CN114908090A

CN114908090A - 靶向破坏Aqp1 mRNA的sgRNA及其载体与应用

Info

Publication number: CN114908090A
Application number: CN202110174416.5A
Authority: CN
Inventors: 梁峻彬; 张克闯; 徐辉; 古博
Original assignee: Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-02-07
Filing date: 2021-02-07
Publication date: 2022-08-16
Also published as: JP2024506040A; US20230383275A1; EP4289954A1; WO2022167009A1

Abstract

本发明公开了一种靶向破坏Aqp1mRNA的sgRNA及其载体与应用，能够实现Aqp1mRNA水平的显著下调。利用载体递送至细胞后，可以靶向破坏Aqp1mRNA，降低Aqp1mRNA水平。可用于治疗下调Aqp1表达有利的疾病，包括但不限于Aqp1过表达相关的疾病，包括癌症、青光眼。

Description

靶向破坏Aqp1 mRNA的sgRNA及其载体与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种靶向破坏Aqp1 mRNA的sgRNA及其载体与应用。

背景技术

水通道蛋白1(Aquaporin 1,Aqp1)是一类跨膜蛋白，在体内广泛分布。主要参与调节体内水分的运输，除此之外它在血管生成、细胞迁移以及细胞生长过程中也发挥重要作用。MeiraGTx公司开发了一种基因治疗产品AAV-Aqp1。通过AAV载体将Aqp1基因在受损伤的唾液腺中过表达来治疗放射性诱发的口干症(Radiation-Induced Xerostomia，RIX)。目前，MeiraGTx公司正在对AAV-Aqp1基因药物进行I/II期临床实验。另外发现Aqp1与青光眼的发病有关。

青光眼(Glaucoma)属于一种神经变性疾病，其病理特征是视网膜神经节细胞(retinal ganglioncell,RGC)的凋亡及其轴突的变性。神经节细胞的凋亡主要与眼内压(Intraocular pressure,IOP)有关。而IOP主要由房水来维持，当房水的生成组织睫状体(Ciliary body,CB)和房水的主要排出组织小梁网(Trabecular meshwork,TM)发生故障时，就可能导致房水循环体系故障，最终引起IOP升高，压迫RGC，最终导致视野不可逆缺失。Aqp1功能性丧失会减少房水生成，使眼压降低。目前，降低眼压依然是治疗青光眼的常规手段。

由于青光眼引起的视野损伤是不可逆的，目前治疗青光眼的药物主要作用在于降低眼压(IOP)。当前主要有五类降低IOP的药物：a-肾上腺素能激动剂，β-肾上腺素能拮抗剂，胆碱能激动剂，前列腺素类以及碳酸酐酶抑制剂。主要以滴眼液方方式给药。需要频繁给药，且有一定的副作用。苏州瑞博生物技术有限公司开发出一款视神经保护的创新型siRNA(小干扰RNA)核酸药物QPI-1007，目前已处于的全球关键性临床II/III研究。该药物旨在暂时抑制促凋亡蛋白半胱天冬酶2的表达。阻止视网膜神经节细胞RGC的凋亡，进而减少视野损伤。

研究发现减少Aqp1的表达还可以减少血管形成减速肿瘤进程(Nico et al,Cancer Letters,2010,294(2):135-138)。

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统是目前应用最为广泛的基因编辑技术。作为治疗药物时，可显著降低给药频率，副作用相对较少。现有技术已有使用CRISPR/Cas系统编辑Aqp1基因，但编辑效率较低。而且现有技术是靶向Aqp1基因外显子区域，切割基因组DNA，导致原有Aqp1基因突变。这种方法破坏了基因，且可能导致一些毒蛋白的产生。

发明内容

本发明提供一种可靶向破坏人Aqp1 mRNA的sgRNA(single guide RNA，单分子gRNA)及其载体与应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种sgRNA，所述sgRNA可靶向破坏人Aqp1 mRNA。

所述sgRNA包括靶向结构域和骨架结构域(骨架序列)，如图1所示。

在一些实施例中，所述sgRNA的靶向结构域的序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:31中的任一种。

通过设计，发明人还发现了一些效果明显更优的sgRNA，可更有效地降低Aqp1mRNA水平。

优选地，所述sgRNA的靶向结构域的序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31中的任一种。

本发明所述sgRNA的骨架序列按照常规方式设计即可。本发明sgRNA通过靶向结构域和骨架序列足以允许Cas13d核酸酶(例如CasRx)靶向Aqp1 mRNA。本领域一般技术人员可以知道，将本发明的sgRNA靶向结构域与任意合适的骨架序列连接形成单分子gRNA(sgRNA)后都可以实现将Cas13d核酸酶(例如CasRx)靶向至Aqp1 mRNA的功能，达到本发明的技术效果。

在一些实施例中，所述sgRNA使用Cas13d-sgRNA系统通用的sgRNA骨架序列。

进一步地，在一些实施例中，所述sgRNA使用CasRx-sgRNA系统通用的sgRNA骨架序列。再进一步地，在一些实施例中，所述sgRNA骨架序列为5’-CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAAC-3’(SEQ ID NO:32)。

在一些实施例中，所述sgRNA与Cas13d核酸酶或编码Cas13d核酸酶的核酸分子组合使用。在一些实施例中，所述Cas13d核酸酶为CasRx。

在一些实施例中，所述sgRNA与Cas13d核酸酶组合使用。在一些实施例中，所述Cas13d核酸酶为CasRx。

本发明sgRNA可在任意核苷酸上进行合适的化学修饰。

本发明的第二个方面，提供一种载体，包含编码如第一个方面所述的sgRNA的核苷酸序列。

进一步地，所述编码sgRNA的核苷酸序列被可操作地连接至启动子。

在一些实施例中，所述载体包含编码如第一个方面所述的任意一条sgRNA的核苷酸序列。进一步地，在一些实施例中，所述sgRNA的靶向结构域的序列选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31中的任意一种。

在一些实施例中，所述载体包含编码如第一个方面所述的任意两条sgRNA的核苷酸序列。进一步地，在一些实施例中，所述两条sgRNA的靶向结构域的序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:31中的任意两种。优选地，所述两条sgRNA的靶向结构域的序列选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31中的任意两种。

在一些实施例中，所述载体包含两条以上编码如第一个方面所述的sgRNA的核苷酸序列。

上述载体，可表达用于靶向破坏Aqp1 mRNA的sgRNA，可以理解的，本领域技术人员可参照常规技术构建。

在一些实施例中，所述载体中还包含编码Cas13d核酸酶的核苷酸序列。进一步地，所述编码sgRNA的核苷酸序列被可操作地连接至启动子。所述载体可表达用于靶向破坏Aqp1mRNA的sgRNA和Cas13d核酸酶，可以理解的，本领域技术人员可参照常规技术构建。进一步地，在一些实施例中，所述Cas13d核酸酶为CasRx。

所述编码sgRNA的核苷酸序列，与所述编码Cas13d核酸酶的核苷酸序列可以位于同一个载体上，也可以位于不同的载体上。

本发明的第三个方面，提供含有以下Ⅰ～Ⅲ中至少一种的重组菌、重组细胞系或病毒：

Ⅰ.本发明第一个方面所述的sgRNA；

Ⅱ.编码本发明第一个方面所述sgRNA的核酸分子；

Ⅲ.本发明第二个方面所述的载体。

本发明的第四个方面，提供一种组合物，包括以下Ⅰ～Ⅳ中至少一种：

Ⅰ.Cas13d核酸酶，和本发明第一个方面所述的sgRNA；

Ⅱ.编码Cas13d核酸酶的核酸分子，和编码本发明第一个方面所述sgRNA的核酸分子；

Ⅲ.Cas13d核酸酶，和编码本发明第一个方面所述sgRNA的核酸分子；

Ⅳ.编码Cas13d核酸酶的核酸分子，和本发明第一个方面所述的sgRNA。

在一些实施例中，所述Cas13d核酸酶为CasRx核酸酶。

在一些实施例中，所述组合物中的所述sgRNA为1条。

在一些实施例中，所述组合物中的所述sgRNA为2条，所述2条sgRNA的靶向结构域选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:31的任两种。进一步地，在一些实施例中，所述2条sgRNA的靶向结构域选自以下(1)-(10)中的任一种组合：

(1)sgRNA 2+sgRNA 5；

(2)sgRNA 2+sgRNA 21；

(3)sgRNA 2+sgRNA 24；

(4)sgRNA 2+sgRNA 31；

(5)sgRNA 5+sgRNA 21；

(6)sgRNA 5+sgRNA 24；

(7)sgRNA 5+sgRNA 31；

(8)sgRNA 21+sgRNA 24；

(9)sgRNA 21+sgRNA 31；

(10)sgRNA 24+sgRNA 31。

本发明的第五个方面，提供一种试剂盒、所述试剂盒中包含有发明第一个方面所述的sgRNA、本发明第二个方面所述所述的载体或本发明第四个方面所述的组合物。

所述试剂盒可用于显著下调Aqp1的表达量。

本发明的第六个方面，提供一种药物，所述药物含有本发明第一个方面所述的sgRNA、本发明第二个方面所述的载体或本发明第四个方面所述的组合物，以及药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物可采用的递送系统包括但不限于：RNP递送、脂质体递送、纳米粒递送、病毒递送。

在本发明的部分实施例中，采用病毒递送。在一些实施例中，使用AAV载体递送。

本发明的第七个方面，提供本发明第一个方面所述的sgRNA、本发明第二个方面所述所述的载体、本发明第三个方面所述的重组菌、重组细胞系或病毒、本发明第四个方面所述的组合物、本发明第五个方面所述的试剂盒或本发明第六个方面所述的药物在制备治疗下调Aqp1表达有利的疾病的药物中的应用。

在一些实施例中，所述下调Aqp1表达有利的疾病选自肿瘤、青光眼。

在一些实施例中，所述下调Aqp1表达有利的疾病选自青光眼。

本发明的有益效果是：

本发明首次使用CRISPR/CasRx系统，提供靶向破坏人Aqp1 mRNA序列的sgRNA，并且实现了Aqp1 mRNA水平的显著下调。利用载体递送至细胞后，靶向破坏Aqp1 mRNA，降低Aqp1 mRNA水平。可用于治疗下调Aqp1表达有利的疾病，包括但不限于Aqp1过表达相关的疾病(包括癌症、青光眼)，或通过将常规Aqp1表达水平下调而治疗有关疾病。

本发明提供的靶向Aqp1基因的mRNA序列的sgRNA，相比直接靶向破坏Aqp1基因而言更安全。

本发明的sgRNA可有效地降低Aqp1 mRNA水平。通过设计，发明人在部分sgRNA靶向位点附近发现了效果明显更优的sgRNA，可更有效地降低Aqp1 mRNA水平，取得了预料不到的技术效果。

此外，本发明人还意外地发现两条sgRNA的特定组合，相比单个sgRNA具有更高的编辑效率，具有更好的抑制Aqp1的效果，因此具有协同作用。

附图说明

图1为本发明sgRNA分子结构的示意图。

图2为本发明的部分sgRNA在Aqp1 mRNA上的靶向位置示意图一。

图3为本发明的部分sgRNA在Aqp1 mRNA上的靶向位置示意图二。

图4为本发明的部分sgRNA在Aqp1 mRNA上的靶向位置示意图三。

图5为RFZH-1质粒的图谱。

图6示例性地给出了本发明部分载体的测序峰图，图A-F分别对应为RFZH-1-Aqp1-sgRNA1、2、4、7、8、9载体的测序峰图。

图7为过表达Aqp1的质粒Lv-Aqp1的图谱。

图8示例性地给出了实施例中sgRNA2编辑细胞后的Q-PCR扩增图。

图9为小鼠注射sgRNA 21AAV 3周后的眼压测试结果。

图10为小鼠注射sgRNA C AAV 3周后的眼压测试结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

定义：本发明所述Cas13d核酸酶/Cas13d酶可以为任意的Cas13d核酸酶；例如可以是EsCas13d、RfxCas13d(CasRx)、AdmCas13d、P1E0Cas13d、UrCas13d、RffCas13d、RaCas13d，它们与其它序列(包括但不限于核定位序列[NLS]或标签序列等)的融合蛋白，或上述蛋白的合适突变体。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例一、sgRNA载体设计与构建

设计靶向Aqp1 mRNA的sgRNA，所述sgRNA的核酸序列包括靶向结构域序列和骨架序列，靶向结构域序列与Aqp1 mRNA分子上的靶序列反向互补，长度为20-30nt，如图1所示。

本实施例中sgRNA骨架序列为5’-CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAAC-3’(SEQ ID NO:32)。

发明人设计的sgRNA的靶向结构域序列如下表1所示。图2-4示出了所设计sgRNA在人Aqp1 mRNA上对应的靶序列的位置。

其中，sgRNA1-sgRNA31被设计用于通过CRISPR-CasRx系统在质粒转染细胞实验中靶向人Aqp1 mRNA的CDS区域。

表1 sgRNA的靶向结构域的序列

分别合成靶序列对应的Oligo DNA，正义链为靶序列的反向互补序列，并且根据BpiI酶切位点的选择，5’端加AAAC，反义链为靶序列，5’端加CTTG。

将上述靶序列对应的Oligo DNA正义链和反义链混合，95℃孵育5分钟后放置在冰上冷却退火形成带粘性末端的双链DNA。

RFZH-1质粒(SEQ ID NO:33)图谱如图5所示，由发明人构建。该质粒用于构建CasRx和sgRNA表达载体。

质粒使用BpiI酶切线性化，37℃反应1小时。酶切产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，切胶回收酶切产物。

退火产物和RFZH-1-BpiI酶切线性化回收产物使用T4连接酶进行连接，连接产物使用热击法转化大肠杆菌感受态细胞Stbl3，转化后向离心管中加入不含抗生素的LB液体培养基，置于恒温摇床37℃、200rpm振荡培养使菌体复苏。

将复苏后的Stbl3细胞涂布氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，于恒温培养箱37℃倒置培养。从上述平板上分别挑取单菌落接种到含50ul氨苄青霉素的50ml液体LB培养基中，使用引物U6 Promoter-F(5’-GGGCCTATTTCCCATGATTCCTT-3’，SEQ ID NO:34)和f1ori-R(5’-GCTGGCAAGTGTAGCGGTCA-3’，SEQ ID NO:35)，对上述菌液进行PCR鉴定。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，筛选出包含阳性克隆的菌液，接种至5ml含氨苄青霉素的50ml LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养16小时。

提取质粒并测定质粒浓度后，取部分质粒进行Sanger测序，测序正确的质粒保存于-20℃备用。

将包含编码靶向Aqp1 mRNA的sgRNAn的序列的载体命名为RFZH-1-Aqp1-sgRNAn(n为数字序号)。

图6示例性地给出了部分载体的测序峰图，图A-F分别对应为RFZH-1-Aqp1-sgRNA1、2、4、7、8、9载体的测序峰图。

实施例二、质粒转染。

293T细胞的质粒转染。

使用无血清培养基稀释Lipofectamine 2000脂质体转染试剂以及克隆了sgRNA的RFZH-1-Aqp1-sgRNAn1、RFZH-1-Aqp1-sgRNAn2(n1、n2表示含有sgRNA 1～sgRNA 31的任意两种质粒)质粒和过表达Aqp1的质粒Lv-Aqp1按12:12:1比例(共250ng)共转染。或仅转染一种sgRNA质粒，RFZH-1-Aqp1-sgRNAn1(n1表示含有sgRNA 1～sgRNA 31的任意一种质粒)与过表达Aqp1的Lv-Aqp1质粒按24:1比例(共250ng)共转染。

阴性对照组转染RFZH-1质粒和Lv-Aqp1质粒。

空白对照组仅转染RFZH-1质粒。

过表达Aqp1的质粒Lv-Aqp1(SEQ ID NO:36)由发明人构建，其图谱如图7所示。

混合两种质粒稀释液保温20分钟后，把复合物加入24孔板，然后将细胞悬浮液加入到复合物中。

转染质粒72小时后，使用艾科瑞通用型RNA提取试剂盒提取293T细胞总RNA后，使用Evo M-MLV反转录试剂盒进行gDNA消化以及逆转录反应，获得相应的cDNA。Q-PCR反应使用SYSB Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒，以GAPDH为内参，通过罗氏lightcycler480II，获得各组靶向编辑后的Aqp1 mRNA水平。Q-PCR每个样品每对引物平行做3个复孔。Q-PCR引物见表2。

表2. 293T细胞Q-PCR所用的引物

引物名称	序列5’-3’	序列编号
			Q-hGAPDH-F	CCATGGGGAAGGTGAAGGTC	SEQ ID NO:37
Q-hGAPDH-R	GAAGGGGTCATTGATGGCAAC	SEQ ID NO:38
			hAqp1-F	gctcttctggagggcagtgg	SEQ ID NO:39
hAqp1-R	cagtgtgacagccgggttgag	SEQ ID NO:40

实施例三、Aqp1 mRNA表达量检测结果

重组质粒转染细胞、提取RNA、反转合成cDNA以及qPCR均需独立的3次生物性重复实验，通过2^-ΔΔCt计算方法获得3次平均结果。

Aqp1 mRNA表达测试结果见下表3。结果数据用3次试验结果的平均值表示。以空白对照组的Aqp1 mRNA水平计为0，阴性对照组Aqp1 mRNA水平计为1。图8示例性地给出了sgRNA2编辑细胞后的Q-PCR扩增图。

表3. CRISPR系统编辑293T细胞后的Aqp1 mRNA水平

注：*表示与阴性对照组相比有统计学差异(P<0.05)。

表3数据显示，过表达Aqp1的质粒Lv-Aqp1造模成功，将含有sgRNA的组别的结果与阴性对照相比，可见发明人构建的sgRNA可显著降低Aqp1 mRNA的表达水平。

在人源293T细胞中，对Aqp1 mRNA敲低作用最强的是sgRNA 1-2、4-5、7-10、12、14-15、17-18、20-21、23-24、26、28、30-31，其次为sgRNA 3、6、11、13、16、19、22、25、27、29。

如图2-4所示，sgRNA 26、28、30-31与sgRNA 27、29的靶向位点虽然在Aqp1 mRNA分子上很接近但令人意外的是，sgRNA 26、28、30-31相比sgRNA 27、29具有明显增强的编辑效果，编辑后使得Aqp1 mRNA水平大为降低，取得了预料不到的技术效果。

类似地，发明人还发现sgRNA 1-2、4-5、7-10、12相比靶向临近位点的sgRNA 3、6、11具有明显增强的编辑效果；sgRNA 14相比靶向临近位点的sgRNA 13具有明显增强的编辑效果；sgRNA 15、17相比靶向临近位点的sgRNA 16具有明显增强的编辑效果；sgRNA 18相比靶向临近位点的sgRNA 19具有明显增强的编辑效果；sgRNA 20-21相比靶向临近位点的sgRNA 22具有明显增强的编辑效果；sgRNA 23-24相比靶向临近位点的sgRNA 25具有明显增强的编辑效果。

此外，根据表3中的结果显示，共转染sgRNA 2+sgRNA 5、sgRNA 2+sgRNA 21、sgRNA2+sgRNA 24、sgRNA 2+sgRNA 31、sgRNA 5+sgRNA 21、sgRNA 5+sgRNA 24、sgRNA 5+sgRNA 31、sgRNA 21+sgRNA 24、sgRNA 21+sgRNA 31和sgRNA 24+sgRNA 31组合，相比仅有一条sgRNA的组别，对Aqp1 mRNA水平具有更好的抑制效果。

综上所述，本发明人成功构建出了靶向Aqp1 mRNA的CRISPR-CasRx系统，sgRNA编辑效果好，编辑效率高，能有效地降低Aqp1 mRNA水平。相比直接靶向破坏Aqp1基因而言更安全。

实施例四、动物体内药效试验

采用实施例一的方法构建得到可表达CasRx、sgRNA C(靶向小鼠Aqp1 mRNA)的RFZH-1-Aqp1-sgRNA C质粒(用于后续的阳性对照)和RFZH-1-Aqp1-sgRNA 21质粒(靶向小鼠Aqp1 mRNA)。sgRNA C的靶向结构域序列为ACUUUGGGCCAGAGUAGCGAU(SEQ ID NO:41)。

通过转染RFZH-1-Aqp1-sgRNA质粒，使用常规方法在293T细胞中培养、分离得到血清型AAV-ShH10，其可表达CasRx和sgRNA。另外按同样方法制备得到sgRNA空载(表达CasRx，不表达sgRNA)的AAV-ShH10。

选择眼压稳定的正常6周龄小鼠10只，其中5只小鼠左眼玻璃体注射表达sgRNA 21的AAV(2×10⁹GC AAV)和GFP AAV(2×10⁸GC AAV)，另外5只小鼠左眼玻璃体注射表达sgRNAC的AAV(2×10⁹GC AAV)和GFP AAV(2×10⁸GC AAV)。所有10只小鼠的右眼玻璃体注射sgRNA空载AAV(2×10⁹GC AAV)和GFP AAV(2×10⁸GC AAV)，如下表4所示。

表4.动物实验分组

分组	给药
		阴性对照	sgRNA空载AAV+GFP AAV
实验组	sgRNA 21AAV+GFP AAV
		阳性对照	sgRNA C AAV+GFP AAV

注射1周后，检测睫状体GFP的覆盖度。荧光检测GFP分布情况，显示药物注射成功。注射3周后，使用

TONOLAB眼压计检测双眼眼压。每只小鼠以1#-5#表示，每只小鼠任一只眼睛的眼压以连续6次测试结果的平均值表示。结果如下表5和表6所示。

表5.小鼠注射sgRNA 21 AAV 3周后的眼压测试结果

注：*表示实验组平均值与阴性对照组的平均值相比有统计学差异(P<0.05)。

表6.小鼠注射sgRNA C AAV 3周后的眼压测试结果

如表5和图9显示，sgRNA 21相比空载可有效降低小鼠眼压。表6和图10显示，sgRNAC相比空载可有效降低小鼠眼压。因此sgRNA 21和sgRNA C可用于青光眼的治疗。

从眼压值降低的幅度来看，本发明的sgRNA 21比sgRNA C效果更好，因此在用于青光眼的治疗时，本发明的sgRNA 21能发挥更好的疗效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州瑞风生物科技有限公司

<120> 靶向破坏Aqp1 mRNA的sgRNA及其载体与应用

<130>

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcccuccaga agagcuucuu cuuga 25

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccuccagaag agcuucuucu uga 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggaacucg gccaccacug ccc 23

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagacaaaga gggucguggc cag 23

<210> 5

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

agggcagaac cgaugcugau gaagac 26

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

caggaacucg gccaccacug cc 22

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

auuugaagcc cagggcagaa ccg 23

<210> 8

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

ugguuguucc ccaccgggua uuug 24

<210> 9

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccgucugguu guuccccacc gggu 24

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgccgucug guuguucccc acc 23

<210> 11

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcgccagcgu ggcgaugcuc agcccgaagg 30

<210> 12

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

gccagcgaca ccuucacguu guccuggacc 30

<210> 13

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagaugcuga ucuggcagcu gag 23

<210> 14

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

augauguaca ugagggcacg gaa 23

<210> 15

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgaguucaca ccaucagcca ggu 23

<210> 16

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcccaggccc uggcccgagu uca 23

<210> 17

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 17

ucccgaugau cucgaugccc agg 23

<210> 18

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 18

gccaguguag ucaauagcca gga 23

<210> 19

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 19

aucccacagc caguguaguc aau 23

<210> 20

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 20

cugaaguugu gugugaucac cgc 23

<210> 21

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 21

cccacccaga aaauccagug guu 23

<210> 22

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 22

cccagaaaau ccagugguug cug 23

<210> 23

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 23

aagucguaga ugaguacagc cag 23

<210> 24

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 24

cugcugcgug gggccaggau gaaguc 26

<210> 25

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 25

caccuucacg cggucuguga ggucac 26

<210> 26

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcauccaggu cauacuccuc caccuggcc 29

<210> 27

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 27

gucauacucc uccaccuggc cgc 23

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 28

gucauacucc uccaccuggc 20

<210> 29

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 29

gcauccaggu cauacuccuc cac 23

<210> 30

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 30

cuucaucucc acccuggagu ugaugucguc 30

<210> 31

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 31

uuugggcuuc aucuccaccc ugga 24

<210> 32

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 32

caaguaaacc ccuaccaacu ggucgggguu ugaaac 36

<210> 33

<211> 7102

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggcctcta gactcgaggc gttgacattg attattgact agttattaat 180

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 240

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 300

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 360

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 420

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 480

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 540

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 600

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 660

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 720

tctatataag cagagctctc tggctaacta ccggtgccac catgagcccc aagaagaaga 780

gaaaggtgga ggccagcatc gaaaaaaaaa agtccttcgc caagggcatg ggcgtgaagt 840

ccacactcgt gtccggctcc aaagtgtaca tgacaacctt cgccgaaggc agcgacgcca 900

ggctggaaaa gatcgtggag ggcgacagca tcaggagcgt gaatgagggc gaggccttca 960

gcgctgaaat ggccgataaa aacgccggct ataagatcgg caacgccaaa ttcagccatc 1020

ctaagggcta cgccgtggtg gctaacaacc ctctgtatac aggacccgtc cagcaggata 1080

tgctcggcct gaaggaaact ctggaaaaga ggtacttcgg cgagagcgct gatggcaatg 1140

acaatatttg tatccaggtg atccataaca tcctggacat tgaaaaaatc ctcgccgaat 1200

acattaccaa cgccgcctac gccgtcaaca atatctccgg cctggataag gacattattg 1260

gattcggcaa gttctccaca gtgtatacct acgacgaatt caaagacccc gagcaccata 1320

gggccgcttt caacaataac gataagctca tcaacgccat caaggcccag tatgacgagt 1380

tcgacaactt cctcgataac cccagactcg gctatttcgg ccaggccttt ttcagcaagg 1440

agggcagaaa ttacatcatc aattacggca acgaatgcta tgacattctg gccctcctga 1500

gcggactgag gcactgggtg gtccataaca acgaagaaga gtccaggatc tccaggacct 1560

ggctctacaa cctcgataag aacctcgaca acgaatacat ctccaccctc aactacctct 1620

acgacaggat caccaatgag ctgaccaact ccttctccaa gaactccgcc gccaacgtga 1680

actatattgc cgaaactctg ggaatcaacc ctgccgaatt cgccgaacaa tatttcagat 1740

tcagcattat gaaagagcag aaaaacctcg gattcaatat caccaagctc agggaagtga 1800

tgctggacag gaaggatatg tccgagatca ggaaaaatca taaggtgttc gactccatca 1860

ggaccaaggt ctacaccatg atggactttg tgatttatag gtattacatc gaagaggatg 1920

ccaaggtggc tgccgccaat aagtccctcc ccgataatga gaagtccctg agcgagaagg 1980

atatctttgt gattaacctg aggggctcct tcaacgacga ccagaaggat gccctctact 2040

acgatgaagc taatagaatt tggagaaagc tcgaaaatat catgcacaac atcaaggaat 2100

ttaggggaaa caagacaaga gagtataaga agaaggacgc ccctagactg cccagaatcc 2160

tgcccgctgg ccgtgatgtt tccgccttca gcaaactcat gtatgccctg accatgttcc 2220

tggatggcaa ggagatcaac gacctcctga ccaccctgat taataaattc gataacatcc 2280

agagcttcct gaaggtgatg cctctcatcg gagtcaacgc taagttcgtg gaggaatacg 2340

cctttttcaa agactccgcc aagatcgccg atgagctgag gctgatcaag tccttcgcta 2400

gaatgggaga acctattgcc gatgccagga gggccatgta tatcgacgcc atccgtattt 2460

taggaaccaa cctgtcctat gatgagctca aggccctcgc cgacaccttt tccctggacg 2520

agaacggaaa caagctcaag aaaggcaagc acggcatgag aaatttcatt attaataacg 2580

tgatcagcaa taaaaggttc cactacctga tcagatacgg tgatcctgcc cacctccatg 2640

agatcgccaa aaacgaggcc gtggtgaagt tcgtgctcgg caggatcgct gacatccaga 2700

aaaaacaggg ccagaacggc aagaaccaga tcgacaggta ctacgaaact tgtatcggaa 2760

aggataaggg caagagcgtg agcgaaaagg tggacgctct cacaaagatc atcaccggaa 2820

tgaactacga ccaattcgac aagaaaagga gcgtcattga ggacaccggc agggaaaacg 2880

ccgagaggga gaagtttaaa aagatcatca gcctgtacct caccgtgatc taccacatcc 2940

tcaagaatat tgtcaatatc aacgccaggt acgtcatcgg attccattgc gtcgagcgtg 3000

atgctcaact gtacaaggag aaaggctacg acatcaatct caagaaactg gaagagaagg 3060

gattcagctc cgtcaccaag ctctgcgctg gcattgatga aactgccccc gataagagaa 3120

aggacgtgga aaaggagatg gctgaaagag ccaaggagag cattgacagc ctcgagagcg 3180

ccaaccccaa gctgtatgcc aattacatca aatacagcga cgagaagaaa gccgaggagt 3240

tcaccaggca gattaacagg gagaaggcca aaaccgccct gaacgcctac ctgaggaaca 3300

ccaagtggaa tgtgatcatc agggaggacc tcctgagaat tgacaacaag acatgtaccc 3360

tgttcagaaa caaggccgtc cacctggaag tggccaggta tgtccacgcc tatatcaacg 3420

acattgccga ggtcaattcc tacttccaac tgtaccatta catcatgcag agaattatca 3480

tgaatgagag gtacgagaaa agcagcggaa aggtgtccga gtacttcgac gctgtgaatg 3540

acgagaagaa gtacaacgat aggctcctga aactgctgtg tgtgcctttc ggctactgta 3600

tccccaggtt taagaacctg agcatcgagg ccctgttcga taggaacgag gccgccaagt 3660

tcgacaagga gaaaaagaag gtgtccggca attccggatc cggacctaag aaaaagagga 3720

aggtggcggc cgcttaccca tacgatgttc cagattacgc ttgaggtacc ctagagctcg 3780

ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 3840

gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 3900

tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 3960

caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg gagagggcct atttcccatg 4020

attccttcat atttgcatat acgatacaag gctgttagag agataattgg aattaatttg 4080

actgtaaaca caaagatatt agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata atttcttggg 4140

tagtttgcag ttttaaaatt atgttttaaa atggactatc atatgcttac cgtaacttga 4200

aagtatttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac cgcaagtaaa 4260

cccctaccaa ctggtcgggg tttgaaacgg gtcttcgaga agacctcaag taaaccccta 4320

ccaactggtc ggggtttgaa actttttttc ccgggaatgg ccgcaggaac ccctagtgat 4380

ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt 4440

cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct 4500

gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 4560

acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 4620

gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 4680

ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc 4740

cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgatttgggt 4800

gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 4860

tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg 4920

ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag 4980

ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg 5040

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 5100

acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 5160

gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 5220

agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt 5280

tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 5340

ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 5400

taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 5460

tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 5520

gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 5580

atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 5640

ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 5700

cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 5760

ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 5820

aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 5880

ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 5940

gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 6000

ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 6060

gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 6120

ggagccggtg agcgtggaag ccgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc 6180

tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga 6240

cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 6300

tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 6360

atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 6420

tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 6480

tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 6540

ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 6600

cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 6660

ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 6720

gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 6780

tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 6840

gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 6900

ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 6960

tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 7020

ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 7080

tgctggcctt ttgctcacat gt 7102

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gggcctattt cccatgattc ctt 23

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gctggcaagt gtagcggtca 20

<210> 36

<211> 9363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240

attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300

atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360

acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420

tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600

tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660

ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720

accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780

gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata gaccagatct gagcctggga gctctctggc 840

taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 900

tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 960

tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg 1020

agctctctcg acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc 1080

gactggtgag tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg 1140

agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc 1200

cagggggaaa gaaaaaatat aaataaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga 1260

ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag 1320

ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca 1380

accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag 1440

atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc aagcggccgg ccgcgctgat 1500

cttcagacct ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat ataaatataa 1560

agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca 1620

gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg 1680

aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat tattgtctgg 1740

tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca 1800

actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct 1860

aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc 1920

tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga atcacacgac 1980

ctggatggag tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact ccttaattga 2040

agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttggaattag ataaatgggc 2100

aagtttgtgg aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat tattcataat 2160

gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta tagtgaatag 2220

agttaggcag ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc 2280

cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg tggagagaga gacagagaca gatccattcg 2340

attagtgaac ggatcggcac tgcgtgcgcc aattctgcag acaaatggca gtattcatcc 2400

acaattttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 2460

taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt 2520

ttcgggttta ttacagggac agcagagatc cagtttggtt agtaccgggc ccgctctagc 2580

gtcgaggagc ttggcccatt gcatacgttg tatccatatc ataatatgta catttatatt 2640

ggctcatgtc caacattacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 2700

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 2760

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 2820

tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 2880

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 2940

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 3000

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 3060

tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 3120

cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 3180

cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 3240

ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt 3300

gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccccgaatt cgccaccatg 3360

gccagcgagt tcaagaagaa gctcttctgg agggcagtgg tggccgagtt cctggccacg 3420

accctctttg tcttcatcag catcggttct gccctgggct tcaaataccc ggtggggaac 3480

aaccagacgg cggtccagga caacgtgaag gtgtcgctgg ccttcgggct gagcatcgcc 3540

acgctggcgc agagtgtggg ccacatcagc ggcgcccacc tcaacccggc tgtcacactg 3600

gggctgctgc tcagctgcca gatcagcatc ttccgtgccc tcatgtacat catcgcccag 3660

tgcgtggggg ccatcgtcgc caccgccatc ctctcaggca tcacctcctc cctgactggg 3720

aactcgcttg gccgcaatga cctggctgat ggtgtgaact cgggccaggg cctgggcatc 3780

gagatcatcg ggaccctcca gctggtgcta tgcgtgctgg ctactaccga ccggaggcgc 3840

cgtgaccttg gtggctcagc cccccttgcc atcggcctct ctgtagccct tggacacctc 3900

ctggctattg actacactgg ctgtgggatt aaccctgctc ggtcctttgg ctccgcggtg 3960

atcacacaca acttcagcaa ccactggatt ttctgggtgg ggccattcat cgggggagcc 4020

ctggctgtac tcatctacga cttcatcctg gccccacgca gcagtgacct cacagaccgc 4080

gtgaaggtgt ggaccagcgg ccaggtggag gagtatgacc tggatgccga cgacatcaac 4140

tccagggtgg agatgaagcc caaataccca tacgatgttc cagattacgc tggatccgct 4200

agcggcagtg gagagggcag aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct 4260

ggcccagtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 4320

gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 4380

tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 4440

accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 4500

aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 4560

ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 4620

ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 4680

cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 4740

aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 4800

gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 4860

cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 4920

gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 4980

taaggatcct aggcggccgc gcatgccctg caggtgatct atcgatcggc cggcccctct 5040

ccctcccccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt 5100

tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc 5160

tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca 5220

aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac 5280

gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg 5340

ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt 5400

gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca agcgtattca acaaggggct 5460

gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtacacatg 5520

ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt 5580

ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata tggccacaac cgggccggat atcacgcgtg 5640

atctgatcag cacgtgttga caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac 5700

gacaaggtga ggaactaaac catggccaag cctttgtctc aagaagaatc caccctcatt 5760

gaaagagcaa cggctacaat caacagcatc cccatctctg aagactacag cgtcgccagc 5820

gcagctctct ctagcgacgg ccgcatcttc actggtgtca atgtatatca ttttactggg 5880

ggaccttgtg cagaactcgt ggtgctgggc actgctgctg ctgcggcagc tggcaacctg 5940

acttgtatcg tcgcgatcgg aaatgagaac aggggcatct tgagcccctg cggacggtgc 6000

cgacaggtgc ttctcgatct gcatcctggg atcaaagcca tagtgaagga cagtgatgga 6060

cagccgacgg cagttgggat tcgtgaattg ctgccctctg gttatgtgtg ggagggctaa 6120

gcaatgcata catgtgttta aacctcgact taattaagtc gagggtcgac ggtatcgata 6180

agctcgcttc acgagatcat gtttaagggt tccggttcca ctaggtacaa ttcgatatca 6240

agcttatcga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta 6300

actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta 6360

ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt 6420

atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg 6480

caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt 6540

tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag 6600

gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc 6660

cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc 6720

cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc 6780

ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc 6840

atcgataccg tcgacctcga tcgagaccta gaaaaacatg gagcaatcac aagtagcaat 6900

acagcagcta ccaatgctga ttgtgcctgg ctagaagcac aagaggagga ggaggtgggt 6960

tttccagtca cacctcaggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt 7020

agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa 7080

gatatccttg atctgtggat ctaccacaca caaggctact tccctgattg gcagaactac 7140

acaccagggc cagggatcag atatccactg acctttggat ggtgctacaa gctagtacca 7200

gttgagcaag agaaggtaga agaagccaat gaaggagaga acacccgctt gttacaccct 7260

gtgagcctgc atgggatgga tgacccggag agagaagtat tagagtggag gtttgacagc 7320

cgcctagcat ttcatcacat ggcccgagag ctgcatccgg actgtactgg gtctctctgg 7380

ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 7440

caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 7500

aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag catgtgagca 7560

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 7620

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 7680

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 7740

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 7800

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 7860

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 7920

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 7980

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 8040

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 8100

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 8160

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 8220

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 8280

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 8340

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 8400

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 8460

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 8520

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 8580

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 8640

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 8700

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 8760

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 8820

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 8880

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 8940

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 9000

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 9060

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 9120

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 9180

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 9240

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 9300

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 9360

gac 9363

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ccatggggaa ggtgaaggtc 20

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gaaggggtca ttgatggcaa c 21

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gctcttctgg agggcagtgg 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cagtgtgaca gccgggttga g 21

<210> 41

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 41

acuuugggcc agaguagcga u 21

Claims

1.一种sgRNA，所述sgRNA可靶向破坏人Aqp1 mRNA。

2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核酸序列包括靶向结构域和骨架序列，所述靶向结构域的序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:31中的任一种。

3.根据权利要求2所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶向结构域的序列选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31中的任一种。

4.一种载体，包含编码权利要求1-3任一项所述的sgRNA的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的载体，所述载体中还包含编码Cas13d核酸酶的核苷酸序列。

6.含有以下Ⅰ～Ⅲ中至少一种的重组菌、重组细胞系或病毒：

Ⅰ.权利要求1-3任一项所述的sgRNA；

Ⅱ.编码权利要求1-3任一项所述的sgRNA的核酸分子；

Ⅲ.权利要求4-5任一项所述的载体。

7.一种组合物，包括以下Ⅰ～Ⅳ中至少一种：

Ⅰ.Cas13d核酸酶和权利要求1-3任一项所述的sgRNA；

Ⅱ.编码Cas13d核酸酶的核酸分子和编码权利要求1-3任一项所述sgRNA的核酸分子；

Ⅲ.Cas13d核酸酶，和编码权利要求1-3任一项所述sgRNA的核酸分子；

Ⅳ.编码Cas13d核酸酶的核酸分子，和权利要求1-3任一项所述的sgRNA。

8.一种试剂盒，包含权利要求1-3任一项所述的sgRNA、权利要求4或5所述的载体或权利要求7所述的组合物。

9.一种药物，所述药物含有权利要求1-3任一项所述的sgRNA、权利要求4或5所述的载体或权利要求7所述的组合物以及药学上可接受的辅料。

10.权利要求1-3任一项所述的sgRNA、权利要求4或5所述的载体、权利要求6所述的重组菌、重组细胞系或病毒、权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的药物在制备治疗下调Aqp1表达有利的疾病的药物中的应用。