WO2017213435A1 - Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2017213435A1
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고정민
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating myopathy using the SLIT-ROBO system, and more specifically, a gene selected from slit1, slit2, slit3, robo1, robo2, and fragments thereof, or an expression protein thereof; And / or relates to a composition for preventing and treating muscle diseases or improving muscle function, containing the activator thereof as an active ingredient.
  • Slit protein is a protein well known to regulate the movement of neurons and axons during the development of the nervous system. Slit protein can regulate physiological activity by interacting with Robo receptor, and is known to play a role as a factor regulating various intracellular processes in various tissues such as heart, lung, kidney and breast tissue. It has been reported that there is an important role in the regulation of the ability and mobility of the Slit protein may be involved in the process of cell differentiation and the development and metastasis of cancer. Specifically, it has been reported that Slit protein and Robo protein are expressed in embryonic development of vertebrates, and that the expression of Slit3, Robo1 and Robo2 proteins is increased in muscle tissue (Neil Vargesson et. Al., Mechanisms of development 106.1). (2001): 175-180. According to the report, the Slit3 protein increases expression in myoblasts of embryonic hindlimb muscle tissue, but is involved in migration but not related to myoblast differentiation.
  • Muscular dystrophy refers to a condition in which the amount and function of skeletal muscle is reduced. Muscular dystrophy is caused by a variety of causes, including aging, hormonal abnormalities, malnutrition, lack of physical activity, inflammation and degenerative diseases. Among them, aging and sex hormone deficiency are known to be the main causes. As the life expectancy increases due to the development of various treatments, the aging population is increasing. Accordingly, the demand for treatment for myopathy is expected to continue to increase.
  • the number of myoblasts decreases due to impairment of recruitment, activity or proliferation of satellite cells, stem cells of myoblasts, and decreases myoblast proliferation and differentiation, thereby reducing Muscles show a decrease in muscle function due to a decrease in the size and number of muscle fibers at the histological level.
  • the present inventors have tried to develop a therapeutic agent that can have a direct therapeutic effect on myotropenia, resulting in a decrease in muscle mass in mice deficient in Slit protein, and the Slit protein binds to the Robo1 or Robo2 receptor and thus to Slit-Robo.
  • the system releases ⁇ -catenin, which is bound to myoblast's M-cadherin, activates ⁇ -catenin and increases myogenin expression, thereby promoting muscle differentiation by inducing differentiation of myoblasts. Confirmed that it can.
  • Slit protein, Robo protein, active fragments thereof, or encoding the same in particular when processing the Slit protein full length as well as the active fragment thereof LRRD2 protein can promote myoblast differentiation, thereby inducing an increase in muscle mass.
  • the present invention was completed by confirming that the gene can be used as an active ingredient for the composition for preventing and treating myotropenia.
  • Patent Document 1 KR10-1617497 B1
  • the present inventors activate the ⁇ -catenin by releasing ⁇ -catenin, which is bound to the M-cadherin of myoblasts through the Slit-Robo system by binding the Slit protein to the Robo1 or Robo2 receptor.
  • ⁇ -catenin a protein that has a high expression of nin
  • the present invention was completed by confirming that not only the full length of the Slit protein, but also particularly active fragments thereof, promoted the differentiation of myoblasts to induce an increase in muscle mass.
  • Another object of the present invention is to provide a dietary supplement, or feed additive for preventing and improving muscle diseases.
  • Another object of the present invention to provide a cosmetic composition for improving muscle function.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a therapeutic agent for muscle diseases.
  • the present invention is Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and any one protein selected from the group consisting of fragments thereof or genes encoding the same; It provides a pharmaceutical composition for preventing and treating muscle diseases, including an activator thereof as an active ingredient.
  • preventing and treating pharmaceutical composition for muscle diseases comprising any one protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 or a gene encoding the same as an active ingredient, preventing and treating pharmaceutical composition for muscle diseases to provide:
  • Slit3 protein consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 1;
  • Robo1 protein consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 2;
  • LRRD2 protein consisting of the amino acids of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also provides a method of treating muscle diseases, comprising administering to a subject in need thereof any protein selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and fragments thereof or a gene encoding the same. to provide.
  • the present invention also provides a method for treating muscle diseases, comprising administering to a subject in need thereof any one protein selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 or 4 or a gene encoding the same.
  • the present invention also provides a method of treating muscle diseases, comprising administering to a subject in need an activator of any one of the proteins selected from the group consisting of Slit and fragments thereof or a gene encoding the same.
  • the present invention also provides a method for treating muscle diseases, comprising administering to a subject in need thereof an activator of any one of the proteins selected from the group consisting of Robo and fragments thereof or genes encoding the same.
  • the present invention provides a use of any one protein selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and fragments thereof, or a gene encoding the same, in a pharmaceutical composition for preventing and treating muscle diseases. do.
  • the present invention provides a use of any protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 or a gene encoding the same for use in the pharmaceutical composition for preventing and treating muscle diseases.
  • the present invention also provides the use of an activator of any one protein selected from the group consisting of Slit and fragments thereof, or a gene encoding the same, in a pharmaceutical composition for preventing and treating muscle diseases.
  • the present invention also provides the use of an activator of any one protein selected from the group consisting of Robo and fragments thereof, or a gene encoding the same, in a pharmaceutical composition for preventing and treating muscle diseases.
  • the present invention is any one protein selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and fragments thereof or a gene encoding the same; Or it provides a health functional food for preventing and improving muscle diseases, including their activator as an active ingredient.
  • the present invention is any one protein selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and fragments thereof or a gene encoding the same; Or it provides a use for the use of these activators in dietary supplements for preventing and improving muscle diseases.
  • the present invention provides a use of any protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 or a gene encoding the same for use in health functional foods for preventing and improving muscle diseases.
  • a health functional food for preventing and improving muscle diseases to provide.
  • the present invention is any one protein selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and fragments thereof or a gene encoding the same; Or it provides a cosmetic composition for improving muscle function, comprising these activators as an active ingredient.
  • the present invention is any one protein selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and fragments thereof or a gene encoding the same; Or use of these activators in cosmetic compositions for improving muscle function.
  • the present invention provides a use of any protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 or a gene encoding the same for use in the cosmetic composition for improving muscle function.
  • a cosmetic composition for improving muscle function comprising any one protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 or a gene encoding the same as an active ingredient.
  • the present invention is any one protein selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and fragments thereof or a gene encoding the same; Or it provides a feed additive for improving muscle function, including an active agent thereof.
  • the present invention is any one protein selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and fragments thereof or a gene encoding the same; Or use of these activators in feed additives for improving muscle function.
  • the present invention provides a use of any protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 or a gene encoding the same for use in feed additives for improving muscle function.
  • a feed additive for improving muscle function comprising any one protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 or a gene encoding the same as an active ingredient.
  • the Slit3 protein may be expressed from the slit3 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the Robo1 protein may be expressed from the robo1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the Robo2 protein may be expressed from the robo2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the LRRD2 protein may be expressed from a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the muscle disease may be a muscle disease due to muscle function decline, muscle wasting or muscle degeneration, and the muscle disease is atony, muscular atrophy, muscular dystrophy. (muscular dystrophy), muscle degeneration, myasthenia, cachexia and sarcopenia may be any one or more selected from the group consisting of.
  • step iii) if the Slit3 protein expression level of the experimental group compared in step ii) is reduced compared to the control group, the experimental group comprising the step; providing a protein detection method for providing information on the diagnosis of muscle disease, including; .
  • test compound or composition any one or more selected from the group consisting of Slit3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Robo1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and Robo2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: Treating the cell line;
  • iii) selecting the test compound or composition in which the expression level of the Slit3 protein of step ii), or the activity of the Robo1 protein or Robo2 protein, is increased compared to a control cell line that has not been treated with the test compound or composition; Provided is a method for screening a therapeutic agent for a disease.
  • the present invention can provide a composition for preventing or treating myopathy using the SLIT-ROBO system.
  • the present invention provides a gene selected from slit1, slit2, slit3, robo1, robo2, and fragments thereof, or an expression protein thereof; Or it may provide a composition for preventing and treating muscle diseases, or improve muscle function containing the activator thereof.
  • the Slit protein of the present invention binds to the Robo1 or Robo2 receptor and releases ⁇ -catenin, which was bound to M-caderin of myoblasts through the Slit-Robo system.
  • ⁇ -catenin By releasing and activating ⁇ -catenin and increasing the expression of myogenin, it is possible to promote muscle formation by inducing differentiation of myoblasts.
  • the treatment of not only the full length of the Slit protein but also active fragments thereof, particularly preferably the LRRD2 protein may promote differentiation of myoblasts, thereby inducing an increase in muscle mass.
  • the fragment, or the gene encoding the same is effective because it can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for preventing and treating myopathy.
  • 1A-1E show body weight change and muscle loss indices in a group of male mice deficient in Slit3.
  • 2A-2E show body weight change and muscle loss indicators in Slit3 deficient female mouse model group.
  • 3A to 3D show the results of H & E staining of EDL muscles of Slit3 deficient male mouse model group.
  • 4A to 4D show the results of H & E staining of GC muscles of Slit3 deficient male mouse model group.
  • 5A to 5D show the results of immunohistochemical staining of GC muscles of Slit3 deficient male mouse model group.
  • Figure 6 shows the confirmation of the cell viability change of the C2C12 cell line following Slit3 treatment to confirm the effect of Slit3 myoblast differentiation.
  • 7a to 7e show the effect of increasing the differentiation of Slit3 in the differentiation from myoblasts to myotubes.
  • 8A to 8F show changes in mRNA expression levels of various myogenic regulators following Slit3 treatment during myoblast differentiation.
  • 9A and 9B show changes in the protein expression level of myogenin following Slit3 treatment in the differentiation of myoblasts.
  • Figure 10 shows the difference in the number of myogenin-positive cells according to Slit3 treatment in the differentiation process of myoblasts.
  • FIG. 11 is a diagram confirming the type and expression level of the Caderin protein expressed in myoblasts:
  • 11A shows mRNA expression levels of M-cadherin and N-cadherin in myoblasts
  • 11B shows protein expression levels of M-cadherin and N-cadherin in myoblasts.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of inducing myoblast differentiation by ⁇ -catenin activation of Slit3:
  • Figure 12f shows the expression level of myogenin in Slit3 treated myoblasts following ⁇ -catenin expression inhibition.
  • Figure 13 shows the Robo receptor subtype binding to Slit3 in myoblasts:
  • Figure 13A shows subtypes of Robo receptors expressed in C2C12 cells, myoblasts.
  • 13b to 13d show that the effect of increasing myogenin expression by Slit3 does not significantly increase with Robo1 or Robo2 knockout in C2C12 cells.
  • 15A-15D show the myoblast differentiation effect by LRRD2 of Slit3 at in vitro levels.
  • 16A-16E show the confirmation of the effect of Slit3's weight change and muscle loss index increase on in vivo levels.
  • the Slit protein or active fragment thereof is ⁇ -catenin ( ⁇ -) that binds to the Robo1 or Robo2 receptor and binds to M-caderin of myoblasts via the Slit-Robo system.
  • catenin activates ⁇ -catenin and increases the expression of myogenin, which can promote muscle formation by inducing differentiation of myoblasts, and therefore is effective in treating muscle hypoplasia. It was confirmed that can be represented.
  • the present invention provides a combination of any one or more proteins selected from the group consisting of Slit1, Slit2, Slit3 protein, Robo1 protein, Robo2 protein and LRRD2 protein or genes encoding the same; Or it provides a pharmaceutical composition for preventing and treating muscle diseases, including the activator thereof as an active ingredient.
  • Slit3 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 1
  • Robo1 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 2
  • Robo2 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 3
  • "LRRD2 protein” of the present invention is preferably composed of the amino acid of SEQ ID NO: 4, may comprise a functional equivalent of the protein or peptide.
  • the "functional equivalent” is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% of the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1-4, due to amino acid addition, substitution, or deletion of the protein or peptide, More preferably, it refers to a protein or peptide having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with a protein or peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs.
  • the "activators" of the present invention are various compounds, proteins or peptides, bases that can enhance the expression of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, and / or fragments thereof, or can activate the SLIT-ROBO system. Sequence and the like. The compounds, proteins or peptides, various metabolites, precursors, pharmaceutical equivalents of the sequences are also included in the activator.
  • Slit3 protein of the present invention is preferred to be expressed from slit3 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is preferred and, "Robo1 protein” is expressed from robo1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and " Robo2 protein "is preferably expressed from the robo2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7," LRRD2 protein "is preferably expressed from the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the muscle disease of the present invention is preferably a disease reported in the art as a muscle disease caused by muscle function deterioration, muscle wasting or muscle degeneration, and specifically, atony, muscular atrophy, and muscular dystrophy. More preferably, it is one or more selected from the group consisting of muscle degeneration, myasthenia gravis, cachexia and sarcopenia, but is not limited thereto.
  • muscle wasting or degeneration occurs due to congenital factors, acquired factors, aging, and the like, and muscle wasting is characterized by a gradual loss of muscle mass, particularly weakening and degeneration of muscle, particularly skeletal or veterinary and cardiac muscle.
  • muscle refers to tendons, muscles, and tendons collectively, muscle function or muscle function refers to the ability to exert a force by the contraction of the muscle, the muscle to the maximum contraction force to overcome the resistance Muscle strength that can be exerted; Muscle endurance, the ability to indicate how long or how many times a muscle can repeat contraction and relaxation at a given weight; And quickness, which is the ability to exert a strong force in a short time.
  • the muscle function is proportional to muscle mass, and the term muscle function improvement means improving muscle function in a more positive direction.
  • the inventors confirmed the relationship between the expression of Slit3 and muscle mass, the mice lacking Slit3 reduced skeletal muscle (Fig. 1, Fig. 2, Table 1 and Table 2), the area of the muscle fiber is remarkable However, it was confirmed that there is no change in the number of myoblasts and their satellite cells themselves (Figs. 3 to 5).
  • Slit3 promotes myoblast differentiation
  • Slit3 did not affect the viability of myoblasts and confirmed that myoblasts can be differentiated into muscle myofiber (FIGS. 6 and 7). It was confirmed that the expression of myogenin is increased by Slit3 among the myogenic regulatory factors involved in differentiation (FIGS. 8 to 10).
  • M-cadherin expressed in myoblasts is more abundant than N-cadherin in the process of differentiation of myoblasts into muscle myofiber, and ⁇ -catenin binding to M-cadherin is released and -Catenin activity was confirmed to be increased by Slit3 (FIGS. 11A, 11B and 12A), resulting in increased M ⁇ -catenin activity and increased expression of myogenin via Slit3 during myoblast differentiation. Induction of differentiation was confirmed to be involved in promoting muscle formation (FIGS. 12B, 12C to 12E and 12F).
  • the present inventors confirmed that Robo receptor subtypes that bind to Slit3 in myoblasts, Robo1 and Robo2 receptors are expressed on the surface of myoblasts, they confirmed that the Slit-Robo system exhibits the effect of Slit3 (Fig. 13a) And FIGS. 13B and 13C).
  • the deficiency of Robo1 indicates a decrease in muscle mass at the biological level
  • an improvement effect of muscle reduction may be obtained through the binding system of Slit3 and Robo1 or Robo2 (Table 3 and FIG. 14).
  • the present inventors confirmed the myoblast differentiation and muscle mass enhancement effect by the LRRD2 domain of Slit3, increased the myoblast differentiation effect by LRRD2 of Slit3 at the in vitro level, the muscle administered with LRRD2 of Slit3 at the in vivo level It was confirmed that the body weight and muscle loss index is increased in the reduction model mouse (FIG. 15, FIG. 16 and Table 4).
  • the Slit protein of the present invention binds to the Robo1 or Robo2 receptor and releases ⁇ -catenin, which is bound to M-cadherin of myoblasts via the Slit-Robo system, thereby activating ⁇ -catenin and inhibiting the expression of myogenin.
  • muscle formation can be promoted by inducing differentiation of myoblasts.
  • the treatment of not only the full length of the Slit protein but also active fragments thereof may promote differentiation of myoblasts, thereby inducing an increase in muscle mass.
  • the Slit3 protein or the LRRD2 protein of Slit3, or an encoding thereof The gene to be used can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for preventing and treating myopathy.
  • Proteins or peptides of the present invention may also be included within the scope of the present invention.
  • the amino acid sequence variant refers to a protein or peptide having a sequence different from the wild type amino acid sequence of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 or LRRD2 by one of deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. it means.
  • Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein and LRRD2 protein, or variants thereof, of the present invention are extracted from nature or synthesized (Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, 1963) or based on DNA sequences. It can be produced by a genetic recombination method (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd edition, 1989).
  • Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein and LRRD2 protein of the present invention can express genes encoding Slit3, Robo1, Robo2 protein and LRRD2 protein in cells for use in gene therapy or vaccine It may be provided in the form of an expression vector that can be.
  • the expression vector may be an expression vector known in the art that can be expressed by inserting a gene encoding the Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein, such as pBK-CMV (Staratagene), pCR3 Expression vectors such as .1 (Invitrogen) can be used.
  • a nucleotide sequence encoding the Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein, and LRRD2 protein of the present invention ie, a form in which a recombinant DNA molecule including a polynucleotide is operably linked to a nucleic acid sequence for controlling expression
  • the polynucleotide may be administered so that it is expressed in a patient to be treated in the form of an expression vector.
  • the vector thus comprises a suitable transcriptional control signal comprising a promoter site capable of expressing the coding sequence, which promoter is preferably operable in the patient to be treated.
  • a promoter which is a term that includes not only the sequences needed to direct RNA polymerase to a transcription initiation site, but also other operational or regulatory sequences, including an enhancer, as appropriate, is preferably from a human gene. It may be a human promoter sequence or a human promoter sequence from a gene generally expressed in humans, for example a promoter from human cytomegalovirus (CMV).
  • CMV cytomegalovirus
  • CMV ie early promoter CMV ie early promoter
  • HSV thymidine kinase promoter HSV thymidine kinase promoter
  • early and late SV40 promoters retroviral LTR promoters such as those of Lu sarcoma virus ("RSV")
  • retroviral LTR promoters such as those of Lu sarcoma virus (“RSV")
  • mouse metallothionein- Metallothionein promoters such as the 1 promoter are suitable.
  • Such polynucleotide sequences and transcriptional regulatory sequences may be provided cloned into replicable plasmid vectors based on plasmids such as commercially available pBR322 or may be constructed from plasmids available by routine application of well-known published procedures.
  • the vector may also comprise a transcriptional regulatory sequence located 3 ′ of the gene sequence and a polyadenylation sequence recognizable in the patient to be treated, such as the corresponding sequence from a virus such as the SV40 virus when used in human therapy. .
  • a transcriptional regulatory sequence located 3 ′ of the gene sequence and a polyadenylation sequence recognizable in the patient to be treated, such as the corresponding sequence from a virus such as the SV40 virus when used in human therapy.
  • Other transcriptional regulatory sequences are well known and available in the art.
  • the expression vector may also include selectable markers such as antibiotic resistance such that the vector can be propagated.
  • Expression vectors capable of synthesizing the protein or peptide by themselves can be introduced directly to the wound site by physical means. Examples of these include, for example, local application of a "naked" nucleic acid vector in a suitable vehicle in a solution in a pharmaceutically acceptable excipient such as phosphate buffered saline (PBS), or according to methods known in the art.
  • Gene gun " which also includes administering the vector by a physical method such as particle bullet.
  • the "gene gun” technique is a method of releasing under high pressure from a propulsion device, as described in US Pat. No. 53,71015, in which inert particles such as gold beads coated with a vector may be applied to the wound site, e.g. skin cells. Accelerate at a speed sufficient to pass through the surface.
  • other physical methods of administering DNA directly to the receptor include ultrasound, electrical stimulation, electrotransmission, and microseeding.
  • the gene sequence may also be administered to the wound site by means of a transformed host cell.
  • the cells include cells harvested from the patient, and the nucleic acid sequence can be introduced into the cell by a gene introduction method known in the art, so that the transformed cells can be grown in culture and transplanted into the patient.
  • Expression constructs as described above can be used in various ways in the treatment of the present invention.
  • the expression constructs can be administered directly to the site in need of treatment in the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include an active factor for increasing the expression of Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein as an active ingredient.
  • the activator for increasing the expression of the Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein may act directly or indirectly on the slit1 , slit2 , slit3 , robo1 , robo2 gene or LRRD2 encoding Slit1, Slit2, Slit3 Means a substance that improves, induces, stimulates, or increases the biological activity of the Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein.
  • the material includes a single compound such as an organic or inorganic compound, a complex of a plurality of compounds and a biopolymer such as peptides, proteins, nucleic acids, carbohydrates and lipids.
  • the activator for increasing the expression of slit1 , slit2 , slit3 is It can be used for the prevention, amelioration and treatment of diseases caused by a decrease in the expression, activity, or function of slit1 , slit2 , slit3 .
  • the mechanism by which the substance encodes the slit1 , slit2 , slit3 , robo1 , robo2 gene or LRRD2 is not particularly limited.
  • the substance may act as a mechanism for increasing gene expression such as transcription, translation, or converting an inactive form into an active form.
  • the slit1 , slit2 , slit3 , robo1 , robo2 gene or a substance that activates a gene encoding LRRD2 is a biopolymer compound such as a peptide, a protein, a nucleic acid, a carbohydrate and a lipid.
  • slit1, slit2, slit3, where the nucleic acid and protein sequences are already known those skilled in the art will appreciate that single compound peptides, such as organic or inorganic compounds, which act as inducers or activators, and biopolymers such as proteins, nucleic acids, carbohydrates and lipids and complexes of multiple compounds And the like can be prepared or screened using techniques in the art.
  • compositions of the present invention may be in various oral or parenteral formulations.
  • buffers e.g. saline or PBS
  • antioxidants e.g. bacteriostatic agents
  • chelating agents e.g. EDTA or glutathione
  • fillers e.g. extenders, binders
  • adjuvants e.g. Aluminum hydroxide
  • suspending agents thickening humectants, disintegrants or surfactants, diluents or excipients.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid form contains at least one excipient such as starch (corn starch, wheat starch, rice starch, potato) in at least one compound. Starch, etc.), calcium carbonate, sucrose, lactose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol maltitol, cellulose, methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl It is prepared by mixing cellulose or gelatin. For example, tablets or dragees can be obtained by combining the active ingredients with solid excipients and then grinding them and adding suitable auxiliaries and then processing them into granule mixtures.
  • starch corn starch, wheat starch, rice starch, potato
  • Starch, etc. calcium carbonate
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions or syrups, and include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances or preservatives, in addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. Can be.
  • crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant, and may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, a preservative, and the like. .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations or suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol, gelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally, externally for skin during parenteral administration; Injections injected intraperitoneally, rectally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrauterine dural or cerebrovascular; Transdermal agents; Or in the form of nasal inhalants according to methods known in the art.
  • suitable carriers for injections include, but are not limited to, solvents or dispersion media comprising water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols, etc.), mixtures thereof and / or vegetable oils Can be. More preferably, suitable carriers include Hanks solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanol amine or sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose Etc. can be used.
  • solvents or dispersion media comprising water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols, etc.), mixtures thereof and / or vegetable oils Can be. More preferably, suitable carriers include Hanks solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanol amine or sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propy
  • various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like may be further included.
  • the injection may in most cases further comprise an isotonic agent such as sugar or sodium chloride.
  • transdermal administration means that the pharmaceutical composition is locally administered to the skin such that an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is delivered into the skin.
  • the compositions used according to the invention may be pressurized packs, using suitable propellants, for example dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be delivered conveniently from the nebulizer in the form of an aerosol spray. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit can be determined by providing a valve to deliver a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges for use in inhalers or blowers can be formulated to contain a mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch. Formulations for parenteral administration are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour, a prescription generally known in all pharmaceutical chemistries.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level means the type, severity, and activity of the patient's disease. , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose, and may be administered by a fractionated treatment protocol which is administered in multiple doses for a long time. . Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the patient.
  • the daily dosage is preferably in an amount of 0.01 to 50 mg, more preferably 0.1 to 30 mg per kg of body weight per day, based on Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein upon parenteral administration
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be provided in a formulation of an external preparation including Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein, or a base sequence encoding the same as an active ingredient.
  • an external preparation for skin it is further used for fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening agents and gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, and foaming agents.
  • Fragrance surfactant, water, ionic emulsifier, nonionic emulsifier, filler, metal ion sequestrant, chelating agent, preservative, vitamin, blocking agent, wetting agent, essential oil, dye, pigment, hydrophilic active agent, lipophilic active agent Or any other component commonly used in external preparations for skin, such as lipid vesicles.
  • the ingredients may also be introduced in amounts generally used in the field of dermatology.
  • the pharmaceutical composition for preventing and treating muscle diseases of the present invention is provided as an external preparation for skin, it may be a formulation such as, but not limited to, ointment, patch, gel, cream or spray.
  • the present invention includes any one or more proteins selected from the group consisting of Slit1 protein, Slit2 protein, Slit3 protein, Robo1 protein, Robo2 protein and LRRD2 protein or genes encoding them as active ingredients, for preventing and improving muscle diseases Provide dietary supplements.
  • Slit3 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 1
  • Robo1 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 2
  • Robo2 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 3
  • "LRRD2 protein” of the present invention is preferably composed of the amino acid of SEQ ID NO: 4, may comprise a functional equivalent of the protein or peptide.
  • the "functional equivalent” is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% of the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1-4, due to amino acid addition, substitution, or deletion of the protein or peptide, More preferably, it refers to a protein or peptide having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with a protein or peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs.
  • Slit3 protein of the present invention is preferred to be expressed from slit3 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is preferred and, "Robo1 protein” is expressed from robo1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and " Robo2 protein "is preferably expressed from the robo2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7," LRRD2 protein "is preferably expressed from the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the muscle disease of the present invention is preferably a disease reported in the art as a muscle disease caused by muscle function deterioration, muscle wasting or muscle degeneration, and specifically, atony, muscular atrophy, and muscular dystrophy. More preferably, it is one or more selected from the group consisting of muscle degeneration, myasthenia gravis, cachexia and sarcopenia, but is not limited thereto.
  • muscle wasting or degeneration occurs due to congenital factors, acquired factors, aging, and the like, and muscle wasting is characterized by a gradual loss of muscle mass, particularly weakening and degeneration of muscle, particularly skeletal or veterinary and cardiac muscle.
  • muscle refers to tendons, muscles, and tendons collectively, muscle function or muscle function refers to the ability to exert a force by the contraction of the muscle, the muscle to the maximum contraction force to overcome the resistance Muscle strength that can be exerted; Muscle endurance, the ability to indicate how long or how many times a muscle can repeat contraction and relaxation at a given weight; And quickness, which is the ability to exert a strong force in a short time.
  • the muscle function is proportional to muscle mass, and the term muscle function improvement means improving muscle function in a more positive direction.
  • the Slit protein of the present invention binds to the Robo1 or Robo2 receptor and releases ⁇ -catenin, which is bound to M-cadherin of myoblasts via the Slit-Robo system, thereby activating ⁇ -catenin and increasing the expression of myogenin. Induction of myoblasts can promote muscle formation.
  • the treatment of not only the full length of the Slit protein but also an active fragment thereof, particularly preferably the LRRD2 protein may promote differentiation of myoblasts, leading to an increase in muscle mass, and thus, the Slit protein or the active fragment of the Slit of the present invention, or The gene encoding this can be used as an active ingredient in health functional foods for preventing and improving myopathy.
  • the Slit protein of the present invention or the active fragment of the Slit, or the gene encoding the same can be used as an active ingredient of the feed composition for preventing and improving myopathy.
  • the food composition according to the present invention can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • General foods include, but are not limited to, beverages (including alcoholic beverages), fruits and processed foods (e.g. canned fruit, canned foods, jams, marmalade, etc.), fish, meat and processed foods (e.g. hams, sausages) Cornbread, etc.), breads and noodles (e.g. udon, soba noodles, ramen, spagate, macaroni, etc.), fruit juices, various drinks, cookies, malts, dairy products (e.g.
  • Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein of the present invention may be prepared by adding Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein of the present invention to vegetable protein, retort food, frozen food, various seasonings (eg, miso, soy sauce, sauce, etc.).
  • the dietary supplement may be prepared by adding Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein, or LRRD2 protein of the present invention to a capsule, a tablet, a pill, and the like.
  • Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein itself of the present invention can be prepared in the form of tea, juice and drink for drinking (health drink).
  • the Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein of the present invention may be consumed by liquefying, granulating, encapsulating and powdering.
  • the Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein of the present invention in the form of a food additive, it may be prepared in powder or concentrate form.
  • the Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein of the present invention can be prepared in the form of a composition by mixing with a known active ingredient known to be effective in preventing muscle disease and improving muscle function.
  • the health beverage composition may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as a general beverage.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as taumartin, stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame;
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally from about 0.01 to 0.04 g, preferably from about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein of the present invention may be contained as an active ingredient of a food composition for preventing muscle diseases and improving muscle function, the amount of which is effective for preventing muscle diseases and improving muscle function. Although not particularly limited to an amount effective to achieve, it is preferably 0.01 to 100% by weight based on the total weight of the total composition.
  • the food composition of the present invention may be prepared by mixing with Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 protein or LRRD2 protein together with other active ingredients known to be effective in preventing muscle diseases and improving muscle function.
  • the health food of the present invention is various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, Glycerin, alcohol or carbonation agent, and the like.
  • the health food of the present invention may contain a flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverage, or vegetable beverage. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention comprises a Slit1 protein, Slit2 protein, Slit3 protein, Robo1 protein, Robo2 protein and LRRD2 protein comprising any one or more proteins selected from the group consisting of or a gene encoding the same as an active ingredient, cosmetic composition for improving muscle function to provide.
  • the cosmetic composition is not particularly limited, but may be used externally or ingested orally.
  • Slit3 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 1
  • Robo1 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 2
  • Robo2 protein of the present invention consists of amino acids of SEQ ID NO: 3
  • "LRRD2 protein” of the present invention is preferably composed of the amino acid of SEQ ID NO: 4, may comprise a functional equivalent of the protein or peptide.
  • the "functional equivalent” is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% of the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1-4, due to amino acid addition, substitution, or deletion of the protein or peptide, More preferably, it refers to a protein or peptide having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with a protein or peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs.
  • Slit3 protein of the present invention is preferred to be expressed from slit3 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is preferred and, "Robo1 protein” is expressed from robo1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and " Robo2 protein "is preferably expressed from the robo2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7," LRRD2 protein "is preferably expressed from the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the muscle disease of the present invention is preferably a disease reported in the art as a muscle disease caused by muscle function deterioration, muscle wasting or muscle degeneration, and specifically, atony, muscular atrophy, and muscular dystrophy. More preferably, it is one or more selected from the group consisting of muscle degeneration, myasthenia gravis, cachexia and sarcopenia, but is not limited thereto.
  • muscle wasting or degeneration occurs due to congenital factors, acquired factors, aging, and the like, and muscle wasting is characterized by a gradual loss of muscle mass, particularly weakening and degeneration of muscle, particularly skeletal or veterinary and cardiac muscle.
  • muscle refers to tendons, muscles, and tendons collectively, muscle function or muscle function refers to the ability to exert a force by the contraction of the muscle, the muscle to the maximum contraction force to overcome the resistance Muscle strength that can be exerted; Muscle endurance, the ability to indicate how long or how many times a muscle can repeat contraction and relaxation at a given weight; And quickness, which is the ability to exert a strong force in a short time.
  • the muscle function is proportional to muscle mass, and the term muscle function improvement means improving muscle function in a more positive direction.
  • the Slit protein of the present invention binds to the Robo1 or Robo2 receptor and releases ⁇ -catenin, which is bound to M-cadherin of myoblasts via the Slit-Robo system, thereby activating ⁇ -catenin and increasing the expression of myogenin. Induction of myoblasts can promote muscle formation.
  • the treatment of not only the full length of the Slit protein but also an active fragment thereof, particularly preferably the LRRD2 protein may promote differentiation of myoblasts, leading to an increase in muscle mass, and thus, the Slit protein or the active fragment of the Slit of the present invention, or Gene encoding this can be used as an active ingredient of the cosmetic composition for improving muscle function.
  • the composition for improving muscle function of the present invention may also be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition of the present invention contains Slit1 protein, Slit2 protein, Slit3 protein, Robo1 protein, Robo2 protein, or LRRD2 protein as an active ingredient and is a basic cosmetic composition (cosmetic water, cream, essence, cleansing foam and It may be prepared in the form of cleansing water such as cleansing water, packs, body oils, color cosmetic compositions (foundation, lipstick, mascara, makeup base), hair product compositions (shampoo, rinse, hair conditioner, hair gel) and soap. .
  • the excipients include, but are not limited to, emollients, skin penetration enhancers, colorants, fragrances, emulsifiers, thickeners and solvents.
  • fragrances, pigments, fungicides, antioxidants, preservatives and moisturizing agents may be further included, and may include thickeners, inorganic salts, synthetic polymer materials and the like for the purpose of improving the properties.
  • the above-mentioned Slit1 protein, Slit2 protein, Slit3 protein, Robo1 protein, Robo2 protein, or LRRD2 protein can be easily prepared in a conventional face wash and soap base. Can be.
  • the cream When the cream is prepared, it may be prepared by adding Slit1 protein, Slit2 protein, Slit3 protein, Robo1 protein, Robo2 protein, or LRRD2 protein, or a base sequence encoding the same, to a general oil-based cream base (O / W). .
  • synthetic or natural materials such as proteins, minerals, vitamins, etc., for the purpose of improving physical properties, such as flavors, chelating agents, pigments, antioxidants, and preservatives, may be added.
  • the content of Slit1 protein, Slit2 protein, Slit3 protein, Robo1 protein, Robo2 protein or LRRD2 protein contained in the cosmetic composition of the present invention is not limited thereto, but is preferably 0.001 to 10% by weight based on the total weight of the composition, and 0.01 to 5 It is more preferable that it is weight%. If the content is less than 0.001% by weight, the desired anti-aging or anti-wrinkle effect may not be expected, and when the content is more than 10% by weight, there may be difficulty in preparing a safety or formulation.
  • step iii) if the Slit3 protein expression level of the experimental group compared in step ii) is reduced compared to the control group, the experimental group comprising the step; providing a protein detection method for providing information on the diagnosis of muscle disease, including; .
  • measuring the expression level of a protein can be confirmed by measuring the expression level of an mRNA or a protein.
  • test compound or composition any one or more selected from the group consisting of Slit3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Robo1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and Robo2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: Treating the cell line;
  • iii) selecting the test compound or composition in which the expression level of the Slit3 protein of step ii), or the activity of the Robo1 protein or Robo2 protein, is increased compared to a control cell line that has not been treated with the test compound or composition; Provided is a method for screening a therapeutic agent for a disease.
  • the muscle disease of the present invention is preferably a disease reported in the art as a muscle disease caused by muscle function deterioration, muscle wasting or muscle degeneration, and specifically, atony, muscular atrophy, and muscular dystrophy. More preferably, it is one or more selected from the group consisting of muscle degeneration, myasthenia gravis, cachexia and sarcopenia, but is not limited thereto.
  • muscle wasting or degeneration occurs due to congenital factors, acquired factors, aging, and the like, and muscle wasting is characterized by a gradual loss of muscle mass, particularly weakening and degeneration of muscle, particularly skeletal or veterinary and cardiac muscle.
  • muscle refers to tendons, muscles, and tendons collectively, muscle function or muscle function refers to the ability to exert a force by the contraction of the muscle, the muscle to the maximum contraction force to overcome the resistance Muscle strength that can be exerted; Muscle endurance, the ability to indicate how long or how many times a muscle can repeat contraction and relaxation at a given weight; And quickness, which is the ability to exert a strong force in a short time.
  • the muscle function is proportional to muscle mass, and the term muscle function improvement means improving muscle function in a more positive direction.
  • the Slit protein or LRRD2 protein thereof of the present invention binds to the Robo1 or Robo2 receptor and releases ⁇ -catenin, which is bound to M-cadherin of myoblasts via the Slit-Robo system, thereby activating ⁇ -catenin and Increased expression can promote muscle formation by inducing differentiation of myoblasts. Therefore, the expression level of the Slit protein or its LRRD2 protein can determine whether the onset of myopathy before direct symptoms appear.
  • compounds or compositions that can increase the level of Slit protein expression or the activity of the Robo receptor can be selected as candidates for the treatment of myopathy.
  • the expression level of the mRNA is measured in the biological process to determine the presence and extent of expression of mRNA encoding the SLIT3 protein or LRRD2 protein to measure the amount of mRNA.
  • methods known in the art can be used, for example, polymerase reaction (PCR), reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (Competitive RT-PCR), Real-time reverse transcription polymerase reaction (Realtime RT-PCR), RNase protection assay (RPA), Northern blotting (Northern blotting), DNA chip, and the like, but are not limited thereto.
  • measuring the expression level of the protein means measuring the amount of the protein by confirming the presence and degree of expression of SLIT3 protein or LRRD2 protein in the biological sample.
  • the amount of the protein can be confirmed using an antibody that specifically binds to the protein of the gene.
  • methods known in the art may be used, for example, western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion (RIA), Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS), Protein chips and the like, but are not limited thereto.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • RIA radioimmunodiffusion
  • Ouchterlony immunodiffusion rocket immunoelectrophoresis
  • tissue immunostaining immunoprecipitation assay
  • complement fixation assay complement fixation assay
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the method is described using Slit3, but Slit1 and Slit2; Alternatively, active fragments of Slit1, Slit2, Slit3 can be used.
  • mice embryos of slit3 knockout mice were purchased from Mutant Mouse Regional Resource Centers (Stock number 030759-MU; columbia, MO, USA), and male and female slit3 +/- C57BL / 6J mice were crossed to yield Slit3 deficient mice.
  • the model was made.
  • the Slit3 deficient mouse model was divided into male and female groups to measure the body weight of the mouse model deficient in Slit3 expression.
  • EDL extensor digitorum longus
  • GC + SOL short and long muscles
  • mice lacking Slit3 were found to have reduced skeletal muscle, so to specifically confirm this, the muscles were stained to compare muscle area.
  • marker proteins of satellite cells which are stem cells of sarcolemma, nucleus and myoblasts.
  • Anti-laminin antibody and anti-PAX7 antibody were treated with the primary antibody on the cross-section of GC muscle tissue, and then reacted according to the manufacturer's protocol, followed by color development with secondary antibody, and stem cells of myofibrils and myoblasts.
  • Marker proteins of phosphorous satellite cells were stained, and nuclei were stained with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), followed by fluorescence microscope. The ratio of stem cells of myoblasts to cells in GC muscle tissue was determined.
  • DAPI 4'6-diamidino-2-phenylindole
  • fetal bovine serum fetal bovine serum, FBS
  • C2C12 cell line myoblast purchased, ATCC, USA
  • recombinant Slit3 Abcam, Cambridge, Ma, USA; and R & D System Inc., Minneapolis, MN, USA
  • C2C12 cells were inoculated in DMEM medium containing 10% FBS and cultured until 100% confluent.
  • the culture medium was then exchanged with DMEM medium containing 1 ⁇ g / ml Slit3 recombinant protein and 2% horse serum and cultured to induce C2C12 cells to differentiate into muscle muscle fibers.
  • differentiated cells were obtained, treated with phosphate buffered saline (PBS) containing 4% formaldehyde, fixed at room temperature for 15 minutes, and treated with 0.1% Triton X-100 to permeate the cell membrane. (Permeability) was given.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the treated cells were then blocked at room temperature for 1 hour by adding 4% normal donkey serum, then treated with anti-myosin heavy chain (MyHC) antibody as the primary antibody overnight at 4 Incubated and washed several times with PBST, PBS containing 0.1% Tween-20. After washing, the secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 594 was treated and incubated for 1 hour to MyHC immunocytochemistry (ICC staining). Then, DAPI was treated to stain the nuclei of the cells, which were observed by fluorescence microscopy.
  • MyHC anti-myosin heavy chain
  • MRF myogenic regulatory factors
  • C2C12 cells were seeded in DMEM medium containing 10% FBS and incubated until 100% saturated, and then the culture medium was exchanged with DMEM medium containing 1 ⁇ g / ml Slit3 recombinant protein and 2% horse serum. Cultures were carried out for a total of 5 days to induce C2C12 cells to differentiate into muscle muscle fibers.
  • C2C12 cells which were induced to differentiate for 2 days were obtained, and myogenin induced increased expression by Slit3 in cells differentiated using an anti-myogenin antibody in the same manner as in Example ⁇ 2-2>. Fluorescent immunostaining was confirmed for expression at the protein level.
  • the receptor for Slit protein is well known as Robo protein, which is a membrane protein.
  • Robo protein is present in the cell membrane in the form of Caderin in the cell membrane.
  • ⁇ -catenin which is bound to Kaderin, moves into the cell and is activated.
  • karedin expressed in myoblasts is N-cadherin and M-cadherin, it was confirmed what kind of karedin could be affected by Slit3 in relation to Robo protein in myoblasts.
  • C2C12 cell line and HEK297 cell line were inoculated in DMEM medium containing 10% FBS and cultured to maintain 5% CO 2 at 37. After 24 hours of culture, cells and brain tissues were obtained, and real-time PCR was performed in the same manner as in ⁇ Example 3>, and mRNAs of M-cadherin and N-cadherin in C2C12 cells, HEK293 cells, or brain tissues were obtained. Expression level was confirmed.
  • lysis buffer (20 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM -glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1) was obtained in each of the obtained cells.
  • Cell lysates were prepared by mixing mM NaF, and a protease-inhibitor mixture and reacting at 4 to 20 minutes, using a BCA protein assay kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) The concentration was confirmed.
  • M-cadherin showed significantly higher mRNA expression level in C2C12 cells than N-cadherin (FIG. 11A). It was confirmed that the expression of the protein of Kaderin is significantly higher than that of N-cadherin (FIG. 11B).
  • Slit proteins activate ⁇ -catenin, and ⁇ -catenin also binds to the promoter region of myogenin and increases the expression of myogenin to promote differentiation of myoblasts. It was confirmed whether the ⁇ -catenin activity of the parental cells changes.
  • C2C12 cells were transfected with a ⁇ -catenin expression vector comprising a ⁇ -catenin-luciferase (luciferase) reporter gene.
  • the transfected C2C12 cells were then inoculated in DMEM medium containing 10% FBS and incubated until 100% saturated, followed by culture medium DMEM medium containing 1 ⁇ g / ml Slit3 recombinant protein and 2% horse serum. After culturing, the cultured C2C12 cells were suspended in reporter lysis buffer to extract cellular proteins. 10 ⁇ l of the extracted cell protein was mixed with a luciferase substrate (promega, USA) to measure luminescence with a luminometer to confirm the activity of ⁇ -catenin-luciferase.
  • luciferase substrate promega, USA
  • Slit3 When Slit3 is treated in C2C12 cells, Slit3 binds to the Robo receptor, thereby increasing the activity of ⁇ -catenin, and the expression level of M-cadherin in C2C12 cells is increased by N-cadherin. Since it was confirmed that the expression level is higher than, it was confirmed by co-immunoprecipitation whether the binding of M-cadherin and ⁇ -catenin changes with Slit3 treatment.
  • human cDNA of GFP-tagged M-cadherin was purchased, transformed into C2C12 cells with Lipofectamine 2000 (Gibco, Grand Island, NY, USA), and then treated with 1 ⁇ g / ml Slit3 recombinant protein. Cells were cultured. Then, cultured cells were obtained to obtain a TNE comprising a protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and phosphatase inhibitors (1 mM Na3VO4, 1 mM NaF). It was dissolved in buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA). The lysed lysate was immunoprecipitated with M-cadherin antibody and IgG for 4 to 30 minutes, and Western blot was performed using anti- ⁇ -catenin antibody by the method of Example ⁇ 4-1>.
  • a protease inhibitor cocktail Sigma-
  • C2C12 cells after culturing C2C12 cells in DMEM containing 10% FBS, adding a mixture of lipofectamine 2000 (Invitrogen) containing siRNA (CTNNB1 siRNA) for ⁇ -catenin, and then adding C2C12 cells for an additional 6 hours. Were further incubated. After incubation, the culture medium was replaced with fresh DMEM medium and further incubated for 2 days to prepare C2C12 cells knocked out of ⁇ -catenin. For use as a normal control expressing ⁇ -catenin, scrambled SiRNAs were transformed instead of CTNNB1 siRNAs to prepare normal control cells.
  • CTNNB1 siRNAs For use as a normal control expressing ⁇ -catenin, scrambled SiRNAs were transformed instead of CTNNB1 siRNAs to prepare normal control cells.
  • the prepared ⁇ -catenin knockout C2C12 cells or normal control cells were inoculated in DMEM medium containing 10% FBS and cultured until 100% saturation, followed by culture of 1 ⁇ g / ml Slit3 recombinant protein and 2 Cultures were exchanged with DMEM medium containing% horse serum. After incubation, the cells were obtained and subjected to immunofluorescence staining (ICC staining) by the method of Example ⁇ 2-2> using an anti-MyHC antibody as the primary antibody. Then, DAPI was treated to stain the nuclei of the cells, which were observed under a fluorescence microscope to quantify the number of cells by fluorescence.
  • ICC staining immunofluorescence staining
  • Fusion index represents the number of nuclei of MyHC expressing muscle muscle fibers as a percentage of the number of nuclei of total MyHC expressing cells. Also, the cells obtained after the culture were subjected to western blot using the anti-myogenin antibody in the method of Example ⁇ 4-1>.
  • Slit3 can increase ⁇ -catenin activity and expression of myogenin, which can be induced through the binding of the Slit3-Robo receptor. Since the receptor of the Slit protein is a Robo protein, it is known that there are four subtypes of Robo1 to Robo4. Thus, in the myoblasts, to identify which subtype of the Robo receptor associated with Slit3, the Robo receptor expressed in myoblasts is identified. It was.
  • C2C12 cell line and HEK297 cell line were inoculated in DMEM medium containing 10% FBS and cultured to maintain 5% CO 2 at 37. After 24 hours of incubation, each cell was obtained, and Western blot was performed using anti-Robo1 antibody, anti-Robo2 antibody, anti-Robo3 antibody, and anti-Robo4 antibody in the same manner as in ⁇ Example 4>, and C2C12 was performed. Protein expression levels of Robo1, Robo2, Robo3 and Robo4 were determined in cells, HEK293 cells or brain tissue.
  • Example ⁇ 4-4> transformed with siRNA for Robo1 or Robo2, respectively, to prepare C2C12 cells knocked out of Robo1 or Robo2, and this was DMEM medium containing 10% FBS. After inoculation at 100% saturation, the culture medium was exchanged with DMEM medium containing 1 ⁇ g / ml Slit3 recombinant protein and 2% horse serum. After culturing, cells were obtained and real-time PCR was performed in the same manner as in ⁇ Example 3> to confirm mRNA expression levels of Robo1, Robo2 and myogenin when the expression of Robo1 and Robo2 was inhibited.
  • FIGS. 13B and 13C myogenin, which was increased in expression by Slit3, was significantly inhibited as the expression of Robo1 and Robo2 was suppressed, resulting in a level similar to that of the untreated Slit3 control group. It confirmed that it expresses (FIG. 13B and FIG. 13C, FIG. 13D).
  • Slit3 protein is a very large substance composed of 1,523 amino acids and has a molecular weight of about 170 kDa
  • the drug using the full length of Slit3 protein is not considered to be highly practical, and thus exhibits myoblast differentiation and muscle mass enhancement effects in the Slit3 full length. Only domain fragments considered to be selected were selected.
  • Slit3 protein contains four Leucine-rich domains, and Leucine rich domain 2 (LRRD2), consisting of 130 amino acids, binds to the receptor, which enables various cellular functions. It was determined that LRRD2 can exhibit the effect of Slit3 full length also in promoting myoblast differentiation and muscle mass enhancement effects of the present invention.
  • LRRD2 Leucine rich domain 2
  • C2C12 cells were inoculated in DMEM medium containing 10% FBS and incubated until 100% saturated, and then the culture medium was prepared with DMEM medium containing 10 nM recombinant LRRD2 (Patent Document 1) and 2% horse serum. Exchange was incubated. After incubation, the cells were obtained and subjected to immunofluorescence staining (ICC staining) by the method of Example ⁇ 2-2> using an anti-MyHC antibody as the primary antibody. Then, DAPI was treated to stain the nuclei of the cells, which were observed under a fluorescence microscope to quantify the number of cells by fluorescence. Fusion index (%) represents the number of nuclei of MyHC expressing muscle muscle fibers as a percentage of the number of nuclei of total MyHC expressing cells.
  • ICC staining immunofluorescence staining
  • mice were injected intravenously in myopathy mouse model. Four weeks later, the weight, muscle weight, and muscle loss index of the 13-week-old mouse model were confirmed in the same manner as in Example ⁇ 1-1>.
  • the body weight of the mouse model administered LRRD2 did not show a significant change compared to the LRRD2 unadministered control group, but in relation to the muscle mass and muscle loss index, the LRRD2 was administered.
  • the weight of EDL and GC + SOL were significantly increased compared to the control group without LRRD2, and the decrease index of EDL and muscle reduction index of GC + SOL were significantly increased compared to the control group without LRRD2. It was confirmed (Fig. 16 and Table 4).

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Abstract

본 발명은 SLIT-ROBO 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2, 및 이들의 단편에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

SLIT-ROBO 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 2016년 06월 08일 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0071252호 및 2017년 01월 31일 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2017-0013799호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 SLIT-ROBO 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2, 및 이들의 단편에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질; 및/또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
Slit 단백질은 신경계의 발생 과정 동안에 뉴런과 액손의 이동을 조절하는 것으로서 잘 알려져 있는 단백질이다. Slit 단백질은 Robo 수용체와 작용하여 생리학적 활성을 조절할 수 있으며, 심장, 폐, 신장, 유방조직 등 다양한 조직에서 다양한 세포 내 과정을 조절하는 인자로서 역할을 하는 것으로 알려졌으며, 최근 세포의 생장, 부착능 및 이동능의 조절에 중요한 역할이 있음이 보고되면서 세포의 분화과정에서의 이동 및 암의 발생과 전이 과정에 Slit 단백질이 관여할 수 있음이 보고된 바 있다. 구체적으로, 척추동물의 배아 발달 단계에서 Slit 단백질 및 Robo 단백질이 발현되며, Slit3, Robo1 및 Robo2 단백질의 발현이 근육 조직에서 증가하는 것이 보고된 바 있다(Neil Vargesson et. al., Mechanisms of development 106.1 (2001): 175-180). 이 보고에 따르면, Slit3 단백질은 배아 뒷다리 근육 조직의 근육모세포에서 발현이 증가하나, 이동능(migration)에 관여될 뿐 근육모세포의 분화에는 관련하지 않을 것으로 언급하고 있다.
인간 Robo 단백질은 Robo1, Robo2, Robo3 및 Robo4의 네 가지 형태로 존재한다. Slit과 Robo는 어떠한 아형이 서로 결합하느냐에 따라 다양한 역할을 할 수 있을 것으로 보고되었지만, 발현 세포에 따라 역할이 달라질 수 있어 아직까지 활발하게 연구되고 있다. 이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제 10-1617497호에서는 Slt3 단백질이 Robo1 또는 Robo2와 상호작용하여 활성을 나타내고, 이를 통해 조골세포의 분화를 유도할 수 있고 골 형성을 증가시킬 수 있음이 기재되어있다.
근감소증은 골격근의 양 및 기능이 저하된 상태를 말한다. 근감소증은 노화, 호르몬 이상, 영양 부족, 신체 활동 부족, 염증 및 퇴행성 질환 등 다양한 원인에 의해 발생되는데, 그 중 노화및 성호르몬 부족이 주요 원인이 될 수 있는 것으로 알려져 있고, 의료기술의 발전 및 다양한 치료제 개발로 인해 전 세계적으로 평균 수명이 증가함에 따라 고령화 인구가 증가하고 있으며, 이에 따라 근감소증에 대한 치료의 요구 또한 지속적으로 증가할 것으로 예상되고 있다.
근감소증 환자에서, 근육모세포의 줄기 세포인 위성 세포의 모집, 활성 또는 증식의 장애로 인한 근육모세포(myoblast)의 개수가 감소하며, 근육모세포의 증식 및 분화가 감소하고, 이에 따라 근감소증 환자의 근육은 조직학적인 수준에서 근 섬유의 크기 및 수가 감소하여 근기능이 감소하는 증상이 나타난다.
과거 10여년간 미국 및 유럽을 중심으로 근감소증의 역학에 대한 연구가 활발히 이루어지면서 최근에 근감소증의 임상적 중요성에 대한 관심이 폭증하고 있다. 초기 연구에서는 근감소증이 전신 쇠약, 활동 장애 및 근력 감소에 의해 삶의 질 저하를 유발한다는 결과들이 주류를 이루었지만, 최근 발표되는 연구들에서는 삶의 질 이외에도 골다공증성 골절 위험이 현저히 증가할 수 있음이 보고되었다. 또한, 근감소증 환자에서 당뇨병 및 대사 증후군, 비만, 만성 신부전, 만성 간부전 등의 만성 질환이 유발되며, 궁극적으로는 사망률도 증가시키기 때문에, 근감소증은 적절하게 치료받아야 하는 질환으로서 관심이 집중되고 있다.
최근 미국에서는 근감소증 환자에서 신체 장애가 발생할 가능성이 약 1.5배 내지 약 3.5배가 증가함으로써 연간 185억 USD의 사회적 비용을 유발한다고 보고된 바 있다. 우리나라에서는 국민건강영양조사에 따르면 근감소증 유병률은 60세 이상 남성의 42.0%와 여성의 42.7%로 매우 흔한 질환이며, 특히 우리나라는 전세계에서도 고령화 속도가 가장 높기 때문에 향후 중요한 사회적 문제가 될 것이 확실하다.
현재 근감소증에는 운동, 단백질 및 칼로리보충이 도움이 된다고 알려져 있으나, 근감소증 환자의 대부분을 차지하는 노인들에서는 크게 도움이 되지 않아 근감소증 치료제가 절실히 필요하다. 그러나, 현재 근감소증에 사용되는 치료제들은 근육감소 개선 및 근육량 증진에 직접적인 효과를 나타내는 약물은 아직까지 암상실험 수준의 단계이며, 현재 최종적으로 FDA 승인을 받은 약제는 없는 상황이다. 때문에 근감소증 치료를 위해서 일부 selective androgen receptor modulator, activin receptor antagonist, fast skeletal muscle troponin inhibitor 등을 근감소증 치료제로 개발하려는 노력들은 있으나, 현재 초기 임상을 시도하는 수준이다.
근감소증 치료제 동향에 대한 리포트들에 따르면 2010년 전세계적인 근감소증 치료제 시장은 약 1000만 달러(US)이며, 2018년 2000만 달러(US) 규모로 성장할 것으로 예측된다고 보고되었다("Sarcopenia Therapeutics - Pipeline Assessment and Market Forecasts to 2018", 2011.11.17). 또한, 2013년 EU 산하 민간 보관협력체인 Innovative Meticines Initiative에서는 4대 보건 연구 주제 중 하나로서 노인 근감소증 치료제의 개발에 약 5천만 유로를 투자하기로 발표하여 진행중에 있다.
이에, 본 발명자들은 근감소증에 대하여 직접적으로 치료 효과를 나타낼 수 있는 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, Slit 단백질이 결핍된 마우스에서 근육량이 감소하였으며, Slit 단백질이 Robo1 또는 Robo2 수용체와 결합하여 Slit-Robo 시스템을 통해 근육모세포의 M-카데린에 결합되어있던 β-카테닌이 유리(release)되어 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌의 발현을 증가시켜, 근육모세포의 분화를 유도함으로서 근육 형성을 촉진할 수 있음을 확인하였다. 또한, 특히 Slit 단백질 전장 뿐 아니라 이의 활성 단편인 LRRD2 단백질을 처리하는 경우에도 근육모세포의 분화를 촉진시켜 근육량의 증가를 유도할 수 있으므로, Slit 단백질, Robo 단백질, 이들의 활성 단편, 또는 이를 암호화하는 유전자는 근감소증 예방 및 치료용/개선용 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) KR10-1617497 B1
이와 같이, 본 발명자들은 Slit 단백질이 Robo1 또는 Robo2 수용체와 결합하여 Slit-Robo 시스템을 통해 근육모세포의 M-카데린에 결합되어있던 β-카테닌을 유리(release)하여 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌의 발현을 증가시켜, 근육모세포의 분화를 유도함으로서 근육 형성을 촉진할 수 있음을 확인하였다. 또한, Slit 단백질 전장 뿐 아니라, 특히 이의 활성 단편을 처리하는 경우에도 근육모세포의 분화를 촉진시켜 근육량의 증가를 유도할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품, 또는 사료 첨가물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 근기능 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 근육질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 근육 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 이의 활성화제(activator)를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 단백질.
또한, 본 발명은 필요한 개체에 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 필요한 개체에 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 필요한 개체에 Slit 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제(activator)를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 필요한 개체에 Robo 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 Slit 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제(activator)를 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 Robo 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제를 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 근기능 개선용 화장료 조성물에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근기능 개선용 화장료 조성물에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 사료 첨가물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 근기능 개선용 사료 첨가물에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근기능 개선용 사료 첨가물에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 사료 첨가물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 Slit3 단백질은 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 slit3 유전자로부터 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 Robo1 단백질은 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 robo1 유전자로부터 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 Robo2 단백질은 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 robo2 유전자로부터 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 LRRD2 단백질은 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 유전자로부터 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 근육 질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환일 수 있고, 상기 근육 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 실험군인 피검체 유래 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Slit3 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 측정한 Slit3 단백질의 발현 수준을 대조군인 정상 개체 유래 시료의 Slit3 단백질 발현 수준과 비교하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 비교한 실험군의 Slit3 단백질 발현 수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 실험군을 근육 질환으로 판단하는 단계;를 포함하는, 근육질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
i) 피검 화합물 또는 조성물을, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Slit3 단백질, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 Robo1 단백질 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 Robo2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 처리한 세포주에서 상기 Slit3 단백질의 발현 정도 또는 상기 Robo1 단백질 또는 Robo2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 Slit3 단백질의 발현 정도, 또는 Robo1 단백질 또는 Robo2 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, 근육 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 SLIT-ROBO 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 특히 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2, 및 이들의 단편에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질; 또는 이의 활성화제를 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
특히, 구체적으로는 본 발명의 Slit 단백질은 Robo1 또는 Robo2 수용체와 결합하여 Slit-Robo 시스템을 통해 근육모세포의 M-카데린(M-caderin)에 결합되어있던 β-카테닌(β-catenin)을 유리(release)하여 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌(myogenin)의 발현을 증가시켜, 근육모세포(myoblast)의 분화를 유도함으로서 근육 형성을 촉진할 수 있다. 또한, Slit 단백질 전장뿐 아니라 이의 활성 단편, 특히 바람직하게는 LRRD2 단백질을 처리하는 경우에도 근육모세포의 분화를 촉진시켜 근육량의 증가를 유도할 수 있으므로, 본 발명의 Slit 단백질, Robo 단백질, 이들의 활성단편, 또는 이를 암호화하는 유전자는 근감소증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있으므로, 효과적이다.
도 1a 내지 도 1e는 Slit3이 결핍된 수컷 마우스 모델군에서 체중 변화 및 근감소 지표를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2e는 Slit3이 결핍된 암컷 마우스 모델군에서 체중 변화 및 근감소 지표를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 Slit3이 결핍된 수컷 마우스 모델군의 EDL 근육을 H&E 염색한 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 Slit3이 결핍된 수컷 마우스 모델군의 GC 근육을 H&E 염색한 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 Slit3이 결핍된 수컷 마우스 모델군의 GC 근육을 면역조직화학 염색한 결과를 나타낸다.
도 6은 Slit3의 근육모세포 분화 촉진 효과를 확인기 위해 Slit3 처리에 따른 C2C12 세포주의 세포 생존능 변화의 확인을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7e는 근육모세포로부터 근관세포(myotube)로의 분화에 있어서 Slit3의 분화 증가 효과를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8f는 근육모세포의 분화 과정에서 Slit3 처치에 따른 다양한 근원성 조절인자의 mRNA 발현 수준의 변화를 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 근육모세포의 분화 과정에서 Slit3 처치에 따른 미오게닌의 단백질 발현수준의 변화를 나타낸다.
도 10은 근육모세포의 분화 과정에서 Slit3 처치에 따른 미오게닌 양성 세포 수의 차이를 나타낸다.
도 11은 근육모세포에서 발현되는 카데린(Caderin) 단백질의 종류 및 발현 수준을 확인한 도이다:
도 11a는 근육모세포에서 M-카데린 및 N-카데린의 mRNA 발현 수준을 나타내고; 및
도 11b는 근육모세포에서 M-카데린 및 N-카데린의 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 12는 Slit3의 β-카테닌(β-catenin) 활성화에 의한 근육모세포 분화 유도 효과를 확인한 도이다:
도 12a는 근육모세포에서 Slit3의 첨가에 따른 β-카테닌 활성의 확인을 나타내며;
도 12b는 Slit3 처치에 따른 M-카데린 및 β-카테닌의 결합 수준의 변화를 공동면역침전법으로 확인한 결과를 나타내고;
도 12c 내지 도 12e는 β-카테닌 발현 억제에 따른 Slit3의 근육모세포 분화 수율의 확인을 나타내며; 및
도 12f는 β-카테닌 발현 억제에 따른 Slit3 처치한 근육모세포에서 미오게닌의 발현 수준 변화를 나타낸다.
도 13은 근육모세포에서 Slit3와 결합하는 Robo 수용체 아형을 확인한 도이다:
도 13a는 근육모세포인 C2C12 세포에서 발현하는 Robo 수용체의 아형을 나타내며; 및
도 13b 내지 도 13d는 C2C12 세포에서 Robo1 또는 Robo2 넉아웃에 따라 Slit3에 의한 미오게닌 발현 증가 효과가 유의적으로 증가하지 못함을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14e는 Robo 수용체가 결핍된 마우스 모델에서 체중 변화 및 근감소 지표의 확인을 나타낸다.
도 15a 내지 도 15d는 시험관 내 수준에서 Slit3의 LRRD2에 의한 근육모세포 분화 효과를 나타낸다.
도 16a 내지 도 16e는 생체 내 수준에서 Slit3의 LRRD2에 의한 체중 변화 및 근감소 지표 증가 효과의 확인을 나타낸다.
상술한 바와 같이, 전 세계적으로 평균 수명이 증가함에 따라 고령화 인구가 증가하고 있으며, 이에 따라 근감소증에 대한 치료 요구 또한 지속적으로 증가할 것으로 예상되나, 아직까지 근감소증 치료제로서 FDA의 승인을 받은 수준의 약제는 보고된 바 없다.
본 발명의 일구체예에서는, Slit 단백질 또는 이의 활성 단편은 Robo1 또는 Robo2 수용체와 결합하여 Slit-Robo 시스템을 통해 근육모세포의 M-카데린(M-caderin)에 결합되어있던 β-카테닌(β-catenin)을 유리하여 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌(myogenin)의 발현을 증가시켜, 근육모세포(myoblast)의 분화를 유도함으로서 근육 형성을 촉진할 수 있으므로, 직접적으로 근감소증에 대한 치료에 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 Slit1, Slit2, Slit3 단백질, Robo1 단백질, Robo2 단백질 및 LRRD2 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 "Slit3 단백질"은 서열번호 1의 아미노산으로 구성되며, 본 발명의 "Robo1 단백질"은 서열번호 2의 아미노산으로 구성되고, 본 발명의 "Robo2 단백질"은 서열번호 3의 아미노산으로 구성되며, 본 발명의 "LRRD2 단백질"은 서열번호 4의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하며, 상기 단백질 또는 펩티드의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.
상기 "기능적 동등물"은 단백질 또는 펩티드의 아미노산 부가, 치환 또는 결실로 인해, 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 구성된 단백질 또는 펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 말한다.
본 발명의 "활성화제"는, Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및/또는 이들의 단편의 발현을 증강시킬 수 있거나, SLIT-ROBO 시스템을 활성화시킬 수 있는 각종 화합물, 단백질 또는 펩티드, 염기서열 등을 포함한다. 상기 화합물, 단백질 또는 펩티드, 염기서열의 각종 대사체, 전구체, 약제학적 등가물도 또한 상기 활성화제에 포함된다.
본 발명의 "Slit3 단백질"은 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 slit3 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하고, "Robo1 단백질"은 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 robo1 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하며, "Robo2 단백질"은 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 robo2 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하고, "LRRD2 단백질"은 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 근육 질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환으로 당업계에 보고된 질병인 것이 바람직하며, 구체적으로 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 근육 소모 또는 퇴화는 선천적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 상기 근육은 심줄, 근육, 건을 포괄적으로 지칭하고, 근 기능 또는 근육 기능은 근육의 수축에 의해 힘을 발휘할 수 있는 능력을 의미하며, 근육이 저항을 이겨내기 위하여 최대한의 수축력을 발휘할 수 있는 근력; 근육이 주어진 중량에 얼마나 오랫동안 또는 얼마나 여러 번 수축과 이완을 반복할 수 있는지 나타내는 능력인 근 지구력; 및 단시간 내에 강한 힘을 발휘하는 능력인 순발력을 포함한다. 상기 근 기능은 근육량에 비례하며, 용어 근 기능 개선은 근 기능을 보다 긍정적인 방향으로 향상시키는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직할 실시예에서, 본 발명자들은 Slit3 발현과 근육량의 관계를 확인한 결과, Slit3가 결핍된 마우스는 골격근이 감소하고(도 1, 도 2, 표 1 및 표 2) 근섬유의 면적은 현저하게 감소하나, 근육모세포 및 이의 위성세포의 개수 자체에는 변화가 없는 것을 확인하였다(도 3 내지 도 5).
또한, 본 발명자들은 Slit3의 근육모세포 분화 촉진 효과를 확인한 결과, Slit3는 근육모세포의 생존능에는 영향을 미치지 않으며 근육모세포가 근육 근섬유로 분화할 수 있도록 함을 확인하였고(도 6 및 도 7), 이러한 분화에 관여하는 근원성 조절 인자 중 Slit3에 의해 미오게닌의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 8 내지 도 10).
또한, 본 발명자들은 근육모세포가 근육 근섬유로 분화되는 과정에 있어서, 근육모세포에 발현된 M-카데린이 N-cadherin에 비해 발현이 풍부하다는 것과, M-cadherin과 결합하는 β-카테닌이 유리되어 β-카테닌 활성이 Slit3에 의해 증가됨을 확인하여(도 11a, 도 11b 및 도 12a), 근육모세포의 분화 과정에서 Slit3을 통해 Mβ-카테닌의 활성이 증가하고 미오게닌의 발현을 증가시켜, 근육모세포의 분화를 유도함으로서 근육 형성 촉진에 관여할 수 있음을 확인하였다(도 12b, 도 12c 내지 도 12e 및 도 12f).
또한, 본 발명자들은 근육모세포에서 Slit3와 결합하는 Robo 수용체 아형을 확인한 결과, 근육모세포 표면에 Robo1 및 Robo2 수용체가 발현되어 있어, 이들이 Slit-Robo 시스템을 이루어 Slit3의 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 13a 및 도 13b 및 도 13c). 특히 Robo1이 결핍되는 경우 생체 수준에서 근육량이 감소됨을 나타내므로, Slit3 및, Robo1 또는 Robo2의 결합 시스템을 통해 근감소증의 개선 효과가 나타날 수 있음을 확인하였다(표 3 및 도 14).
또한, 본 발명자들은 Slit3의 LRRD2 도메인에 의한 근육모세포 분화 및 근육량 증진 효과를 확인한 결과, 시험관 내 수준에서는 Slit3의 LRRD2에 의한 근육모세포 분화 효과가 증가하였으며, 생체 내 수준에서는 Slit3의 LRRD2를 투여한 근감소증 모델 마우스에서 체중 및 근감소 지표가 증가됨을 확인하였다(도 15, 도 16 및 표 4).
따라서, 본 발명의 Slit 단백질은 Robo1 또는 Robo2 수용체와 결합하여 Slit-Robo 시스템을 통해 근육모세포의 M-카데린에 결합되어있던 β-카테닌을 유리하여 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌의 발현을 증가시켜, 근육모세포의 분화를 유도함으로서 근육 형성을 촉진할 수 있다. 또한, Slit 단백질 전장뿐 아니라 이의 활성 단편을 처리하는 경우에도 근육모세포의 분화를 촉진시켜 근육량의 증가를 유도할 수 있으므로, 본 발명의 특히 바람직하게는, Slit3 단백질 또는 Slit3의 LRRD2 단백질, 또는 이를 암호화하는 유전자는 근감소증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 펩티드는 이의 야생형 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체 또한 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 상기 아미노산 서열 변이체란 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 또는 LRRD2의 야생형 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질 또는 펩티드를 의미한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서 가능한 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변경(modification)될 수도 있다.
본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 및 LRRD2 단백질, 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 및 LRRD2 단백질은 단백질의 형태뿐만 아니라, 유전자 치료나 백신 등에 사용되기 위하여 세포 내에서 Slit3, Robo1, Robo2 단백질 및 LRRD2 단백질을 암호화하는 유전자를 발현할 수 있는 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다.
상기 발현벡터는 상기 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하여 발현할 수 있는 당업계에 공지된 발현벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 pBK-CMV (Staratagene), pCR3.1 (Invitrogen) 등의 발현벡터를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 및 LRRD2 단백질을 암호화하는 염기서열, 즉 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 분자를 발현을 조절하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결한 형태, 예를 들어 발현벡터의 형태로 치료대상 환자 내에서 이것이 발현되도록 상기 폴리뉴클레오티드를 투여할 수 있다. 상기 벡터는 따라서 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터 부위를 포함하는 적당한 전사 조절 신호를 포함하고, 상기 프로모터는 치료될 환자 내에서 작동 가능한 것이 바람직하다. 따라서, 인간 유전자 치료용으로, RNA 폴리머라제를 전사 개시 부위로 인도하는데 필요한 서열뿐만 아니라, 적당하다면 인헨서를 포함하는 다른 작동 서열 또는 조절 서열들을 포함하는 용어인 프로모터는, 바람직하게는 인간 유전자로부터의 인간 프로모터 서열 또는 일반적으로 인간에게서 발현되는 유전자로부터의 인간 프로모터 서열, 예를 들어 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 프로모터일 수 있다. 이러한 관점에서 적당한 공지된 진핵 프로모터 중에서 CMV 즉 초기 프로모터, HSV 티미딘키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 루 육종 바이러스("RSV")의 것들과 같은 레트로바이러스 LTR 프로모터, 및 생쥐 메탈로티오네인-1 프로모터와 같은 메탈로티오네인 프로모터가 적합하다.
상기 폴리뉴클레오티드 서열 및 전사 조절 서열은 상업적으로 입수 가능한 pBR322와 같은 플라스미드에 기초하여 복제 가능한 플라스미드 벡터 내에 클로닝되어 제공되거나 또는 잘 알려진 공개된 절차의 일상적인 응용에 의해 입수 가능한 플라스미드로부터 구축될 수도 있다.
상기 벡터는 또한 상기 유전자 서열의 3'에 위치하는 전사 조절 서열, 및 인간 치료로 사용될 때 SV40 바이러스와 같은 바이러스로부터의 상응하는 서열과 같이 치료될 환자에게서 인식 가능한 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 기타 전사 조절 서열이 이 기술분야에 잘 알려져 있어 이용 가능하다.
상기 발현벡터는 또한 상기 벡터가 전파될 수 있도록 항생제 저항성과 같은 선택가능한 마커를 포함할 수 있다.
그 자체로 상기 단백질 또는 펩티드를 합성할 수 있는 발현 벡터들을 물리적 방법으로 직접적으로 상처 부위에 도입시킬 수 있다. 이들의 예로는 예를 들어 인산 완충 염수(PBS)와 같은 제약학적으로 허용되는 부형제 중의 용액 내에 적당합 비히클 내의 "네이키드" 핵산 벡터를 국부적으로 적용하는 것, 또는 당업계에 알려진 방법에 따라 "유전자 총" 기술로도 알려진 입자 총알과 같은 물리적 방법으로 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 상기 "유전자 총" 기술은 미국특허번호 제5371015호에 기술된 바와 같이, 추진 장치로부터의 고압력하에서 방출시키는 방법으로, 벡터로 코팅된 금 비드와 같은 불활성 입자를 상처 부위, 예를 들어 피부 세포의 표면을 통과할 수 있을 정도로 충분한 속력으로 가속하는 것이다. 또한, DNA를 직접 수용체에 투여하는 기타 물리적 방법으로는 초음파, 전기적 자극, 전기투과 및 마이크로시딩(microseeding) 등이 있다.
상기 유전자 서열은 또한 형질전환된 숙주 세포의 수단으로 상처 부위에 투여될 수 있다. 세포는 환자로부터 수거된 세포를 포함하며, 상기 핵산 서열을 이 세포내로 당업계에 공지인 유전자 도입 방법에 의해 도입하여 형질 전환된 세포를 배양액 중에서 성장시켜 환자에게 이식할 수 있다.
상술한 바와 같은 발현 구조체를 본 발명의 치료에 다양한 방법으로 사용할 수 있다. 따라서, 상기 발현 구조체들은 환자에서 치료가 필요한 부위에 직접 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질의 발현을 증가시키는 활성인자를 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질의 발현을 증가시키는 활성인자는 slit1 , slit2 , slit3, robo1, robo2 유전자 또는 LRRD2를 암호화는 유전자에 직접 또는 간접적으로 작용하여 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질의 생물학적 활성을 개선, 유도, 자극, 증가시키는 물질을 의미한다. 상기 물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 포함한다. 상기 slit1 , slit2 , slit3의 발현을 증가시키는 활성 인자는 slit1 , slit2 , slit3의 발현, 활성, 또는 기능의 감소에 의해 발병되는 질병의 예방, 개선 및 치료에 이용될 수 있다.
상기 물질이 slit1 , slit2 , slit3, robo1, robo2 유전자 또는 LRRD2를 암호화는 유전자를 활성화시키는 기작은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 물질은 전사, 번역 등의 유전자 발현을 증대시키거나, 비활성형을 활성형으로 전환시키는 기작으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, slit1 , slit2 , slit3, robo1, robo2 유전자 또는 LRRD2를 암호화는 유전자를 활성화시키는 물질은 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물이다. 핵산 및 단백질 서열이 이미 공지된 slit1, slit2, slit3에 대하여 당업자는 유도제 또는 활성제로 작용하는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 당 분야의 기술을 이용하여 제조하거나 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 조성물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질, 또는 이를 암호화하는 염기서열을 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다. 본 발명의 근육 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 근육 질환 예방 및 치료용 약학 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.
또한, 본 발명은 Slit1 단백질, Slit2 단백질, Slit3 단백질, Robo1 단백질, Robo2 단백질 및 LRRD2 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 "Slit3 단백질"은 서열번호 1의 아미노산으로 구성되며, 본 발명의 "Robo1 단백질"은 서열번호 2의 아미노산으로 구성되고, 본 발명의 "Robo2 단백질"은 서열번호 3의 아미노산으로 구성되며, 본 발명의 "LRRD2 단백질"은 서열번호 4의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하며, 상기 단백질 또는 펩티드의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.
상기 "기능적 동등물"은 단백질 또는 펩티드의 아미노산 부가, 치환 또는 결실로 인해, 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 구성된 단백질 또는 펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 말한다.
본 발명의 "Slit3 단백질"은 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 slit3 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하고, "Robo1 단백질"은 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 robo1 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하며, "Robo2 단백질"은 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 robo2 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하고, "LRRD2 단백질"은 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 근육 질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환으로 당업계에 보고된 질병인 것이 바람직하며, 구체적으로 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 근육 소모 또는 퇴화는 선천적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 상기 근육은 심줄, 근육, 건을 포괄적으로 지칭하고, 근 기능 또는 근육 기능은 근육의 수축에 의해 힘을 발휘할 수 있는 능력을 의미하며, 근육이 저항을 이겨내기 위하여 최대한의 수축력을 발휘할 수 있는 근력; 근육이 주어진 중량에 얼마나 오랫동안 또는 얼마나 여러 번 수축과 이완을 반복할 수 있는지 나타내는 능력인 근 지구력; 및 단시간 내에 강한 힘을 발휘하는 능력인 순발력을 포함한다. 상기 근 기능은 근육량에 비례하며, 용어 근 기능 개선은 근 기능을 보다 긍정적인 방향으로 향상시키는 것을 의미한다.
본 발명의 Slit 단백질은 Robo1 또는 Robo2 수용체와 결합하여 Slit-Robo 시스템을 통해 근육모세포의 M-카데린에 결합되어있던 β-카테닌을 유리하여 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌의 발현을 증가시켜, 근육모세포의 분화를 유도함으로서 근육 형성을 촉진할 수 있다. 또한, Slit 단백질 전장뿐 아니라 이의 활성 단편, 특히 바람직하게는 LRRD2 단백질을 처리하는 경우에도 근육모세포의 분화를 촉진시켜 근육량의 증가를 유도할 수 있으므로, 본 발명의 Slit 단백질 또는 Slit의 활성 단편, 또는 이를 암호화하는 유전자는 근감소증 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 Slit 단백질 또는 Slit의 활성 단편, 또는 이를 암호화하는 유전자는 근감소증 예방 및 개선용 사료 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질과 근육 질환 예방 및 근 기능 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ～ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ～ 0.03 g 이다.
또한, 본 발명의 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질은 근육 질환 예방 및 근 기능 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 근육 질환 예방 및 근 기능 개선용 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질과 함께 근육 질환 예방 및 근 기능 개선용 조성물에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 Slit1 단백질, Slit2 단백질, Slit3 단백질, Robo1 단백질, Robo2 단백질 및 LRRD2 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 특히 제한되는 것은 아니나, 피부 외용으로 사용하거나, 경구 섭취할 수 있다.
본 발명의 "Slit3 단백질"은 서열번호 1의 아미노산으로 구성되며, 본 발명의 "Robo1 단백질"은 서열번호 2의 아미노산으로 구성되고, 본 발명의 "Robo2 단백질"은 서열번호 3의 아미노산으로 구성되며, 본 발명의 "LRRD2 단백질"은 서열번호 4의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하며, 상기 단백질 또는 펩티드의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.
상기 "기능적 동등물"은 단백질 또는 펩티드의 아미노산 부가, 치환 또는 결실로 인해, 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 구성된 단백질 또는 펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 말한다.
본 발명의 "Slit3 단백질"은 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 slit3 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하고, "Robo1 단백질"은 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 robo1 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하며, "Robo2 단백질"은 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 robo2 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하고, "LRRD2 단백질"은 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 유전자로부터 발현되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 근육 질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환으로 당업계에 보고된 질병인 것이 바람직하며, 구체적으로 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 근육 소모 또는 퇴화는 선천적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 상기 근육은 심줄, 근육, 건을 포괄적으로 지칭하고, 근 기능 또는 근육 기능은 근육의 수축에 의해 힘을 발휘할 수 있는 능력을 의미하며, 근육이 저항을 이겨내기 위하여 최대한의 수축력을 발휘할 수 있는 근력; 근육이 주어진 중량에 얼마나 오랫동안 또는 얼마나 여러 번 수축과 이완을 반복할 수 있는지 나타내는 능력인 근 지구력; 및 단시간 내에 강한 힘을 발휘하는 능력인 순발력을 포함한다. 상기 근 기능은 근육량에 비례하며, 용어 근 기능 개선은 근 기능을 보다 긍정적인 방향으로 향상시키는 것을 의미한다.
본 발명의 Slit 단백질은 Robo1 또는 Robo2 수용체와 결합하여 Slit-Robo 시스템을 통해 근육모세포의 M-카데린에 결합되어있던 β-카테닌을 유리하여 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌의 발현을 증가시켜, 근육모세포의 분화를 유도함으로서 근육 형성을 촉진할 수 있다. 또한, Slit 단백질 전장뿐 아니라 이의 활성 단편, 특히 바람직하게는 LRRD2 단백질을 처리하는 경우에도 근육모세포의 분화를 촉진시켜 근육량의 증가를 유도할 수 있으므로, 본 발명의 Slit 단백질 또는 Slit의 활성 단편, 또는 이를 암호화하는 유전자는 근기능 개선용 화장료 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 근 기능 개선용 조성물은 또한 화장료 조성물일 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 Slit1 단백질, Slit2 단백질, Slit3 단백질, Robo1 단백질, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 Slit1 단백질, Slit2 단백질, Slit3 단백질, Robo1 단백질, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 Slit1 단백질, Slit2 단백질, Slit3 단백질, Robo1 단백질, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질, 또는 이를 암호화하는 염기서열을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 Slit1 단백질, Slit2 단백질, Slit3 단백질, Robo1 단백질, Robo2 단백질 또는 LRRD2 단백질의 함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.001중량% 미만에서는 목적하는 항노화 또는 주름개선 효과를 기대할 수 없고, 10중량% 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 실험군인 피검체 유래 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Slit3 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 측정한 Slit3 단백질의 발현 수준을 대조군인 정상 개체 유래 시료의 Slit3 단백질 발현 수준과 비교하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 비교한 실험군의 Slit3 단백질 발현 수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 실험군을 근육 질환으로 판단하는 단계;를 포함하는, 근육질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서 "단백질의 발현 수준을 측정"하는 것은 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 피검 화합물 또는 조성물을, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Slit3 단백질, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 Robo1 단백질 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 Robo2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 처리한 세포주에서 상기 Slit3 단백질의 발현 정도 또는 상기 Robo1 단백질 또는 Robo2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)의 Slit3 단백질의 발현 정도, 또는 Robo1 단백질 또는 Robo2 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, 근육 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 근육 질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환으로 당업계에 보고된 질병인 것이 바람직하며, 구체적으로 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 근육 소모 또는 퇴화는 선천적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 상기 근육은 심줄, 근육, 건을 포괄적으로 지칭하고, 근 기능 또는 근육 기능은 근육의 수축에 의해 힘을 발휘할 수 있는 능력을 의미하며, 근육이 저항을 이겨내기 위하여 최대한의 수축력을 발휘할 수 있는 근력; 근육이 주어진 중량에 얼마나 오랫동안 또는 얼마나 여러 번 수축과 이완을 반복할 수 있는지 나타내는 능력인 근 지구력; 및 단시간 내에 강한 힘을 발휘하는 능력인 순발력을 포함한다. 상기 근 기능은 근육량에 비례하며, 용어 근 기능 개선은 근 기능을 보다 긍정적인 방향으로 향상시키는 것을 의미한다.
본 발명의 Slit 단백질 또는 이의 LRRD2 단백질은 Robo1 또는 Robo2 수용체와 결합하여 Slit-Robo 시스템을 통해 근육모세포의 M-카데린에 결합되어있던 β-카테닌을 유리하여 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌의 발현을 증가시켜, 근육모세포의 분화를 유도함으로서 근육 형성 촉진할 수 있다. 따라서, Slit 단백질 또는 이의 LRRD2 단백질의 발현 수준을 통해 직접적인 증상이 나타나기 이전에 근감소증에 대한 발병 여부를 판단할 수 있다. 또한, Slit 단백질 발현 수준 또는 Robo 수용체의 활성을 증가시킬 수 있는 화합물 또는 조성물을 근감소증 치료제 후보물질로서 선별할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, mRNA의 발현 수준을 측정하는 것은 생물학적 시료에서 SLIT3 단백질 또는 LRRD2 단백질을 암호화하는 mRNA의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 생물학적 시료에서 SLIT3 단백질 또는 LRRD2 단백질의 존재 여부 및 발현 정도를 확인하는 과정으로 단백질의 양을 측정하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다
상기 근육질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법 및 근육 질환 치료제 스크리닝 방법에 있어서, 바람직한 일실시예의 Slit3를 사용하여 기재하고 있지만, Slit1, Slit2; 또는 Slit1, Slit2, Slit3의 활성 단편을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> Slit3 발현과 근육량의 관계 확인
<1-1> Slit3가 결핍된 마우스 모델에서 체중 변화 및 근감소 지표 확인
Slit3가 생체에서 골격근 형성에 관여하는지를 확인하기 위해서, Slit3 발현 유무에 따른 마우스 모델의 근육량 변화를 확인하였다.
구체적으로, Mutant Mouse Regional Resource Centers(Stock number 030759-MU; columbia, MO, USA)로부터 slit3 넉아웃 마우스의 배아를 구입하고, 수컷 및 암컷 slit3 +/- C57BL/6J 마우스를 교배하여, Slit3 결핍 마우스 모델을 제조하였다. Slit3 결핍 마우스 모델은 수컷군과 암컷군으로 다시 나누어, Slit3 발현이 결핍된 마우스 모델의 체중을 측정하였다. 마우스 모델이 7주령이 되면, 수컷군과 암컷군을 희생하고, 각각의 장지신근(extensor digitorum longus, EDL) 및, 장단지근과 비장근(gastrocnemius와 soleus, GC+SOL) 근육을 수득하여 무게를 측정하였다. 근감소에 대한 지표(sarcopenic index)는 마우스 체중에 대한 근육량을 백분율로 나타내기 위해 "sarcopenic index(%) = 100 × 근육의 중량 × 체중"의 수식을 사용하여 나타내었다.
그 결과 도 1, 도 2, 하기 [표 1] 및 [표 2]에서 나타난 바와 같이, Slit3가 결핍된 마우스 모델에서는 수컷군 및 암컷군 모두에서 정상 대조군 마우스에 비해 체중이 낮았고, EDL의 중량 및 GC+SOL의 중량도 낮았으며, EDL의 근감소 지표 및 GC+SOL의 근감소 지표도 정상대조군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 1, 도 2, 표 1 및 표 2). 이를 통해, 성별 및 근육의 종류와 관계없이 생체에서 Slit3가 결핍되면 골격계 근육량도 감소하는 것을 확인하였다.
Slit이 결핍된 수컷 마우스에서 체중 변화 및 근감소 지표의 비교
실험군 체중(g) 근육 중량(g) 근감소 지표(%)
EDL GC+SOL EDL GC+SOL
정상 대조군 22.8±0.7 0.058±0.002 0.131±0.001 0.257±0.011 0.578±0.015
Slit3 결핍군 19.8±1.0 0.041±0.003 0.101±0.008 0.207±0.014 0.507±0.022
Slit이 결핍된 암컷 마우스에서 체중 변화 및 근감소 지표의 비교
실험군 체중(g) 근육 중량(g) 근감소 지표(%)
EDL GC+SOL EDL GC+SOL
정상 대조군 18.6±0.5 0.047±0.006 0.104±0.007 0.250±0.026 0.558±0.028
Slit3 결핍군 18.2±0.4 0.031±0.003 0.083±0.004 0.171±0.020 0.458±0.028
<1-2> Slit3이 결핍된 마우스 모델에서 근육 면적 변화 확인
Slit3가 결핍된 마우스는 골격근이 감소하는 것을 확인하였으므로, 이를 구체적으로 확인하기 위해 근육을 염색하여 근육 면적을 비교하였다.
구체적으로, 7주령의 Slit3이 결핍된 수컷 마우스 모델군을 희생하여, EDL 및 GC+SOL 근육 조직을 수득한 다음, 4% 포름알데하이드로 고정하고 OCT 화합물에 포매하였다(embedding). 그런 다음, 헤마토실린(hematoxylin) 및 에오신(Eosin)을 처리하여 H-E 염색(Hematoxylin & Eosin staining)을 통해 근육 조직을 염색하였다. 염색한 근육 조직의 사진을 찍어 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 근육의 조직의 핵과 섬유질 부분 수를 비교하고 면적을 확인하였다.
또한, 세포의 수를 보다 구체적으로 비교하기 위해 근섬유초(sarcolemma), 핵(nucleus) 및 근육모세포의 줄기세포인 위성세포의 마커 단백질을 면역조직화학염색하였다. GC 근육 조직의 단면에 1차 항체로 항-라미닌(laminin) 항체 및 항-PAX7 항체를 각각 처리하여 제조사의 프로토콜에 따라 반응한 후, 2차 항체로 발색하여, 근섬유초 및 근육모세포의 줄기세포인 위성세포의 마커 단백질을 염색하였고, 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(4'6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)를 처리하여 핵을 염색한 다음, 형광 현미경(fluorescence microscope)으로 관찰하여 GC 근육 조직 내 세포 중 근육모세포의 줄기세포 비율을 구하였다.
그 결과, 도 3 내지 도 5에서 나타난 바와 같이 Slit3이 결핍된 마우스 모델에서는 EDL 및 GC 근육 모두에서 정상 대조군 마우스에 비해 근섬유 및 핵의 수가 유사한 것을 확인하였다(도 3 및 도 4). GC 조직 단면의 면역조직화학염색하였을 때 라미닌 염색을 통해 Slit3 결핍 마우스에서 근섬유의 면적이 유의적으로 감소하는 반면, 핵 및 PAX7을 염색한 것을 통해 조직 내 전체 핵의 수 및 PAX7 양성 세포의 수에서는 유의적인 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 5). 이를 통해, 생체 수준에서 Slit3가 결핍되었을 때 근섬유의 면적은 현저하게 감소하나, 근육모세포 및 이의 위성세포의 개수 자체에는 변화가 없어, Slit3 결핍에 의한 근육량 감소는 근육모세포의 증식, 이의 위성세포의 증식 및 증가(resruitment)와는 무관한 것을 확인하였다.
< 실시예 2> Slit3의 근육모세포 분화 촉진 효과의 확인
<2-1> Slit3에 의한 근육모세포의 생존능 변화 여부 확인
Slit3 결핍에 따라 골격근의 양이 감소하는 것을 확인하였으므로, Slit3가 근육량을 증가시키기 위해 어떠한 역할을 하는지 확인하였다. 먼저, 근육량을 증가시키는데 있어서 Slit3의 역할이 근육세포의 생존능 증가 효과인지 확인하였다.
구체적으로, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 DMEM 배지에 근육모세포(myoblast)인 C2C12 세포주(ATCC 구입, 미국)를 접종하여 37에서 5% CO2가 유지되도록 배양하였다. 배양 24시간 후, 재조합 Slit3(Abcam 사, Cambridge, Ma, USA; 및 R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA)를 1 ㎍/㎖ 또는 3 ㎍/㎖의 농도로 배양한 세포에 처리하여 24 시간 동안 추가 배양하였다. 그런 다음 PBS 용액으로 2 회 세척하고 MTT 시약을 처리한 다음, 2 시간 동안 추가로 배양하여 450 ㎚에서 엘리사 플레이트 리더기(ELISA plate reader)로 흡광도를 측정하였다. 미처리 대조군으로는 Slit3를 처리하지 않은 C2C12 세포주를 동일한 조건에서 배양하였으며, 양성 대조군으로는 TNF-α를 처리한 C2C12 세포주를 사용하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 TNF-α를 처리한 양성대조군에서는 미처리 대조군에 비해 세포 생존능이 유의적으로 증가하는 반면, Slit3를 처리한 실험군에서는 세포 생존능에 대한 유의적인 변화가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 6).
<2-2> 근육모세포로부터 근육 근섬유( myotube ) 로의 분화에 있어서 Slit3의 분화 증가 효과 확인
Slit3 결핍에 따라 골격근의 양이 감소하는 것을 확인하였으므로, Slit3가 근육량을 증가시키기 위해 어떠한 역할을 하는지 확인하였다. Slit3에 의해 근육모세포의 생존에 유의적인 변화가 없었으므로, 근육모세포가 근육 근섬유로 분화되는 과정에서 Slit3의 효과를 확인하였다.
구체적으로, C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화(confluent)될 때까지 배양하였다. 그런 다음, 배양 배지를 1 ㎍/㎖ Slit3 재조합 단백질 및 2% 말 혈청(horse serum)을 포함하는 DMEM 배지로 교환하고 배양하여 C2C12 세포를 근육 근섬유로 분화되도록 유도하였다. 유도 후, 분화된 세포를 수득하여 4% 포름알데히드를 포함하는 인산완충식염수(PBS)를 처리하여 실온에서 15 분간 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100(triton X-100)을 처리하여 세포막에 투과성(Permeability)를 부여하였다. 그런 다음, 처리한 세포에 4% 정상 당나귀 혈청을 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 차단(blocking)한 다음, 1차 항체로 항-미오신 H 사슬(myosin heavy chain, MyHC) 항체를 처리하여 4에서 밤새 배양하고, 0.1% 트윈-20을 포함하는 PBS인 PBST로 수회 세척하였다. 세척 후, 알렉사 플루오르 594(Alexa Fluor 594)가 결합된 2차 항체를 처리하여 1 시간 동안 배양하여 MyHC를 면역형광염색(immunocytochemistry, ICC staining)하였다. 그런 다음, DAPI를 처리하여 세포의 핵을 염색하고, 이를 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 Slit3 재조합 단백질을 첨가하지 않은 미처리 대조군에 비해 Slit3 처치 하에서 분화된 실험군에서 세포 개수의 변화는 없으나, 근섬유의 면적이 유의적으로 증가하였으며 fusion index가 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 7).
< 실시예 3> 근육모세포의 분화 과정에 있어서 Slit3 관여 인자의 확인
근육모세포가 근육 근섬유로 분화되는 과정에서, Myf5, Mrf4, MyoD, 미오게닌(myogenin), Mef2A 및 Mef2c과 같은 다양한 근원성 조절 인자(myogenic regulatory factor, MRF)가 근육모세포의 분화를 유발함이 알려져 있으므로, Slit3가 이러한 조절 인자의 발현을 유도함을 통해 근육모세포의 분화를 유도하는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 배양 배지를 1 ㎍/㎖ Slit3 재조합 단백질 및 2% 말 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 교환하고 총 5일 동안 배양하여 C2C12 세포를 근육 근섬유로 분화되도록 유도하였다. 배양하면서 24 시간마다 세포를 수득하고, 트리졸(TRIzol; Invitrogen, 미국) 시약에 현탁하고 제조사의 프로토콜에 따라 분화된 근육 근섬유의 전체 RNA를 추출하여, 1 ㎍의 RNA를 주형으로 하고 해당 프라이머 및 수퍼스크립트 III 키트(superscript III kit; Invitrogen 사, 미국)를 사용하여 역전사하여 Myf5, Mrf4, MyoD, 미오게닌(myogenin), Mef2A 및 Mef2c의 cDNA를 각각 합성하였다. 합성을 위한 증폭 조건은, 95에서 30초간 변성(denaturation), 60에서 30초간 어닐링(annealing) 및 72에서 30초간 신장(extension)의 30 싸이클로 구성하였다. 합성한 cDNA는 Light Cycler 480 SYBR Green I Master Mix(Roche)를 사용하고, 95에서 10분간 전반응, 95에서 10초간, 55에서 15초간 및 72에서 20초간 세트(set)인 45 사이클의 증폭 반응조건으로 Light Cycler 480(Roche) 기기에서 real-time PCR을 수행하여, 분화가 유도되는 근육모세포에서 Slit3의 처리 유무에 따라 근원성 조절 인자들의 발현 수준 변화를 확인하였다.
또한, 2일 동안 분화 유도한 C2C12 세포를 수득하여, 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 항-미오게닌 항체를 사용하여 분화 유도된 세포에서 Slit3에 의해 발현 증가 유도된 미오게닌을 형광면역염색하여 단백질 수준에서 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 8 내지 도 10에서 나타난 바와 같이 Slit3는 Myf5, Mrf4, MyoD, Mef2A 및 Mef2c 등의 발현에는 유의적인 변화를 나타내지 않았으나, Slit3을 처리한 실험군에서는 미오게닌의 mRNA의 발현 수준이 현저히 증가하여, 미처리 대조군에서의 미오게닌 mRNA 발현 수준에 비해 약 1.8배 증가된 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 8). 또한, 미오게닌 단백질 발현 수준을 형광면역염색하여 확인하였을 때, Slit3를 처치한 실험군에서 미처리 대조군에 비해 미오게닌-양성 세포의 개수가 현저하게 증가하는 것을 나타내어(도 9 및 도 10), Slit3는 미오게닌의 발현을 증가시켜 근육모세포의 분화를 촉진함으로써, 근육 형성을 유발할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 4> Slit3의 β-카테닌(β- catenin ) 활성화에 의한 근육모세포 분화 유도 효과 확인
<4-1> 근육모세포에서 발현되는 카데린 ( Caderin ) 단백질의 종류 및 발현 수준 확인
Slit 단백질의 수용체는 세포막 단백질인 Robo 단백질로 잘 알려져 있다. Robo 단백질은 세포막에서 카데린(Caderin)과 결합한 형태로 세포막에 존재하는데, Slit가 Robo와 결합하면 Robo와 카데린의 결합이 벌어져 카데린에 결합되어 있던 β-카테닌이 세포 안으로 이동하여 활성화되는 것으로 알려져 있다. 근육모세포에서 발현되는 카데린은 N-카데린 및 M-카데린이므로, 근육모세포에서 Robo 단백질과 관련되어 Slit3에 의해 영향을 받을 수 있는 카데린이 어떠한 종류인지 확인하였다.
구체적으로, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 C2C12 세포주, HEK297 세포주(신장 세포주)를 접종하여 37에서 5% CO2가 유지되도록 배양하였다. 배양 24시간 후 각각의 세포 및 뇌조직을 수득하여, <실시예 3>과 동일한 과정으로 real-time PCR을 수행하여 C2C12 세포, HEK293 세포 또는 뇌조직에서 M-카데린 및 N-카데린의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.
또한, 상기 수득한 각각의 세포에 용해버퍼(20 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM -glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 및 a protease-inhibitor mixture)를 혼합하고 4에서 20분간 반응하여 세포 용해물을 제조하였고, BCA 단백질 분석키트(Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA)를 이용하여 용해물 내 단백질의 농도를 확인하였다. 10 내지 20 ㎍ 단백질을 포함하는 세포 용해물 시료는 10% 겔 SDS-PAGE로 분리한 다음, 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)로 이동시켰다. 그런 다음, 5% 스킴 밀크를 포함하는 TBST 완충용액(500 mM Tris-HCL [pH 7.4], 1.5 M NaCl, 0.1% Tween-20) 멤브레인에 처리하고 1 시간 동안 실온에서 블로킹한 후, 항-M-카데린 항체 또는 항-N-카데린 항체를 1차 항체로 처리하여 4에서 밤새 배양하고, TBST로 세척하여, 거위 유래의 항-마우스 IgG 항체(goat anti-mouse IgG)를 2차 항체로 하여 1% 소혈청알부민(bovine serum albumi, BSA)을 포함하는 TBST와 함께 멤브레인에 처리하여 한 시간 동안 배양하여 웨스턴블럿(western blot)을 수행하였다.
그 결과, 도 11a 및 도 11b에서 나타난 바와 같이 C2C12 세포에서는 M-카데린이 N-카데린에 비해 mRNA 발현 수준이 유의적으로 높은 것을 확인하였고(도 11a), 단백질 발현 수준에서도 C2C12 세포에서 M-카데린의 단백질 발현이 N-카데린보다 현저히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다(도 11b).
<4-2> Slit3의 첨가에 따른 근육모세포에서 β-카테닌 활성 확인
Slit 단백질들은 β-카테닌을 활성화하며, β-카테닌은 또한 미오게닌의 프로모터 부위에 결합하여 미오게닌의 발현을 증가시켜 근육모세포의 분화를 촉진함이 알려져 있으므로, 본 발명에서도 Slit3에 의해 근육모세포의 β-카테닌 활성이 변화하는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, β-카테닌-루시퍼라아제(luciferase, luc) 리포터 유전자를 포함하는 β-카테닌 발현 벡터로 C2C12 세포에 형질감염하였다. 그런 다음, 형질감염한 C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 배양 배지를 1 ㎍/㎖ Slit3 재조합 단백질 및 2% 말 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 배양하고, 리포터 용해 완충용액(reporter lysis buffer)에 상기 배양한 C2C12 세포를 현탁하여 세포 단백질을 추출하였다. 상기 추출한 세포 단백질 10 ㎕에 루시퍼라제 기질(luciferase substrate; promega 사, 미국)과 혼합하여 루미노미터(luminometer)로 발광도(luminescence)를 측정하여 β-카테닌-루시퍼라제의 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 12a에서 나타난 바와 같이 Slit3는 근육모세포에서 β-카테닌-루시퍼라제의 활성을 미처리 대조군에 비해 약 1.5 배 수준으로 증가시키는 것을 확인하였다(도 12a).
<4-3> Slit3 처치에 따른 M- 카데린 및 β-카테닌 의 결합 수준 변화 확인
C2C12 세포에 Slit3를 처리했을 때 β-카테닌의 활성이 높은 것을 통해 Slit3가 Robo 수용체와 결합하여 β-카테닌의 활성이 증가할 수 있으며, C2C12 세포에서 M-카데린의 발현 수준이 N-카데린의 발현 수준보다 높음을 확인하였으므로, M-카데린과 β-카테닌의 결합이 Slit3 처치에 따라 변화하는지 여부를 공동-면역침전(co-immunoprecipitation)하여 확인하였다.
구체적으로, GFP-tagged M-카데린의 인간 cDNA를 구입하여, 리포펙타민 2000(Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 C2C12 세포에 형질전환한 후, 1 ㎍/㎖ Slit3 재조합 단백질을 처리하여 세포를 배양하였다. 그런 다음, 배양한 세포를 수득하여 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 포스파타아제 저해제(phosphatase inhibitors; 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF)를 포함하는 TNE 버퍼(25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA)로 용해하였다. 용해된 용해물은 4에서 30분 동안 M-카데린 항체 및 IgG로 면역침전하고, 상기 실시예 <4-1>의 방법으로 항-β-카테닌 항체를 사용하여 웨스턴블럿을 수행하였다.
그 결과, 도 12b에서 나타난 바와 같이 Slit3를 처치한 실험군에서 M-카데린과 결합된 β-카테닌의 수준이 현저히 감소하는 것을 확인하여, Slit3을 통해 M-카데린이 Robo 단백질의 결합이 벌어져, β-카테닌 역시 M-카데린으로부터 유리되어 활성이 증가할 수 있음을 확인하였다(도 12b).
<4-4> β-카테닌 발현 유무에 따른 Slit3의 근육모세포 분화 촉진 효과 차이의 확인
Slit3가 근육모세포의 분화를 촉진하는 과정에서 β-카테닌이 관여하는 것을 확인하였으므로, Slit3를 처리하였을 때 β-카테닌의 발현 유무에 따라 근육 형성 효과에 차이가 나타나는지 확인하였다.
구체적으로, 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 C2C12 세포를 배양한 후, β-카테닌에 대한 siRNA(CTNNB1 siRNA)을 포함하는 리포펙타민 2000(Invitrogen) 혼합물을 첨가한 다음, C2C12 세포를 추가 6시간 동안 더 배양하였다. 배양 후, 배양 배지를 신선한 DMEM 배지로 교체하여 2일 간 추가 배양하여, β-카테닌이 넉아웃된 C2C12 세포를 제조하였다. β-카테닌을 발현하는 정상 대조군으로 사용하기 위해서, CTNNB1 siRNA 대신 scrambled SiRNA를 형질전환하여 정상 대조군 세포를 제조하였다.
그런 다음, 제조한 β-카테닌 넉아웃 C2C12 세포 또는 정상 대조군 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 배양 배지를 1 ㎍/㎖ Slit3 재조합 단백질 및 2% 말 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 배양하였다. 배양 후 세포를 수득하여 1차 항체로 항-MyHC 항체를 사용하여 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 면역형광염색(ICC staining)하였다. 그런 다음, DAPI를 처리하여 세포의 핵을 염색하고, 이를 형광 현미경으로 관찰하여 형광값으로 세포의 수를 정량하였다. Fusion index(%)는 전체 MyHC 발현 세포의 핵 수에 대한 MyHC 발현 근육 근섬유의 핵 수를 백분율로 나타내었다. 또한, 상기 배양 후 수득한 세포를 상기 실시예 <4-1>의 방법으로, 항-미오게닌 항체를 사용하여 웨스턴블럿을 수행하였다.
그 결과, 도 12c 내지 도 12e 및 도 12f에서 나타난 바와 같이 β-카테닌 siRNA로 β-카테닌의 발현을 억제한 실험군에서는 Slit3에 의해 촉진되었던 근섬유의 비대화 및 fusion index가 현저히 억제하는 것을 확인하였으며, 미오게닌의 발현 또한 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 12c 내지 도 12e 및 도 12f). 이를 통해, Slit3는 M-카데린에 결합되어있던 β-카테닌을 유리(release)하여 근육모세포의 β-카테닌을 활성화하고 미오게닌의 발현을 증가시켜, 근육모세포의 분화를 유도함으로서 근육 형성 촉진에 관여할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 5> 근육모세포에서 Slit3와 결합하는 Robo 수용체 아형의 확인
<5-1> 근육모세포에서 발현하는 Robo 수용체 아형 확인
근육모세포의 분화 과정에서 Slit3가 β-카테닌 활성 및 미오게닌의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였고, 이는 Slit3-Robo 수용체의 결합을 통해 유도될 수 있음을 확인하였다. Slit 단백질의 수용체는 Robo 단백질로서, 현재까지 Robo1 내지 Robo4의 네 가지 아형이 존재함이 알려져 있으므로, 근육모세포에서는 Slit3와 연관된 Robo 수용체가 어떠한 아형인지 확인하기 위해, 근육모세포에서 발현되는 Robo 수용체를 확인하였다.
구체적으로, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 C2C12 세포주, HEK297 세포주(신장 세포주)를 접종하여 37에서 5% CO2가 유지되도록 배양하였다. 배양 24시간 후 각각의 세포를 수득하여, 상기 <실시예 4>와 동일한 과정으로 항-Robo1 항체, 항-Robo2 항체, 항-Robo3 항체 및 항-Robo4 항체를 사용하여 웨스턴블럿을 수행하여, C2C12 세포, HEK293 세포 또는 뇌조직에서 Robo1, Robo2, Robo3 및 Robo4의 단백질 발현 수준을 확인하였다.
그 결과 도 13a에서 나타난 바와 같이 C2C12 세포에서 Robo1 및 Robo2 단백질이 유의적인 수준으로 발현되었으나, Robo3 및 Robo4 단백질은 발현되지 않는 것을 확인하였다(도 13a).
<5-2> 근육모세포에서 Slit3 - Robo1 및 Slit3 - Robo2 결합 여부 확인
근육모세포에서 Robo1 및 Robo2 단백질이 발현되는 것을 확인하였으므로, Slit3 단백질의 수용체가 Robo1 및 Robo2일 것으로 판단하였다. 이를 확인하기 위해, Robo1 및 Robo2의 발현이 억제되었을 때 Slit3의 작용이 소실되는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-4>와 동일한 방법을 수행하여 Robo1 또는 Robo2에 대한 siRNA로 각각 형질전환하여 Robo1 또는 Robo2이 넉아웃된 C2C12 세포를 제조하고, 이를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 배양 배지를 1 ㎍/㎖ Slit3 재조합 단백질 및 2% 말 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 배양하였다. 배양 후 세포를 수득하고, 상기 <실시예 3>과 동일한 과정으로 real-time PCR을 수행하여, Robo1 및 Robo2의 발현이 억제되었을 때 Robo1, Robo2 및 미오게닌의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 13b 및 도 13c에서 나타난 바와 같이 Slit3에 의해 발현이 증가되었던 미오게닌은 Robo1 및 Robo2 발현이 억제됨에 따라 발현이 유의적으로 억제되어, Slit3 미처리 대조군과 유사한 수준으로 미오게닌을 발현하는 것을 확인하였다(도 13b 및 도 13c, 도 13d).
< 실시예 6> 생체 내에서 Slit3에 의한 근육 형성 촉진 효과에 있어서 Robo 수용체의 역할 확인
본 발명에서 확인한 결과를 생체 내에서 구체적으로 확인하기 위해, Robo 수용체가 결핍된 마우스 모델에서 근육량 변화를 확인하였다.
구체적으로, Mutant Mouse Regional Resource Centers(Stock number 030759-MU; columbia, MO, USA)로부터 Robo1 또는 Robo2 넉아웃 마우스의 배아를 구입하고, 수컷 및 암컷 slit3 +/- C57BL/6J 마우스를 교배하여, Robo1 또는 Robo2 넉아웃 마우스 모델을 각각 제조하였다. 이 중 수컷을 실험군으로 선별하여, 상기 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 7주령의 마우스 모델의 체중 및 근육 무게와 근감소에 대한 지표를 확인하였다. Robo2 결핍군은 7주까지 생존하지 못해 실험군으로서 사용하지 못하고, Robo1 결핍군에 대하여만 실험을 수행한 다음, 정상대조군과 비교하였다.
그 결과, 하기 [표 3] 및 도 14에서 나타난 바와 같이 Robo1이 결핍된 마우스 모델에서는 정상 대조군 마우스에 비해 체중이 낮았고, EDL의 중량 및 GC+SOL의 중량도 낮았으며, EDL의 근감소 지표 및 GC+SOL의 근감소 지표도 정상대조군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 14 및 표 3). 이를 통해, Slit3가 골격근 형성에 관여하는 근육모세포의 수용체는 Robo1 및 Robo2이며, 특히 Robo1이 결핍되는 경우 생체 수준에서 근육량이 감소됨을 나타내므로, Slit3 및, Robo1 또는 Robo2의 결합 시스템을 통해 근감소증의 개선 효과가 나타날 수 있음을 확인하였다.
Robo1이 결핍된 수컷 마우스에서 체중 변화 및 근감소 지표의 비교
실험군 체중(g) 근육 중량(g) 근감소 지표(%)
EDL GC+SOL EDL GC+SOL
정상 대조군 21.1±0.6 0.048±0.002 0.117±0.001 0.206±0.009 0.541±0.014
Robo1 결핍군 17.6±0.9 0.029±0.003 0.085±0.002 0.162±0.011 0.474±0.024
< 실시예 7> Slit3의 LRRD2 도메인에 의한 근육모세포 분화 및 근육량 증진 효과의 확인
인간 Slit3 단백질은 1,523개의 아미노산으로 구성되어 약 170 kDa의 분자량을 가지는 매우 큰 물질이므로, Slit3 단백질 전장을 사용하는 약제는 실용성이 높지 않을 것으로 판단하여, Slit3 전장 중에서 근육모세포 분화 및 근육량 증진 효과를 나타낼 것으로 판단되는 도메인 단편만을 선별하고자 하였다. Slit3 단백질은 류신이 풍부한 도메인(Leucine-rich domain)을 4 개 포함하고, 이 중 130 개의 아미노산으로 구성된 Leucine rich domain 2(LRRD2)가 수용체와 결합하는 부분이며, 이를 통해 다양한 세포작용을 할 수 있을 것으로 판단되어, 본 발명의 근육모세포 분화 촉진 및 근육량 증진 효과에 있어서도 LRRD2가 Slit3 전장의 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하였다.
<7-1> 시험관 내 수준에서 Slit3의 LRRD2에 의한 근육모세포 분화 효과의 확인
구체적으로, C2C12 세포를 10% FBS을 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 100% 포화될 때까지 배양한 후, 배양 배지를 10 nM 재조합 LRRD2(특허문헌 1) 및 2% 말 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 교환하여 배양하였다. 배양 후 세포를 수득하여 1차 항체로 항-MyHC 항체를 사용하여 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 면역형광염색(ICC staining)하였다. 그런 다음, DAPI를 처리하여 세포의 핵을 염색하고, 이를 형광 현미경으로 관찰하여 형광값으로 세포의 수를 정량하였다. Fusion index(%)는 전체 MyHC 발현 세포의 핵 수에 대한 MyHC 발현 근육 근섬유의 핵 수를 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도 15에서 나타난 바와 같이 재조합 LRRD2 단백질을 처치한 실험군에서 미처리 대조군에 비해 근육 근섬유의 면적 및 fusion index 수준이 현저하게 증가하였으며, 이는 Slit3 단백질 전장을 처치하는 경우와 유사한 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 15).
<7-2> 생체 내 수준에서 Slit3의 LRRD2에 의한 체중 및 근감소 지표 증가 효과의 확인
구체적으로, 8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 개복하고 난소를 절제하여 성호르몬이 결핍되도록 유도된 근감소증 마우스 모델을 만들고, 9 주령부터 4 주 동안 재조합 LRRD2 도메인을 2 ㎍ 또는 10 ㎍ 투여량을 1일 1회, 1주일 5회의 투여횟수로 근감소증 마우스 모델에 정맥 주사하였다. 4 주 후, 상기 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 13주령의 마우스 모델의 체중 및 근육 무게와 근감소에 대한 지표를 확인하였다.
그 결과, 하기 [표 4] 및 도 16에서 나타난 바와 같이 LRRD2를 투여한 마우스 모델의 체중은 LRRD2 미투여 대조군에 비해 유의적인 변화를 나타내지 않았으나, 근육량 및 근감소 지표와 관련하여, LRRD2를 투여한 마우스 모델에서 LRRD2 미투여 대조군에 비해 EDL의 중량 및 GC+SOL의 중량이 유의적으로 증가하였으며, EDL의 근감소 지표 및 GC+SOL의 근감소 지표도 LRRD2 미투여 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 16 및 표 4).
난소 절제 암컷 마우스에서 LRRD2에 의한 근감소 지표의 비교
실험군 근육 중량(g) 근감소 지표(%)
EDL GC+SOL EDL GC+SOL
정상 대조군 0.040±0.001 0.109±0.003 0.196±0.006 0.540±0.017
LRRD2 처치군 2 ㎍ 0.041±0.005 0.121±0.001 0.200±0.010 0.596±0.011
10 ㎍ 0.047±0.002 0.119±0.002 0.235±0.013 0.594±0.015

Claims (36)

  1. Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:
    서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 Slit3 단백질은 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 slit3 유전자로부터 발현되는 것을 특징으로 하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 Robo1 단백질은 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 robo1 유전자로부터 발현되는 것을 특징으로 하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 Robo2 단백질은 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 robo2 유전자로부터 발현되는 것을 특징으로 하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 LRRD2 단백질은 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 유전자로부터 발현되는 것을 특징으로 하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. Slit 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제(activator)를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  8. Robo 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 1항, 제 2항, 제7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 근육 질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환인 것을 특징으로 하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 근육 질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증, 악액질(cachexia) 및 근감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  11. Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
  12. 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품:
    서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 단백질.
  13. Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 화장료 조성물.
  14. 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 화장료 조성물:
    서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 단백질.
  15. Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 사료 첨가물.
  16. 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근기능 개선용 사료 첨가물:
    서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 단백질.
  17. i) 실험군인 피검체 유래 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Slit3 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 측정한 Slit3 단백질의 발현 수준을 대조군인 정상 개체 유래 시료의 Slit3 단백질 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)에서 비교한 실험군의 Slit3 단백질 발현 수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 실험군을 근육 질환으로 판단하는 단계;를 포함하는, 근육질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 근육 질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환인 것을 특징으로 하는, 근육질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 근육 질환은 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근무력증, 악액질 및 근감소증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 근육 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  20. i) 피검 화합물 또는 조성물을, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 Slit3 단백질, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 Robo1 단백질 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 Robo2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)의 처리한 세포주에서 상기 Slit3 단백질의 발현 정도 또는 상기 Robo1 단백질 또는 Robo2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)의 Slit3 단백질의 발현 정도, 또는 Robo1 단백질 또는 Robo2 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, 근육 질환 치료제 스크리닝 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 근육 질환은 근기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환인 것을 특징으로 하는, 근육 질환 치료제 스크리닝 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 근육 질환은 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근무력증, 악액질 및 근감소증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 근육 질환 치료제 스크리닝 방법.
  23. 필요한 개체에 Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료 방법.
  24. 필요한 개체에 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료 방법:
    서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 도메인.
  25. 필요한 개체에 Slit 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제(activator)를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료 방법.
  26. 필요한 개체에 Robo 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 치료 방법.
  27. Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하기 위한 용도.
  28. 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하기 위한 용도:
    서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 도메인.
  29. Slit 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제(activator)를 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하기 위한 용도.
  30. Robo 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제를 근육 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하기 위한 용도.
  31. Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품에 사용하기 위한 용도.
  32. 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근육 질환 예방 및 개선용 건강기능식품에 사용하기 위한 용도:
    서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 단백질.
  33. Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 근기능 개선용 화장료 조성물에 사용하기 위한 용도.
  34. 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근기능 개선용 화장료 조성물에 사용하기 위한 용도:
    서열번호 1의 아미노산으로 구성된 Slit3 단백질;
    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 단백질.
  35. Slit1, Slit2, Slit3, Robo1, Robo2, 및 이들의 단편으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 이들의 활성화제를 근기능 개선용 사료 첨가물에 사용하기 위한 용도.
  36. 하기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 근기능 개선용 사료 첨가물에 사용하기 위한 용도:
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    서열번호 2의 아미노산으로 구성된 Robo1 단백질;
    서열번호 3의 아미노산으로 구성된 Robo2 단백질; 및
    서열번호 4의 아미노산으로 구성된 LRRD2 단백질.
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JP2022522723A (ja) * 2019-02-27 2022-04-20 デウン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋肉疾患の予防または治療用組成物
JP7295261B2 (ja) 2019-02-27 2023-06-20 デウン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋肉疾患の予防または治療用組成物
JP7340027B2 (ja) 2019-02-27 2023-09-06 デウン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む骨関連疾患の予防または治療用組成物

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