KR20080094910A - 신규 단백질 발현계 - Google Patents

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마코토 이노우에
쯔구미네 슈
마모루 하세가와
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Abstract

본 발명자들은 MiniSeV-SeV 입자 공존 단백질 발현계의 시스템을 고안하여, 본 발현계의 표적세포로의 목적 유전자의 도입능, 목적 유전자의 표적세포에 있어서의 발현능에 대해서 검토를 행하였다. 그 결과, 본 발명의 발현계가, 표적세포로의 목적 유전자의 높은 도입능, 목적 유전자의 표적세포에 있어서의 높은 발현능을 보유하고 있는 것이 명확해졌다.

Description

신규 단백질 발현계{Novel Protein expression system}
본 발명은, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자를 표적세포에 도입하는 공정을 포함하는, 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈에 관한 것이다. 추가적으로 본 발명은, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자의 제조방법, 및 당해 바이러스 입자에 관한 것이다.
지금까지의 단백질 발현(단백질 생산, 기능 해석 등)계는 비(非)바이러스 단백질 발현계와 바이러스 단백질 발현계의 2종류로 크게 구별할 수 있다. 비바이러스 단백질 발현계는 제작 간편, 저비용, 단기간에서의 대량 조제가 가능, 생물 안전성(biosafety)이 높다는 등의 장점이 있으나, 인비트로(in vitro)에서의 유전자 도입효율이 도입 시약이나 세포종류 등에 크게 의존하여, 인비보(in vivo)에 있어서의 유전자 도입효율이 매우 낮다. 한편, 바이러스 단백질 발현계는 인비트로와 인비보 양쪽에 있어서 높은 유전자 도입효율이 얻어지는 경우가 많으나, 비바이러스 벡터에 비해 비용이 높고, 조제에 시간이 걸리며, 생물 안전성으로의 배려가 필 요하다는 등의 단점도 있다. 이들 2종류의 단백질 발현계에는 각각 장점과 단점이 있으므로, 보다 고성능의 신규 단백질 발현계의 개발이 요망되고 있었다.
센다이 바이러스 벡터(이하 SeV라고 표기하는 경우도 있음)는 세포질형의 바이러스 벡터로서, 인비트로와 인비보 양쪽에 있어서 유전자 도입효율, 발현효율이 높다는 점이나, 인비트로에서는 장기 지속발현이 가능하다는 등 우수한 성능을 갖고 있다. 그러나, 제작 비용이 높고, 단기간에서의 대량 조제가 곤란한 등 바이러스 벡터에 공통적인 약점도 보유하고 있다.
한편, SeV 게놈의 일부가 결실되어 있어, 증식하기 위해서는 정상 바이러스를 헬퍼로서 필요로 하고, 또한 정상 바이러스의 증식을 억제(간섭)하는 성질을 갖고 있는 간섭성 결손 입자(DI)의 존재가 알려져 있다. 이 DI 입자의 성질을 이용하여, 외래 유전자를 탑재한 인공 DI(SeV 미니게놈)의 cDNA 플라스미드를 구축하고, NP, P, L을 발현하는 헬퍼 SeV 또는 헬퍼 플라스미드와 함께 표적세포로 도입함으로써, 목적 외래 단백의 발현을 시험한 예가 보고되어 있다(비특허문헌 1). 이것에 따라, 재조합 SeV 벡터에 비해, 보다 벡터 cDNA의 제작이 용이한 미니게놈계에 의한 단백 발현이 가능해졌으나, 인비보나 인비트로에 있어서의 유전자 도입 및 발현효율이 낮아, 이들의 개선이 요구되고 있다.
상기의 사실로부터, 바이러스 벡터 및 미니게놈을 사용한 발현계 쌍방의 이점을 보유한 새로운 발현계의 개발이 요구되고 있다.
또한, 본 출원의 발명에 관련하는 선행기술 문헌정보를 이하에 나타낸다.
비특허문헌 1: Vullienoz et al, Journal of General Virology, 86:171-180, 2005
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자를 표적세포에 도입하는 공정을 포함하는, 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 방법을 제공하는 것에 있다. 또한 본 발명은, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈의 제공을 과제로 한다. 추가적으로 본 발명은, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자의 제조방법, 및 당해 바이러스 입자의 제공을 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해, SeV 벡터의 우수한 성능을 살리면서, 제작이 간편하고, 저비용, 단기간에서의 대량 조제가 가능한 새로운 단백질 발현계를 개발하기 위해, SeV 미니게놈(MiniSeV)계의 이용을 시도하였다. SeV 미니게놈계는 제작이 간편하고, 전사 복제효율이 높은 등의 유리한 특징을 갖고 있으나, 세포 내에서의 자율적인 복제에 정상 바이러스 또는 NP, P, L 발현 플라스미드를 헬퍼로서 필요로 하므로, 고발현능의 벡터로서 완성하기에는 곤란하였다.
이에, 본 발명자들은 MiniSeV-SeV 입자 공존 단백질 발현계(도 6)의 시스템을 고안하여, 본 발현계의 표적세포로의 목적 유전자의 도입능, 목적 유전자의 표적세포에 있어서의 발현능에 대해서 검토를 행하였다. 먼저, SeV 융합 단백질(F 단백질)을 결손시킨 SeV/△F, 및 목적 유전자(GOI: gene of interest)를 탑재한 SeV 미니게놈 cDNA 플라스미드를, T7 RNA 폴리머라아제와 SeV 융합 단백질(F 단백질)이 발현하고 있는 생산세포에 도입하였다. 그 후, MiniSeV/GOI 입자와 SeV/△F 입자가 공존한 배양상청을 회수하였다. 이 MiniSeV/GOI와 SeV/△F 공존 입자를 사용함으로써, 인비트로와 인비보의 양쪽에 있어서, 목적 유전자(GOI)의 표적세포로의 높은 도입효율, 및 상기 세포 내에서의 높은 발현효율을 실현하였다. 본 발명에 있어서는, 목적 유전자(GOI)의 일례로서 GFP를 사용하였다.
추가적으로, 상기 공존 입자계의 SeV 미니게놈에 있어서 RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 사용한 경우, 또는 목적 유전자에 Tag 서열(HA-Tag)을 부가한 경우에도, 목적 유전자의 표적세포로의 높은 도입효율, 및 상기 세포 내에서의 높은 발현효율이 실현되는 것이 명확해졌다.
즉, 본 발명자들은, 목적 유전자의 표적세포로의 높은 도입능, 및 목적 유전자의 표적세포에 있어서의 높은 발현능을 보유하는, MiniSeV-SeV 입자 공존 단백질 발현계의 구축에 성공하여, 이에 따라 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 보다 구체적으로는 이하의 [1]~[51]을 제공하는 것이다.
[1] 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 방법.
(a) 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 생산세포에 도입하는 공정
(b) 상기 생산세포 내에서 생산된 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자를 회수하는 공정
(c) 공정 (b)에서 회수된 바이러스 입자를 표적세포에 도입하는 공정
[2] 공정 (a)에 있어서, NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 발현하는 벡터를, 추가적으로 생산세포에 도입하는 공정을 포함하는, [1]에 기재의 방법.
[3] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP) 복합체 또는, 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP)인 [1]에 기재의 방법.
[4] 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이, 하나 또는 복수의 프로모터를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는, [1]에 기재의 방법.
[5] 프로모터 중 하나 이상이 RNA 폴리머라아제 I 프로모터인 것을 특징으로 하는, [4]에 기재의 방법.
[6] 마이너스가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스(paramyxovirus)인, [1]~[5] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[7] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 또는 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈에 의해, 파라믹소바이러스의 NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 발현시키는 것을 특징으로 하는, [6]에 기재의 방법.
[8] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 파라믹소바이러스의 F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하지 않도록 개변되고, 5' 말단의 트레일러 영역(5'-trailer region)이 리더 영역(leader region)으로 치환된, 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는 벡터인, [6]에 기재의 방법.
[9] 생산세포가, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터에 있어서 발현하지 않도록 개변된, F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하고 있는 것을 특징으로 하는, [8]에 기재의 방법.
[10] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터의 개변된 단백질이 F 단백질인, [8] 또는 [9]에 기재의 방법.
[11] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, P 유전자 및/또는 C 유전자에 변이를 보유하는 것을 특징으로 하는, [8]~[10] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[12] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 하기 (a) 또는 (b)에 기재의 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는, [11]에 기재의 방법.
(a) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
(b) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 RNA의 상보가닥과 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
[13] 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인, [6]에 기재의 방법.
[14] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가 야생형 센다이 바이러스 벡터인 [6]에 기재의 방법.
[15] 생산세포가, T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 세포인 [1]~[14] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[16] 인비트로에서의 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는, [1]~[15] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[17] 표적세포가, 293T 세포, A549 세포, BHK-21 세포, C2C12 세포, HeLa 세포, LLC-MK2 세포, MDCK 세포, 또는 NIH3T3 세포 중 어느 하나인, [16]에 기재의 방법.
[18] 인비보에서의 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는, [1]~[15] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[19] 외래 유전자에 Tag 서열이 부가되어 있는 것을 특징으로 하는, [1]~[18] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[20] Tag 서열이 HA-Tag인 [19]에 기재의 방법.
[21] 파라믹소바이러스의 F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하지 않도록 개변되고, 5' 말단의 트레일러 영역이 리더 영역으로 치환된, 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터.
[22] 개변된 단백질이 F 단백질인, [21]에 기재의 벡터.
[23] P 유전자 및/또는 C 유전자에 변이를 보유하는 것을 특징으로 하는, [21] 또는 [22]에 기재의 벡터.
[24] 마이너스가닥 단일가닥 RNA가 하기 (a) 또는 (b)에 기재의 마이너스가닥 단일가닥 RNA인, [23]에 기재의 벡터.
(a) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
(b) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 RNA의 상보가닥과 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
[25] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 리보핵단백질(RNP) 복합체 또는, 바이러스 유사 입자(VLP)인 [21]~[24] 중 어느 하나에 기재의 벡터.
[26] 마이너스가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스인, [21]~[25] 중 어느 하나에 기재의 벡터.
[27] 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인, [26]에 기재의 벡터.
[28] 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈.
[29] 하나 또는 복수의 프로모터를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는, [28]에 기재의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈.
[30] 프로모터 중 하나 이상이 RNA 폴리머라아제 I 프로모터인 것을 특징으로 하는, [29]에 기재의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈.
[31] 마이너스가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스인, [28]~[30] 중 어느 하나에 기재의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈.
[32] 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인, [31]에 기재의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈.
[33] 외래 유전자에 Tag 서열이 부가되어 있는 것을 특징으로 하는, 청구항 28~32 중 어느 하나에 기재의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈.
[34] Tag 서열이, HA-Tag인 청구항 33에 기재의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈.
[35] [21]~[27] 중 어느 하나에 기재의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터, 및 [28]~[34] 중 어느 하나에 기재의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 표적세포에 도입하는 공정을 포함하는, 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 방법.
[36] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 바이러스 입자의 제조방법.
(a) 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 생산세포에 도입하는 공정
(b) 상기 생산세포 내에서 생산된 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자를 회수하는 공정
[37] 공정 (a)에 있어서, NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 발현하는 벡터를, 추가적으로 생산세포에 도입하는 공정을 포함하는, [36]에 기재의 방법.
[38] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 리보핵단백질(RNP) 복합체 또는, 바이러스 유사 입자(VLP)인 [36]에 기재의 방법.
[39] 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이, 하나 또는 복수의 프로모터를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는, [36]에 기재의 방법.
[40] 프로모터 중 하나 이상이 RNA 폴리머라아제 I 프로모터인 것을 특징으로 하는, [39]에 기재의 방법.
[41] 마이너스가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스인, [36]~[40] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[42] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 또는 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈에 의해, 파라믹소바이러스의 NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 발현시키는 것을 특징으로 하는, [41]에 기재의 방법.
[43] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 파라믹소바이러스의 F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하지 않도록 개변되고, 5' 말단의 트레일러 영역이 리더 영역으로 치환된, 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는 벡터인, [41]에 기재의 방법.
[44] 생산세포가, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터에 있어서 발현하지 않도록 개변된, F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하고 있는 것을 특징으로 하는, [43]에 기재의 방법.
[45] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터의 개변된 단백질이 F 단백질인, [43] 또는 [44]에 기재의 방법.
[46] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, P 유전자 및/또는 C 유전자에 변이를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는, [43]~[45] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[47] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 하기 (a) 또는 (b)에 기재의 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는, [46]에 기재의 방법.
(a) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
(b) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 RNA의 상보가닥과 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
[48] 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인, [41]에 기재의 방법.
[49] 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 야생형 센다이 바이러스 벡터인 [41]에 기재의 방법.
[50] 생산세포가, T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 세포인 [36]~[49] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[51] [36]~[50] 중 어느 하나에 기재의 방법에 있어서 회수되는, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자.
도면의 간단한 설명
도 1은 pSeVagp55/△F의 구축도이다.
도 2는 pSeVagp55/(P/C)m/△F의 구축도이다.
도 3은 SeV 미니게놈의 디자인도이다. (A) 단일 프로모터 SeV 미니게놈; MiniSeVSP/GOI (B) 이중 프로모터 SeV 미니게놈; MiniSeVDP/GOI (1) GP의 제58번째 염기 C가 A로 변이, 이 변이에 의해 S의 기능이 크게 저하한다. (2) GP의 최초 12 염기의 결실에 의해 3'-프로모터 기능이 크게 저하한다.
도 4는 SeV 단일 프로모터 미니게놈 cDNA의 구축도이다.
도 5는 SeV 이중 프로모터 미니게놈 cDNA의 구축도이다.
도 6은 MiniSeV-SeV/△F 입자 공존 단백 발현계의 구조를 나타내는 도면이다.
도 7은 Helper SeV 디자인에 의한 공존 입자 생산성으로의 영향을 나타내는 사진이다. (A) 패키징 세포(Packaging Cell)에서의 공존 입자의 생산 (B) 표적세포(Target Cell)로의 공존 입자에 의한 감염
도 8은 MiniSeV cDNA 디자인에 의한 공존 입자 생산성으로의 영향을 나타내는 사진 및 도면이다. (A) 패키징 세포에서의 공존 입자의 생산 (B) 생산된 공존 입자의 타이터(titer)
도 9는 SeVagp55/△F와 SeVagp55/(P/C)m/△F를 사용한 공존 입자 생산성의 비교를 나타내는 사진 및 도면이다. (A) 패키징 세포에서의 공존 입자의 생산 (B) 표적세포로의 공존 입자에 의한 감염 (C) 생산된 공존 입자의 타이터
도 10은 공존 입자 중 MiniSeV와 Helper SeV의 양비(量比) 개선을 나타내는 사진 및 도면이다. (A) 패키징 세포에서의 공존 입자의 생산 (B) 생산된 공존 입자의 타이터와 Helper SeV/MiniSeV 양비
도 11은 MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/△F 공존 입자에 의한 인비트로 발현을 나타내는 사진이다.
도 12는 공존 입자에 의한 인비보 발현(비강 내 GFP 발현)을 나타내는 사진이다.
도 13은 MiniSeVDP/GFP cDNA 플라스미드 및 SeVagp55/△F 감염성 입자에 의한 단백질 발현을 나타내는 사진이다.
도 14는 RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 사용한 미니게놈 cDNA의 구축도이다.
도 15는 HA-Tag 부착 유전자(GFP) 탑재 미니게놈 cDNA의 구축도이다.
도 16은 RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 사용한 공존 입자계에 의한 인비트로 발현을 나타내는 사진이다.
도 17은 HA-Tag 부착 유전자를 탑재한 공존 입자계에 의한 인비트로 발현을 나타내는 사진이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명자들은, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 생산세포에 도입하고, 생산세포 내에서 각각 패키징된 바이러스 입자를 표적세포에 도입함으로써, 높은 목적 유전자의 도입효율 및 발현효율을 실현하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 본 발명은, 이들의 지견(知見)을 토대로 하는 것이다.
본 발명은, 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
(a) 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 생산세포에 도입하는 공정
(b) 상기 생산세포 내에서 생산된 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자를 회수하는 공정
(c) 공정 (b)에서 회수된 바이러스 입자를 표적세포에 도입하는 공정
본 발명에 있어서, 마이너스가닥 RNA 바이러스란, 마이너스가닥(바이러스 단백질을 센스로 코드하는 가닥과 상보적인 안티센스가닥)의 RNA를 게놈으로서 포함하는 바이러스를 말한다. 마이너스가닥 RNA 바이러스는 음성가닥 RNA 바이러스(negative strand RNA virus)라고도 불린다. 본 발명에 있어서 사용되는 마이너스가닥 RNA 바이러스로서는, 특히 단일가닥 마이너스가닥 RNA 바이러스(비분절형(non-segmented) 마이너스가닥 RNA 바이러스라고도 한다)가 바람직하다. 「단일가닥 음성가닥 RNA 바이러스」란, 단일가닥 음성가닥[즉 마이너스가닥] RNA를 게놈에 갖는 바이러스를 말한다. 이와 같은 바이러스로서는, 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, 및 Pneumovirus속 등을 포함한다), 라브도바이러스(Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, 및 Ephemerovirus속 등을 포함한다), 필로바이러스(Filoviridae), 분야바이러스(Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, 및 Phlebovirus속 등을 포함한다), 아레나바이러스(Arenaviridae) 등의 과(科)에 속하는 바이러스가 포함된다. 본 발명에 있어서 사용되는 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터는, 전파능을 갖고 있어도 되고, 전파능을 갖지 않는 결손형 벡터여도 된다. 「전파능을 갖는다(transmissible)」란, 바이러스 벡터가 숙주세포를 감염시킨 경우, 상기 세포에 있어서 바이러스가 복제되어, 감염성 바이러스 입자가 생산되는 것을 가리킨다. 결손형 벡터로서는, 예를 들면 엔벨로프(envelope)를 구성하는 단백질을 코드하는 유전자 중 1개 이상을 결손하는 벡터를 들 수 있다. 구체적으로는, 바이러스의 종류에 따라서도 상이하나, F, H, HN, G, M, M1 등의 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자 중 1개 이상을 결손하는 벡터를 예시할 수 있다(WO00/70055 및 WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569(2000)).
본 발명에 있어서 특히 적합하게 사용되는 마이너스가닥 RNA 바이러스를 구체적으로 들면, 예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 바이러스의 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), RS바이러스(respiratory syncytial virus), 우역바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(simian parainfluenza virus)(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 3형, 라브도바이러스과(rhabdoviridae)의 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus), 광견병 바이러스(Rabies virus) 등을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서 파라믹소바이러스는, 바람직하게는 파라믹소바이러스 아과(Paramyxovirinae)(레스피로바이러스속(Respirovirus), 루블라바이러스속(Rubulavirus), 및 모빌리바이러스속(Morbillivirus)을 포함한다)에 속하는 바이러스, 보다 바람직하게는 레스피로바이러스속(Respirovirus)(파라믹소바이러스속(Paramyxovirus)이라고도 한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이다. 유도체에는, 바이러스에 의한 유전자 도입능을 손상하지 않도록, 바이러스 유전자가 개변된 바이러스, 및 화학 수식된 바이러스 등이 포함된다. 본 발명을 적용 가능한 레스피로바이러스속 바이러스로서는, 예를 들면 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형(HPIV-3), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형(BPIV-3), 센다이 바이러스(Sendai virus; 마우스 파라인플루엔자 바이러스 1형이라고도 불린다), 및 원숭이 파라인플루엔자 바이러스 10형(SPIV-10) 등이 포함된다. 본 발명에 있어서 파라믹소바이러스는 가장 바람직하게는 센다이 바이러스이다. 이들의 바이러스는, 천연주(natural strain), 야생주(wild type strain), 변이주(mutant strain), 라보 계대주(laboratory-passaged strain), 및 인위적으로 구축된 주(strain) 등에 유래하여도 된다.
예를 들면, 센다이 바이러스(Sendai virus; SeV)의 경우, 천연 바이러스의 게놈사이즈는 약 15,000 염기이고, 음성가닥은 3'의 짧은 리더 영역에 계속되어, NP(뉴클레오캡시드), P(포스포), M(매트릭스), F(퓨전), HN(헤마글루티닌-뉴라미니다아제), 및 L(라지) 단백질을 코드하는 6개의 유전자가 나란히 늘어서 있고, 짧은 5' 트레일러 영역을 5' 말단에 갖는다.
파라믹소바이러스의 「NP, P, M, F, HN, 및 L 유전자」란, 각각 뉴클레오캡시드, 포스포, 매트릭스, 퓨전, 헤마글루티닌-뉴라미니다아제, 및 라지 단백질을 코드하는 유전자를 가리킨다. 포스포(P) 단백질은, RNA 폴리머라아제의 작은 서브유닛인 인산화 단백질이다. 매트릭스(M) 단백질은, 바이러스 입자구조를 내측에서 유지하는 기능을 한다. 퓨전(F) 단백질은, 숙주세포로의 침입에 관여하는 막융합 단백질이고, 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN) 단백질은, 숙주세포와의 결합에 관여하는 단백질이다. 라지 단백질은, RNA 폴리머라아제의 큰 서브유닛이다. 상기 각 유전자는 각각의 전사제어유닛을 갖고, 각 유전자로부터 단독의 mRNA가 전사되어, 단백질이 전사된다. P 유전자로부터는, P 단백질 이외에, 상이한 ORF를 이용하여 번역되는 비구조 단백질(C)과, P 단백질 mRNA를 독취하는 도중의 RNA 편집에 의해 제작되는 단백질(V)이 번역된다. 파라믹소바이러스 아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로 3'로부터 순서대로, 다음과 같이 표기된다. 또한, 일반적으로 NP 유전자는 「N 유전자」로 표시되는 경우도 있다.
레스피로바이러스속 N P/C/V M F HN - L
루블라바이러스속 N P/V M F HN (SH) L
모빌리바이러스속 N P/C/V M F H - L
예를 들면 센다이 바이러스의 각 유전자 염기서열의 데이터베이스의 승인번호(accession number)는, N 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886을 참조할 것. 또한 그 외의 바이러스가 코드하는 바이러스 유전자를 예시하면, N 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; 및 Tupaia, AF079780, P 유전자에 대해서는 CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; 및 Tupaia, AF079780, C 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, D00047; MV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; 및 Tupaia, AF079780, M 유전자에 대해서는 CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; 및 SV5, M32248, F 유전자에 대해서는 CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; 및 SV5, AB021962, HN(H 또는 G) 유전자에 대해서는 CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2, D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; 및 SV-5, S76876, L 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV, Z30698; 및 SV-5, D13868을 예시할 수 있다. 단, 각 바이러스는 복수의 주가 알려져 있고, 주의 상이함에 의해 상기에 예시한 이외의 서열로 되는 유전자도 존재한다.
본 발명에 있어서, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이란, 게놈의 일부를 결실하고 있으므로, 증식하는데에는 결실한 유전자를 상보하는 작용을 갖는 헬퍼 바이러스를 필요로 하고, 또한 헬퍼 바이러스의 증식을 억제하는 간섭성 결손 입자 중, 마이너스가닥 RNA 바이러스에 유래하는 것을 말한다.
마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈은, 게놈 RNA 중에 목적의 외래 유전자를 도입할 수 있다. 외래 유전자는 특별히 제한은 없고, 천연의 단백질 전장, 그의 부분 단편(7 아미노산 이상, 바람직하게는 8, 10, 또는 15 아미노산 이상), 또는 그들과 다른 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드 등을 코드하는 것이어도 된다. 외래 유전자가 도입된 재조합 바이러스 벡터는, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈의 게놈에 상기 유전자를 안티센스로 코드하는 유전자를 삽입함으로써 얻어진다.
미니게놈에 탑재하는 유전자수가 적은(게놈사이즈가 짧은) 쪽이 전사복제효율이 좋다. 본 발명의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈 중의 마이너스가닥 단일가닥 RNA 바이러스를 구성하는 단백질을 전부 결실하는 것이 가장 바람직하나, 복수를 결실하고 있어도 된다.
유전자의 삽입위치는, 예를 들면 바이러스 게놈의 단백질 비코드 영역의 목적으로 하는 부위를 선택할 수 있고, 예를 들면 게놈 RNA의 3' 리더 영역과 3' 말단에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF의 사이, 각 바이러스 단백질 ORF의 사이, 및/또는 5' 말단에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF와 5' 트레일러 영역 사이에 삽입할 수 있다. 또한, 복수의 유전자를 결실하는 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈에서는, 그 결실 영역에 삽입해도 된다. 또한, 파라믹소바이러스과 바이러스 미니게놈에 외래 유전자를 도입하는 경우는, 게놈으로의 삽입 단편의 폴리뉴클레오티드의 쇄장이 6의 배수가 되도록 삽입하는 것이 바람직하다(Kolakofski, D. et al., J. Virol. 1998: 72; 891-899; Calain, P. and Roux, L. J. Virol. 1993: 67; 4822-4830). 삽입한 외래 유전자와 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈 ORF의 사이에는, E-I-S 서열이 구성되도록 한다. E-I-S 서열을 매개로 하여 2 또는 그 이상의 외래 유전자를 직렬로 나란히 늘어서 삽입하는 것도 가능하다.
본 발명의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈은, 하나 또는 복수의 게놈 프로모터를 보유하고 있어도 된다. 본 발명에 있어서, 게놈 프로모터는 특별히 제한되는 것은 아니나, 일례로서 RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 들 수 있다. RNA 폴리머라아제 I를 세포 내에서 발현하는 세포를 생산세포로서 사용하는 경우에는, RNA 폴리머라아제 I를 외래 벡터(헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터)에 의해 공급할 필요가 없어, 그 공급분의 비용이 절약된다. 또한 T7계와 동일하게 유전자의 높은 발현효율을 실현할 수 있다.
외래 유전자의 발현 레벨은, 그 유전자의 상류(마이너스가닥(음성가닥)의 3'측)에 부가하는 전사개시서열의 종류에 따라 조절할 수 있다(WO01/18223). 또한, 게놈 상의 외래 유전자의 삽입위치에 따라 제어할 수 있어, 마이너스가닥의 3'의 가까이에 삽입할수록 발현 레벨이 높고, 5'의 가까이에 삽입할수록 발현 레벨이 낮아진다. 외래 유전자를 고발현시키기 위해서는, 외래 폴리펩티드를 코드하는 유전자는, 효율이 높은 전사개시서열에 연결하고, 마이너스가닥 게놈의 3' 말단 가까이에 삽입하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 3' 리더 영역과 3'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF의 사이에 삽입된다. 또는, 3'에 가장 가까운 바이러스 단백질 유전자와 2번째 바이러스 단백질 유전자의 ORF 사이, 또는 3'에서부터 2번째와 3번째 바이러스 단백질 유전자의 사이에 삽입해도 된다.
외래 유전자를 코드하는 핵산을 게놈에 삽입할 때에 부가하는 S 서열로서는, 예를 들면 마이너스가닥 RNA 바이러스의 목적으로 하는 S 서열을 사용할 수 있으나, 센다이 바이러스라면, 3'-UCCCWVUUWC-5'(W=A 또는 C; V=A, C, 또는 G)(서열번호: 22)의 콘센서스 서열을 적합하게 사용할 수 있다. 특히 3'-UCCCAGUUUC-5'(서열번호: 23), 3'-UCCCACUUAC-5'(서열번호: 24), 및 3'-UCCCACUUUC-5'(서열번호: 25)가 바람직하다. 이들의 서열은, 플러스가닥을 코드하는 DNA 서열로 표시하면 각각 5'-AGGGTCAAAG-3'(서열번호: 26), 5'-AGGGTGAATG-3'(서열번호: 27), 및 5'-AGGGTGAAAG-3'(서열번호: 28)이다. 센다이 바이러스 벡터의 E 서열로서는, 예를 들면 3'-AUUCUUUUU-5'(서열번호: 29)(플러스가닥을 코드하는 DNA에서는 5'-TAAGAAAAA-3'(서열번호: 30))가 바람직하다. I 서열은, 예를 들면 임의의 3 염기여도 되고, 구체적으로는 3'-GAA-5'(플러스가닥 DNA에서는 5'-CTT-3')를 사용하면 된다.
또한, 본 발명의 외래 유전자에는, Tag 서열을 코드하는 염기서열을 부가하고 있어도 된다. Tag 서열을 부가함으로써, 외래 유전자의 기능이 불명확한 경우여도, 외래 유전자의 발현을 확인하는 것이 가능해진다. Tag 서열이 부가되는 위치는 특별히 한정되지 않고, 외래 유전자의 아미노 말단측에 부가되어 있어도 되고, 카르복실 말단측에 부가되어 있어도 된다. Tag 서열의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니나, 일례로서, HA-Tag 서열을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터란, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 증식하기 위해, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 결실된 유전자를 상보하는 작용을 하는, 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터를 나타낸다.
본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터는, 리보핵단백질(RNP) 복합체 또는, 바이러스 유사 입자(VLP)여도 된다.
파라믹소바이러스는, 일반적으로 엔벨로프의 내부에 RNA와 단백질로 되는 복합체(리보핵단백질; RNP)를 포함하고 있다. RNP에 포함되는 RNA는 파라믹소바이러스의 게놈인 (-)가닥(음성가닥)의 단일가닥 RNA이고, 이 단일가닥 RNA가 NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질과 결합하여, RNP를 형성하고 있다. 이 RNP에 포함되는 RNA가 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 위한 주형이 된다(Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae: The viruses and their replication. pp.1177-1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al.(ed.), Raven Press, New York, N. Y.).
본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 바이러스 벡터 중의 마이너스가닥 단일가닥 RNA(게놈 RNA)는, 전형적으로는 NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 발현하고 있는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 또는 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈에 의해, 파라믹소바이러스의 NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질이 발현되어 있으면 된다.
또한, 본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 바이러스 벡터 중의 마이너스가닥 단일가닥 RNA(게놈 RNA)는, F 단백질, M 단백질 및 또는 HN 단백질의 전부 또는 일부를 발현하지 않도록 개변되어 있어도 된다. 파라믹소바이러스의 F 단백질은 숙주세포막으로의 막융합에, HN 단백질은 막접착에 관여하는 단백질이다. M 단백질은 바이러스 입자 구조를 내측에서 유지하는 단백질이다. 본 발명의 바이러스 벡터는, 게놈 RNA로부터 F, M 및 HN 단백질을 발현하지 않으므로, 입자 형성능 및 전파성을 갖지 않는다. 즉 본 발명의 바이러스 벡터로 숙주세포가 감염된 경우, 상기 숙주세포에 있어서 감염성 바이러스 입자를 생산하여 스스로가 감염된 세포의 인접세포로 딸 바이러스(daughter virus)를 침입시키는 것은 불가능하다. 한편, 본 발명의 바이러스 벡터는 감염성 입자를 생산해도 된다. 후술하는 바와 같이, 본 발명의 바이러스 벡터를 재구축할 때 F 단백질, M 단백질 및/또는 HN 단백질을 공발현시키면, 재구축된 바이러스 벡터는 숙주로의 감염성을 갖는다.
본 발명에 있어서는, 이 중 F, HN, 및 M 유전자를 결손하는 게놈을 설계함으로써, 엔벨로프 단백질을 발현하지 않도록 개변할 수 있으나, F 유전자가 결손되어 있는 것이 특히 바람직하다. 또한 벡터의 게놈에 코드되는 NP, P, 및 L 유전자는 바이러스 유래의 유전자 서열 그대로여도 되나, 이들 유전자가 코드하는 단백질이 게놈 RNA와 결합하여, 세포 내에서 RNP의 복제를 행하는 활성을 갖는 한, 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한, 이들 게놈 RNA의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 RNA가 코드하는 폴리펩티드 중 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 폴리펩티드를 코드하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA, 당해 게놈 RNA의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 RNA의 상보가닥과 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA도, 이 RNA 중의 유전자에 의해 코드되는 NP, P, 및 L 단백질이 게놈 RNA와 결합하여, RNP 복제활성을 갖는 한, 본 발명 벡터의 게놈 RNA가 될 수 있다. 이와 같은 변이는, 당업자에 의해 주지의 기술로 행할 수 있다. 예를 들면, PCR법이나 카세트 변이법 등에 의해 부위 특이적으로 변이를 도입하는 것이나, 화학 시약이나 랜덤 뉴클레오티드 등에 의해 랜덤 변이를 도입하는 것이 가능하다. 상기 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건은, 당업자이라면 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 25% 포름아미드, 보다 엄격한 조건에서는 50% 포름아미드, 4×SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10×덴하르트 용액, 20 ㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 하이브리다이제이션 용액 중, 42℃에서 하룻밤 프리하이브리다이제이션을 행한 후, 42℃에서 하룻밤 하이브리다이제이션을 행한다. 그 후의 세정은 「1×SSC, 0.1% SDS, 37℃」정도에서, 보다 엄격한 조건으로서는 「0.5×SSC, 0.1% SDS, 42℃」 정도에서, 더욱 엄격한 조건으로서는 「0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃」 정도의 세정액 및 온도조건에서 실시할 수 있다. 이와 같은 하이브리다이제이션 기술을 이용하여 단리되는 폴리뉴클레오티드가 코드하는 폴리펩티드는, 통상 상기 (-)가닥 RNA가 코드하는 폴리펩티드와 아미노산 서열에 있어서 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란, 적어도 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 97% 이상(예를 들면 98%~99%)의 서열 상동성을 가리킨다. 아미노산 서열의 동일성은, 예를 들면 칼린(Karlin) 및 알취일(Altschul)에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)에 따라 결정할 수 있다. 이 알고리즘을 토대로 하여 개발된 BLASTX(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)에 따라 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Grapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
또한, 본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터는, 5' 말단의 트레일러 영역이 리더 영역으로 치환된, 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는 벡터여도 된다. 5' 말단의 트레일러 영역에 존재하는 안티게놈 프로모터의 게놈 전사복제효율이 3' 말단의 리더 영역에 존재하는 게놈 프로모터보다 높으므로, 5' 말단의 트레일러 영역이 3' 말단의 리더 영역으로 치환되면, 헬퍼 바이러스의 게놈 전사복제효율이 저하하고, 미니게놈과의 경합이 억제되어, 보다 높은 미니게놈 단백발현이 얻어진다(Le Mercier P. et al., J Virol. 2002 76(11): 5492-5502).
또한, 본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터는, P 유전자 및/또는 C 유전자에 변이를 보유하고 있어도 된다. 본 변이는, 마이너스가닥 RNA 바이러스의 세포 장해성(cytotoxicity)을 저하시키는 변이여도 된다. 이와 같은 변이가 발생하는 부위는 특별히 한정되지 않으나, SeV P 단백질 9번째의 Lys(K9), 13번째의 Glu(E13), 17번째의 Glu(E17), 29번째의 Ile(I29), 38번째의 Ser(S38), 39번째의 Glu(E39), 41번째의 Thr(T41), 47번째의 Arg(R47), 48번째의 Ser(S48), 52번째의 Asn(N52), 55번째의 Asn(N55), 56번째의 Thr(T56), 58번째의 Gln(Q58), SeV C 단백질 16번째의 Leu(L16), 17번째의 Lys(K17), 18번째의 Lys(K18), 21번째의 Lys(K21), 22번째의 Leu(L22), 25번째의 Arg(R25), 27번째의 Gln(Q27), 28번째의 Glu(E28), 30번째의 Glu(E30), 35번째의 Met(M35), 36번째의 Leu(L36), 38번째의 Asp(D38), 41번째의 Met(M41), 47번째의 Asn(N47), 48번째의 Gln(Q48), 52번째의 Glu(E52), 55번째의 Glu(E55), 63번째의 Thr(T63), 66번째의 Lys(K66), 또는 68번째의 Gln(Q68) 외의 아미노산으로의 치환을 바람직한 예로서 들 수 있다. 하나의 부위에 있어서 변이가 도입되어도 되고, 또한 복수의 부위에 있어서 변이가 도입되어 있어도 된다. 아미노산 변이는, 목적으로 하는 다른 아미노산으로의 치환이어도 되나, 바람직하게는, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 아미노산으로의 치환이다. 예를 들면 아미노산은, 염기성 아미노산(예를 들면 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들면 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전극성 아미노산(예를 들면 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들면 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 분지 아미노산(예를 들면 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 아미노산(예를 들면 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등의 그룹으로 분류할 수 있으나, 어느 아미노산에 대해서, 그 아미노산이 속하는 그룹의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 것 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 염기성 아미노산이면, 산성 또는 중성 아미노산으로의 치환, 극성 아미노산이면 비극성 아미노산으로의 치환, 20종의 천연 아미노산의 평균 분자량보다 큰 분자량을 갖는 아미노산이면, 그 평균 분자량보다 작은 아미노산으로의 치환, 반대로 그 평균 분자량보다 작은 아미노산이면, 그보다 큰 아미노산으로의 치환 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로는, SeV P 단백질 K9의 Gly로의 치환(K9G), E13의 Gly로의 치환(E13G), E17의 Gly로의 치환(E17G), I29의 Val로의 치환(I29V), S38의 Gly로의 치환(S38G), E39의 Gly로의 치환(E39G), T41의 Ala로의 치환(T41A), R47의 Gly로의 치환(R47G), S48의 Gly로의 치환(S48G), N52의 Ser로의 치환(N52S), N55의 Gly로의 치환(N55G), T56의 Ala로의 치환(T56A), Q58의 Arg로의 치환(Q58R), SeV C 단백질 L16의 Trp로의 변이(L16W), K17의 Gly로의 변이(K17G), K18의 Arg로의 변이(K18R), K21의 Gly로의 변이(K21G), L22의 Trp로의 변이(L22W), R25의 Gly로의 변이(R25G), Q27의 Arg로의 변이(Q27R), E28의 Gly로의 변이(E28G), E30의 Gly로의 변이(E30G), M35의 Thr로의 변이(M35T), L36의 Trp로의 변이(L36W), D38의 Gly로의 변이(D38G), M41의 Thr로의 변이(M41T), N47의 Gly로의 변이(N47G), Q48의 Arg로의 변이(Q48R), E52의 Gly로의 변이(E53G), E55의 Gly로의 변이(E55G), T63의 Ala로의 변이(T63A), K66의 Gly로의 변이(K66G), 또는 Q68의 Arg로의 변이(Q68R) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 L 단백질에 있어서도 변이가 도입되어 있어도 된다. L 단백질의 변이 부위로서는, 1197번째의 Asn(N1197) 및/또는 1795번째의 Lys(K1795) 외의 아미노산으로의 치환, 또는 다른 마이너스가닥 RNA 바이러스 L 단백질의 상동 부위의 치환을 들 수 있다. L 단백질의 이들 2개의 변이 양쪽을 갖는 L 단백질 유전자가 특히 바람직하다. 아미노산 변이는, 역시 목적으로 하는 다른 아미노산으로의 치환이어도 되나, 바람직하게는, 상기와 동일하게, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 아미노산으로의 치환이다. 예를 들면, 상기한 바와 같이 상이한 그룹의 아미노산으로 치환하는 것 등을 들 수 있다. 구체적으로는, N1197의 Ser로의 치환(N1197S), K1795의 Glu로의 치환(K1795E) 등을 예시할 수 있다.
P 유전자와 C 유전자의 변이는 양쪽을 갖고 있음으로써, 지속 감염성, 2차 입자 방출의 억제, 또는 세포 상해성의 억제 효과를 현저히 높일 수 있다. 상기의 F 단백질, HN 단백질 및 M 단백질을 발현하지 않도록 개변된 재조합 마이너스가닥 RNA 바이러스에 상기 변이를 조합함으로써, 이들 효과를 극적으로 상승시킬 수 있다. 특히, P, 및 C 유전자의 양쪽에 변이를 갖는 바이러스가 보다 바람직하다. P 유전자에 상기 개소의 변이를, 추가적으로 C 유전자에 상기의 변이를 갖는 바이러스는 가장 바람직하다.
또한, 본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터는, 하기 (a) 또는 (b)에 기재의 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하고 있어도 된다.
(a) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
(b) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 RNA의 상보가닥과 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
본 발명에 있어서 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건이란, 6 M 요소, 0.4% SDS, 0.5×SSC의 조건 또는 이것과 동등한 스트린젠시의 하이브리다이제이션 조건을 가리킨다. 보다 스트린젠시가 높은 조건, 예를 들면 6 M 요소, 0.4% SDS, 0.1×SSC의 조건을 사용함으로써, 보다 상동성이 높은 DNA의 단리를 기대할 수 있다. 이에 따라 단리된 DNA는 아미노산 레벨에 있어서, 목적 단백질의 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는다고 생각된다. 높은 상동성이란, 아미노산 서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 서열 동일성을 가리킨다. 아미노산 서열이나 염기서열의 동일성은, 칼린(Karlin) 및 알취일(Altschul)에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)를 사용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘을 토대로 한 BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al., J Mol Biol 215: 403, 1990). BLASTN을 사용하여 염기서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예를 들면 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLASTX를 사용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예를 들면 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다.
또한, 본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터는, 야생형 센다이 바이러스 벡터여도 된다.
이하에 있어서, 본 발명 발현계의 각 공정에 대해서 설명한다.
본 발명의 발현계에 있어서는, 제1 공정으로서, 상기의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 생산세포에 도입한다.
본 발명에 있어서는, 상기 공정에 있어서, NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 발현하는 벡터를, 추가적으로 생산세포에 도입해도 된다.
본 발명에 있어서, 「생산세포」로서 바람직하게는, 목적으로 하는 포유동물세포 등을 사용할 수 있으나, 구체적으로는, 예를 들면 원숭이 신장 유래의 LLC-MK2 세포(ATCC CCL-7) 및 CV-1 세포(예를 들면 ATCC CCL-70), 햄스터 신장 유래의 BHK-21 세포(예를 들면 ATCC CCL-10) 등의 배양세포, 인간 유래 세포 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 보다 바람직한 예로서는, BHK-21 세포를 들 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다.
마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈 cDNA를 세포 내에 도입하는 방법에는, 다음과 같은 방법, (i) 목적의 세포를 내재화(internalization)시킬 수 있는 DNA 침전물을 제작하는 방법, (ii) 목적의 세포에 의한 내재화에 적합하고, 또한 세포독성이 적은 양전하 특성을 갖는 DNA를 포함하는 복합체를 제작하는 방법, (iii) 목적의 세포막에, DNA 분자가 빠져나갈 수 있을 만큼 충분한 구멍을 전기 펄스로 순간적으로 뚫는 방법 등이 있다.
(ii)로서는, 각종 트랜스펙션 시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat. No.11668-019), DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Boehringer #1811169) 등을 들 수 있다. (i)로서는 예를 들면 인산칼슘을 사용한 트랜스펙션법을 들 수 있고, 이 방법에 의해 세포 내에 들어간 DNA는 탐식소포(phagocyte)에 삽입되나, 핵 내에도 충분한 양의 DNA가 들어가는 것이 알려져 있다(Graham, F. L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223). 첸(Chen) 및 오카야마(Okayama)는 트랜스퍼 기술의 최적화를 검토하여, 1) 세포를 공침전물의 인큐베이션 조건을 2~4% CO2, 35℃, 15~24시간, 2) DNA는 직쇄상보다 환상의 것이 활성이 높고, 3) 침전 혼액중의 DNA 농도가 20~30 ㎍/㎖일 때 최적의 침전이 얻어진다고 보고하고 있다(Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). (ii)의 방법은 일과적인 트랜스펙션에 적합하다. 이전부터 DEAE-덱스트란(Sigma #D-9885 M.W. 5×105) 혼액을 목적으로 하는 DNA 농도비로 조제하여, 트랜스펙션을 행하는 방법이 알려져 있다. 복합체의 대부분은 엔도솜 중에서 분해되어 버리므로, 효과를 높이기 위해 클로로퀸을 첨가하는 것도 가능하다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). (iii)의 방법은 전기천공법(electroporation method)이라고 불리는 방법으로, 세포 선택성이 없다는 점에서 (i)이나 (ii)의 방법에 비해 범용성이 높다. 효율은 펄스 전류의 지속시간, 펄스의 형태, 전계(전극간의 갭, 전압)의 강도, 버퍼의 도전율, DNA 농도, 세포 밀도의 최적조건하에서 양호하다고 되어 있다.
이상, 3개의 카테고리 중에서 (ii)의 방법은 조작이 간편하고 다량의 세포를 사용하여 다수의 검체를 검토할 수 있으므로, 본 발명에 있어서는, 트랜스펙션 시약이 적합하다. 적합하게는 Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat. No.11668-019), Superfect Transfection Reagent(QIAGEN, Cat No. 301305), 또는 DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169)가 사용된다.
헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터의 재구성은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
회수된 바이러스의 역가(titer)는, 예를 들면 CIU(Cell-Infected Unit) 측정 또는 적혈구 응집활성(HA)을 측정함으로써 결정할 수 있다(WO00/70070; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999). 또한, GFP(녹색 형광 단백질) 등의 마커 유전자를 탑재한 벡터에 대해서는, 마커를 지표로 직접적으로 감염세포를 카운트함으로써 역가를 정량할 수 있다(예를 들면 GFP-CIU로서). 이와 같이 하여 측정한 역가는 CIU와 동등하게 취급할 수 있다(WO00/70070).
본 발명의 발현계에 있어서 T7 RNA 폴리머라아제와 F 단백질(변이형 F5R도 가능)의 발현방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 플라스미드 등으로 일시 발현시키는 방법이나, 생산세포에 T7 RNA 폴리머라아제와 F 단백질(F5R) 지속발현하는 세포를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 생산세포는, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터에 있어서 발현하지 않도록 개변된, F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하고 있어도 된다. 바이러스 게놈 이외에서 공급되는 이들 단백질군은, 그 아미노산 서열은 바이러스 유래의 서열 그대로가 아니어도, 핵산의 도입에 있어서의 활성이 천연형의 그것과 동등하거나 그 이상이면, 변이를 도입하거나, 또는 다른 바이러스의 상동 유전자로 대용해도 된다. 다른 바이러스로서는, 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 G 단백질(VSV-G)을 들 수 있다. 일반적으로, 엔벨로프 단백질은 세포독성을 나타내는 것이 많으므로, 유도성 프로모터의 제어하에 벡터의 재구성시에만 발현시키는 것도 가능하다.
세포 내에서 벡터를 재구성시킬 때에 엔벨로프 단백질을 생산세포에 있어서 발현시키면, 이 엔벨로프 단백질이 미니게놈 바이러스 입자에 삽입되어, 엔벨로프 단백질에 의한 감염성을 보유하는 바이러스 벡터를 생산할 수 있다.
이와 같은 벡터는, 한번 세포를 감염시키면, 세포 내에서 RNP를 증식시키는 것은 가능하더라도, 그 자신은 엔벨로프 유전자를 갖지 않으므로, 처음과 동일한 엔벨로프 단백질을 갖는 바이러스를 재차 생산하는 것은 불가능하다. 이와 같은 벡터는, 특히 유전자 치료 등 높은 안전성이 요구되는 분야에 매우 유용하다.
상기 제1 공정을 행함으로써, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이, 바이러스 재구성되어, 생산세포로부터 방출된다.
구체적으로는, 실시예(도 6)에 나타내는 바와 같이, T7 RNA 폴리머라아제와 SeV의 융합 단백질인 F 단백질(변이형 F5R이어도 가능)이 발현하고 있는 생산세포에 헬퍼 SeV/△F(SeVagp55/△F가 바람직하다)와 목적 외래 유전자(GOI)를 탑재한 SeV 미니게놈 cDNA 플라스미드(pSeVmini/GOI)가 도입되면, T7 RNA 폴리머라아제의 작용으로 MiniSeV/GOI의 RNA 게놈이 pSeVmini/GOI로부터 전사되어, Helper의 역할을 담당하고 있는 SeV/△F로부터 발현하고 있는 NP, P, L 단백질을 이용하여 MiniSeV/GOI의 RNP가 형성, 복제된다. 이 MiniSeV/GOI의 RNP는 Helper SeV/△F로부터 발현한 M, HN과 생산세포로부터 발현한 F/F5R을 이용하고, 감염성 MiniSeV/GOI 입자로서 패키징되어, 감염성 Helper SeV/△F 입자와 함께 배양상청으로 방출된다.
본 발명의 발현계에 있어서는, 제2 공정으로서, 상기 생산세포 내에서 생산된 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자를 회수한다.
회수한 바이러스 입자(바이러스 벡터)는 실질적으로 순수해지도록 정제할 수 있다. 정제방법은 여과(filtration), 원심분리, 흡착, 및 칼럼 정제 등을 포함하는 공지의 정제·분리방법 또는 그의 임의의 조합에 의해 행할 수 있다. 「실질적으로 순수」란, 바이러스 벡터를 포함하는 용액 중에서 바이러스의 성분이 주요한 비율을 차지하는 것을 말한다. 예를 들면, 실질적으로 순수한 바이러스 벡터 조성물은, 용액 중에 포함되는 전 단백질(단, 캐리어나 안정제로서 첨가한 단백질은 제외한다) 중, 바이러스 벡터의 성분으로서 포함되는 단백질의 비율이 10%(중량/중량) 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상을 차지함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면 파라믹소바이러스 벡터인 경우, 구체적인 정제방법으로서는, 셀룰로오스 황산 에스테르 또는 가교 폴리사카라이드 황산 에스테르를 사용하는 방법(일본국 특허공고 소62-30752호 공보, 일본국 특허공고 소62-33879호 공보, 및 일본국 특허공고 소62-30753호 공보), 및 푸코오스 황산 함유 다당 및/또는 그의 분해물에 흡착시키는 방법(WO97/32010) 등을 예시할 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명은 이들 제1 및 제2 공정을 포함하는, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자의 제조방법에 관한 것이다. 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈의 높은 도입능, 목적 유전자의 높은 발현능을 실현하기 위해서는, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 패키징된 바이러스 입자의 방출량을 증가시킬 필요가 있다. 본 발명과 같이, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터로서 SeVagp55△F 등의 개변체를 사용함으로써, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 패키징된 바이러스 입자의 방출량을 향상시킬 수 있다.
또한 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가 패키징된 바이러스 입자의 독성(세포 장해성)을 낮추기 위해서는, 생산세포로부터 방출되는 바이러스 입자의 비율(헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터:마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈)을 동등하게 하는 것이 필요하다(헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터에 대한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈의 수가 많아지는 것이 바람직하다). 본 발명과 같이, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터로서 SeVagp55/(P/C)m/△F 등의 개변체를 사용함으로써, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 패키징된 바이러스 입자의 방출비율을 증가시킬 수 있다.
헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터를 구분하여 사용함으로써, 다양한 목적(도입·발현의 향상, 독성의 저하)을 달성할 수 있다.
본 발명의 발현계에 있어서는, 제3 공정으로서, 상기 제2 공정에서 회수된 바이러스 입자를 표적세포에 도입한다.
본 발명에 있어서 「표적세포」란, 본 발명의 바이러스 입자를 도입함으로써 외래 유전자를 발현시키고자 하는 목적의 세포를 가리킨다.
본 발명에 있어서, 바이러스 입자를 도입하는 표적세포는, 인비트로에 있어서의 표적세포여도 되고, 인비보에 있어서의 표적세포(즉 동물에 있어서 직접 외래 유전자를 발현시킨다)여도 된다. 인비트로에 있어서의 표적세포로서는, 293T 세포, A549 세포, BHK-21 세포, C2C12 세포, HeLa 세포, LLC-MK2 세포, MDCK 세포, 또는 NIH3T3 세포 중 어느 하나를 들 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다.
인비트로에 있어서 바이러스 입자를 표적세포에 도입하는 경우는, 예를 들면 배양액 또는 생리식염수 등 목적하는 생리적 수용액 중에서 표적세포에 바이러스 입자를 감염시킨다. 이때, MOI(다중감염도; 세포 하나당 감염 바이러스수)는 1~1000의 사이로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2~500, 더욱 바람직하게는 3~300, 더욱 바람직하게는 5~100이다. 바이러스 입자와 세포의 접촉은 짧은 시간으로도 충분하고, 예를 들면 1분 이상, 바람직하게는 3분 이상, 5분 이상, 10분 이상, 또는 20분 이상 접촉시키면 되며, 예를 들면 1~60분 정도, 보다 특정하면 5분~30분 정도여도 된다. 물론, 그 이상 시간 접촉시켜도 되고, 예를 들면 수일간 또는 그 이상 접촉시켜도 된다.
바이러스 게놈 RNA를 포함하는 RNP나 비감염성 바이러스 입자(바이러스 유사 입자(VLP))를 세포에 도입하는데는, 주지의 트랜스펙션 방법을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 인산 칼슘(Chen, C. & Okayama, H.(1988) BioTechniques 6:632-638; Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745), DEAE-덱스트란(Rosenthal, N.(1987) Methods Enzymol. 152:704-709), 각종 리포솜 베이스의 트랜스펙션 시약(Sambrook, J. et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)), 일렉트로포레이션(electroporation)(Ausubel, F. et al.(1994) In Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5 및 9) 등, 당업자에게 알려지는 다양한 기술로 세포에 트랜스펙트하는 것이 가능하다. 엔도솜에서의 분해를 억제하기 위해, 트랜스펙션에 있어서 클로로퀸을 첨가하는 것도 가능하다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). 트랜스펙션 시약을 몇 가지 예시하면, DOTMA(Roche), Superfect Transfection Reagent(QIAGEN, Cat No. 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Roche #1811169), TransIT-LT1(Mirus, Product No. MIR 2300), CalPhosTM Mammalian Transfection Kit(Clontech #K2051-1), CLONfectinTM(Clontech #8020-1) 등을 들 수 있다. 엔벨로프 바이러스는 바이러스 입자 형성시에 숙주세포 유래의 단백질을 흡수하는 것이 알려져 있고, 이와 같은 단백질은 세포에 도입했을 때 항원성이나 세포 상해성의 원인이 되는 것으로 생각된다(J. Biol. Chem.(1997) 272, 16578-16584). 따라서, 엔벨로프가 제거된 RNP를 사용하는 것에는 이점이 있다(WO00/70055).
또한, 본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터, 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 표적세포에 도입하고, 세포 내에서 바이러스 RNP를 직접 형성시켜, 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것도 가능하다.
본 발명의 바이러스 입자(또는 바이러스 벡터)가 도입된 세포를 12시간~5일간(바람직하게는 1~3일간) 정도 배양하여, 외래 유전자를 발현시킨다.
인비보에 있어서 바이러스 입자를 표적세포에 도입하는 경우는, 본 발명의 바이러스 입자를 직접 동물에 투여하여, 외래 유전자를 발현시킨다.
상기의 본 발명 바이러스 입자로 감염된 세포(바이러스 입자가 도입된 세포)를, 동물에 투여(엑스비보 투여)해도 된다. 세포는 그대로, 또는 용해하여 용해물(lysate)로서 동물에 접종한다. 벡터 감염세포의 용해물은 계면활성제로 세포막을 용해하는 방법, 동결·융해를 반복하는 방법 등으로 제작할 수 있다. 계면활성제로서는 비이온성의 Triton X-100, Nonidet P-40 등이 0.1~1%의 농도로 사용된다. 예를 들면 PBS로 세정한 후 원심으로 회수한 세포 덩어리를 TNE buffer [25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40]에 재현탁하여 빙상에서 10~30분간 방치함으로써 얻어진다. 항원으로서 사용하는 단백이 세포질에 가용성인 경우는 얻어진 용해물을 원심(10,000×g, 10분)하여 불필요한 불용성 분획을 침전으로서 제거한 후의 상청을 면역에 사용할 수 있다. 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하지 않은 투여부위에 사용하는 용해물은 세정 후 PBS에 재현탁한 세포를 5-6회에 걸쳐 반복 동결·융해하여 파괴함으로써 얻어진다.
접종 루트에 특별히 제한은 없으나, 예를 들면 근육주사(예를 들면 비복근, 피하 투여, 비강 내 투여(점비), 손바닥 또는 발바닥 피내 투여, 비장 직접 투여, 복강 내 투여 등이 적합하다. 접종부위는 1개소 또는 복수개소(예를 들면 2~15개소)여도 된다. 또한 접종량은 질환, 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 투여목적, 투여조성물의 형태, 투여방법, 도입 유전자 등에 따라 상이하나, 당업자이면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 투여시에는, 접종대상동물, 접종부위, 접종횟수 등을 적절히 조정해도 된다. 예를 들면 1개소당 접종량은, 바이러스 역가로 환산하여, 1×104 CIU~5×1011 CIU(cell infectious unit), 바람직하게는 1×106 CIU~1×1010 CIU로 하면 된다. 세포를 매개로 하여 접종(엑스비보 투여)하는 경우는, 예를 들면 동종의 배양 세포주(예를 들면 육종(sarcoma) 세포주)에 본 발명의 바이러스를 감염시키고, 104~109 세포, 바람직하게는 105~108 세포, 또는 그의 용해물을 동물에 접종할 수 있다.
예를 들면, 인간에 있어서는 1회당 투여량은 2×105 CIU~2×1010 CIU가 바람직하고, 투여횟수는 1회 또는 임상상 용인 가능한 부작용의 범위에서 복수회 가능하며, 1일 투여횟수에 대해서도 동일하다. 본 발명의 벡터를 사용하여 제조된 단백질 제제이면, 단백질의 투여량은 예를 들면, 10 ng/㎏~100 ㎍/㎏, 바람직하게는 100 ng/㎏~50 ㎍/㎏, 보다 바람직하게는 1 ㎍/㎏~5 ㎍/㎏의 범위이면 된다. 인간 이외의 동물에 대해서도, 예를 들면 목적의 동물과 인간의 체중비 또는 투여 표적부위의 용적비(예를 들면 평균값)로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물의 투여대상으로서는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 소, 개 등 모든 포유동물이 포함된다.
본 발명의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터, 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈, 이들이 각각 패키징된 바이러스 입자, 이 바이러스 입자가 도입된 세포, 또는 그의 용해물은, 약리학적으로 허용 가능한 목적하는 담체 또는 매체와 조합되어 사용되어도 된다.
약리학적으로 허용되는 목적하는 담체 또는 매체로서는, 예를 들면 멸균수나 생리식염수, 안정제, 부형제, 완충제, 방부제, 계면활성제, 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 계면활성제로서는 비이온 계면활성제를 들 수 있고, 예를 들면 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트 등의 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리테이트, 글리세린 모노스테아레이트 등의 글리세린 지방산 에스테르; 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레이트 등의 폴리글리세린 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라올레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비트 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르; 폴리에틸렌글리콜 디스테아레이트 등의 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬에테르; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸에테르 등의 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬에테르; 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르; 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피자마유; 폴리옥시에틸렌 소르비트 밀랍 등의 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌 라놀린 등의 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아미드 등의 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드 등의 HLB6~18을 갖는 것 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.
또한, 계면활성제로서는 음이온 계면활성제도 들 수 있고, 예를 들면 세틸황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 올레일황산나트륨 등 탄소원자수 10~18의 알킬기를 갖는 알킬 황산염; 폴리옥시에틸렌 라우릴황산나트륨 등의, 에틸렌 옥시드의 평균 부가 몰수가 2~4이고 알킬기의 탄소원자수가 10~18인 폴리옥시에틸렌 알킬에테르황산염; 라우릴설포숙신산 에스테르나트륨 등의, 알킬기의 탄소원자수가 8~18인 알킬설포숙신산 에스테르염; 천연계의 계면활성제, 예를 들면 레시틴, 글리세로인지질; 스핑고미엘린 등의 스핑고 인지질; 탄소원자수 12~18의 지방산의 자당 지방산 에스테르 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 이들 계면활성제 중 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있다. 본 발명의 제제에서 사용하는 바람직한 계면활성제는, 폴리소르베이트 20, 40, 60 또는 80 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이고, 폴리소르베이트 20 및 80이 특히 바람직하다. 또한, 폴록사머(플루로닉 F-68(등록상표) 등)로 대표되는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌글리콜도 바람직하다.
계면활성제의 첨가량은 사용하는 계면활성제의 종류에 따라 상이하나, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80의 경우에서는, 일반적으로는 0.001~100 ㎎/mL이고, 바람직하게는 0.003~50 ㎎/mL이며, 더욱 바람직하게는 0.005~2 ㎎/mL이다.
본 발명에 있어서 완충제로서는 인산, 구연산 완충액, 초산, 말산, 타르타르산, 숙신산, 젖산, 인산칼륨, 글루콘산, 카프르산, 데옥시콜산, 살리실산, 트리에탄올아민, 푸마르산 및, 기타 유기산 등, 또는 탄산 완충액, 트리스 완충액, 히스티딘 완충액, 이미다졸 완충액 등을 들 수 있다.
또한 용액 제제의 분야에서 공지의 수성 완충액에 용해함으로써 용액 제제를 조제해도 된다. 완충액의 농도는 일반적으로는 1~500 mM이고, 바람직하게는 5~100 mM이며, 더욱 바람직하게는 10~20 mM이다.
또한, 본 발명에 있어서는, 그 외의 저분자량의 폴리펩티드, 혈청알부민, 젤라틴이나 면역글로불린 등의 단백질, 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 당 알코올을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서 아미노산으로서는 염기성 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 등, 또는 이들 아미노산의 무기염(바람직하게는 염산염, 인산염의 형태, 즉 인산 아미노산)을 들 수 있다. 유리(free) 아미노산이 사용되는 경우 바람직한 pH 값은, 적당한 생리적으로 허용되는 완충물질, 예를 들면 무기산, 특히 염산, 인산, 황산, 초산, 포름산 또는 이들 염의 첨가에 의해 조정된다. 이 경우, 인산염의 사용은, 특히 안정한 동결건조물이 얻어지는 점에서 특히 유리하다. 조제물이 유기산, 예를 들면 말산, 타르타르산, 구연산, 숙신산, 푸마르산 등을 실질적으로 함유하지 않는 경우 또는 대응하는 음이온(말산 이온, 타르타르산 이온, 구연산 이온, 숙신산 이온, 푸마르산 이온 등)이 존재하지 않는 경우에 특히 유리하다. 바람직한 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘, 또는 오르니틴이다. 추가적으로 산성 아미노산, 예를 들면 글루타민산 및 아스파라긴산, 및 그의 염의 형태(바람직하게는 나트륨염) 또는 중성 아미노산, 예를 들면 이소류신, 류신, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린, 메티오닌, 시스테인, 또는 알라닌, 또는 방향족 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 또는 유도체의 N-아세틸트립토판을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물로서는, 예를 들면 덱스트란, 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 크실로오스, 만노오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 당 알코올로서는, 예를 들면 만니톨, 소르비톨, 이노시톨 등을 들 수 있다.
주사용 수용액으로 하는 경우에는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조제를 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50) 등과 병용해도 된다.
목적에 따라 추가적으로 희석제, 용해 보조제, pH 조정제, 무통화제, 황 함유 환원제, 산화방지제 등을 함유해도 된다.
본 발명에 있어서 황 함유 환원제로서는, 예를 들면 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그의 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 및 탄소원자수 1~7의 티오알칸산 등의 설프히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 산화방지제로서는, 예를 들면 에리소르빈산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 초산토코페롤, L-아스코르브산 및 그의 염, L-아스코르브산 팔미테이트, L-아스코르브산 스테아레이트, 아황산 수소나트륨, 아황산나트륨, 몰식자산 트리아밀, 몰식자산 프로필 또는 에틸렌디아민 사초산 이나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
또한, 필요에 따라 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입하거나, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980 등 참조). 추가적으로, 약제를 서방성(徐放性) 약제로 하는 방법도 공지로, 본 발명에 적용할 수 있다(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; 미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허출원 공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP 제133,988호).
사용되는 약리학적으로 허용 가능한 목적하는 담체 또는 매체는, 사용방법에 따라 상기 중에서 적절히 또는 조합해서 선택되나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
외래 유전자로서 질환의 치료용 유전자를 사용하여 바이러스 입자를 조제하면, 이 바이러스 입자를 투여하여 유전자 치료를 행하는 것이 가능해진다. 본 발명의 바이러스 입자의 유전자 치료로의 응용으로서는, 직접투여에 의한 유전자 발현, 간접(ex vivo)투여에 의한 유전자 발현 중 어느 방법에 의해서도, 치료효과를 기대할 수 있는 외래 유전자 또는 환자의 체내에서 공급이 부족한 내재 유전자 등을 발현시키는 것이 가능하다. 외래 유전자로서는 특별히 제한은 없고, 단백질을 코드하는 핵산에 더하여, 예를 들면 안티센스 또는 리보자임 등의 단백질을 코드하지 않는 핵산이어도 된다.
외래 유전자로서, 감염증에 관한 세균 또는 바이러스의 항원을 코드하는 유전자를 사용하면, 이것을 동물에 투여함으로써, 이 동물에 있어서 면역을 유도할 수 있다. 즉, 백신으로서 이용할 수 있다.
백신으로서 사용하는 경우, 예를 들면 종양, 감염증, 및 그 외의 일반적인 질환에 대해 본 발명의 바이러스 입자를 적용하는 것이 생각된다. 예를 들면 종양치료로서는, 종양세포, 또는 DC 세포 등의 항원 제시세포(APC)에 본 발명의 벡터를 사용하여 치료효과를 갖는 유전자를 발현시킬 수 있다. 이와 같은 유전자로서는, 암항원 Muc-1 또는 Muc-1 유사 뮤신 탠덤 리피트 펩티드(Muc-1-like mucin tandem repeat peptide)(미국 특허 제5,744,144호), 흑색종 gp100 항원 등을 들 수 있다. 이와 같은 유전자에 의한 치료는 유방암, 결장암, 췌장암, 전립선암, 폐암 등, 폭넓은 응용이 나타내어져 있다. 또한, 애쥬번트 효과를 높이는 사이토카인류를 조합하는 것도 유효하다. 이와 같은 유전자로서는, 예를 들면 i) IL-2와 단일가닥 IL-12의 조합(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15): 8591-8596, 1999), ii) IL-2와 인터페론-γ(미국 특허 제5,798,100호), iii) 단독으로 사용되는 과립구 콜로니 자극인자(GM-CSF), iv) 뇌종양을 치료대상으로 한 GM-CSF와 IL-4의 조합(J. Neurosurgery 90(6), 1115-1124(1999)) 등을 들 수 있다.
감염증의 치료로서는, 인플루엔자에 있어서는, 예를 들면 강독주(强毒株) H5N1형 엔벨로프, 일본뇌염에 있어서는, 예를 들면 엔벨로프 키메라(Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882(1999)), 에이즈에 있어서는, 예를 들면 HIV gag 또는 SIV gag 단백질(J. Immunology(2000) vol. 164, 4968-4978), HIV 엔벨로프 단백질의 경구투여에 의한 백신치료, 폴리젖산-글리콜 공중합체 코팅에 의한 투여(Kaneko, H. et al., Virology 267: 8-16(2000)), 콜레라에 있어서는, 예를 들면 콜레라독소의 B 서브유닛(CTB)(Arakawa T, et al., Nature Biotechnology(1998) 16(10): 934-8; Arakawa T, et al., Nature Biotechnology(1998) 16(3): 292-7);, 광견병에 있어서는, 예를 들면 광견병 바이러스의 당단백(Lodmell, D. L. et al., 1998, Nature Medicine 4(8): 949-52), 자궁경부암에 있어서는, 인간 유두종바이러스 6형의 캡시드 단백 L1(J. Med. Virol., 60, 200-204(2000)) 등을 들 수 있다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서에 포함된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명은 이들 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 헬퍼 SeV의 cDNA 구축
1.1 pSeVagp55/△F의 구축
도 1에 나타낸 바와 같이, 먼저 pSeV(TDK)를 제한효소 Kas I와 Fse I로 처리, 정제한 SeV 트레일러 서열(genome 5' promoter)을 포함하는 단편을 주형(Template)으로 하여, 프라이머 agp55-1F(5'-caggtttgaggatattatacatag, 24 mer(서열번호: 1))와 agp55-1R(5'-caggattttagtttttcttactattgtc, 28 mer(서열번호: 2))을 사용한 PCR로 단편(Fragment) 1이 얻어지고, 프라이머 agp55-3F(5'-ctcttgtttggtgggtcggcatggcatctc, 30 mer(서열번호: 3))와 agp55-3R(5'-ttagctcactcattaggcaccccag, 25 mer(서열번호: 4))을 사용한 PCR로 단편 3이 얻어졌다. 또한, pSeV(TDK)를 제한효소 Kas I와 Not I로 처리, 정제한 SeV 리더 서열(genome 3' promoter)을 포함하는 단편을 주형으로 하여, 프라이머 agp55-2F(5'-gtaagaaaaactaaaatcctgtataacttc, 30 mer(서열번호: 5))와 agp55-2R(5'-gccgacccaccaaacaagagaaaaaacatg, 30 mer(서열번호: 6))을 사용한 PCR로 단편 2가 얻어졌다. 다음으로, 단편 1, 2, 3을 주형으로 하여, 프라이머 agp55-1F와 agp55-3R을 사용한 PCR로 Sac II와 Mlu I 제한효소 사이트를 포함하는 단편이 얻어졌다. 마지막으로, 이 단편을 Sac II와 Mlu I로 처리, 정제한 후, 동일하게 Sac II와 Mlu I로 처리하고, SeV 트레일러 서열을 포함하는 단편을 제거한 pSeV/△F 벡터에 인서트로서 삽입하여, pSeVagp55/△F(서열번호: 7)가 얻어졌다. 상기에 있어서, agp55란 리더-리더 타입(트레일러를 리더로 교체한 것)인 것을, △F는 F 유전자가 결손되어 있는 것을 나타낸다.
1.2 pSeVagp55/(P/C)m/△F의 구축
도 2에 나타낸 바와 같이, SeV/4C(-)/w를 한외희석법으로 바이러스 클로닝을 행하여, 각 클론으로부터 RNA 게놈을 추출하고, RT-PCR을 행하여, 게놈 서열을 조사한 결과, P/C 유전자에 다수의 변이가 있는 클론 4가 얻어졌다. 이 클론 4의 RNA 게놈을 주형으로 하여, 프라이머 SeVF619(5'-atgggtatcctgcatgcctaggag, 24 mer(서열번호: 8))와 SeVR2111(5'-atcgattatcttgggtcgacg, 21 mer(서열번호: 9))을 사용한 PCR에 의해 양쪽 말단에 Sph I와 Sal I 제한효소 사이트를 갖는 단편(서열번호: 10)이 얻어졌다. 이 단편을 Sph I와 Sal I로 처리, 정제하고, 인서트로서 pSeVagp55/△F 벡터에 대응하는 양쪽 말단에 Sph I와 Sal I 제한효소 사이트를 포함하는 서열과 교체하여, pSeVagp55/(P/C)m/△F가 얻어졌다. 상기에 있어서, (P/C)m이란 P 유전자 및/또는 C 유전자에 변이가 도입되어 있는 것을 나타낸다. pSeVagp55/(P/C)m/△F의 전장 서열을 서열번호: 11에 나타낸다.
[실시예 2] Helper SeV의 조제(SeV/△F, SeVagp55/△F, SeVagp55/(P/C)m/△F)
2.1 준비
1) 세포: 전날~8e5 BHK-21 cells/well(6-well plate)
2) 20% FBS/opti-MEM[Cat No. 31985-070, Lot No. 1183337, Invitrogen사](P&S 무첨가)
3) opti-MEM(원액)
2.2 트랜스펙션 용액 준비
1) DNA 용액
1 well
opti-MEM(무첨가 원액) 250 μL
pCAGGS-NP(Z), 1 ㎍/μL 0.5 μL
pCAGGS-P(Z)/4C(-), 1 ㎍/μL 0.5 μL
pCAGGS-L(TDK), 1 ㎍/μL 2.0 μL
pCAGGS-F5R, 1 ㎍/μL 0.5 μL
pCAGGS-T7, 1 ㎍/μL 0.5 μL
SeV cDNA, 1 ㎍/μL 5 μL
2) LipofectAMINE 2000 reagent[Cat No. 11668-019, Lot No. 1188609, Invitrogen사] 용액
1 well
opti-MEM(무첨가 원액) 250 μL
LipofectAMINE 2000 18 μL
3) 2)의 용액을 준비한 5분 후에, 1)의 용액과 혼합, RT에서 20-30분 방치.
2.3 opti-MEM(원액)으로 1회 세정, 0.5 mL/well의 20% FBS/opti-MEM을 첨가한 후, 상기 트랜스펙션 용액을 0.5 mL/well 세포로 첨가한다.
2.4 37℃에서 6시간 후, 1 mL/well 10% FBS/G-MEM을 첨가한다. 다음날, VP-SFM으로 1회 세정한 후, 5 ㎍/mL 트립신/VP-SFM을 첨가하여 배양한다. 3일째의 상청(P0 바이러스 용액)을 회수하고, 신선한 LLC-MK2/F/Ad 세포에 감염시킨다(P0에서 P1으로 바이러스 계대). 이후, LLC-MK2/F/Ad 세포를 사용하여 바이러스를 생산한다. P1 이후의 상청을 CIU Assay로 바이러스의 타이터를 조사한다.
[실시예 3] SeV 미니게놈의 디자인과 cDNA 구축
3.1 SeV 미니게놈의 디자인
도 3에 나타낸 바와 같이, 통상의 단일 프로모터(GP)를 갖는 SeVminiSP/GOI와 이중 프로모터(GP58A-GPd12)를 갖는 SeVminiDP/GOI, 2종류의 미니게놈을 디자인하였다(참고문헌: Nature of a paramyxovirus replication promoter influences a nearby transcription signal, Diane Vullienoz et al, Journal of General Virology, p171-180, v86, 2005).
3.2 SeV 단일 프로모터(SP) 미니게놈 cDNA의 구축
도 4A에 나타낸 바와 같이, 시판 GFP 플라스미드를 주형으로 하여, 프라이머 Not I-GFP-N(5'-agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg, 50 mer(서열번호: 12))과 GFP-Sac II-C(5'-caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacagctcgtccatg, 65 mer(서열번호: 13))를 사용한 PCR로 얻어진 Not I-GFP-Sac II 단편을 Not I와 Sac II로 처리, 정제하고, GFP 인서트로서, 동일하게 Not I와 Sac II로 처리, NP, P, L, M, F, HN 서열을 포함하는 단편을 제거한 pSeV(TDK) 벡터(Not I와 Sac II 사이트를 포함한다. 437~670 위치는 MiniSeV 게놈 서열을 나타낸다. 서열번호: 14, 일본국 특허공개 제2002-272465)에 삽입하여, pMiniSeVSP/GFP가 얻어졌다.
MiniSeVSP/GFP 게놈 서열을 서열번호: 15에 나타낸다. 또한, 1~137 위치 및 858~996 위치는 MiniSeV 게놈 서열, 138~857 위치는 탑재한 GFP의 ORF 서열을 나타낸다.
도 4B에 나타낸 바와 같이, GFP 이외의 다른 목적 유전자(GOI)를 탑재한 SeV 미니게놈 cDNA를 구축하는 경우, 프라이머 Not I-GOI-N과 GOI-Sac II-C를 사용한 PCR로 GOI의 양측에 Not I와 Sac II 제한효소 사이트를 붙여, pMiniSeVSP/GFP의 Not I-GFP-Sac II 서열과 교체함으로써 간단히 제작할 수 있다.
프라이머 Not I-GOI-N의 서열은 「5'-agttcacgcggccgcagatcttcacg(서열번호: 16)+GOI ORF의 개시 코돈을 포함하는 최초의 18~24 센스 서열」이 되도록, 또한 프라이머 GOI-Sac II-C는 「5'-caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaa(서열번호: 17)+링커+GOI ORF의 종지 코돈을 포함하는 최후의 18~24 안티센스 서열, 링커가 0~2 염기이고 게놈 총 염기수가 6의 배수가 되도록 조정」되도록 설계한다.
3.3 SeV 이중 프로모터(DP) 미니게놈 cDNA의 구축
도 5A에 나타낸 바와 같이, pMiniSeVSP/GFP를 주형으로 하여 프라이머 224N(5'-ataccgcatcaggcgccattcg, 22 mer(서열번호: 18))과 (GP58A-GPd12)R(5'-gttttttagggtctggaacctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg, 57 mer(서열번호: 19))을 사용한 PCR로 얻어진 단편과, 프라이머 (GP58A-GPd12)F(5'-ggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatg, 34 mer(서열번호: 20))와 GFP-Sac II-C(서열 상기 참조)를 사용한 PCR로 얻어진 단편을 정제한 후, 주형으로 하여, 프라이머 224N과 GFP-Sac II-C를 사용한 PCR로 얻어진 단편을 Kas I와 Sal I로 처리, 정제하고, 인서트로서, 동일하게 Kas I와 Sal I로 처리하여 단일 프로모터를 포함하는 서열을 제거한 pMiniSeVSP/GFP 벡터에 삽입하여, pMiniSeVDP/GFP가 얻어졌다. pMiniSeVDP/GFP의 서열을, 서열번호: 21에 나타낸다. 또한, 437~1516 위치는 MiniSeV 게놈 서열, 그 중 658~1377 위치는 탑재한 GFP의 ORF 서열을 나타낸다.
도 5B에 나타낸 바와 같이, GFP 이외의 다른 목적 유전자(GOI)를 탑재한 SeV 미니게놈 cDNA를 구축하는 경우, 프라이머 Not I-GOI-N과 GOI-Sac II-C(설계방법은 상기 참조)를 사용한 PCR로 GOI의 양측에 Not I와 Sac II 제한효소 사이트를 붙여, pMiniSeVDP/GFP의 Not I-GFP-Sac II 서열과 교체함으로써 간단히 제작할 수 있다.
[실시예 4] MiniSeV-SeV/△F 입자 공존 단백질 발현계의 구조
도 6에 나타낸 바와 같이, T7 RNA 폴리머라아제와 SeV의 융합 단백질인 F 단백질(변이형 F5R도 가능)이 발현하고 있는 생산세포에 Helper SeV/△F(SeV/agp55/△F가 바람직하다)와 목적 유전자(GOI)를 탑재한 SeV 미니게놈 cDNA 플라스미드(pSeVmini/GOI)가 도입되면, T7 RNA 폴리머라아제의 작용으로 MiniSeV/GOI의 RNA 게놈이 pSeVmini/GOI로부터 전사되고, 헬퍼의 역할을 담당하고 있는 SeV/△F로부터 발현하고 있는 NP, P, L 단백질을 이용하여 MiniSeV/GOI의 RNP가 형성, 복제된다. 생산세포는 BHK-21 세포가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. T7 RNA 폴리머라아제와 F/F5R의 발현방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 플라스미드 등으로 일시 발현시키는 방법이나 T7 RNA 폴리머라아제와 F/F5R 지속발현세포를 사용하는 방 법 등을 들 수 있다. T7 RNA 폴리머라아제와 F/F5R 양 단백 지속발현세포가 바람직하나, 어느 한쪽을 단독 발현하는 세포여도 된다. 이 MiniSeV/GOI의 RNP는 Helper SeV/△F로부터 발현한 M, HN과 생산세포로부터 발현한 F/F5R을 이용하여, 감염성 MiniSeV/GOI 입자로서 포장되고, 감염성 Helper SeV/△F 입자와 함께 배양상청으로 방출된다. 이 감염성 MiniSeV/GOI와 Helper SeV/△F 입자가 공존한 배양상청을 회수하고, 목적세포로 감염시키면, Helper SeV/△F의 전사 복제 시스템(NP, P, L 단백질)을 이용하여 MiniSeV/GOI에 탑재한 목적 유전자 GOI가 발현된다
Helper SeV는 여기서 SeV/△F를 예로서 나타내었으나, 이에 한정되지 않고, SeV의 구성 단백질 NP, P, L, M, F, HN 중 임의의 하나 또는 복수를 결손한 타입이어도 되나, 이들 결손한 단백질이 생산세포로부터 별도 발현할 필요가 있다.
[실시예 5] Helper SeV/△F 디자인에 의한 MiniSeV-SeV/△F 공존 입자 생산성으로의 영향
전날, 3e5 cells/well(12-well collagen-coated plate, IWAKI)로 파종한 BHK/T7/Ad(T7 RNA 폴리머라아제 지속발현세포)로 SeV/△F와 SeVagp55/△F(SeV 게놈의 5'측 55 염기서열을 3'측 55 염기의 안티센스 서열로 교환한 리더/리더 타입)를 moi 10으로 감염 1시간 후, pCAGGS/F5R(1 ㎍/well)과 pMiniSeVSP/GFP(2 ㎍/well)를 도입하였다(도입 시약: Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2 μL/㎍). 배양(10% FBS/G-MEM 배지) 2일째, 무혈청 배지 VP-SFM으로 1회 세정한 후, 5 ㎍/mL 트립신을 첨가한 VP-SFM에 배지 교환하고, 4일째의 배양상청을 회수하였 다. 4일까지 매일 GFP 사진을 촬영하였다(도 7A). 상기 회수한 배양상청을 100 μL/well로 LLC-MK2 세포(6-well plate)로 감염시켜, 2일째 GFP 사진을 촬영하였다(도 7B).
도 7A에 나타낸 바와 같이, SeVagp55/△F를 Helper SeV로 한 경우의 쪽이, 통상의 SeV/△F에 비해, 미니게놈에 의한 단백질의 발현효율(GFP 발현세포의 비율)이 높았다. 또한, 도 7B에 나타낸 GFP 발현세포수는 생산된 공존 입자 중의 MiniSeV의 양을 나타내고 있으나, SeVagp55/△F를 사용한 공존 입자의 생산성이 SeV/△F보다 훨씬 높았다.
[실시예 6] MiniSeV cDNA 디자인에 의한 MiniSeV-SeV/△F 공존 입자 생산성으로의 영향
전날, 3e5 cells/well(12-well collagen-coated plate, IWAKI)로 파종한 BHK/T7/Ad(T7 RNA 폴리머라아제 지속발현세포)로 SeVagp55/△F를 moi 10으로 감염 1시간 후, pCAGGS/F5R(1 ㎍/well)과 미니게놈 cDNA(2 ㎍/well)를 도입하였다(도입 시약: Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2 μL/㎍). 여기서 MiniSeV cDNA로서는, pMiniSeVSP/GFP, pMiniSeVDP/GFP의 2종류를 사용하였다. 배양(10% FBS/G-MEM 배지) 2일째, 무혈청 배지 VP-SFM으로 1회 세정한 후, 5 ㎍/㎖ 트립신을 첨가한 VP-SFM에 배지 교환하고, 4일째의 배양상청을 회수하였다. 4일까지 매일 GFP 사진을 촬영하였다(도 8A). 상기 회수한 배양상청을 사용하여, CIU Assay를 행하였다(도 8B). 구체적으로는, 샘플을 10배씩 희석하고, 100 μL/well로 6-well plate의 LLC-MK2 세포로 1시간 감염시킨 후, 무혈청 배지에서 배양한 2일째에 GFP 발현세포수를 카운트하고, MiniSeV 타이터로서 계측하였다. 또한, Anti-SeV 항체 DN2를 사용하여 항체염색을 행하고, DN2-양성 세포수를 카운트하여, 헬퍼 SeV 타이터로서 계측하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, SP와 DP 디자인 양쪽에 있어서 높은 GFP 발현효율이 얻어졌으나, DP 디자인에 있어서, 보다 높은 MiniSeV 생산성(GFP-CIU) 및 낮은 헬퍼 SeV/MiniSeV 양비가 얻어졌다.
[실시예 7] SeVagp55/△F와 SeVagp55/(P/C)m/△F를 사용한 공존 입자 생산성의 비교
전날 3e5 cells/well(12-well collagen-coated plate, IWAKI)로 파종한 BHK/T7/Ad(T7 RNA 폴리머라아제 지속발현세포)로 SeVagp55/△F와 SeVagp55/(P/C)m/△F를 moi 1, 3, 10으로 1시간 감염시킨 후, pCAGGS/F5R(1 ㎍/well)과 pMiniSeVDP/GFP(2 ㎍/well)를 도입하였다(도입 시약: Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2 μL/㎍). 배양(10% FBS/G-MEM 배지) 2일째, 무혈청 배지 VP-SFM으로 1회 세정한 후, 5 ㎍/mL 트립신을 첨가한 VP-SFM에 배지 교환하고, 4일째의 배양상청을 회수하였다. 4일까지 매일 GFP 사진을 촬영하였다(도 9A). 상기 회수한 배양상청을 100 μL/well로 LLC-MK2 세포(6-well plate)로 감염시키고, 2일째에 GFP 사진을 촬영하였다(도 9B). 또한, 상기 회수한 배양상청을 사용하여, CIU Assay를 행하였다(도 9C).
도 9에 나타낸 바와 같이, SeVagp55/△F를 Helper SeV로서 공존 입자를 생산한 경우, 보다 높은 MiniSeV 생산성이 얻어졌으나, Helper SeV/MiniSeV의 양비(~10배)도 높았다. 한편, SeVagp55/(P/C)m/△F를 사용하여 공존 입자를 생산한 경우는, 비교적 낮은 MiniSeV 생산성이었으나, Helper SeV/MiniSeV의 양비(약 1:1)가 매우 낮았다. 목적에 따라 이 2종류 Helper SeV를 구분하여 사용하는 것이 가능하다.
[실시예 8] Helper SeV/MiniSeV 양비의 개선
전날 8e5 cells/well(6-well collagen-coated plate, IWAKI)로 파종한 BHK-21 세포로 SeVagp55/△F를 moi 0.5, 1, 2로 1시간 감염시킨 후, 「pCAGGS/T7(1 ㎍/well), pCAGGS/F5R(4 ㎍/well) 및 pMiniSeVDP/GFP(5 ㎍/well)」 또는 「pCAGGS/NP, P, L(0.5, 0.5, 2 ㎍/well), pCAGGS/T7(1 ㎍/well), pCAGGS/F5R(4 ㎍/well) 및 pMiniSeVDP/GFP(5 ㎍/well)」를 도입하였다(도입 시약: Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2 ㎕/㎍). 또한, 상기 2조건 플라스미드를 도입한 6시간 후의 BHK-21 세포로 SeVagp55/△F를 moi 0.5, 1, 2로 감염을 행하였다. 배양(10% FBS/G-MEM 배지) 1일째, 무혈청 배지 VP-SFM으로 1회 세정한 후, 5 ㎍/mL 트립신을 첨가한 VP-SFM에 배지 교환하고, 3일째 GFP 사진을 촬영하여(도 10A), 배양상청을 회수하였다. 상기 회수한 배양상청을 사용하여 CIU Assay를 행하였다(도 10B).
도 10에 나타낸 바와 같이, MiniSeV cDNA를 도입할 때에 NP, P, L 발현하는 플라스미드를 함께 도입하면, 생산된 공존 입자 중의 MiniSeV의 양에 큰 변화는 없 었으나, Helper SeV/MiniSeV의 양비가 저하하는 경향이 보여졌다.
[실시예 9] 공존 입자에 의한 인비트로 발현
24-well collagen-coated plate에서 ~90% 컨플루언트가 되도록 배양한 293T, A549, BHK-21, C2C12, HeLa, LLC-MK2, MDCK, NIH3T3 세포로 MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/△F 공존 입자(2e6 GFP-CIU/mL, 7.7e6 DN2-CIU/mL)를 MOI 3으로 감염시킨 후, 32℃에서 배양하였다. 2일째에 GFP 사진을 촬영하였다(도 11).
도 11에 나타낸 바와 같이, MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/△F 공존 입자에 의해, 검토한 8종류 세포 전체에 있어서 높은 GFP 도입, 발현효율이 얻어졌다.
[실시예 10] 공존 입자에 의한 인비보 발현
MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/△F 공존 입자를 사용하여 (5e6 GFP-CIU/head)마우스(n=3)로의 비강 내 투여를 행하였다. 대조로서 동량 SeV18+GFP/△F를 투여하였다. 2일째 해부, 비강을 적출하여, GFP 사진을 촬영하였다(도 12).
도 12에 나타낸 바와 같이, MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/△F 공존 입자를 사용하여 높은 인비보 발현(비강 내 GFP 발현)이 얻어졌다.
[실시예 11]
12-well collagen-coated plate에서 ~90% 컨플루언트가 되도록 배양한 BHK-21, HeLa 세포로 Helper-SeV로서의 SeVagp55/T7/△F 감염성 입자를 moi 20으로 1시간 감염시킨 후, MiniSeVDP/GFP cDNA 플라스미드를 Lipofectamine 2000 시 약[Lipofectamine 2000/DNA=2.0 (μL/㎍), 2 ㎍ DNA/well]으로 도입하고, 2일째에서 GFP 사진을 촬영하였다(도 13).
도 13에 나타내는 바와 같이, MiniSeVDP/GFP의 cDNA 플라스미드와 SeVagp55/T7/△F 감염성 입자를 표적세포로 도입함으로써, 높은 미니게놈 단백발현효율이 얻어졌다.
[실시예 12] RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 사용한 공존 입자계
SeV 벡터는 T7 프로모터를 사용하고 있으므로, 바이러스를 재구축할 때에 T7 폴리머라아제를 공급할 필요가 있다. 상기 실시예에 있어서의 공존 입자 생산시에도, 미니게놈 cDNA를 생산세포로 도입하는 동시에 T7 폴리머라아제 발현 플라스미드도 함께 도입하는 방법, 또는 T7 폴리머라아제 유전자를 탑재한 Helper-SeV를 사용하는 방법으로, T7 폴리머라아제를 공급해야만 한다. 전자의 방법의 경우, 도입하는 플라스미드의 종류가 많아, 생산 비용과 생산효율에 있어서 마이너스 영향을 줄 우려가 있다. 또한, 후자의 방법의 경우, Helper-SeV가 T7 폴리머라아제를, MiniSeV에 탑재한 목적 유전자(GOI)와 항상 동시에 발현하므로, 단백기능의 해석에 마이너스 영향을 줄 가능성이 있다. 이들 문제를 회피하기 위해, T7 프로모터 대신에 RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 사용한 공존 입자계를 검토하였다.
12.1 RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 사용한 미니게놈 cDNA 플라스미드의 구축
도 14에 나타낸 바와 같이, pMpolBDV 플라스미드를 주형으로 하여, 프라이머 Apa I/polmPr-F(5'-gtacgggcccgtacgtctgaggccgagggaaag, 33 mer(서열번호: 31))와 polmPr/GP-R(5'-ctcttgtttggtacctatctccaggtccaatagg, 34 mer(서열번호: 32))을 사용한 PCR로 Apa I-polmPr 단편이 얻어졌다. 또한, pMiniSeVDP/GFP를 주형으로 하여, 프라이머 polmPr/GP-F(5'-gacctggagataggtaccaaacaagagaaaaaac, 34 mer(서열번호: 33))와 MiniDP/Not I-R(5’-gactagcggccgcgtgaactttggcag, 27 mer(서열번호: 34))을 사용한 PCR로 DP-Not I 단편이 얻어졌다. 다음으로, Apa I-polmPr 단편과 DP-Not I 단편을 주형으로 하여, 프라이머 Apa I/polmPr-F와 MiniDP/Not I-R을 사용한 PCR로 얻어진 Apa I-polmDP-Not I 단편을, Apa I/Not I에 의해 처리하고, 정제하였다. 정제 후의 단편을, 동일하게 Apa I/Not I 처리하고, Apa I로부터 Not I까지의 단편을 제거한 pMiniSeVDP/GFP에 삽입하여, pMiniSeVDPpolm/GFP를 얻었다.
GFP 유전자의 사이즈는 0.7 kb로 비교적 짧아, 보다 긴 사이즈의 유전자 공존 입자 생산성을 검토하기 위해, GFP와 루시페라아제의 융합 단백(GFP-Luci, 2.3 kb)을 모델로서 구축하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, pMiniSeVDP/GFP를 주형으로 하여, 프라이머 GFP-Not I-F(5'-atatgcggccgcaatggtgagcaagggcgaggag, 34 mer(서열번호: 35))와 GFP-Luci3m-R(5'-tggcgtcttccttgtacagctcgtccatgccg, 32 mer(서열번호: 36))을 사용한 PCR로 Not I-GFP 단편이 얻어졌다. 또한, pSeV18+Luci3m/△F를 주형으로 하여, 프라이머 GFP-Luci3m-F(5'-acgagctgtacaaggaagacgccaaaaacataaag, 35 mer(서열번호: 37))와 Luci3m-Not I-R(5'-atatgcggccgcttacacggcgatctttccgc, 32 mer(서열번호: 38))을 사용한 PCR로 Luci3m-Not I 단편이 얻어졌다. 다음으로, Not I-GFP 단편과 Luci3m-Not I 단편을 주형으로 하여, 프라이머 GFP-Not I/Luci3m-Not I를 사용한 overlap PCR로 얻어진 Not I-GFP-Luci-Not I 단편을 Not I 처리하고, 인서트로서 조제하였다. pMiniSeVDPpolm/GFP를 주형으로 하여, 프라이머 MiniDP/Not I-F(5'-tcacgcggccgctagtccctatcgtgcagaacg, 33 mer(서열번호: 39))와 MiniDP/Not I-R(5'-gactagcggccgcgtgaactttggcag, 27 mer(서열번호: 40))을 사용한 PCR로 얻어진 Not I-MiniSeVDPpolm-Not I 단편을 Not I 처리하고, 벡터로서 조제하였다. 추가적으로, GFP-Luci 인서트(2384 nt(서열번호: 41))를 MiniSeVDP 벡터에 삽입하여, pMiniSeVDPpolm/GFP-Luci를 얻었다.
12.2 RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 사용한 공존 입자의 생산
전날 1e6 cells/well(6-well collagen-coated plate, IWAKI)로 파종한 BHK-21 세포로 SeVagp55/△F를 moi 10으로 1시간 감염시킨 후, 「pCAGGS/F5R(5 ㎍/well) 및 pMiniSeVDPpolm/GFP(5 ㎍/well)」를 도입하였다(도입 시약: Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2 ㎕/㎍). 또한, 「pCAGGS/NP, P, L(0.5, 0.5, 2 ㎍/well), pCAGGS/F5R(4 ㎍/well) 및 pMiniSeVDPpolm/GFP-Luci(5 ㎍/well)」를 도입하였다(도입 시약: Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=1.5 ㎕/㎍). 다음날 SeVagp55/△F를 moi 10으로 감염을 행하였다. 배양(10% FBS/G-MEM 배지) 1일째, 무혈청 배지 VP-SFM으로 1회 세정한 후, 3 ㎍/㎖ 트립신을 첨가한 VP-SFM에 배지 교환하고, 이후 매일 배지 교환 및 GFP 사진을 촬영하며, Day 4 배양상청을 사용하여 CIU Assay를 행하였다(도 16).
도 16에 나타낸 바와 같이, 사이즈가 짧은 유전자(GFP, 0.7 kb)와 긴 유전 자(GFP-Luci, 2.3 kb) 양쪽에 있어서, 1e7 GFP-CIU/㎖ 이상의 MiniSeV를 포함하는 공존 입자가 생산되어, RNA 폴리머라아제 I 프로모터를 사용해도 공존 입자의 높은 생산성이 얻어진다는 것을 확인하였다.
[실시예 13] HA-Tag 부착 유전자를 탑재한 공존 입자계
GFP 등 마커 유전자나 면역염색 가능한 항체를 코드하는 유전자를, 본 발명의 공존 입자계에 탑재한 경우에는, 공존 입자 중 MiniSeV의 타이터를 용이하게 측정할 수 있다. 그러나, 성능이 불명확한 유전자를 탑재한 경우 또는 면역염색 가능한 항체를 코드하는 유전자를 탑재하지 않은 경우에는, 공존 입자 중 MiniSeV의 타이터를 측정하는 것은 곤란하다. 이 문제를 해결하기 위해, HA-Tag 부착 유전자(GFP)를 탑재한 공존 입자계를 검토하였다.
13.1 HA-Tag 부착 유전자(GFP) 탑재 미니게놈 cDNA의 구축
도 15에 나타낸 바와 같이, GFP의 N 말단에 HA-Tag를 부착하기 위해, 미니게놈 cDNA의 구축을 행하였다. 먼저, GFP 탑재 플라스미드를 주형으로 하여, 프라이머 HA-GFP-Not I-F(5'-atagcggccgcaatgtacccatacgacgtcccagactacgctgtgagcaagggcgaggagctg, 63 mer(서열번호: 42))와 GFP-Not I-R2(5'-tatgcggccgcttacttgtacagctcgtccatg, 33 mer(서열번호: 43))를 사용한 PCR로 Not I-HA-GFP-Not I 단편이 얻어졌다. 또한, 동일한 주형으로, 프라이머 GFP-Not I-F(상기 실시예 12 참조)와 GFP-HA-Not I-R(5'-tatgcggccgcttaagcgtagtctgggacgtcgtatgggtacttgtacagctcgtccatgccg, 63 mer(서열번호: 44))을 사용한 PCR로 Not I-GFP-HA-Not I 단편이 얻어졌다. 이 2종류 단 편(Not I-HA-GFP-Not I와 Not I-GFP-HA-Not I)을 Not I 처리하고, 인서트로서 동일한 Not I 처리한 상기 실시예 12에서 얻어진 Not I-MiniSeVDPpolm-Not I 단편으로 삽입하여, pMiniSeVDPpolm/HA-GFP와 pMiniSeVDPpolm/GFP-HA를 얻었다.
13.2 HA-Tag 부착 유전자(GFP)를 탑재한 공존 입자의 생산
전날 1e6 cells/well(6-well collagen-coated plate, IWAKI)로 파종한 BHK-21 세포로 SeVagp55/△F를 moi 10으로 1시간 감염시킨 후, 「pCAGGS/F5R(5 ㎍/well)+pMiniSeVDPpolm/GFP(5 ㎍/well) or pMiniSeVDPpolm/HA-GFP(5 ㎍/well) or pMiniSeVDPpolm/GFP-HA(5 ㎍/well)」를 도입하였다(도입 시약: Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=1.5 ㎕/㎍). 배양(10% FBS/G-MEM 배지) 1일째, 무혈청 배지 VP-SFM으로 1회 세정한 후, 3 ㎍/㎖ 트립신을 첨가한 VP-SFM에 배지 교환하고, 이후 매일 배지 교환 및 GFP 사진을 촬영하며, Day 4 배양상청을 사용하여 CIU Assay를 행하였다(도 17). 또한, 토끼 Anti-HA-Tag 항체를 1차 항체, Alexa Fluor 594 염소 항토끼 IgG 항체를 2차 항체로서, 공존 입자로 감염된 LLC-MK2 세포를 면역 염색하였다(도 17).
도 17A에 나타낸 바와 같이, N 말단 영역은 C 말단에 HA-Tag 부착 GFP를 탑재한 경우, 대조(HA-Tag 없이 GFP 탑재)와 동일한 레벨의 공존 입자가 생산된다. 또한, 도 17B에 나타낸 바와 같이, HA-Tag 항체를 사용한 형광 항체 염색으로, HA-Tag 부착 유전자(GFP)를 탑재한 공존 입자에 감염된 세포를 특이적으로 염색할 수 있는 것이 명확해졌다.
본 발명자들이 개발한 MiniSeV-SeV 입자 공존 단백질 발현계는, 종래의 바이러스 벡터의 「유전자 도입효율·발현효율이 높다」는 이점, 및 비바이러스 벡터의 「제작 간편, 단기 대량조제 용이, 저비용」이라는 이점을 겸비하고 있다. 즉, 본 발명의 발현계는, 종래의 비바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 쌍방의 이점을 갖고 있으므로, 유용한 단백질의 생산, 항체 제작, 단백질 기능 해석, 유전자 치료, 유전자 백신 등 폭넓은 분야로의 응용이 기대된다.
또한, 헬퍼 바이러스 벡터에 단백질 결손 타입을 사용한 경우에는, 공존 입자를 표적세포에 감염시킨 후, 재차 감염성 입자가 방출될 우려가 없어, 생물 안전성의 측면에서 우수하다.
SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC CORPORATION <120> Novel protein expression system <130> D4-A0511P <150> JP 2006-008965 <151> 2006-01-17 <160> 44 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 1 caggtttgag gatattatac atag 24 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 2 caggatttta gtttttctta ctattgtc 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 3 ctcttgtttg gtgggtcggc atggcatctc 30 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 4 ttagctcact cattaggcac cccag 25 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 5 gtaagaaaaa ctaaaatcct gtataacttc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 6 gccgacccac 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tgagactcgc agagagacgg caagaggatt 1620 ctgcaaccca tggagatgaa ggccgcaata acggtgtcga tcatgacgaa gatgacgatg 1680 ccgcagcagt agctgggata ggaggaatct aggatcatac gaggcttcaa ggtacttgat 1740 ccgtagtaag aaaaacttag ggtgaaagtt catccaccga tcggctcagg caaggccaca 1800 cccaacccca ccgaccacac ccagcagtcg agacagccac ggcttcggct acacttaccg 1860 catggatcaa gatgccttca ttcttaaaga agattctgaa gttgagaggg aggcgccagg 1920 aggacgagag tcgctctcgg atgttatcgg attcctcgat gctgtcctgt cgagtgaacc 1980 aactgacatc ggaggggaca gaagctggct ccacaacacc atcaacactc cccaaggacc 2040 aggctctgct catagagcca aaagtgaggg cgaaggagaa gtctcaacac cgtcgaccca 2100 agataatcga tcaggtgagg agagtagagt ctctgggaga acaagcaagc cagaggcaga 2160 agcacatgct ggaaaccttg ataaacaaaa tatacaccgg gcctttgggg gaagaactgg 2220 tacaaactct gtatctcagg atctgggcga tggaggagac tccggaatcc ttgaaaatcc 2280 tccaaatgag agaggatatc cgagatcagg tattgaagat gaaaacagag agatggctgc 2340 gcaccctgat aagaggggag aagaccaagc tgaaggactt ccagaagagg tacgaggaag 2400 tacatcccta cctgatgaag gagaaggtgg agcaagtaat aatggaagaa gcatggagcc 2460 tggcagctca catagtgcaa gagtaactgg ggtcctggtg attcctagcc ccgaacttga 2520 agaggctgtg ctacggagga acaaaagaag acctaccaac agtgggtcca aacctcttac 2580 tccagcaacc gtgcctggca cccggtcccc accgctgaat cgttacaaca gcacagggtc 2640 accaccagga aaacccccat ctacacagga tgagcacatc aactctgggg acacccccgc 2700 cgtcagggtc aaagaccgga aaccaccaat agggacccgc tctgtctcag attgtccagc 2760 caacggccgc ccaatccacc cgggtctaga gaccgactca acaaaaaagg gcataggaga 2820 gaacacatca tctatgaaag agatggctac attgttgacg agtcttggtg taatccagtc 2880 tgctcaagaa ttcgaatcat cccgagacgc gagttatgtg tttgcaagac gtgccctaaa 2940 gtctgcaaac tatgcagaga tgacattcaa tgtatgcggc ctgatccttt ctgccgagaa 3000 atcttccgct cgtaaggtag atgagaacaa acaactgctc aaacagatcc aagagagcgt 3060 ggaatcattc cgggatattt acaagagatt ctctgagtat cagaaagaac agaactcatt 3120 gctgatgtcc aacctatcta cacttcatat catcacagat agaggtggca agactgacaa 3180 cacagactcc cttacaaggt ccccctccgt ttttgcaaaa tcaaaagaga acaagactaa 3240 ggctaccagg tttgacccat ctatggagac cctagaagat atgaagtaca aaccggacct 3300 aatccgagag gatgaattta gagatgagat ccgcaacccg gtgtaccaag agagggacac 3360 agaacccagg gcctcaaacg catcacgtct cctcccctcc aaagagaagc ccacaatgca 3420 ctctctcagg ctcgtcatag agagcagtcc cctaagcaga gctgagaaag tagcatatgt 3480 gaaatcatta tccaagtgca agacagacca agaggttaag gcagtcatgg aactcgtaga 3540 agaggacata gagtcactga ccaactagat cccgggtgag gcatcctacc atcctcagtc 3600 atagagagat ccaatctacc atcagcatca gccagtaaag attaagaaaa acttagggtg 3660 aaagaaattt cacctaacac ggcgcaatgg cagatatcta tagattccct aagttctcat 3720 atgaggataa cggtactgtg gagcccctgc ctctgagaac tggtccggat aagaaagcca 3780 tcccccacat caggattgtc aaggtaggag accctcctaa acatggagtg agatacctag 3840 atttattgct cttgggtttc tttgagacac cgaaacaaac aaccaatcta gggagcgtat 3900 ctgacttgac agagccgacc agctactcaa tatgcggctc cgggtcgtta cccataggtg 3960 tggccaaata ctacgggact gatcaggaac tcttaaaggc ctgcaccgat ctcagaatta 4020 cggtgaggag gactgttcga gcaggagaga tgatcgtata catggtggat tcgattggtg 4080 ctccactcct accatggtca ggcaggctga gacagggaat gatatttaat gcaaacaagg 4140 tcgcactagc tccccaatgc ctccctgtgg acaaggacat aagactcaga gtggtgtttg 4200 tcaatgggac atctctaggg gcaatcacca tagccaagat cccaaagacc cttgcagacc 4260 ttgcattgcc caactctata tctgttaatt tactggtgac actcaagacc gggatctcca 4320 cagaacaaaa gggggtactc ccagtacttg atgatcaagg ggagaaaaag ctcaatttta 4380 tggtgcacct cgggttgatc aggagaaagg tcgggaagat atactctgtt gagtactgca 4440 agagcaagat tgagagaatg cggctgattt tctcacttgg gttaatcggc ggtataagct 4500 tccatgttca ggttaatggg acactatcta agacattcat gagtcagctc gcatggaaga 4560 gggcagtctg cttcccatta atggatgtga atccccatat gaacatggtg atttgggcgg 4620 catctgtaga aatcacaggc gtcgatgcgg tgttccaacc ggccatccct cgtgatttcc 4680 gctactaccc taatgttgtg gctaagaaca tcggaaggat cagaaagctg taaatgtgca 4740 cccatcagag acctgcgaca atgccccaag cagacaccac ctggcagtcg gagccaccgg 4800 gtcactcctt gtcttaaata agaaaaactt agggataaag tcccttgtga gtgcttggtt 4860 gcaaaactct ccacctggta caagcacaga tcatggatgg tgataggggc aaacgtgact 4920 cgtactggtc tacttctcct agtggtagca 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aatgagtgag ctaactcaca 900 ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 960 taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 1020 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 1080 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 1140 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 1200 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 1260 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1320 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1380 tctcaaagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1440 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1500 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1560 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1620 tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1680 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1740 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1800 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1860 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1920 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1980 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 2040 acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 2100 tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 2160 ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 2220 agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 2280 tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2340 acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2400 agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2460 actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2520 tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2580 gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2640 ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2700 tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2760 aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2820 tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2880 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2940 gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 3000 ccctttcgtc 3010 <210> 15 <211> 996 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized nucleotide sequence <400> 15 accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt 60 caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccctttgc tttgctgcca aagttcacgc 120 ggccgcagat cttcacgatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 180 tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 240 agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 300 ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 360 accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 420 aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 480 tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 540 gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 600 ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 660 gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 720 tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 780 agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 840 acgagctgta caagtaatta gtccctatcg tgcagaacga tcgaagctcc gcggtacctg 900 gaagtcttgg acttgtccat atgacaatag taagaaaaac ttacaagaag acaagaaaat 960 ttaaaaggat acatatctct taaactcttg tctggt 996 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 16 agttcacgcg gccgcagatc ttcacg 26 <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 17 caggtaccgc ggagcttcga tcgttctgca cgatagggac taa 43 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 18 ataccgcatc aggcgccatt cg 22 <210> 19 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 19 gttttttagg gtctggaacc tgctcctcag ggtggatact ttgacactaa aatcctg 57 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 20 ggttccagac cctaaaaaac atgtatggga tatg 34 <210> 21 <211> 3856 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized nucleotide sequence <400> 21 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gctcgcgtcg tacgggccct 420 aatacgactc actataacca aacaagagaa aaaacatgta tgggatatgt aatgaagtta 480 tacaggattt tagtgtcaaa gtatccaccc tgaggagcag gttccagacc ctaaaaaaca 540 tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt caaagtatcc accctgagga 600 gcaggttcca gaccctttgc tttgctgcca aagttcacgc ggccgcagat cttcacgatg 660 gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 720 gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 780 aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 840 gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 900 cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 960 aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 1020 aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 1080 ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 1140 atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 1200 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1260 ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1320 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaatta 1380 gtccctatcg tgcagaacga tcgaagctcc gcggtacctg gaagtcttgg acttgtccat 1440 atgacaatag taagaaaaac ttacaagaag acaagaaaat ttaaaaggat acatatctct 1500 taaactcttg tctggtgggt cggcatggca tctccacctc ctcgcggtcc gacctgggca 1560 tccgaaggag gacgcacgtc cactcggatg gctaagggag agctacgcgt ggatccccgg 1620 gaattcgtaa tcatgtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 1680 cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 1740 ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 1800 ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 1860 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1920 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1980 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 2040 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 2100 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 2160 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 2220 gcgctttctc aaagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 2280 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 2340 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2400 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2460 tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2520 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2580 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2640 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2700 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 2760 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 2820 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 2880 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 2940 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 3000 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 3060 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 3120 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 3180 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 3240 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 3300 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 3360 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 3420 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 3480 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 3540 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 3600 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 3660 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 3720 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3780 ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 3840 acgaggccct ttcgtc 3856 <210> 22 <211> 10 <212> RNA <213> Sendai virus <400> 22 ucccwvuuwc 10 <210> 23 <211> 10 <212> RNA <213> Sendai virus <400> 23 ucccaguuuc 10 <210> 24 <211> 10 <212> RNA <213> Sendai virus <400> 24 ucccacuuac 10 <210> 25 <211> 10 <212> RNA <213> Sendai virus <400> 25 ucccacuuuc 10 <210> 26 <211> 10 <212> DNA <213> Sendai virus <400> 26 agggtcaaag 10 <210> 27 <211> 10 <212> DNA <213> Sendai virus <400> 27 agggtgaatg 10 <210> 28 <211> 10 <212> DNA <213> Sendai virus <400> 28 agggtgaaag 10 <210> 29 <211> 9 <212> RNA <213> Sendai virus <400> 29 auucuuuuu 9 <210> 30 <211> 9 <212> DNA <213> Sendai virus <400> 30 taagaaaaa 9 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 31 gtacgggccc gtacgtctga ggccgaggga aag 33 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 32 ctcttgtttg gtacctatct ccaggtccaa tagg 34 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 33 gacctggaga taggtaccaa acaagagaaa aaac 34 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 34 gactagcggc cgcgtgaact ttggcag 27 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 35 atatgcggcc gcaatggtga gcaagggcga ggag 34 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 36 tggcgtcttc cttgtacagc tcgtccatgc cg 32 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 37 acgagctgta caaggaagac gccaaaaaca taaag 35 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 38 atatgcggcc gcttacacgg cgatctttcc gc 32 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 39 tcacgcggcc gctagtccct atcgtgcaga acg 33 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 40 gactagcggc cgcgtgaact ttggcag 27 <210> 41 <211> 2384 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 41 gcggccgcaa tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 60 gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 120 gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 180 tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 240 cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 300 accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 360 gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 420 ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 480 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 540 cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 600 gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 660 cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 720 tacaaggaag acgccaaaaa cataaagaaa ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat 780 ggaaccgctg gagagcaact gcataaggct atgaagagat acgccctggt tcctggaaca 840 attgctttta cagatgcaca tatcgaggtg gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg 900 tccgttcggt tggcagaagc tatgaaacga tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc 960 gtatgcagtg aaaactctct tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga 1020 gttgcagttg cgcccgcgaa cgacatttat aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc 1080 atttcgcagc ctaccgtggt gttcgtttcc aaaaaggggt tgcaaaagat tttgaacgtg 1140 caaaagaagc tcccaatcat ccaaaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag 1200 ggatttcagt cgatgtacac gttcgtcaca tctcatctac ctcccggttt taatgaatac 1260 gattttgtgc cagagtcctt cgatagggac aagacaattg cactgatcat gaactcctct 1320 ggatctactg gtctgcctaa aggtgtcgct ctgcctcata gaactgcctg cgtgagattc 1380 tcgcatgcca gagatcctat ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt 1440 gttgttccat tccatcacgg ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga 1500 tttcgagtcg tcttaatgta tagatttgaa gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat 1560 tacaagattc aaagtgcgct gctggtgcca accctattct ccttcttcgc caaaagcact 1620 ctgattgaca aatacgattt atctaattta cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc 1680 tctaaggaag tcggggaagc ggttgccaag aggttccatc tgccaggtat caggcaagga 1740 tatgggctca ctgagactac atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg 1800 ggcgcggtcg gtaaagttgt tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg 1860 aaaacgctgg gcgttaatca aagaggcgaa ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc 1920 ggttatgtaa acaatccgga agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat 1980 tctggagaca tagcttactg ggacgaagac gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag 2040 tctctgatta agtacaaagg ctatcaggtg gctcccgctg aattggaatc catcttgctc 2100 caacacccca acatcttcga cgcaggtgtc gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa 2160 cttcccgccg ccgttgttgt tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg 2220 gattacgtcg ccagtcaagt aacaaccgcg aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg 2280 gacgaagtac cgaaaggtct taccggaaaa ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc 2340 ataaaggcca agaagggcgg aaagatcgcc gtgtaagcgg ccgc 2384 <210> 42 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 42 atagcggccg caatgtaccc atacgacgtc ccagactacg ctgtgagcaa gggcgaggag 60 ctg 63 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 43 tatgcggccg cttacttgta cagctcgtcc atg 33 <210> 44 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 44 tatgcggccg cttaagcgta gtctgggacg tcgtatgggt acttgtacag ctcgtccatg 60 ccg 63

Claims (22)

  1. 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 방법.
    (a) 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 생산세포에 도입하는 공정
    (b) 상기 생산세포 내에서 생산된 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자를 회수하는 공정
    (c) 공정 (b)에서 회수된 바이러스 입자를 표적세포에 도입하는 공정
  2. 제1항에 있어서,
    공정 (a)에 있어서, NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 발현하는 벡터를, 추가적으로 생산세포에 도입하는 공정을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 리보핵단백질(RNP) 복합체 또는, 바이러스 유사 입자(VLP)인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이, 하나 또는 복수의 프로모터를 보유 하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    프로모터 중 하나 이상이 RNA 폴리머라아제 I 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이너스가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 또는 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈에 의해, 파라믹소바이러스의 NP 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 파라믹소바이러스의 F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하지 않도록 개변되고, 5' 말단의 트레일러 영역이 리더 영역으로 치환된, 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는 벡터인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    생산세포가, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터에 있어서 발현하지 않도록 개변된, F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터의 개변된 단백질이 F 단백질인 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, P 유전자 및/또는 C 유전자에 변이를 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가, 하기 (a) 또는 (b)에 기재의 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는 방법.
    (a) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
    (b) 서열번호: 10에 기재의 염기서열을 포함하는 마이너스가닥 RNA의 상보가닥과 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 마이너스가닥 단일가닥 RNA
  13. 제6항에 있어서,
    파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 방법.
  14. 제6항에 있어서,
    헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터가 야생형 센다이 바이러스 벡터인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    생산세포가, T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 세포인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    인비트로에서의 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    표적세포가, 293T 세포, A549 세포, BHK-21 세포, C2C12 세포, HeLa 세포, LLC-MK2 세포, MDCK 세포, 또는 NIH3T3 세포 중 어느 하나인 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    인비보에서의 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 파라믹소바이러스의 F 단백질, M 단백질 또는 HN 단백질 중, 어느 하나 또는 복수의 단백질을 발현하지 않도록 개변되고, 5' 말단의 트레일러 영역이 리더 영역으로 치환된, 마이너스가닥 단일가닥 RNA를 포함하는, 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터.
  20. 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈.
  21. 제19항의 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터, 및 제20항의 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 표적세포에 도입하는 공정을 포함하는, 표적세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 방법.
  22. 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, 바이러스 입자의 제조방법.
    (a) 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및, 외래 유전자를 탑재한 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈을 생산세포에 도입하는 공정
    (b) 상기 생산세포 내에서 생산된 헬퍼 마이너스가닥 RNA 바이러스 벡터 및 마이너스가닥 RNA 바이러스 미니게놈이 각각 패키징된 바이러스 입자를 회수하는 공정
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