KR102353524B1 - 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating bone related disorder comprising HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein}
본 발명은 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
Slit 단백질은 신경계의 발생 과정 동안에 뉴런과 액손의 이동을 조절하는 것으로서 잘 알려져 있는 단백질이다. Slit 단백질은 Robo 수용체와 작용하여 생리학적 활성을 조절할 수 있고, 심장, 폐, 신장, 유방조직 등 다양한 조직에서 다양한 세포 내 과정을 조절하는 인자로서 역할을 하는 것으로 알려졌으며, 최근 세포의 생장, 부착능 및 이동능의 조절에 중요한 역할이 있음이 보고되면서 세포의 분화과정에서의 이동 및 암의 발생과 전이 과정에 Slit 단백질이 관여할 수 있음이 보고된 바 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 Slit3의 LRRD2가 세포 및 동물모델에서 골 형성을 증가시키고, 골 흡수를 감소시키며, 골다공증의 발병률과 음의 상관관계를 가지고 있어, 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물 및 골절 또는 골다공증 발생 위험을 예측하기 위한 바이오 마커로 유용하게 이용될 수 있음을 밝힌 바 있다 (대한민국 등록특허 제10-1617497호). LRRD2는 주사제로 환자가 병원에 내원하여 투여 받아야 하지만, 생체 내 반감기가 매우 짧아 이의 약효가 발휘되기 위해서는 투여 주기가 짧아질 수 밖에 없고, 이에 따른 과도한 약제 사용으로 효능이 감소되는 문제가 발생할 것으로 예상된다.
이에 본 발명자들은 LRRD2의 생체 내 반감기를 증진함으로써 이의 효능을 개선시킨 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Slit3 단백질의 LRRD2의 골 관련 질환 예방 또는 치료효능을 개선시킨 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 인간 혈청 알부민은 Slit3 단백질의 LRRD2의 N-말단에 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 인간 혈청 알부민은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 Slit3 단백질의 LRRD2는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 알부민과 Slit3 단백질의 LRRD2 사이에 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 링커는 (GGGGS)n (서열번호 5)이고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 주사제로 투여될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골절, 골 손실, 골관절염(osteoarthritis), 골전이암 및 파젯병 (Paget's disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2는 알부민이 결합되지 않은 Slit3 단백질의 LRRD2와 동일한 세포학적 효능을 나타내고, 알부민이 결합되지 않은 Slit3 단백질의 LRRD2와 비교하여 생체 내 반감기가 현저하게 증가되어 골 관련 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 알부민이 Slit3 LRRD2의 N-말단에 결합된 융합 단백질의 구성 및 이의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 SP 시스타틴 S-HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질을 분리 정제 후 SDS-PAGE를 시행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 형태의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 수용체 결합능을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 형태의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 처리에 따른 조골세포의 이동능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 형태의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 처리에 따른 파골세포의 분화능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein) 처리에 따른 조골세포의 이동능(A), 조골세포의 β-카테닌 활성(B) 및 파골세포 분화능(C)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 단식시킨 수컷 ICR 마우스에서 Slit3 LRRD2 (●, "Slit3")와 HSA-Slit3 LRRD2 (■, "HSA-Slit3")의 IV 투여 후 Slit3 LRRD2의 혈장 농도 시간 프로파일을 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, Slit3 단백질의 LRRD2는 세포 및 동물모델에서 골 형성을 증가시키고, 골 흡수를 감소시킴으로써 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있으나, 생체 내 반감기가 매우 짧아 이의 약효가 발휘되기 위해서는 투여 주기가 짧아질 수 밖에 없고, 이에 따른 과도한 약제 사용으로 효능이 감소되는 문제가 발생할 것으로 예상되었다.
이에 본 발명자들은 LRRD2의 생체 내 반감기를 증진함으로써 이의 효능을 개선시킨 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)을 개발함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2는 알부민의 결합되지 않은 Slit3 단백질의 LRRD2와 동일한 세포학적 효능을 나타내고, 알부민이 결합되지 않은 Slit3 단백질의 LRRD2와 비교하여 생체 내 반감기가 현저하게 증가되어 골 관련 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 알부민이 결합된 Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 골 관련 질환예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, "Slit3 단백질의 LRRD2"는 Slit3 단백질 내의 두 번째 류신 풍부 반복 도메인(leucine rich repeat domain, LRRD2)을 말한다.
본 발명에서, 용어 "Slit3 LRRD2"는 "Slit3 단백질의 LRRD2"를 의미하며, 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 래서스(rhesus) 혈청 알부민 (RhSA), 시노몰구스 원숭이(cynomolgous monkey) 혈청 알부민 (CySA), 또는 뮤린(murine) 혈청 알부민 (MuSA)일 수 있고, 바람직하게는 인간 혈청 알부민일 수 있다. 상기 Slit3 LRRD2는 인간 혈청 알부민 존재 하에 Slit3 LRRD2의 생체 내 반감기는 인간 혈청 알부민 부재 하에서의 Slit3 LRRD2의 생체 내 반감기보다 적어도 적어도 10배 이상 더 길다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서, 인간 혈청 알부민 존재 하의 Slit3 LRRD2의 혈청 반감기는 인간 혈청 알부민 부재 하의 Slit3 LRRD2보다 14배 더 길다.
본 발명의 약학 조성물에서, 인간 혈청 알부민과 Slit3 LRRD2는 인간 혈청 알부민 및 Slit3 LRRD2의 순서로 결합되거나, 그 반대일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈청 알부민 및 Slit3 LRRD2의 순서로 결합된다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민이 Slit3 LRRD2의 N 말단에 결합하는 경우, Slit3 LRRD2의 생체 내 반감기 및 이의 골 관련 질환의 치료효능이 가장 우수하며, 인간 혈청 알부민이 C 말단에 결합하는 경우, 정도의 차이가 있을 수 있으나 유효한 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민은 609개의 아미노산으로 이루어진 전장 또는 이의 일부 아미노산 서열을 포함하는 단편으로 사용될 수 있다. 인간 혈청 알부민의 전장 아미노산 서열은 NCBI GenBank: AAA98797.1에 개시된 것으로, 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 609개의 아미노산으로 이루어진 전장의 인간 혈청 알부민에서 25번째 내지 609번째의 아미노산(585개의 아미노산)으로 이루어진 단편의 형태를 사용하였다. 본 발명의 약학 조성물에서, 인간 혈청 알부민은 하기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진다:
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (서열번호 2).
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 Slit3 LRRD2는 인간 유래이며, 1523개의 아미노산으로 이루어진 Slit3 단백질 내의 LRRD2의 전장 또는 이의 일부 아미노산 서열을 포함하는 단편으로 사용될 수 있다. Slit3 단백질의 전장 아미노산 서열은 NCBI GenBank: AAQ89243.1에 개시된 것으로, 본 발명의 구체적인 일실시예에서 Slit3 LRRD2는 1523개의 아미노산으로 이루어진 전장의 Slit3 단백질에서 278번째 내지 486번째의 아미노산(209개의 아미노산)으로 이루어진 단편의 형태를 사용하였다. 본 발명의 약학 조성물에서 Slit3 LRRD2는 하기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진다:
ISCPSPCTCSNNIVDCRGKGLMEIPANLPEGIVEIRLEQNSIKAIPAGAFTQYKKLKRIDISKNQISDIAPDAFQGLKSLTSLVLYGNKITEIAKGLFDGLVSLQLLLLNANKINCLRVNTFQDLQNLNLLSLYDNKLQTISKGLFAPLQSIQTLHLAQNPFVCDCHLKWLADYLQDNPIETSGARCSSPRRLANKRISQIKSKKFRCS (서열번호 3).
본 발명의 약학 조성물에 있어서, "Slit3 LRRD2"는 서열번호 3의 아미노산 서열과의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.
상기 "기능적 동등물"은 단백질 또는 펩티드의 아미노산 부가, 치환 또는 결실로 인해, 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열로 구성된 단백질 또는 펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 말한다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 융합 단백질은 이의 야생형 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체 또한 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 상기 아미노산 서열 변이체란 Slit3 LRRD2의 야생형 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질 또는 펩티드를 의미한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서 가능한 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
본 발명의 Slit3 LRRD2, 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 알부민과 Slit3 단백질의 LRRD2 사이에는 링커가 추가로 포함될 수 있다. 바람직한 링커의 종류로는 (GGGGS)n (서열번호 5)일 수 있고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수일 수 있으며, 바람직하게는 n은 1 내지 5의 정수 일 수 있다.
본 발명의 Slit3 LRRD2는 이의 생체 내 반감기를 증진시키기 위해, 알부민 융합 이외에도 IgG의 Fc 단백질 융합 또는 페길레이션(PEGylation) 등이 수행될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 융합 단백질은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 HSA-Slit3 LRRD2를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 외용제의 제형으로 제공할 수 있다. 본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환은 골 흡수 증가 또는 골 형성 감소, 예를 들어 골 형성이 골 흡수보다 적어지면서 골량이 감소하여 발생할 수 있는 질환을 의미하며, 골다공증(osteoporosis), 골절, 골 손실, 골관절염(osteoarthritis), 골전이암 및 파젯병 (Paget's disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한, 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품 조성물에 포함되는 유효성분의 구성 및 이의 효과는 전술한 약학 조성물에 대한 것과 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질과 골 관련 질환 예방 및 근 기능 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.
또한, 본 발명의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질은 골 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 골 관련 질환 예방 또는 개선 효과를 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질과 함께 골 관련 질환에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에 사용된 약어 및 이의 의미는 아래 표 1에 나타낸 바와 같다.
CL Systemic plasma clearance
T1/2 Terminal half-life
Vss Steady state volume of distribution
IV Intravenous
PO Per oral
Cmax Maximum plasma concentration observed
Tmax Time to Cmax
AUC0-∞ Total area under the plasma concentration time curve from zero to infinity
AUC0-t Area under the plasma concentration time curve from zero to the last quantifiable time point
MRT Mean residence time
BA Estimated bioavailability
BQL Below Quantification Level
HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질(HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 제조
PC DNA 3.1 벡터 SP 시스타틴 S-HSA-Slit3 LRR D2-FLAG DNA 1.6mg/ml를 Expi293F 현탁액 세포에 트랜스펙션시켜 발현을 진행하였다. 125ml 293F 세포 현탁액에서 세포를 4.5 ~ 5×106 세포/ml까지 배양하고 배지만 새로 교체한 후, 엑스피펙타민(Expifectamine) 400μl와 Opti-mem 7.5ml(A 샘플)을 상온에서 5분 반응 하고, DNA 150ug, Opti-mem 7.5ml(B 샘플)을 상온에서 5분 반응 후 A와 B 샘플을 서로 섞어 20분 상온 반응하여 트랜스펙션을 진행 하였다. 24시간 후, 인핸서 1과 2를 섞어 처리한 후, 7일 동안 배양하였다.
7일된 배양액을 원심분리기 4℃ 8000rpm에서 20분 동안 세포를 침전시킨 뒤에 상층액을 코닝(corning) 사의 0.22μm 필터로 여과하여 사용하였다. 레진은 시그마(Sigma) 사의 항-FLAG 레진을 사용하여 진행하였다. 레진을 각각 1.2ml씩 사용하였으며 정제는 4℃ 1ml/분 속도에서 진행하였다. TBS (Tris Glycine pH 7.4)를 이용한 워싱 버퍼를 레진의 20배로 흘려 넣어주었다. 용출은 시그마사의 FLAG 펩티드 200μl와 TBS 9.8ml를 섞어 사용하였는데, 분획(fraction) 당 500μl씩 8개를 얻었고, 단백질 분획을 모아 버퍼를 DPBS로 바꿔 농축 한 다음, 농도를 측정하였다.
도 2는 상기 과정으로 융합 단백질을 분리 정제 후 SDS-PAGE를 시행한 결과를 나타낸 것으로, 본 실시예에서 제조된 도 1에 도시된 융합 단백질의 크기가 75 KDa임을 확인하였다.
다양한 형태의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 수용체 결합능 확인
2-1. 다양한 형태의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 제조
실시예 1의 제조방법을 바탕으로, 하기 표 2와 같이 12종의 다양한 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질을 제조하였다. 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 6)을 사용하였다.
융합 단백의 종류 HSA와의 결합 말단 링커
존재 여부		 LRRD2 종류 최종 형태
LRRD2-1 N 말단 없음 단편 (68 a.a.) HSA-단편LRRD2
LRRD2-2 N 말단 없음 중간 (130 a.a) HSA-중간LRRD2
LRRD2-3 N 말단 없음 전장 (209 a.a) HSA-전장LRRD2
LRRD2-4 N 말단 존재 단편 (68 a.a.) HSA-링커-단편LRRD2
LRRD2-5 N 말단 존재 중간 (130 a.a) HSA-링커-중간LRRD2
LRRD2-6 N 말단 존재 전장 (209 a.a) HSA-링커-전장LRRD2
LRRD2-7 C 말단 없음 단편 (68 a.a.) 단편LRRD2-HSA
LRRD2-8 C 말단 없음 중간 (130 a.a) 중간LRRD2-HSA
LRRD2-9 C 말단 없음 전장 (209 a.a) 전장LRRD2-HSA
LRRD2-10 C 말단 존재 단편 (68 a.a.) 단편LRRD2-링커-HSA
LRRD2-11 C 말단 존재 중간 (130 a.a) 중간LRRD2-링커-HSA
LRRD2-12 C 말단 존재 전장 (209 a.a) 전장LRRD2-링커-HSA
상기 12종의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질의 아미노산 서열은 표 3에 나타내었다.
융합 단백의 종류 아미노산 서열 서열번호
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LRRD2-10 MARPLCTLLLLMATLAGALALTSLVLYGNKITEIAKGLFDGLVSLQLLL
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LRRD2-12 MARPLCTLLLLMATLAGALAISCPSPCTCSNNIVDCRGKGLMEIPANLP
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*상기 표 3에서 밑줄로 표시된 서열은 HSA와 LRRD2를 연결하는 GS 링커이며, 볼드체로 표시된 서열은 융합 단백질을 최종 형태로 발현시키기 위해 C-말단에 부가되는 서열을 연결하는 GS 링커이다.
2-2. 다양한 형태의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 수용체 결합능 확인
골 세포에 대한 Slit3 LRRD2의 작용은 Robo1 및 Robo2 수용체를 통해 매개된다. 따라서, 본 실시예에서는 실시예 2-1에서 제조된 12종의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질의 Robo1 수용체 결합능을 확인하였다. 12종의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질과 수용체의 결합능은 ELISA 시스템을 사용하여 정량하였다. 상세한 조건은 다음과 같다.
12종의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질은 분자량을 고려하여 웰 당 0, 1, 10, 100, 1000 nM이 되게 4℃에서 18시간 동안 96-웰 Maxisorp 미량정량판 (microtiter plates) (NUNC사)에 코팅하였다. 코팅된 물질은 0.05% Tween 20이 포함된 PBS (PBST)를 사용하여 3번 세척하였다. 비특이적인 바인딩을 차단하기 위해 1% BSA가 첨가된 PBST로 실온에서 2시간 동안 블러킹을 하였다. 블러킹 버퍼를 제거하기 위해 PBST로 3번 세척하였다. 세척 후 조골세포인 MC3T3-E1 세포주로부터 얻어진 단백 30 ug을 (용해 버퍼 (lysis buffer): 0.5% NP40, 50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.2mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM DTT, 1mM PMSF, 단백분해효소 억제제 칵테일 (Proteinase inhibitor cocktail)) 실온에서 2시간 동안 부착시켰다. PBST를 사용하여 3번 세척한 후 0.1% BSA로 1:1000 희석시킨 Robo1 항체 (abcam: ab7279)를 실온에서 2시간 동안 부착시켰다. PBST를 사용하여 3번 세척한 후 0.1% BSA로 1:2000 희석시킨 HRP 결합 항체 (cell signaling: 7074)를 실온에서 2시간 동안 부착시켰다. PBST를 사용하여 5번 세척한 후 TMB용액으로 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응을 중지시키기 위해 100㎕의 1N H2SO4를 사용하였고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 LRRD2-3과 LRRD2-6의 수용체 결합능이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
다양한 형태의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 세포학적 효능 확인
본 실시예에서는 실시예 2-1에서 제조된 12종의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질의 처리에 따른 조골세포 이동능, 및 파골세포 분화능을 관찰함으로써 이의 세포학적 효능을 확인하였다.
3-1. 조골세포 이동능 측정
세포 이동능 측정을 위해 보이든 챔버 시스템 (transwell, 8um pores)을 사용하였다. 조골세포주인 MC3T3-E1 세포주 (1×105)를 0.2% FBS가 첨가된 MEM-알파 배지에 희석하여 내측 챔버(inner chamber)에 6시간 부착시킨 후 외측 챔버(outer chamber)에 약물을 24시간 처리하였다. 침입된(invaded) 세포들은 고정액(fixing solution)이 포함된 크리스탈 바이올렛 용액을 10분간 처리한 후 광학 현미경으로 세포 개수를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 LRRD2-3의 조골세포 이동능이 가장 우수함을 확인하였다.
3-2. 파골세포의 분화능 측정
6주령의 ICR 마우스 대퇴골과 경골로부터 파골전구세포를 추출한 후 37℃ 배양기에서 18시간 배양하였다. 떠있는 세포들만 모아 30 ng/ml M-CSF와 30 ng/ml RANKL를 처리하여 파골세포로 분화시켰다. 4일 후 TRAP 염색 용액 (Leukocyte acid phosphatase)으로 10분 동안 반응시킨 후 광학 현미경으로 TRAP 염색된 핵이 3개 이상인 다핵세포들을 파골세포로 간주하여 세포개수를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 LRRD2-3과 LRRD2-6의 파골세포 분화 억제능이 나머지 10종의 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질에 비해 우수함을 확인하였다.
HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질(HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 세포학적 효능 확인
본 실시예에서는 실시예 2와 3의 결과를 바탕으로, 세포에서의 효능이 가장 우수한 LRRD2-3를 선정하여, 알부민이 결합되지 않은 Slit3 LRRD2의 조골세포 이동능, 조골세포의 b-카테닌 활성 및 파골세포 분화 억제능과 비교 관찰하였다.
4-1. 조골세포 이동능 측정
세포 이동능 측정을 위해 보이든 챔버 시스템 (transwell, 8um pores)을 사용하였다. 조골세포주인 MC3T3-E1 세포주 (1×105)를 0.2% FBS가 첨가된 MEM-알파 배지에 희석하여 내측 챔버(inner chamber)에 6시간 부착시킨 후 외측 챔버(outer chamber)에 약물을 24시간 처리하였다. 침입된(invaded) 세포들은 고정액(fixing solution)이 포함된 크리스탈 바이올렛 용액을 10분간 처리한 후 광학 현미경으로 세포 개수를 측정하였다.
그 결과, 도 6의 (A)에 나타난 바와 같이 LRRD2-3은 알부민이 결합되지 않은 Slit3 LRRD2와 동일한 정도로 조골세포 이동능을 촉진하였다.
4-2. 조골세포의 b-카테닌 활성 측정
MC3T3-E1 세포주 (2x104/웰)를 24-웰 플레이트에 18시간 배양한 후 100 ng의 8x SuperTOPFlash와 10ng의 레닐라 리포터 플라스미드(Renilla reporter plasmid)를 세포에 형질주입 하였다. 48시간 후 듀얼 루시퍼레이즈 리포터 어세이(Dual luciferase reporter assay) 키트를 사용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 6의 (B)에 나타난 바와 같이 LRRD2-3은 알부민이 결합되지 않은 Slit3 LRRD2와 동일한 정도로 조골세포의 b-카테닌을 활성화하였다.
4-3. 파골세포의 분화능 측정
6주령의 ICR 마우스 대퇴골과 경골로부터 파골전구세포를 추출한 후 37℃ 배양기에서 18시간 배양하였다. 떠있는 세포들만 모아 30 ng/ml M-CSF와 30 ng/ml RANKL를 처리하여 파골세포로 분화시켰다. 4일 후 TRAP 염색 용액 (Leukocyte acid phosphatase)으로 10분 동안 반응시킨 후 광학 현미경으로 TRAP 염색된 핵이 3개 이상인 다핵세포들을 파골세포로 간주하여 세포개수를 측정하였다.
그 결과, 도 6의 (C)에 나타난 바와 같이 LRRD2-3은 알부민이 결합되지 않은 Slit3 LRRD2와 동일한 정도로 파골세포의 분화를 억제하였다.
마우스에서 Slit3 LRRD2 및 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질의 약물동태 연구
약동학 연구는 신약 개발 과정 중의 한 부분으로, 시간에 따른 체내의 약물 농도의 변화평가를 통해 시험 약물의 흡수, 분포, 대사 및 배설에 대한 정보를 얻는 것을 목표로 한다. 본 실시예에서는 Slit3 LRRD2-3 및 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (LRRD2-3)의 1회 정맥투여 후 마우스에서 약물동태 특성을 확인하였다.
5-1. 화학물질 및 용매
본 실시예에서 사용된 카르바마제핀(carbamazepine)은 Sigma Aldrich에서 구입하였고, 아세토니트릴과 메탄올은 HPLC등급으로 J.T. Baker에서 구입하였다.
5-2. 동물 및 투여조건
본 실시예에서는 체중 30~32.5g 범위의 ICR계 웅성 마우스(6주령, ㈜오리엔트바이오, 성남, 대한민국)를 사용하였다. 마우스는 실험 전 4시간 동안 절식하였고, 투여 후 4시간까지 절식을 유지하였다. 사육장은 12시간씩 명암을 주며 적정 온도(20~25℃)및 습도(40~60%)를 유지하였다.
약물동태 시험
투여물질 동물 수 투여 용량
Slit3 LRRD2 4 10 mg/kg
HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3) 3 35 mg/kg
총 계 7 -
Slit3 LRRD2를 1 mg/mL의 용량으로 PBS에 녹여 준비하였다. HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)의 경우, 분자량을 고려하여 3.5 mg/mL의 용량 (Slit3 LRRD2로서 1 mg/mL)으로 PBS에 녹여 준비하였다. 투여 용량은 두 군 모두 10 mL/kg으로, 좌측 미정맥을 통해 투여하였다.
5-3. 약물동태 시험
약물동태 시험의 경우, 절식 시킨 마우스에 Slit3 LRRD2와 HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)를 각각 10 mg/kg 및 35 mg/kg의 용량으로 미정맥을 통해 각각 투여하였다. 투여 후 각각 0.05, 0.12, 0.33, 1, 3, 7, 10, 24, 48, 및 72 시간에 마우스를 손으로 고정한 후 헤파린 코팅된 모세관으로 우측 안와정맥총에서 혈액 70 μL를 채혈하였다. 취해진 혈액은 5분 간 원심분리 한 후 혈장을 분리하여 분석 전까지 -20℃에서 냉동보관 하였다.
5-4. 분석 방법
혈장 시료 중 Slit3 LRRD2의 농도는 HPLC/MS/MS 시스템을 이용하여 정량 하였다. 시료 전처리 전, 혈장 시료는 Ni-NTA 마그네틱 비드를 이용하여 정제하였다. 정제된 Slit3 LRRD2 및 HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)에 6M의 요소와 18 mM의 디티오트레이톨(DTT)을 가해 변성시킨 후, 225 mM의 요오드아세트아미드를 이용하여 알킬화를 유도하였다. 이후, 시그니처 펩타이드(signature peptide)를 얻기 위해, 850 ng의 재조합 돼지 트립신(V5117, Promega, Madison, WI, USA)을 가해 24시간 동안 37℃로 설정된 워터 배스(water bath)에서 반응시켰다. 반응 후 생성된 트립신 소화물 70 μL에 MeOH에 용해한 3%의 포름산 50 μL를 가한 후, 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 이용하여 10분 간 혼합시료를 현탁하고 13,500 rpm에서 10분 간 원심분리 하여 상징액 160 μL을 취해 분석용기에 옮겨 이 중 5 μL를 HPLC/MS/MS 시스템에 주입하여 분석을 진행하였다
상세한 분석조건은 다음과 같다.
- HPLC 시스템: Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)
- 컬럼: ZORBAX® C8 3.5 μm, 2.1*50 mm (Agilent)
- 이동상(Mobile phase):
A: 증류수에 용해한 0.1%의 포름산
B: 아세토니트릴
(등용매용리)
Figure 112020021078464-pat00001
- 유속: 300 μL/min
- 온도: 컬럼에서 20℃, 및 자동샘플기 트레이(autosampler tray)에서 10℃
- 런타임: 5 분
- 검출: 탠덤 사중극자 질량분석기(API 4000, QTRAP®, Applied Biosystems/ MDS SCIEX, Foster City, CA, USA)
- 커튼 가스(curtain gas): 20 psi
- 이온소스 가스 1(ion source gas 1): 50 psi
- 이온소스 가스 2(ion source gas 2): 60 psi
- 이온스프레이 전압(ionspray voltage): 5500 V
- 온도: 600℃
- 다중반응모니터링(multiple-reaction-monitoring, MRM) 모드: 양성
Silt3 LRRD2의 시그니처 펩타이드 (P6)의 분자 이온은 23V의 충돌 에너지(collision energy)에 의해 조각화 되었으며, 충돌 가스(collision gas)는 장비에서 'medium (8 psi)'으로 설정하였다. 이온의 검출은 ESI 양성 MRM 모드로 진행하였고, P6는 m/z 587.97 → 491.50 에서 정량하였다. 검출피크의 적분은 Analyst software version 1.4.2 (Applied Biosystems/MDS SCIEX)을 이용하여 진행하였다. 혈장 중 Silt3 LRRD2의 정량가능범위는 1 ~ 100 μg/mL 이었고, HSA-Silt3 LRRD2 (LRRD2-3)의 경우, 3 ~ 100 μg/mL 이었다. 해당 분석에서 Slit3 LRRD2는 3.29분의 피크 머무름 시간을 나타내었다.
5-5. 데이터 분석
시간에 따른 혈장 중 CNC00000의 농도를 상기 실시예 5-4에 기재된 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 구하고, WinNonlin® 4.2 (Pharsight Corp., Cary, NC, USA) 소프트웨어의 비구획적 분석법(non-compartmental analysis)으로 약동학적 매개변수(PK parameters)를 계산하였다. 최고농도(Cmax)와 최고농도 도달시간(Tmax)은 혈중 약물 농도 대비 시간에 따른 곡선에서 경시적으로 구하였고, 소실속도상수(Ke)는 로그 스케일(log scale)의 최종 단계(terminal phase)에서 선형회귀분석을 통해 계산하였다. 반감기(T1/2)는 LN2를 Ke로 나누어 구하였고, 혈중 약물 농도 대 시간 곡선하면적(AUC0-∞) 및 혈중약물 모멘트 대 시간 곡선하면적(AUMC0-∞)은 선형사다리꼴법(linear trapezoidal rule)과 표준면적 외삽법(standard area extrapolation method)으로 계산하였다. 클리어런스(clearance, CL)와 분포용적(steady state volume of distribution, Vss)는 다음의 [식 1] 내지 [식 3]으로 계산하였다:
[식 1]
Figure 112020021078464-pat00002
[식 2]
Figure 112020021078464-pat00003
[식 3]
Figure 112020021078464-pat00004
5-6. 결과
시간에 따른 혈장 내 Slit3 LRRD2 및 HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)의 농도는 도 7 및 표 5와 6에 나타내었고, 약동학 파라메터는 표 6에 나타내었다. 관련된 파라미터와 모든 값들은 개체 별로 산출한 후 평균으로 나타내었다. 시간에 따른 혈중농도 패턴과 동물실험 기록지를 참고하여 이상이 있는 개체군은 데이터 분석에서 배제하였으며, 데이터 해석에 사용된 실험군은 최소 n=3 이상이 되도록 하였다.
Slit3의 정맥 내 투여 후 혈장 농도
Slit3의 혈장 농도 (μg/mL)
시간 (h) #1 #2 #3 #4 mean S.D.
0.05 122 90.9 97.6 96.7 102 13.8
0.12 62.6 61.4 47.9 59.7 57.9 6.77
0.33 14.1 11.4 12.1 11.0 12.2 1.38
1 0.66 0.48 0.84 0.71 0.67 0.15
3 BQL BQL BQL BQL 0.000 -
7 BQL BQL BQL BQL 0.000 -
10 BQL BQL BQL BQL 0.000 -
24 BQL BQL BQL BQL 0.000 -
*BQL: 정량한계 미만은 "0"으로 처리함.
HSA-Slit3 (LRRD2-3)의 정맥 투여 후 혈장 농도
Slit3의 혈장 농도 (μg/mL)
시간 (h) #6 #7 #8 mean S.D.
0.05 587 460 577 541 70.6
0.12 539 366 480 462 87.9
0.33 355 327 441 374 59.4
1 217 199 262 226 32.4
3 82.8 73.6 98.9 85.1 12.8
7 18.9 18.5 23.4 20.3 2.72
10 9.71 7.64 12.5 9.95 2.44
24 BQL BQL BQL 0.000 -
*BQL: 정량한계 미만은 "0"으로 처리함.
하기 표 7에 확인되는 바와 같이 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (LRRD2-3)은 Slit3 LRRD2 대비 약 14배 개선된 반감기를 나타내었다.
파라미터 Slit3 LRRD2 HSA-Slit3 LRRD2 (LRRD2-3)
평균 S.D. 평균 S.D.
Tmax (h) 0.050 ± 0.000 0.050 ± 0.000
C0 (μg/mL) 153.9 33.25 607.8 59.87
Cmax (μg/mL) 101.8 ± 13.79 541.3 ± 70.61
T1/2 (h) 0.139 ± 0.012 1.993 ± 0.147
AUCall (μg·h/mL) 23.63 ± 2.534 919.9 ± 131.2
AUCinf (μg·h/mL) 23.77 ± 2.530 948.1 ± 136.1
CL (mL/h/kg) 424.0 ± 40.88 10.69 ± 1.504
Vss (mL/kg) 61.46 ± 7.368 24.1 ± 3.293
HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (HSA-Slit3 LRRD2 fusion protein)의 생체 효능 확인
12주령의 SCID 마우스에 4주 동안 알부민이 결합되지 않은 Slit3 LRRD2 또는 HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (LRRD2-3)을 처리하였다. 각 약물은 하루 한번, 주당 5회 정맥 주사로 투여하였고, Slit3 LRRD2는 매일 10 mg, HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (LRRD2-3)은 매일 37.13 mg (Slit3 LRRD2는 매일 10 mg에 해당) 주사하였다. 투여 전후로 소동물용 골밀도를 측정하여 그 변화 폭을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
그룹 BMD 변화 (%) BMC 변화 (%)
대조군 (n = 12) 5.27 ± 1.10 9.51 ± 2.51
Slit3 LRRD2 (n = 12) 6.94 ± 0.83 10.91 ± 2.44
HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (LRRD2-3) (n = 11) 9.03 ± 1.18* 18.78 ± 2.87*
*BMD: bone mineral density, 단위 면적 당 BMC
*BMC: bone mineral content
*P < 0.05, vs. 비처리 대조군
표 8에 나타난 바와 같이, 알부민이 결합되지 않은 Slit3 LRRD2는 BMD 및 BMC가 개선되기는 하였으나 통계적으로 유의하지 않았으며, HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (LRRD2-3)은 BMD 및 BMC를 모두 유의하게 개선시키는 효과를 보였다. 이에 따라, HSA-Slit3 LRRD2 융합 단백질 (LRRD2-3)은 알부민이 결합되지 않은 Slit3 LRRD2 보다 더 강력하게 골 관련 질환에 대한 치료효과를 나타냄을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING <110> DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Composition for preventing or treating bone related disorder comprising HSA-conjugated Slit3 LRRD2 <130> 1067121 <150> KR 10-2019-0023376 <151> 2019-02-27 <160> 18 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SP Cystatin S <400> 1 Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala 20 <210> 2 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HSA <400> 2 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 3 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Slit3 LRRD2 <400> 3 Ile Ser Cys Pro Ser Pro Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys 1 5 10 15 Arg Gly Lys Gly Leu Met Glu Ile Pro Ala Asn Leu Pro Glu Gly Ile 20 25 30 Val Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Ser Ile Lys Ala Ile Pro Ala Gly 35 40 45 Ala Phe Thr Gln Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Ile Asp Ile Ser Lys Asn 50 55 60 Gln Ile Ser Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Lys Ser Leu 65 70 75 80 Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Ile Ala Lys Gly 85 90 95 Leu Phe Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 100 105 110 Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp Leu Gln Asn Leu 115 120 125 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ser Lys Gly 130 135 140 Leu Phe Ala Pro Leu Gln Ser Ile Gln Thr Leu His Leu Ala Gln Asn 145 150 155 160 Pro Phe Val Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Gln 165 170 175 Asp Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Ser Ser Pro Arg Arg 180 185 190 Leu Ala Asn Lys Arg Ile Ser Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys 195 200 205 Ser <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FLAG <400> 4 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GS linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> The amino acid residues at Position 1 to Postion 5 are repeated 1 to 10 times. <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GS linker <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 681 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LRRD2-1 <400> 7 Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys 20 25 30 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 35 40 45 Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn 50 55 60 Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 65 70 75 80 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 85 90 95 Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 100 105 110 Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp 115 120 125 Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys 130 135 140 Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe 165 170 175 Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala 180 185 190 Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu 195 200 205 Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln 210 215 220 Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser 225 230 235 240 Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr 245 250 255 Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu 260 265 270 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln 275 280 285 Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 290 295 300 Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala 305 310 315 320 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys 325 330 335 Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr 340 345 350 Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg 355 360 365 Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 370 375 380 Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 385 390 395 400 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 405 410 415 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 420 425 430 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 435 440 445 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 450 455 460 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 465 470 475 480 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 485 490 495 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 500 505 510 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 515 520 525 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 530 535 540 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 545 550 555 560 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 565 570 575 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 580 585 590 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Leu Thr Ser 595 600 605 Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Ile Ala Lys Gly Leu Phe 610 615 620 Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile 625 630 635 640 Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp Leu Gln Asn Leu Asn Leu 645 650 655 Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ser Lys Gly Leu Phe 660 665 670 Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 675 680 <210> 8 <211> 743 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LRRD2-2 <400> 8 Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys 20 25 30 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 35 40 45 Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn 50 55 60 Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 65 70 75 80 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 85 90 95 Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 100 105 110 Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp 115 120 125 Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys 130 135 140 Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe 165 170 175 Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala 180 185 190 Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu 195 200 205 Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln 210 215 220 Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser 225 230 235 240 Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr 245 250 255 Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu 260 265 270 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln 275 280 285 Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 290 295 300 Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala 305 310 315 320 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys 325 330 335 Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr 340 345 350 Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg 355 360 365 Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 370 375 380 Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 385 390 395 400 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 405 410 415 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 420 425 430 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 435 440 445 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 450 455 460 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 465 470 475 480 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 485 490 495 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 500 505 510 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 515 520 525 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 530 535 540 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 545 550 555 560 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 565 570 575 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 580 585 590 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Ile Val Glu 595 600 605 Ile Arg Leu Glu Gln Asn Ser Ile Lys Ala Ile Pro Ala Gly Ala Phe 610 615 620 Thr Gln Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Ile Asp Ile Ser Lys Asn Gln Ile 625 630 635 640 Ser Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Lys Ser Leu Thr Ser 645 650 655 Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Ile Ala Lys Gly Leu Phe 660 665 670 Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile 675 680 685 Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp Leu Gln Asn Leu Asn Leu 690 695 700 Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ser Lys Gly Leu Phe 705 710 715 720 Ala Pro Leu Gln Ser Ile Gln Thr Leu His Leu Ala Gln Asn Pro Asp 725 730 735 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 740 <210> 9 <211> 822 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LRRD2-3 <400> 9 Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys 20 25 30 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 35 40 45 Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn 50 55 60 Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 65 70 75 80 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 85 90 95 Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 100 105 110 Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp 115 120 125 Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys 130 135 140 Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe 165 170 175 Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala 180 185 190 Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu 195 200 205 Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln 210 215 220 Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser 225 230 235 240 Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr 245 250 255 Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu 260 265 270 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln 275 280 285 Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 290 295 300 Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala 305 310 315 320 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys 325 330 335 Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr 340 345 350 Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg 355 360 365 Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 370 375 380 Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 385 390 395 400 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 405 410 415 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 420 425 430 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 435 440 445 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 450 455 460 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 465 470 475 480 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 485 490 495 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 500 505 510 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 515 520 525 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 530 535 540 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 545 550 555 560 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 565 570 575 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 580 585 590 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Ile Ser Cys 595 600 605 Pro Ser Pro Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys Arg Gly Lys 610 615 620 Gly Leu Met Glu Ile Pro Ala Asn Leu Pro Glu Gly Ile Val Glu Ile 625 630 635 640 Arg Leu Glu Gln Asn Ser Ile Lys Ala Ile Pro Ala Gly Ala Phe Thr 645 650 655 Gln Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Ile Asp Ile Ser Lys Asn Gln Ile Ser 660 665 670 Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Lys Ser Leu Thr Ser Leu 675 680 685 Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Ile Ala Lys Gly Leu Phe Asp 690 695 700 Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile Asn 705 710 715 720 Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp Leu Gln Asn Leu Asn Leu Leu 725 730 735 Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ser Lys Gly Leu Phe Ala 740 745 750 Pro Leu Gln Ser Ile Gln Thr Leu His Leu Ala Gln Asn Pro Phe Val 755 760 765 Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Gln Asp Asn Pro 770 775 780 Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Ser Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn 785 790 795 800 Lys Arg Ile Ser Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys Ser Asp Tyr 805 810 815 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 820 <210> 10 <211> 696 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LRRD2-4 <400> 10 Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys 20 25 30 Asp Leu Gly Glu Glu Asn 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Glu Val Ser Lys Leu Val Thr 245 250 255 Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu 260 265 270 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln 275 280 285 Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 290 295 300 Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala 305 310 315 320 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys 325 330 335 Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr 340 345 350 Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg 355 360 365 Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 370 375 380 Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 385 390 395 400 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 405 410 415 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 420 425 430 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 435 440 445 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys 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Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp 180 185 190 Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His 195 200 205 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp 210 215 220 Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys 225 230 235 240 Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys 260 265 270 Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu 275 280 285 Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala 290 295 300 Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala 305 310 315 320 Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys 325 330 335 Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp 340 345 350 Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys 355 360 365 Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys 370 375 380 Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu 385 390 395 400 Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys 405 410 415 Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met 420 425 430 Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu 435 440 445 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys 450 455 460 Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe 465 470 475 480 Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu 485 490 495 Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val 500 505 510 Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu 515 520 525 Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro 530 535 540 Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu 545 550 555 560 Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val 565 570 575 Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 580 585 590 Ala Leu Glu Val Asp 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Ile Ala Lys Gly Leu Phe Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln 100 105 110 Asp Leu Gln Asn Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln 115 120 125 Thr Ile Ser Lys Gly Leu Phe Ala Pro Leu Gln Ser Ile Gln Thr Leu 130 135 140 His Leu Ala Gln Asn Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe 165 170 175 Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe 180 185 190 Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val 195 200 205 Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala 210 215 220 Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys 225 230 235 240 Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys 245 250 255 Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp 260 265 270 Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met 275 280 285 Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu 290 295 300 Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu 305 310 315 320 Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala 325 330 335 Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp 340 345 350 Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu 355 360 365 Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu 370 375 380 Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val 385 390 395 400 Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu 405 410 415 Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn 420 425 430 Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu 435 440 445 Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro 450 455 460 Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val 465 470 475 480 Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu 485 490 495 Tyr Glu Tyr 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Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val 705 710 715 720 Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu 725 730 735 Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly 740 745 750 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys 755 760 765 Asp Asp Asp Asp Lys 770 <210> 18 <211> 852 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LRRD2-12 <400> 18 Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Ile Ser Cys Pro Ser Pro Cys Thr Cys Ser Asn Asn 20 25 30 Ile Val Asp Cys Arg Gly Lys Gly Leu Met Glu Ile Pro Ala Asn Leu 35 40 45 Pro Glu Gly Ile Val Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Ser Ile Lys Ala 50 55 60 Ile Pro Ala Gly Ala Phe Thr Gln Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Ile Asp 65 70 75 80 Ile Ser Lys Asn Gln Ile Ser Asp Ile Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly 85 90 95 Leu Lys Ser Leu Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu 100 105 110 Ile Ala Lys Gly Leu Phe Asp Gly Leu Val Ser Leu Gln Leu Leu Leu 115 120 125 Leu Asn Ala Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gln Asp 130 135 140 Leu Gln Asn Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr 145 150 155 160 Ile Ser Lys Gly Leu Phe Ala Pro Leu Gln Ser Ile Gln Thr Leu His 165 170 175 Leu Ala Gln Asn Pro Phe Val Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala 180 185 190 Asp Tyr Leu Gln Asp Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Ser 195 200 205 Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn Lys Arg Ile Ser Gln Ile Lys Ser Lys 210 215 220 Lys Phe Arg Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys 245 250 255 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 260 265 270 Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn 275 280 285 Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 290 295 300 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr 305 310 315 320 Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala 325 330 335 Lys Gln Glu 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Claims (9)

  1. 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 Slit3 단백질의 LRRD2는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골절, 골 손실, 골관절염(osteoarthritis), 골전이암 및 파젯병 (Paget's disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin)인, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민은 Slit3 단백질의 LRRD2의 N-말단에 결합되는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 알부민과 Slit3 단백질의 LRRD2 사이에 링커를 추가로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 링커의 아미노산 서열은 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n이고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수인, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 주사제로 투여되는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 삭제
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