KR101590452B1 - 펩타이드 defb124를 유효성분으로 포함하는 면역증강 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드 DEFB124의 면역증강 및 암세포 증식 억제효과에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 면역증강 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드 DEFB124를 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역증강 효과 및 암세포 증식 억제효과가 있어, 암 예방 또는 치료에 효과적이다.

Description

펩타이드 DEFB124를 유효성분으로 포함하는 면역증강 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for enhancing immune response and preventing or treating cancer comprising peptide DEFB124}

본 발명은 펩타이드 DEFB124의 면역증강 및 암세포 증식 억제효과에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 면역증강 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 현재 한국에서 사망원인 1위를 차지하는 질병이며, 그 비중 또한 해마다 높아지고 있다. 암 정복을 위하여 많은 연구자들이 부단히 노력한 결과 암의 발생 기작이 많이 알려지고 새로운 항암제들이 개발되고 있으나 현재 사용 중인 화학요법 항암제들은 부작용, 내성 및 낮은 약효 등 많은 문제점을 가지고 있어 암을 완전히 극복하지 못하고 있다. 따라서 이러한 문제점을 극복할 수 있는 새로운 항암제의 개발이 절실하며 최근 들어 국내외 연구진들은 기존의 문제점을 해결할 수 있는 방안으로 host defense peptide에 주목하고 있다.

Host defense peptide는 자연면역체계(innate defense system)의 일원으로 모든 생물체가 가지고 있는 5~50개의 아미노산으로 구성된 작은 크기의 펩타이드로서 주로 양전하를 띠며 양친화성 α-나선구조를 가지는데, 이러한 구조적인 특성으로 인해 세포막의 지질성분에 대한 친화력을 나타내어 세포막 지질과 결합하여 미생물의 세포막의 전위를 변화시키거나, 세포막 자체에 구멍을 내어 세포막을 파괴하며 일부는 세포막내로 들어간 다음 세포내 타깃을 공격하여 세포 기능을 마비시킴으로서 항균 활성을 나타낸다.

Host defense peptide들 중 일부는 항균 활성뿐만 아니라 암세포막을 파괴하거나 암세포 내로 들어가 세포사멸(apoptpsis)을 유발하여 암세포를 파괴하는 항암 펩타이드로 작용한다. 뿐만 아니라 이들은 기존 화학요법인 항암제와는 달리 다약제 내성의 영향을 받지 않아 신규 항암제로의 개발이 아주 유망하다.

현재 항암제는 대부분 외국 제약회사가 독점 개발한 것이며 고가로 인해 환자에게 커다란 경제적 부담이 되고 있다. 또한 국가차원에서 볼 때도 대부분의 의약을 외국에 의존하기 때문에 엄청난 경제적 손실을 야기한다. 항암 펩타이드를 이용한 암 치료제는 아직 연구 단계로 제품화 된 것이 없으며 따라서 이를 개발할 경우, 새로운 항암제 시장을 선점할 수 있으므로 관련 연구가 시급한 실정이다. (보건복지부, ‘항암펩타이드의 작용기작 연구 및 이를 이용한 신규 암 치료제의 개발’과제 최종보고서,2010)

인체 및 포유류 동물에서 두 종류의 주요 항균펩타이드인 defensins와 cathelicidins가 존재하며, 이 중 defensins는 6개의 매우 잘 보존된 cysteine 잔기와, 이들이 형성하는 3개의 disulfide 결합으로 연결된 구조로 알려져 있다.

아미노산 서열의 상동성과 6개의 cysteine 잔기들의 연결성에 기초하여, defensins는 α, β, 그리고 θ, 3 종류의 구조적 가계로 분류되며, 인체에는 α-와 β-defensins만이 존재한다. 수많은 종류의 인체 β-defensins가 존재하며, 이들은 다양한 형태의 상피세포에 분포하고 있을 것으로 여겨지나, 비교적 소수의 인체 β-defensins만이 단백질 수준에서 밝혀져 있다. 현재까지 28개의 인체 β-defensins가 발견되었으며, 이 중 전체 인간 유전체의 BLAST 탐색에 연결된 hidden Markov chain 모델에 근거해서 새로운 인체 β-defensins의 멤버인 DEFB124가 확인되었지만, DEFB124의 구체적인 기능은 현재 알려져 있지 않다.

본 발명자들은 펩타이드 DEFB124의 면역증강 효과 및 암세포 증식 억제효과를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 N 말단에 신호 펩타이드가 추가로 포함된, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 EFKRCWKGQGACQTYCTRQETYMHLCPDASLCCLSYALKPPPVPKHEYE (서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 신호 펩타이드가 추가된 서열은 MTQLLLFLVALLVLGHVPSGRSEFKRCWKGQGACQTYCTRQETYMHLCPDASLCCLSYALKPPPVPKHEYE (서열번호 2)로 표시될 수 있다.

수많은 종류의 인체 β-defensins가 존재하며, 이들은 다양한 형태의 상피세포에 분포하고 있을 것으로 여겨지나, 비교적 소수의 인체 β-defensins만이 단백질 수준에서 밝혀져 있다. 현재까지 28개의 인체 β-defensins가 발견되었으며, 이 중 전체 인간 유전체의 BLAST 탐색에 연결된 hidden Markov chain 모델에 근거해서 새로운 인체 β-defensins의 멤버인 DEFB124가 확인되었다.

본 발명자들은 이전에 Toll-like receptor(TLR) agonists를 처리한 RWPE-1 세포주에서 Illumina HumanHT-12 microarray를 이용하여, 차등적으로 발현되는 인체 β-defensins의 리스트를 확보한 바 있다. 특히 다른 TLR agonists를 처리한 RWPE-1 세포주들에 비해 PGN(peptidoglycan)을 처리한 RWPE-1 세포주에서 유의미하게 높은 수준으로 발현이 증가한 DEFB124(β-defensin 124) 유전자를 발견하여, DEFB124가 수행하는 기능을 조사하였다. DEFB124는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 펩타이드 DEF124는 NF-κB의 활성화에 의해 발현이 증가될 수 있다.

이와 같은 효과는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.

본 발명의 일실시예에서는 PGN(peptidoglycan)에 의해 유도되는 NF-κB 활성화를 통한 DEFB124의 발현 증가 및 DEFB124 상향조절에 의한 cytokines/chemokines 유전자 발현 증가를 확인하였다. 그 결과, NF-κB가 PGN에 의한 DEFB124 발현 증가의 직접적인 조절인자이며, DEFB124 상향조절에 의해 cytokines/chemokines 유전자들이 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다(<실험결과> 1 내지 2 및 도 1a 내지 3c 참조).

나아가 DEFB124에 의해 유도된 cytokines/chemokines에 의한 monocytes의 migration을 확인한 결과, DEFB124가 상향조절 된 군에서 control군에 비하여 2.6배가 증가되는 것을 확인하였다(<실험결과> 3 및 도 4 참조). 이와 같은 결과를 통하여 DEFB124가 감염 부위에 면역세포들을 집합시킴으로써 선천면역과 적응면역 사이를 매개할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 N 말단에 신호 펩타이드가 추가로 포함된, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기의 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에서는 DEFB124의 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다. DEFB124의 암세포 증식 억제 효과를 알아보기 위해, DEFB124-DDK-Myc 벡터를 전립선암 세포주 PC-3에 과발현시킨 후, MTT assay를 수행하여 DEFB124에 의한 암세포 증식 억제 효과를 관찰한 결과, DEFB124 과발현 군에서 암세포의 증식이 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다(<실험결과> 4 및 도 5 참조).

따라서, 본 발명은 상기 펩타이드 DEFB124를 유효성분으로 포함하는 면역증강 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “면역증강”은 생체 내 면역시스템의 면역 반응 또는 활성을 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 펩타이드 DEFB124를 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 1000mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 펩타이드 DEFB124를 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역증강 효과 및 암세포 증식 억제효과가 있어, 면역증강용 조성물로 유용하게 이용될 수 있으며 암 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

도 1a는 RWPE-1 세포주에서 PGN(peptidoglycan)에 의해 유도되는 DEFB124의 발현량을 RT-PCR로 측정한 결과이다(Control : 무처리군; PGN : peptidoglycan 처리군).
도 1b는 PGN(peptidoglycan)을 처리한 RWPE-1 세포주에서 I-κB의 인산화를 western blot으로 측정하여, NF-κB의 활성을 확인한 결과이다.
도 1c는 PGN(peptidoglycan)을 처리한 RWPE-1 세포주에서 IKK(IκB kinase) 저해제인 Bay11-7082를 함께 처리하여, NF-κB의 활성저해에 의한 DEFB124의 발현량을 ELISA로 측정한 결과이다(Control : 무처리군; PGN : peptidoglycan 처리군; PGN+Bay11-7082 : PGN 및 Bay11-7082 처리군).
도 1d는 PGN(peptidoglycan)을 처리한 RWPE-1 세포주에서 IKK(IκB kinase) 저해제인 Bay11-7082를 함께 처리하여, NF-κB의 활성저해에 의한 DEFB124의 발현량을 immunocytochemistry 방법으로 측정한 결과이다(Control : 무처리군; PGN : peptidoglycan 처리군; PGN+Bay11-7082 : PGN 및 Bay11-7082 처리군).
도 1e는 PGN(peptidoglycan)을 처리한 RWPE-1 세포주에서 DEFB124 프로모터에 결합한 NF-κB/p65 단백질 레벨을 ChIP(Chromatin immunoprecipitation) 분석하고, qPCR 방법으로 정량분석 한 결과의 그래프이다(Control : 무처리군; PGN : peptidoglycan 처리군; Negative control : normal rabbit IgG 처리군; ** : consensus NF-κB binding sequences (CBS)와 다른 site).
도 2a는 RWPE-1 세포주에서 재조합 발현 벡터인 DEFB124-DDK-Myc과 empty vector를 각각 transfection시킨 결과를 RT-PCR(왼쪽) 및 qPCR(오른쪽)로 조사한 결과이다.
도 2b는 RWPE-1 세포주에서 재조합 발현 벡터인 DEFB124-DDK-Myc과 empty vector를 각각 transfection시킨 결과를 Western blot으로 조사한 결과이다.
도 3a는 재조합 발현 벡터 DEFB124-DDK-Myc를 transfection시킨 RWPE-1 세포주에서 IL-1α, IL-1β, IL-6 및 IL-12α의 발현량을 qPCR로 확인한 결과이다.
도 3b는 재조합 발현 벡터 DEFB124-DDK-Myc를 transfection시킨 RWPE-1 세포주에서 CCL5, CCL20, CCL22 및 CXCL8의 발현량을 qPCR로 확인한 결과이다.
도 3c는 재조합 발현 벡터 DEFB124-DDK-Myc를 transfection시킨 RWPE-1 세포주에서 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12α, CCL2, CCL5, CCL22 및 CXCL8의 발현량을 ELISA로 확인한 결과이다(Negative control : 비처리군; pCMV6 : empty vector; DEFB124-DDK-Myc : DEFB124-DDK-Myc vector 처리군).
도 4는 DEFB124를 통해 유도된 cytokines/chemokines에 의한 THP-1 monocytes의 migration을 Transwell assay를 이용하여 확인한 결과이다(MCP-1 : positive control).
도 5는 재조합 발현 벡터 DEFB124-DDK-Myc를 transfection시킨 PC-3세포주에서 DEFB124의 암세포 증식 억제 효과를 MTT assay로 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험재료 및 방법>

1. RWPE-1 세포 배양

인간 전립선 상피 세포주 RWPE-1은 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 구입하였다. RWPE-1 세포는 Keratinocyte-SFM(K-SFM, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 배지에 0.05 mg/mL의 bovine pituitary extract (BPE)와 5 ng/mL epidermal growth factor (EGF)를 추가하고, 5% CO₂에서 배양하였다. 세포의 자극에 사용된 PGN(peptidoglycan)은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.

2. RNA 분리 및 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)

RWPE-1 세포의 전체 RNA를 RNeasy Kit(Qiagen, Hilden, Germany)로 분리한 후, First-strand synthesis system(Promega Co., Madison, WI, USA)을 이용해서 cDNA를 합성하였다. PCR 반응 조건은 94℃, 5분에 이어서 94℃, 30초, 64℃, 30초, 그리고 72℃, 30초로 이뤄진 싸이클 총 35회, 마지막으로 72℃, 5분으로 구성하여 행하였다. DEFB124 mRNA의 레벨은 β-actin 유전자 (ACTB)의 발현량으로 보정하였다. 본 발명에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

human DEFB124 프라이머 서열

서열번호	프라이머명	염기서열	길이(bp)
3	human DEFB124 forward	5’-ATGTGCCATCAGGGAGAAGT-3’	131
4	human DEFB124 reverse	5’-TGCATAGGAGAGACAGCACA-3’	131
5	β-actin(ACTB) forward	5’-CCATCGAGCACGCATCGTC-3’	375
6	β-actin(ACTB) reverse	5’-CTCGGTGAGGATCTTCATGA-3’	375

3. Quantitative real - time PCR ( qPCR )

모든 qPCR 분석은 Rotor-Gene Q 기기(Qiagen)와 QuantiTect Primer Assay 키트(Qiagen)를 이용하여 수행하였다. cDNA 반응물은 Rotor-Gene SYBR Green PCR 키트(Qiagen)를 사용해 합성되었으며, 반응 싸이클 조건은 95℃ 5분에 이은 95℃ 5초, 그리고 60℃ 10초의 단일 형광 측정 40 싸이클로 구성되어 수행하였다. 상기 실험에 사용한 프라이머는 Qiagen 사에서 구입하여 사용하였으며, 측정된 mRNA의 레벨은 β-actin 유전자의 발현량으로 보정하였다.

4. Western blot

세포 추출물 내의 단백질들을 10% SDS-PAGE 젤에서 분리한 후, nitrocellulose membrane(Bio-Rad Laboratories Inc.)으로 이동시키고, 상기 membrane을 5% 탈지 분유로 blocking한 후, 토끼 anti-IκBα 항체(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), 토끼 anti-phospho-IκBα 항체(Cell Signaling Technology Inc.), 염소 anti-DEFB124 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA)와 생쥐 monoclonal anti-ACTB 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.)와 각각 반응시켰다. 항체와 반응시킨 membranes를 TBST 용액으로 씻은 후, enhanced chemiluminescence detection system(Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, USA)으로 결합한 항체들을 확인하였다.

5. Immunocytochemistry

RWPE-1 세포를 유리 coverslip에서 배양한 후, 4% formaldehyde로 고정하고, 0.1% Triton X-100 용액으로 permeabilizaton시켰다. 3% BSA(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 2시간 동안 blocking 후, DEFB124 항체를 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰다. Washing 이후에 FITC-conjugated anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology)와 반응시키고, coverslip을 Fluorescence Mounting Medium(DAKO, Carpinteria, CA, USA)에 위치하여 공초점현미경으로 형광 패턴을 분석하였다.

6. 재조합 DEFB124 생산

본 발명에서는 C-말단에 DDK(FLAG)-Myc가 태그된, DEFB124 발현 벡터인 DEFB124-DDK-Myc(RC217724)와 empty vector인 pCMV6-Entry vector(PS100001)를 ORIGENE사에서 구입하여 사용하였다. DEFB124-DDK-Myc와 empty vector를 RWPE-1 세포에 각각 transfection 시키고 24시간 후, G418이 포함된 선택 배양액으로 배지를 교체하였다. 일주일 경과 이후 세포 배양액을 분리, 농축한 후, anti-Myc 항체(Cell Signaling Technology)로 western blot을 수행하여 재조합 DEFB124 단백질의 생산을 확인하였다. 본 발명의 재조합 DEFB124 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

6. ELISA

Human Inflammatory Cytokines Multi-Analyte ELISArray 키트(Qiagen)와 Human Common Chemokines Multi-Analyte ELISArray 키트(Qiagen)를 이용해 각각 cytokines와 chemokines의 양을 측정하였다. 96-well plate에 배양액을 담고, 탐지 항체를 1시간 동안 반응시킨 후, avidin-horse radish peroxidase 반응 결과를 OD₄₅₀에서 측정하여 정량분석을 수행하였다.

7. Chromatin immunoprecipitation( ChIP )

본 실험은 chromatin immunoprecipitation(ChIP) assay kit (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA, USA)의 프로토콜에 따라 수행되었다. 2 x 10⁷의 RWPE-1 세포를 1% formaldehyde로 고정하고, SDS lysis buffer에 푼 후, sonication을 통해 chromatin을 절단화 시켰다. Protein G agarose로 pre-clearing 한 후, 세포 추출물에 1 μg의 NF-κB/p65 항체(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA)를 넣고 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응 후에 Proteinase K 처리를 통해 chromatin의 cross-linking을 제거한 뒤, DNA만을 분리 정제하여 qPCR 방법으로 정량분석을 수행하였다.

8. Monocyte chemotaxis assay

THP-1 monocytes를 serum-free RPMI-1640 배지(Sigma-Aldrich Co.)에서 24시간 동안 배양한 후, 1 x 10⁶ THP-1 monocytes를 Transwell이 포함된 24-well plates (Corning Costar, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)의 상층에, 그리고 empty vector 또는 DEFB124-DDK-Myc을 transfection 시킨 RWPE-1 세포로부터 각각 50배로 농축한 배양액으로 이뤄진 chemoattractant suspension을 하층 chamber에 위치시켰다. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)은 positive control로 사용되었다. 37℃에서 24시간 방치한 후, Transwell의 하층 chamber로 이동한 cells의 수를 trypan blue dye exclusion 방법으로 측정하였다.

9. cell proliferation assay

DEFB124-DDK-Myc와 empty vector를 RWPE-1 세포에 각각 transfection 시키고 24시간 후, 2 x 10⁴ 의 RWPE-1 세포를 100 μl의 배양액에 섞어 96-well plates(NUNC)에 분주한 후 24시간 배양하였다. 각 well에 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, USA)을 10 μl씩 넣어 반응시킨 후 OD₄₅₀에서 측정하여 정량분석을 수행하였다.

<실험결과>

1. PGN ( peptidoglycan )에 의해 유도되는 NF -κB 활성화를 통한 DEFB124 의 발현 증가

PGN에 의해 유도되는 DEFB124의 발현량을 확인하기 위해 RT-PCR로 조사한 결과, DEFB124의 mRNA가 PGN을 처리한 RWPE-1 세포주에서 높게 발현됨을 확인하였다(도 1a 참조). PGN이 RWPE-1 세포주에서 NF-κB의 활성화를 유도하는지 알아보기 위해, IκBα의 인산화 여부를 Western blot으로 조사한 결과, PGN 처리 5분 후에 IκBα가 인산화 되는 것을 확인하였다(도 1b 참조). 또한 NF-κB의 활성화를 저해하기 위해 IKK(IκB kinase) 저해제인 Bay11-7082(Calbiochem)를 처리하자, PGN을 처리한 RWPE-1 세포주에서 DEFB124의 생산이 감소되는 것을 ELISA 방법으로 확인하였다(도 1c 참조). 이와 같은 결과는 immunocytochemistry 방법을 통하여 다시 확인하였다(도 1d 참조). 따라서 PGN에 의한 DEFB124의 발현 증가는 NF-κB의 활성화를 통해 이뤄지는 것을 상기의 실험결과들을 통해 알 수 있다. 이러한 발현 조절이 NF-κB의 직접적인 작용에 의한 것인지를 밝히기 위해 NF-κB/p65 전사 인자의 ChIP 분석을 수행한 결과, DEFB124 프로모터 (-3,142 ~ -3,152 부위)에 결합한 NF-κB/p65 단백질의 레벨이 PGN을 처리한 RWPE-1 세포주에서 월등하게 높게 나타나는 것을 알 수 있었다(도 1e 참조). 상기와 같은 결과들은 NF-κB가 PGN에 의한 DEFB124 발현 증가의 직접적인 조절인자임을 증명한다.

2. DEFB124 상향조절에 의한 cytokines / chemokines 유전자 발현 증가

RWPE-1 세포주에 재조합 발현 벡터인 DEFB124-DDK-Myc과 empty vector를 각각 transfection시킨 후, DEFB124의 발현 증가를 qPCR과 Western blot으로 조사한 결과, 상향 조절된 DEFB124의 전사체와 단백질 생산을 확인하였다(도 2a 및 도 2b 참조). 이와 같이 증가된 DEFB124가 염증 및 면역 반응에서 중요한 역할을 수행하는 cytokines와 다양한 면역세포들의 이동을 촉진하는 chemokines의 생산을 어떻게 변화시키는지 알아보기 위해 qPCR 분석을 수행하였다. 그 결과 IL-1α, IL-1β, IL-6, 그리고 IL-12α와 같은 cytokines와, CCL5, CCL20, 그리고 CXCL8과 같은 chemokines의 발현이 DEFB124에 의해 상향조절 된 세포에서 증가되는 것을 발견하였다(도 3a 및 도 3b 참조). 이후 상기 cytokines/chemokines의 분비 변화를 ELISA로도 확인한 결과, DEFB124 상향조절에 의해 cytokines/chemokines 유전자들이 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 3c 참조).

3. DEFB124 에 의해 유도된 cytokines / chemokines 에 의한 THP -1 monocytes 의 chemotaxis 촉진 효과

DEFB124를 통해 유도된 cytokines/chemokines에 의해 THP-1 monocytes의 chemotaxis 자극에 반응하여 이동하는 정도를 Transwell assay를 이용하여 확인한 결과, DEFB124가 상향조절 된 군에서 2.6배가 증가되는 것을 확인하였다(도 4 참조). 이와 같은 결과는 DEFB124가 감염 부위에 면역세포들을 집합시킴으로써 선천면역과 적응면역 사이를 매개할 수 있는 가능성을 제시한다.

4. DEFB124 의 암세포 증식 억제 효과

DEFB124의 암세포 증식 억제 효과를 알아보기 위해, DEFB124-DDK-Myc 벡터를 전립선암 세포주 PC-3에 과발현시킨 후, MTT assay를 수행하여 DEFB124에 의한 암세포 증식 억제 효과를 관찰하였다. 그 결과, DEFB124 과발현 군에서 암세포의 증식이 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다(도 5 참조).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 펩타이드 DEFB124를 유효성분으로 포함하는 면역증강 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 펩타이드 DEFB124를 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역증강 효과 및 암세포 증식 억제효과가 있어, 암 예방 또는 치료에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 크다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for enhancing immune response and preventing or treating cancer comprising peptide DEFB124 <130> NP15-0022 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DEFB124 <400> 1 Glu Phe Lys Arg Cys Trp Lys Gly Gln Gly Ala Cys Gln Thr Tyr Cys 1 5 10 15 Thr Arg Gln Glu Thr Tyr Met His Leu Cys Pro Asp Ala Ser Leu Cys 20 25 30 Cys Leu Ser Tyr Ala Leu Lys Pro Pro Pro Val Pro Lys His Glu Tyr 35 40 45 Glu <210> 2 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DEFB124(including signal peptide) <400> 2 Met Thr Gln Leu Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Gly His 1 5 10 15 Val Pro Ser Gly Arg Ser Glu Phe Lys Arg Cys Trp Lys Gly Gln Gly 20 25 30 Ala Cys Gln Thr Tyr Cys Thr Arg Gln Glu Thr Tyr Met His Leu Cys 35 40 45 Pro Asp Ala Ser Leu Cys Cys Leu Ser Tyr Ala Leu Lys Pro Pro Pro 50 55 60 Val Pro Lys His Glu Tyr Glu 65 70 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human DEFB124 forward primer <400> 3 atgtgccatc agggagaagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human DEFB124 reverse primer <400> 4 tgcataggag agacagcaca 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB forward primer <400> 5 ccatcgagca cgcatcgtc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB reverse primer <400> 6 ctcggtgagg atcttcatga 20

Claims (7)

1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 N 말단에 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 면역증강용 조성물.
   
4. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 N 말단에 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제4항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

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