KR100378949B1 - 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 펩타이드 및그의 유도체 - Google Patents

세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 펩타이드 및그의 유도체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 부착, 확산 및 탈착을 매개하는 펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것으로, 구체적으로 기능적 세포 수용체로서 α3β1 인테그린과 결합하여 세포 부착 활성을 매개하며 세포 부착 및 탈착 활성을 위한 필수적 아미노산으로 아스파르트산(aspartic acid) 및 아이소류우신(isoleusine)을 포함하는 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM 및 그의 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 βig-h3를 포함하는 다양한 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein)에 의해 매개되는 세포 부착 활성 연구 및 창상치유, 조직재생 및 암전이 억제 등에 매우 유용한 세포 부착, 확산 및 탈착을 촉진하는 펩타이드(cell attachment, spreading and detachment-promoting peptide)의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 펩타이드 및 그의 유도체{Peptides and derivatives thereof showing cell attachment, spreading and detachment activity}
본 발명은 세포 부착, 확산 및 탈착을 매개하는 펩타이드 및 그의 유도체에 관한 것으로, 구체적으로 기능적 세포 수용체로서 α3β1 인테그린과 결합하여 세포 부착 활성을 매개하며 세포 부착 및 탈착 활성을 위한 필수적 아미노산으로 아스파르트산(aspartic acid) 및 아이소류우신(isoleusine)을 포함하는 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM 및 그의 유도체에 관한 것이다.
βig-h3은 인간의 흑색소 세포종 세포(human melanoma cells), 포유동물의 상피세포(mammary ephithelial cells), (keratinocytes) 및 허파 섬유아 세포(lung fibroblasts)등을 포함하는 여러 종류의 세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein)이다. βig-h3은 TGF-β를 처리한 인간의 허파 선암 세포(lung adenocarcinoma cells) A549로부터 제조된 cDNA 라이브러리의 스크리닝(differential screening)에 의하여 최초로 분리되었다. βig-h3은 683개의 아미노산으로 구성되며, 카르복실 말단에는 여러 가지 인테그린에 대한 리간드 인식부위로 작용하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열이 존재하고 아미노 말단에는 분비서열이 존재하는 단백질을 코딩한다.
βig-h3 mRNA와 단백질은 여러 세포계에서 TGF-β에 의해 조절되어 그 발현량이 증가하고 TGF-β에 의하여 세포증식이 조절되는 여러 세포계에서 βig-h3 유전자가 유도되기 때문에 βig-h3이 TGF-β의 신호 중 일부를 매개하는데 관여할 것으로 생각된다. 이와는 반대로, 희귀한 골질환인 국한성 유선상과골증(melorheostosis)에 걸린 피부손상 부위로부터 배양된 섬유아세포, 일부 종양세포계 및 덱싸메타손(dexamethasone)으로 처리된 골수 간 세포(stem cells)에서는 βig-h3 발현이 감소되는 것이 보고되었다. 이처럼 βig-h3은 다양한 조직에서 세포외 기질 단백질 및 세포들 사이의 상호작용과 형태 형성에서 중요한 인자로 작용하는 것으로 보인다.
또한, βig-h3은 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)로서 세포 부착(attachment)과 탈착(detachment)을 매개하는 것으로 알려져 있다. 정제된 βig-h3 단백질은 피부 섬유아세포의 부착과 확산을 촉진시키는 한편, 무혈청배지에서 A549, HeLa 및 WI-38 세포의 부착을 저해하였다. 특히, βig-h3은 종양세포의 성장, 콜로니 형성 및 출현을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 실예로 차이니즈 햄스터의 난소 세포(Chinase hamster ovary cells)에 βig-h3 발현벡터를 전이(transfection)시킨 누드 마우스에서 상기 세포들의 종양형성능이 현저하게 감소함이 보고되었다. 또한, 빠르고 효과적인 상처 치유를 위하여 유효한 양의 βig-h3을 상처와 접촉시킴으로써 세포, 특히 섬유아세포가 상처부위에 퍼지고 점착하는 것을 촉진시킬 수 있는 방법이 개발되었다. 따라서, βig-h3은 여러 세포에서 TGF-β에 의해 고도로 유도되는 세포 부착 분자로서 세포 성장(cell growth), 세포 분화(cell differentioa), 창상 치유(wound healing), 형태 형성(morphogenesis) 및 세포 부착(cell adhesion)에 있어 매우 중요한 역할을 담당한다.
βig-h3은 RGD 모티프와 함께 상동성을 지닌 4개의 내부 반복 도메인(internal repeated domain)을 포함하는데, 이들은 포유류, 곤충, 섬게, 식물, 효모 및 세균을 포함하는 여러 종의 분비 단백질 또는 막 단백질에서 매우 보존적인 서열로서 발견된다. 상기 보존적 서열을 포함하는 단백질들에는 페리오스틴(periostin), 파스시클린 Ⅰ(fasciclin Ⅰ), 섬게 HLC-2(sea urchin HLC-2), 알갈-CAM(algal-CAM) 및 마이코박테리움 MPB70(mycobacterium MPB70) 등이 포함된다. 이러한 단백질들에서 보존적으로 발견되는 상동성 도메인(이하 "파스-1( fas-1)"이라 약칭함)은 110 내지 140개의 아미노산으로 구성되며 약 10개의 아미노산으로 구성된 매우 보존적인 두 개의 가지(H1 및 H2)를 포함하고 있다. 상기 단백질들 중 βig-h3, 페리오스틴 및 파스시클린 Ⅰ은 4개의 파스-1 도메인을 가지며, HLC-2는 2개, MPB70은 오직 한 개의 파스-1 도메인을 가지고 있다. 상기 단백질들의 생물학적 기능이 정확하게 밝혀진 것은 아니지만, 이들 중 몇몇이 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)로서 작용함이 보고되었다. 예를 들면, βig-h3, 페리오스틴 및 파스시클린 Ⅰ은 각각 섬유아세포, 골아세포 및 신경세포의 부착을 매개하는 것으로 보고되었으며, 알갈-CAM은 조류 볼복스(Vovolx)의 자층(embryos)에 존재하는 세포 부착 분자임이 밝혀졌다.
이와 같이 세포 부착 분자로서 βig-h3의 세포 부착 활성은 인간의 피부 섬유아세포(dermal fibroblasts)에서 최초로 보고된 후 연골아세포(chondrocytes), 복막 섬유아세포(peritoneal fibroblasts) 및 인간의 MRC5 섬유아세포 등에서도보고되었다. 이러한 βig-h3의 세포 부착 활성은 초기에는 βig-h3의 C-말단에 존재하는 RGD 모티프에 의해 매개되는 것으로 여겨졌으나, RGD 모티프가 연골아세포의 분산을 촉진하는데 필요하지 않으며, 카르복실-말단 프로쎄싱(carbocyl-terminus processing)에 의해 RGD 모티프가 결실된 성숙한 형태의 βig-h3이 세포 부착을 억제할 수 있음이 보고되면서, RGD 모티프가 βig-h3의 세포 부착 활성을 매개하는데 필수불가결한 요소가 아님이 확인되었다. 또한, 최근의 연구 결과에서 βig-h3은 인테그린 α1β1을 통해 섬유아세포의 분산을 증가시키는 반면, βig-h3의 RGD 모티프는 βig-h3-매개성 세포 분산에 요구되지 않으며 βig-h3 내 보존적 H1 및 H2 펩타이드 역시 βig-h3-매개성 세포 부착에 효과적이지 않음이 보고되었다. 이러한 결과는 βig-h3의 세포 부착 활성을 위한 필수적인 아미노산이 H1 및 H2 지역이 아닌 다른 곳에 존재함을 의미하며, βig-h3의 반복 파스-1 도메인 뿐만 아니라 다른 단백질들의 파스-1 도메인들과의 상동성을 비교한 컴퓨터 분석 결과 역시 H1 및 H2 이외에도 여러개의 매우 보존적인 아미노산이 존재하여 이들이 세포 부착 활성에 관여할 수 있음을 제시하였다.
따라서, 본 발명자들은 세포 부착 및 탈착 활성에 관여하는 보존적 모티프를 밝히고 이를 포함하는 펩타이드를 제조하고자 연구한 결과, 세포 부착 분자로서 알려진 βig-h3의 제 2 및 제 4 도메인을 이용하여 기능적 세포 수용체로서 α3β1 인테그린과 결합하여 세포 부착 및 탈착 활성을 매개하는 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM 및 그의 유도체를 제조하고, βig-h3의 제 2 및 제 4 도메인 내 H2 지역 근처에 위치하는 두 개의 매우 보존적 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, Asp) 및 아이소류우신(isoleucine, Ile)이 세포 부착 및 탈착 활성을 위한 필수적인 아미노산으로 작용함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 보존적 서열을 포함하는 펩타이드 및 그의 유도체를 제공하는 것이다.
도 1a는 βig-h3 파스-1 도메인 유래 재조합 단백질의 모식도를 나타낸 것이고,
도 1b는 βig-h3 파스-1 도메인 유래 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이고,
도 2는 βig-h3 파스-1 도메인 유래 재조합 단백질에 대한 세포 부착 활성을 나타낸 결과이고,
도 3은 βig-h3 파스-1 도메인 유래 재조합 단백질의 세포 부착 활성에 대한 항 인테그린 항체의 억제 효과를 나타낸 결과이고,
도 4는 파스-1 도메인을 포함하는 여러 기질 단백질들의 아미노산 서열을 분석한 결과이고,
도 5a는 βig-h3 제 4 파스-1 도메인의 아미노산을 치환시켜 제조한 돌연변이 단백질의 모식도를 나타낸 결과이고,
도 5b는 βig-h3 제 4 파스-1 도메인의 돌연변이 단백질을 정제하여 15% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행한 결과이고,
도 6은 βig-h3 제 4 파스-1 도메인의 돌연변이 단백질의 세포 부착 활성을 나타낸 결과이고,
도 7은 본 발명에서 제조된 합성 펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 결과이고,
도 8a는 HCE 세포의 세포 부착 활성에 대한 본 발명에서 제조된 합성 펩타이드의 세포 탈착 효과를 나타낸 결과이고,
도 8b는 βig-h3 파스-1 도메인 재조합 단백질의 세포 부착 활성에 대한 본 발명에서 제조된 합성 펩타이드의 세포 탈착 효과를 나타낸 결과이고,
도 9a는 본 발명에서 제조된 합성 펩타이드의 농도별 HCE 세포의 세포 부착 활성을 나타낸 결과이고,
도 9b는 본 발명에서 제조된 합성 펩타이드 EPDIM 및 NKDIL의 세포 부착 활성에 대한 항 인테그린 항체의 억제 효과를 나타낸 결과이고,
도 10a는 다양한 기질 단백질이 코팅된 표면에서 HCE 세포의 세포 부착 활성에 대한 본 발명에서 제조된 합성 펩타이드의 세포 탈착 효과를 나타낸 결과이고,
도 10b는 다양한 기질 단백질의 세포 부착 활성에 대한 본 발명에서 제조된 합성 펩타이드 EPDIM의 농도에 따른 세포 탈착 효과를 나타낸 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α3β1 인테그린을 통하여 세포 부착 활성을 매개하고 세포 부착 및 탈착 활성에 필수적인 모티프(motif)로서 아스파르트산-아이소류우신 잔기를 포함하는 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 세포 부착 및 확산 활성을 나타내는 보존적 서열을 포함하는 펩타이드를 제조하기 위하여, 기존에 세포 부착 활성을 매개한다고 알려진 βig-h3의 아미노산 서열을 이용하였다.
이를 위하여, 본 발명자들은 4개의 파스-1 도메인을 포함하는 βig-h3 단백질 뿐만 아니라 βig-h3의 4개 파스-1 도메인 중 제 2 및 제 4 파스-1 도메인만으로도 세포 부착 활성을 매개할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, βig-h3 각각의 반복 도메인에 대한 4 개의 재조합 단백질 βigh3 D-Ⅰ, βigh3 D-Ⅱ, βigh3 D-Ⅲ 및 βigh3 D-Ⅳ를 제조하여(도 1a참조), 각각의 도메인에 대한 재조합 단백질의 세포 부착 및 확산 활성을 조사하였는데, βig-h3의 4개 파스-1 도메인 중 제 2 도메인과 제 4 도메인이 각 도메인만으로도 세포 부착 및 확산 활성을 매개하며(도 2참조), 상기 두 도메인 내에 세포 부착 및 확산을 매개하는데 필수적인 아미노산이 포함되어 있음을 확인하였다. 반면, βig-h3의 제 1 도메인은 중간 정도의 세포 부착 활성을 나타내고 제 3 도메인은 세포 부착 활성을 전혀 나타내지 않았다.
또한, 본 발명자들은 βig-h3의 제 2 및 제 4 도메인의 기능적 수용체가 α3β1 인테그린임을 확인하였다.
각 도메인만으로도 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 βig-h3의 제 2 및 제 4 도메인의 재조합 단백질을 이용하여 βig-h3의 수용체를 조사한 결과, 제 2 및 제 4 파스-1 도메인-매개성 세포 부착 활성은 모두 α3 및 β1 인테그린 소단위에 대한 항체에 의해 거의 억제되는데(도 3참조), 이는 제 2 및 제 4 파스-1 도메인 모두 기능적 수용체로서 α3β1 인테그린과 결합하여 세포 부착 활성을 매개하며 이에 요구되는 필수적인 아미노산을 가지고 있음을 나타낸다.
본 발명자들은 βig-h3의 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 위한 보존적 서열로 아스파르트산 및 아이소류우신을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
각각의 도메인만으로도 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 βig-h3의 제 2 및 제 4 파스-1 도메인 내에서 세포 부착에 관련된 아미노산을 찾기 위하여, βig-h3의 내부 반복 파스-1 도메인들 뿐만 아니라 파스-1 도메인을 포함하는 다른 기질 단백질들의 아미노산 서열을 분석한 결과, 각각의 파스-1 도메인 내 H2 지역 근처에 두 개의 아미노산, 아스파르트산 및 아이소류우신이 다양한 기질 단백질들 사이에서 매우 보존적으로 존재함을 확인하였다(도 4참조).
상기의 아스파르트산 및 아이소류우신을 포함하는 서열이 세포 부착 활성에 필수적인지를 확인하기 위하여, βig-h3의 제 4 파스-1 도메인을 포함하는 재조합 단백질에서 프롤린(proline), 아스파르트산 및 아이소류우신 각각을 세린(serine), 알라닌(alanine) 및 세린으로 치환시킨 돌연변이 단백질을 제조하여(도 5a참조) 이들의 세포 부착 활성을 조사한 결과, 아스파르트산 및 아이소류우신이 치환된 돌연변이에서 제 4 파스-1 도메인-매개성 세포 부착 활성이 거의 완벽하게 억제됨으로써 아스파르트산 및 아이소류우신이 βig-h3의 세포 부착 활성을 매개하는데 매우 중요한 아미노산임을 확인하였다.
상기와 같이, βig-h3의 4개 파스-1 도메인 중 세포 부착 활성을 나타낸 제 2 및 제 4 파스-1 도메인은 아스파르트산 및 아이소류우신이 매우 보존적인 반면, 중간 정도의 세포 부착 활성을 나타낸 제 1 파스-1 도메인은 아스파르트산 만이 보존적이고 아이소류우신은 히스티딘(histidine)으로 치환되어 있으며 세포 부착 활성을 거의 나타내지 않은 제 3 도메인은 두 아미노산 모두를 가지고 있지 않았다. 이는, 아스파르트산 및 아이소류우신이 βig-h3의 세포 부착 및 확산 활성을 매개하는 필수 아미노산임을 의미한다.
상기와 같이, 아스파르트산 및 아이소류우신이 세포 부착 활성에 있어서 필수적인 아미노산임을 확인한 본 발명자들은 이들 두 아미노산을 포함하는 βig-h3의 제 1, 제 2 및 제 4 파스-1 도메인 유래 펩타이드를 합성하였다. 상기 펩타이드들은 βig-h3의 제 1, 제 2 및 제 4 파스-1 도메인의 보존적 서열을 포함하는데, 각각의 펩타이드는서열번호 1로 기재되는 KADHH(아미노산 219-223),서열번호 2로 기재되는 NKDIL(아미노산 354-358) 및서열번호 3으로 기재되는 EPDIM(아미노산 615-619)으로 구성된다(도 7참조).
상기에서 합성된 βig-h3의 파스-1 도메인 유래 합성 펩타이드의 세포 부착 및 탈착 활성을 조사한 결과, 제 2 파스-1 도메인 유래 합성 펩타이드 NKDIL 및 제 4 파스-1 도메인 유래 합성 펩타이드 EPDIM은 βig-h3에 대한 세포 부착 활성을 상당히 억제하여 매우 우수한 세포 탈착 효과를 나타낸 반면, 제 1 파스-1 도메인 유래 합성 펩타이드 KADHH는 세포 부착을 약하게 억제하고 대조군 펩타이드 DEMPI는 세포 부착에 아무런 억제 효과를 나타내지 않아 상대적으로 매우 낮은 세포 탈착 효과를 나타내었다(도 8a참조). 또한, 제 2 및 제 4 파스-1 도메인 단백질을 기질로 사용하여 측정한 상기 합성 펩타이드들의 세포 부착 활성에 대한 억제 효과 역시 βig-h3을 기질로 사용한 상기 결과와 거의 동일하다(도 8b참조).
상기 합성 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM의 세포 부착 활성은 농도-의존성 양상을 보이며(도 9a참조), βig-h3의 표면 수용체로서 밝혀진 α3β1 인테그린이 합성 펩타이드 EPDIM 및 NKDIL에 의해 매개되는 세포 부착 활성에 있어서도 수용체로서작용함이 확인되었고(도 9b참조), 이러한 이유로 NKDIL 및 EPDIM이 α3β1 인테그린과 결합하는 다른 세포 부착 분자들과 특이적으로 경쟁하는 양상을 보였다(도 10a참조).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 기능적 세포 수용체인 α3β1 인테그린을 통하여 세포 부착 및 탈착 활성을 매개하며 이들의 세포 부착 및 탈착 활성을 위한 필수적인 아미노산으로 아스파르트산 및 아이소류우신을 포함하는 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM을 제조하였다. 본 발명의 펩타이드 서열은 세포 부착 분자인 βig-h3의 4개 도메인 중 각각의 도메인만으로도 세포 부착 활성을 나타내는 제 2 파스-1 도메인 및 제 4 파스-1 도메인의 보존적 서열로부터 유래하였다. 본 발명의 펩타이드는 βig-h3를 포함하는 다양한 세포외 기질 단백질에 의해 매개되는 세포 부착 활성 연구 및 세포 부착, 확산 및 탈착을 촉진하는 펩타이드(cell attachment, spreading and detachment-promoting peptide)의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서는 또한 상기의 세포 부착 및 탈착 활성을 나타내는 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드 및 그의 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.
또한, 상기 펩타이드 및 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 펩타이드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르빅산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 비경구 투여제이므로 독성 실험을 수행하지 않았다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> βig-h3 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질의 제조 및 세포 부착 활성 조사
βig-h3의 세포 부착에 필수적인 아미노산을 밝히기 위하여, 먼저 4개의 파스-1 반복 도메인을 포함하는 βig-h3에서 각각의 반복 도메인만으로도 세포 부착 활성을 매개할 수 있는지 조사하였다. 이를 위하여, βig-h3 각각의 반복 도메인에 대한 4 개의 재조합 단백질을 만들어 이들의 세포 부착 활성을 조사하였다.
<1-1> 4개의 βig-h3 파스-1 반복 도메인에 대한 재조합 단백질의 생산
βig-h3의 4개 파스-1 도메인에 대한 각각의 재조합 단백질을 생산하기 위하여, βig-h3의 유전자 133부터 236까지의 제 1 도메인, 242부터 372까지의 제 2 도메인, 373부터 501까지의 제 3 도메인 및 502부터 632까지의 제 4 도메인을 코딩하는 각각의 DNA 단편을 중합효소연쇄반응(polymerase chainreaction, PCR)을 수행하여 증폭한 후 각 단편을 벡터 pET-29β(Novagen)에 클로닝하여 각 도메인의 발현벡터 βigh3 D-Ⅰ, βigh3 D-Ⅱ, βigh3 D-Ⅲ 및 βigh3 D-Ⅳ를 제조하였다(도 1a). Ni-NTA 레진을 사용하여 정제하기 위해 상기 DNA 단편 C 말단에 6개의 히스티딘(histidine) 잔기를 연결시켜 His-표지(His-tag)를 만들었다. 상기 발현벡터 각각을 대장균 BS21(DE3)에 형질전환시킨 후 대장균 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 카나마이신(kanamicine)이 첨가된 배지에서 배양하였다. 각각의 도메인에 대한 대장균 형질전환체를 1 mM IPTG가 첨가된 배지에서 배양하여 각 도메인에 대한 재조합 단백질의 발현을 유도시킨 후 원심분리로 배양액을 제거하였다. 배양액이 제거된 각각의 도메인에 대한 형질전환체 균체를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF 및 0.5 mM DTT를 포함하는 세포용해 완충용액에 현탁시킨 후 초음파처리를 하여 세포를 파쇄하였다. 이 과정을 5회 반복한 후 원심분리로 상등액을 분리하고 이 상등액을 Ni-NTA 레진(Qiagen)이 충진된 컬럼을 사용하여 정제하였다.
상기에서 정제된 βigh3 D-Ⅰ, βigh3 D-Ⅱ, βigh3 D-Ⅲ 및 βigh3 D-Ⅳ 재조합 단백질을 SDS-PAGE를 수행하여 분석한 결과, βigh3 D-Ⅰ은 14.4 KDa에서 검출되었고, βigh3 D-Ⅱ, βigh3 D-Ⅲ 및 βigh3 D-Ⅳ은 21.5 KDa에서 검출되었다(도 1b)
<1-2> βig-h3 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질의 세포 부착 활성 측정
상기와 같이 제조된 βig-h3 각가의 도메인에 대한 재조합 단백질의 세포 부착 활성을 조사하기 위하여, 상기 재조합 단백질을 96 웰 플레이트(Falcon)에 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켜 웰 플레이트에 부착시킨 후 0.2% BSA를 포함하는 인산염 완충용액을 처리하여 웰 플레이트에 부착되지 않은 재조합 단백질들을 제거하였다. 트립신을 처리하여 배양한 HCE 세포를 2 × 105cells/㎖의 농도로 배양액에 현탁시킨 후 이 세포 현탁액 0.1 ㎖을 상기의 재조합 단백질이 코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포 현탁액이 첨가된 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 인산염 완충용액으로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 웰 플레이트에 헥소스아미니다아제 기질(hexosaminidase substrate)로 작용하는 3.75 mM p-니트로페놀-N-아세틸 1-β-D-글리코사미니드(p-nitrophenol-N-acetyl 1-β-D-glycosaminide) 및 0.25% 트리톤 X-100(triton X-100)을 포함하는 50 mM 구연산 완충용액(citrate buffer, pH 5.0)를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 5 mM EDTA를 포함하는 50 mM 글리신 완충용액(glycine buffer, pH 10.4)을 첨가하여 효소활성을 정지시키고 멀티스캔 MCC/340 마이크로플레이트 분석기(Multiskan MCC/340 microplate reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 결과를도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 제 2 파스-1 도메인의 재조합 단백질(βigh3-D-Ⅱ)이 코팅된 플레이트와 제 4 파스-1 도메인의 재조합 단백질(βigh3-D-Ⅳ)이 코팅된 플레이트에서는 야생형 βig-h3(βigh3-WT)의 활성과 상응한 HCE 세포의 부착 및 확산 활성이 나타난 반면, 제 1 파스-1 도메인의 재조합 단백질(βigh3-D-Ⅰ)이 코팅된 플레이트에서는 조금 약한 활성이, 제 3 파스-1 도메인의 재조합 단백질(βigh3-D-Ⅲ)이 코팅된 플레이트에서는 세포 부착 활성이 거의 나타나지 않았다.
따라서, βig-h3의 4개 파스-1 도메인 중 제 2 도메인과 제 4 도메인이 각 도메인만으로도 세포 부착 및 확산을 매개하기에 충분하며, 상기 두 도메인 내에 세포 부착 및 확산에 필수적인 아미노산이 포함되어 있음을 확인하였다.
<1-3> βig-h3 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질의 세포 부착 및 확산을 위한 수용체 확인
상기 실시예 <1-2>에서 확인한 바와 같이, 각 도메인만으로도 세포 부착 및 확산 활성을 나타내는 βig-h3의 제 2 및 제 4 도메인의 재조합 단백질을 이용하여 βig-h3의 수용체를 조사하였다. 이를 위하여, 다양한 인테그린 소단위에 대한 단일클론 항체를 사용하여 세포 부착 및 확산에 대한 기능 억제 효과를 조사하였다.
구체적으로, 3 × 105cells/㎖의 HCE 세포 배양액에 여러 종류의 인테그린 소단위에 대한 단일클론 항체를 5 ㎍/㎖씩 첨가하여 37℃에서 30분 동안 전배양하였다. 전배양한 HCE 세포를 상기 재조합 단백질 βig-h3 D-Ⅲ 또는 βig-h3 D-Ⅳ가 코팅된 플레이트에 옮기고 37℃에서 1시간 동안 더 배양한 후 기질에 부착된 세포를 상기 실시예 <1-2>의 헥소스아미니다아제 분석에 의하여 정량하였다. 각 측정값은 항 인테그린 항체가 존재하지 않을 경우 기질에 부착하는 세포수에 대한 백분율로 환산하여 측정한 결과를도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 다양한 인테그린 소단위에 대한 항체를 이용한 기능-억제 실험 결과, 제 2 및 제 4 파스-1 도메인-매개성 세포 부착은 모두 α3 및 β1 인테그린 소단위에 대한 항체에 의해 거의 억제되었는데, 이는 제 2 및 제 4 파스-1 도메인 모두 α3β1 인테그린과의 결합에 의해 세포 부착 활성을 매개하며 이에 요구되는 필수적인 아미노산을 가지고 있음을 나타낸다.
<실시예 2> βig-h3의 세포 부착 및 확산 활성을 위해 필수적인 아미노산, 아스파르트산 및 아이소류우신
<2-1> 파스-1 도메인을 포함하는 다양한 기질 단백질의 아미노산 서열 분석
각각의 도메인만으로도 세포 부착 및 확산 활성을 나타내는 βig-h3의 제 2 및 제 4 파스-1 도메인 내에서 세포 부착에 관련된 아미노산을 찾기 위하여, βig-h3의 내부 반복 파스-1 도메인들 뿐만 아니라 파스-1 도메인을 포함하는 다른 기질 단백질들의 아미노산 서열을 분석하였다. 서열 분석 결과, 각각의 파스-1 도메인 내 H2 지역 근처에 두 개의 아미노산, 아스파르트산 및 아이소류우신이 다양한 기질 단백질들 사이에서 매우 보존적으로 존재하였다(도 4). βig-h3의 제 2 및 제4 도메인을 포함하여 다양한 파스-1 도메인들 사이에서 아스파르트산 및 아이소류우신이 매우 보존적인 반면, βig-h3의 제 1 도메인을 포함하는 파스-1 도메인은 오직 아스파르트산만이 보존적이고 βig-h3의 제 3 도메인을 포함하는 파스-1 도메인은 다른 도메인들 사이에서 보존적으로 존재하는 아스피르틱산 및 아이소류우신이 모두 존재하지 않았다.
<2-2> βig-h3 제 4 파스-1 도메인의 치환 돌연변이 재조합 단백질의 제조
상기의 아스파르트산 및 아이소류우신을 포함하는 서열이 세포 부착 활성에 필수적인지를 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 βig-h3의 제 4 파스-1 도메인 유래의 재조합 단백질 βigh3 D-Ⅳ에서 616 프롤린(proline), 617 아스파르트산 및 618 아이소류우신을 각각 세린(serine), 알라닌(alanine) 및 세린으로 치환시킨 돌연변이 단백질 βigh3 D-Ⅳ-sDI, βigh3 D-Ⅳ-PaI, βigh3 D-Ⅳ-PDs 및 βigh3 D-Ⅳ-sas을 제조하였다(도 5a). 상기 돌연변이 단백질을 분리하여 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과, 모두 βigh3 D-Ⅳ와 동일한 위치에서 밴드가 검출되었다(도 5b).
<2-2> βig-h3 제 4 파스-1 도메인의 치환 돌연변이 재조합 단백질의 세포 부착 활성 측정
상기와 같이 βigh3 D-Ⅳ에서 프롤린, 아스파르트산 및 아이소류우신 각각 혹은 모두가 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이 단백질들, βigh3 D-Ⅳ-sDI, βigh3 D-Ⅳ-PaI, βigh3 D-Ⅳ-PDs 및 βigh3 D-Ⅳ-sas의 세포 부착 활성을 조사하였다. 이를 위하여, 상기 각각의 돌연변이 단백질들이 코팅된 웰 플레이트에 HCE 세포를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 기질에 부착된 세포를 상기 실시예 <1-2>의 헥소스아미니다아제 분석에 의하여 정량하여 그 결과를도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 돌연변이 D617A(βigh3 D-IV-Pal) 및 아이소류우신이 세린으로 치환된 돌연변이 I618S(βigh3 D-IV-PDs)는 대조군 βigh3 D-IV에 비하여 세포 부착 활성이 상당히 낮아진 반면, 프롤린이 세린으로 치환된 돌연변이 P616S(βig-h3 D-IV-sDI)는 대조군에 상응하는 세포 부착 활성을 나타내었다. 또한, 상기 세가지 아미노산이 모두 치환된 돌연변이, P616S/D617/I618S(βigh3 DIV-sas) 역시 세포 부착 활성이 대조군에 비하여 상당히 낮았다.
이와 같이, 제 4 파스-1 도메인 내 아스파르트산 및 아이소류우신의 돌연변이는 제 4 파스-1 도메인-매개성 세포 부착 활성을 거의 완벽하게 억제함으로써 617 위치의 아스파르트산 및 618 위치의 아이소류우신이 βig-h3의 세포 부착 활성을 매개하는데 매우 중요한 아미노산임을 확인하였다.
따라서, 실시예 1의 결과와 비교해 볼 때, βig-h3의 4개 파스-1 도메인 중 세포 부착 활성을 나타낸 제 2 및 제 4 파스-1 도메인은 상기에서 세포 부착 활성에 필수적인 아미노산이라고 확인된 아스파르트산 및 아이소류우신이 매우 보존적인 반면, 이보다 낮은 활성을 나타낸 제 1 파스-1 도메인은 아스파르트산 만이 보존적이고 아이소류우신은 히스티딘(histidine)으로 치환되어 있으며 세포 부착 활성을 거의 나타내지 않은 제 3 도메인은 두 아미노산 모두를 가지고 있지 않았다. 따라서, 아스파르트산 및 아이소류우신이 βig-h3의 세포 부착 및 확산 활성을 매개하는 필수 아미노산임을 증명하였다.
<실시예 3> βig-h3-매개성 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 합성 펩타이드
상기에서 아스파르트산 및 아이소류우신이 세포 부착 활성에 있어서 필수적인 아미노산임을 확인한 본 발명자들은 이들 아미노산을 포함하는 펩타이드를 합성하여 세포 부착 및 탈착 활성을 조사하였다.
<3-1> βig-h3의 파스-1 도메인 유래 합성 펩타이드의 제조
βig-h3의 제 1, 제 2 및 제 4 파스-1 도메인 유래 펩타이드 및 대조군 펩타이드를 표준 고체상 방법(standard solid phase procedures)을 이용하는 자동화된 다중 펩타이드 합성기(PE/ABD 433)에 의해 합성한 후 역상 고압 액체 크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography)에 의해 분리·정제하였다. 이와 같이 합성된 펩타이드는 βig-h3의 제 1, 제 2 및 제 4 파스-1 도메인의 보존적 서열을 포함하는데, 각각서열번호 1로 기재되는 KADHH(아미노산 219-223),서열번호 2로 기재되는 NKDIL(아미노산 354-358) 및서열번호 3으로 기재되는 EPDIM(아미노산 615-619)로 구성된다.서열번호 4로 기재되는 대조군 펩타이드 DEMPI는 제 4 파스-1 도메인의 보존적 서열을 포함하는 펩타이드 EPDIM과 아미노산조성은 동일하나 서열 순서가 틀린 것이다(도 7).
<3-2> 합성 펩타이드의 세포 부착 및 탈착 활성 측정
상기와 같이 βig-h3의 파스-1 도메인의 보존적 서열을 포함하는 합성 펩타이드들이 HCE 세포의 세포 부착 및 탈착 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 이를 위하여, HCE 세포를 상기 4가지 합성 펩타이드 각각이 100 μM 첨가 또는 첨가되지 않은 배지에 넣고 30분 동안 전배양한 후 10 ㎍/㎖ BSA 또는 10 ㎍/㎖ βig-h3이 코팅된 플라스틱 배양 접시(plastic culture dishes)에 옮겨 배양하였다. 배양 후 기질에 부착된 세포를 상기 실시예 <1-2>의 헥소스아미니다아제 분석에 의하여 정량하여도 8a에 나타내었다.
도 8a에 나타난 바와 같이, 아스파르트산-아이소류우신 잔기를 포함하는 합성 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM은 βig-h3에 대한 HCE 세포 부착 활성을 상당히 억제하여 매우 우수한 세포 탈착 활성을 나타낸 반면, 아스파르트산만을 포함하는 합성 펩타이드 KADHH는 세포 부착을 약하게 억제하고 상기 두 아미노산 모두를 포함하지 않는 대조군 펩타이드 DEMPI는 세포 부착에 아무런 억제 효과를 나타내지 않아 상대적으로 세포 부착 활성이 낮았다.
또한, 상기의 합성 펩타이드에 의해 억제되는 βig-h3 파스-1 제 2 및 제 4 도메인의 재조합 단백질 βigh3 D-Ⅱ 및 βigh3 D-Ⅳ에 대한 HCE 세포 부착 및 탈착 활성을 조사하였다. 이를 위하여, HCE 세포를 4가지 합성 펩타이드 각각이 100μM 첨가 또는 첨가되지 않은 배지에 넣고 30분 동안 전배양한 후 10 ㎍/㎖ βigh3 D-Ⅱ 및 βigh3 D-Ⅳ 단백질 각각이 코팅된 플라스틱 배양 접시에 옮겨 배양하였다. 배양 후 기질에 부착된 세포를 상기 실시예 <1-2>의 헥소스아미니다아제 분석에 의하여 정량하여도 8b에 나타내었다.
도 8b에 나타난 바와 같이, 제 2 및 제 4 파스-1 도메인 단백질을 기질로 사용하여 합성 펩타이드들의 HCE 세포 부착 활성에 대한 억제 효과는 βig-h3을 기질로 사용한 상기 결과와 거의 동일하였다.
<3-3> 합성 펩타이드로 코팅된 표면에 대한 HCE 세포의 세포 부착 활성
본 발명에서 제조한 합성 펩타이드 각각을 기질로 사용하여 합성 펩타이드의 농도에 따른 HCE 세포의 세포 부착 활성을 조사하였다. 이를 위하여, 웰 플레이트를 0, 20, 40, 60, 80, 100 및 120 μM 농도의 합성 펩타이드 각각으로 코팅한 후 HCE 세포를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 기질에 부착된 세포를 상기 실시예 <1-2>의 헥소스아미니다아제 분석에 의하여 정량하여도 9a에 나타내었다.
도 9a에 나타난 바와 같이, 아스파르트산 및 아이소류우신을 포함하는 합성 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM은 농도-의존성 양상으로 세포 부착을 매개하는 활성을 증가시켰고, 아스파르트산만을 포함하는 합성 펩타이드 KADHH 역시 농도-의존성 양상으로 세포 부착 활성을 나타내지만, 그 활성은 상기 두 펩타이드들에 비해 상대적으로 낮았다. 한편, 상기 두 아미노산 모두를 포함하지 않는 대조군 펩타이드DEMPI는 세포 부착에 있어서 어떠한 활성도 나타내지 않았다.
<3-4> 합성 펩타이드의 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 매개하는 수용체 확인
βig-h3의 표면 수용체로서 밝혀진 α3β1 인테그린이 본 발명의 합성 펩타이드 EPDIM 및 NKDIL에 의해 매개되는 세포 부착 및 탈착 활성에 관여하는지를 다양한 인테그린 소단위에 대한 항체를 이용하는 기능-억제 실험을 수행하여 조사하였다. 이를 위하여, HCE 세포에 여러 인테그린 소단위에 대한 단일클론 항체를 5 ㎍/㎖씩 첨가하여 37℃에서 30분 동안 전배양한 후 100 μM EPDIM 또는 100 μM NKDIL이 코팅된 웰에 접종하여 배양하였다. 1시간 배양 후 기질에 부착된 세포를 상기 실시예 <1-2>의 헥소스아미니다아제 분석에 의하여 정량하여도 9b에 나타내었다.
도 9b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 합성 펩타이드 NKDIL 또는 EPDIM이 코팅된 플레이트 모두에서 HCE 세포의 세포 부착 활성이 α3 및 β1 인테그린 소단위에 대한 항체에 의해 억제됨으로써 βig-h3 파스-1 도메인 유래 합성 펩타이드가 α3β1 인테그린을 세포 부착 및 탈착 활성을 매개함을 확인하였다.
<3-5> 다양한 세포외 기질 단백질에 대한 합성 펩타이드의 세포 탈착 효과
본 발명의 합성 펩타이드 EPDIM 또는 NKDIL의 세포 부착 및 탈착 활성이 βig-h3에 대해 특이적인지를 확인하기 위하여, 상기 펩타이드의 다양한 기질 단백질에 대한 세포 부착 및 탈착 효과를 조사하였다. 이를 위하여, HCE 세포를 100μM 농도의 합성 펩타이드 EPDIM 또는 NKDIL이 첨가 또는 첨가되지 않은 배지에서 전배양한 후 βig-h3, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 콜라겐 Ⅰ형(type Ⅰ colagen) 및 콜라겐 Ⅱ형 등의 다양한 기질 단백질이 코팅된 플레이트에 접종하여 배양하였다. 1시간 동안 배양한 후 기질에 부착된 세포를 상기 실시예 <1-2>의 헥소스아미니다아제 분석에 의하여 정량하여도 10a에 나타내었다.
도 10a에 나타나 바와 같이, 본 발명의 합성 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM은 βig-h3 및 라미닌에 대해서는 세포 부착 활성을 상당히 억제하여 매우 우수한 세포 탈착 효과를 나타낸 반면, 피브로넥틴에 대한 세포 부착 활성은 약하게 억제하며 콜라겐 Ⅰ형, Ⅱ형 및 비트로넥틴에 대한 세포 부착 활성에는 전혀 억제 효과를 나타내지 않아 상대적으로 세포 탈착 활성이 낮았다. 이러한 결과는 합성 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM이 α3β1 인테그린과 결합하는 다른 세포 부착 분자들과 특이적으로 경쟁함을 나타낸다.
또한, 상기에서 본 발명의 합성 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM에 의해 세포 부착 활성이 억제되었던 βig-h3 , 라미닌 및 피브로넥틴에 대해서 합성 펩타이드 EPDIM의 농도에 따른 세포 탈착 활성을 조사하였다. 이를 위하여, HCE 세포를 0, 200, 400, 600, 800, 1000 및 1200 μM 농도의 합성 펩타이드 EPDIM이 첨가된 배지에서 전배양한 후 βig-h3, 피브로넥틴 및 라미닌이 코팅된 플레이트에 접종하여 배양하였다. 1시간 동안 배양한 후 기질에 부착된 세포를 상기 실시예 <1-2>의 헥소스아미니다아제 분석에 의하여 정량하여도 10b에 나타내었다.
도 10b에 나타난 바와 같이, βig-h3, 피브로넥틴 및 라미닌의 세포 부착 활성에 대한 합성 펩타이드 EPDIM의 세포 탈착 효과는 EPDIM의 농도가 증가할수록 세포 부착 활성이 낮아지는 농도-의존성 양상을 나타내었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 세포 부착, 확산 활성을 위한 필수적인 아미노산으로 아스파르트산 및 아이소류우신을 보존적 모티프로 포함하는 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM을 제조하였다. 상기 펩타이드는 세포 부착 분자인 βig-h3의 4개 도메인 중 각각의 도메인만으로도 세포 부착 활성을 나타내는 제 2 파스-1 도메인 및 제 4 파스-1 도메인의 보존적 서열을 포함하며 기능적 세포 수용체로서 α3β1 인테그린과 결합하여 세포 부착 및 탈착 활성을 매개한다. 지금까지는 α3β1 인테그린과 결합한다고 알려진 트롬보스폰딘(thrombospondin), 라미닌 및 Ⅳ 형 콜라겐 등의 다양한 세포외 기질 단백질에서 서로의 활성 부위에 상동성을 갖는 어떠한 특정 서열이나 α3β1 인테그린을 위한 특정한 보존적 결합 모티프가 발견되지 않았는데, 본 발명은 보존적 아미노산인 아스파르트산-아이소류우신 잔기를 포함하는 합성 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM이 특이적으로 α3β1 인테그린을 통하여 세포 부착 활성을 매개함을 확인함으로써 아스파르트산-아이소류우신 잔기가 α3β1 인테그린을 위한 특정한 보존적 결합 모티프임을 증명하였다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 βig-h3를 포함하는 다양한 세포외 기질 단백질에 의해 매개되는 세포 부착 활성 연구 및 창상치유, 조직재생 및 암전이 억제 등에 매유 유용한세포 부착, 확산 및 탈착을 촉진하는 펩타이드(cell attachment, spreading and detachment-promoting peptide)의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 세포 부착 분자인 βig-h3의 4개 도메인 중 각각의 도메인만으로도 세포 부착 및 탈착 활성을 나타내는 제 2 파스-1 도메인 및 제 4 파스-1 도메인의 보존적 서열을 이용하여 기능적 세포 수용체로서 α3β1 인테그린과 결합하여 세포 부착 및 탈착 활성을 매개하고 세포 부착 및 탈착 활성을 위한 필수적인 아미노산으로 아스파르트산 및 아이소류우신을 포함하는 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM을 제조하였다. 본 발명의 펩타이드는 βig-h3를 포함하는 다양한 세포외 기질 단백질에 의해 매개되는 세포 부착 활성 연구 및 창상치유, 조직재생 및 암전이 억제 등에 매유 유용한 세포 부착, 확산 및 탈착을 촉진하는 펩타이드(cell attachment, spreading and detachment-promoting peptide)의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 보존적 서열로서 아스파르트산-아이소류우신을 포함하며서열번호 2로 기재되는 NKDIL 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 펩타이드 및 그의 유도체.
  4. 보존적 서열로서 아스파르트산-아이소류우신을 포함하며서열번호 3으로 기재되는 EPDIM 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 부착, 확산 및 탈착 활성을 나타내는 펩타이드 및 그의 유도체.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, α3β1 인테그린을 통하여 세포 부착 및 확산 활성을 매개하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 및 그의 유도체.
  6. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, βig-h3, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)의 세포 부착 활성에 대한 세포 탈착 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드 및 그의 유도체.
  7. 제 3항 또는 제 4항의 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 창상치유, 조직재생 또는 암전이 억제용 약학적 조성물.
  8. 삭제
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