三个复孔，贴壁12h，按效靶比1：5，分别加入对比例制备的CD276 CAR-T细胞和实施例2制备的CD276-Glut3 CAR-T细胞，并以CD276 CAR-T细胞作为对照，培养基糖浓度为2mM，共孵育48h后用1.5mlEP管收取上清中CAR-T细胞，500g离心5min后弃上清，加入500μl PBS，涡旋后，500g离心5min，弃去上清，活化组每管加入50μl PBS，1μl PEcy7 anti-human CD3、PerCPanti-human CD69，调亡组每管加入50μl PBS，1μlPEcy7 anti-human CD3、1μl APC anti-human Annexin-V，耗竭组每管加入50μl PBS，1μl PEcy7 anti-human CD3、PEcy7 anti-human PD-1、BV605 anti-human Tim3、混匀后，加入对应细胞中，涡旋后4℃避光孵育30min，加入500μl PBS，涡旋后，500g离心5min，加入200μl PBS，流式上机检测相关指标，统计CD276 CAR-T细胞和CD276-Glut3 CAR-T细胞的T细胞活化标志物CD69的平均荧光强度，CD276 CAR-T细胞组为：1263、1297、1294，CD276-Glut3 CAR-T细胞组为15162、15183、15641，T细胞耗竭标志物PD-1的阳性群比例，CD276 CAR-T细胞组为：30.4、30.2、31.9，CD276-Glut3 CAR-T细胞组为17.0、16.9、16.3，T细胞耗竭标志物TIM3的阳性群比例，CD276CAR-T细胞组为：18.0、18.1、17.9，CD276-Glut3 CAR-T细胞组为9.95、9.75、10.30，细胞凋亡标志物Annexin V的阳性群比例，CD276 CAR-T细胞组为：19.0、20.8、21.1，CD276-Glut3CAR-T细胞组为4.07、4.01、4.15，结果如图6所示，分析后发现在低糖环境中与肿瘤细胞共孵育48h后，CD276-Glut3 CAR-T细胞相比于CD276 CAR-T细胞，活化效果更好，耗竭和凋亡比例更少。

5)检测改造前后CAR-T细胞的细胞因子分泌

选择肺癌细胞系H322为靶细胞，细胞计数后铺入12孔板中，每孔5×10³个细胞，设置三个复孔，贴壁12h，按效靶比1：1，分别加入对比例制备的CD276 CAR-T细胞和实施例2制备的CD276-Glut3 CAR-T细胞，培养基糖浓度为2mM，24h后用1.5ml EP管收取共孵育上清，500g离心5min，吸取上清，取出细胞因子检测试剂盒预包被后的96孔板(IL-2、IFN-γ、Granzyme B、Perforin)，每孔加入100μl共孵育上清，空白孔加入Dilution buffer R(1×)，然后加入50μl稀释后的Biotinylated antiboday，混匀后盖上盖板，37℃孵育90min，弃去孔内液体，每孔加入300μl washing buffer，轻微震荡后弃去，重复三次，在滤纸上扣干，每孔加入100μl稀释后的Streptavidin-HRP，改上盖板，37℃孵育30分钟，重复上述洗板步骤，每孔加入100μl TMB，在37℃避光孵育5-20min，当孔中颜色合适时，每孔加入100μlStop solution，终止反应，酶标仪450nm检测波长，统计OD值并计算上清中相应细胞因子的浓度，CD276 CAR-T细胞组培养上清中IL-2浓度为41.77444、41.47099、42.24602，IFN-γ浓度为203.3991、202.987、220.8308，Granzyme B浓度为69.25108、102.5262、94.79059，Perforin浓度为705.0015、659.1558、781.4672，CD276-Glut3细胞组培养上清中IL-2浓度为759.8502、811.69、815.4608，IFN-γ浓度为434.4553、389.5122、570.7364，Granzyme B浓度为246.0127、271.3456、248.6299，Perforin浓度为1357.611、1333.326、1377.243，如图7所示，对比分析后发现，过表达Glut3后CAR-T细胞细胞因子的分泌明显增加。

6)检测改造前后CAR-T细胞的增殖活性和糖摄取能力

将实施例2和对比例中转染后两天的CD276、CD276-Glut3肿瘤杀伤细胞，铺入48孔板中，每孔1×10⁵个细胞，加入低糖培养基，每组设置三个复孔，48h后，用1.5ml EP管吸出，500g离心5min，加入500μl PBS，涡旋后，500g离心5min，每管加入50μl PBS，1μl APC anti-human Ki-76，4℃避光孵育30min，加入500μl PBS，涡旋后，500g离心5min，加入200μl PBS，流式上机检测细胞增殖标志物Ki-67的平均荧光强度，CD276 CAR-T细胞组为：4729、4712、4264，CD276-Glut3组为：10126、10483、10145，结果见图8a，由图8a可知过表达Glut3后CAR-T细胞在低糖培养条件下增殖活性增强。

将CD276、CD276-Glut3肿瘤杀伤细胞铺入48孔板中，每组设置三个复孔，加入低糖培养基，48小时后，每孔加入葡萄糖衍生物2NBDG，终浓度为100nM，6h后流式上机检测CAR-T细胞对于葡萄糖的吸收能力，以细胞内葡萄糖衍生物2NBDG的平均荧光强度来反映，CD276CAR-T细胞组为：13711、13700、13828，CD276-Glut3 CAR-T细胞组为：66610、67036、66769，结果见图8b，由图8b可知CAR-T细胞过表达Glut3后，对葡萄糖的吸收能力增强。

7)检测改造前后CAR-T细胞的体内杀伤能力

在15只NTG雌性小鼠尾静脉注射1×10⁵个H322细胞，分为PBS组、CD276组和CD276-Glut3组，每组5只，荷瘤7天后回输PBS或对应CAR-T细胞1×10⁵个，在回输后第40天剥离小鼠完整的肺，并对其上肿瘤结节进行计数，CD276 CAR-T细胞组为：87、83、68、54、73，CD276-Glut3 CAR-T细胞组为:10、8、3、4、7，结果如图9和图10所示，统计分析后发现，过表达Glut3的改造方式可以使CAR-T细胞体内的杀伤能力增强。

综上实验结果可以看出，CD276 CAR-T细胞在低糖环境下对于肿瘤的杀伤能力受到抑制，是实体瘤的治疗中细胞治疗应用受限的关键因素，过表达Glut3后，CAR-T细胞体外低糖环境下的杀伤能力、细胞功能、抗凋亡能力、增殖能力、细胞因子的分泌、代谢强度均得到改善，同时体内的杀伤能力增强。

<110> 郑州大学

<120> 一种肿瘤杀伤细胞及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 496

<212> PRT

<400> 1

Met Gly Thr Gln Lys Val Thr Pro Ala Leu Ile Phe Ala Ile Thr Val

1 5 10 15

Ala Thr Ile Gly Ser Phe Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val Ile Asn

20 25 30

Ala Pro Glu Lys Ile Ile Lys Glu Phe Ile Asn Lys Thr Leu Thr Asp

35 40 45

Lys Gly Asn Ala Pro Pro Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Leu Trp Ser

50 55 60

Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser Phe Ser

65 70 75 80

Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met Leu Ile

85 90 95

Val Asn Leu Leu Ala Val Thr Gly Gly Cys Phe Met Gly Leu Cys Lys

100 105 110

Val Ala Lys Ser Val Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Leu Val Ile Gly

115 120 125

Leu Phe Cys Gly Leu Cys Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Ile Gly Glu

130 135 140

Ile Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Phe Gly Thr Leu Asn Gln Leu

145 150 155 160

Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Val Ala Gln Ile Phe Gly Leu Glu Phe

165 170 175

Ile Leu Gly Ser Glu Glu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Gly Phe Thr Ile

180 185 190

Leu Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ala Ala Leu Pro Phe Cys Pro Glu Ser

195 200 205

Pro Arg Phe Leu Leu Ile Asn Arg Lys Glu Glu Glu Asn Ala Lys Gln

210 215 220

Ile Leu Gln Arg Leu Trp Gly Thr Gln Asp Val Ser Gln Asp Ile Gln

225 230 235 240

Glu Met Lys Asp Glu Ser Ala Arg Met Ser Gln Glu Lys Gln Val Thr

245 250 255

Val Leu Glu Leu Phe Arg Val Ser Ser Tyr Arg Gln Pro Ile Ile Ile

260 265 270

Ser Ile Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn Ala Val

275 280 285

Phe Tyr Tyr Ser Thr Gly Ile Phe Lys Asp Ala Gly Val Gln Glu Pro

290 295 300

Ile Tyr Ala Thr Ile Gly Ala Gly Val Val Asn Thr Ile Phe Thr Val

305 310 315 320

Val Ser Leu Phe Leu Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu His Met

325 330 335

Ile Gly Leu Gly Gly Met Ala Phe Cys Ser Thr Leu Met Thr Val Ser

340 345 350

Leu Leu Leu Lys Asp Asn Tyr Asn Gly Met Ser Phe Val Cys Ile Gly

355 360 365

Ala Ile Leu Val Phe Val Ala Phe Phe Glu Ile Gly Pro Gly Pro Ile

370 375 380

Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg Pro Ala

385 390 395 400

Ala Met Ala Val Ala Gly Cys Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe Leu Val

405 410 415

Gly Leu Leu Phe Pro Ser Ala Ala His Tyr Leu Gly Ala Tyr Val Phe

420 425 430

Ile Ile Phe Thr Gly Phe Leu Ile Thr Phe Leu Ala Phe Thr Phe Phe

435 440 445

Lys Val Pro Glu Thr Arg Gly Arg Thr Phe Glu Asp Ile Thr Arg Ala

450 455 460

Phe Glu Gly Gln Ala His Gly Ala Asp Arg Ser Gly Lys Asp Gly Val

465 470 475 480

Met Glu Met Asn Ser Ile Glu Pro Ala Lys Glu Thr Thr Thr Asn Val

485 490 495

<210> 2

<211> 1488

<212> DNA

<400> 2

atggggacac agaaggtcac cccagctctg atatttgcca tcacagttgc tacaatcggc 60

tctttccaat ttggctacaa cactggggtc atcaatgctc ctgagaagat cataaaggaa 120

tttatcaata aaactttgac ggacaaggga aatgccccac cctctgaggt gctgctcacg 180

tctctctggt ccttgtctgt ggccatattt tccgtcgggg gtatgatcgg ctccttttcc 240

gtcggactct tcgtcaaccg ctttggcagg cgcaattcaa tgctgattgt caacctgttg 300

gctgtcactg gtggctgctt tatgggactg tgtaaagtag ctaagtcggt tgaaatgctg 360

atcctgggtc gcttggttat tggcctcttc tgcggactct gcacaggttt tgtgcccatg 420

tacattggag agatctcgcc tactgccctg cggggtgcct ttggcactct caaccagctg 480

ggcatcgttg ttggaattct ggtggcccag atctttggtc tggaattcat ccttgggtct 540

gaagagctat ggccgctgct actgggtttt accatccttc ctgctatcct acaaagtgca 600

gcccttccat tttgccctga aagtcccaga tttttgctca ttaacagaaa agaagaggag 660

aatgctaagc agatcctcca gcggttgtgg ggcacccagg atgtatccca agacatccag 720

gagatgaaag atgagagtgc aaggatgtca caagaaaagc aagtcaccgt gctagagctc 780

tttagagtgt ccagctaccg acagcccatc atcatttcca ttgtgctcca gctctctcag 840

cagctctctg ggatcaatgc tgtgttctat tactcaacag gaatcttcaa ggatgcaggt 900

gttcaagagc ccatctatgc caccatcggc gcgggtgtgg ttaatactat cttcactgta 960

gtttctctat ttctggtgga aagggcagga agaaggactc tgcatatgat aggccttgga 1020

gggatggctt tttgttccac gctcatgact gtttctttgt tattaaagga taactataat 1080

gggatgagct ttgtctgtat tggggctatc ttggtctttg tagccttctt tgaaattgga 1140

ccaggcccca ttccctggtt tattgtggcc gaactcttca gccagggccc ccgcccagct 1200

gcgatggcag tggccggctg ctccaactgg acctccaact tcctagtcgg attgctcttc 1260

ccctccgctg ctcactattt aggagcctac gtttttatta tcttcaccgg cttcctcatt 1320

accttcttgg cttttacctt cttcaaagtc cctgagaccc gtggcaggac ttttgaggat 1380

atcacacggg cctttgaagg gcaggcacac ggtgcagata gatctggaaa ggacggcgtc 1440

atggagatga acagcatcga gcctgctaag gagaccacca ccaatgtc 1488

<210> 3

<211> 7923

<212> DNA

<400> 3

tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag 60

gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa 120

ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa 180

gtaagaccac cgcacagcaa gcggccactg atcttcagac ctggaggagg agatatgagg 240

gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 300

gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga 360

gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc ctcaatgacg 420

ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg 480

agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat caagcagctc 540

caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg 600

ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat 660

aaatctctgg aacagattgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 720

attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 780

aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 840

attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 900

tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 960

ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1020

gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1080

taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1140

taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt 1200

ttatcgatac tagtaaggat ctgcgatcgc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca 1260

tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga 1320

aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag 1380

ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg 1440

tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc 1500

cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt 1560

ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc 1620

ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct agactcagcc ggctctccac gctttgcctg 1680

accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc 1740

aagctgtgac cggcgcctac tctagagcta gcgaattcat ggccctgcct gtgaccgccc 1800

tgctgctgcc cctggcgctg ctgctgcacg ccgcgcgccc cgagcagaag ctgatctccg 1860

aggaggacct gggctctcag gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaggtg gtgaagcctg 1920

gcgccagcgt gaagctgagc tgcaagacca gcggctacac cttcaccaat tacgacatca 1980

attgggtgag acagaggcct ggccagggcc tggagtggat tggctggatt tttcccggcg 2040

acggcagcac ccagtacaac gagaagttta agggcaaggc caccctgacc accgacacct 2100

ctaccagcac agcctacatg gaactgagca gcctgaggag cgaggacacc gccgtgtact 2160

tctgcgctag gcagaccacc gccacctggt tcgcctactg gggccagggc accctggtga 2220

ccgtgagcag cggcggcggc ggaagcggcg gcggcggctc cggcggcggg ggctccgaga 2280

tcgtgatgac ccagagccct gccaccctga gcgtgtcccc cggcgagcgg gtgaccctga 2340

gctgccgggc cagccagtcc attagcgact acctgtactg gtaccagcag aagagccacg 2400

agtcccctag gctgctgatc aagtacgcca gccagtccat cagcggaatc cccgcccgct 2460

tttccggcag cggcagcggc agcgagttca ccctgaccat caactccgtg gagcctgagg 2520

atgtgggagt gtactactgc cagaatggcc acagcttccc cctgaccttt ggacagggaa 2580

ctaaactgga actgaaaagg acaactacac ctgcccctag acctcctaca cctgccccta 2640

caattgcctc tcagcctctg agcctgagac ctgaggcctg taggccagca gccggcggcg 2700

ctgtgcatac cagaggcctg gactttgcct gtgatatcta tatttgggct ccactggccg 2760

gcacttgcgg cgtgctgctg ctgagcctgg ttattacact gtattgtaaa agaggcagaa 2820

agaaactgct ctatattttt aagcagcctt tcatgaggcc agtgcagaca acacaggaag 2880

aagatggctg tagctgcaga tttcctgaag aagaagaggg aggatgtgag ctgagagtga 2940

aattctctag gtctgctgat gctccagcat atcagcaggg ccagaatcag ctgtataatg 3000

aactgaatct gggcagaaga gaagagtatg atgtgctgga taagaggaga ggcagagatc 3060

ctgaaatggg aggaaaacca cagagaagga aaaatcccca ggaaggactg tataatgaat 3120

tacagaaaga taagatggct gaggcataca gtgaaattgg aatgaaagga gagaggagaa 3180

gaggaaaggg ccacgatggc ctgtatcagg gcctgtctac agccactaaa gatacatatg 3240

atgccctgca tatgcaggcc ctgcctccta gatcgacaat caacctctgg attacaaaat 3300

ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc 3360

tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt 3420

gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg 3480

cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg 3540

tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc 3600

cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt 3660

gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct 3720

gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg 3780

cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg 3840

gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag 3900

ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc 3960

aacgaaaata agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag 4020

cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt 4080

gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca 4140

gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc 4200

agtatttata acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag 4260

cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 4320

cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct 4380

agctatcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc 4440

tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc 4500

tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctagactttt gcagagacgg 4560

cccaaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 4620

tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 4680

ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 4740

ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 4800

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 4860

agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 4920

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 4980

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 5040

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 5100

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 5160

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 5220

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 5280

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 5340

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 5400

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 5460

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 5520

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 5580

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 5640

catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 5700

atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 5760

ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 5820

gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 5880

agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 5940

gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 6000

agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 6060

catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 6120

aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 6180

gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 6240

taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 6300

caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 6360

ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 6420

ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 6480

tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 6540

aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 6600

actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 6660

catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 6720

agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 6780

tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 6840

gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 6900

tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 6960

gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 7020

aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 7080

ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 7140

aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa 7200

gctgacgcgt gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt 7260

agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt 7320

ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca 7380

ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacggg 7440

tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg 7500

cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt 7560

gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt 7620

ggcgcccgaa cagggacctg aaagcgaaag ggaaaccaga gctctctcga cgcaggactc 7680

ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 7740

ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 7800

ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 7860

aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 7920

tgt 7923

<210> 4

<211> 3003

<212> DNA

<400> 4

atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctcca cgccgcccgg 60

ccccaggtcc agctggtgca gagcggcgcc gaggtggtca agccaggggc cagcgtgaag 120

ctctcctgca agacaagcgg ctacacattc accaactacg acattaactg ggtgcggcag 180

cggccagggc agggcctgga gtggatcggg tggattttcc ccggcgacgg ctccacccag 240

tacaacgaga agtttaaggg caaggccacc ctgacaaccg atacaagcac atccacagcc 300

tacatggagc tcagcagcct gaggagcgag gataccgccg tgtacttttg cgcccggcag 360

acaaccgcca cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tggtgacagt gagcagcggc 420

ggcgggggca gcgggggcgg cgggagcggg ggcgggggga gcgagatcgt gatgactcag 480

tcccccgcca ccctcagcgt gagccccggc gagcgggtga ccctgtcctg ccgcgcctcc 540

cagtccatca gcgactacct gtactggtac cagcagaaga gccacgagtc ccccaggctg 600

ctcattaagt acgcctccca gagcatttcc ggcattcctg ccaggttcag cggcagcggg 660

agcgggagcg agttcacact gaccattaac agcgtggagc ccgaggatgt gggggtgtac 720

tactgccaga acggccacag ctttcctctg accttcgggc agggcactaa gctggagttg 780

aagcggacaa ccacacctgc ccccaggccc ccaacacccg cccctactat cgcctcccag 840

cccctctccc tgcggcccga ggcctgccgg cccgccgccg ggggggccgt gcacacacgg 900

ggcctggatt tcgcctgcga tatctacatc tgggcccctc tggccgggac ttgcggcgtg 960

ctcctgctga gcctcgtgat cacactgtac tgtaagcggg gccggaagaa gctgctgtac 1020

atcttcaagc agcccttcat gaggcccgtg cagactacac aggaggagga cggctgctcc 1080

tgcaggttcc cagaggagga ggaggggggg tgcgagctga gggtcaagtt tagccggagc 1140

gctgacgccc ccgcctacca gcaggggcag aaccagctgt acaacgagct gaacctcggc 1200

aggcgggagg agtacgacgt gctggacaag cggcggggga gggaccctga gatggggggc 1260

aagccccaga gaaggaagaa cccccaggag ggcctgtaca acgagctgca gaaggataag 1320

atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgaga ggcggagggg caaggggcac 1380

gatgggctgt accagggcct gagcaccgcc acaaaggaca cctacgacgc cctgcacatg 1440

caggccctgc ccccacgggg cagcggggcc acaaacttta gcctcctgaa gcaggccggc 1500

gatgtcgagg agaaccccgg ccctatggag cccagcagca agaagctgac gggtcgcctc 1560

atgctggccg tgggaggagc agtgcttggc tccctgcagt ttggctacaa cactggagtc 1620

atcaatgccc cccagaaggt gatcgaggag ttctacaacc agacatgggt ccaccgctat 1680

ggggagagca tcctgcccac cacgctcacc acgctctggt ccctctcagt ggccatcttt 1740

tctgttgggg gcatgattgg ctccttctct gtgggccttt tcgttaaccg ctttggccgg 1800

cggaattcaa tgctgatgat gaacctgctg gccttcgtgt ccgccgtgct catgggcttc 1860

tcgaaactgg gcaagtcctt tgagatgctg atcctgggcc gcttcatcat cggtgtgtac 1920

tgcggcctga ccacaggctt cgtgcccatg tatgtgggtg aagtgtcacc cacagccctt 1980

cgtggggccc tgggcaccct gcaccagctg ggcatcgtcg tcggcatcct catcgcccag 2040

gtgttcggcc tggactccat catgggcaac aaggacctgt ggcccctgct gctgagcatc 2100

atcttcatcc cggccctgct gcagtgcatc gtgctgccct tctgccccga gagtccccgc 2160

ttcctgctca tcaaccgcaa cgaggagaac cgggccaaga gtgtgctaaa gaagctgcgc 2220

gggacagctg acgtgaccca tgacctgcag gagatgaagg aagagagtcg gcagatgatg 2280

cgggagaaga aggtcaccat cctggagctg ttccgctccc ccgcctaccg ccagcccatc 2340

ctcatcgctg tggtgctgca gctgtcccag cagctgtctg gcatcaacgc tgtcttctat 2400

tactccacga gcatcttcga gaaggcgggg gtgcagcagc ctgtgtatgc caccattggc 2460

tccggtatcg tcaacacggc cttcactgtc gtgtcgctgt ttgtggtgga gcgagcaggc 2520

cggcggaccc tgcacctcat aggcctcgct ggcatggcgg gttgtgccat actcatgacc 2580

atcgcgctag cactgctgga gcagctaccc tggatgtcct atctgagcat cgtggccatc 2640

tttggctttg tggccttctt tgaagtgggt cctggcccca tcccatggtt catcgtggct 2700

gaactcttca gccagggtcc acgtccagct gccattgccg ttgcaggctt ctccaactgg 2760

acctcaaatt tcattgtggg catgtgcttc cagtatgtgg agcaactgtg tggtccctac 2820

gtcttcatca tcttcactgt gctcctggtt ctgttcttca tcttcaccta cttcaaagtt 2880

cctgagacta aaggccggac cttcgatgag atcgcttccg gcttccggca ggggggagcc 2940

agccaaagtg acaagacacc cgaggagctg ttccatcccc tgggggctga ttcccaagtg 3000

tag 3003

<210> 5

<211> 1476

<212> DNA

<400> 5

atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60

cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120

gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180

ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240

ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300

ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360

atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgaccac aggcttcgtg 420

cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480

cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540

ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600

tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660

gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720

ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780

gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840

tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900

gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960

actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020

ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080

ctaccctgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140

gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200

ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260

tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320

ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380

gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440

gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtg 1476

<210> 6

<211> 492

<212> PRT

<400> 6

Met Glu Pro Ser Ser Lys Lys Leu Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val

1 5 10 15

Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val

20 25 30

Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp

35 40 45

Val His Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Leu

50 55 60

Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser

65 70 75 80

Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met

85 90 95

Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly Phe

100 105 110

Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Ile

115 120 125

Ile Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Val

130 135 140

Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu His

145 150 155 160

Gln Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Phe Gly Leu

165 170 175

Asp Ser Ile Met Gly Asn Lys Asp Leu Trp Pro Leu Leu Leu Ser Ile

180 185 190

Ile Phe Ile Pro Ala Leu Leu Gln Cys Ile Val Leu Pro Phe Cys Pro

195 200 205

Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Ile Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala

210 215 220

Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Thr Ala Asp Val Thr His Asp

225 230 235 240

Leu Gln Glu Met Lys Glu Glu Ser Arg Gln Met Met Arg Glu Lys Lys

245 250 255

Val Thr Ile Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gln Pro Ile

260 265 270

Leu Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn

275 280 285

Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Lys Ala Gly Val Gln

290 295 300

Gln Pro Val Tyr Ala Thr Ile Gly Ser Gly Ile Val Asn Thr Ala Phe

305 310 315 320

Thr Val Val Ser Leu Phe Val Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu

325 330 335

His Leu Ile Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala Ile Leu Met Thr

340 345 350

Ile Ala Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Pro Trp Met Ser Tyr Leu Ser

355 360 365

Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Val Gly Pro Gly

370 375 380

Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg

385 390 395 400

Pro Ala Ala Ile Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe

405 410 415

Ile Val Gly Met Cys Phe Gln Tyr Val Glu Gln Leu Cys Gly Pro Tyr

420 425 430

Val Phe Ile Ile Phe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe Ile Phe Thr

435 440 445

Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Thr Phe Asp Glu Ile Ala

450 455 460

Ser Gly Phe Arg Gln Gly Gly Ala Ser Gln Ser Asp Lys Thr Pro Glu

465 470 475 480

Glu Leu Phe His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gln Val

485 490

Claims (10)

1.一种肿瘤杀伤细胞，其特征在于：所述肿瘤杀伤细胞过表达葡萄糖转运体3。

2.根据权利要求1所述的肿瘤杀伤细胞，其特征在于：所述肿瘤杀伤细胞的葡萄糖转运体3的过表达效率在30％以上。

3.根据权利要求1或2所述的肿瘤杀伤细胞，其特征在于：所述肿瘤杀伤细胞为肿瘤浸润淋巴细胞、T细胞受体嵌合型T细胞、自然杀伤细胞、Gamma-Delta T细胞、NKT细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-Treg细胞中的一种。

4.根据权利要求1所述的肿瘤杀伤细胞，其特征在于：所述肿瘤杀伤细胞还表达嵌合受体多肽，所述嵌合受体多肽包含细胞外靶结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。

5.根据权利要求4所述的肿瘤杀伤细胞，其特征在于：所述嵌合受体多肽为嵌合抗原受体，所述细胞外靶结合结构域为细胞外抗原结合结构域。

6.根据权利要求4～5中任意一项所述的肿瘤杀伤细胞，其特征在于：所述肿瘤杀伤细胞包含DNA片段或DNA片段组；所述DNA片段或DNA片段组共同包含编码葡萄糖转运子3的核苷酸片段和编码所述嵌合受体多肽的核苷酸片段。

7.根据权利要求6所述的肿瘤杀伤细胞，其特征在于：所述肿瘤杀伤细胞包含所述DNA片段，所述DNA片段包含编码葡萄糖转运体3的核苷酸片段和编码所述嵌合受体多肽的核苷酸片段；所述DNA片段包含于载体内。

8.根据权利要求7所述的肿瘤杀伤细胞，其特征在于：所述载体为重组有所述DNA片段的慢病毒表达质粒。

9.一种如权利要求1～8中任意一项所述的肿瘤杀伤细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物为抗食管癌相关肿瘤和/或非小细胞肺癌相关肿瘤药物。

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