KR100385293B1

KR100385293B1 - βｉｇ-ｈ3의 일부 도메인을 이용한 세포 부착 및 창상치유 방법

Info

Publication number: KR100385293B1
Application number: KR10-2000-0025662A
Authority: KR
Inventors: 김인산; 김정은
Original assignee: 주식회사 리젠 바이오텍
Priority date: 2000-05-13
Filing date: 2000-05-13
Publication date: 2003-05-23
Also published as: WO2001087327A1; US7396682B2; AU2027001A; EP1282434A4; AU2001220270B2; ATE446765T1; US20100331253A9; RU2234937C2; US20080214463A1; CA2409506A1; US20040052767A1; IL152410A0; KR20010104176A; CN1209165C; EP1282434B1; JP2004521605A; RU2002133463A; CN1452493A; DE60043238D1; EP1282434A1

Abstract

본 발명은 βig-h3의 일부 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 세포 부착 및 창상 치유에 이용하는 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 βig-h3를 구성하는 도메인인 fas-1 도메인을 포함하고 있는 다른 여러 단백질의 아미노산 서열을 분석하여, 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산으로 알려진 아스파르트산과 이소류신이 높은 상동성을 보이며 존재하는 것을 확인하고, 상기 아미노산이 존재하고 있는 βig-h3의 2번째 또는 4번째 도메인을 단독 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 세포의 부착 및 창상치유에 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

βｉｇ-ｈ3의 일부 도메인을 이용한 세포 부착 및 창상 치유 방법{Method for cell adhesion and wound healing with domains of βig-h3}

βig-h3은 인간의 흑색종 세포(human melanoma cells), 포유동물의 상피세포(mammary ephithelial cells), 각질형성세포(keratinocytes) 및 허파 섬유아세포(lung fibroblasts)등을 포함한 여러 종류의 세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포외 기질 단백질이다(Skonier, J. et al., DNA Cell Biol. 13, 571, 1994).

βig-h3는 Skonier 등에 의해 TGF-β1을 처리한 인체폐선암종 세포주인 A549 세포주에서 cDNA 자료 선별 중 최초로 동정되었으며, βig-h3 단백질의 아미노산 서열분석에 의해, 아미노 말단 분비 서열(amino-terminal secretory sequence)과 인테그린(integrin)에 대하여 리간드 식별(ligand recognition)이 가능한 카르복시 말단(carboxy-terminal) Arg-Gly-Asp(RGD) 배열을 가진 683개의 아미노산으로 구성되어 있음이 밝혀졌다(Skonier, J. et al., DNA cell Biol. 11, 511, 1992).

현재까지 βig-h3은 세포의 성장 및 분화, 창상 치유(wound healing) 및 세포 부착(cell adhesion)에 관여한다고 밝혀져 있으나, 이들의 작용기작에 관하여는 명확히 알려진 바가 없다. 다만, 다양한 조직에서 세포외 기질 단백질 및 세포들 사이의 상호작용과 형태 형성에서 중요한 인자로 작용하는 것으로 보인다.

βig-h3가 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)로서 세포 부착(attachment) 및 탈착(detachment)을 매개한다는 것과 관련된 증거가 몇가지 연구에 의해 확인되었다. 먼저, 정제된 βig-h3 단백질은 피부 섬유아세포의 부착과 확산을 촉진시키는 한편, 무혈청배지에서 A549, HeLa 및 WI-38 세포의 부착을 저해하였다. 특히, βig-h3은 종양세포의 성장, 콜로니 형성 및 출현을 저해하는것으로 알려졌는데, 이는 차이니즈 햄스터의 난소 세포(Chinase hamster ovary cells)에 βig-h3 발현벡터를 전이(transfection)시킨 누드 마우스에서 상기 세포들의 종양형성능이 현저하게 감소함이 보고됨으로써 확인되었다. 또한, 빠르고 효과적인 상처 치유를 위하여 유효한 양의 βig-h3을 상처에 적용함으로써 섬유아세포가 상처부위에 퍼지고 점착하는 것을 촉진시킬 수 있는 방법이 개발되고 있다. 따라서, βig-h3은 여러 세포에서 TGF-β에 의해 고도로 유도되는 세포 부착 분자로서 세포 성장(cell growth), 세포 분화(cell differentioa), 창상 치유(wound healing), 형태 형성(morphogenesis) 및 세포 부착(cell adhesion)에 있어 매우 중요한 역할을 담당한다고 할수 있다(Rawe, I.M. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 893, 1997; Lebaron, R.G. et al., J. Invest. Dermatol. 104, 844, 1995)

βig-h3는 4개의 반복된 내부 도메인(internal domain), 즉 fas-1을 포함하고 있는 것으로 알려져 있는데, 이 모티프(motif)는 포유류, 곤충, 성게, 식물, 효소 및 미생물 등의 페리오스틴(periostin), 파시클린 I(fasciclin I), 성게의 HLC-2, 조류의 Algal-CAM 및 미코박테리아의 MPB70과 같은 분비 단백질이나 막(membrane) 단백질 내에도 존재하며, 높은 상동성을 가지는 것으로 밝혀졌다(Kawamoto, T. et al., Biochem. Biophys. Acta. 1395, 288, 1998). 상기 도메인은 110 내지 140 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 특히 상동성이 높은 약 10개의 아미노산으로 이루어진 H1 및 H2가 내부에 존재한다.

βig-h3을 포함하여 페리오스틴 및 파시클린 I 단백질은 4개의 fas-1으로 구성되어 있으며, HLC-2는 2개, MPB70은 1개의 fas-1으로 구성되어 있다. 이들의 생물학적인 기능은 아직 밝혀져 있지 않지만, 이들 중 몇몇은 세포 부착에 관여하는 것으로 확인되었다. 특히, βig-h3, 페리오스틴 및 파스클린 I 단백질은 섬유아세포, 골아세포(osteoblast) 및 신경세포에서 세포 부착을 매개하는 것으로 알려졌으며, Algal-CAM 역시 조류인 볼복스(Volvox)의 배(embryo)에서 세포부착에 관여하는 것이 밝혀졌다(LeBaron, R. G., et al., J. Invest. Dermatol. 104, 844, 1995; Horiuchi, K. et al., J. Bone Miner. Res. 14, 1239, 1999; Huber, O. et al.,EMBO J.13, 4212, 1994).

상기와 같은 βig-h3의 세포 부착 활성은 초기에 βig-h3의 C-말단에 존재하는 RGD 모티프에 의해 매개되는 것으로 생각되었으나, RGD 모티프가 연골아세포의 확산을 촉진하는데 필수적이지는 않으며, RGD 모티프가 결실된 성숙한 형태의 βig-h3가 세포 부착을 억제할 수 있음이 보고되면서, RGD 모티프가 βig-h3의 세포 부착 활성을 매개하는데 필수불가결한 요소가 아님이 확인되었다. 최근 연구에 의하면, βig-h3은 인테그린 α1β1에 특이적으로 인식되며, RGD 모티프와 관계없이 독자적으로 인테그린 α1β1과 작용하여 세포의 부착과 확산을 촉진시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다(Ohno, S. et al.,Biochim. Biophys. Acta1451,196, 1999). 또한, βig-h3 내 보존적 서열로 이루어진 H1 및 H2 펩타이드 역시 βig-h3에 의해 매개되는 세포 부착에 영향을 미치지 못하는 것이 확인되었다. 이는 βig-h3의 세포 부착 활성을 위한 필수적인 아미노산이 H1 및 H2 지역이 아닌 다른 곳에 존재함을 의미하는 것이다.

이에 본 발명자들은 상기와 같이 세포 부착 분자로서 중요한 역할을 담당하는 βig-h3에 있어, βig-h3의 2번째 또는 4번째 도메인이 세포 부착 활성을 나타내는데 최소의 필수 도메인임을 확인하고, 이러한 사실에 근거하여 상기 도메인을 포함하는 재조합 단백질이 창상 치료에도 효과적임을 밝혔다.

최근 창상치유에 관한 연구는 세포생물학적, 분자생물학적 분야로 더욱 세분화되고 있고, 창상치유 촉진에 관한 임상적 적용 또한 더욱 광범위해지고 있으나, 아직도 미세한 세포생물학, 분자생물학적 기전에는 의문점들이 많다.

현재까지 밝혀진 바에 의하면, 창상치유는 손상에 대한 조직의 반응이며, 조직회복의 과정으로, 주화성(chemotaxis), 세포의 분화 및 복제(differentiation and replication), 기질단백질(matrix protein)의 합성, 혈관의 신생, 창상의 재구성 등을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다(Steed, D.L. et al., Clin. Plast. Surg. 25, 397, 1998). 이러한 창상치유 과정의 초기에 나타나 이후 과정을 조절하는 대표적인 물질 중의 하나로 성장인자를 들 수 있는데, 이들은 창상치유 과정 전반에 걸쳐 강력한 영향을 미치면서 세포의 성장, 분화, 대사 등을 조절하고, 창상 주변환경 또한 조절하므로, 이를 이용한 치료의 개발이 꾸준히 진행되고 있다. 현재까지 널리 연구되어진 성장인자들 중에서 PDGF(platelet-derived growth factor)는 교원섬유 대사를 촉진시키고 섬유아세포와 대식세포의 이동을 촉진시키며 주화성, 혈관신생, 섬유아세포의 분화를 촉진시키는 작용을 하며(Mustoe, T.A,et al., J. Clin. Invest. 87, 694, 1991; Lepisto, J. et al., J. Surg. Res. 53, 596, 1992), EGF(epidermal growth factor)는 상피화와 섬유아세포의 분화, 혈관신생을 증가시킨다고 알려졌다(Franklin, J.D. et al., Plast. Resonst Surg. 64, 766, 1979; Buckly, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7340, 1985). 또한, bFGF(basic fibroblast growth factor)는 혈관신생, 상피화와 교원섬유 침착을 촉진시키며 헤파린과 여러 형태로 결합하여 그와 관련된 작용을 하고(Tsuboi, R. et al., J. Exp. Med. 172, 245, 1990; Kinsnorth, A. N. et al., Br. J. Surg. 77, 409, 1990), IGF(insulinlike growth factor)는 세포의 분화를 증진시키는 역할을 하며, VEGF(vascular endothelial growth factor)는 혈관의 투과성을 증가시키며 혈관신생을 촉진하는 물질로 밝혀졌다.

그 외에도 많은 성장인자와 사이토카인들이 창상치유에 관여한다고 알려져 있는데, 그 중 하나인 TGF-β(transforming growth factor-β)는 여러 가지 세포들의 성장과 분화에 관여하는 물질로, 포유류에서는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 등 세가지 종류로 존재하고, 성장조절, 면역반응의 조절, 골생성의 자극, 연골특이적분자(cartilage specific macromolecule)의 유도, 창상치유 촉진 등의 여러 가지 복잡한 기능을 가진다고 알려졌다(Bennett, N.T. et al., Am. J. Surg. 165, 728, 1993). 이러한 TGF-β는 창상치유시기의 상피에 나타나는데, 이는 재상피화 동안 각질형성세포(keratinocyte) 내의 인테그린(integrin) 발현을 자극하는 것으로 보여진다. TGF-β 발현에 관한 최근 연구에서는, TGF-β3 mRNA가 정상 피부의 상피, 급성 및 만성 창상에서 발현되고, TGF-β1 mRNA가 정상피부와 만성 창상에서는 발현되지 않으나 급성 창상에서 재생되는 상피층에서 발현되며, TGF-β2 mRNA는 발현되지 않는다는 것이 밝혀졌다(Schmid, P. et al., J. Pathol. 171, 191, 1993). 아직까지 상기 기작에 대한 정설이 확립된 것은 아니지만 TGF-β가 재상피화에 큰 역할을 할 것으로 예측된다.

βig-h3 mRNA와 단백질은 상기의 TGF-β에 의하여 상승조절(up-regulation)되는데 이는 TGF-β의 어떤 신호를 매개하는데 관여할 것으로 생각된다. βig-h3 발현 플라스미드를 CHO(Chinese hamster ovary) 세포에 전이시켰을 경우 종양 생성능력이 감소되는 것으로 보고되었다(Skonier, J. et al., DNA Cell Biol. 13, 571, 1994). 그러나 덱사메타손으로 치료된 골수세포와 몇 종의 종양세포주에서는 반대로 하강조절(down-regulation)되는 것으로 보고되어 있고,드문 골질환인 국한성유선상과골증(melorheostosis)에서도 침범된 피부의 섬유세포에서 하강조절된 것을 볼 수 있으며 골생성의 음성조절인자(negative regulator)로 보고되었다(Genini, M. et al., Int. J. Cancer 66, 571, 1996; Schenker, T. et al., Exp. Cell. Res. 239, 161, 1998; Kim, J. et al., J. Cell. Biochem. 77, 169, 2000). 이러한 작용들 외에도 βig-h3는 상술한 바와 같이, 세포유착분자(cell adhesion molecule)로도 알려지고 있는데 진피내 섬유아세포의 유착과 확장을 촉진하는 보고가 있었다. 그 분포에 관한 연구를 보면, 안조직(eye tissue)에서 정상성인의 각막상피, 각막 내 태아간질세포(fetal stromal cell)와 치유과정중의 각막내피 및 간질 세포에서 발현되는 것으로 보고되었고, 신장의 사구체근접부장치(juxtaglomerular apparatus)와 근위 세관 (proximal tubule)에서 발현되고 당뇨병이 있는 경우 발현이 증가된다고 하였다. 그 외 정상인의 관상동맥의 내피하 평활근(subendothelial smooth muscle)에서 발현되고 동맥경화시 혈관 내막에서 증가된다는 보고가 있으나 아직 정상피부조직과 피부창상에서의 βig-h3의 발현은 정립되어 있지 않다(Klintworth, G.K. et al., Am. J. Pathol. 152, 743, 1998; Munier, F.L. et al., Nature Genetics 15, 247, 1997; Streeten, B. W. et al., Arch. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 893, 1997). 이러한 βig-h3 단백질의 인체 정상조직에서의 분포나 발현에 관해 불분명하며, 특히 피부 창상에서의 발현양상에 관한 보고는 없는 상태이지만 βig-h3 단백질에 관한 몇 가지 연구 중에서 진피내 섬유아세포(dermal fibroblast)의 유착과 확산을 증진시키는 역할이 보고되어 창상치유 촉진에 기여할 것으로 기대되고 있다.

이에 본 발명자들은 상기의 사실을 토대로 하여, βig-h3의 fas-1 도메인과 다른 단백질들의 fas-1 도메인들과의 상동성을 비교한 컴퓨터 분석에 의하여 H1 및 H2 이외에도 높은 상동성을 보이는 몇몇 아미노산 서열이 존재함을 밝히고, 특히 H2 펩티드 가까이에 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산으로 알려진 아스파르트산(Asp)과 이소류신(Ile)이 높은 상동성을 보이며 존재하는 것을 확인하고, βig-h3의 4개 도메인 중 상기 아미노산이 존재하는 도메인인 2번째 또는 4 번째 도메인이 각각 인테그린 α3β1과 작용하여 세포의 부착을 매개할 수 있으며, 또한창상 치유에 효과적임을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질이 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함하는 βig-h3와 세포 부착과 확산, 그리도 창상 치유에 동일한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 H2 펩티드 가까이에 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산으로 알려진 아스파르트산(Asp)과 이소류신(Ile)이 높은 상동성을 보이며 존재하는 βig-h3의 4개 fas-1 도메인 중 2번째 또는 4 번째 도메인이 세포의 부착과 확산, 그리고 창상 치유에 충분히 효과적임을 확인하고, 상기 도메인 각각을 단독 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 세포 부착과 확산, 그리고 창상 치유에 이용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 재조합 단백질 βigh3-WT와 βigh3-△RGD의 모식도를 나타낸 것이고,

▨ 및 ▩ : 보존 서열

? : RGD 모티프

도 2는 재조합 단백질 βigh3-WT와 βigh3-△RGD의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이고,

도 3은 재조합 단백질 βigh3-WT와 βigh3-△RGD에 대한 HCE 세포의 세포 부착 및 확산 효과를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후 현미경으로 관찰한 사진이고,

도 4는 재조합 단백질 βigh3-WT와 βigh3-△RGD에 대한 HCE 세포의 세포 부착 활성이 농도 의존적임을 부착된 세포 수(A) 및 세포 표면적(B)으로 나타낸 그래프이고,

도 5는 재조합 단백질 βigh3-WT와 βigh3-△RGD의 HCE 세포 부착 활성을 부착된 세포 수(A)와 세포 표면적(B)으로 비교한 그래프이고.

도 6a는 재조합 단백질 βigh3-WT와 βigh3-△RGD의 HCE 세포 부착 활성에대한 각 화합물 영향을 나타낸 그래프이고,

도 6b는 재조합 단백질 βigh3-WT의 HCE 세포 부착 활성에 대한 2가 양이온의 영향을 분석한 그래프이고,

도 6c는 재조합 단백질 βigh3-WT의 HCE 세포 부착 활성에 대한 항 인테그린 단일항체의 억제 효과를 나타낸 그래프이고,

도 6d는 여러 단백질들의 HCE 세포 부착 활성에 대한 항 인테그린 항체 억제 효과를 나타낸 그래프이고,

도 6e는 재조합 단백질 βigh3-WT 및 각 기질 단백질에 대한 K562 세포 부착 활성을 비교한 그래프이고,

도 7은 βig-h3의 fas-1 도메인 각각을 포함하는 재조합 단백질의 모식도를 나타낸 것이고,

도 8는 βig-h3의 fas-1 도메인 각각을 포함하는 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 사진이고,

도 9는 βig-h3의 fas-1 도메인 각각을 포함하는 재조합 단백질에 대한 HCE 세포 부착 활성을 나타낸 결과이고,

도 10은 βig-h3의 fas-1 도메인 각각을 포함하는 재조합 단백질의 HCE 세포 부착 활성에 대한 항 인테그린 항체의 억제 효과를 나타낸 결과이고,

도 11은 fas-1 도메인을 포함하는 여러 기질 단백질들의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과이고,

도 12는 βig-h3 4번째 도메인의 치환 돌연변이체를 나타내는 모식도이고,

도 13은 분리·정제된 βig-h3 4번째 도메인의 치환 돌연변이체 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과이고,

도 14는 βig-h3 4번째 도메인의 치환 돌연변이체의 세포 부착 활성을 나타낸 그래프이고,

도 15는βig-h3 4번째 도메인을 하나 이상 포함하고 있는 βigh3-D-Ⅳ, βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X 및 4X 재조합 단백질의 모식도이고,

도 16은 βigh3-D-Ⅳ, βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X 및 4X 재조합 단백질의 Ni-NTA 아가로오스 수지를 이용한 정제결과를 10% SDS-PAGE(A) 및 8% 비변성(nondenaturing) PAGE(B)로써 확인한 사진이고,

도 17은 βig-h3 4번째 도메인이 포함된 연고기제를 적용한 후, 창상면적의 육안적 형태를 나타낸 사진이고,

A : 실험군 1-A B : 실험군 1-B

C : 실험군 1-C D : 실험군 1-D

도 18은 βig-h3 4번째 도메인이 포함된 연고기제를 적용한 후, 재상피화에 대한 광학현미경적 관찰 결과를 나타낸 것이고,

A : 실험군 1-A B : 실험군 1-B

C : 실험군 1-C D : 실험군 1-D

도 19는 βig-h3 4번째 도메인이 포함된 연고기제를 적용한 후, 교원섬유형성에 대한 광학현미경적 관찰 결과를 나타낸 것이고,

A : 실험군 1-A B : 실험군 1-B

C : 실험군 1-C D : 실험군 1-D

도 20은 βig-h3 4번째 도메인을 하나 이상 포함하고 있는 βigh3-D-Ⅳ, βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X 및 4X 재조합 단백질의 HCE 세포 부착 활성을 나타낸 그래프이고,

도 21은 βig-h3 4번째 도메인을 다수개 포함하고 있는 βigh3-D-Ⅳ 3X 및 4X 재조합 단백질이 포함된 키토산 기제를 적용한 후, 창상면적의 육안적 형태를 나타낸 사진이다.

A : 실험군 2-A B : 실험군 2-B

C : 실험군 2-C D : 실험군 2-D

본 발명은 βig-h3의 4개 도메인 중 2번째 또는 4 번째 도메인 각각을 단독 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 세포 부착과 확산에 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 창상치료에 이용하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 세포의 부착 및 확산에 있어 실제로 활성을 가지는 도메인을 밝히기 위해 기존에 알려진 인테그린에 대하여 리간드 식별이 가능한 서열로 알려진 카르복시 말단 Arg-Gly-Asp(RGD) 배열이 βig-h3의 세포부착 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 세포 부착 활성은 세포의 수와 표면적을 이용하여 측정하였는데, 그 결과 βig-h3가 RGD 모티프에 비의존적으로 세포 부착 및 분산을 촉진한다는 사실을 확인하였다.

상기의 결과에 근거하여, 여러 종류의 시약을 이용한 세포 부착 저해실험을 수행함으로써 βig-h3 단백질의 세포부착 활성에 관여하는 βig-h3의 세포 표면 수용체를 확인한 바에 의하면, βig-h3-매개 세포 부착을 위한 βig-h3의 세포 표면 수용체는 RGD-의존성 인테그린의 하나로서, βig-h3와의 결합에 있어 2가 양이온을 요구하는 인테그린 α3β1이다.

한편, βig-h3의 세포 부착 활성을 위한 필수적인 최소 단위의 도메인을 확인하기 위하여 먼저 본 발명자들은 각각의 fas-1 도메인만으로 세포 부착을 매개할 수 있는지 여부를 조사하였다.

이는 세포 부착 분자로서 작용하는 것으로 알려진 βig-h3을 포함한 페리오스틴, 파스시클린, HLC-2 및 알갈-CAM 등을 포함하는 여러 단백질들에서 fas-1 도메인이 발견되며, 상기 단백질내에 포함되는 fas-1 도메인의 수 또한 일정치 않으므로, βig-h3가 세포 부착 활성을 나타내는데 4개 모두의 fas-1 도메인을 필요로 하지 않을 가능성이 있을 뿐만 아니라, 심지어 오직 한 개의 fas-1 도메인만으로도 세포 부착을 매개할 수 있음을 근거로 한다. 본 발명자들은 βig-h3는 4개의 fas-1 도메인 중 2번째 또는 4번째 파스-1 도메인만으로도 세포 부착 활성을 나타내기에 충분하다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 4개의 도메인에 공통적으로 존재하는 H1 및 H2 서열이 βig-h3의 세포 부착 활성을 매개하는데 필수적이지 않음을 나타내며, 결과적으로 2번째 및 4번째 fas-1 도메인 내 H2 지역 가까운 위치에서 매우 보존적으로 존재하는 두 개의 아미노산, 즉 아스파르트산 및 이소류신이 세포 부착 관련 모티프임을 간접적으로 증명한다. 상기의 두 보존적 아미노산이 세포 부착 활성에 있어 필수적임은 βig-h3 4번째 도메인의 아미노산 치환 돌연변이체를 통하여 확인하였다.

또한, 본 발명은 βig-h3의 4개 도메인 중 2번째 또는 4번째 도메인 각각을 단독 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 창상 치료에 이용하는 방법을 제공한다.

상기에서 세포부착에 활성을 보이는 βig-h3의 일부 도메인 만으로도 4개의 도메인을 모두 포함하고 있는 βig-h3-WT와 동일하게 창상치유 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 상기 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 백서에 직접 적용하여 그 효과를 관찰하였다.

βig-h3의 4번째 도메인을 포함한 재조합 단백질 연고기제를 이용하면, 창상면적의 감소, 재상피화 및 교원섬유의 형성 효과가 관찰되는데, 이러한 결과는 궁극적으로 본 발명의 βig-h3의 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산으로 알려진 아스파르트산과 이소류신이 존재하는 βig-h3의 2번째 도메인 또는 4번째 도메인이 그 자체만으로도 창상치유에 효과적이며, 창상치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있음을 의미한다.

또한, βig-h3의 4번째 도메인을 하나 이상 포함하고 있는 재조합 단백질의 경우에도 높은 세포부착 활성 및 창상치유 효과를 나타내는데, 이러한 일부 도메인만을 포함하고 있는 재조합 단백질은 발현시 전체 4개의 도메인을 포함하고 있는 단백질과는 달리 수용성으로 합성되어 변성단계를 거치지 않아도 되며 훨씬 많은 양을 쉽게 얻을 수가 있다.

상기한 4번째 도메인 외에도 2번째 도메인, 2번째 및 4번째 도메인을 혼합하여 하나이상 포함하고 있는 재조합 단백질의 경우에도 높은 세포 부착 활성 및 창상치유 효과를 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> RGD 비의존적 βig-h3 단백질의 세포부착 활성 확인

<1-1> 재조합 βig-h3 단백질의 제조

본 발명자들은 세포의 부착 및 확산에 있어 실제로 활성을 가지는 도메인을 밝히기 위하여, 기존에 알려진 인테그린에 대하여 리간드 식별이 가능한 서열로 알려진 카르복시 말단 Arg-Gly-Asp(RGD) 배열이 βig-h3의 세포부착 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위하여 RGD 서열이 결실된 βigh3-△RGD 및 βigh3-야생형(WT) 재조합 단백질을 제조하였다.

먼저 pBluescript(pBsβig-h3)에 클론(clone)된 전장의 human βig-h3 cDNA를 제한효소NdeⅠ과BglⅡ로 분리하였다. 분리된 절편을 pET-29b(+) 벡터(Novagen Inc.)의EcoRⅤ와EcoRⅠ사이에 삽입하고, 다시 상기 벡터의NcoI 부위로 βig-h3 cDNA로부터 잘라낸 1351 bp의 NcoI 절편을 삽입함으로써 βigh3-WT을 제조하였다. RGD 배열이 결실된 βigh3-△RGD의 발현 벡터는 상기 βigh3-WT 벡터로부터AocI-NotI 제한효소 부위에 이르는 유전자를 결실시킴으로써 제조하였다(도 1).

상기 벡터들을 각각 형질전환시킨 대장균 세포주(E.coliBL 21 DE3)는 50 ㎍/ml 카나마이신(kanamycin)을 포함한 37℃ LB 배양액에서, 595 nm 흡광도가 0.5∼0.6까지 배양하고, 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-(-)-thiogalactopyranoside)로 37℃에서 3시간 동안 재조합 βig-h3 단백질의 발현을 유도하여, 용해 완충용액(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, o.5 mM DTT)에 재부유시키고 초음파로 분쇄하였다. 봉입체 형태로 발현된 단백질들은 8 M 요산 변성완충액으로 용해시켰고, 변성된 단백질들은 Ni-NTA 수지(resin,Qiagen)을 이용해 정제하였다. 재조합 단백질은 200 mM 이미다졸(imidazole) 용액에서 용리한 다음, 50 mM 염화나트륨을 포함한 20 mM 트리스 염산 완충액 내에서 고농도에서 저농도 요산으로 차례로 투석하여 정제하였다. 상기 발현 정제된 제조합 단백질은 SDS-PAGE에 의하여 확인하였다(도 2).

<1-2> βig-h3 재조합 단백질에 의한 세포부착 활성 확인

세포부착 활성 실험에 이용된 사람의 각막상피세포(HCE 세포)는 15%의 소혈청(fetal bovine serum), 젠타마이신(40 ㎍/㎖), 인슐인(5 ㎍/㎖), 콜레라 톡신(0.1 ㎍/㎖) 및 사람의 상피 성장호르몬인 hEGF(10 ng/㎖)을 포함하는 DMEM(DMEM/F-12, Gibco BRL) 배지를 이용하여, 5% 이산화탄소 및 37℃ 조건으로 배양하였다.

세포 부착 활성은 다음과 같이 측정하였다. 먼저, 재조합 βig-h3 단백질 또는 다른 세포외 기질 단백질들을 37℃에서 1시간 동안 96 웰 플레이트(Falcon)에 부착시킨 후, 동일한 온도에서 0.2% BSA를 포함하는 인산염 완충용액으로 세척하여 부착되지 않고 남아있는 단백질들을 제거하였다. 세포외 기질 단백질로는 인간 혈장 비트로넥틴(Human plasma vitronectin, Promega), 정제된 인간 혈장 피브로넥틴(purified human plasma fibronectin, pFN), 닭 콜라겐 타입 Ⅰ 및 Ⅱ(chicken collagen types I and II, Chemicon International Inc.), 소 콜라겐 타입 Ⅳ 및 Ⅵ(bovine collagen types IV and VI, Chemicon), 생쥐 라미닌(mouse laminin, Chemicon) 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA, Sigma)을 이용하였다. 각 세포는 트립신을 처리하여 2 × 10⁵cells/㎖의 농도로 배양액에 현탁시키고, 0.1 ㎖ 씩 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.

상기 웰 플레이트를 37℃에서 1시간 방치한 후, 부착되지 않은 세포는 인산염 완충용액으로 세척하여 제거하였다. 부착된 세포는 헥소스아미다아제 기질(hexosamidase substrate)로 작용하는 3.75 mM p-니트로페놀-N-아세틸 1-β-D-글리코사미니드(p-nitrophenol-N-acetyl l-β-D-glycosaminide) 및 0.25% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함하는 50 mM 구연산 완충용액(citrate buffer, pH 5.0)를 첨가하여, 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 5 mM EDTA를 포함하는 50 mM 글리신 완충용액(glycine buffer, pH 10.4)을 첨가하여 효소 활성을 정지시킨 후, 멀티스캔 MCC/340 마이크로플레이트 분석기(Multiskan MCC/340 microplate reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포부착 활성을 나타내는 지표의 하나로 세포 표면적을 측정하기 위하여는, 4 × 10⁴개의 세포를 기질이 부착된 48-웰 플레이트 내에 첨가하였다. 기질에 부착된 세포는 8% 글루타르알데히드(glutaraldehyde, Sigma)로 고정시키고, 20% 메탄올(methanol)에 용해시킨 0.25% 클리스탈 바이올렛(crystal violet, Sigma)으로 염색하였다. 세포 표면적은 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Image-Pro plus software, Media Cybernetics)를 사용하여 측정하였다. 상기 측정은 각 실험 마다 위치당 200 내지 300회 측정하였으며, 이를 3회 반복하여 수행하였다. 데이타는 3번 측정한 값의 평균 ±S.D로 나타내었다.

βigh3-WT 및 βigh3-△RGD를 이용하여 세포 부착 및 확산 활성을 측정한 결과, βigh3-WT에 부착된 HCE 세포의 수와 표면적은 음성대조군으로 사용된 알부민(albumin)에 부착된 것보다 월등하게 많았으며, 양성대조군으로 사용된 피브로넥틴(fibronectin)에 부착된 것과는 서로 유사하였다(도 3). 또한, βig-h3의 세포 부착 및 분산은 농도의존적 양상을 나타낸다(도 4의 A및B). RGD 모티프가 결실된 재조합 단백질 βigh3-△RGD 역시 세포 부착 및 확산을 촉진하는데 있어 피브로넥틴 및 βigh3-WT와 거의 동일한 활성을 나타내었다(도 5의 A및B). 이러한 결과는 βig-h3가 RGD 모티프에 비의존적으로 세포 부착 및 분산을 촉진한다는 사실을 증명하는 것이다.

<실험예 1> βig-h3 단백질의 세포부착 활성에 관여하는 βig-h3의 세포 표면 수용체 확인

<2-1> 기질 펩타이드 및 시약을 이용한 세포 부착활성 확인

본 발명자들은 βig-h3 단백질의 세포부착 활성에 관여하는 세포 표면 수용체를 밝히기 위하여, 여러 시약을 이용한 세포 부착 저해실험을 수행하였다.

먼저, 플라스틱 배양 접시를 각각의 피브로넥틴, βigh3-WT 또는 βigh3-△RGD 10 ㎍/㎖으로 코팅하였다. HCE 세포를 5 mM EDTA, 100 ㎍/㎖ βigh3-WT, 100 ㎍/㎖ βigh3-△RGD, 1 mM RGD, 1 mM RGE 또는 100 ㎍/㎖ 피브로넥틴이 첨가 또는 첨가되지 않은 배지에서 30분 동안 전배양하고<실시예 1>과 동일한 방법으로 세포 부착 활성분석을 수행하였다.

그 결과, βig-h3에 대한 세포 부착은 βig-h3 자신, RGD 펩타이드 및 EDTA에 의해 현저하게 억제되는 반면, 피브로넥틴 및 EGTA에 의해서는 부분적으로 억제되며, RGE 펩타이드에 의해서는 거의 억제되지 않았다. 피브로넥틴에 대한 세포부착 역시 피브로넥틴 자신, RGD 펩타이드 및 EDTA에 의하여 억제되었고, βig-h3 및 EGTA에 의해서는 부분적으로 억제되며, RGE 펩타이드에 의해서는 거의 억제되지 않았다(도 6a). 이는 βig-h3-매개 세포 부착을 위한 βig-h3의 세포 표면 수용체가 RGD-의존성 인테그린의 하나임을 의미한다.

<2-2> 세포 부착 활성에 대한 2가 양이온의 필요성 분석

βig-h3-매개 세포 부착 활성에 대한 2가 양이온의 필요성을 분석하기 위하여, pH 7.4의 햅스-완충용액(Hepes-buffered saline(HBS); 150 mM NaCl, 25 mM Hepes)에 2×10⁵개/㎖ 농도로 세포를 현탁하여 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, HBS로 두번 세척하고 동일한 완충용액에 다시 현탁하였다. 상기 세포 현탁액 50 ㎕를 웰 플레이트에 첨가한 후, 2가 양이온(MnCl₂, MgCl₂또는 CaCl₂)의 최종 농도의 두배를 포함하는 50 ㎕ HBS와 혼합하여 5% CO₂의 습한 대기 조건에서 37℃, 30분 동안 배양하였다. 세포 부착 활성 분석은 βig-h3-WT가 코팅된 배양접시(ligand-coated dishes)로 옮겨 측정하였다.

그 결과, βig-h3에 대한 세포 부착이 Mn²⁺에 의해서 매우 강하게 촉진되는반면, Mg²⁺에 의해서는 조금 약하게 촉진되고, Ca²⁺에 의해서는 거의 촉진되지 않았다(도 6b). 이러한 결과는 βig-h3-매개 세포 부착 활성을 위한 βig-h3의 세포 표면 수용체가 RGD-의존성 인테그린의 하나이며, βig-h3와의 결합에 있어 2가 양이온을 요구함을 의미한다.

<2-3> 인테그린의 단일클론 항체를 이용한 βig-h3의 세포 표면 수용체 확인

βig-h3 수용체를 분리 확인하기 위하여, βig-h3로 코팅된 표면에 부착하는 HCE 세포에 대한 인테그린 소단위들에 대한 기능-억제 단일클론항체(function-blocking monoclonal antibodies)를 사용하여 억제 효과를 조사하였다. 먼저 여러가지 타입의 인테그린 소단위에 대한 기능-억제 단일클론 항체 5 ㎍/㎖를 각각 2 × 10⁵개/㎖ 농도의 0.5 ㎖ 세포 배양액내에서 HCE 세포와 37℃에서 30분 동안 전배양하였다. 이를 10 ㎍/㎖ βigh3-WT가 코팅된 웰 플레이트로 옮긴 후 37℃에서 1시간 더 배양하고, 부착된 세포를 헥소스아미다아제(hexosamidase) 분석에 의하여 정량하였다. 정량값은 항체를 첨가하지 않은 경우 세포 부착수의 %로서 나타내었다.

그 결과, βig-h3 코팅 표면에 대한 세포 부착은 인테그린 α3 소단위에 대한 항체에 의해 특이적으로 억제되었다. 인테그린 α3 소단위는 인테그린 β1 소단위와 함께 작용한다고 알려져 있으므로, 항-β1 항체의 βig-h3에 대한 세포 부착 억제를 조사한 결과, 항-β1 항체 역시 세포 부착을 억제함을 확인하였다(도6c). HT1080 세포에서도 동일한 결과가 관찰되었다.

상기의 기능-억제 항체에 대한 대조군 실험으로 피브로넥틴, 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin) 및 타입 Ⅰ 콜라겐(type Ⅰ collagen)등을 기질로 사용하였다. 구체적으로, 인테그린 소단위에 대한 기능-억제 단일클론 항체와 HCE 세포를 전배양한 후 10 ㎍/㎖ 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐 Ⅰ형 또는 라미닌 각각이 코팅된 웰로 옮겨 배양한 후 세포수를 정량하였다.

그 결과, 피브로넥틴에 대한 세포 부착은 인테그린 α3 및 α5에 의해 명백하게 억제되었고, 비트로넥틴 및 타입 Ⅰ콜라겐에 대한 세포 부착은 각각 인테그린 αv 및 α2 에 대한 항체에 의해 억제되는 반면, 라미닌에 대한 세포 부착은 인테그린 α3 및 α6에 대한 항체에 의해 억제되었다(도 6d). 한편, β1 인테그린에 대한 항체는 상기에 언급한 모든 리간드에 대한 세포 부착을 효과적으로 억제하였다.

또 다른 대조군 실험으로서, 본 발명자들은 α5 인테그린은 발현하지만 α3 인테그린은 발현하지 않는 K562 세포를 사용하여 βig-h3의 세포 부착 실험을 수행하였다. K562 세포를 βigh3-WT, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 Ⅰ형이 고팅된 플레이트 각각에 접종한 후 1시간 동안 배양하고 기질에 부착된 세포수를 헥소스아미다아제 분석에 의해 정량하였다. 그 결과, K562 세포는 βig-h3에는 부착하지 않고 피브로넥틴에만 부착하였는데, 이는 인테그린 α3β1이 HCE 세포 부착 활성을 위한 βig-h3의 특이적인 기능 수용체임을 나타낸다(도 6e).

<실시예 2> βig-h3의 세포 부착 활성을 위한 필수 도메인 확인

본 발명자들은 βig-h3의 세포 부착에 필수적인 도메인을 밝히기 위하여, 각각의 반복 도메인만으로 세포 부착을 매개할 수 있는지 여부를 조사하였다.

βig-h3의 일부 도메인만을 포함하는 각각의 재조합 단백질은 아미노산 서열 129번부터 241번까지, 237번부터 377번까지, 368번부터 506번까지, 498번부터 637번까지 해당하는 βig-h3 cDNA 각각의 절편들을 PCR에 의해 증폭시킨 후, 벡터 pET-29b(+)의 EcoRV 및 XhoI 위치에 클로닝하여 각각 pβig-h3 D-Ⅰ, pβig-h3 D-Ⅱ, pβig-h3 D-Ⅲ 및 pβig-h3 D-Ⅳ로 명명한 발현벡터를 이용하여 제조하였다(도 7). 상기 발현벡터 pβig-h3 D-Ⅱ 및 pβig-h3 D-Ⅳ에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체는 각각E. coliBL21/Hisβ-g 및E. coliBL21/Hisβ-e로 명명하였으며, 2000년 4월 25일자로 생명공학 연구소 유전자 은행에 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 18010P 및 KCTC 18009P).

상기 형질전환체를 이용한 βig-h3의 일부 도메인을 포함하는 재조합 단백질 βig-h3 D-Ⅰ, βig-h3 D-Ⅱ, βig-h3 D-Ⅲ 및 βig-h3 D-Ⅳ의 발현 및 정제는 상기실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 수행하였으며, SDS-PAGE를 이용하여 제조된 단백질을 확인하였다(도 8).

먼저, 이들의 세포 부착 활성을 조사하였는데, 2번째 fas-1 도메인과 4번째 fas-1 도메인이 야생형 βig-h3에 상응하는 활성을 나타낸 반면, 1번째 fas-1 도메인은 미약하게, 3번째 fas-1 도메인은 세포 부착 활성을 거의 나타내지 않았다(도9).

인테그린 소단위에 대한 기능-억제 항체 실험 결과에 있어서도, 2번째 및 4번째 fas-1 도메인에 의하여 매개되는 세포 부착은 α3 및 β1 인테그린 소단위에 대한 항체에 의해 거의 억제되었는데, 이러한 결과는 2번째 및 4번째 fas-1 도메인에 α3β1 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산이 존재함을 의미한다(도 10). 이는 또한 H1 및 H2 서열을 가지는 1번째 및 3번째 fas-1 도메인이 세포 부착 활성을 나타내지 않으므로, H1 및 H2 서열이 βig-h3의 세포 부착 활성을 매개하는데 필수적이지 않음을 나타낸다.

<실시예 3> βig-h3의 도메인내 세포 부착에 필수적인 보존적 아미노산 서열 확인

<3-1> 아미노산 서열 분석에 의한 모티프 확인

상기의 결과에 근거하여 본 발명자들은 세포 부착 활성을 나타내는 2번째 및 4번째 fas-1 도메인 내에 존재하는 세포 부착 관련 모티프를 찾기 위하여, βig-h3의 반복적인 fas-1 도메인들 뿐만 아니라, 상기 도메인을 포함하는 다른 단백질들 사이에서 상동성을 조사하였다. 그 결과, 각각의 fas-1 도메인내 H2 지역 가까운 위치에서 매우 보존적인 두 개의 아미노산, 즉 아스파르트산 및 이소류신을 찾아내었다(도 11). 구체적으로 βig-h3의 2번째 및 4번째 도메인을 포함한 많은 fas-1 도메인들은 매우 보존적인 아스파르트산 및 이소류신을 가지는 반면, βig-h3의 1번째 도메인은 아스파르트만이 보존적이고, βig-h3의 3번째 도메인에는 상기의 보존적 아미노산이 모두 존재하지 않았다.

<3-2> 치환 돌연변이를 이용한 보존적 아미노산 서열의 세포 부착 활성 확인

본 발명자들은 상기의 두 보존적 아미노산이 세포 부착 활성에 있어 필수적임을 밝히기 위하여, βig-h3 4번째 도메인의 치환 돌연변이체를 제작하였다(도 12). βig-h3 D-Ⅳ의 치환 돌연변이체는 PCR 방법을 이용하여 제조하였으며, 제조된 돌연변이체들은 DNA 염기서열을 분석하여 확인하였다. 상기의 돌연변이체 재조합 단백질은실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 분리·정제하고, SDS-PAGE 를 통하여 확인하였다(도 13).

먼저 아스파르트산을 포함하는 서열의 세포 부착 활성을 확인하기 위하여, 4번째 도메인의 아미노산 서열 616번 프롤린(proline)이 세린으로 치환된 P616S, 617번 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 D617A 및 618번 이소류신이 세린으로 치환된 I618S 각각의 세포 부착 활성을 조사하였다. 그 결과, D617A(βig-h3 D-IV-Pal) 및 I618S(βig-h3 D-IV-PDs) 돌연변이는 세포 부착 활성을 상당히 억제하는 반면, P616S(βig-h3 D-IV-sDI) 돌연변이는 세포 부착 활성에 아무런 영향을 미치지 않았다. 또한, 상기 세가지 아미노산이 모두 치환된 돌연변이, P616S/D617/I618S(βig-h3 DIV-sas) 역시 세포 부착 활성이 억제되었다(도 14). 이처럼 4번째 fas-1 도메인의 아스파르트산 및 이소류신의 돌연변이체의 세포 부착 활성이 거의 완벽하게 억제되는 것으로 보아, 617번 아스파르트산 및 618번 이소류신이 세포 부착에 필수적인 아미노산임을 확인하였다.

<실시예 4> βig-h3의 일부 도메인의 창상 치유 효과 확인

<4-1> 재조합 βig-h3 단백질의 발현 및 정제

상기에서 세포부착에 활성을 보이는 βig-h3의 일부 도메인 만으로도 4개의 도메인을 모두 포함하고 있는 천연의 βig-h3 단백질과 동일한 창상치유 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 천연 βig-h3 단백질과 동일하게 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함하고 있는 βig-h3 재조합 단백질 His-β-b, 4개의 도메인 중 4번째 도메인만을 포함하는 βigh3-D-Ⅳ 및 상기 4번째 도메인을 2개 이상 포함하고 있는 βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X 및 4X를 제조하였다(도 15). βig-h3 재조합 단백질 His-β-b는 상기실시예 <1-1>에서 제조한 βigh3-WT과 동일한 세포부착 활성을 보이는 것으로 βig-H3 cDNA로부터 아미노 말단부분이 일부 결실된 Asp718 - BglⅡ 단편을 pET-29β의 EcoRⅤ와 EcoRⅠ부위에 삽입하여 제조한 것이다. 상기 재조합 단백질과 4번째 도메인을 포함하는 재조합 단백질 βigh3-D-Ⅳ은 상기실시예 <1-1>및<실시예 3>에 기재된 방법으로 발현 및 분리정제하였으며, 4번째 도메인을 하나 이상 포함하고 있는 βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X 및 4X는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

즉, 4번째 도메인에 해당하는 아미노산 498에서 637까지의 단편을 PCR로 합성하여 Klenow로 3' 말단부분을 평활화시킨 후,실시예 3에서 제조한 4번째 도메인을 포함하는 발현벡터 pβig-h3 D-Ⅳ의EcoRV 부위에 삽입하고 이를 pβig-h3 D-IV 2X라 명명하였다. Pβig-h3 D-IV 2X의 삽입절편을EcoRV와XhoI으로 잘라내어 역시 같은 방법으로 Klenow로 3' 말단부분을 평활화시킨 후, pβig-h3 D-Ⅳ 및 pβig-h3 D-IV 2X의EcoRV 부위로 각각 삽입하고, 이를 pβig-h3 D-Ⅳ 3X와 pβig-h3 D-Ⅳ 4X로 명명하였다. 이들 모든 재조합 단백질은 3시간동안 1 mM IPTG로 발현을 유도하고 Ni-NTA 수지 (Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 분리된 재조합 단백질들은 50 mM NaCl과 300 mM 이미다졸(imidazole)을 포함한 20mM Tris-HCl로 용출하여 분리 정제하였다. βig-h3 D-IV 2x, 3x 및 4x는 4개의 도메인을 모두 포함하고 있는 βig-h3 재조합 단백질과는 달리 모두 수용성으로 합성되어 변성단계를 거치지 않아도 되며, 많은 양을 쉽게 얻을 수가 있다(도 16의 A). 또한, βig-h3 D-IV 및 βig-h3 D-IV 2x, 3x 및 4x를 비변성 젤을 이용하여 전기영동한 결과, βig-h3 D-IV는 폴리머를 형성하지 못하였으며 2x는 일부 폴리머를 형성하였고, 3x와 4x는 폴리머를 를 잘 형성함을 알 수 있었다(도 16의 B).

상기 발현벡터 중 βig-h3의 4번째 도메인을 4개 포함하고 있는 발현벡터 pβig-h3 D-Ⅳ 4X에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체E. coliBL21/Hisβ-e4X는 2000년 4월 25일자로 생명공학 연구소 유전자 은행에 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 18011P).

양성 대조군으로 사용된 피브로넥틴(fibronectin)은 백서의 구연산염 첨가혈장(citrated rat plasma)과 젤라틴-세파로즈 4B(gelatin-sepharose 4B)에서 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 정제하였다. 혈장을 비치환된 세파로즈 4B(sepharose 4B)로 실온에서 여과하고 그 유출액을 0.05 M EACA(ε-amino caproic acid), 0.02 M 구연산나트륨, 0.02% 소디움 아자이드(sodium azaid)를 포함한 0.05 M 트리스 염산으로 평형화시킨 젤라틴-세파로즈(gelatin sepharose4B)에 부하시켰다. 혈장단백 대부분을 용리한 후, 1 M 염화나트륨을 포함한 완충액으로 세척했다. 흡착된 피브로넥틴은 3 M 요산 등장 완충액으로 용리했는데, 요산 용리액은 바로 인산염 완충액(phosphate buffer saline, PBS, pH7.2)으로 약 48시간 투석시켜 피브로넥틴을 정제하였다. 정제된 피브로넥틴의 농도는 280 nm에서 자외선(UV) 흡광도로 결정하였고, 동결건조 후 -20℃에서 보관하였다.

<4-2> 4번째 도메인을 포함하는 βigh3-D-Ⅳ의 창상치유 효과 확인

먼저, 천연 βig-h3 단백질과 동일하게 4개의 fas-1 도메인을 모두 포함하고 있는 βig-h3 재조합 단백질 His-β-b 및 4개의 도메인 중 4번째 도메인만을 포함하는 βigh3-D-Ⅳ의 창상치유 효과를 비교하기 위하여 상기 재조합 단백질을 포함하는 연고기제를 제조하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

백서의 등에 직경 2cm의 원형의 피부전층창상 4곳을 만들어 각 창상에 도포한 연고의 내용물에 따라 실험군 1-A, 1-B, 1-C, 1-D, 로 세분하였다.

1-A : 연고 기제(ointment base)에 아무 물질도 혼합하지 않고 연고 기제 만을 하루에 1gm씩 도포한 창상.

1-B : 연고 기제에 피브로넥틴(fibronectin)을 100 ㎍/ml 농도로 혼합한 연고를 하루에 1gm씩 도포한 창상.

1-C : 연고 기제에 Hisβ-b 단백질을 100 ㎍/ml 농도로 혼합한 연고를 하 루에 1g씩 도포한 창상.

1-D : 연고 기제에 βigh3-D-Ⅳ 단백질을 100 ㎍/ml 농도로 혼합한 연고를하루에 1g씩 도포한 창상

먼저 백서를 에테르로 마취시킨 후, 등을 면도하여 베타딘 용액으로 소독하였다. 실험군 1에서는 백서의 등 4 군데에 지름 약 2 cm의 원형의 창상을 15번 수술칼을 이용해 피부전층으로 만들고, 각각의 창상에 실험군 1-A, 1-B, 1-C, 1-D에 사용된 연고를 약 1 g 도포한 후 드레싱용 합성물질(Tegaderm^??, 3M)로 창상을 덮고 압력붕대로 가볍게 싸주었다. 연고의 교체는 하루 1회 매일 시행하였다.

사용한 연고기제는 수용성 연고기제(삼아베이스)를 사용하였으며, 연고기제 1 g당 경납 38 ㎎, 스테아릴알코올 116 ㎎, 폴리에틸렌글리콜 38 ㎎, 농글리세린 192 ㎎, 에탄올 23 ㎎, 라울릴 황산나트륨 ㎎, 파라옥시안식향산에칠 0.87 ㎎, 파라옥시안식향신부칠 0.12 ㎎ 및 정제수를 포함하고 있다.

먼저 육안적 형태측정을 시행하였는데, 동일한 눈금자를 각 창상연과 평행으로 근접되게 위치시킨 후 같은 거리에서 근접 사진촬영을 실시하고, 사진을 컴퓨터 스캔한 후 이미지 분석기(NIH image analysis system, Bio-Optics)를 이용하여 남은 상처의 면적을 측정하였다. 이때 백서는 에테르로 충분히 흡입마취시킨 후, 근육이 완전 이완된 상태에서 실시하였으며, 22일째까지 2일에 한번씩 측정하여 비교 분석하였다. 측정된 값들은 시간에 따른 각 실험군간의 상호비교로 분산분석법(ANOVA test)과 쉐페법(Scheffe's test)을 이용하였다.

그 결과, 전군에 있어서 창상면적은 창상형성 직후부터 서서히 감소하였으며, 그 중 연고 기제만으로 처리한 군에 비해 피브로넥틴과 βig-h3 재조합 단백질을 적용한 군에서 그 면적 감소가 더욱 빨랐다. 창상면적의 감소는 창상치유 초기보다 7일 이후 현저한 차이가 나타나기 시작하였으며, 통계학적으로는 수술 후 2일, 8일, 10일에서 1-A 창상에 비해 다른 창상들에서 유의한 차이가 있었으나(p＜0.05) 다른 창상들 상호간에는 유의한 차이는 없었다(표 1및도 17).

<표 1> 각 βig-h3 재조합 단백질을 포함한 연고기제의 창상면적의 감소효과

수치: 평균값±표준 편차,

* : 분산분석법(ANOVA test)과 쉐페법(Scheffe's test)의한 유의도 p＜0.05

a,b : 통계학적 차이를 보이는 수치

또한, 광학현미경 조직학적 분석을 시행하였다. 창상부위들을 3, 7, 10, 14, 20일째 생검한 후 즉시 10% 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후, 6 ㎛ 두께로 잘라 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin, HE) 및 마손의트리크롬(Masson's trichrome) 염색을 수행하여 관찰하였다. 각 사용물질들의 시간에 따른 창상치유 효과는 재상피화 및 교원섬유의 형성 여부를 통하여 관찰하였는데, 이 중 재상피화는 그 생성정도를 반정량화하여 상피층의 형성이 되지 않는 경우를 0, 상피층이 형성되기 시작할 경우를 1+, 형성은 되었으나 상피층의 구조가 불완전할 경우를 2+, 상피층의 형성이 완전할 경우를 3+로 등급화하였다. 측정된 값들은 시간에 따른 각 실험군간의 상호비교와 각 실험군 내에서의 시간에 따른 차이에 대해 분산분석법와 쉐페법을 이용하여 통계 처리하였다. 교원섬유의 형성은 트리크롬 염색상 그 형성의 정도가 매우 미약한 경우를 1+, 그 형성이 엉성한 경우 2+, 형성의 정도가 밀집되어 있는 경우를 3+로 등급화하여 비교하였다.

먼저 재상피화에 대한 광학현미경적 관찰 결과는, 실험군 1-B, 1-C, 1-D에서는 7일에서 10일경사이에 시작되어 20일경에는 재상피화가 모두 이루어진 것으로 나타났으나, 대조군인 1-A에서는 14일경에도 아직 재상피화가 시작되지 못하였고 20일경에도 재상피화를 완성하지 못하였다(표 2및도 18).

<표 2> 창상에서의 재상피화

일군	3	7	10	14	20
1-A(대조군)	0	0	0	0	2+
1-B(피브로넥틴)	0	1+	1+	2+	3+
1-C(His-β-b)	0	0	1+	2+	3+
1-D(βig-h3 D-Ⅳ)	0	0	1+	2+	3+

교원섬유(collagen fiber)의 형성에 있어서는표 3에 나타난 바와 같이, 초기 7일까지는 실험군 1-A, 1-D에서 1+ 정도로 미약한 형성을 나타나는데 비해, 1-B 및1-C에서 2+ 정도로 차이를 보이나 약 10일경에는 모든 창상에서 2+로 비교적 풍부한 교원섬유의 형성을 관찰할 수 있었다. 약 14일경에 이르러서는 모든 창상에서 3+ 로 밀집되고 잘 배열된 교원섬유를 관찰할 수 있으며 그 양도 더욱 증가되었다(표 3및도 19). 이러한 교원섬유 형성의 증가는 창상치유가 잘 일어남을 의미하는 것이다.

<표 3> 창상에서의 교원섬유 형성양상

일군	3	7	10	14	20
1-A(대조군)	1+	1+	2+	3+	3+
1-B(피브로넥틴)	1+	2+	2+	3+	3+
1-C(His-β-b)	1+	2+	2+	3+	3+
1-D(βig-h3 D-Ⅳ)	1+	1+	2+	3+	3+

교원섬유의 형성정도 0 : 음성 1+ : 매우 미약

2+ : 형성 3+ : 매우 밀집된 형성

<4-3> 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 βigh3-D-Ⅳ,βig-h3 D-IV2X, 3X 및 4X의 창상치유 효과 확인

4번째 도메인만을 포함하는 βigh3-D-Ⅳ이 창상치유에 효과적이라는 상기 결과를 근거로 본 발명자들은 4번째 도메인을 2개 이상 포함하는 βigh3-D-Ⅳ 2X, 3X및 4X를 제조하여 상기 도메인의 각막상피세포 부착 및 창상치유 효과를 확인하였다.

상기실시예 <1-2>에 기재된 방법으로 각막상피세포에 대한 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 제조합 단백질의 세포 부착활성을 조사한 결과, βig-h3 D-IV, βig-h3 D-IV 2X, 3X 및 4X가 모두 각막상피세포의 부착을 잘 유도함을 확인하였다(도 20).

창상치유 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

실험동물로는 체중 250-300 gm의 성장한 Sprague-Dawley계 백서를 이용하였고 실험기간 동안 일정한 온도와 습도 하에서 표준 사료로 사육하였다.

실험군 2에서는 백서의 등에 직경 7mm의 원형의 피부전층결손을 4곳에 만들어 각 창상에 도포한 키토산 기제와 혼합된 내용물에 따라 2-A, 2-B, 2-E, 2-F로 세분하였다.

2-A : 아무 물질도 혼합하지 않고 키토산 기제만을 창상에 도포한 창상.

2-B : 키토산 기제에 피브로넥틴을 500 ㎍/㎖ 농도로 혼합한 복합체를 도포 한 창상.

2-E : 키토산 기제에 βigh3-D-Ⅳ 3X 단백질을 500 ㎍/㎖ 농도로 혼합한 복 합체를 도포한 창상.

2-F : 키토산 기제에 βigh3-D-Ⅳ 4X 단백질을 500 ㎍/ml 농도로 혼합한 복 합체를 도포한 창상.

상기의 키토산을 기제로 한 복합체는 하기의 방법으로 제조하였다. 분자량이 600,000 달톤인 수용성 키토산(Poly(1→4) 2-amino-2-deoxy-β-D-glucan, 자광)분말 1 g을 멸균 증류수 100 ㎖에 녹여 1% 용액으로 만든 후 12 웰 플레이트(코닝, USA)에 각각 2 ㎖씩 나누어 담은 후 겐타마이신(gentamycin) 100 ㎍을 각각 첨가했다. 복합체의 종류에 따라 피브로넥틴, βigh3-D-Ⅳ 3X, βigh3-D-Ⅳ 4X를 각각 500 ㎍/㎖의 농도로 첨가시킨 다음, -70℃로 얼린 후 동결건조기(freeze drier, 일신)에서 약 12시간 정도 동결건조시켜 원판 모양의 복합체를 제작하였다.

먼저 백서를 에테르로 마취시킨 후, 백서의 등을 면도하고 베타딘 용액으로 소독했다. 백서의 등에 직경 약 7mm의 원형의 피부전층창상을 4군데에 만들고 각각 실험군 2-A, 2-B, 2-E, 2-F에 사용된 복합체로 덮은 후, Tegaderm^??(3M, USA)으로 다시 덮고 압력붕대로 싸주었으며 복합체의 교체는 3일 간격으로 시행하였다.

창상치유 효과는 상기실시예 <4-2>의 방법과 동일하게 육안적 형태측정으로써 시행하였다.

그 결과, 키토산 기제에 재조합 βig-h3 D-IV 3X 및 4X 단백질을 혼합한 복합체의 창상치유 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

2-A를 제외한 2-B에서 한 마리, 2-E, 2-F에서 두 마리 외의 모든 백서에서 12일부터 15일 사이에 완전히 창상치유가 되었으며, 창상면적은 전체 창상에서 창상형성 직후부터 감소하였고, 2-A에서는 전기간 동안 비교적 서서히 감소하는 경향을 보이나, 그 외 나머지 창상에서는 초반 3일 정도까지 급격히 감소하고 약 9일정도까지 완만히 감소한 후 다시 급격히 감소하는 양상을 보였다. 창상 상호간의 비교를 볼 때 3일에서 15일 전 기간에 걸쳐 2-B, 2-E, 2-F에서 2-A에 비해 유의한 차이가 있었다(p＜0.05)(표 4 및 도 21).

<표 4> 창상면적의 감소효과(㎟)

수치: 평균값±표준 편차,

* : 분산분석법(ANOVA test)에 의한 유의도 p＜0.05

a,b : 통계학적 차이를 보이는 수치

결론적으로 본 발명의 βig-h3의 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산으로 알려진 아스파르트산과 이소류신이 존재하는 βig-h3의 2번째 도메인, 4번째 도메인 또는 상기 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질은 그 자체만으로도 세포의 부착 및 창상치유에 효과적이며, 이러한 용도는 궁극적으로 세포 배양 및 창상치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 인테그린과의 결합에 필수적인 아미노산으로 알려진 아스파르트산과 이소류신이 높은 상동성을 보이며 존재하는 βig-h3의 2번째 또는 4번째 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 세포의 부착 및 창상치유에 이용하는 방법에 관한 것으로서, 상기 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질은 그 자체만으로도 세포의 부착 및 창상치유에 효과적이며, 이러한 용도는 궁극적으로 세포 배양 및 창상치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

βig-h3 단백질의 4개 fas-1 도메인 중 2번째 또는 4번째 fas-1 도메인을 단독으로 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 인간을 제외한 동물의 세포 부착(cell attachment)에 이용하는 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, βig-h3의 2번째 fas-1 도메인은 βig-h3 단백질의 아미노산 서열 237-377을 포함하며, 발현벡터 pβig-h3 D-Ⅱ로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, βig-h3의 4번째 fas-1 도메인은 βig-h3 단백질의 아미노산 서열 498-637를 포함하며, 발현벡터 pβig-h3 D-Ⅳ로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 4개의 βig-h3 단백질의 아미노산 서열 498-637을 포함하며, 발현벡터 pβig-h3 D-Ⅳ 4X로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항의 발현벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체E. coliBL21/Hisβ-e4x(수탁번호: KCTC 18011P).
삭제
βig-h3 단백질의 4개 fas-1 도메인 중 2번째 또는 4번째 fas-1 도메인을 단독으로 또는 혼합하여 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 인간을 제외한 동물의 창상 치유에 이용하는 방법.
삭제