KR20180013616A - 암세포 특이적 억제활성을 가지는 펩타이드, 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암 활성을 가지는 펩타이드에 관한 것으로, 특정 서열로 구성된 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

암세포 특이적 억제활성을 가지는 펩타이드, 및 이의 용도{PEPTIDE WITH CANCER CELL-SPECIFIC INHIBITING ACTIVITY, AND USES THEREOF}

본 발명은 항암 효과가 우수한 신규 펩타이드에 관한 것이다.

암은 제어되지 않는 성장 및 확산을 하는 비정상적 세포로서, 신체의 모든 기관 및 조직에 치명적인 부작용을 야기할 수 있다.

현재 사용되고 있는 항암 치료는 대부분 화학요법에 의한 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 상이하고(The pharmacological Basis of therapeutics, 18: 1202, 1986), 독성에 의한 부작용이 다양하므로 치료시 다양한 문제가 수반된다.

항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하는 반면, 비특이성으로 인해 세포분열이 활발한 정상 조직세포에도 손상을 입힐 수 있으므로 골수기능저하, 위장장애, 탈모증을 유발한다. 또한 암세포는 성장, 증식 및 전이를 일으키는 과정에서 변이로 인해 항암제에 대한 내성을 획득할 수 있다.

따라서 항암제의 정상세포에 대한 독성과 암세포의 약제 저항성을 해결할 수 있는 효과적인 항암제의 개발이 요구되고 있다.

펩타이드 기반의 항암제는 기존의 항암제들과 타겟이 상이하고 다른 항암제의 세포 내 전달을 향상시키므로 단독 사용뿐만 아니라 병용 치료에 있어서 효과적이다.

2010년 기준 치료용 펩타이드 및 단백질은 연간 매출 규모가 590억 달러에 이를 것으로 전망되었으며 이는 2001년 대비 두배를 초과한다. 긍정적인 전망에도 불구하고 펩타이드를 이용한 항암제는 아직 연구단계로서 실용화를 위한 적극적인 노력이 요구된다.

최근 항균성 펩타이드가 생체 내에서 미생물의 침입을 효과적으로 방어할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 기능을 수행할 수 있음이 밝혀졌다. 특히, BMAP-28, HNP-1(β-defensin), 락토페리신 B(Lactoferricin B), LL-37, 마가이닌2(Magainin2), 멜리틴(Melittin), 타치플레신 I(Tachyplesin I)의 세포막 관련 항암 활성이 보고된 바 있으며, 국내에서는 개구린 5, 개구린 6, 카이신 I, 카이신 II 의 암세포 성장 억제 활성이 연구된 바 있다.

펩타이드는 작은 크기로 세포 투과율 및 항암 활성이 우수하므로 질병의 치료제, 특히 항암제로서의 활용 가능성이 높으며, 항암 활성뿐만 아니라 암세포에 대한 특이적 활성을 가지는 신규한 펩타이드에 대한 개발 요구가 증대되고 있는 실정이다.

본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 생체안정성이 우수하며, 암세포 특이적 억제활성이 우수한 신규의 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 항암 펩타이드가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 카스파제-3(caspase-3)의 활성을 증대시킬 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 암세포 내 시토크롬 C(Cytochrome C)의 방출을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 자궁경부암, 대장암, 난소암, 피부암, 폐암, 직장암, 전립선암, 또는 혈액암의 치료용일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포 억제용 조성물이 제공된다.

본 발명에 따르면, 상기 펩타이드는 크기가 작으므로 암세포 내 침투율이 우수하고, 암세포의 증식 및 성장을 효과적으로 억제할 수 있다.

상기 펩타이드는 우수한 암세포 억제 활성으로 기존의 항암제를 대체할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 펩타이드의 암세포 성장 억제능을 평가한 것이다(BrdU incoporation assay).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 펩타이드의 암세포 성장 억제능을 평가한 것이다(MTT assay).
도 3 은 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 펩타이드가 암세포의 세포주기에 미치는 영향을 분석한 것이다(Cell cycle analysis).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 펩타이드의 암세포 증식 억제능을 평가한 것이다(Clonogenic assay).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 펩타이드의 암세포 증식 억제능을 평가한 것이다(Cell migration assay).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 펩타이드가 암세포 내 시토크롬 C의 방출에 미치는 영향을 분석한 것이다(Cytochrome C release assay).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 펩타이드가 카스파제-3의 활성에 미치는 영향을 분석한 것이다(Caspase-3 activation assay).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 펩타이드가 정상세포의 생존률에 미치는 영향을 분석한 것이다(MTT assay).

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.

본 발명의 일 측면은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 항암 펩타이드를 제공한다.

상기 펩타이드(peptide)는 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 하나 이상의 아미노산으로 구성된 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 펩타이드는 항암 활성을 나타내는 펩타이드 또는 이의 단편을 의미할 수 있다.

상기 펩타이드를 명명하는 일반적인 규칙은 구체적으로 지시된 예외사항이 없는 경우 3문자 또는1문자 아미노산 코드를 기초로 할 수 있다. 예컨대, 아미노산 구조의 중심부를 3문자 코드(예컨대, Ala, Lys)로 표시하며, 3문자 코드의 앞에 "D-"를 적음으로써 D-입체형태(예컨대, D-Ala, D-Lys)를 구체적으로 지시하지 않은 경우라면L-입체형태로 가정할 수 있다. 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연아미노산 잔기일 수 있다.

상기 펩타이드는 카스파제-3(caspase-3)의 활성을 증대시킬 수 있고, 암세포 내 시토크롬 C(Cytochrome C)의 방출을 증대시킬 수 있다.

세포자살(apoptosis)은 세포막이나 세포소기관 등이 정상적인 형태를 유지하면서 핵 내의 크로마틴이 응집하고 세포 전체가 위축 및 단편화되어 세포가 파괴되는 자살 기작이다. 세포자살 과정에서 카스파제 및 엔도뉴클레아제의 분비로 인해 세포 단백질이 가수분해된다.

세포자살 신호전달에서 중요한 경로인 카스파제는 단백질 관련 세포 자살 기작에서 중요한 역할을 한다. 상기 카스파제-3는 세포 형태학적 변화와 관련되며, 카스파제의 발현 증가는 세포자살의 증가로 연결될 수 있다.

상기 카스파제-3는 내인성 및 외인성 세포자살 경로의 하류에서 신호 전달의 필수적인 역할을 하며 정상세포에는 영향을 미치지 않고 암세포에만 특이적으로 작용하여 암세포의 세포자살을 유도할 수 있다.

또한, 시토크롬 C(Cytochrome C)는 APAF1(Apoptotic protease activating factor 1)와 상호작용을 하고 카스파제-3 및 세포자살의 주요인자인 PARP(poly-ADP ribose polymerase)의 활성을 증대시킬 수 있다.

상기 펩타이드는 암세포에 작용하여 시토크롬 C이 방출을 유도할 수 있고, 카스파제-3의 활성을 증대시켜 암세포 특이적 세포자살을 유도하므로 암세포를 효과적으로 억제할 수 있다.

특히, 상기 펩타이드는 작은 분자량 및 크기로 인해 세포 내 침투율이 우수하고, 그로 인한 암세포 억제 효과가 뛰어나다.

상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성 구성되거나, 또는 상기 아미노산 서열을 일부로서 포함할 수도 있다.

한편, 상기 펩타이드는 생체 내의 단백질을 추출한 후 단백질 분해효소로 처리하여 저분자량화하거나, 유전자 재조합 및 단백질 발현시스템을 이용하여 생물학적으로 제조할 수 있고, 또는 펩타이드 합성기 등을 이용한 화학 합성 방법으로 제조할 수 있다.

예컨대, 유전자 조작을 통하여 융합파트너 및 상기 펩타이드로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하고, 상기 유전자로 숙주 미생물을 형질 전환시킨 후 숙주 미생물에서 융합 단백질 형태로 발현시킬 수 있다.

상기 융합 단백질은 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 절단 및 분리할 수 있고, 상기 펩타이드가 수득될 수 있다. 구체적으로, Factor Xa 또는 엔테로키나제와 같은 단백질 분해효소, CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 상기 융합파트너 및 상기 펩타이드의 유전자 사이에 삽입할 수 있다.

상기 펩타이드의 N 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)가 결합될 수 있다. 상기 펩타이드는 상기 변형에 의해 안정성이 현저히 개선될 수 있다. 상기 안정성은 in vivo 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성도 포함하는 개념이다. 상기 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호할 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 상기 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 아미노산 서열과 적어도 40% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 상기 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다.

상기 "실질적으로 동질의 생리활성"은 상기 펩타이드의 구조적, 기능적 상동성으로 인한 항암 활성을 의미한다. 상기 서열 상동성은 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 대비하여 결정되며, 비교 영역에서의 일부 핵산 서열이 추가 또는 삭제될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

상기 암은 폐암, 방광암, 유방암, 장암, 신장암, 직장암, 간암, 뇌암, 식도암, 쓸개암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암, 피부(편평상피세포 암종 포함)암, 및 혈액암과 같은 암종; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간충직 발원의 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소건피증, 각화극세포증, 갑상선 여포상암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양일 수 있고, 바람직하게는 자궁경부암, 대장암, 난소암, 피부암, 폐암, 직장암, 전립선암, 또는 혈액암일 수 있다.

상기 “치료”는 치료하고자 하는 대상 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다.

상기 “유효 성분으로 포함하는”은 항암 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 암세포의 증식을 억제하여 암에 의한 증상을 호전시키거나 발명을 완화시킬 수 있을 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염을 형성할 수 있다. 상기 산 부가염은 통상의 방법, 예컨대 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 수혼화성 유기 용매(예컨대, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴)로 침전시켜 제조할 수 있다. 또한, 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예컨대, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나 석출된 염을 흡인 여과할 수 있다.

상기 유리산은 유기산 및 무기산이 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 또는 인산일 수 있으며, 상기 유기산은 구연산(Citric acid), 초산, 젖산, 주석산(Tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(Fumaric acid), 포름산, 프로피온산(Propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콜산, 숙신산(Succinic acid), 4-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 니코틴산, 이소니코틴산, 피콜린산, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 펩타이드는 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 화합물이 조성물로서 투여되는 경우, 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드를 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 상기 펩타이드와 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.　

상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

제조예 : 펩타이드의 제조

9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하는 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)을 이용하여 펩타이드를 합성하였다. N-히드록시벤조 트리아졸(N-hydroxybenzotriazole; HOBt)와 N, N-디아이소프로필카보 디이미드(N, N'-diisopropylcarbodiimide; DIC)를 활성화제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다(Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc-solid phase peptide synthesis', Oxford).

합성된 펩타이드를 C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Waters Associates, USA)를 이용하여 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 μM, Waters Co, USA)을 이용하였다.

상기 방법에 따라 합성된 펩타이드는 하기 표 1과 같다.

구분	서열	비고
실시예 1	AVPSP	서열번호 1(AN-1)
실시예 2	AVPSPPPAS	서열번호 2(AN-2)

실험예 1 : 암세포 성장능 저해 활성 시험

상기 펩타이드가 암세포 성장에 미치는 양향을 분석하고자 BrdU incorporation assay를 수행하였다. 실시예 1 및 2의 펩타이드를 암세포주에 처리하고 성장능을 측정하였다.

BrdU assay 분석을 위하여, 1:1000으로 희석된 BrdU solution을 10μL씩 각 웰에 넣어서 암세포주를 라벨링(labeling) 하였다.

암세포주는 자궁경부암세포주(HeLa), 피부암세포주(SK-MEL-2), 대장암세포주(HCT116), 난소암세포주(SKOV3), 뇌암(U87MG)을 대상으로 하였으며, 상기 펩타이드의 농도를 달리하여 처리하였을 때 암세포의 성장이 농도 의존적으로 감소하였다(도 1).

실험예 2 : 암세포 증식능 억제 활성 시험

상기 펩타이드가 암세포 증식에 미치는 영향을 분석하였다. 자궁경부암세포주(HeLa), 피부암세포주(SK-MEL-2), 대장암세포주(HCT116), 난소암세포주(SKOV3), 뇌암(U87MG)을 대상으로, 상기 펩타이드를 농도를 달리하여 처리한 후 세포 증식이 억제되는지 확인하였다.

상기 펩타이드를 처리한 후 24시간 동안 상기 암세포주를 배양하였고 MTT을 이용하여 viability를 측정하였다. 각 세포주는 상기 펩타이드 처리에 따라 농도 의존적으로 세포의 증식이 억제되었다(도 2).

상기 펩타이드가 암세포주의 증식을 억제하는지 확인하고자 세포주기 분석(Cell cycle analysis)을 수행하였다.

자궁경부암세포주(HeLa), 피부암세포주(SK-MEL-2), 대장암세포주(HCT116), 난소암세포주(SKOV3), 뇌암(U87MG) 세포(3.5×10⁵/mL)에 시료를 처리하여 시간별로 배양한 후, HL-60 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다. 암세포주를 -20 ℃에서 70 % 에탄올로 30분 동안 고정시킨 후, PBS로 세척하였다.

RNase A를 처리한 후 요오드화프로피디움(PI, Sigma)로 염색하고 BD FACSCallibur flow cytometer(BD, USA)로 세포주기를 분석하였다.

상기 펩타이드를 암세포주에 0, 10, 20 μg/mL의 농도로 처리하고 세포주기를 비교한 결과, 농도 의존적으로 sub-G1 hypodiploid 증가되었다. 세포주기는 Sub-G1(세포사멸), G1, G2/M, S 기로 나눌 수 있으며, Sub-G1 phase가 증가할수록 세포사멸이 증가한 것으로 해석할 수 있다(도 3).

또한, 상기 펩타이드가 암세포주의 증식을 억제하는지 확인하고자 집락형성 분석법(clonogenic assay) 을 수행하였다. 암세포는 무한 증식이 가능한 세포로서 하나의 암세포가 계속 증식하여 군집을 형성하므로 군집 형성 개수를 측정하여 증식능을 평가할 수 있다.

암세포주에 상기 펩타이드를 0, 10, 20 μg/mL의 농도로 처리하고 상기 암세포주의 증식을 관찰한 결과, 농도 의존적으로 상기 암세포주의 집락 형성이 억제되었다(도 4).

실험예 3 : 암세포 이동성 억제 활성 시험

상기 펩타이드가 암세포 이동성에 미치는 영향을 분석하고자, 세포이동성 분석(cell migration assay)을 수행하였다.

암세포는 세포 증식이 빠르고 이동성이 높아 생체 내에서 빠르게 확산될 수 있다. 따라서 암세포의 이동성을 억제시킴으로써 암세포의 확산을 저해할 수 있다.

암세포주를 배양접시에 충분히 배양한 후 배양접시의 중앙부에 멸균된 봉을 이용하여 상처(scratch)를 유발하였다. 상기 암세포주를 다시 배양시켜 상처부위의 회복 정도(wound healing)를 분석하였다. 상기 암세포주의 상처부위는 상기 펩타이드의 처리에 따라 농도 의존적으로 회복이 저해되었다(도 5).

상기 결과는 상기 펩타이드가 암세포의 이동성을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사한다.

실험예 4 : 시토크롬 C(Cytochrome C) 방출 촉진 시험

상기 펩타이드가 시토크롬 C의 방출에 미치는 영향을 분석하였다. 암세포주에 상기 펩타이드를 농도를 달리하여 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 상기 세포주를 회수하여 시토크롬 C가 미토콘드리아에서 세포질로의 유출되는 정도를 웨스턴 블랏 분석으로 검정하였다.

암세주를 얼음냉각(ice-cold) PBS로 2회 세척한 후, 부착된 세포들을 플레이트(plate)에서 분리한 후 원심분리(500 x g, 10 min)하였다.

210 mM 만니톨(mannitol), 70 mM 수크로스(sucrose), 20 mM HEPES-KOH(pH 7.4), 50 mM KCl, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 1 mM 디치올트레이톨(dithiothreitol), 0.1 mM 페닐메틸설포닐 풀루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride), 프로테아제 저해제(protease inhibitors, Complete Cocktail; Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)를 포함하는 추출 완충액(extraction buffer) 500 μL에 재현탁 하였다.

세포 현탁액을 얼음에서 30분간 정치한 후 글라스 다운스(glass Dounce) 및 B 페슬(pestle)을 이용하여 균질화하고 원심분리(12,000 x g, 5 min, 4℃) 하였다. 상층액을 분리하고 추가적인 원심분리(10,0000 x g, 30 min, 4℃)를 하여 세포질을 분리하였다.

분리된 세포질로부터 브래드포드법(Bradford method, Bio-Rad)을 이용하여 단백질을 정량하였으며, 세포질 단백질 25 ㎍을 대상으로 하여 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행하였다.

세미-드라이 트랜스퍼 시스템(semi-dry transfer system, Fisher, Suwanee, GA)을 이용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 막으로 전이하고, 막을 5% 탈지유(non-fat dry milk)를 포함하는 TBS(20 mM Tris-HCl, 8 g/L NaCl, pH 7.4)를 이용하여 1시간동안 상온에서 블로킹(blocking)을 수행하였다. 항체는 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse antibody(1:2500 dilution, Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 사용하였다.

블로킹 후에 막(membrane)을 3% 탈지유(non-fat milk)를 포함하는 TBS 완충액에 1 ㎍/mL 1차 모노클로날 항-시토크롬 C 항체(primary monoclonal anti-cytochrome C antibody)를 첨가하고, 4℃에서 일정 시간 반응시켰다.

막을 TBS 완충액으로 3회 세척한 후 콘쥬게이티드 호오스래디쉬 퍼옥시다제(conjugated horseradish peroxidase, 1:10000 dilution, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)를 2차 항체(secondary antibody)로 하여 상온에서 30분간 블로팅을 수행하였다.

막을 TBS 완충액으로 3회 세척한 후 ECLTM (Enhanced Chemiluminescence, Amersham, Piscataway, NJ)로 관찰하였다.

분석 결과 시토크롬 C의 방출은 상기 펩타이드의 처리에 따라 농도 의존적으로 증가하였다(도 6).

실험예 5 : 카스파제-3 억제 활성 시험

상기 펩타이드가 암세포주 내 세포사멸 핵심인자(Caspase-3)의 활성에 미치는 영향을 분석하고자 발광효소분석(luciferase assay)을 수행하였다.

Z-DEVD 말단에 루시퍼레이즈를 결합한 물질을 기질로 하였으며, 활성화된 카스파제-3에 의해 해당 기질이 분해되면 형광값이 증가한다.

분석 결과 카스파제-3의 활성은 상기 펩타이드의 처리에 따라 농도 의존적으로 증가하였다(도 7).

실험예 6 : 세포 독성 시험

상기 펩타이드가 암세포 외 정상세포에 미치는 영향을 분석하였다. 섬유아세포 및 각질형성세포를 대상으로 상기 펩타이드를 처리하고 세포의 생존율(viability)을 분석하였다.

인간각질형성세포(human keratinocyte cell, HaCaT)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였으며, 인간진피섬유아세포(normal Human Dermal Fibroblasts, nHDF)는 Lonza (Switzerland)에서 구득하였다.

각 세포를 1×10⁴ cells/mL의 농도로 24 웰 배양판에 접종하였다. 세포배양액은 Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM; Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco), 10% penicillin(100 unit/mL)과 streptomycin(100 g/mL)을 첨가하여 사용하였다.

상기 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 25 내지 30% 이상 배양되면, 상기 펩타이드가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간동안 추가로 배양하였다.

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물(MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/mL)을 50μL 첨가하고 3시간동안 더 배양한 후 상등액을 제거하였다.

웰 당 200 μL 의 DMSO(Dimethylsulfoxide, Sigma D2650, USA) 용액을 첨가하고 20분간 교반하여 포르마잔(formazan) 결정을 용해시킨 후, 100 μL씩 96 웰에 취하여 570 nm 에서 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)로 흡광도를 측정하였다.

피부 세포의 증식 활성 정도는 정제수를 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

분석 결과 상기 펩타이드는 농도를 증가시켰을 때 세포 생존율은 일부 감소하였으나, 그 정도가 미미하여 암세포와 달리 정상세포에 대한 독성은 거의 나타나지 않는 것으로 확인되었다(도 8).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의해 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의해 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Konkuk University <120> PEPTIDE WITH CANCER CELL-SPECIFIC INHIBITING ACTIVITY, AND USES THEREOF <130> 16PP11247 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AN-1 <400> 1 Ala Val Pro Ser Pro 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AN-1 <400> 2 Ala Val Pro Ser Pro Pro Pro Ala Ser 1 5

Claims (6)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 항암 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   카스파제-3(caspase-3)의 활성을 증대시키는 펩타이드.
3. 제1항에 있어서,
   암세포 내 시토크롬 C(Cytochrome C)의 방출을 증대시키는 펩타이드.
4. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 항암 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   자궁경부암, 대장암, 난소암, 피부암, 폐암, 직장암, 전립선암, 또는 혈액암의 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포 억제용 조성물.
   

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