JP7295261B2 - アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋肉疾患の予防または治療用組成物 - Google Patents

アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋肉疾患の予防または治療用組成物 Download PDF

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Description

本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋肉疾患の予防または治療用組成物に関し、より具体的には、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む融合タンパク質、前記融合タンパク質を暗号化する核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、前記組換えベクターを含む形質転換体、前記形質転換体を用いた融合タンパク質の製造方法、前記融合タンパク質を含む筋肉疾患の予防または治療用組成物、及び前記融合タンパク質を含むＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の生体内半減期増進用組成物を提供する。
Ｓｌｉｔタンパク質は、神経系の発生過程の間にニューロンとエクソンの移動を調節するものとしてよく知られているタンパク質である。Ｓｌｉｔタンパク質は、Ｒｏｂｏ受容体と作用して生理学的活性を調節し得、心臓、肺、腎臓、乳房組織など様々な組織において様々な細胞内過程を調節する因子として役割を果たすことが知られており、最近、細胞の成長、付着能及び移動能の調節に重要な役割があることが報告され、細胞の分化過程における移動及びがんの発生と転移過程においてＳｌｉｔタンパク質が関与できることが報告されている。具体的には、脊椎動物の胚の発達段階においてＳｌｉｔタンパク質及びＲｏｂｏタンパク質が発現し、Ｓｌｉｔ３、Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２タンパク質の発現が筋肉組織において増加することが報告されている（Ｎｅｉｌ Ｖａｒｇｅｓｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０６．１ （２００１）：１７５－１８０）。この報告によると、Ｓｌｉｔ３タンパク質は、胚の後肢筋肉組織の筋肉母細胞において発現が増加するが、移動能（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に関与するだけで、筋肉母細胞の分化には関連していないと述べている。
本発明者らは、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２が筋肉母細胞の分化を促進させて筋肉量の増加を誘導することにより、筋肉減少症の予防または治療に使用できることを明らかにした（大韓民国公開特許第１０－２０１７－０１３８９２０号）。ＬＲＲＤ２は、注射剤であって、患者が病院に来院して投与を受けなければならないが、生体内半減期が非常に短く、その薬効が発揮されるためには、投与周期が短くなるしかなく、これによる過度の薬剤の使用により効能が減少する問題が発生するものと予想される。
そこで、本発明者らは、ＬＲＲＤ２の生体内半減期を増進することにより、その効能を改善させたＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を開発し、本発明を完成した。
本発明の目的は、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の生体内半減期を改善させるための融合タンパク質を提供することである。
本発明の他の目的は、前述の融合タンパク質を暗号化する核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター及び前記組換えベクターを含む形質転換体を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前述の融合タンパク質の製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の筋肉疾患の予防または治療効能を改善させた組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の生体内半減期を増進させた組成物を提供することである。
上述した課題を解決するため、本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の融合タンパク質を提供する。
本発明の好適な一実施例によれば、前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）であってもよい。
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記融合タンパク質は、前記ヒト血清アルブミンがＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２のＮ－末端に結合されたものであってもよい。
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記ヒト血清アルブミンは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよい。
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含んでもよい。
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記アルブミンとＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２間にリンカーをさらに含んでもよい。
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）であり、ここで、ｎは、１～１０の整数であってもよい。
本発明は、さらに前述の融合タンパク質を暗号化する核酸分子を提供する。
本発明は、さらに前述の核酸分子を含む組換えベクター及びこれを含む形質転換体を提供する。
本発明は、さらに前述の形質転換体を培養する段階を含む、融合タンパク質の製造方法を提供する。
本発明は、さらに前述の融合タンパク質を筋肉疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明の好適な他の一実施例によれば、前記薬学組成物は、注射剤として投与されてもよい。
本発明の好適なさらに他の一実施例によれば、前記筋肉疾患は、緊張減退症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）及び筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってもよい。
本発明は、さらにアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の生体内半減期増進用組成物を提供する。
本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較して、生体内半減期が著しく増加し、筋肉関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
図１は、本発明のアルブミンがＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２のＮ－末端に結合された融合タンパク質の構成及びそのアミノ酸配列を示す。 図２は、ＳＰシスタチンＳ－ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を分離精製後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を示したものである。 図３は、様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能をグラフで示したものである。 図４は、絶食させた雄ＩＣＲマウスにおいてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（●、「Ｓｌｉｔ３」）とＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（■、「ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３」）のＩＶ投与後、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の血漿濃度時間プロファイルを示したものである。
上述したように、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、筋肉母細胞の分化を促進させて筋肉量の増加を誘導することにより、筋肉減少症の予防または治療に使用してもよいが、生体内半減期が非常に短く、その薬効が発揮されるためには、投与周期が短くなるしかなく、これによる過度の薬剤の使用により効能が減少する問題が発生するものと予想された。
そこで、本発明者らは、ＬＲＲＤ２の生体内半減期を増進することにより、その効能を改善させたＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を開発することにより、上述した問題の解決方案を模索した。本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較し、生体内半減期が著しく増加して筋肉関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の融合タンパク質を提供する。
本発明の融合タンパク質において、「Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２」は、Ｓｌｉｔ３タンパク質内の２番目のロイシンリッチリピートドメイン（Ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ、ＬＲＲＤ２）をいう。本発明者らは、以前の研究により、Ｓｌｉｔ３タンパク質またはこのタンパク質内のＬＲＲＤ２がＲｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合してＳｌｉｔ－Ｒｏｂｏシステムを介して、筋肉母細胞のＭ－カデリン（Ｍ－ｃａｄｅｒｉｎ）に結合されていたβ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）を遊離してβ－カテニンを活性化し、ミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）の発現を増加させて、筋肉母細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）の分化を誘導することにより、筋肉の形成を促進することを確認した。本発明において、用語の「Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２」とは、「Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２」を意味し、相互互換的に使用されてもよい。
本発明の融合タンパク質において、前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、リーサス（ｒｈｅｓｕｓ）血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、またはミューリン（ｍｕｒｉｎｅ）血清アルブミン（ＭｕＳＡ）であってもよく、好ましくは、ヒト血清アルブミンであってもよい。前記Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ヒト血清アルブミンの存在下のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期はヒト血清アルブミンの不在下におけるＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期よりも少なくとも１０倍以上さらに長い。本発明の具体的な一実施例において、ヒト血清アルブミンの存在下のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の血清半減期は、ヒト血清アルブミンの不在下におけるＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２より１４倍さらに長い。
本発明による融合タンパク質は、ヒト血清アルブミン及びＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の順序で結合されるか、またはその逆であってもよい。好ましくは、ヒト血清アルブミン及びＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の順序で結合される。例えば、ヒト血清アルブミンがＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２のＮ末端に結合する場合、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体内半減期及びその筋肉疾患関連効能が最も優れており、ヒト血清アルブミンがＣ末端に結合する場合、程度の差があり得るが、有効な効能を示すことができる。
本発明の融合タンパク質において、前記ヒト血清アルブミンは、６０９個のアミノ酸からなる全長またはその一部のアミノ酸配列を含む断片として使用されてもよい。ヒト血清アルブミンの全長アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９８７９７．１に開示されたもので、本発明の具体的な一実施例では、６０９個のアミノ酸からなる全長のヒト血清アルブミンにおいて２５番目～６０９番目のアミノ酸（５８５個のアミノ酸）からなる断片の形態を使用した。本発明の融合タンパク質において、ヒト血清アルブミンは、下記配列番号２のアミノ酸配列からなる。
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）。
本発明の融合タンパク質において、前記Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、ヒト由来であり、１５２３個のアミノ酸からなるＳｌｉｔ３タンパク質内のＬＲＲＤ２の全長またはその一部のアミノ酸配列を含む断片として使用されてもよい。Ｓｌｉｔ３タンパク質の全長アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＱ８９２４３．１に開示されたもので、本発明の具体的な一実施例において、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、１５２３個のアミノ酸からなる全長のＳｌｉｔ３タンパク質において２７８番目～４８６番目のアミノ酸（２０９個のアミノ酸）からなる断片の形態を使用した。本発明の融合タンパク質において、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、下記配列番号３のアミノ酸配列からなる。
ＩＳＣＰＳＰＣＴＣＳＮＮＩＶＤＣＲＧＫＧＬＭＥＩＰＡＮＬＰＥＧＩＶＥＩＲＬＥＱＮＳＩＫＡＩＰＡＧＡＦＴＱＹＫＫＬＫＲＩＤＩＳＫＮＱＩＳＤＩＡＰＤＡＦＱＧＬＫＳＬＴＳＬＶＬＹＧＮＫＩＴＥＩＡＫＧＬＦＤＧＬＶＳＬＱＬＬＬＬＮＡＮＫＩＮＣＬＲＶＮＴＦＱＤＬＱＮＬＮＬＬＳＬＹＤＮＫＬＱＴＩＳＫＧＬＦＡＰＬＱＳＩＱＴＬＨＬＡＱＮＰＦＶＣＤＣＨＬＫＷＬＡＤＹＬＱＤＮＰＩＥＴＳＧＡＲＣＳＳＰＲＲＬＡＮＫＲＩＳＱＩＫＳＫＫＦＲＣＳ（配列番号３）。
本発明の融合タンパク質において、「Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２」は、配列番号３のアミノ酸配列との機能的同等物を含んでもよい。
前記「機能的同等物」とは、タンパク質またはペプチドのアミノ酸付加、置換または欠失により、本発明の配列番号１～４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を持つもので、配列番号１～４のアミノ酸配列から構成されたタンパク質またはペプチドと実質的に同質の生理活性を示すタンパク質またはペプチドをいう。
具体的に、前記融合タンパク質は、その野生型アミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドだけでなく、そのアミノ酸配列変異体も本発明の範囲に含まれてもよい。前記アミノ酸配列変異体とは、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の野生型アミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するタンパク質またはペプチドを意味する。
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおいて、可能なアミノ酸の交換は、当該分野に公知されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
本発明のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２、またはその変異体は、天然から抽出したり、合成（Ｍｅｒｒｉｆｌｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１５６，１９６３）、またはＤＮＡ配列を基本とする遺伝子組換え方法により製造されてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２版，１９８９）。
本発明のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、その生体内半減期を増進させるため、アルブミン融合以外にもＩｇＧのＦｃタンパク質融合またはペギュレーション（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）などが行われてもよい。
本発明の融合タンパク質において、アルブミンとＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の間には、リンカーがさらに含まれてもよい。好ましいリンカーの種類としては、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）であってもよく、ここで、ｎは、１～１０の整数であってもよく、好ましくは、ｎは、１～５の整数であってもよい。
本発明は、さらにＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２のＮ末端にヒト血清アルブミンが連結された形態の融合タンパク質を暗号化する核酸分子を提供し、さらに前記ヒト血清アルブミンのＮ末端には、シスタチンＳが連結されてもよい。
本発明の核酸分子において、シスタチンＳは、信号ペプチドとして前記シスタチンＳを暗号化する塩基配列は、ヒト血清アルブミンを暗号化する塩基配列の５’末端に連結され、前記ヒト血清アルブミンを暗号化する塩基配列は、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を暗号化する塩基配列の５’末端に連結されてシスタチンＳ－ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２が生産されてもよい。
本発明の核酸分子において、前記シスタチンＳは、ヒト由来であり、１４１個のアミノ酸からなる全長またはその一部のアミノ酸配列を暗号化する塩基配列として使用されてもよい。シスタチンＳの全長アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＸ１０１３５．１に開示されたもので、本発明の具体的な一実施例では、１４１個のアミノ酸からなる全長のシスタチンＳにおいて１番目～２０番目のアミノ酸（２０個のアミノ酸）からなる断片を暗号化する塩基配列を使用した。本発明の核酸分子において、シスタチンＳは、下記配列番号１のアミノ酸配列を暗号化する塩基配列である。
ＭＡＲＰＬＣＴＬＬＬＬＭＡＴＬＡＧＡＬＡ（配列番号１）。
本発明は、さらに前記融合タンパク質を暗号化する塩基配列及び前記塩基配列に機能的に連結されたプロモーターを含む組換えベクターを提供する。
用語の「機能的に連結された」とは、核酸発現調節配列（プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合部位のアレイ）及び二次塩基配列の間が機能的に連結されたことを意味し、前記発現調節配列は、二次配列に相応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。
本発明のベクターシステムは、文献［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）］に記載されているように、当業界でよく知られている方法によって製造されてもよい。
一般的に、ベクターは、クローニングまたは発現の目的のために製造されてもよい。また、ベクターは、真核又は原核宿主細胞で使用するために製造されてもよい。例えば、ベクターが原核細胞で発現するために製造されると、転写を開始するための強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びＴ７プロモーター）、リボソーム結合部位又は翻訳開始及び転写／翻訳中止配列を含む。特に、Ｅ．ｃｏｌｉが宿主細胞として使用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉにあるトリプトファン生合成のためにプロモーター及びオペロンにあるオペレーター（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８－１０２４（１９８４））、及びファージλの左方向プロモーター（ｐＬλプロモーター，Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄ Ｈａｇｅｎ，Ｄ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９－４４５（１９８０））が調節配列として使用されてもよい。宿主細胞としてバチルスが使用される場合、バチルス・チューリンゲンシスのトキシンタンパク質をコードする遺伝子に対するプロモーター（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３９３２－３９３８（１９９８）；ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５０：７３４－７４１（１９９６））またはバチルスにある他の作動可能なプロモーターが調節配列として使用されてもよい。
原核細胞に使用可能な多くの通常のベクターは、当業者によく知られており、適切なベクターの選別は、選別の問題である。本発明で使用された通常のベクターは、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸ ｓｅｒｉｅｓ、ｐＥＴ ｓｅｒｉｅｓ、ｐＵＣ１９、λｇｔ・４λＢ、λ－ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３を含み、必ずしもこれに限定されるものではない。
例えば、ベクターが真核宿主細胞のために製造される場合、その中でも、動物細胞、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルス（例えば、アデノウイルスレートプロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター）からのプロモーターが使用されてもよい。ベクターは、一般的に転写体のポリアデニル化部位を含む。商業的に利用可能なウイルス－基礎のベクターの例は、ｐｃＤＮＡ ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；サイトメガロウイルスプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む）、ｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ；ＳＶ４０プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ；サイトメガロウイルスプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む）、及びｐＲＥＰ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＲＳＶプロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む）。
ベクターが酵母に対して製造される場合、ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、エノラーゼ及びアルコールジヒドロラーゼに対する遺伝子のプロモーターが調節配列として使用されてもよい。
発現ベクターが植物細胞に対して製造される場合、当業界に知られている様々な植物体－機能的プロモーターが使用されてもよく、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ピグワートモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、シュガーケインバシリフォームウイルスプロモーター、コメリナイエローモトルウイルスプロモーター、リブロース－１，５－ビス－ホスフェートカルボキシラーゼの小単位（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）からの光－誘導性プロモーター、コメサイトゾリックトリオースフォスフェイトイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）プロモーター、コメアクチン１遺伝子プロモーター及びマンノピンシンターゼ並びにオクトピンシンターゼプロモーターを含む。
また、本発明の組換えベクターは、発現された融合タンパク質を容易に分離できる塩基配列を含み、必ずしもこれに限定されるものではないが、グルタチオンＳ－トランスファラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６Ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を含む。このような追加配列によって発現された融合タンパク質は、迅速かつ簡単な方法で親和クロマトグラフィーで分離してもよい。
本発明の具体的な一実施例では、ＦＬＡＧ配列を使用し、ＦＬＡＧタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。配列番号４のアミノ酸配列は、以下の通りである。
ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４）。
本発明の他の一実施例によれば、融合タンパク質は、親和クロマトグラフィーによって分離される。例えば、グルタチオンＳ－トランスファラーゼの場合、グルタチオンを含む溶出緩衝液が使用され、外来タンパク質を迅速かつ簡単に分離するために６Ｘ Ｈｉｓを使用する場合、Ｎｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓ－結合レジン（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）が使用される。
本発明の発現ベクターは、形質転換された宿主を選別可能にできる１つまたはそれ以上のマーカーを含むことが好ましく、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ジェネティシン及びテトラサイクリンなどの抗生剤に耐性を持つ遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、金属イオンのような他の毒性化合物に抵抗性を持つ遺伝子がある。
本発明は、さらに前述の本発明の組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
形質転換体を製造するのに有用な宿主は、当業界でよく知られている。例えば、原核細胞宿主、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルス・サブティリス、バチルス・チューリンゲンシス、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス及び様々なシュードモナス、コリネバクテリウム及びストレプトマイセスが使用されてもよい。
真核細胞において、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株）及び植物体細胞が使用されてもよい。
６７宿主細胞の形質転換は、当業界に知られている多くの方法によって行われてもよい。例えば、宿主細胞として、原核細胞を使用する場合、ＣａＣｌ２方法、ハンソン方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０－２１１４（１９７３）；ａｎｄ Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７－５８０（１９８３））及び電気泳動が形質転換のために使用されてもよい。また、宿主細胞として、真核細胞を使用する場合、微細注入、カルシウムホスフェイト沈殿、電気衝撃、リポソーム－媒介の形質感染、ＤＥＡＥ－デキストラン処理法、及び粒子衝撃法が形質転換のために使用されてもよい。また、植物細胞が宿主細胞として使用される場合、アグロバクテリウム－媒介の形質転換が最も好ましい方法であり、これは原形質体から隣接する植物体の再分化のために必要な迂回を可能にするためである。
本発明は、さらにＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の融合タンパク質を生産する方法を提供する。前記方法は、（ａ）前記形質転換体を発現させるための条件下で培養する段階と、（ｂ）生産された融合タンパク質を得る段階と、を含む。
本発明の融合タンパク質を製造するための形質転換体の培養は、当業界で知られている適当な培地と培養条件に応じて行われてもよい。これらの培養過程は、当業者であれば、選択された菌株に応じて容易に調整して使用してもよい。細胞培養は、細胞の成長方式によって懸濁培養と付着培養、培養方法に応じて回分式、流加式及び連続培養式の方法に区分される。培養に使用される培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満たさなければならない。
動物細胞培養に使用する前記培地は、様々な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。使用可能な炭素源の例としては、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉及びセルロースなどの炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油及びココナッツ油などの脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノレン酸などの脂肪酸、グリセロール及びエタノールなどのアルコール、及び酢酸などの有機酸を含む。これらの炭素源は、単独または組み合わせて使用されてもよい。使用可能な窒素源の例としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆粕などの有機窒素源及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムなどの無機窒素源を含む。これらの窒素源は、単独または組み合わせて使用されてもよい。前記培地にはリン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するソジウム－含有塩が含まれてもよい。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を含んでもよい。その他に、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが含まれてもよい。
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸などの化合物を培養物に適切な方式で添加し、培養物のｐＨを調整しうる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用して気泡の生成を抑制しうる。また、培養物の好気状態を維持するため、培養物内に酸素または酸素－含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、通常２０℃～４５℃、好ましくは、２５℃～４０℃である。
本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の融合タンパク質を生産する方法において、前記（ｂ）段階の収得は、分離された形態の融合タンパク質を得るために行われてもよい。例えば、融合タンパク質が大容量に形質転換されたバクテリアによって発現される場合、一般的にはプロモーターの誘導後に発現され、しかし、発現は持続してタンパク質が不溶性沈殿物を形成することになる（すなわち、インクルージョンボディ）。インクルージョンボディの分離のための適切ないくつかのプロトコルがある。インクルージョンボディを形成した融合タンパク質は、適切な緩衝液を用いて希釈または透析によって再形成されてもよい。その後、融合タンパク質は、硫酸アンモニウム、サイズ差別ろ過（ウルトラフィルトレーション）及びカラムクロマトグラフィー（サイズ、ネット表面電荷、疎水性又は親和度に依存）の使用により、溶解度分画化を含む当業界に知られている基本的な方法で行われてもよい。
本発明の融合タンパク質は、植物体で発現されてもよい。植物細胞の形質転換は、当業界に知られている通常の方法によって行われてもよく、電気衝撃、粒子衝撃及びアグロバクテリウム－誘導された形質転換によって行われてもよい。これらの中で、アグロバクテリウム－誘導された形質転換が最も好ましい。アグロバクテリウム－誘導された形質転換は、一般的に葉切片及び子葉並びに胚軸のような他の組織を用いて行われてもよい。
形質転換された細胞の選別は、形質転換された培養を代謝阻害剤（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、抗生剤及び除草剤のような選別製剤に露出させることにより行われてもよい。細胞が形質転換され、選別遺伝子に抵抗性を持つマーカー遺伝子を安定的に発現すると、培養の間に成長及び分化する。例えば、マーカーは、必ずしもこれに限定されるものではないが、グリコホスフェート抵抗性遺伝子及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）システムがある。植物原形質剤又は様々な外来物質から植物体の発生や再分化は、当業界でよく知られている。生産された形質転換発根した新梢は、適切な植物体の成長培地に置床される。アグロバクテリウムにより誘導された外来遺伝子を含む植物体の発生や再分化は、当業界に知られている方法により行われてもよい。
本発明は、アルブミンが結合されたＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋肉疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明の薬学組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。前記薬学組成物を剤形化する場合、１つ以上の緩衝剤（例えば、生理食塩水またはＰＢＳ）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、充填剤、増量剤、結合剤、アジュバント（例えば、アルミニウムハイドロオキサイド）、懸濁剤、濃厚剤、湿潤剤、崩解剤または界面活性剤、希釈剤または賦形剤を使用して調製されてもよい。
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれており、これらの固形剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉（トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉などを含む）、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル－セルロースまたはゼラチンなどを混合して調剤される。例えば、活性成分を固体賦形剤と配合した後、これを粉砕し、適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することにより、錠剤または糖衣錠剤が得られる。
また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤または保存剤などが含まれてもよい。また、場合によっては、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはナトリウムアルギネートなどを崩解剤として添加してもよく、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んでもよい。
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤または坐剤などが含まれる。非水性溶剤及び懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されてもよい。
本発明の薬学組成物は、経口または非経口で投与されてもよく、非経口投与時に皮膚外用、腹腔内、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内に注射する注射剤、経皮投与剤、または鼻腔吸入剤の形態で当業界で公知の方法により剤形化されてもよい。
前記注射剤の場合には、必ず滅菌されなければならず、バクテリア及び真菌などの微生物の汚染から保護されるべきである。注射剤の場合、適切な担体の例としては、これに限定されるものではないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒または分散媒質であってもよい。より好ましくは、適切な担体としては、ハンクス液、リンゲル液、トリエタノールアミンが含有されたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストロースなどの等張溶液などが使用されてもよい。前記注射剤を微生物汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含んでもよい。また、前記注射剤は、ほとんどの場合、糖またはナトリウムクロライドなどの等張化剤をさらに含んでもよい。
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロール剤などの形態が含まれる。前記において経皮投与は、薬学組成物を局所的に皮膚に投与して薬学組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。
吸入投与剤の場合、本発明によって使用される融合タンパク質は、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用し、加圧パックまたは煙霧機からエアロゾルスプレーの形態で便利に伝達しうる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を伝達する弁を提供して決定してもよい。例えば、吸入器または吹込器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化してもよい。非経口投与用剤形は、すべての製薬化学で一般的に公知の処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。
本発明の薬学組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定されてもよい。本発明の薬学組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは、順次的又は同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。すなわち、本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定されてもよい。
本発明の薬学組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度に応じて、その範囲が多様である。一日投与量としては、非経口投与時にＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を基準に一日に体重１ｋｇ当たり、好ましくは、０．０１～５０ｍｇ、より好ましくは、０．１～３０ｍｇの量で投与されるように、そして、経口投与時には、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を基準に一日に体重１ｋｇ当たり、好ましくは、０．０１～１００ｍｇ、より好ましくは、０．０１～１０ｍｇの量で投与されるように１～数回に分けて投与してもよい。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減されてもよいので、前記投与量がいかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の薬学組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用してもよい。
本発明の薬学組成物は、さらに外用剤の剤形として提供しうる。本発明の筋肉疾患の予防及び治療用薬学組成物を皮膚外用剤として使用する場合、さらに脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型乳化剤、非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤または脂質小胞などの皮膚外用剤に通常使用される任意の他の成分と同じ皮膚科学分野において通常使用される補助剤を含有してもよい。また、前記成分は、皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入されてもよい。
本発明の筋肉疾患の予防及び治療用薬学組成物が皮膚外用剤として提供される場合、これらに制限されるものではないが、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤などの剤形であってもよい。
本発明の筋肉疾患は、筋機能の低下、筋肉消耗または筋肉退化による筋肉疾患として当業界で報告された疾病であることが好ましく、具体的には、緊張減退症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉退化、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）及び筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることがより好ましいが、これに限定されるものではない。
前記筋肉消耗または退化は、先天的要因、後天的要因、老化などを原因として発生し、筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に骨格筋または随意筋及び心臓筋肉の弱化及び退行を特徴とする。
より具体的には、前記筋肉は、筋、筋肉、腱を包括的に指し、筋機能または筋肉機能は、筋肉の収縮によって力を発揮できる能力を意味し、筋肉が抵抗を乗り越えるために最大限の収縮力を発揮できる筋力、筋肉が与えられた重量にどれだけ長い間、あるいはどれだけ何度も収縮と弛緩を繰り返すことができるかを示す能力である筋持久力、及び短時間内に強い力を発揮する能力である瞬発力を含む。前記筋機能は、筋肉量に比例し、用語の筋機能の改善とは、筋機能をより肯定的な方向に向上させることを意味する。
本発明は、さらにアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋肉疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。本発明の健康機能食品の組成物に含まれる有効成分の構成及びその効果は、前述の薬学組成物に対するものと同じなので、その記載を省略する。
本発明による健康機能食品組成物は、当業界で公知の通常の方法によって様々な形態で製造されてもよい。一般食品としては、これに限定されるものではないが、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実及びその加工食品（例えば、果物缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレードなど）、魚類、肉類及びその加工食品（例えば、ハム、ソーセージ、コンビーフなど）、パン類及び麺類（例えば、うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例えば、バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例えば、味噌、醤油、ソースなど）などに本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を添加して製造してもよい。また、栄養補助剤としては、これに限定されるものではないが、カプセル、タブレット、丸薬などに本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を添加して製造してもよい。また、健康機能食品としては、これに限定されるものではないが、例えば、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質そのものをお茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用（健康飲料）できるように液状化、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取してもよい。また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を食品添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液の形態で製造して使用してもよい。また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質と筋肉疾患の予防及び筋機能の改善効果があると知られている公知の活性成分とともに混合して組成物の形態で製造してもよい。
本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を健康飲料として用いる場合、前記健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前述の天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライド、マルトース、スクロースなどのジサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンなどのポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを使用してもよい。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍＬ当たり、一般的に約０．０１～０．０４ｇ、好ましくは、約０．０２～０．０３ｇである。
また、本発明のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質は、筋肉疾患の予防及び筋機能改善用食品組成物の有効成分として含有されてもよいが、その量は、筋肉疾患の予防及び筋機能改善用作用を達成するのに有効な量で、特に限定されるものではないが、全組成物の総重量に対して、０．０１～１００重量％であることが好ましい。本発明の健康機能食品組成物は、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質とともに筋肉疾患の予防及び筋機能改善用組成物に効果があることが知られている他の活性成分とともに混合して製造されてもよい。
前記の他に本発明の健康機能食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有してもよい。その他に本発明の健康食品は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。これらの成分は、独立してまたは混合して使用してもよい。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり、０．０１～０．１重量部の範囲で選ばれるのが一般的である。
また、本発明は、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を含む、筋機能改善用化粧料組成物を提供する。本発明の化粧料組成物に含まれる有効成分の構成及びその効果は、前述の薬学組成物に対するものと同じなので、その記載を省略する。
前記化粧料組成物は、特に制限されるものではないが、皮膚外用として使用してもよい。
本発明の化粧料組成物は、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を有効成分として含有し、皮膚学的に許容可能な賦形剤とともに基礎化粧品の組成物（化粧水、クリーム、エッセンス、クレンジングフォーム及びクレンジングウォーターなどの洗顔剤、パック、ボディオイル）、カラー化粧品の組成物（ファンデーション、口紅、マスカラ、メイクアップベース）、頭髪製品の組成物（シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、ヘアジェル）及び石鹸などの形態で製造されてもよい。
前記賦形剤としては、これに限定されるものではないが、例えば、皮膚軟化剤、皮膚浸透増強剤、着色剤、芳香剤、乳化剤、濃化剤及び溶媒を含んでもよい。また、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤及び保湿剤などをさらに含んでもよく、物性の改善を目的として粘増剤、無機塩類、合成高分子物質などを含んでもよい。例えば、本発明の化粧料組成物で洗顔剤や石鹸を製造する場合には、通常の洗顔剤及び石鹸ベースにＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を添加して容易に製造してもよい。クリームを製造する場合には、一般的な水中油滴型（Ｏ／Ｗ）のクリームベースにＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を添加して製造してもよい。ここに香料、キレート剤、色素、酸化防止剤、防腐剤などと物性改善を目的としたタンパク質、ミネラル、ビタミンなどの合成または天然素材をさらに添加してもよい。
本発明の化粧料組成物に含有されるＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の含量は、これに限定されるものではないが、全組成物の総重量に対して、０．００１～１０重量％であることが好ましく、０．０１～５重量％であることがより好ましい。前記含量が０．００１重量％未満では、目的とする効果が期待できず、１０重量％超過では、安全性又は剤形上の製造に困難性があり得る。
本発明は、さらにアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋機能改善用飼料添加物を提供する。本発明の飼料添加物に含まれる有効成分の構成及びその効果は、前述の薬学組成物に対するものと同じなので、その記載を省略する。
本発明の飼料添加物は、飼料管理法上の補助飼料に該当する。
本発明において、用語の「飼料」とは、動物が食べ、摂取し、消化させるための、またはこれに適した任意の天然または人工規定食、一食式など、または前記一食式の成分を意味する。
前記飼料の種類は、特に制限されず、当該技術分野で通常使用される飼料を使用しうる。前記飼料の非制限的な例としては、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、澱粉類、粕類または穀物副産物類などの植物性飼料、タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類または食物などの動物性飼料が挙げられる。これらは単独で使用されるか、または２種以上を混合して使用されてもよい。
また、前記飼料添加物は、さらに単胃動物に許容される担体を含有してもよい。本発明においては、前記飼料添加物をそのまま、または公知の担体、安定剤などを加えることができ、必要に応じてビタミン、アミノ酸類、ミネラルなどの各種養分、抗酸化剤及びその他の添加剤などを加えることもでき、その形状としては、粉体、顆粒、ペレット、懸濁液などの適切な状態であってもよい。本発明の飼料添加物を供給する場合には、単胃動物に対して単独で、または飼料に混合して供給しうる。
本発明は、さらにアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の生体内半減期増進用組成物を提供する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明であろう。
下記実施例に使用された略語及びその意味は、以下の表１の通りである。
Figure 0007295261000001
［実施例１］
ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の製造
ＰＣ ＤＮＡ ３．１ベクターＳＰシスタチンＳ－ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲ Ｄ２－ＦＬＡＧ ＤＮＡ １．６ｍｇ／ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ懸濁液細胞にトランスフェクションさせて発現を行った。１２５ｍｌの２９３Ｆ細胞懸濁液で細胞を４．５～５×１０６細胞／ｍｌまで培養し、培地のみを新しく交換した後、エクスピフェタミン（Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ）４００μｌとＯｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ａサンプル）を常温で５分間反応し、ＤＮＡ１５０μｇ、Ｏｐｔｉ－ｍｅｍ７．５ｍｌ（Ｂサンプル）を常温で５分間反応後、ＡとＢサンプルを互いに混合し、２０分間常温で反応してトランスフェクションを行った。２４時間後、エンハンサー１と２を混合して処理した後、７日間培養した。
７日たった培養液を遠心分離器４℃８０００ｒｐｍで２０分間細胞を沈殿させた後、上澄み液をコーニング（ｃｏｒｎｉｎｇ）社の０．２２μｍフィルターでろ過して使用した。レジンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社の抗－ＦＬＡＧレジンを使用して行った。レジンをそれぞれ１．２ｍｌずつ使用し、精製は、４℃１ｍｌ／分の速度で行った。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ７．４）を用いたウォッシングバッファーをレジンの２０倍で流し込んだ。溶出は、シグマ社のＦＬＡＧペプチド２００μｌとＴＢＳ９．８ｍｌを混合して使用したが、分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）あたり５００μｌずつ８個を得て、タンパク質分画を集めてバッファーをＤＰＢＳに変えて濃縮した後、濃度を測定した。
図２は、前記過程により融合タンパク質を分離精製後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を示したものであり、本実施例で製造された図１に示された融合タンパク質のサイズが７５ＫＤａであることを確認した。
［実施例２］
様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能確認
２－１．様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の製造
実施例１の製造方法に基づいて、下記表２に示すように１２種の様々なＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質を製造した。リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）を使用した。
Figure 0007295261000002
前記１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、表３に示した。
Figure 0007295261000003
Figure 0007295261000004
Figure 0007295261000005
Figure 0007295261000006
Figure 0007295261000007
Figure 0007295261000008
＊前記表３において下線で表示された配列は、ＨＳＡとＬＲＲＤ２を連結するＧＳリンカーであり、太字で表示された配列は、融合タンパク質を最終形態で発現させるため、Ｃ－末端に付加される配列を連結するＧＳリンカーである。
２－２．様々な形態のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の受容体結合能確認
Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、Ｒｏｂｏ１またはＲｏｂｏ２受容体と結合し、Ｓｌｉｔ－Ｒｏｂｏシステムを介して筋肉母細胞のＭ－カデリンに結合されていたβ－カテニンを放出させて（ｒｅｌｅａｓｅ）β－カテニンを活性化し、ミオゲニンの発現を増加させることにより、筋肉母細胞の分化を誘導して筋肉の形成を促進する。したがって、本実施例では、実施例２－１で製造された１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の受容体結合能を確認した。１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質とＲｏｂｏ１受容体の結合能は、ＥＬＩＳＡシステムを使用して定量した。詳細条件は、次の通りである。
１２種のＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質は、分子量を考慮してウェル当たり０、１、１０、１００、１０００ｎＭとなるように、４℃で１８時間９６ウェル微量定量板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ）（ＮＵＮＣ社）にコーティングした。コーティングされた物質は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれたＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を使用して３回洗浄した。非特異的なバインディングを遮断するため、１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳＴで室温で２時間ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーを除去するためにＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、該当細胞株から得られたタンパク３０ｕｇを（溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）：０．５％ＮＰ４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ））室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡで１：１０００希釈させたＲｏｂｏ１抗体（ａｂｃａｍ：ａｂ７２７９）を室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡで１：２０００希釈させたＨＲＰ結合抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：７０７４）を室温で２時間付着させた。ＰＢＳＴを使用して５回洗浄した後、ＴＭＢ溶液で３７℃で３０分間反応させた。前記反応を停止させるために１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を使用し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図３に示すように、ＬＲＲＤ２－３とＬＲＲＤ２－６の受容体結合能が最も優れていることを確認した。
［実施例３］
マウスにおいてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質の薬物動態研究
本実施例では、実施例２の結果に基づいて、受容体結合能が最も優れたＬＲＲＤ２－３を選定し、薬物動態研究を行った。
薬物動態学の研究は、新薬開発過程の一部分で、時間による体内の薬物濃度の変化評価を通じて試験薬物の吸収、分布、代謝及び排泄に対する情報を得ることを目的とする。本実施例では、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２－３及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）の１回静脈内投与後、マウスにおいて薬物動態特性を確認した。
３－１．化学物質及び溶媒
本実施例で使用されたカルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、アセトニトリルとメタノールは、ＨＰＬＣグレードでＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。
３－２．動物及び投与条件
本実施例では、体重３０～３２．５ｇ範囲のＩＣＲ系雄性マウス（６週齢、(株）オリエントバイオ、城南、大韓民国）を使用した。マウスは、実験前に４時間絶食し、投与後４時間まで絶食を維持した。飼育場は、１２時間ずつ明暗を与えて適正温度（２０～２５℃）及び湿度（４０～６０％）を維持した。
Figure 0007295261000009
Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２を１ｍｇ／ｍＬの容量でＰＢＳに溶かして準備した。ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の場合、分子量を考慮して３．５ｍｇ／ｍＬの容量（Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２として１ｍｇ／ｍＬ）でＰＢＳに溶かして準備した。投与容量は、両群とも１０ｍＬ／ｋｇで、左側の尾静脈を介して投与した。
３－３．薬物動態試験
薬物動態試験の場合、絶食させたマウスにＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２とＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び３５ｍｇ／ｋｇの容量で尾静脈を介してそれぞれ投与した。投与後、それぞれ０．０５、０．１２、０．３３、１、３、７、１０、２４、４８、及び７２時間にマウスを手で固定した後、ヘパリンコーティングされた毛細管で右側の眼窩静脈叢から血液７０μＬを採血した。取られた血液は、５分間遠心分離した後、血漿を分離して分析前まで－２０℃で冷凍保管した。
３－４．分析方法
血漿試料のうち、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の濃度は、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを用いて定量した。試料前処理の前、血漿試料は、Ｎｉ－ＮＴＡマグネティックビードを用いて精製した。精製されたＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）に６Ｍの尿素と１８ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて変性させた後、２２５ｍＭのヨードアセトアミドを用いてアルキル化を誘導した。以後、シグネチャーペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を得るため、８５０ｎｇの組換えブタトリプシン（Ｖ５１１７、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を加えて２４時間３７℃に設定されたウォーターバス（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で反応させた。反応後に生成されたトリプシン消化物７０μＬにＭｅＯＨに溶解した３％のギ酸５０μＬを加えた後、ボルテックスミキサー（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ）を用いて１０分間混合試料を懸濁し、１３,５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液１６０μＬを取って分析容器に移し、そのうち５μＬをＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入して分析を行った。
詳細な分析条件は、次の通りである。
－ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）
－カラム：ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）Ｃ８ ３．５μｍ、２．１＊５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
－移動相（Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）：
Figure 0007295261000010
－流速：３００μＬ／ｍｉｎ
－温度：カラムで２０℃、及び自動サンプル機トレイ（ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ ｔｒａｙ）で１０℃
－ランタイム：５分
－検出：タンデム四重極型質量分析計（ＡＰＩ ４０００，ＱＴＲＡＰ（登録商標），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）
－カーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ ｇａｓ）：２０ｐｓｉ
－イオンソースガス １（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ １）：５０ｐｓｉ
－イオンソースガス ２（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ ２）：６０ｐｓｉ
－イオンスプレー電圧（ｉｏｎｓｐｒａｙ ｖｏｌｔａｇｅ）：５５００Ｖ
－温度：６００℃
－多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、ＭＲＭ）モード：陽性
Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２のシグネチャペプチド（Ｐ６）の分子イオンは、２３Ｖの衝突エネルギー（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）によって断片化され、衝突ガス（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｇａｓ）は、装備において「ｍｅｄｉｕｍ（８ｐｓｉ）」に設定した。イオンの検出は、ＥＳＩ陽性ＭＲＭモードで行い、Ｐ６は、ｍ／ｚ ５８７．９７→４９１．５０で定量した。検出ピークの積分は、Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４．２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ）を用いて行った。血漿中においてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の定量可能範囲は、１～１００μｇ／ｍＬであり、ＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の場合、３～１００μg／ｍＬであった。該当分析においてＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、３．２９分のピーク保持時間を示した。
３－５．データ分析
時間による血漿中のＣＮＣ０００００の濃度を前記実施例３－４に記載されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて求め、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ４．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）のソフトウェアのノンコンパートメント解析（ｎｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で薬物動態的パラメータ（ＰＫ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を計算した。最高濃度（Ｃｍａｘ）と最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、血中薬物濃度に対して時間による曲線から経時的に求め、消失速度定数（Ｋe）は、ログスケール（ｌｏｇ ｓｃａｌｅ）の最終段階（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈａｓｅ）において線形回帰分析によって計算した。半減期（Ｔ１／２）は、ＬＮ２をＫｅで除して求め、血中薬物濃度に対して時間曲線下面積（ＡＵＣ０－∞）及び血中薬物モーメントに対して時間曲線下面積（ＡＵＭＣ０－∞）は、線形台形法（ｌｉｎｅａｒ ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｒｕｌｅ）と標準面積外挿法（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｒｅａ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により計算した。クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ、ＣＬ）と分布容積（ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｖｓｓ）は、次の［式１］～［式３］により計算した。
Figure 0007295261000011
Figure 0007295261000012
Figure 0007295261000013
３－６．結果
時間による血漿内のＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２及びＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）の濃度は、図４及び表５と６に示し、薬物動態パラメータは、表７に示した。これに関連したパラメータとすべての値は、個体毎に算出した後、平均で示した。時間による血中濃度パターンと動物実験記録紙を参考して異常のある個体群は、データの分析から排除し、データの解釈に使用された実験群は、少なくともｎ＝３以上となるようにした。
Figure 0007295261000014
Figure 0007295261000015
下記表７から確認されるように、ＨＳＡ－結合Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２(ＬＲＲＤ２－３)は、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２に対して約１４倍改善された半減期を示した。
Figure 0007295261000016
［実施例４］
ＨＳＡ－結合Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の生体効能確認
９週齢のＢａｌｂｃ－ｎｕｄｅマウスを９週齢で卵巣切除した後、１１週齢から４週間アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２またはＨＳＡ－Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２融合タンパク質（ＬＲＲＤ２－３）を処理した。各薬物は、１日１回、毎週５回静脈注射により投与し、Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇ、ＨＳＡ－結合Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２（ＬＲＲＤ２－３）は、毎日３７．１３ｍｇ（Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、毎日１０ｍｇに該当）注射した。投与完了後、ヒラメ筋（Ｓｏｌｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）を採取して筋肉の重さを測定し、その結果を下記表８に示した。
Figure 0007295261000017
表８に示すように、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２とＨＳＡ－結合Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２は、すべてヒラメ筋の筋肉量を有意に増加させた。しかし、ＨＳＡ－結合Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２がアルブミンと結合しないＳｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２よりさらに強い治療効能を示した。
本発明のアルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と同じ細胞学的効能を示し、アルブミンと結合しないＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２と比較して生体内半減期が著しく増加し、筋肉関連疾患をより効果的に予防または治療しうる。
本発明をサポートした国家研究開発事業は、下記の通りである。
(１)［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１７－１２２９（ＨＩ１５Ｃ０３７７０１００１７）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ 骨形成促進作用を持つ巨核細胞分泌因子の発掘
［寄与率］ ７５／１００
［主管機関］ ソウル峨山病院
［研究期間］ ２０１７．０９．０７～２０１８．０９．０６

（２）［この発明をサポートした国家研究開発事業］
［課題固有番号］ ２０１３－２２３４（ＨＩ１３Ｃ１６３４０６００１８）
［省庁名］ 保健福祉部
［研究管理専門機関］ 韓国保健産業振興院
［研究事業名］ 疾病中心仲介重点研究
［研究課題名］ Ｓｌｉｔ３ ＬＲＲＤ２の薬物動態研究及びＳｌｉｔ３ ＴＧマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ毒性の検証
［寄与率］ ２５/１００
［主管機関］ 忠南大学校産学協力団
［研究期間］ ２０１３．１１．０１～２０１９．０６．３０

Claims (15)

  1. アルブミンと結合した、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含み、
    前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２は、配列番号３のアミノ酸配列からなり、
    前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）であり、
    前記ヒト血清アルブミンは、前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２のＮ－末端に結合されている、融合タンパク質。
  2. 前記ヒト血清アルブミンは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記ヒト血清アルブミンと前記Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは１～１０の整数である、請求項３に記載の融合タンパク質。
  5. 請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
  6. 請求項５に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
  7. 請求項６に記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
  8. 請求項７に記載の形質転換体を培養する段階を含む、ヒト血清アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む、融合タンパク質の製造方法。
  9. 請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、筋肉疾患の予防または治療用薬学組成物。
  10. 注射剤として投与される、請求項９に記載の筋肉疾患の予防または治療用薬学組成物。
  11. 前記筋肉疾患は、緊張減退症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）及び筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項９に記載の筋肉疾患の予防または治療用薬学組成物。
  12. 請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、Ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２の生体内半減期増進用組成物。
  13. 筋肉疾患の予防または治療用薬剤を製造するための、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
  14. 前記薬剤は、注射剤として投与されている、請求項１３に記載の使用。
  15. 前記筋肉疾患は、緊張減退症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉退化、筋無力症、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）及び筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項１３に記載の使用。
JP2021550267A 2019-02-27 2020-02-27 アルブミンと結合したＳｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲＤ２を含む筋肉疾患の予防または治療用組成物 Active JP7295261B2 (ja)

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