KR102372647B1 - 멜라닌 형성 검출용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

멜라닌 형성 검출용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 멜라닌 형성 검출용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법 등에 관한 것으로, 보다 구체적으로 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 바이오마커인 FAM86A은 멜라닌 분비 또는 형성량의 증가에 따라 그 수준이 감소하므로, FAM86A의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 본원발명의 진단용 조성물 또는 FAM86A 검출 방법을 통해 피부 미백 물질을 스크리닝할 수 있으며, 멜라닌 형성 여부를 정확하고 신속하게 확인할 수 있다.

Description

멜라닌 형성 검출용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법{Composition for melanin formation detection and Screening method of skin whitening materials}
본 발명은 멜라닌 형성 검출용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법 등에 관한 것으로, 보다 구체적으로 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 조성물에 관한 것이다.
멜라닌(melanin) 색소는 피부색을 결정하며 자외선을 흡수하여 피부를 보호하는 역할을 한다. 멜라닌 색소는 티로신(tyrosine)이라는 아미노산으로 이루어져 있는데, 티로신은 티로시나아제(tyrosinae)라는 효소에 의해 활성화된다. 티로신은 전환 과정에 따라 피오멜라닌(pheomelanin) 또는 유멜라닌(eumelanin)의 두 종류의 멜라닌으로 합성되는데, 피오멜라닌은 황색에서 적색을 띠며, 유멜라닌은 갈색에서 검은색을 띠는 색소로 주로 동양인에게서 볼 수 있다. 멜라닌 색소를 생성하는 멜라닌 세포(melanocyte)는 멜라노블라스트(melanoblast)에서 유래한다. 멜라노블라스트가 자극을 받아 멜라닌 세포로 분화되면, 티로시나아제가 활성화되어 세포 내 함유되어 있는 티로신을 DOPA(3,4-dihydroxy-L-phenyl-alanine)로 변화시키고, 이어서 DOPA는 도파옥시다제(dopaoxidase)라는 효소의 작용으로 도파퀴논(dopaquinone)이라는 물질로 변한 후 멜라닌으로 합성된다. 멜라닌 세포는 멜라닌을 만든 후 피부 상층부의 표피 조직까지 이동하여, 표피 조직에 존재하는 각질 형성 세포(keratinocyte)로 멜라닌을 전달한다. 세포 이동 과정에서 멜라닌 색소는 멜라노좀(melanosome)에 저장되어 운반되는데 생성 초기에는 색이 없다가 점차 상층부로 이동하면서 4-5 단계에 걸쳐 검은 색소로 채워져 마침내 완전한 색소를 띤 성숙한 멜라닌 과립이 된다.
α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)은 멜라닌 생성에 매우 중요하다. α-MSH는 Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 멜라노코틴 1 수용체(melanocortin 1 receptor, MC1-R)의 작용제이다. 작용제가 MC1-R에 결합하면, MC1-R은 아데닐 사이클라제(adenylate cyclase)를 활성화하고, cAMP가 증가하여 PKA가 활성화되며, PKA는 cAMP 반응성 단백질 전사인자(cAMP-responsive element binding protein transcription factor)를 인산화하여 최종적으로 소안구 관련 전사인자(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)를 활성화시킨다. MITF는 또한 Wnt, GSK3β, 그리고 MAPK 신호전달계에 의하여 활성화되며, 다양한 자극에 반응하여 타이로시나제(TYR), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TYRP1), 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase, DCT; tyrosinase-related protein 2, TRP2라고도 불림) 등 멜라닌 생합성에 관련된 효소의 발현 수준을 조절한다.
사람의 피부색을 결정하는 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 가지 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌으로서, 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨 및 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다. 그리고 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는다.
따라서 이러한 멜라닌의 생성을 억제하기 위한 연구가 진행되고 있으며, 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용되어 오고 있다. 그러나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제로 인해 그 사용이 제한되고 있다.
대한민국공개특허공보 제10-2013-0025768호
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 멜라닌 형성 검출용 조성물 및 피부 미백 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것으로서, 본 발명자들은 FAM86A 단백질이 멜라닌 생성량과 반비례함을 확인함으로써, FAM86A를 이용하여 멜라닌 형성을 검출하고, 미백 관련 물질을 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 피부 미백 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
(a) FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교해 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 증가시킨 물질을 피부 미백 물질로 선별하는 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 FAM86A 단백질, 이의 아고니스트 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FAM86A 단백질, 이의 아고니스트 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 피부 미백 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교해 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 증가시킨 물질을 피부 미백 물질로 선별하는 단계.
이에 더하여, 본 발명은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 색소관련 피부 상태 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 색소관련 피부 상태 진단용 키트를 제공한다.
또한, 하기 단계를 포함하는 색소관련 피부 상태의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
(a) 피검체로부터 수득한 시료에서 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 FAM86A 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 정상 대조구와 비교하여 FAM86A 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준이 감소한 피검체를 멜라닌이 과다 생성될 것으로 예측하는 단계.
또한, 본 발명은 본 발명의 또 다른 목적은 FAM86A 단백질, 이의 아고니스트 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 FAM86A 단백질, 이의 아고니스트 또는 이의 활성화제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 미백 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 미백용 제제를 제조하기 위한 FAM86A 단백질, 이의 아고니스트 또는 이의 활성화제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 FAM86A 단백질, 이의 아고니스트 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 FAM86A 단백질, 이의 아고니스트 또는 이의 활성화제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 색소 침착 질환 약제를 제조하기 위한 FAM86A 단백질, 이의 아고니스트 또는 이의 활성화제의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 FAM86A의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 FAM86A의 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 FAM86A의 mRNA는 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 FAM86A의 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 mRNA의 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-timeRT-PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택된 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 아고니스트 또는 활성화제는 FAM86A 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포, 화합물 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 색소 침착 질환은 색소 침착, 기미, 주근깨, 잡티, 점, 반점, 오타모반, 푸른 흑피증(cyanic melasma), 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 검버섯, 노인성 흑자, 상처, 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 및 멜라닌 피부증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 바이오마커인 FAM86A은 멜라닌 분비 또는 형성량의 증가에 따라 그 수준이 감소하므로, FAM86A의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 본원발명의 진단용 조성물 또는 FAM86A 검출 방법을 통해 피부 미백 물질을 스크리닝할 수 있으며, 멜라닌 형성 여부를 정확하고 신속하게 확인할 수 있다.
도 1은 C57BL/6 마우스에 UVB (1mJ)을 처리한 뒤 시간별로 FAM86A 단백질 발현 량을 western blotting analysis를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이며(상단), 또한 동일 샘플을 이용하여 멜라닌 생성량을 melanin contents assay를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다(하단).
도 2는 ICR(백색-알비노) 쥐와, C57BL/6(검정) 마우스의 등 조직에서 FAM86A의 발현량을 western blotting analysis를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 C57BL/6 마우스의 검정 털 피부(귀와 귀 사이), 흰 털 피부 (귀 뒤 부분) 의 조직에서 FAM86A의 발현량을 Western blotting analysis를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 마우스 흑색종 세포를 이용하여 멜라닌 형성을 유도하는 α-MSH를 처리한 뒤 FAM86A 단백질 발현량을 western blotting analysis로 확인한 결과를 나타낸 것이고(상단), 멜라닌 생성량을 melanin contents assay를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다(하단).
도 5는 마우스 흑색종 세포를 이용하여 멜라닌 형성을 유도하는 a-MSH를 처리한 뒤 멜라닌 형성에 관여하는 유전자(Tyrosinase, TYRP-1, TYRP-2, MITF) 및 FAM86A 유전자의 발현량을 real-time PCR을 이용하여 확인한 결과이다.
도 6은 마우스 흑색종 세포에 FAM86A를 과발현시킨 후 멜라닌 형성에 중요한 단백질인 cAMP의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 7은 마우스 흑색종 세포에 FAM86A를 과발현시킨 후 폰타나 마송 염색을 통해 멜라닌 발현을 확인한 결과이다.
도 8은 마우스 흑색종 세포에 FAM86A를 과발현시킨 후 멜라닌 분비 어세이를 통해 멜라닌 분비량을 확인한 결과이다.
도 9는 마우스 흑색종 세포에 FAM86A를 과발현시킨 후 멜라닌 분비 어세이를 통해 멜라닌 생성량을 확인한 결과이다.
도 10은 마우스 흑색종 세포에 FAM86A를 과발현시킨 후 RT-PCR을 이용하여 멜라닌 형성에 중요한 유전자인 Tyrosinase, TYRP-1 및 MITF의 발현량을 측정한 결과이다.
도 11은 마우스 흑색종 세포에 FAM86A를 과발현시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 MAPK 및 MC1R 신호전달경로 단백질인 MC1R, p-CREB 및 p-MITF의 발현량을 측정한 결과이다.
본 발명자들은 실시예를 통하여, FAM86A와 멜라닌과의 관계를 연구하던 중, α-MSH로 유도하여 멜라닌 형성을 촉진시켰을 때, FAM86A 발현이 오히려 감소하는 것을 확인하였는 바, 본 발명을 완성하였다(본 발명의 실시예 참조).
본 명세서에서, 용어 "단백질"은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 명세서에서, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 "상보적(complementary)"이라고 한다.
한편, 'mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.
본 명세서에서, "FAM86"은 단백질 MTase 패밀리에 속하는 단백질로, 대부분 포유류의 게놈에는 단일 FAM86 유전자가 존재하며, 영장류의 FAM86은 종양이 발생하기 쉬운 부분의 복제영역 내에 포함되어 있고, 여러 게놈위치에 퍼져 있는 것으로 알려져 있다(Identification and Characterization of a Novel Evolutionarily Conserved Lysine-specific Methyltransferase Targeting Eukaryotic Translation Elongation Factor 2 (eEF2), JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOLUME 289 NUMBER 44 OCTOBER 31, 2014).
본 명세서에서, 상기 FAM86은 FAM86A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, FAM86A 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명에서의 FAM86A 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간의 FAM86A(NP_958802.1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다(괄호 안은 NCBI Genbank accession number).
상기 FAM86 mRNA는 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 인간 FAM86A mRNA(NM_201400.4)로 표시되는 염기서열을 포함하는 것이다(괄호 안은 NCBI Genbankaccession number). 상기한 인간의 FAM86A mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genbank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 구체적으로는 생리학적 조건 하(세포 내)에서 핵산 분자 내 타겟팅 모이어티가 타겟(예컨대, FAM86A 유전자)에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 보다 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
이에, 본 발명은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 조성물 또는 색소관련 피부 상태 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 과다생성 검출용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 '검출'은 목적하는 물질(본 발명에서의 마커 단백질, FAM86A)의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 같은 맥락에서, 본 발명에서 상기 단백질의 발현수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것(즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 FAM86A 단백질 검출은 FAM86A 단백질의 존재 여부 검출, 또는 상기 단백질 발현량의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서, 단백질의 '발현 증가(또는 고발현)'라는 의미는 발현되지 않던 것이 발현된 것(즉, 검출되지 않던 것이 검출된 것) 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 과발현된 것(즉, 검출량이 많아지는 것)을 의미한다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.
본 명세서에서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 FAM86A의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 FAM86A의 단백질에 특이적인 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 FAM86A의 mRNA는 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 FAM86A의 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 '프라이머(primer)'는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 FAM86A mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 각 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 KRS 또는 AIMP1의 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다. 본 발명에서 상기 프라이머는 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 FAM86A의 mRNA에 특이적으로 결합하는 한 세트, 한 쌍 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 '프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 FAM86A mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 FAM86A mRNA의 발현양을 측정함으로써 색소관련 피부 상태의 진단 또는 멜라닌 과다생성 검출에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 FAM86A mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지 물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
상기 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.
FAM86A 단백질은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 FAM86A 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 FAM86A 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 FAM86A 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 FAM86A 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.
예를 들어, 다클론 항체는 FAM86A 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
한편, 본 발명은 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 키트 또는 색소관련 피부 상태 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 FAM86A의 단백질 항체이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
본 발명의 검출용 또는 진단용 키트에 포함되는 FAM86A 측정제제는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow & Lane;Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 피부 미백 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교해 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 증가시킨 물질을 피부 미백 물질로 선별하는 단계.
본 명세서에서, 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA을 발현하는 세포는 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA이 내인적으로(endogenous) 발현 또는 일시적으로 고발현된 세포를 포함하며, 또는 FAM86A을 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하여 형질전환시킴으로써 과발현 되도록 하여 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.
본 명세서에서, "발현(expression)"은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. 상기 FAM86A를 발현하는 세포는 FAM86A를 내재적으로 발현하는 세포일 수도 있고, FAM86A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 FAM86A를 과발현하는 세포일 수도 있다. 바람직하게는 상기 FAM86A유전자를 발현하는 세포는 멜라닌 세포에서 유래한 세포일 수 있다. 본 발명자들은 FAM86A를 내재적으로 발현하는 세포로서 B6F10 세포주를 사용한 바 있다.
본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물"은 본 발명의 FAM86A의 발현에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계에서 사용되는 세포는 실험동물의 형태로 제공될 수 있으며, 이 경우 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 실험동물에게 멜라닌 형성을 유도하는 단계를 추가로 포함하며, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구투여, 정위주사를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
시험물질을 처리하는 것은 시험물질을 세포 또는 조직 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 상기 세포가 실험동물 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 mRNA의 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-timeRT-PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택된 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 상기 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계는 대조군 세포와 비교하여 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 증가시킨 물질을 피부 미백 물질로 선별하는 단계이다.
상기 대조군 세포는 시험물질을 처리하지 않은 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 시험 물질이 접촉된 멜라닌 과다생성 시료에서의 FAN86 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 후보물질 접촉되지 않은 멜라닌 과다생성 시료에서의 해당 유전자 또는 단백질의 발현 정도보다 증가된 경우, 상기 후보물질을 멜라닌 생성 억제제 및/또는 색소성 피부질환 치료제 및/또는 피부 미백제로 판단하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 색소관련 피부 상태의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
(a) 피검체로부터 수득한 시료에서 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 FAM86A 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 정상 대조구와 비교하여 FAM86A 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준이 감소한 피검체를 멜라닌이 과다 생성될 것으로 예측하는 단계.
본 발명에서 색소관련 피부 상태란, 멜라닌 색소와 관련된 피부 유형 내지 피부상태를 나타내는 피부 관련 정보를 의미한다. 본 발명은 다양한 피부 특성 중 특히, 색소침착과 관련된 정보를 그 진단 대상으로 한다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 색소관련 피부 상태를 진단하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 조직 또는 세포일 수 있다.
상기 (a) 단계의 방법으로 측정한 피검체에서 FAM86A 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 동일한 방법으로 측정한 정상 대조구와 비교하여, FAM86A 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준이 감소한 경우, 상기 피검체를 멜라닌이 과다 형성된 것으로 판단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 피검체, 및 각종 시료는 모든 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간, 또는 이로부터 얻은 시료 또는 생검 시료는 모든 조직, 체액, 또는 세포일 수 있으며, 예컨대 피부 조직 또는 피부 세포 또는 섬유아세포일 수 있다. 또한, 정상 개체는 멜라닌 과다생성 및 이로 인한 색소성 피부질환의 증상및 징후가 없으며, 개인적 및 가족적으로 멜라닌 과다생성 및 이로 인한 색소성 피부질환의 병력이 없는 개체를 의미한다.
상기 멜라닌 과다생성 시료는 동물, 예컨대 포유류, 바람직하게는 인간으로부터 자연적으로 얻어지거나 인위적인 방법으로 얻어진 것일 수 있으며, 상기 인위적 방법은 비색소 세포에 타이로시네이즈를 과발현시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 미백 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 미백용 제제를 제조하기 위한 FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제의 용도를 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물의 형태로 제공되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 아고니스트 또는 활성화제는 FAM86A 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포, 화합물 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 발현벡터는 FAM86A 유전자 또는 단백질을 과발현할 수 있는 벡터라면 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있다.
본 발명에서, 상기 발현벡터에 포함된 FAM86A 유전자는 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 렌티바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "미백"이라 함은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 말한다.
또한, 본 발명의 "미백"은 흑색이나 황색 피부를 미백하는 것을 포함하며, 흑색이나 황색 피부를 백색의 피부로 전환시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 과도한 멜라닌 색소 침착의 병리 상태, 예를 들어 노화/광노화, 임신 등 급격한 호르몬의 변화, 상처, 염증, 화상 등으로 인한 피부 손상과 재생 등을 원인으로 한 색소 침착, 기미, 주근깨, 잡티, 점, 반점, 오타모반, 푸른 흑피증(cyanic melasma), 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 검버섯, 노인성 흑자, 상처, 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 및 멜라닌 피부증 등을 개선하고 완화하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 본 발명에서 용어, “식품학적으로 허용 가능한 염”이란 식품학적으로 허용되는 유기산, 무기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 염"이란 수의학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3)이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O3),아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개, 고양이, 어류 및 파충류에 적용될 수 있다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제를 포함하는 조성물은 미백 목적으로 식품에 첨가될 수 있다.
본 발명에 있어서 식품은 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함한다.
바람직하게는, 상기건강기능성 식품은 이너뷰티 푸드(inner beauty) 형태로 섭취함으로써 더욱 우수한 효과를 갖는 장점을 가진다. 상기 이너뷰티(inner beauty)는 '먹는 화장품 또는 뷰티 푸드'로 일컬어지는 푸드로, 피부에 좋은 여러 가지 성분을 몸속으로 흡수시켜 피부 체질을 건강하게 바꾸는 식품을 지칭하며, 피부 타입에 맞는 화장품을 고르듯 피부 컨디션과 라이프스타일을 고려해 개개인에게 맞는 이너 뷰티 푸드를 선택하여 섭취할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품과 상기 FAM86A 단백질을 포함하는 이너뷰티 푸드를 혼용할 경우, 화장품 또는 약제만 사용하는 것에 비해 미백 효과가 월등히 높아져 더욱 효과적인 피부 미백 효과를 볼 수 있는 장점을 가진다.
본 발명의 FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 FAM86A 단백질, 아고니스트 또는 활성화제는 화장료 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.
수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.
유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.
고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.
고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.
스핑고지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.
이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.
에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.
탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.
실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.
불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.
동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.
보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.
수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.
지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.
수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.
지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.
에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.
계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.
음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.
양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.
양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.
유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.
자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.
살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.
산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.
pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.
알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-5% 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01-3% 중량 백분율로 배합된다.
본 발명의 제형이 로션, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 세포 배양
쥐의 멜라닌 세포주(murine melanoma cell)인 B16F10 세포와 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)와 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양액을 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 배양하였다.
실시예 2. UVB에 의한 멜라닌 형성 및 FAM86A 단백질 확인을 위한 웨스턴 블롯팅(Western blotting)
C57BL/6 쥐에 UVB(1mJ)를 처리한뒤 시간별로 피부조직을 적출한 후, PBS 로 2회 세척하였다. 그 다음 PBS를 완전히 제거한 후 조직 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 처리하였다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행하였으며, 전기영동한 SDS-PAGE젤의 단백질을 PVDF막으로 이동시킨 후, 단백질 이동이 완료된 PVDF막을 상온에서 TBS-T(in 100mM NaCl, 10mM Tris, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.4 (PBST)containing 3% BSA)로 블록킹하였다. 그리고나서 TBS-T를 사용하여 10분간 3회 세척한 후, 3% BSA를 녹인 TBS-T에 1차 항체를 1시간 처리하고, TBS-T로 충분히 세척하였다. 그리고 2차 항체를 1 시간 동안 처리하고 PBS-T로 10분씩 3회 세척하였다. 그 다음 ECL detection system 을 사용하여 특정 단백질의 양 및 위치를 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 단백질 양의 보정은 PVDF 막을 재활용(stripping )하여 액틴 단백질의 양을 확인함으로써 동량임을 확인하였다. 각각의 항체는 Cell signaling 및 Santacruz에서 구입하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, UVB에 의해 멜라닌 형성 과정이 진행되면서 FAM86A 단백질 발현양이 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 동일한 샘플을 이용하여 실시예 3을 통하여 FAM86A의 발현량과 멜라닌 형성량을 비교했을 때 반비례하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 멜라닌 형성에 FAM86A가 영향이 있음을 확인하였다.
실시예 3. UVB에 의한 멜라닌 형성 증가 확인
C57BL/6 쥐에 UVB(1mJ)를 처리한뒤 시간별로 피부조직을 적출 하였다. 얻어낸 조직에 cell lysis를 200㎕를 처리하여 조직를 용해시킨 후 4℃에서 12,000rpm으 로 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거하였다. 확보한 침전물에 10% Sodium dodecyl sulfate - 1M NaOH 용액을 100㎕ 씩 분주하고 30분간 60℃로 가열하였다. 그 후 가열된 용액을 상온에 방치하여 25℃ 까지 냉각 후 405㎚에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, UVB를 처리하지 않은 세포에서의 멜라닌 형성 양을 100% 기준으로 하여, 멜라닌 양을 계산하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, UVB에 의해 멜라닌 함량이 시간에 따라 점차 증가함을 확인하였다.
실시예 4. 마우스 색 종류에 따른 FAM86A 발현량 확인을 위한 웨스턴 블롯팅(Western blotting)
C57BL/6, ICR 마우스의 피부조직을 적출하고, PBS로 2회 세척하였다. 그 다음 PBS를 완전히 제거한 후 조직 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 처리하였다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동한 SDS-PAGE젤의 단백질을 PVDF막으로 이동시킨 후, 단백질 이동이 완료된 PVDF막을 상온에서 TBS-T(in 100mM NaCl, 10mM Tris, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.4 (PBST)containing 3% BSA)로 블록킹하였다. 그 다음 TBS-T를 사용하여 10분간 3회 세척한 후, 3% BSA를 녹인 TBS-T에 1차 항체를 1시간 처리하고, TBS-T로 충분히 세척하였다. 그리고 2차 항체를 1시간 동안 처리하고 PBS-T로 10분씩 3회 세척하였다. 그 다음 ECL detection system을 사용하여 특정 단백질의 양 및 위치를 확인하였다. 단백질 양의 보정은 PVDF 막을 재활용(stripping)하여 액틴 단백질의 양을 확인함으로써 동량임을 확인하였다. 각각의 항체는 Cell signaling 및 Santacruz에서 구입하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 피부의 색에 따라 FAM86A 단백질 발현양이 변화되는 것을 확인하였다. 구체적으로, 검정색 마우스 피부에서는 FAM86A가 거의 발현되지 않은 한편, 흰색 마우스 피부에서는 FAM86A가 고발현되는 것을 확인하였다. 이는 멜라닌 형성에 FAM86A가 영향이 있음을 나타내는 결과이다.
실시예 5. 마우스의 피부 부위 색에 따른 FAM86A 발현량 확인을 위한 웨스턴 블롯팅(Western blotting)
C57BL/6 마우스의 귀 뒤(white skin) 및 귀와 귀 사이(black skin)의 피부조직을 적출한 후, PBS로 2회 세척하였다. 그 다음 PBS를 완전히 제거한 후 조직 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 처리하였다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동한 SDS-PAGE 젤의 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후, 단백질 이동이 완료된 PVDF 막을 상온에서 TBS-T(in 100mM NaCl, 10mM Tris, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.4 (PBST)containing 3% BSA)로 블록킹하였다. 그 다음 TBS-T를 사용하여 10분간 3회 세척한 후, 3% BSA를 녹인 TBS-T에 1차 항체를 1시간 처리하고, TBS-T로 충분히 세척하였다. 그리고 2차 항체를 1시간 동안 처리하고 PBS-T로 10분씩 3회 세척하였다. 그 다음 ECL detection system을 사용하여 특정 단백질의 양 및 위치를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 단백질 양의 보정은 PVDF 막을 재활용(stripping)하여 액틴 단백질의 양을 확인함으로써 동량임을 확인하였다. 각각의 항체는 Cell signaling 및 Santacruz에서 구입하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 피부의 색에 따라 FAM86A 단백질 발현양이 변화되는 것을 확인하였다. 구체적으로, 검정 피부에 해당하는 귀와 귀 사이의 피부 조직에서는 FAM86A가 거의 발현되지 않은 반편, 귀 뒤의 흰색 피부에서는 FAM86A가 고발현 되는 것을 확인하였다. 이는 멜라닌 형성에 FAM86A가 영향이 있음을 나타내는 결과이다.
실시예 6. α-MSH에 의한 멜라닌 형성 유도 및 FAM86A 단백질 발현량 확인을 위한 웨스턴 블롯팅(Western blotting)
상기 실시예 1에서 배양한 B16F10 세포를 6웰 플레이트에 웰 당 5×104 개의 세포가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후, α-MSH를 100nM이 되도록 처리하였다. 세포는 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 48시간 동안 배양한 후, PBS 로 2회 세척하였다. 그 다음 PBS를 완전히 제거한 후 세포 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 각각의 접시에 넣고 스크래퍼를 이용하여 긁었다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동한 SDS-PAGE 젤의 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후, 단백질 이동이 완료된 PVDF 막을 상온에서 TBS-T(in 100mM NaCl, 10mM Tris, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.4 (PBST)containing 3% BSA)로 블록킹하였다. 그 다음 TBS-T를 사용하여 10분간 3회 세척한 후, 3% BSA를 녹인 TBS-T에 1차 항체를 1시간 처리하고, TBS-T로 충분히 세척하였다. 그리고 2차 항체를 1시간 동안 처리하고 PBS-T로 10분씩 3회 세척하였다. 그 다음 ECL detection system을 사용하여 특정 단백질의 양 및 위치를 확인하였다. 단백질 양의 보정은 PVDF 막을 재활용 (stripping)하여 액틴 단백질의 양을 확인함으로써 동량임을 확인하였다. 각각의 항체는 Cell signaling 및 Santacruz 에서 구입하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 멜라닌 형성 유도 물질인 α-MSH에 의해 멜라닌 생성이 증가하며, 그에 따라 FAM86A의 단백질 발현양이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 멜라닌 형성에 FAM86A가 영향이 있음을 확인하였다.
실시예 7. 멜라닌 형성 관련 유전자 발현양 확인(realtime PCR)
상기 실시예 1에서 배양한 B16F10 세포를 6웰 플레이트에 웰 당 5×104개의 세포가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후, α-MSH를 100nM이 되도록 처리하였다. 세포는 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 세포 배양액을 모두 걷어 내고, TRI-Zol을 이용하여 상기 세포를 분해하고, BCP를 이용하여 중화시켰다. 중화시킨 액체에 isopropanol을 이용하여 mRNA를 침강시켰다. 이어서 원심분리기를 이용하여 침강된 mRNA만을 모아 실험에 이용하였다. 세포내 mRNA는 cDNA kit를 이용하여 cDNA로 합성하여, PCR을 통해 멜라닌 형성에 중요한 유전자인 Tyrosinase, TYRP-1, TYRP-2, MITF , FAM86A 유전자의 발현양을 확인하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, α-MSH에 의해 멜라닌 형성에 중요한 유전자인 Tyrosinase, TYRP-1, TYRP-2, MITF 유전자의 발현양이 현저히 증가하였고, FAM86A는 반대로 감소하는 것을 확인 하였다. 이를 통해, 멜라닌 형성시 FAM86A 유전자의 발현량이 감소하는 것을 알 수 있었다.
실시예 8. FAM86A 과발현에 따른 cAMP 발현 감소 확인
마우스 흑색종 B16F10 세포에서 FAM86A 단백질의 과발현을 위해서 서열번호 12로 표시되는 FAM86A를 포함하는 벡터(pCMV Myc mFAM86A; 서열번호 11) 와 Empty Vector(pCMV Myc; 서열번호 13)를 lipopectamine을 이용하여 세포 내 형질 주입하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후 배양된 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그 다음 PBS를 완전히 제거한 후 세포 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 각각의 접시에 넣고 스크래퍼를 이용하여 긁었다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 cAMP ELISA KIT(ab65355)를 이용하여 cAMP 단백질의 발현을 측정하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, FAM86A 과발현 결과 cAMP의 발현이 감소함을 확인하였다.
실시예 9. FAM86A 과발현에 따른 폰타나-마손 염색(Fontana-Masson stain)을 통한 멜라닌 형성 감소 효과 확인
실시예 8과 같이, 마우스 흑색종 B16F10 세포에 Myc-FAM86A를 형질주입하여 FAM86A를 과발현 시킨 후 폰타나 마손 염색을 통하여 멜라닌을 염색하여 멜라닌 형성 정도를 현미경을 통해 확인하였다.
구체적으로, 세포는 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 PBS 로 2회 세척후 1% amonical silver nitrate 용액을 1ml 씩 각 웰에 처리한 뒤 1시간 동안 60℃ 건조기를 통해 가열하였다. 그 후 흐르는 물에 3회 세척 후 Gold chloride 0.2% 용액을 1ml 씩 30초동안 처리하였다. 그 후 흐르는 물에 2회 세척 후 Sodium thiosulfate 5% 용액을 1ml 씩 처리하였고, 흐르는 물에 2회 세척 후 neutral red 0.5% 용액을 1ml 씩 2분간 처리한 뒤 흐르는 물에 세척하였다. 그 후 현미경을 통하여 결과를 확인하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, FAM86A 과발현 결과 대조군에 비해 멜라닌이 감소 하는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 FAM86A가 과발현되었을 때 세포 내 및 세포 외에서 멜라닌이 감소됨을 확인하였다.
실시예 10. FAM86A 과발현에 따른 멜라닌 분비 감소 확인
실시예 8과 같이, 마우스 흑색종 B16F10 세포에 Myc-FAM86A를 형질주입하여 FAM86A를 과발현 시킨 후 멜라닌 분비 어세이(melanin secretion assay)를 통해 멜라닌 분비량을 확인하였다. 세포는 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 세포 배양액 800㎕를 새 튜브에 옮기고 4℃에서 12,000rpm으로 5분간 원심 분리하여 상등액을 확보하였다. 확보한 상등액 중 100㎕를 96웰 플레이트에 분주하고 475㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, FAM86A 유전자를 과발현하지 않은 세포에서의 멜라닌 양을 100% 기준으로 하여, 멜라닌 분비량을 계산하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, FAM86A 과발현 결과 멜라닌 분비량이 대조군에 비해 크게 감소한 것을 확인하였다. 이에 따라 FAM86A가 증가되었을 때 멜라닌 분비를 감소시킴을 확인하였다.
실시예 11. FAM86A 과발현에 따른 멜라닌 생성량 확인
실시예 8과 같이, 마우스 흑색종 B16F10 세포에 Myc-FAM86A 를 형질주입하여 FAM86A를 과발현 시킨 후 멜라닌 분비 어세이(melanin secretion assay)를 통해 멜라닌 생성량을 확인하였다. 세포는 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 48시간 동안 배양한 후에 세포 배양액을 제거하고 cell lysis buffer를 각 웰에 200㎕를 처리하여 세포를 용해시킨 후 4℃에서 12,000rpm으로 5분간 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하였다. 확보한 침전물에 10% Sodium dodecyl sulfate - 1M NaOH 용액을 100㎕ 씩 분주하고 30분간 60℃로 가열하였다. 그 후 가열된 용액을 상온에 방치하여 25℃ 까지 냉각 후 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, FAM86A 유전자를 과발현하지 않은 세포에서의 멜라닌 양을 100% 기준으로 하여, 멜라닌 양을 계산하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, FAM86A 과발현 결과 멜라닌 생성량이 대조군에 비해 크게 감소한 것을 확인하였다. 이에 따라 FAM86A가 증가되었을 때 멜라닌 생성을 감소시킴을 확인하였다.
실시예 12. FAM86A 과발현에 따른 멜라닌 형성 관련 유전자 발현량 확인 (real time PCR)
실시예 8과 같이, 마우스 흑색종 B16F10 세포에 Myc-FAM86A를 형질주입하여 FAM86A를 과발현 시킨 후 실시예 7의 real time PCR법을 이용하여 멜라닌 형성에 중추적인 유전자(Tyrosinase, TYRP-1, TYRP-2, MITF) 발현량을 측정하였다.
구체적으로, 세포는 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 48시간 동안 배양 하였다. 48시간 후 세포 배양액을 모두 걷어 내고, TRI-Zol을 이용하여 상기 세포를 분해하고, BCP를 이용하여 중화시켰다. 중화시킨 액체에 isopropanol을 이용하여 mRNA를 침강시켰다. 이어서 원심분리기를 이용하여 침강된 mRNA만을 모아 실험에 이용하였다. 세포 내 mRNA는 cDNA kit를 이용하여 cDNA로 합성하여, PCR을 통해 멜라닌 형성에 중요한 유전자인 Tyrosinase, TYRP-1, TYRP-2, MITF 유전자의 발현량을 확인하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, FAM86A 과발현 결과 멜라닌 형성 관련 유전자들이 하향 조절됨을 확인하였다. 따라서, FAM86A의 과발현은 단백질 수준에서 뿐만 아니라 유전자 수준에서도 멜라닌 형성을 감소시킴을 확인하였다.
실시예 13. FAM86A 과발현에 따른 멜라닌 형성 관련 단백질 발현량 확인 (Western blotting)
실시예 8과 같이, 마우스 흑색종 B16F10 세포에 Myc-FAM86A를 형질주입하여 FAM86A를 과발현 시킨 후 실시예 6의 웨스턴 블롯을 통해 FAM86A K/D 수준 및 멜라닌 형성과 관련된 MAPK & MC1R 신호전달경로 단백질들의 발현량을 확인하였다.
구체적으로, 세포는 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 세포 배양기에서 48시간 동안 배양 하였다. 그 후 PBS 로 2회 세척하였다. 그 다음 PBS를 완전히 제거한 후 세포 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 각각의 접시에 넣고 스크래퍼를 이용하여 긁었다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동한 SDS-PAGE젤의 단백질을 PVDF막으로 이동시킨 후, 단백질 이동이 완료된 PVDF막을 상온에서 TBS-T(in 100mM NaCl, 10mM Tris, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.4 (PBST)containing 3% BSA)로 블록킹하였다.그 다음 TBS-T를 사용하여 10분간 3회 세척한 후, 3% BSA를 녹인 TBS-T에 1차 항체를 1시간 처리하고, TBS-T로 충분히 세척하였다. 그리고 2차 항체를 1시간 동안 처리하고 PBS-T로 10분씩 3회 세척하였다. 그 다음 ECL detection system 을 사용하여 특정 단백질의 양 및 위치를 확인하였다. 단백질 양의 보정은 PVDF 막을 재활용 (stripping) 하여 액틴 단백질의 양을 확인함으로써 동량임을 확인하였다. 각각의 항체는 Cell signaling 및 Santacruz에서 구입하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, FAM86A 과발현 결과 MC1R 신호전달경로의 단백질인 MC1R, p-CREB 및 p-MITF 단백질의 발현량이 현저히 감소함을 확인하였다. 상기 결과를 통해 FAM86A의 발현이 높아짐에 따라 멜라닌 형성 신호전달경로인 MC1R의 활성도가 감소함을 확인함으로써 FAM86A 가 증가되면 멜라닌 형성을 감소시킴을 확인하였다.
이상의 실시예를 종합하여, 본 발명자들은 FAM86A를 멜라닌 생성의 검출 바이오마커로서 활용할 수 있음을 확인하였는 바, FAM86A 수준을 측정함으로써 멜라닌 형성 검출하고, 그에 따라 색소관련 피부 상태를 진단할 수 있음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 본 발명의 FAM86A 단백질을 포함하는 미백용 건강기능식품, 화장료 조성물과 이들 개발을 위한 마커로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
이에 더하여, 본 발명의 FAM86A 단백질 또는 이의 아고니스트를 피부 미백용 화장료 조성물로 이용할 수 있음을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Composition for melanin formation detection and Screening method of skin whitening materials <130> MP19-207P1 <150> KR 10-2019-0100307 <151> 2019-08-16 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM86A(NP_958802.1) <400> 1 Met Ala Pro Glu Glu Asn Ala Gly Thr Glu Leu Leu Leu Gln Ser Phe 1 5 10 15 Glu Arg Arg Phe Leu Ala Ala Arg Thr Leu Arg Ser Phe Pro Trp Gln 20 25 30 Ser Leu Glu Ala Lys Leu Arg Asp Ser Ser Asp Ser Glu Leu Leu Arg 35 40 45 Asp Ile Leu His Lys Thr Val Lys His Pro Val Cys Val Lys His Pro 50 55 60 Pro Ser Val Lys Tyr Ala Arg Cys Phe Leu Ser Glu Leu Ile Lys Lys 65 70 75 80 His Glu Ala Val His Thr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Tyr Glu Ala Leu 85 90 95 Ala Glu Thr Leu Met Ala Lys Glu Ser Thr Gln Gly His Arg Ser Tyr 100 105 110 Leu Leu Pro Ser Gly Gly Ser Val Thr Leu Ser Glu Ser Thr Ala Ile 115 120 125 Ile Ser Tyr Gly Thr Thr Gly Leu Val Thr Trp Asp Ala Ala Leu Tyr 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<400> 2 Met Ala Pro Glu Glu Asn Ala Gly Thr Glu Leu Leu Leu Gln Gly Phe 1 5 10 15 Glu Arg Arg Phe Leu Ala Val Arg Thr Leu Arg Ser Phe Pro Trp Gln 20 25 30 Ser Leu Glu Ala Lys Leu Arg Asp Ser Ser Asp Ser Glu Leu Leu Arg 35 40 45 Asp Ile Leu Gln Lys Thr Val Arg His Pro Val Cys Val Lys His Pro 50 55 60 Pro Ser Val Lys Tyr Ala Trp Cys Phe Leu Ser Glu Leu Ile Lys Lys 65 70 75 80 Ser Ser Gly Gly Ser Val Thr Leu Ser Lys Ser Thr Ala Ile Ile Ser 85 90 95 His Gly Thr Thr Gly Leu Val Thr Trp Asp Ala Ala Leu Tyr Leu Ala 100 105 110 Glu Trp Ala Ile Glu Asn Pro Ala Ala Phe Ile Asn Arg Thr Val Leu 115 120 125 Glu Leu Gly Ser Gly Ala Gly Leu Thr Gly Leu Ala Ile Cys Lys Met 130 135 140 Cys Arg Pro Arg Ala Tyr Ile Phe Ser Asp Pro His Ser Arg Val Leu 145 150 155 160 Glu Gln Leu Arg Gly Asn Val Leu Leu Asn Gly Leu Ser Leu Glu Ala 165 170 175 Asp Ile Thr Gly Asn Leu Asp Ser Pro Arg Val Thr Val Ala Gln Leu 180 185 190 Asp Trp Asp Val Ala Met Val His Gln Leu Ser Ala Phe Gln Pro Asp 195 200 205 Val Val Ile 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<220> <223> FAM86(NP_081722.1) <400> 5 Met Ala Pro Glu Asp His Glu Gly Ala Thr Ser Leu Leu Gln Ser Phe 1 5 10 15 Glu Arg Arg Phe Leu Ala Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Pro Trp Gln 20 25 30 Ser Leu Glu Glu Lys Leu Lys Asp Pro Ser Gly Ser Glu Leu Leu Leu 35 40 45 Ala Ile Leu Gln Arg Thr Val Lys His Pro Val Cys Val Gln His Gly 50 55 60 Pro Ser Val Lys Tyr Ala Arg Cys Phe Leu Ser Lys Leu Ile Lys Lys 65 70 75 80 His Glu Ala Val Pro Thr Glu Pro Leu Asp Ala Leu Tyr Glu Ala Leu 85 90 95 Ala Glu Val Leu Met Thr Gln Glu Ser Thr Gln Cys His Arg Ser Tyr 100 105 110 Leu Leu Pro Ser Gly Asn Ser Val Thr Leu Ser Glu Ser Thr Ala Ile 115 120 125 Val Ser His Gly Thr Thr Gly Leu Val Thr Trp Asp Ala Ala Leu Tyr 130 135 140 Leu Ala Glu Trp Ala Ile Glu Asn Pro Ala Ala Phe Thr Asp Arg Thr 145 150 155 160 Ile Leu Glu Leu Gly Ser Gly Ala Gly Leu Thr Gly Leu Ala Ile Cys 165 170 175 Lys Ala Cys Cys Pro Arg Ala Tyr Ile Phe Ser Asp Cys His Ala Gln 180 185 190 Val Leu Glu Gln Leu Arg Gly Asn Val Leu Leu Asn Gly Phe Ser 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cacgaggctg tccacacaga gcctttggac gagctgtatg aagcgctggc ggagaccctg 300 atggccaagg agtccaccca gggccaccgg agctatttgc tgccctcggg aggctcggtc 360 acactctccg agagcacggc catcatctcc tacggtacca caggcctggt cacatgggac 420 gccgccctct accttgcaga atgggccatc gagaacccgg cagtcttcac taacaggact 480 gtcctagagc ttggcagtgg tgctggcctc acaggcctgg ccatctgcaa gatgtgccgc 540 ccccgggcat acatcttcag cgactgtcac agccgggtcc ttgagcagct ccgagggaat 600 gtccttctca atggcctctc attagaggca gacatcactg ccaagttaga cagccccagg 660 gtgacagtgg cccagctgga ctgggacgtc gcgacggtcc atcagctctc tgccttccag 720 ccagatgttg tcattgcagc agatgtgctg tattgcccag aagccatcat gtcgctggtc 780 ggcgtcctgc ggaggctggc tgcctgccgg gagcaccagc gggctcctga ggtctacgtg 840 gcctttaccg tccgcaaccc agagacgtgc cagctgttca ccaccgagct aggccgggcc 900 gggatcagat gggaagtgga acctcgtcat gagcagaaac tgtttcccta cgaagagcac 960 ttggagatgg caatgctgaa tctcaccctg tag 993 <210> 7 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM86B1(NM_001083537.2) <400> 7 atggcgcccg aggagaacgc 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tcacactgta g 891 <210> 8 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM86B2(NM_001137610.2) <400> 8 atggcgcccg aggagaacgc ggggaccgaa ctcttgctgc agggttttga gcgccgcttc 60 ctggcggtgc gcacactgcg ctccttcccc tggcagagct tagaggcaaa gttaagagac 120 tcatcagatt ctgagctgct gcgggatatt ttgcagaaga ctgtgaggca tcctgtgtgt 180 gtgaagcacc cgccgtcagt caagtatgcc tggtgctttc tctcagaact catcaaaaag 240 cacgaggctg tccacacgga gcctttggac aaactgtacg aggtgctcgc ggagactctg 300 atggccaagg agtccaccca gggccaccgg agctatttgc tgtcctcagg aggctcagtc 360 acactctcca agagcacagc catcatctcc cacggtacca caggcctggt cacatgggat 420 gccgccctct accttgcaga atgggccatc gagaacccgg cagccttcat taacaggact 480 gtcctagagc ttggcagtgg tgccggcctc acaggccttg ccatctgcaa gatgtgccgc 540 ccccgggcat acatcttcag cgaccctcac agccggatcc tcgagcagct ccgagggaat 600 gtccttctca atggcctctc attagaggca gacatcactg gcaacttaga cagccccagg 660 gtgacagtgg cccagctgga ctgggacgta gcaatggtcc atcagctctc tgccttccag 720 ccagatgttg tcattgcagc agacgtgctg tattgcccag aagccatcgt gtcgctggtc 780 ggggtcctgc agaggctggc tgcctgccgg gagcacaagc gggctcctga ggtctacgtg 840 gcctttaccg tccgcaaccc agagacatgc cagctgttca ccaccgagct aggccgggat 900 gggatcagat gggaagcgga agctcatcat gaccagaaac tgtttcccta tggagagcac 960 ttggagatgg caatgctgaa cctcacactg tag 993 <210> 9 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM86C1(NM_018172.3) <400> 9 atggcgcccg aggagaacgc ggggagcgaa ctcttgctgc agagtttcaa gcgccgcttc 60 ctggcagcgc gcgccctgcg ctccttccgc tggcagagct tagaagcaaa gttaagagac 120 tcatcagatt ctgagctgct gcgggatatt ttgcagaagc acgaggctgt ccacacagag 180 cctttggatg agctgtacga ggtgctggtg gagaccctga tggccaagga gtccacccag 240 ggccaccgga gctatttgct gacgtgctgt attgcccaga agccatcgtg tcgctggtcg 300 gggtcctgcg gaggctggct gcctgccggg agcaccagcg ggctcctcaa ttctacatgg 360 cccttaccgt ctgcaaccca gagatgtgcc agctgttcac caccgagcta tgctggactg 420 ggatcagatg ggaagcggaa gctcatcatg accagaaact gtttccctac agagagcact 480 tggagatggc aaagctga 498 <210> 10 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM86(NM_027446.2) <400> 10 atggcgcctg aggaccacga gggggccacg tctctgctgc agagtttcga gcgccgcttc 60 ctggcggctc gcgcgctgcc ctcctttccc tggcagagcc tagaagaaaa actaaaggac 120 ccctcgggtt ctgagctgtt gctggctatt ctgcagagga ctgtgaagca ccctgtgtgt 180 gtgcagcacg gaccttctgt gaagtatgcc cgctgctttc tctcaaagct catcaaaaag 240 catgaggctg tacccacgga gcctttggat gcactgtatg aggcgttggc agaggttctg 300 atgacccaag agtccaccca gtgccaccgg agctatttgc tgccttcagg aaactcagtt 360 acactctctg agagcactgc catcgtgtcc catggcacca caggcttggt tacatgggac 420 gctgctctct acctggcaga atgggccatt gagaacccag cagccttcac tgacaggact 480 atcctggagc taggcagtgg agctggcctt acaggcctgg caatttgcaa ggcatgctgc 540 cccagagcat acatcttcag cgactgtcat gcccaagtgc ttgagcagct ccgtggaaac 600 gttctcctca acggcttctc cttagagccg cacaccccca ttgacgcagg cagctcgaag 660 gtgacagtgg ctcagctgga ctgggacgag gtgacagcct ctcagctctc tgccttccag 720 gcagatgttg tcattgcagc agatgtactg tactgctggg agatgacact gtcactggtc 780 agggtcctga agatgctcga ggactgccag aggaagagcg ctcctgatgt ctatgtagcc 840 tatactatcc gcagccagga cacaggcaag ctgttcatcg aagagctgga ccgtgctgga 900 atctactggg aagaggtgcc ccctcacact ggcaaactgt tcccttacga agagcattca 960 gccatcgtaa tcctgaagct ggtgctgacc agtcgccatg gtgtttga 1008 <210> 11 <211> 4795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCMV Myc mFAM86 full vector <400> 11 gagttcgagc ttgcatgcct gcaggtcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 60 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 120 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 180 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 240 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 300 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 360 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 420 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 480 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 540 gtgaaccgtc 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tggccttaca ggcctggcaa tttgcaaggc atgctgcccc 1440 agagcataca tcttcagcga ctgtcatgcc caagtgcttg agcagctccg tggaaacgtt 1500 ctcctcaacg gcttctcctt agagccgcac acccccattg acgcaggcag ctcgaaggtg 1560 acagtggctc agctggactg ggacgaggtg acagcctctc agctctctgc cttccaggca 1620 gatgttgtca ttgcagcaga tgtactgtac tgctgggaga tgacactgtc actggtcagg 1680 gtcctgaaga tgctcgagga ctgccagagg aagagcgctc ctgatgtcta tgtagcctat 1740 actatccgca gccaggacac aggcaagctg ttcatcgaag agctggaccg tgctggaatc 1800 tactgggaag aggtgccccc tcacactggc aaactgttcc cttacgaaga gcattcagcc 1860 atcgtaatcc tgaagctggt gctgaccagt cgccatggtg tttgaagatc tctcgaggta 1920 ccgcggccgc ggggatccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 1980 tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 2040 aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 2100 ggttcagggg gaggtgtggg aggttttttc ggatcctcta gagtcgatct gcaggcatgc 2160 tagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 2220 tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 2280 ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 2340 ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 2400 ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 2460 agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 2520 catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 2580 tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 2640 gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 2700 ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 2760 cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 2820 caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 2880 ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 2940 taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 3000 taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 3060 cttcggaaaa agagttggta 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gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 3960 ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 4020 ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 4080 tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 4140 aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 4200 actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 4260 catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 4320 agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 4380 tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 4440 gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 4500 tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 4560 gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 4620 aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 4680 ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 4740 aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagt 4795 <210> 12 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mFAM86 <400> 12 atggcgcctg aggaccacga gggggccacg tctctgctgc agagtttcga gcgccgcttc 60 ctggcggctc gcgcgctgcc ctcctttccc tggcagagcc tagaagaaaa actaaaggac 120 ccctcgggtt ctgagctgtt gctggctatt ctgcagagga ctgtgaagca ccctgtgtgt 180 gtgcagcacg gaccttctgt gaagtatgcc cgctgctttc tctcaaagct catcaaaaag 240 catgaggctg tacccacgga gcctttggat gcactgtatg aggcgttggc agaggttctg 300 atgacccaag agtccaccca gtgccaccgg agctatttgc tgccttcagg aaactcagtt 360 acactctctg agagcactgc catcgtgtcc catggcacca caggcttggt tacatgggac 420 gctgctctct acctggcaga atgggccatt gagaacccag cagccttcac tgacaggact 480 atcctggagc taggcagtgg agctggcctt acaggcctgg caatttgcaa ggcatgctgc 540 cccagagcat acatcttcag cgactgtcat gcccaagtgc ttgagcagct ccgtggaaac 600 gttctcctca acggcttctc cttagagccg cacaccccca ttgacgcagg cagctcgaag 660 gtgacagtgg ctcagctgga ctgggacgag gtgacagcct ctcagctctc tgccttccag 720 gcagatgttg tcattgcagc agatgtactg 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atataagcag agctcgttta 540 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 600 cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gatccggtac tagaggaact gaaaaaccag 660 aaagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc aggtcccgga tccggtggtg 720 gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt acttctaggc ctgtacggaa 780 gtgttacttc tgctctaaaa gctgcggaat tgtacccgcg ggcccaccat ggcatcaatg 840 cagaagctga tctcagagga ggacctgctt atggccatgg aggcccgaat tcggtcgacc 900 gagatctctc gaggtaccgc ggccgcgggg atccagacat gataagatac attgatgagt 960 ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg 1020 ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca 1080 ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttcggat cctctagagt 1140 cgatctgcag gcatgctagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 1200 gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 1260 gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 1320 cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 1380 tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 1440 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 1500 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 1560 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 1620 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 1680 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 1740 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 1800 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 1860 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 1920 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 1980 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 2040 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 2100 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 2160 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 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Claims (12)

  1. FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 FAM86A의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 형성 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 FAM86A의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 형성 검출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 FAM86A의 mRNA는 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 형성 검출용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 FAM86A의 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 형성 검출용 조성물.
  6. FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 멜라닌 형성 검출용 키트.
  7. 하기 단계를 포함하는 피부 미백 물질의 스크리닝 방법:
    (a) FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군 세포와 비교해 상기 FAM86A의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현량을 증가시킨 물질을 피부 미백 물질로 선별하는 단계.
  8. FAM86A 단백질, 이의 아고니스트, 이의 활성화제, FAM86A 유전자를 포함하는 발현벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 아고니스트 또는 활성화제는 화합물 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  10. FAM86A 단백질, 이의 아고니스트, 이의 활성화제, FAM86A 유전자를 포함하는 발현벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 식품 조성물.
  11. FAM86A 단백질, 이의 아고니스트, 이의 활성화제, FAM86A 유전자를 포함하는 발현벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 색소 침착 질환은 색소 침착, 기미, 주근깨, 잡티, 점, 반점, 오타모반, 푸른 흑피증(cyanic melasma), 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 검버섯, 노인성 흑자, 상처, 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 및 멜라닌 피부증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.

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