WO2019059634A1 - D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물 Download PDF

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WO2019059634A1
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tyrosine
peptide
melanin
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tyr
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오억수
박지수
정혜정
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주식회사 스킨큐씨
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Definitions

  • the present invention relates to a skin whitening composition comprising D-tyrosine or a peptide containing D-tyrosine. More specifically, the present invention relates to a skin whitening cosmetic composition comprising D-tyrosine or a peptide comprising the D-tyrosine or a salt thereof; Pharmaceutical compositions; Health functional food composition; Quasi-drug composition; And compositions for inhibiting melanin synthesis.
  • Melanin is synthesized by melanocytes in the basal layer of the skin and is transferred to the keratinocyte through the cytoplasm. Melanin in the epidermis absorbs ultraviolet light to prevent damage to cellular proteins and nucleic acids. However, when the melanin is overly synthesized locally, or when the physiological function of the skin is deteriorated due to aging or the like, an abnormality occurs in the melanin production process, which causes pigmentation such as spots, freckles, black spots and sunburn.
  • Melanocyte stimulating hormone ⁇ -MSH
  • ultraviolet B and the like are particularly exposed in everyday life, as are the genetic, hormonal imbalance, endocrine diseases, stress and ultraviolet rays. It is known as an easy intrinsic or environmental factor.
  • L-tyrosine which acts as a hormone-like regulator, increases the melanin content in human melanoma and hamster melanoma cells and induces the appearance of a large number of melanocytes (Slominski A, Pigment Cell Melanoma Res 2012; 25 (1): 14-27.), which is also considered to be a major cause of melanin synthesis.
  • melanogenesis enzymes include tyrosinase (TYR), tyrosinase-related protein 1 (TRP-1) and tyrosinase-related protein 2 2, TRP-2 / DOPA, chrome tautomerase), and the melanin-forming enzyme is known to be regulated by a transcription factor called MITF (microphthalmia-associated transcription factor).
  • Tyrosinase which plays an important role in the melanin synthesis pathway, converts L-tyrosine into L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) and converts the resulting L-DOPA into L-dopaquinone L-dopaquinone), which in turn eventually forms melanin.
  • Pigmentation on the other hand, can make the face feel dull and can also have a negative impact on the impression.
  • a substance that can be used for prevention, improvement, treatment, or skin whitening use of a pigmentation-related disease is actively conducted.
  • Examples thereof include skin whitening compositions comprising stipitolide as an active ingredient (Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2017-0053150), a whitening cosmetic composition containing a quercitin extract and a method for producing the same 10-2017-0049743).
  • D-tyrosine or a peptide containing it can effectively inhibit melanin production by L-tyrosine, UVB or alpha-MSH, And that it does not show toxicity to skin cells, it can be safely used as a composition for prevention or treatment of melanin pigment hyperpigmentation diseases and as a composition for whitening, thereby completing the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for skin whitening comprising D-tyrosine or a peptide comprising it, or a pharmaceutically acceptable salt of D-tyrosine.
  • Another object of the present invention is to provide a quasi-skin whitening composition comprising D-tyrosine or a peptide comprising the same, or a quasi-acceptable salt of D-tyrosine.
  • composition for inhibiting melanin synthesis which comprises a salt of D-tyrosine or a peptide containing D-tyrosine or a salt of D-tyrosine.
  • Another object of the present invention is to provide a skin whitening method comprising the step of administering to a subject a composition comprising D-tyrosine or a peptide comprising D-tyrosine or a salt thereof, or D-tyrosine.
  • Another object of the present invention is to provide a skin whitening use of D-tyrosine or a peptide comprising it or a salt of D-tyrosine.
  • D-tyrosine or a peptide comprising it inhibits melanin synthesis, Since the amount of melanin produced by L-tyrosine, alpha -MSH or UV, which is a main factor causing melanin synthesis, is reduced and does not show toxicity to skin cells, the composition of the present invention containing it is safe and useful as a skin whitening application Can be used.
  • L-Tyr L-tyrosine
  • D-Tyr D-tyrosine
  • A is a graph showing the amount of melanin produced after MNT-1 human malignant melanoma cells were treated with various concentrations of L-tyrosine or D-tyrosine for 24 hours, and the amount of melanin was measured by means of three experiments ⁇ SEM , * Means P ⁇ 0.05 and ** means P ⁇ 0.01;
  • B is an image showing tyrosinase (TYR) and MITF protein expression levels detected after MNT-1 cells were treated with various concentrations of L-tyrosine or D-tyrosine for 24 hours.
  • ⁇ -actin was used as a loading control;
  • C is a schematic showing the experimental strategy under conditions without L-tyrosine
  • D is an image showing the amount of TYR expression over time after treatment of MNT-1 cells with L-tyrosine or D-tyrosine in the absence of L-tyrosine as a result of the experiment according to the strategy of C above. beta -actin was used as a loading control;
  • E is the result of performing the experiment according to the strategy of C above.
  • the melanin amount and TYR activity generated after treatment of MNT-1 cells with various concentrations of L-tyrosine or D-tyrosine in the absence of L- It is a graph showing.
  • the amount of melanin was expressed as mean ⁇ SEM through three experiments, * means P ⁇ 0.05 and ** means P ⁇ 0.01;
  • 2 is a graph showing the inhibitory activity of melanin synthesis by L-tyrosine of D-tyrosine. Specifically,
  • the amount of melanin was expressed as mean ⁇ SEM through three experiments, * means P ⁇ 0.05 and ** means P ⁇ 0.01;
  • B was cultured for 24 hours with various concentrations of L-tyrosine or D-tyrosine on MNT-1 cells pre-incubated with a medium containing L-tyrosine (Tyr And the amount of protein expression of TYR, TRP1 and MITF detected after treatment.
  • beta -actin was used as a loading control;
  • C is an image showing MNT-1 cells treated with various concentrations of L-tyrosine or D-tyrosine for 24 hours and then reacted with L-DOPA. Scale bars represent 20 [mu] m;
  • D is a graph showing the survival rate of MNT-1 cells after treatment with various concentrations of L-tyrosine or D-tyrosine for 24 hours. The survival rate was expressed as mean ⁇ SEM through three experiments;
  • E is an image showing the expression levels of proteins involved in the Wnt signaling pathway detected after treatment with 500 ⁇ M of D-tyrosine in MNT-1 cells.
  • Figure 3 is a diagram showing the tyrosinase inhibiting activity of D-tyrosine. Specifically,
  • A shows the TYR activity depending on the concentration after treatment with L-tyrosine, D-tyrosine or L-DOPA on HEK 293 cells transfected with the empty vector (-) or tyrosinase coding vector (+ Graph.
  • the TYR activity was expressed as mean ⁇ SEM through three experiments;
  • B is Thai rosinase A graph showing TYR activity over time after treatment with 1 mM L-DOPA and various concentrations of D-tyrosine on HEK 293 cells transfected with the coding vector, SEM;
  • C is a graph showing TYR activity over time after 5 mM of L-tyrosine and various concentrations of D-tyrosine were treated on HEK 293 cells transfected with a tyrosinase coding vector.
  • the TYR activity was expressed as mean ⁇ SEM through three experiments;
  • D can be obtained by treating MNT-1 cells with various concentrations of L-DOPA alone (-D-Tyr) or various concentrations of L-DOPA and 5 mM D-tyrosine (+ D-Tyr)
  • E is a graph showing the level of D-tyrosine present in cells after treating MNT-1 cells with various concentrations of D-tyrosine.
  • Figure 4 shows the effect of D-tyrosine down-regulating melanin synthesis induced by? -MSH or UVB, showing the results of treatment of various concentrations of D-tyrosine after treatment with? -MSH or UVB .
  • A is an image showing the amount of protein expression of TYR, TRP1 and MITF detected after treatment of MNT-1 cells with? -MSH and D-tyrosine;
  • B is a graph showing the amount of melanin produced after treatment of MNT-1 cells with? -MSH and D-tyrosine.
  • the amount of melanin was expressed as mean ⁇ SEM through three experiments, * indicates P ⁇ 0.05 and * * Means P ⁇ 0.01;
  • C is an image showing MNT-1 cells reacted with L-DOPA after ⁇ -MSH and D-tyrosine treatment, and the scale bar shows 20 ⁇ m;
  • D is an image showing the amount of protein expression of TYR, TRP1 and MITF detected after treatment of MNT-1 cells with UVB and D-tyrosine;
  • E is a graph showing the amount of melanin produced after treatment of MNT-1 cells with UVB and D-tyrosine, wherein the amount of melanin was expressed as the mean value ⁇ SEM through three experiments, * indicates P ⁇ 0.05 and ** indicates P ⁇ 0.01;
  • F is an image showing MNT-1 cells reacted with L-DOPA after UVB and D-tyrosine treatment.
  • the scale bar represents 20 mu m.
  • Figure 5 shows the effect of D-tyrosine down-regulating melanin synthesis on human melanocytes.
  • A is a graph showing the amount of melanin produced after L-tyrosine or D-tyrosine treatment for 24 hours.
  • the amount of melanin was expressed as mean ⁇ SEM through three experiments, * means P ⁇ 0.05 and ** means P ⁇ 0.01;
  • B is a graph showing the TYR activity measured after treating L-tyrosine or D-tyrosine for 24 hours and reacting with L-DOPA;
  • C is an image showing the amount of protein expression of TYR and TRP1 measured after 24 hours of treatment with L-tyrosine or D-tyrosine. beta -actin was used as a loading control;
  • D is an image showing the appearance of cells reacted with L-DOPA after 24 hours of treatment with L-tyrosine or D-tyrosine.
  • the scale bar represents 20 ⁇ ⁇ ;
  • E is a graph showing the amount of melanin produced after 1 ⁇ M ⁇ -MSH and various concentrations of D-tyrosine treated for 24 hours.
  • FIG. 6 is a graph depicting, for a 3D human skin model, D-tyrosine. ≪ / RTI > Specifically,
  • A is a schematic showing the experimental strategy
  • B is an image and a graph showing the appearance of a cultured human skin model.
  • the dark areas were analyzed using the ImageJ program, and the dark areas measured were shown relative to the total area. Values are expressed as means ⁇ SEM over three experiments, * means P ⁇ 0.05;
  • C is an image of cells stained with hematoxylin and eosin, showing the immunohistochemical appearance of melanocytes in the basal layer of cultured human skin model. Immunostaining was performed using antibodies against pre-immune serum (IgG) as a TYR or negative control. Images were observed at 40X (upper and middle) or 20X (lower) and the scale bars at 50 ⁇ m;
  • D is a graph showing the relative amount of melanin present in sections of skin stained with hematoxylin and eosin.
  • the amount of melanin was analyzed by the ImageJ program, and the relative amount of melanin was expressed as mean ⁇ SEM, and ** means P ⁇ 0.01.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of peptides containing D-tyrosine on melanin synthesis, showing the amount of melanin detected, the activity of tyrosinase, and the amount of MITF expressed after each peptide treatment
  • NL is a peptide containing L-tyrosine at its N-terminus
  • ND is a peptide containing D-tyrosine at its N-terminus
  • CL is a peptide containing L-tyrosine at its C-terminus
  • CD is a peptide containing C- End of the peptide).
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of peptides containing D-tyrosine on melanin synthesis, showing the dark area width and melanin amount after each peptide treatment.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of a peptide containing D-tyrosine down-regulating melanin synthesis induced by? -MSH, wherein MNT-1 cells were treated with a peptide containing? -MSH and D-tyrosine The amount of melanin detected, the amount of MITF protein expressed, and the width of the dark area.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of a peptide containing D-tyrosine that down-regulates UV-induced melanin synthesis, wherein MNT-1 cells were treated with peptides containing UV and D-tyrosine, Amount of MITF protein, and width of dark area.
  • FIG. 11 shows the effect of peptides containing D-tyrosine on melanin synthesis in human superficial epinephrine melanocytes, showing the amount of melanin, tyrosinase activity and dark area.
  • Figure 12 shows the effect of peptides containing D-tyrosine, which down-regulates melanin synthesis induced by? -MSH or UV in human superficial epinephrine melanocytes, showing the width of melanin and the dark area.
  • FIG. 13 is a graph showing the effect of peptides (DD) containing D-tyrosine at N-terminal and C-terminal on melanin synthesis, showing the amount of melanin detected after each peptide treatment.
  • FIG. 14 shows the reduction of the amount of melanin and maintenance of anti-aging activity when D-tyrosine is contained in a peptide having anti-aging effect (Tetrapeptide-21).
  • FIG. 15 shows the reduction of the amount of melanin and maintenance of anti-inflammatory activity when D-tyrosine is contained in a peptide (Tri) having an anti-inflammatory effect.
  • a cosmetic composition for skin whitening comprising D-tyrosine or a peptide containing D-tyrosine or a cosmetically acceptable salt of D-tyrosine, to provide.
  • D-tyrosine or a peptide comprising it inhibits the production, synthesis or formation of melanin in MNT-1 human malignant melanoma cells, human superficial melanocytes and human skin models, ultraviolet B), the amount of melanin increased by L-tyrosine or melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH), which is a substrate of tyrosinase, and further decreased the amount of tyrosinase tyrosinase and the activity of D-tyrosine, and thus it has been confirmed that the D-tyrosine or the peptide containing D-tyrosine can be usefully used for skin whitening.
  • L-tyrosine or melanocyte stimulating hormone ⁇ -MSH
  • D-tyrosine refers to tyrosine having a chiral structure of D-form.
  • the tyrosine is named 4-hydroxylphenylalanine.
  • the D-tyrosine may be a separated D-tyrosine, and may be chemically synthesized or commercially available, but is not limited thereto.
  • the term "peptide comprising D-tyrosine” refers to a peptide comprising D-tyrosine.
  • Peptides are compounds in which two or more amino acids are formed by peptide bonding in the form of a chain or ring with an ⁇ -carboxyl group and an ⁇ -amino group.
  • the number of oligopeptides (2 to 10 amino acids) or polypeptides And the number of amino acids is 10 to 50).
  • the peptides of the present invention may comprise from 2 to 13, more specifically from 2 to 10, from 2 to 9, from 2 to 8, from 2 to 7, even more specifically from 2 to 6, But it is not limited thereto. In the examples of the present invention, it was confirmed that whitening activity was excellent when all of the peptides having various lengths contained D-tyrosine.
  • the peptide comprises an N-terminal thereof; C-terminal; Or D-tyrosine at the N-terminus and C-terminus.
  • the peptide when D-tyrosine is included at the terminal of the peptide, the peptide exhibits an excellent effect in inhibiting melanin synthesis, and the peptide preferably contains D-tyrosine at the terminal, that is, at the N-terminal and / or the C-terminal can do.
  • the effect of inhibiting the melanin synthesis of the peptide containing C-terminal of D-tyrosine at the N-terminal is more excellent than that of the peptide containing D-tyrosine at the N-terminal and in particular, It may be preferable to include D-tyrosine at the C-terminus, and it may be most preferable to include D-tyrosine at both the N-terminus and the C-terminus because the peptide has better melanin synthesis inhibitory effect.
  • the peptide may be selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO:
  • the D-tyrosine may be included in the form of a salt suitable for the form of the composition to be contained.
  • the D-tyrosine is in the form of a cosmetically acceptable salt thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a quasi-acceptable salt thereof, a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, Food compositions or quasi-drugs, respectively.
  • a cosmetically acceptable salt, a pharmaceutically acceptable salt, a pharmacologically acceptable salt or a quasi-externally acceptable salt in the present invention means a salt in which a cation and an anion are bonded by electrostatic attraction Quot; means a salt of a form that can be used in cosmetics, pharmaceuticals, foodstuffs or quasi-drugs. It may be a metal salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a salt with a basic or an acidic amino acid, and the like.
  • the metal salt may be an alkali metal salt (sodium salt, potassium salt, etc.), an alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.), an aluminum salt and the like;
  • salts with organic bases include salts with organic bases such as triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, And the like;
  • the salt with inorganic acid may be a salt with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like;
  • Salts with organic acids may be salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p
  • D-tyrosine may competitively inhibit tyrosinase activity by L-tyrosine.
  • L-tyrosine in the present invention is an L-form tyrosine existing in nature and is a natural tyrosine generally present in nature. It is known that L-tyrosine increases tyrosinase activity and promotes melanin synthesis.
  • tyrosinase in the present invention means an enzyme involved in the production of melanin. Since the tyrosinase forms melanin through various reactions using tyrosine as a substrate, a method of inhibiting the activity of tyrosinase is widely used as a means for inhibiting melanin synthesis.
  • melanin is generically referred to as a black or brown pigment existing in tissues such as skin and eyes. It is synthesized by various factors in the cell, and melanin present in the epidermis absorbs ultraviolet light and prevents damage of cellular protein or nucleic acid. However, when the melanin is overly synthesized locally, or when the physiological function of the skin is deteriorated due to aging or the like, an abnormality occurs in the melanin production process, and thus the skin is free from stain, freckles, black lentigines, solar lentigines, It causes pigmentation such as Ota, blue nevus, Mongolian, macule or dullness.
  • the peptide is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or 14, and may further have an anti-aging activity.
  • the peptide is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and may further have anti-inflammatory activity.
  • anti-aging of the present invention means an action for suppressing aging of the skin, which means improvement of symptoms such as reduction of elasticity of skin, reduction of gloss, wrinkle formation, weakening regenerative power, or severe drying.
  • anti-inflammatory of the present invention means inhibiting inflammation. Inflammation reactions are caused to reduce the enhancement and damage of the in vivo restoration system, and if it is severe or lasts for a long time, damage of the cell may be caused and various inflammatory diseases may be caused.
  • the anti-inflammatory activity which suppresses this can reduce the damage of the cells, so that it can show effects such as improvement of acne or folliculitis, reduction of pores and the like.
  • the cosmetic composition of the present invention may exhibit properties of functional cosmetics.
  • cosmedical, cosmeceutical refers to a product having a professional function that has been introduced into cosmetics and has a special therapeutic function emphasizing physiologically active effects and effects unlike general cosmetics.
  • the functional cosmetics include products that help skin whitening, products that help to improve skin wrinkles, and the like.
  • the term “ skin whitening” refers to whitening of skin, and includes prevention or improvement of at least one selected from the group consisting of spots, freckles, black spots and dull spots.
  • the skin whitening can be achieved by inhibiting the production, synthesis or formation of melanin, but is not limited thereto.
  • D-tyrosine may inhibit melanin synthesis by decreasing the expression and activity of tyrosinase and may be increased by L-tyrosine, UVB or alpha-MSH, It was confirmed that the expression level of the synergist and its activity could be reduced (Figs. 1 to 6).
  • peptides containing D-tyrosine can also inhibit the expression and activity of tyrosinase, inhibit melanin synthesis, decrease the amount of melanin increased by? -MSH, and the activity of tyrosinase (Figs. 7 to 15).
  • composition of the present invention comprising D-tyrosine or a peptide containing D-tyrosine effectively inhibits melanin synthesis and thus can be usefully used as a functional cosmetic composition for skin whitening.
  • the cosmetic composition containing the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulations conventionally produced in the art and may be in the form of solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, Active-agent-containing cleansing, oils, powdered foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays, and the like. More specifically, the present invention relates to a cosmetic lotion composition comprising a lotion, a cosmetic lotion, a nutritional lotion, a nutritional cream, a massage cream, a lotion, a gel, an essence, an eye cream, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, May be prepared in a formulation.
  • the cosmetic composition of the present invention can be used as an adjuvant in the field of cosmetics such as a lipid, an organic solvent, a solubilizer, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, A surfactant, a water, an ionic or nonionic emulsifier, a filler, a sequestering agent, a chelating agent, a preservative, a vitamin, a blocking agent, a wetting agent, an essential oil, a dye, a pigment, a hydrophilic or lipophilic active agent, As well as any other ingredients commonly used in cosmetics or dermatology, such as cosmetics or dermatological sciences.
  • cosmetics such as a lipid, an organic solvent, a solubilizer, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, A
  • composition for skin whitening comprising D-tyrosine or a peptide comprising D-tyrosine or a pharmaceutically acceptable salt of D-tyrosine.
  • D-tyrosine, D-tyrosine-containing peptide, D-tyrosine salt and skin whitening are as described above.
  • the pharmaceutical composition may be used for the prophylaxis or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of solar lentigines, warts, osteoblasts, blue nevi, mongolian nodules and hyperpigmentation macules Lt; / RTI >
  • the above-mentioned diseases are pigmentary diseases in which melanin pigment is overly deposited on the skin as compared with normal individuals.
  • the main causes are hereditary, hormonal imbalance, endocrine diseases, stress and ultraviolet rays.
  • ultraviolet B, L-tyrosine and melanocyte-stimulating hormone ( ⁇ -MSH) are known to cause melanin deposition in daily life.
  • Pigmented diseases can make the face look slimy and may have a negative impact on the overall impression, but it is difficult to prevent and is difficult to treat when the disease develops.
  • D-tyrosine may inhibit melanin synthesis by decreasing the expression and activity of tyrosinase and may be increased by L-tyrosine, UVB or alpha-MSH, It was confirmed that the expression level of the synergist and its activity could be reduced (Figs. 1 to 6).
  • peptides containing D-tyrosine can also inhibit the expression and activity of tyrosinase, inhibit melanin synthesis, decrease the amount of melanin increased by? -MSH, and the activity of tyrosinase (Figs. 7 to 15).
  • composition of the present invention comprising D-tyrosine or a peptide containing D-tyrosine can effectively inhibit melanin synthesis and thus can be usefully used for prevention or treatment of the above-mentioned diseases.
  • prophylactic in the present invention means any action that inhibits or delays the onset of a disease by administration of a composition according to the present invention.
  • treatment means any action in which the symptom of the disease is alleviated or changed by administration of the composition according to the present invention.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes all of the non-naturally occurring carrier forms.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories May have one formulation, and may be various forms of oral or parenteral administration.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions and syrups. Common diluents such as water and liquid paraffin are used in addition to various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like. .
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used as the non-aqueous solvent and suspension agent.
  • Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
  • composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply.
  • the preferred dosage of the composition of the present invention may vary depending on the condition and the weight of the patient, the degree of the disease, the drug form, the administration route and the period.
  • the administration may be carried out once a day or divided into several doses.
  • the composition can be administered to various mammals such as rats, livestock, humans, and the like in various routes.
  • the mode of administration is not limited as long as it is a conventional method in the art, and is preferably applied to skin, .
  • a health functional food composition for skin whitening comprising D-tyrosine or a peptide comprising D-tyrosine, or a pharmacologically acceptable salt of D-tyrosine.
  • D-tyrosine, D-tyrosine-containing peptide, D-tyrosine salt, and skin whitening are as described above.
  • the health functional food composition of the present invention can be routinely ingested, an excellent skin whitening effect can be expected. Unlike general medicines, there is an advantage that natural products are used as raw materials and side effects that may occur when a medicament is taken for a long time , And can be very useful for skin whitening purposes.
  • health functional food of the present invention is the same term as a food for special health use (FoSHU). In addition to nutrition, And includes all foods in a conventional sense. Here, 'function' refers to the structure and function of the human body to obtain a beneficial effect for health use such as controlling nutrients or physiological action. In some cases, the terms health functional foods, health foods, and health supplements may be used.
  • the health functional food may be prepared by adding the D-tyrosine of the present invention, a peptide containing the same, or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a food material such as beverage, tea, spice, gum, confectionery, , Suspension, etc., which means that it has a certain health effect when ingested, but unlike general drugs, there is an advantage that there is no side effect that may occur when a drug is taken for a long time using a food as a raw material.
  • a food material such as beverage, tea, spice, gum, confectionery, , Suspension, etc.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and ingredients that are conventionally added in the art.
  • the health functional food composition can be manufactured without limitation as various forms of formulations as long as it is a form recognized as a food.
  • the health functional food composition may further include a physiologically acceptable carrier.
  • the carrier is not particularly limited, and any carrier conventionally used in the art can be used.
  • the health functional food composition may contain additional components that are commonly used in food compositions and can improve odor, taste, visual appearance, and the like.
  • Minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu) and chromium (Cr); And amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine, and the like.
  • the health functional food composition may contain antiseptic agents (such as potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, and sodium dehydroacetate), bactericides (such as bleaching powder and highly bleached white powder, sodium hypochlorite), antioxidants (butylhydroxyanilide (BHA) (Sodium hypophosphite, etc.), coloring agent (tar pigment, etc.), coloring agent (sodium nitrite, sodium nitrate), bleaching agent (sodium sulfite), seasoning (sodium MSG glutamate etc.) (Antimicrobial agents such as alginate, sodium saccharin, etc.), perfumes (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum and potassium hydrogen D-tartrate), emulsifiers, thickeners Of food additives.
  • the additives can be selected according to the type of food and used in an appropriate amount.
  • a quasi-skin whitening composition comprising D-tyrosine or a peptide containing D-tyrosine or a quasi-acceptable salt of D-tyrosine.
  • D-tyrosine, D-tyrosine-containing peptide, D-tyrosine salt, and skin whitening are as described above.
  • quasi-drug product of the present invention refers to products which are used for diagnosis, treatment, improvement, alleviation, treatment or prevention of diseases of human beings or animals, and whose action is less than that of drugs.
  • Quasi-drugs are products that are used for the treatment or prevention of diseases of humans / animals, products which are mild to the human body or which do not act directly.
  • the components contained in the quasi-drug can be added directly to the quasi-drug composition or can be used together with other quasi-drug components and can be suitably used according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be appropriately determined depending on the purpose of use.
  • the external preparation for skin is not particularly limited, but may be preferably used in the form of an ointment, a lotion, a spray, a patch, a cream, a powder, a suspension, a gel or a gel.
  • composition for inhibiting melanin synthesis which comprises a salt of D-tyrosine or a peptide comprising the same, or a salt of D-tyrosine.
  • D-tyrosine, D-tyrosine-containing peptide, D-tyrosine salt and melanin are as described above.
  • the D-tyrosine or the peptide comprising the D-tyrosine according to the present invention competitively inhibits tyrosinase activity by L-tyrosine, and thus the composition of the present invention containing the D-tyrosine inhibits melanin synthesis Can be usefully used.
  • a skin whitening method comprising the step of administering to a subject a composition comprising D-tyrosine or a peptide comprising D-tyrosine or a salt thereof, or D-tyrosine.
  • a skin whitening use of D-tyrosine or a peptide comprising the D-tyrosine or a salt of D-tyrosine is provided.
  • D-tyrosine, D-tyrosine-containing peptide, D-tyrosine salt, skin whitening, administration and the like are as described above.
  • the subject includes, but is not limited to, mammals including humans, and the administration may preferably be to the skin.
  • the MNT-1 human melanoma cell line was cultured in a minimal essential medium (MEM) containing 20% FBS, 10% DMEM, 20 mM HEPES and 50 / / g gentamicin Lt; / RTI >
  • MEM minimal essential medium
  • Human primary epidermal melanocytes were purchased from Lonza (Basel, Switzerland) and were purchased from FBS, rh-insulin, GA-1000 (gentamicin sulfate amphotericin-B), calcium chloride (Lonza) medium containing PMA, bovine pituitary extract (BPE), hydrocortisone and rh-FGFB.
  • a 3D human skin model, MelanoDerm (TM), MEL-312-B, tissue was obtained from MatTek Inc. (Ashland, Oreg., USA).
  • Melanodum is a new maintenance medium (EPI-100-NMM-1) containing keratinocyte growth factor,? -Fibroblast growth factor and? -Melanocyte-stimulating hormone 113; MatTek Corporation) for 17 days at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator.
  • the cDNA for this was amplified using the following primers:
  • tyrosinase 5'-CGAGCCTGTGCCTCCTCTAA-3 '(forward, SEQ ID NO: 1) and 5'-CCAGGACTCACGGTCATCCA-3' (reverse direction, SEQ ID NO: 2);
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor: 5'-GGAACAGCAACGAGCTAAGG-3 '(forward, SEQ ID NO: 3) and 5'-TGATGATCCGATTCACCAGA-3' (reverse direction, SEQ ID NO: 4);
  • the first denaturation was carried out at 94 ⁇ for 5 minutes, followed by denaturation at 94 ⁇ for 30 seconds, annealing at 55 ⁇ for 30 seconds and extension at 72 ⁇ for 60 seconds.
  • the protein was then probed with a suitable antibody and detected with an Odyssey CLx imager (Lincoln, Iowa, USA), transferred to a 0.45 ⁇ m nitrocellulose blotting membrane (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) software (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
  • each cell was incubated with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) containing 1% Triton X-100, 1 ⁇ M PMSF, 1 ⁇ g / ml aprotinin and 10 ⁇ g / Lt; / RTI > The lysate was centrifuged at 13,000 rpm and 4 ° C for 15 minutes, then reacted at 37 ° C for 3 hours with L-DOPA, and the activity was evaluated by measuring the absorbance at 470 nm.
  • each cell was placed on a cover slip of a 12-well plate, fixed with 4% paraformaldehyde for 20 minutes, washed with phosphate buffer containing 10 mM L-DOPA at 37 ° C And reacted for 3 hours. Then, the cover slip was mounted on a glass slide and observed with a fluorescence microscope.
  • a Dermalight 80 MED tester National Biological Corp., Beachwood, OH, USA
  • a broadband uorescent UVB lamp Philips PL 9W / 12; Philips, Eindhoven, Respectively.
  • the lamp emits a wavelength spectrum in the range of 305 to 315 nm and has a peak at 311 nm.
  • the lid of the culture dish was removed, and the culture was replaced with PBS and exposed to 100 mJ / cm 2 UVB to prevent the production of toxic minerals derived from the culture medium.
  • Melanodum tissue samples were flaked to a thickness of 5 ⁇ m and then treated with 3% hydrogen peroxide to block the endogenous peroxidase activity and 1% BSA to eliminate other nonspecific reactions ≪ / RTI > PBS.
  • each section obtained by flaking was incubated with anti-tyrosinase ( ⁇ -Tyr, diluted 1: 100) for 16 hours, and a Vectastain ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame , CA, USA). At this time, cross-staining was performed with hematoxylin, and the sections were dehydrated and mounted.
  • ⁇ -Tyr anti-tyrosinase
  • Vectastain ABC kit Vector Laboratories, Burlingame , CA, USA
  • the degree of cell proliferation was measured using MTT [3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay.
  • MNT-1 cells were plated in 96-well plates at a density of 1 x 10 4 cells / well and cultured. Subsequently, the medium containing 0.5 mg / ml MTT (100 ⁇ l; Sigma) was added to each well, the cells were cultured for 1 hour, and 100 ⁇ l of acidic isopropanol (90% isopropanol, 0.5% SDS, 25 mM NaCl) Well. The absorbance of each sample was measured at 570 nm using a 96-well microtiter plate reader (Dynatech, Chantilly, VA, USA).
  • the levels of D-tyrosine and L-tyrosine were measured using the Agilent 1290 Infinity LC device and the Agilent 6490 Triple Quadrupole MS system (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA) at the Seoul Center for Basic Science Research,
  • D-tyrosine and L-tyrosine were extracted from the cells using a solvent composed of methanol, water and chloroform, and L-tyrosine-D 2 was added as an internal standard.
  • Chromatographic analysis was performed at 40 ° C. using an Astec CHIROBIOTIC T column (250 ⁇ 4.6 mm, particle size 5 ⁇ m; Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, USA).
  • the mobile phase was composed of 70% methanol containing 0.02% formic acid and eluted at a flow rate of 1 ml / min. For each sample, 2 [mu] l volume was injected and the total run time was adjusted to 10 minutes. All samples were measured three times.
  • the MS / MS experiments were performed in the cationic mode using the following parameters: capillary voltage 3.5 kV, atomizer gas 40 psi nitrogen, dry gas temperature 120 ⁇ , dry gas flow 11 l / min, sheath gas temperature 350 ⁇ ; A sheath gas flow rate of 12 L / min, and a nozzle voltage of 500 V.
  • SRM single reaction monitoring
  • L-tyrosine or D-tyrosine In order to confirm the effect on melanin formation, L-tyrosine or D-tyrosine was treated at various concentrations in human malignant melanoma cell MNT-1 and cultured for 24 hours. Then, according to Experimental Examples 3 to 5, And melanin synthesis-related proteins were measured.
  • the medium used in the present invention contains 104 mg / L of L-tyrosine as a base, L-tyrosine or D-tyrosine
  • L-tyrosine or D-tyrosine In order to more precisely determine the effect on melanin formation, experiments were carried out using minimal essential medium without L-tyrosine. The above experimental strategy is shown in Fig. 1C, and the amounts of melanin, melanin synthesis related protein and TYR were measured according to Experimental Examples 3 to 6.
  • MNT-1 cells were cultured in medium lacking L-tyrosine for 24 hours, and then cultured for another 24 hours after treatment with L-tyrosine or D-tyrosine.
  • Fig. 1D it was confirmed that the amount of TYR protein in the cells decreased in a time-dependent manner under the absence of L-tyrosine. In particular, it was confirmed that the amount of TYR protein decreased to 20% (that is, 80%) after 24 hours from the time of replacing with L-tyrosine-free medium, compared to 0 hours of culture.
  • L-tyrosine increases the expression of TYR, TRP1 and MITF proteins, which play an important role in melanin synthesis, but D-tyrosine does not show the expression- Respectively.
  • D-tyrosine inhibits melanin synthesis and inhibits the expression of TYR and melanin synthesis-related proteins Respectively.
  • Example 1 it was confirmed that L-tyrosine promotes melanin synthesis, whereas D-tyrosine suppresses melanin synthesis rather rather, so that D-tyrosine can inhibit the production of L-tyrosine-induced melanin Respectively.
  • MNT-1 cells were cultured using a medium containing or not containing L-tyrosine, followed by further treatment with L-tyrosine and / or D-tyrosine for 24 hours. Then, according to Experimental Examples 3 to 6, the amount of melanin, the expression amount of melanin synthesis related protein, and the activity of TYR were measured.
  • L-DOPA staining according to Experimental Example 6 showed that intracellular TYR activity was increased when 10 ⁇ M of L-tyrosine was treated, whereas when L- It was confirmed that the activity of the protein increased by tyrosine was remarkably decreased and that the activity was the same as that of the untreated cells.
  • the cell proliferation assay according to Experimental Example 9 confirmed that L-tyrosine or D-tyrosine did not show toxicity to cells.
  • D-tyrosine is involved in the Wnt signal transduction pathway that plays an important role in skin function (Lim X, Cold Spring Harb Perspect Biol 2013; 5 It was confirmed that the expression of Dvl2 (disheveled segment polarity protein 2), LRP6 (LDL receptor related protein 6), beta-catenin, axin or GSK3 beta (glycogen synthase kinase 3 beta) .
  • Example 2 Taken together with the contents of Example 2, it was confirmed that D-tyrosine suppresses melanin synthesis caused by L-tyrosine, and inhibits melanin production without adversely affecting skin function.
  • D-tyrosine inhibits melanin synthesis and can inhibit melanin production induced by L-tyrosine. Therefore, D-tyrosine can inhibit melanin synthesis .
  • cDNA encoding TYR was transfected into HEK293 cells that did not express the intrinsic TYR, and the activity of TYR was confirmed according to Experimental Example 6 after reacting various cells with the extract of the cells.
  • TYR TYR activity over time after treatment with L-tyrosine, D-tyrosine or L-DOPA was analyzed according to Experimental Example 6 for HEK 293 cells transfected with the coding vector.
  • MNT-1 cells were treated with various concentrations of L-DOPA as a substrate for TYR, or L-DOPA and 5 mM D-tyrosine simultaneously, TYR activity was analyzed according to Experimental Example 6 and confirmed by Michaelis-Menten curve analysis.
  • D-tyrosine significantly decreased TYR activity increased by L-DOPA, Km value increased from 0.78 to 1.81 mM, V max Value was maintained near 1.00 (DELTA OD 470 / min).
  • Example 3 Taken together with the contents of Example 3, it was confirmed that D-tyrosine enters the cell and inhibits intracellular TYR activity, thereby inhibiting melanin production.
  • D-tyrosine suppresses melanin production and further inhibits melanin production induced by L-tyrosine through the above Examples 1 to 3.
  • D-tyrosine which is a kind of key hormone that regulates melanin formation, Melanocyte-stimulating hormone (MSH) to inhibit the synthesis of melanin.
  • MSH Melanocyte-stimulating hormone
  • MNT-1 cells were treated with 1 [mu] M of alpha-MSH, treated with 100 or 500 [mu] M of D-tyrosine, and cultured for a certain period of time. Then, according to Experimental Examples 3 to 6, Amount of melanin and TYR activity were confirmed.
  • UV ultraviolet
  • MNT-1 cells were irradiated with UVB (100 mJ / cm 2 ) for 48 hours, treated with 100 or 500 ⁇ M of D-tyrosine, cultured for a certain period of time, The amount of melanin was confirmed.
  • Example 4 Taken together with the contents of Example 4 above, it was found that D-tyrosine can inhibit melanin production caused by? -MSH or UV, which is a main factor causing melanin synthesis in the daily environment.
  • the obtained human primary epidermal melanocytes were treated with D-tyrosine, L-tyrosine or? -MSH and D-tyrosine, and then, according to Experimental Examples 3 to 6, the amount of melanin , TYR activity, and TYR expression level.
  • D-tyrosine increased the amount of melanin (A), TYR activity (B and D), expression of TYR and TRP1 protein (C) in the treatment of L-tyrosine .
  • D-tyrosine was found to be capable of decreasing the amount of melanin increased by? -MSH.
  • a peptide consisting of 5 to 6 amino acids including D-tyrosine was prepared. Based on the existing peptide containing L-tyrosine at the N-terminus, peptides containing D-tyrosine at both the N-terminus, C-terminus, or N-terminus / C-terminus were prepared. - < / RTI > tyrosine at the N-terminus or at the C-terminus. On the other hand, the sequences of the peptides are listed in Table 2 below.
  • Example 7-2 D- Tyrosine Included Of peptide Determine the effect on melanin synthesis
  • a peptide (ND or CD) containing D-tyrosine at the N-terminal or C-terminal decreases the total amount of melanin, decreases TYR activity and decreases the amount of MITF expression Respectively.
  • Example 7-3 D- Tyrosine Included Of peptide ⁇ - MSH Or UV to inhibit melanin synthesis
  • UV ultraviolet
  • Example 7-4 Human invincible epidermis Melanocytes (human primary epidermal melanocytes) inhibited melanin synthesis
  • Example 7-5 The D- Tyrosine Included Of peptide Confirm melanin synthesis inhibitory effect
  • Example 8 D- Tyrosine Included Of peptide Identification of complex activity of whitening and anti-inflammation / anti-aging
  • peptides were prepared by binding D-tyrosine to peptides for which anti-inflammatory and anti-aging effects were already known.
  • the sequences of the peptides are listed in Table 3 below.

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Abstract

본 발명은 D-타이로신(D-tyrosine) 또는 이를 포함하는 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 이의 염을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물; 약학 조성물; 건강기능식품 조성물; 의약외품 조성물; 및 멜라닌 합성 억제용 조성물에 관한 것이다. D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드는 멜라닌 합성을 억제하고, 멜라닌 합성을 야기하는 주된 요인인 L-타이로신, α-MSH 또는 UV에 의해 생성된 멜라닌 양을 감소시키며, 피부 세포에 독성을 나타내지 않으므로, 이를 포함한 본 발명의 조성물은 피부 미백 용도로서 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.

Description

D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물
본 발명은 D-타이로신(D-tyrosine) 또는 이를 포함하는 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 이의 염을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물; 약학 조성물; 건강기능식품 조성물; 의약외품 조성물; 및 멜라닌 합성 억제용 조성물에 관한 것이다.
멜라닌은 피부의 기초층(basal layer)에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)에 의해 합성되어, 세포질 돌기를 통해 각질형성세포(keratinocyte)로 전달된다. 표피에 존재하는 멜라닌은 자외선을 흡수하여 세포의 단백질이나 핵산의 손상을 방지하는 역할을 한다. 그러나, 멜라닌이 국소적으로 과도하게 합성되거나, 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지게 되면, 멜라닌 생성과정에 이상이 생겨 기미, 주근깨, 검버섯 및 일광흑색증 등의 색소 침착을 유발하게 된다.
상술한 멜라닌 합성의 주요인으로는, 유전, 호르몬의 불균형, 내분비 질환, 스트레스, 자외선 등이 해당하며, 특히 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH), 자외선(ultraviolet B) 등은 일상생활에서 가장 노출되기 쉬운 내재적 또는 환경적 요인으로 알려져 있다. 아울러, 호르몬 유사 조절자로 작용하는 L-타이로신(L-tyrosine)은 인간 흑색종 및 햄스터 흑색종 세포에서 멜라닌 함량을 증가시키고, 다수의 멜라닌 소체의 출현을 유발한다는 내용이 공지된바(Slominski A, Pigment Cell Melanoma Res 2012;25(1):14-27.), 이 또한 멜라닌 합성을 야기하는 주요 원인으로 생각된다.
이와 관련하여, 멜라닌 형성 효소로는 타이로시나제(tyrosinase; TYR), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1; TRP-1) 및 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase-related protein 2, TRP-2/DOPA, chrome tautomerase) 등이 알려져 있으며, 상기 멜라닌 형성 효소는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)라 불리는 전사인자에 의해 조절된다고 알려져 있다. 멜라닌 합성 경로에 중요한 역할을 수행하는 타이로시나제는 L-타이로신(L-tyrosine)을 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)로 전환하고, 생성된 L-DOPA를 L-도파퀴논(L-dopaquinone)으로 신속하게 전환하며, 이후의 여러 반응을 통해 결국 멜라닌을 형성한다. 이러한 타이로시나제의 촉매 반응 속도는 기질인 L-타이로신의 양에 따라 증가한다는 것이 공지된바(Hearing VJ, FASEB J 1991;5(14):2902-9.), L-타이로신의 이용성을 조절한다면 타이로시나제의 활성 증가에 따른 멜라닌 생성을 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 생각되고 있다.
한편, 색소 침착은 얼굴이 칙칙한 느낌이 들게 하고, 인상에도 좋지 않은 영향을 줄 수 있다. 또한, 전체적으로 고른 피부 색조를 갖는 것이 아름다움의 일 기준으로 생각되는바, 색소 침착 관련 질환의 예방, 개선, 치료 용도, 또는 피부 미백 용도로 사용될 수 있는 물질의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 그 예로서, 스티피탈리드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물(한국 공개특허공보 제10-2017-0053150호), 제비쑥 추출물을 함유하는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법(한국 공개특허공보 제10-2017-0049743호) 등이 개발되었다. 아울러, 코지산(kojic acid), 살리실산(salicylic acid), 니코틴아마이드(nicotinamide), 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코르티코스테로이드(corticosteroids), 트리티노인(tretinoin) 등의 화합물이 개발되어 현재 미백 용도로 사용되고 있다. 그러나, 하이드로퀴논, 코르티코스테로이드, 트리티노인 등의 화합물은 부작용을 나타내어 많은 국가에서 사용이 제한되고 있는 상황이며(Desmedt B, J Pharm Biomed Anal 2014;90:85-91.), 살리실산은 각질 용해 효과에 의해 화장품에 포함된 다른 성분을 피부 내로 침투시키는 부작용을 나타낸다(Bashir SJ, Int J Pharm 2005;292(1-2):187-94.). 따라서, 부작용이 최소화된, 멜라닌 생성 억제 물질의 개발이 시급한 실정이었다.
본 발명자들은 멜라닌 색소 침착을 억제하여 미백 효과를 가지는 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드가 L-타이로신, UVB 또는 α-MSH 등에 의한 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 또한 피부세포에 대하여 독성을 나타내지 않음을 확인함으로써, 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 및 미백용 조성물로서 안전하게 사용될 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 D-타이로신(D-tyrosine) 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 화장품학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 의약외품적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 염을 포함하는, 멜라닌 합성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 염, 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 미백 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 염의 피부 미백 용도를 제공하는 것이다.
D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드는 멜라닌 합성을 억제하고, 멜라닌 합성을 야기하는 주된 요인인 L-타이로신, α-MSH 또는 UV에 의해 생성된 멜라닌 양을 감소시키며, 피부 세포에 독성을 나타내지 않으므로, 이를 포함한 본 발명의 조성물은 피부 미백 용도로서 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 L-타이로신(L-tyrosine; L-Tyr) 및 D-타이로신(D-tyrosine; D-Tyr)이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 보여주는 도면이다. 구체적으로,
A는 MNT-1 인간 악성흑색종 세포에 다양한 농도의 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후에 생성된 멜라닌 양을 보여주는 그래프로서, 상기 멜라닌 양은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었고, *는 P < 0.05 및 **는 P < 0.01를 의미한다;
B는 MNT-1 세포에 다양한 농도의 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후에 검출한 타이로시나제(tyrosinase; TYR) 및 MITF 단백질 발현량을 보여주는 이미지이다. β-액틴(β-actin)은 로딩 대조군(loading control)으로 사용하였다;
C는 L-타이로신이 없는 조건에서의 실험 전략을 보여주는 개략도이다;
D는 상기 C의 전략에 따른 실험을 수행한 결과로서, L-타이로신이 없는 조건에서 MNT-1 세포에 L-타이로신 또는 D-타이로신을 처리한 이후에 시간에 따른 TYR 발현량을 보여주는 이미지이다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다;
E는 상기 C의 전략에 따른 실험을 수행한 결과로서, L-타이로신이 없는 조건에서 MNT-1 세포에 다양한 농도의 L-타이로신 또는 D-타이로신을 처리한 이후에 생성된 멜라닌 양 및 TYR 활성을 보여주는 그래프이다. 상기 멜라닌 양은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었고, *는 P < 0.05 및 **는 P < 0.01를 의미한다;
F는 상기 C의 전략에 따른 실험을 수행한 결과로서, L-타이로신이 없는 조건에서 MNT-1 세포에 다양한 농도의 L-타이로신 및 D-타이로신을 처리한 이후에 검출한 TYR, TRP1(tyrosinase-related protein 1) 및 MITF의 단백질 및 mRNA 발현량을 보여주는 이미지이다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 2는 D-타이로신의 L-타이로신에 의한 멜라닌 합성 억제 활성을 보여주는 도면이다. 구체적으로,
A는 L-타이로신이 포함되거나(Tyr(+)) 포함되지 않은 배지(Tyr(-))를 사용하여 전-배양한 MNT-1 세포에 대하여, 다양한 농도의 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후에 생성된 멜라닌 양 및 TYR 활성을 보여주는 그래프이다. 상기 멜라닌 양은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었고, *는 P < 0.05 및 **는 P < 0.01를 의미한다;
B는 L-타이로신이 포함되거나(Tyr(+)) 포함되지 않은 배지(Tyr(-))로 전-배양한 MNT-1 세포에 대하여, 다양한 농도의 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후에 검출한 TYR, TRP1 및 MITF의 단백질 발현량을 보여주는 이미지이다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다;
C는 MNT-1 세포에 다양한 농도의 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후, L-DOPA와 반응시킨 모습을 보여주는 이미지이다. 스케일바(Scale bars)는 20 ㎛을 나타낸다;
D는 MNT-1 세포에 다양한 농도의 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후, 상기 세포의 생존율을 보여주는 그래프이다. 상기 생존율은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었다;
E는 MNT-1 세포에 500 μM의 D-타이로신을 처리한 이후에 검출한 Wnt 신호전달 경로에 관여하는 단백질들의 발현 수준을 보여주는 이미지로서, Dvl2, pLRP6, LRP6, active βcatenin, β-catenin, Axin, GSK3β, β-actin에 대한 발현량을 보여준다.
도 3은 D-타이로신의 타이로시나제 억제 활성을 보여주는 도면이다. 구체적으로,
A는 공벡터(-) 또는 타이로시나제 암호화 벡터(+)가 형질주입된 HEK 293 세포에 대하여, L-타이로신, D-타이로신 또는 L-DOPA를 처리한 이후에 농도에 따른 TYR 활성을 보여주는 그래프이다. 상기 TYR 활성은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었다;
B는 타이로시나제 암호화 벡터가 형질주입된 HEK 293 세포에 대하여, 1mM의 L-DOPA와 다양한 농도의 D-타이로신을 처리한 이후에 시간에 따른 TYR 활성을 보여주는 그래프로서, 상기 TYR 활성은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었다;
C는 타이로시나제 암호화 벡터가 형질주입된 HEK 293 세포에 대하여, 5 mM의 L-타이로신과 다양한 농도의 D-타이로신을 처리한 이후에 시간에 따른 TYR 활성을 보여주는 그래프이다. 상기 TYR 활성은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었다;
D는 MNT-1 세포에 다양한 농도의 L-DOPA 단독(- D-Tyr), 또는 다양한 농도의 L-DOPA와 5 mM의 D-타이로신(+ D-Tyr)을 처리한 이후에 L-DOPA의 농도에 따른 TYR 활성을 보여주는 그래프이다;
E는 MNT-1 세포에 다양한 농도의 D-타이로신을 처리한 이후에 세포 내에 존재하는 D-타이로신의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 4는 α-MSH 또는 UVB에 의해 유도된 멜라닌 합성을 하향조절하는 D-타이로신의 효과를 보여주는 도면으로서, α-MSH 또는 UVB를 처리한 이후에 다양한 농도의 D-타이로신을 처리한 결과를 보여준다. 구체적으로,
A는 MNT-1 세포에 α-MSH 및 D-타이로신을 처리한 이후에 검출한 TYR, TRP1 및 MITF의 단백질 발현량을 보여주는 이미지이다;
B는 MNT-1 세포에 α-MSH 및 D-타이로신을 처리한 이후에 생성된 멜라닌 양을 보여주는 그래프로서, 상기 멜라닌 양은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었고, *는 P < 0.05 및 **는 P < 0.01를 의미한다;
C는 MNT-1 세포에 α-MSH 및 D-타이로신을 처리한 이후에 L-DOPA와 반응시킨 모습을 보여주는 이미지로서, 스케일바는 20 ㎛을 나타낸다;
D는 MNT-1 세포에 UVB 및 D-타이로신을 처리한 이후에 검출한 TYR, TRP1 및 MITF의 단백질 발현량을 보여주는 이미지이다;
E는 MNT-1 세포에 UVB 및 D-타이로신을 처리한 이후에 생성된 멜라닌 양을 보여주는 그래프로서, 상기 멜라닌 양은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었고, *는 P < 0.05 및 **는 P < 0.01를 의미한다;
F는 MNT-1 세포에 UVB 및 D-타이로신을 처리한 이후에 L-DOPA와 반응시킨 모습을 보여주는 이미지이다. 스케일바는 20 ㎛을 나타낸다.
도 5는 인간 멜라닌세포(melanocytes)에 대하여, 멜라닌 합성을 하향조절하는 D-타이로신의 효과를 보여주는 도면이다. 구체적으로,
A는 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후에 생성된 멜라닌 양을 보여주는 그래프이다. 상기 멜라닌 양은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었고, *는 P < 0.05 및 **는 P < 0.01를 의미한다;
B는 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리하고, L-DOPA를 반응시킨 이후에 측정한 TYR 활성을 보여주는 그래프이다;
C는 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후에 측정한 TYR, TRP1의 단백질 발현량을 보여주는 이미지이다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다;
D는 L-타이로신 또는 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후에 L-DOPA와 반응한 세포의 모습을 보여주는 이미지이다. 스케일바는 20 ㎛을 나타낸다;
E는 1 μM의 α-MSH와 다양한 농도의 D-타이로신을 24시간 동안 처리한 이후에 생성된 멜라닌 양을 보여주는 그래프이다.
도 6은 3D 인간 피부 모델(human skin model)에 대하여, 멜라닌 합성을 감소시키는 D-타이로신의 효과를 보여주는 도면이다. 구체적으로,
A는 실험 전략을 보여주는 개략도이다;
B는 배양한 인간 피부 모델의 모습을 보여주는 이미지 및 그래프이다. 어두운 영역은 ImageJ 프로그램을 이용하여 분석하였고, 측정한 어두운 영역은 총 영역에 대한 상대적인 값으로 나타내었다. 값은 세 번의 실험을 통한 평균값 ± SEM로 나타내었고, *는 P < 0.05를 의미한다;
C는 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)을 이용하여 염색한 세포의 이미지로서, 배양한 인간 피부 모델의 기초층에 존재하는 멜라닌세포의 면역조직화학적 모습을 보여준다. TYR 또는 음성대조군으로 전-면역 혈청(pre-immune serum, IgG)에 대한 항체를 사용하여 면역염색하였다. 이미지를 40배(위 및 중간) 또는 20배(아래)로 관찰하였고, 스케일바는 50 ㎛을 나타낸다;
D는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 피부의 절편에 존재하는 상대적인 멜라닌 양을 보여주는 그래프이다. 멜라닌 양은 ImageJ 프로그램을 통해 분석하였고, 상기 멜라닌의 상대적인 양은 평균값 ± SEM로 나타내었고, **는 P < 0.01를 의미한다.
도 7은 D-타이로신을 포함하는 펩타이드가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 보여주는 도면으로, 각각의 펩타이드를 처리한 이후에 검출한 멜라닌 양, 타이로시나제의 활성 및 MITF의 발현양을 도시한 것이다 (N-L은 L-타이로신을 N-말단에 포함하는 펩타이드, N-D는 D-타이로신을 N-말단에 포함하는 펩타이드, C-L은 L-타이로신을 C-말단에 포함하는 펩타이드, C-D는 D-타이로신을 C-말단에 포함하는 펩타이드).
도 8은 D-타이로신을 포함하는 펩타이드가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 보여주는 도면으로, 각각의 펩타이드를 처리한 이후에 dark area 의 너비 및 멜라닌 양을 도시한 것이다.
도 9는 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 합성을 하향조절하는 D-타이로신을 포함하는 펩타이드의 효과를 보여주는 도면으로서, MNT-1 세포에 α-MSH 및 D-타이로신을 포함하는 펩타이드를 처리한 이후에 검출한 멜라닌 양, MITF 단백질 발현량, dark area 의 너비를 보여준다.
도 10은 UV에 의해 유도된 멜라닌 합성을 하향조절하는 D-타이로신을 포함하는 펩타이드의 효과를 보여주는 도면으로서, MNT-1 세포에 UV 및 D-타이로신을 포함하는 펩타이드를 처리한 이후에 검출한 멜라닌 양, MITF 단백질 발현량, dark area 의 너비를 보여준다.
도 11은 인간 초대 표피 멜라닌세포에서 D-타이로신을 포함하는 펩타이드가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 보여주는 도면으로, 멜라닌 양, 타이로시나제 활성 및 dark area 의 너비를 보여준다.
도 12는 인간 초대 표피 멜라닌세포에서 α-MSH 또는 UV에 의해 유도된 멜라닌 합성을 하향조절하는 D-타이로신을 포함하는 펩타이드의 효과를 보여주는 도면으로서, 멜라닌 양 및 dark area의 너비를 보여준다.
도 13은 D-타이로신을 N-말단 및 C-말단에 포함하는 펩타이드(DD)가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 보여주는 도면으로, 각 펩타이드를 처리한 이후에 검출한 멜라닌의 양을 보여주는 그래프이다.
도 14는 항노화 효과를 갖는 펩타이드(Tetrapeptide-21)에 D-타이로신이 포함되는 경우, 멜라닌 양 감소 및 항노화 활성 유지를 보여주는 도이다.
도 15는 항염 효과를 갖는 펩타이드(Tri)에 D-타이로신이 포함되는 경우, 멜라닌 양 감소 및 항염 활성 유지를 보여주는 도이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태로서, D-타이로신(D-tyrosine) 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 화장품학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드는 MNT-1 인간 악성흑색종 세포, 인간 초대 표피 멜라닌세포 및 인간 피부모델에서 멜라닌의 생성, 합성 또는 형성을 억제하며, 멜라닌 침착의 주요인인 자외선(ultraviolet B), 타이로시나제의 기질인 L-타이로신(L-tyrosine) 또는 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)에 의해 증가된 멜라닌 양을 감소시키며, 나아가 멜라닌 합성의 핵심 단백질인 타이로시나제(tyrosinase)의 발현량 및 활성을 감소시키는 것을 확인하였고, 이에 따라 상기 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드는 피부 미백 용도로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "D-타이로신"은 D-형태의 카이랄 구조를 가지는 타이로신을 말한다. 상기 타이로신은 4-히드록시페닐알라닌(4-hydroxylphenylalanine)으로 명명된다. 본 발명에서, 상기 D-타이로신은 분리된 D-타이로신일 수 있으며, 또한 화학적으로 합성하거나 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "D-타이로신을 포함하는 펩타이드"는 상기 D-타이로신을 포함하는 펩타이드를 말한다. 펩타이드는 2개 이상의 아미노산이 주로 α-카르복시기와 α-아미노기로 사슬모양 또는 고리모양으로 펩티드 결합을 하여 형성된 화합물이며, 결합한 아미노산의 수에 의해 올리고펩타이드(아미노산수 2~10개) 또는 폴리펩타이드(아미노산 수 10~50개)로 구분된다. 구체적으로, 본 발명의 펩타이드는 2 내지 13개, 더 구체적으로 2 내지 10개, 2 내지 9개, 2 내지 8개, 2 내지 7개, 보다 더 구체적으로 2 내지 6개, 가장 구체적으로 4 내지 6개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는, 다양한 길이의 펩타이드에서 모두 D-타이로신을 포함하는 경우에 미백 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.
본 발명에서, 상기 펩타이드는 이의 N-말단; C-말단; 또는 N-말단 및 C-말단에 D-타이로신을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, D-타이로신이 펩타이드의 말단에 포함되는 경우 상기 펩타이드는 멜라닌 합성 억제에 우수한 효과를 나타내어, 상기 펩타이드는 D-타이로신을 말단, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
더욱 구체적으로, D-타이로신을 N-말단에 포함하는 펩타이드보다 C-말단에 포함하는 펩타이드의 멜라닌 합성 억제 효과가 더욱 우수하며, 특히 C-말단 단독보다 N-말단 및 C-말단 모두에 포함하는 펩타이드의 멜라닌 합성 억제 효과가 더욱 우수하므로, D-타이로신을 C-말단에 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, D-타이로신을 N-말단 및 C-말단 모두에 포함하는 것이 가장 바람직할 수 있다.
본 발명에서, 상기 펩타이드는 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
이때, 본 발명에서 '특정 서열번호로 구성되는 펩타이드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본 발명의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 발명에서, 상기 D-타이로신은 포함되는 조성물의 형태에 적합한 염의 형태로 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 D-타이로신은 이의 화장품학적으로 허용가능한 염, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 식품학적으로 허용가능한 염 또는 이의 의약외품적으로 허용가능한 염의 형태로 화장료 조성물, 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 의약외품에 각각 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "화장품학적으로 허용가능한 염, 약학적으로 허용가능한 염, 식품학적으로 허용가능한 염 또는 의약외품적으로 허용가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 화장품학적, 약학적, 식품학적 또는 의약외품학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미한다. 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 D-타이로신은 통상적인 방법에 의해 그의 염으로 전환시킬 수 있다.
또한, 상기 D-타이로신은 L-타이로신(L-tyrosine)에 의한 타이로시나제(tyrosinase) 활성을 경쟁적으로 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "L-타이로신"은 자연계에 존재하는 L-형태의 타이로신으로서, 자연계에 일반적으로 존재하는 천연의 타이로신이다. 상기 L-타이로신은 타이로시나제의 활성을 증가시켜 멜라닌 합성을 촉진한다고 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "타이로시나제"는 멜라닌의 생성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 타이로시나제는 타이로신을 기질로 하는 여러 반응을 통해 멜라닌을 형성하므로, 멜라닌 합성을 억제하기 위한 수단으로써 타이로시나제의 활성을 억제하는 방법이 많이 이용되고 있다.
이때, 상기 용어 "멜라닌"은 피부나 눈 등의 조직에 존재하는 흑색 내지는 갈색 색소를 총칭한다. 세포 내에서 다양한 요인에 의해 합성되며, 표피에 존재하는 멜라닌은 자외선을 흡수하여 세포의 단백질이나 핵산의 손상을 방지하는 역할을 한다. 그러나, 멜라닌이 국소적으로 과도하게 합성되거나, 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지게 되면, 멜라닌 생성과정에 이상이 생겨 기미, 주근깨, 검버섯, 일광흑색증(solar lentigines), 사마귀, 밀크커피반점, 오타모반, 청색모반, 몽고반점, 과다 색소침착 반(macule) 또는 잡티 등의 색소 침착을 유발한다.
또한, 상기 펩타이드는 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열로 구성된 것이고, 추가로 항노화 활성을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 것이고, 추가로 항염 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "항노화"는 피부의 노화를 억제하는 작용으로서, 피부의 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상을 개선하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "항염"은 염증을 억제하는 것을 의미한다. 염증 반응은 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위하여 야기되는데, 그 정도가 심하거나 오랜 기간 지속되면 세포의 손상이 야기되어 다양한 염증성 질환이 발병될 수 있다. 이를 억제하는 항염증 활성은 세포의 손상을 감소시킬 수 있으므로, 여드름 또는 모낭염의 개선, 모공 축소 등의 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서는 기존에 항노화 또는 항염 활성을 갖는 펩타이드가 해당 활성을 유지하면서, 미백 활성이 추가로 우수해짐을 확인하였다.
본 발명의 목적상, 본 발명의 화장료 조성물은 기능성 화장품의 특성을 나타낼 수 있다.
상기 용어, "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"은 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품을 의미한다. 그 예로, 상기 기능성 화장품은 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름 개선에 도움을 주는 제품 등을 들 수 있다.
본 발명에서 용어, "피부 미백"은 피부를 하얗게 하는 것을 말하며, 기미, 주근깨, 검버섯 및 잡티로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 예방 또는 개선하는 것을 포함한다. 또한, 상기 피부 미백은 멜라닌의 생성, 합성 또는 형성을 억제하여 달성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, D-타이로신은 타이로시나제의 발현 및 활성을 감소시켜 멜라닌 합성을 억제할 수 있으며, L-타이로신, UVB 또는 α-MSH에 의해 증가된 멜라닌 양, 타이로시나제의 발현양 및 이의 활성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 1 내지 6). 또한, D-타이로신을 포함하는 펩타이드도 타이로시나제의 발현 및 활성을 감소시켜 멜라닌 합성을 억제할 수 있으며, α-MSH에 의해 증가된 멜라닌 양, 및 타이로시나제의 활성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 7 내지 15).
이는, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드를 포함하는 본 발명의 조성물은 멜라닌 합성을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 피부 미백용 기능성 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 화장료 조성물을 포함하는 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 로션, 젤, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 연고, 스틱, 패취, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적인 보조제, 예를 들어, 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭뿐만 아니라 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제와 함께 일반 화장품 또는 기능성 화장품의 구성요소로서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 약학 조성물을 제공한다.
상기 D-타이로신, D-타이로신을 포함하는 펩타이드, D-타이로신의 염 및 피부 미백에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 목적상, 상기 약학 조성물은 일광흑색증(solar lentigines), 사마귀, 오타모반, 청색모반, 몽고반점 및 과다 색소침착 반(macule)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.
상술한 질환은 정상 개체에 비하여 멜라닌 색소가 피부에 과다하게 침착되어 나타나는 색소성 질환으로서, 주원인은 유전, 호르몬의 불균형, 내분비 질환, 스트레스, 자외선 등이며, 특히 자외선(ultraviolet B), 타이로시나제의 기질인 L-타이로신(L-tyrosine) 및 멜라닌세포 자극 호르몬(α-Melanocyte-stimulating hormone; α-MSH) 등이 일상생활에서 멜라닌 침착을 야기하는 주된 원인으로 알려져 있다. 색소성 질환은 얼굴을 칙칙한 느낌이 들게 하고, 전체적인 인상에 부정적인 영향을 줄 수 있으나, 예방이 어렵고 질환의 발생 시 치료가 쉽지 않다는 특성이 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, D-타이로신은 타이로시나제의 발현 및 활성을 감소시켜 멜라닌 합성을 억제할 수 있으며, L-타이로신, UVB 또는 α-MSH에 의해 증가된 멜라닌 양, 타이로시나제의 발현양 및 이의 활성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 1 내지 6). 또한, D-타이로신을 포함하는 펩타이드도 타이로시나제의 발현 및 활성을 감소시켜 멜라닌 합성을 억제할 수 있으며, α-MSH에 의해 증가된 멜라닌 양, 및 타이로시나제의 활성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 7 내지 15).
이는, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드를 포함하는 본 발명의 조성물은 멜라닌 합성을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 상술한 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 발병을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 특히, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 비자연적인 담체(non-naturally occurring carrier) 형태를 모두 포함한다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 달라질 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있고, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한 없이 포함하며, 피부에 도포하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 D-타이로신, D-타이로신을 포함하는 펩타이드, D-타이로신의 염, 및 피부 미백에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 우수한 피부 미백 효과를 기대할 수 있으며, 일반 약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있으므로, 피부 미백 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 여기서, '기능'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강기능식품은 본 발명의 D-타이로신, 이를 포함하는 펩타이드, 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품으로 인정되는 제형이면 다양한 형태의 제형으로 제한 없이 제조될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별하고 적절한 양으로 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 의약외품적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 D-타이로신, D-타이로신을 포함하는 펩타이드, D-타이로신의 염, 및 피부 미백에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명에서 상기 의약외품에 포함되는 성분은 의약외품 조성물에 그대로 첨가되거나, 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다. 상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 염을 포함하는, 멜라닌 합성 억제용 조성물을 제공한다.
상기 D-타이로신, D-타이로신을 포함하는 펩타이드, D-타이로신의 염 및 멜라닌에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드는 L-타이로신(L-tyrosine)에 의한 타이로시나제(tyrosinase) 활성을 경쟁적으로 억제하므로, 이를 포함하는 본 발명의 조성물은 멜라닌 합성 억제 용도로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 염, 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 미백 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 염의 피부 미백 용도를 제공한다.
상기 D-타이로신, D-타이로신을 포함하는 펩타이드, D-타이로신의 염, 피부 미백, 투여 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 본 발명의 목적상 상기 개체에는 인간을 포함하는 포유동물을 포함하여 제한이 없으며, 상기 투여는 바람직하게는 피부에 도포하는 것일 수 있다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실험예 1. 세포 배양 방법
MNT-1 인간 악성흑색종 세포주(human melanoma cell line)는 20% FBS, 10% DMEM, 20 mM HEPES 및 50 ㎍/㎕ 겐타마이신(gentamicin)이 포함된 최소 필수 배지(minimal essential medium; MEM)를 사용하여 배양하였다.
인간 초대 표피 멜라닌세포(human primary epidermal melanocytes)는 Lonza 사(Basel, Switzerland)에서 구입하였고, FBS, rh-인슐린(rh-insulin), GA-1000(gentamicin sulfate amphotericin-B), 염화칼슘(calcium chloride), PMA, BPE(bovine pituitary extract), 하이드로코르티손(hydrocortisone) 및 rh-FGF B가 포함된 medium-4(Lonza) 배지를 사용하여 배양하였다.
실험예 2. 3D 인간 피부 모델(human skin model)의 배양 방법
3D 인간 피부 모델, 즉 멜라노덤(MelanoDerm™, MEL-312-B) 조직은 MatTek 사(Ashland, Oregon, USA)로부터 수득하였다.
멜라노덤은 케라틴세포 성장인자(keratinocyte growth factor), β-섬유아세포 성장인자(β-fibroblast growth factor) 및 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone)를 포함한 New Maintenance Medium(EPI-100-NMM-113; MatTek Corporation)을 이용하여 17일 동안 5% 이산화탄소가 있는 37℃ 항온기에서 배양하였다.
실험예 3. RNA 추출 및 RT-PCR 방법
각 세포로부터 토탈 RNA를 수득한 뒤, 이에 대한 cDNA는 다음과 같은 프라이머를 이용하여 증폭하였다:
(1) 타이로시나제(tyrosinase): 5'-CGAGCCTGTGCCTCCTCTAA-3'(정방향, 서열번호 1) 및 5'-CCAGGACTCACGGTCATCCA-3'(역방향, 서열번호 2);
(2) MITF(microphthalmia-associated transcription factor): 5'-GGAACAGCAACGAGCTAAGG-3'(정방향, 서열번호 3) 및 5'-TGATGATCCGATTCACCAGA-3'(역방향, 서열번호 4);
(3) β-액틴(β-actin): 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA-3'(정방향, 서열번호 5) 및 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG -3'(역방향, 서열번호 6).
첫 변성(denaturation)은 94℃에서 5분 동안 수행하였고, 이후 변성은 94℃에서 30초, 어닐링(annealing)은 55℃에서 30초, 연장(extension)은 72℃에서 60초 동안 수행하였다.
실험예 4. 면역 블롯팅 방법
세포를 프로테아제 저해제 칵테일(1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ antipain, 5 ㎍/㎖ leupeptin, 1 ㎍/㎖ pepstatin A 및 20 ㎍/㎖ phenylmethylsulfonyl fluoride)이 포함된 RIPA 버퍼(50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10 mM NaF 및 2 mM Na3VO4)를 이용하여 용해하였다. 이후, 13,000 rpm 및 4℃에서 15분 동안 원심분리한 뒤, SDS-PAGE 샘플 버퍼로 변성시킨 후, SDS-PAGE로 분석하였다.
이후, 단백질을 0.45 ㎛ 니트로셀룰로스 블롯팅 막(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 옮긴 후, 적절한 항체로 탐침하였고, 신호는 Odyssey CLx imager(Lincoln, Nebraska, USA)로 탐지하고, Image studio lite software (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA)를 이용하여 분석하였다.
실험예 5. 멜라닌의 정량 방법
5 x 105 수의 각 세포를 1 N NaOH-10% DMSO 100 ㎕를 이용하여 80℃에서 2시간 동안 용해하였다. 이후, 용액에 포함된 멜라닌 양을 405 nm 흡광도에서 측정하였고, 멜라닌 표준품(Sigma)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 생성된 멜라닌 양을 산출하였다.
실험예 6. 타이로시나제 활성 어세이(tyrosinase activity assays) 방법
먼저, L-DOPA를 이용한 방법으로서, 각 세포를 1% Triton X-100, 1 μM PMSF, 1 ㎍/㎖ aprotinin 및 10 ㎍/㎖ leupeptin이 포함된 50 mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)를 이용하여 용해하였다. 상기 용해물을 13,000 rpm 및 4℃에서 15분 동안 원심분리한 뒤, L-DOPA로 37℃에서 3시간 동안 반응시켰고, 470 nm에서 흡광도를 측정하여 활성을 평가하였다.
또한, 면역형광을 이용한 방법으로서, 각 세포를 12웰 플레이트의 커버슬립에 올려두었고, 20분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정한 뒤, 10 mM L-DOPA가 포함된 인산염 버퍼를 이용하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 커버슬립을 글라스 슬라이드에 마운트하고, 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.
실험예 7. 자외선 조사(UVB irradiation) 방법
단파장 자외선(narrow-band UVB) 조사를 위해, broadband uorescent UVB 램프(Philips PL 9W/12; Philips, Eindhoven, the Netherlands)가 있는 Dermalight 80 MED 테스터(National Biological Corp., Beachwood, OH, USA)를 이용하였다. 이때, 상기 램프는 305 내지 315 nm 범위의 파장 스펙트럼을 방출하며, 311 nm에서 피크를 갖는다.
구체적으로, 배양 접시의 뚜껑을 제거하고, 배지에서 유래하는 독성 광물질의 생성을 예방하기 위하여 배양물을 PBS로 교체한 뒤, 100 mJ/cm2 UVB에 노출시켰다.
실험예 8. 면역조직화학 염색(Immunohistochemical staining) 방법
멜라노덤 조직 샘플을 5 ㎛의 두께로 박편한 뒤, 내재적 퍼옥시다제(endogenous peroxidase) 활성을 차단하기 위하여 3% 과산화수소(hydrogen peroxide)를 처리하였고, 다른 비특이적 반응을 제거하기 위하여 1% BSA가 포함된 PBS로 전-배양을 수행하였다.
이후, 박편하여 수득한 각 섹션을 항-타이로시나제 항체(anti-tyrosinase; α-Tyr, diluted 1:100)로 16시간 동안 배양하였고, AEC를 기질로 사용한 Vectastain ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 이용하여 결과를 관찰하였다. 이때, 교차염색은 헤마톡실린(hematoxylin)으로 수행하였고, 절편은 탈수화하여 마운트하였다.
실험예 9. 세포 증식 어세이(Cell proliferation assay) 방법
각 세포 증식 정도는 MTT[3-(4,5-dimethythiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide] 어세이를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, MNT-1 세포를 1 x 104 세포/웰의 수로 96웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 이후, 0.5 ㎎/㎖ MTT(100 ㎕; Sigma)가 포함된 배지를 각 웰에 넣고, 세포를 1시간 동안 배양하였으며, 산성 이소프로판올(90% isopropanol, 0.5% SDS, 25 mM NaCl) 100 ㎕를 각 웰에 넣었다. 각 샘플의 흡광도는 96-well microtiter plate reader(Dynatech, Chantilly, VA, USA)를 이용하여 570 nm에서 측정하였다.
실험예 10. 트리플 쿼드 러폴 MS(triple quadrupole MS) 분석을 이용한 타이로신 측정 방법
D-타이로신 및 L-타이로신의 수준은 한국 기초과학연구소 서부 서울센터에서 Agilent 1290 Infinity LC 장치 및 Agilent 6490 Triple Quadrupole MS 시스템 (Agilent Technologies, 미국, 캘리포니아, 산타 클라라)을 이용하여 측정하였다.
구체적으로, D-타이로신 및 L-타이로신을 메탄올, 물 및 클로로포름으로 구성된 용매를 이용하여 세포에서 추출하였고, L-타이로신-D2를 내부 표준으로 첨가하였다.
크로마토그래피 분석은 Astec CHIROBIOTIC T 컬럼(250 x 4.6 mm, particle size 5 ㎛; Supelco, Bellefonte, Pennsylvania, USA)을 이용하여 40℃에서 수행하였다. 이동상은 0.02 % 포름산이 포함된 70% 메탄올로 구성하였고, 1 ㎖/분의 유속으로 용출하였다. 각 샘플에 대하여, 2 ㎕ 부피로 주입하였고, 전체 실행 시간은 10분으로 조정하였다. 모든 샘플에 대하여 세 번 측정하였다.
MS/MS 실험은 다음의 매개 변수를 사용하여 양이온 모드에서 수행하였다: 모세관 전압 3.5 kV, 분무기 가스 40psi의 질소, 건조 가스 온도 120 ℃, 건조 기체 유속 11 L/분, 시스 가스 온도 350℃; 시스 가스 유량 12 L/분, 노즐 전압 500V.
이러한 단일 반응 모니터링(SRM) 전이 및 유지 시간은 하기 표 1에 요약하였다.
D-타이로신 및 L-타이로신의 정량에 사용한 LC-MS/MS의 성능 파라미터
Retention time(min) Precursor ion(m/z) Product ion(m/z) Collision energy(eV) R2 Calibration range (ng/g)
L-Tyrosine 5.3 182.2 136.1 9 0.9998 5-1000
D-Tyrosine 5.9 182.2 136.1 9 0.9993 5-1000
L-Tyrosine-D2 (internal standard) 5.3 184.1 138.2 6 - -
실험예 11. 통계 분석
모든 값은 세 번의 독립적인 실험으로부터 얻은 평균값으로 나타내었다.
통계 분석은 unpaired Student's t-test를 사용하여 수행하였고, P 값(P value)이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
실시예 1. 멜라닌 합성에 대한 L- 타이로신 또는 D- 타이로신의 영향 확인
L-타이로신 또는 D-타이로신이 멜라닌 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 인간 악성흑색종 세포 MNT-1에 L-타이로신 또는 D-타이로신을 다양한 농도로 처리하고, 24시간 동안 배양한 후, 실험예 3 내지 5에 따라, 멜라닌 양 및 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현양을 측정하였다.
그 결과, 도 1의 A에서 볼 수 있듯이, 250 μM의 L-타이로신을 처리한 세포에서 가장 많은 양의 멜라닌이 생성되는 것을 확인하였다. 반면에, D-타이로신을 처리한 경우에는 멜라닌 양이 오히려 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 1의 B에서 볼 수 있듯이, L-타이로신을 처리한 경우에는 멜라닌 합성에 중요한 역할을 수행하는 타이로시나제(tyrosinase; TYR) 및 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 단백질의 발현이 용량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 반면에, D-타이로신을 처리한 경우에는 상기 단백질들의 발현이 오히려 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, L-타이로신이 멜라닌 합성을 촉진하는 것과 대조적으로, D-타이로신은 멜라닌 합성을 저해함을 확인하였다.
한편, 본 발명에 사용한 배지에는 104 mg/L의 L-타이로신이 기본으로 포함되어 있음에 따라, L-타이로신 또는 D-타이로신이 멜라닌 형성에 미치는 영향을 더욱 정확히 확인하고자 L-타이로신이 없는 최소 필수 배지를 이용하여 실험을 수행하였다. 상기와 같은 실험 전략은 도 1의 C에 나타내었고, 실험예 3 내지 6에 따라, 멜라닌 양, 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현양, 및 TYR의 활성을 측정하였다.
구체적으로, L-타이로신이 없는 배지를 이용하여 타이로신의 영향을 더욱 정확히 분석하고자 하였다. MNT-1 세포를 L-타이로신이 없는 배지에서 24시간 동안 배양하였고, 이후 L-타이로신 또는 D-타이로신을 처리하여 24시간 더 배양하였다.
그 결과, 도 1의 D에서 볼 수 있듯이, L-타이로신이 없는 조건에서는 세포의 TYR 단백질 양이 시간 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 특히, L-타이로신이 없는 배지로 교체한 후 24시간이 지난 후에는 TYR 단백질 양이 배양 0시간일 때에 비하여 20% 수준까지 감소(즉, 80% 감소)하는 것을 확인하였다.
한편, 도 1의 E에서 볼 수 있듯이, L-타이로신을 처리하는 경우에는 멜라닌 양 및 TYR 활성이 용량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 반면에, D-타이로신의 경우에는 상기와 같은 멜라닌 양 및 활성이 처리하지 않은 경우에 비하여 오히려 감소하는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 1의 F에서 볼 수 있듯이, L-타이로신은 멜라닌 합성에 중요한 역할을 수행하는 TYR, TRP1 및 MITF 단백질의 발현을 증가시키지만, D-타이로신은 상기와 같은 발현 증가 활성을 나타내지 않음을 확인하였다.
상기 실시예 1의 내용을 종합하여, L-타이로신이 멜라닌 합성을 촉진하고, TYR의 발현을 촉진하는 것과 대조적으로, D-타이로신은 멜라닌 합성을 저해하고, TYR 및 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현을 억제함을 확인하였다.
실시예 2. D- 타이로신의 L- 타이로신에 의한 멜라닌 합성 억제 효과 확인
상기 실시예 1을 통해 L-타이로신은 멜라닌 합성을 촉진하는 반면에 D-타이로신은 멜라닌 합성을 오히려 억제하는 것을 확인함에 따라, D-타이로신이 L-타이로신에 의해 유도되는 멜라닌 생성을 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, MNT-1 세포를 L-타이로신을 포함하거나, 포함하지 않는 배지를 이용하여 배양하였고, 이후 L-타이로신 및/또는 D-타이로신을 처리하여 24시간 더 배양하였다. 이후, 실험예 3 내지 6에 따라, 멜라닌 양, 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현양, 및 TYR의 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 2의 A에서 볼 수 있듯이, L-타이로신을 포함하거나 포함하지 않는 배지를 이용하여 배양된 모든 조건에서, L-타이로신 10 μM를 처리하는 경우에는 L-타이로신을 처리하지 않은 경우에 비하여 멜라닌 양 및 TYR 활성이 증가하며, 이러한 증가 효과는 L-타이로신이 포함되지 않은 배지에서 더 명확하게 나타나는 것을 확인하였다. 반면에, L-타이로신 10 μM에 의해 생성된 멜라닌은 D-타이로신을 처리하는 경우에 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, 이러한 감소 효과는 L-타이로신이 포함되지 않은 배지에서 더 명확하게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 도 2의 B에서 볼 수 있듯이, L-타이로신을 포함하거나 포함하지 않는 배지를 이용하여 배양된 모든 조건에서, L-타이로신 10 μM를 처리하는 경우에는 TYR, TRP1 및 MITF 단백질 발현이 증가하지만, D-타이로신을 처리하는 경우에는 L-타이로신에 의해 증가된 상기 단백질의 발현양이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 2의 C에서 볼 수 있듯이, 실험예 6에 따른 L-DOPA 염색 결과, L-타이로신 10 μM를 처리하는 경우에는 세포 내 TYR 활성이 증가하지만, D-타이로신을 처리하는 경우에는 L-타이로신에 의해 증가된 상기 단백질의 활성이 현저하게 감소하여, 타이로신을 처리하지 않은 세포와 동일한 정도의 활성을 갖는 것을 확인하였다.
한편, 도 2의 D에서 볼 수 있듯이, 실험예 9에 따른 세포증식 어세이 결과, L-타이로신 또는 D-타이로신은 세포에 대하여 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
아울러, 도 2의 E에서 볼 수 있듯이, 피부 기능에 중요한 역할을 수행하는 Wnt 신호전달 경로에 대하여(Lim X, Cold Spring Harb Perspect Biol 2013;5(2)), D-타이로신은 상기 Wnt 신호전달 경로에 중요하게 관여하는 단백질들인 Dvl2(disheveled segment polarity protein 2), LRP6(LDL receptor related protein 6), beta-catenin, axin 또는 GSK3β(glycogen synthase kinase 3 beta)의 발현에는 영향을 주지 않음을 확인하였다.
상기 실시예 2의 내용을 종합하여, D-타이로신은 L-타이로신에 의해 야기되는 멜라닌 합성을 억제하며, 피부 기능에는 부정적인 영향을 미치지 않으면서 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 3. D- 타이로신의 멜라닌 합성 억제 메커니즘 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 D-타이로신은 멜라닌 합성을 억제하며, 또한 L-타이로신에 의해 유도되는 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인함에 따라, D-타이로신이 멜라닌 합성을 억제하는 메커니즘을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 내재적인 TYR를 발현하지 않는 HEK293 세포에 TYR를 암호화하는 cDNA를 형질주입하였고, 상기 세포의 추출물에 대하여 다양한 기질을 반응시킨 후, 실험예 6에 따라, TYR의 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 3의 A에서 볼 수 있듯이, L-DOPA 및 L-타이로신이 기질인 경우에는 추출물에 포함된 TYR의 활성이 상당히 증가하는 것을 확인하였다. 반면에, D-타이로신이 기질인 경우에는 TYR의 활성이 유의하게 증가하지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, D-타이로신은 TYR의 직접적인 기질로 사용되지 않음을 알 수 있었다.
또한, D-타이로신이 L-타이로신 또는 L-DOPA에 의한 TYR의 활성 증가 효과를 억제하는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, TYR 암호화 벡터가 형질주입된 HEK 293 세포에 대하여, L-타이로신, D-타이로신 또는 L-DOPA를 처리한 이후에 시간에 따른 TYR 활성을 실험예 6에 따라 분석하였다.
그 결과, 도 3의 B 및 C에서 볼 수 있듯이, D-타이로신은 L-DOPA(B) 또는 L-타이로신(C)에 의해 증가하는 TYR 활성을 용량 의존적으로 감소시킴을 확인하였다.
아울러, MNT-1 세포에 TYR의 기질로서 여러 농도의 L-DOPA를 단독으로 처리하거나, 또는 상기 농도의 L-DOPA와 5 mM의 D-타이로신을 동시에 처리한 후, L-DOPA의 농도에 따른 TYR 활성을 실험예 6에 따라 분석하였고, Michaelis-Menten 커브 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3의 D에서 볼 수 있듯이, D-타이로신은 L-DOPA에 의해 증가하는 TYR 활성을 현저하게 감소시키며, Km 값은 0.78에서 1.81 mM까지 증가하고, Vmax 값은 1.00(ΔOD470/min) 근처에서 유지되는 것을 확인하였다.
한편, TYR 억제 활성에 대한 D-타이로신의 메커니즘을 규명하기 위하여, MNT-1 세포에 10, 100 또는 500 μM의 D-타이로신을 배지에 첨가하고, 0, 1, 3, 9 또는 24시간째 세포 내에 존재하는 D-타이로신 양을 실험예 10에 따른 LC/MS/MS을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3의 E에서 볼 수 있듯이, 세포 내 존재하는 D-타이로신의 양은 배양 시간 및 D-타이로신의 농도 등 모든 요인에 의해 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 세포 내 D-타이로신의 수준은 500 μM의 D-타이로신을 처리한 후, 24시간 동안 배양할 때 최대가 됨을 확인하였고, 이는 세포 내에 존재하고 있던 L-타이로신의 농도와는 관련이 없음을 확인하였다.
상기 실시예 3의 내용을 종합하여, D-타이로신은 세포 내로 들어가 세포 내 TYR 활성을 억제함으로써, 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. D- 타이로신의 α- MSH 또는 UVB에 의한 멜라닌 합성 억제 효과 확인
상기 실시예 1 내지 3을 통해 D-타이로신은 멜라닌 생성을 억제하며, 나아가 L-타이로신에 의해 유도되는 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인함에 따라, 멜라닌 형성을 조절하는 핵심 호르몬의 일종인 α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone)에 의한 멜라닌 합성도 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, MNT-1 세포에 1 μM의 α-MSH를 처리한 후, 100 또는 500 μM의 D-타이로신을 처리하고 일정 시간 배양한 뒤, 실험예 3 내지 6에 따라, 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현양, 멜라닌 양 및 TYR 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 4의 A 내지 C에서 볼 수 있듯이, D-타이로신을 처리하는 경우에는 α-MSH에 의해 증가한 TYR, TRP1 및 MITF 단백질의 발현양(A), 멜라닌 양(B) 및 TYR 활성(C)이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
또한, MC1R 및 TYR의 발현을 증가시킴으로써 피부에서 멜라닌 생성을 자극하는 것으로 알려진, 자외선(Ultraviolet; UV)에 의한 멜라닌 합성도 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 실험예 7에 따라, MNT-1 세포에 UVB(100 mJ/cm2)를 48시간 동안 조사한 후, 100 또는 500 μM의 D-타이로신을 처리하고 일정 시간 배양한 뒤, TYR 활성 및 생성된 멜라닌 양을 확인하였다.
그 결과, 도 4의 D 내지 F에서 볼 수 있듯이, D-타이로신을 처리하는 경우에는 UV에 의해 증가한 TYR, TRP1 및 MITF 단백질의 발현양(D), 멜라닌 양(E) 및 TYR 활성(F)이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 실시예 4의 내용을 종합하여, D-타이로신은 일상 환경에서 멜라닌 합성을 야기하는 주된 요인인 α-MSH 또는 UV에 의해 야기된 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 인간 초대 멜라닌세포에 대한 D- 타이로신의 멜라닌 합성 억제 효과 확인
상기 실시예 1 내지 4를 통해 D-타이로신은 MNT-1 인간 악성흑색종 세포주에서 L-타이로신, α-MSH 또는 UV에 의해 유도되는 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인함에 따라, 인간 초대 멜라닌세포에 대해서도 동일한 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 구입한 인간 초대 표피 멜라닌세포(human primary epidermal melanocytes)에 D-타이로신, L-타이로신 또는 α-MSH와 D-타이로신을 처리한 후, 실험예 3 내지 6에 따라, 상기 세포의 멜라닌 양, TYR 활성, TYR 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 5의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, D-타이로신은 L-타이로신의 처리에 증가한 멜라닌 양(A), TYR 활성(B 및 D), TYR 및 TRP1 단백질의 발현양(C)을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 5의 E에서 볼 수 있듯이, D-타이로신은 α-MSH에 의해 증가된 멜라닌 양도 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, D-타이로신은 인간 초대 멜라닌 세포에서도 L-타이로신 또는 α-MSH에 의한 멜라닌 합성을 저해할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. 인간 피부 모델에 대한 D- 타이로신의 멜라닌 합성 억제 효과 확인
상기 실시예 1 내지 5를 통해 D-타이로신은 MNT-1 인간 악성흑색종 세포주 및 인간 초대 멜라닌세포에서 L-타이로신, α-MSH 또는 UV에 의해 유도되는 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인함에 따라, 인간 피부 모델에 대해서도 동일한 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 3D 인간 피부 모델에 10 mM/일 농도의 D-타이로신을 이틀에 한 번씩 17일 동안 총 8번 처리한 후, 실험예 3 내지 6에 따라, 상기 세포의 멜라닌 양, TYR 발현량을 확인하였다. 상기와 같은 실험 전략은 도 6의 A에 나타내었다
그 결과, 도 6의 B에서 볼 수 있듯이, D-타이로신을 처리한 경우에는 물을 처리한 대조군보다 색소 침착이 감소한 것을 확인하였다.
또한, 도 6의 C 및 D에서도 볼 수 있듯이, D-타이로신을 처리한 경우에는 물을 처리한 대조군보다 표피 기초층의 멜라닌 합성을 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, D-타이로신은 인간 피부 모델에서도 멜라닌 합성을 저해할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. D- 타이로신을 포함하는 펩타이드의 제조 및 멜라닌 합성 억제 효과 확인
실시예 7-1. D-타이로신을 포함하는 펩타이드의 제조
상기 실시예 1 내지 6을 통해 D-타이로신은 다양한 멜라닌 합성 세포 및 인간 피부 모델에 대하여 멜라닌 합성 억제 효과를 나타냄을 확인함에 따라, D-타이로신을 포함하는 펩타이드도 동일한 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, D-타이로신을 포함하는 5 내지 6개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제조하였다. L-타이로신을 N-말단에 포함하는 기존의 펩타이드를 토대로 하여, D-타이로신을 N-말단, C-말단, 또는 N-말단/C-말단 모두에 포함하는 펩타이드를 제조하였고, 비교군으로서 L-타이로신을 N-말단 또는 C-말단에 포함하는 펩타이드를 제조하였다. 한편, 상기 펩타이드의 서열은 하기 표 2에 나열하였다.
명명 서열
N-L, pentapeptide-18 Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu (서열번호 7)
N-D D-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu (서열번호 8)
C-L D-Ala-Gly-Phe-Leu-Tyr (서열번호 9)
C-D D-Ala-Gly-Phe-Leu-D-Tyr (서열번호 10)
DD D-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-D-Tyr (서열번호 11)
실시예 7-2. D- 타이로신을 포함하는 펩타이드의 멜라닌 합성에 대한 영향 확인
상기 실시예 7을 통해 제조한, D-타이로신을 다양한 형태로 포함하는 펩타이드의 멜라닌 합성에 대한 영향을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 실험예 5 및 6에 따라, 상기 세포의 멜라닌 양 및 TYR 활성 등을 확인하였다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, N-말단 또는 C-말단에 D-타이로신을 포함하는 펩타이드(N-D 또는 C-D)는 멜라닌 총 양을 감소시키고, TYR 활성을 감소시키고, MITF 발현량을 감소시킴을 확인하였다.
아울러, 도 8에서 볼 수 있듯이, 형광 현미경을 통해 dark area를 관찰한 결과 역시 D-타이로신을 포함하는 펩타이드를 처리한 경우 dark area가 감소됨을 확인할 수 있었고, 멜라닌 양 또한 감소함을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해, D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 세포의 멜라닌 합성을 감소시킴으로써 멜라닌 생성을 억제하여 우수한 미백 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 7-3. D- 타이로신을 포함하는 펩타이드의 α- MSH 또는 UV에 의한 멜라닌 합성 억제 효과 확인
상기 실시예 7-2를 통해 D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인함에 따라, 멜라닌 형성을 조절하는 핵심 호르몬의 일종인 α-MSH에 의한 멜라닌 합성도 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 실험예 5 및 6에 따라, 상기 세포의 멜라닌 양을 확인하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, N-말단 또는 D-말단에 D-타이로신을 포함하는 펩타이드(N-D 또는 C-D)는 α-MSH에 의해 증가한 멜라닌 양을 감소시킴을 확인하였다. 또한, dark area 역시 감소됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 멜라닌 합성을 야기하는 주된 요인인 α-MSH에 의해 야기된 멜라닌 생성을 억제하여 우수한 미백 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
또한, MC1R 및 TYR의 발현을 증가시킴으로써 피부에서 멜라닌 생성을 자극하는 것으로 알려진, 자외선(Ultraviolet; UV)에 의한 멜라닌 합성도 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.
그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 UV에 의해 증가한 멜라닌 양, MITF 발현량 및 dark area의 너비를 모두 현저하게 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 UV에 의해 야기된 멜라닌 생성 또한 억제하여 우수한 미백 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 7-4. 인간 초대 표피 멜라닌세포 (human primary epidermal melanocytes)에서의 멜라닌 합성 억제 효과 확인
상기 실시예 7-2 및 7-3을 통해 D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 MNT-1 인간 악성흑색종 세포주에서 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인함에 따라, 추가로 인간 초대 표피 멜라닌세포에서도 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하고자 하였다.
상기 실시예 7-2 및 7-3과 동일한 실험을 수행한 결과, D-타이로신을 포함하는 펩타이드를 처리한 경우 멜라닌 양을 감소시키고, TYR 활성을 감소시키며, dark area가 감소됨을 확인할 수 있었다(도 11). 아울러, α-MSH 또는 UV에 의해 증가한 멜라닌 양을 감소시키고 dark area가 감소됨으로써 멜라닌 생성을 억제함을 확인할 수 있었다(도 12).
실시예 7-5. 양 말단에 D- 타이로신을 포함하는 펩타이드의 멜라닌 합성 억제 효과 확인
상기 실시예 7-2 내지 7-4를 통해 D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인함에 따라, 양 말단에 D-타이로신을 포함하는 펩타이드의 미백 효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 실험예 5에 따라, 상기 세포의 멜라닌 양을 확인하였다.
그 결과, 도 13에서 볼 수 있듯이, N-말단 및 C-말단 모두에 D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 D-타이로신 단독과 비교해도 유사하거나 더 우수한 멜라닌 감소 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 이를 N-말단 및 C-말단 모두에 포함하는 경우 멜라닌 생성 억제 효과가 더욱 우수함을 알 수 있었고, 현저한 미백 효과를 나타낼 것임을 알 수 있었다.
실시예 8. D- 타이로신을 포함하는 펩타이드의 미백 및 항염/항노화의 복합 활성 확인
상기 실시예 7을 통해 D-타이로신을 포함하는 펩타이드는 우수한 미백 효과를 나타냄을 확인함에 따라, 새로운 다른 펩타이드의 미백 효과 및 항염/항노화 효과와의 복합 활성을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 항염, 항노화 효과가 이미 알려진 펩타이드에 D-타이로신을 결합시켜 펩타이드를 제조하였다. 상기 펩타이드의 서열은 하기 표 3에 나열하였다.
효과 명명 서열
항노화 Tetrapeptide-21 Gly-Glu-Lys-Gly (서열번호 12)
Gly -Glu-Lys-Gly-D-Tyr (서열번호 13)
D-Tyr-Gly-Glu-Lys-Gly-D-Tyr (서열번호 14)
항염 Tri Gly-His-Lys (서열번호 15)
Gly-His-Lys-D-Tyr (서열번호 16)
그 결과, 항염 또는 항노화 효과를 갖는 펩타이드에 D-타이로신이 포함되는 경우, 펩타이드의 항염 또는 항노화 효과는 그대로 유지되면서 추가로 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.
구체적으로, 도 14에서 보는 바와 같이, 항노화 효과를 갖는 펩타이드 (Tetrapeptide-21)에 D-타이로신이 포함되는 경우, COL1A1 및 MMP1 발현량을 통해 항노화 활성이 유지됨과 함께, 멜라닌 양을 통해 미백 효과가 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 15에서 보는 바와 같이, 항염 효과를 갖는 펩타이드(Tri)에 D-타이로신이 포함되는 경우, TNFα 및 IL6 발현량을 통해 항염 활성이 유지됨과 함께, 멜라닌 양을 통해 미백 효과가 증가함을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. D-타이로신(D-tyrosine) 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 화장품학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 D-타이로신은 L-타이로신(L-tyrosine)에 의한 타이로시나제(tyrosinase) 활성을 경쟁적으로 억제하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 이의 N-말단; C-말단; 또는 N-말단 및 C-말단에 D-타이로신을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 2개 내지 6개의 아미노산으로 구성된 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피부 미백은 멜라닌 합성 억제에 의해 달성되는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 기미, 주근깨, 검버섯 및 잡티로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 예방 또는 개선하기 위한 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열로 구성된 것이고, 추가로 항노화 활성을 갖는 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 것이고, 추가로 항염 활성을 갖는 것인, 조성물.
  10. D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 일광흑색증(solar lentigines), 사마귀, 오타모반, 청색모반, 몽고반점 및 과다 색소침착 반(macule)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환을 예방 또는 치료하는 것인, 조성물.
  12. D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 식품학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 건강기능식품 조성물.
  13. D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 의약외품적으로 허용가능한 염을 포함하는, 피부 미백용 의약외품 조성물.
  14. D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드, 또는 D-타이로신의 염을 포함하는, 멜라닌 합성 억제용 조성물.
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