JP2002542824A

JP2002542824A - 組換えラミニン５

Info

Publication number: JP2002542824A
Application number: JP2000615755A
Authority: JP
Inventors: アリエルブタウド、
Original assignee: バイオストラタムインコーポレイテッド
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2002-12-17
Also published as: EP1177290A2; WO2000066731A2; AU4675300A; WO2000066731A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、組換えラミニン５、組換えラミニン５の製造方法、組換えラミニン５を発現する細胞、及び傷の治療を加速するため、及び細胞付着及び移行（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を促進するための、この組換えラミニン５の使用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】相互参照文献本出願は１９９９年４月３０日にファイルされた米国特許出願第６０／１３１
，７２０号、１９９９年８月１９日にファイルされた第６０／１４９、７３８号
、１９９９年９月２４日にファイルされた第６０／１５５，９４５号、および２
０００年２月１１日にファイルされた第６０／１８２、０１２号に対して優先権
を有し、同文献はすべて全体が参照文献として本発明に含まれる。

【０００２】発明の分野本出願は、組換えラミニン５およびその使用方法に関する。

【０００３】発明の背景基底層（基底膜）はシート状の細胞関連性細胞外マトリクスであって、細胞の
生育、組織の伸展および組織の維持において中心的役割を果たしている。実質的
にはすべての組織中に存在し、胎児の発育における最初の段階に現れる。

【０００４】基底層は多様な構造的機能および細胞間作用機能において中心的役割を果たし
ている（例えば、ＭａｌｉｌｎｄａおよびＫｌｅｉｎｍａｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ，２８：９５７−９５９（１９９６）；
ＡｕｍａｉｌｌｅｙａｎｄＫＲｉｅｇ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌｏｇｙ１０６：２０９−２１４（１９９６）らの、１．基底層は組織にとっての構造的支持物としての役割をなし、細胞にとっての
接着性基質を提供している。

【０００５】２．基底層は細胞の遊走を阻止する組織コンパートメント間におけるパーム選択
性障壁を創出し、受動的に巨大分子の交換を制御している。以上の役割は腎糸球
体基底膜によって図で示され、重要な濾過構造としての役割を果たし、ほとんど
のタンパクおよび細胞を透過しない血液・組織障壁を創出する。

【０００６】３．基底層は、反応性の高い表面を有し、胎発生および損傷修復における細胞の
遊走と伸展を促進する。外傷を受けた後、基底層は表面を提供して細胞が再生し
、正常な組織機能を保持できるようにする。

【０００７】４．基底層はその構造中に分化と組織の維持にとって重要な情報をコードしてい
る。この情報は、インテグリン、ジストログリカンおよび細胞表面プロテオグ
リカン等の様々な受容体を解して細胞へ伝えられる。信号伝達は、マトリック
スリガンドの存在に依存するばかりでなく、これに対応し、適度に親和性を有す
る受容体にも依存しているが、３次元マトリックスの「地図」におけるリガンド
密度等のトポグラフィカルな因子や、クラスタ受容体にとっての基底層成分の能
力にも依存して変化する。以上のマトリックス蛋白は寿命が長いため、基底層は
基底層における「表面記憶」を創り出して、現存する細胞や一過性の細胞にとっ
ての「表面記憶」を創り出している。

【０００８】基底層はその大半がＩＶ型コラーゲンヘテロトリマーから構成され、交互に複
雑なポリメトリック構造に組み込まれている。現在までのところ、６つのＩＶコ
ラーゲン鎖と少なくともラミニン鎖（および１２個の異なるヘテロトリメトリッ
クラミニン）が同定されている。これらの鎖が圧縮した形に押し込められて独特
な機能をもち、共有の独特な機能を保持しており、特異的テンポラル（発達性）
および空間的（組織部位特異性）パターンを保持ししている。

【０００９】ラミニンは原則的には基底層内に残っているヘテロトリメトリックな糖蛋白の
ファミリである。ラミニンは隣接する細胞受容体との相互作用を介して機能して
おり、細胞機能に強力な影響を及ぼす重大な信号分子である。ラミニンは細胞の
生育と、組織の修復および発育における分化を促進する上で、細胞／組織の表現
型を両方維持する上で重要である。

【００１０】ラミニンは、共通する構造的機構を有する巨大なマルチドメイン蛋白である。
ラミニン分子は種々のマトリックス及び細胞双方向機能を１つの分子に統合する
。

【００１１】ラミニン分子は、コイル状のコイルドメインを介して一体に結合されたα−、
β−及びγ−鎖からなる。このラミニン分子はα鎖、β鎖、γ鎖が互いにコイル
状のコリドメインを介して連結する構造から成っている。この構造内部にはその
他のラミニンおよび基底層分子および膜結合受容体に近い結合能を保持できるド
メインが認識されている。ドメインＶＩ、ＩＶｂ、ＩＶａはグローブ状をしてお
り、ドメインＶ、ＩＩＩｂ、ＩＩＩａ（システインを豊富に含むＥＧＦ様成分）
はロッド状をしている。（Ｋａｍｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ
．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：９７−１２５（１９９８））。３つの鎖のドメイン
ＩとＩＩは３重螺旋状コイル−コリ構造（長鎖）の形成に関わっている。

【００１２】表１は、各々のラミニン型の構造となっている個別の鎖を示す。

【００１３】

【表１】構造的に定義された４つのラミニン・ファミリ群が同定されている。同定され
た５つのラミニン分子中最初のグループは、すべてβ１鎖とγ１鎖を共有してお
り、α鎖（α１鎖からα５鎖）の組成にはばらつきが大きかった。同定された５
個のラミニン分子のうち２番目のグループは、すべてβ２とγ１鎖を共有し、α
鎖のばらつきが大きかった。同定されたラミニン分子のうち３つめのグループは
、１個の同定されたメンバー、ラミニン５を持ち、α３β３γ２の組成の鎖を持
っていた。同定されたラミニン分子のうち４つめのグループは、新たに同定され
たγ３鎖（α２β１γ３）からなる１つの同定されたメンバを有する。

【００１４】ドメイン構造と機能の間にある関係を明らかにする上で、若干の進歩が見とめ
られてきている。（例えば、ＷｅｗｅｒａｎｄＥｎｇｖａｌｌ、Ｎｅｕｒｏ
ｍｕｓｃ．Ｄｉｓｃｏｒｄ．６：ｐ４０９−４１８（１９９６年）を参照のこと
）。全体的な配列は、異なるさにおいて相同なドメインと類似していたが、ドメ
インＶＩの中に一番高く（ラミニンの重合化にとって鍵となる役割を担うと考え
られている）、ドメインＶ（タンパク−タンパクの相互作用に関わっていると考
えられている）とドメインＩＩＩがこれに続き（エンラクチン／／ニドゲン結
合；細胞接着部位の可能性がある）、ドメインＩとＩＩの中においていちばん少
なく（共に分子内構造に関わっていると考えられており、細胞接着部位を含むと
考えられる）、ドメインＧの中にも少ない。すべてのドメインが３つの鎖すべて
の中に存在するわけではない。このグローブ状Ｇドメイン（細胞受容体の結合に
関わっていると考えられている）は、１個の鎖の中にのみ存在している。ある
種の鎖型においては、すべての鎖の中において他のドメインが存在しないことも
ある。例えば、ドメインＶＩはα３、α４、およびγ２鎖の中には存在しない（
ＷｅｗｅｒａｎｄＥｎｇｖａｌｌ、１９９６年）。

【００１５】サイズが大きくなり（＞６００ｋＤ）構造が独特になった結果、ラミニン分子
は電子顕微鏡で解像することができる（ＷｅｗｅｒａｎｄＥｎｇｖａｌｌ
、１９９６年）。代表的には、ラミニンはＥＭ中において交差型分子の格好をし
ている。交差部分の３つの単腕部は互いに分かれた３つのラミニン鎖の各々にお
けるアミノ末端部を意味している（鎖１つあたり１個の単腕部がある）。交差部
分の長腕部は３つの鎖のうちＣ−末端部を構成しており、これらが一緒になって
コイル状のコリ構造を成している（ＷｅｗｅｒａｎｄＥｎｇｖａｌｌ、１９
９６年）。長腕部はグローブ状Ｇドメインで終っている。

【００１６】長腕部のコイル状コリドメインはラミニンにおける３つの鎖を構築する上で重
要となっている（Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ。Ｓｃｉ．９４：１０１８９−１０１９４（１９９７年））。ジスルフィ
ド結合は架橋を形成して、長腕部の一番近傍にある３つの鎖すべてを安定化し、
長腕部の一番ジスタル領域にあるβ鎖とγ鎖を連結させる。

【００１７】培養骨格ミオチューブおよびシュヴァン細胞を使った実験を基礎とするラミニ
ン受容体利用の自己構築モデルは、リガンドが結合していない場合、ラミニンは
液状膜中に自由に拡散している受容体に結合しているものと予言している。受容
体との結合が、強制的にこういった受容体を高度に局在化した２次元濃度に追い
やり、その巨視的作用によって定められた表面ポリマを構築するようならしめて
いる。この過程において、結合している受容体もまた、再度構成され、これに合
わせて細胞骨格の再構成が行われる（Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉ
ｏｌ．１４５：６１９−６３１（１９９９））。この認識が受容体を活性化し、
細胞発現、形状および／または挙動を変化させて信号伝達のトランスダクション
を引き起こす。

【００１８】ラミニン受容体のうち１つのクラスがインテグリンであり、これは多くの細胞
マトリクスと細胞−細胞相互作用を仲介する細胞表面受容体である。インテグリ
ンはヘテロダイマーであって、１個のαサブユニットと１個のβサブユニットか
ら構成されている。１６個のαサブユニットと８個のβサブユニットが知られて
おり、少なくともαサブユニットとβサブユニットには２２個の組み合わせが現
在までに同定されている。インテグリンの中には１個または複数の既知のリガン
ドのみを有するものもあり、中にはきわめて乱雑なものもある。インテグリンへ
の結合は一般に親和性が低く、２当量の陽イオンに依存している。インテグリン
はそれらのリガンドへ結合することによって活性化され、フォーカルな接着やマ
イトゲン活性化キナーゼ等のキナーゼ活性化カスケードを介して信号をトランス
ジュースしている。異なるインテグリンは異なるミニンイソフォームに多かれ少
なかれ特異的に結合する。（Ａｕｍａｉｌｌｅｙｅｔａｌ．，ｉｎＴｈｅ
Ｌａｍｉｎｉｎｓ，ＴｉｍｐｌａｎｄＥｋｂｌｏｍ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗ
ｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．１２
７−１５８ページ）。

【００１９】ラミニン−５はカリニン、ニセイン、およびエピリグリンともいわれ、細胞の
挙動や活性のモジュレートにとって重要な役割を果たし、上皮の接着やヘミデス
モソームの構築が必要とされるに従い、臨床設定において幅広く使われることが
期待されている。（Ｔａｋｅｄａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ
ａｔｏｌ．１９９９年、１１３（１）：３８−４２ページ）。ラミニン−５は上
皮基底層において主要な接着性リガンドであって、ケラチノサイトおよび上皮細
胞の接着を促進することが示されており、現状でのデルミス、ヘミデソモソーム
の構築をも促進するといわれる（米国特許第５，７７０，５６２号のバーゲソン
等（Ｂｕｒｇｅｓｏｎｅｔａｌ．）、米国特許第５，４２２，２６４号のＱ
ｕａｒａｎｔａａｎｄＨｏｒｍｉａ、米国特許第５，５４１，１０６号のＪ
ｏｎｅｓ、米国特許第５，６５８，７８９号のＱｕａｒａｎｔａａｎｄＨｏ
ｒｍｉａ、Ｈｏｒｍｉａｅｔａｌ．，のＪ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ．１９９５年１０月、第１０５巻第４号：５５７−５６１ページ）。

【００２０】ラミニン５はまた、上皮組織の傷の治療にも必要であると考えられている（Ｇ
ｏｌｄｆｉｎｇｅｒら、Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１９９９；１１２（Ｐｔ．１６
）；２６１５―２６２９）。ラミニン５での移植用ヒトケラチン生成細胞の前処
理は、移植効率を改良する（Ｔａｋｅｄａら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ
ｏｌ．１９９９Ｊｕｌ；１１３（１）：３８―４２）。ラミニン５の添加は、
皮膚の同等モデルにおいて、基底膜の形成を加速する（Ｔｓｕｎｅｎａｇａら、
ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．１７（８―９）：６０３―６１３、１９９８）。ラミ
ニン５はまた、ポリマー、ヒドロキシアパタイト、及び金属を含む、非常に多様
な生物材料への上皮細胞付着をも促進する（Ｊｏｎｅｓら、米国特許第５，５８
５，２６７号；ＥｌＧｈａｎｎａｍら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅ
ｓ．１９９８Ｊｕｌ；４１（１）：３１―４０）。

【００２１】ラミニン５はさらに、下記のものを促進することも証明された：１．歯の内部基礎層板への上皮細胞接着（Ｍｕｌｌｅｎら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄ
ｏｎｔａｌ．Ｒｅｓ．１９９９Ｊａｎ３４（１）：１６―２４；Ｈｏｒｍｉ
ａら、Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．１９９８Ｊｕｌ：７７（７）：１４７９―１４
８５）及びエナメルマトリックスへのエナメル芽細胞（すなわち、エナメル生産
細胞）の固定（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）（Ｙｏｓｈｉｂａら、ＣｅｌｌＴｉｓｓ
ｕｅＲｅｓ．１９９８Ａｐｒ：２９２（１）：１４３―１４９）。

【００２２】２．角膜上皮細胞接着（Ｑｉｎ及びＫｕｒｐａｋｕｓ，Ｅｘｐ．ＥｙｅＲｅ
ｓ．１９９８Ｍａｙ６６（５）：５６９―５７９）。

【００２３】３．腸上皮回復（Ｌｏｔｚら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９７Ｆｅｂ：
１５０（２）：７４７―７６０）。

【００２４】４．一次細胞培養用の効率的接着基質を供給することによる上皮細胞の試験管
内膨張。従って広範囲の新規細胞治療への用途のための基礎を供給する（Ｇｏｎ
ｚａｌｅｓら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９９９Ｆｅｂ；１０（２）：
２５９―２７０；Ｂａｋｅｒら、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．１９９６Ｎｏｖ１；２２８（２）２６２―２７０）。

【００２５】５．すい臓ベータ島細胞（Ｔｏｄｏｒｏｖら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏ
ｃ．１９９８Ｍａｒ；３０（２）：４５５；Ｑｕａｒａｎｔａ及びＪｏｎｅｓ
、米国特許第５，５１０，２６３号；Ｈａｌｂｅｒｓｔａｄｔら、米国特許第５
，６８１，５８７号；Ｈａｌｂｅｒｓｔａｄｔら、米国特許第５，６７２，３６
１号）、及びＴ細胞（Ｖｉｖｉｎｕｓ―Ｎｅｂｏｔら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ
．１９９９Ｆｅｂ８；１４４（３）：５６３―５７４）の増殖。

【００２６】従ってラミニン５は、上皮付着の増加及びヘミデスモソーム集合が必要とされ
るような臨床的環境に広い用途を有する。ラミニン５は、傷の治療及び組織の再
生を促進するために用いることができる。外生ラミニン５の使用は、皮膚障害、
例えば糖尿病性足潰瘍、静脈潰瘍、とこずれ、皮膚手術、やけど、及び急性外傷
の治療の加速に広い用途を有する。外生ラミニン５は、傷表面を直接治療するた
めに用いることができ、あるいは多様な医療器具、及び皮膚、角膜、胃腸、及び
歯周上皮の傷の治療用の皮膚移植片に用いることができる。ラミニン５の使用は
、器具又は移植片の生体適合性の向上を生じ、これによって、組織の組込み及び
再建（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）の改良、免疫応答の減少、及び感染の可能性の減
少を生じる。ラミニン５はまた、様々な細胞型の生体外及び試験管内増殖にも有
用である。これらの細胞型には、上皮細胞、すい臓ベータ島細胞、及びＴ細胞、
及び組織同等物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。従って組織培
養培地又は培地サプリメント用のラミニン５源、並びにラミニン５で被覆された
細胞成長基質は、これらの細胞型及びその他の細胞型の培養に特に有用であろう
。

【００２７】ラミニン５に良好な源及びこのための精製手順は、前記治療及び研究への用途
の開発用材料を供給するために必要とされる。いくつかの細胞系はラミニン５を
分泌するので、プロセス細胞及び細胞培地からのラミニン５を精製するための手
順が開発された。しかしながらこれらの方法は時間がかかるものであり、少量の
ラミニン５しか生産することができない（Ｒｏｕｓｅｌｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．１９９５２７０（２３）：１３７６６―１３７７０；Ｃｈｅｎｇら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７、２７２（５０）：３１５２５―３１５３
２）。

【００２８】しかしながら好ましい生産方法は、組換えラミニン５を生産するための、えり
抜きの細胞系を作り変えるため（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）の組換えＤＮＡ技術の使用
である。ラミニン５生産の組換えをベースとした方法は、組織からの精製又は培
養中の細胞系からの単離よりも優れたいくつかの利点を有する。

【００２９】１．組換え生産タンパク質は、病原体を含まない。このことはまた、内生細胞
培養生産タンパク質にもあてはまるが、ヒト組織に由来するタンパク質は、ＨＩ
Ｖ、肝炎、及びその他の感染物質による汚染のリスクを有する。

【００３０】２．タンパク質の発現レベル、従って収率は、エンコードされたタンパク質の
生産を高める、遺伝的に作り変えられた遺伝子／ベクターの使用によって改良す
ることができる。

【００３１】３．商品として見込みのある親和精製手順のための結合部位を供給する、タン
パク質鎖への追加のペプチド配列を作ることは可能である。

【００３２】４．この方法は、タンパク質領域構造の追加、置換、除去、及び／又はその他
の修飾によって、タンパク質構造／機能の修飾を提供することができる。例えば
、インテグリン結合部位（例えばＲＧＤ）、スイッチインテグリン認識部位を導
入するか、あるいは合成基質への安定した結合部位に作り変えることも望ましい
であろう。従ってラミニン鎖を発現する発現ベクターの創造は、将来の使用のた
めの非常に大きい柔軟性を発生させ、第二世代「デザイナー」ラミニンを作り出
すための基礎を生じる。

【００３３】以前の研究では、ラミニン５鎖―エンコーディングＤＮＡ配列の１つ又は２つ
でトランスフェクションされた細胞が生産されたが、どれも組換えヘテロトリマ
ーラミニン５を生産せず、組換えヘテロトリマーラミニン５を分泌する細胞系を
生産しなかった（Ｇａｇｎｏｕｘ―Ｐａｌａｃｉｏｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７１：１８４３７―１８４４４（１９９６）；Ｍａｔｓｕｉら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３４９６―２３５０３（１９９５））。

【００３４】従って組換えヘテロトリマーラミニン５タンパク質、組換えラミニン５の製造
方法、傷の治療及び組織の再生のため、多様な医療器具、及び皮膚、角膜、胃腸
、及び歯周上皮の傷の治療用の皮膚移植片への使用のため、様々な細胞型の生体
外及び試験管内増殖のため、及び組織培養培地、培地サプリメント用、及び細胞
成長基質の成分としての組換えラミニン５の使用方法に対して、この技術におい
てニーズが存在する。

【００３５】発明の概要本発明は、組換えラミニン５タンパク質、組換えラミニン５の製造方法、やけ
どの治療のため、多様な医療器具、及び皮膚、角膜、胃腸、及び歯周上皮の傷の
治療用の皮膚移植片への使用のため、様々な細胞型の生体外及び試験管内増殖の
ため、及び組織培養培地、培地サプリメント用、及び細胞成長基質の成分として
の組換えラミニン５の使用方法に対する、この技術におけるニーズを満たす。

【００３６】１つの態様において、本発明は、ラミニンα３、β３、及びγ２鎖をエンコー
ドする核酸配列でトランスフェクションされた細胞を提供する。ここにおいて、
これらの細胞は、ヘテロトリマー組換えラミニン５（以後「ｒ―ラミニン５」と
呼ぶ）に集合する個々の鎖を発現する。ｒ―ラミニン５、又はこれらのプロセス
形態は、この細胞によって分泌される。

【００３７】さらなる態様において、本発明は、ｒ―ラミニン５、及び実質的に精製された
ｒ―ラミニン５、又はこれらのプロセス形態の生産方法を提供する。

【００３８】さらなる態様において、本発明は、ｒ―ラミニン５、又はこれらのプロセス形
態を、製薬的に許容しうるキャリヤーと共に含む製薬組成物を提供する。このよ
うな製薬組成物には場合によっては、傷の治療及び組織の再生の有用性を有する
その他の化合物、例えばその他の細胞外マトリックス成分が備えられていてもよ
い。

【００３９】さらなる態様において、本発明は、ａ．傷の治療及び組織の再生を加速するため；ｂ．皮膚の移植片の性能を向上させるため；ｃ．歯の表面への歯肉組織の付着を改良するため；ｄ．医療器具の生体適合性を改良するため、及びｅ．細胞増殖を加速するために、様々な方法に有効な量のｒ―ラミニン５を供給することによる、ｒ―ラミニン
５の使用方法及びキットを提供する。本発明はまた、血管形成を調節するための
ラミニン５の使用方法及びキットをも提供する。これらのキットは、所望の効果
のために有効な量のラミニン５又はｒ―ラミニン５と、これらの使用説明書とを
含んでいる。

【００４０】さらなる態様において、本発明は、改良された医療器具及び移植片を提供する
。ここにおいて、この改良は、所望の用途のために有効な量のｒ―ラミニン５又
は本発明の製薬組成物で、これらの器具又は移植片を被覆することを含む。

【００４１】さらなる態様において、本発明は、細胞の付着及びその後の増殖、分化、又は
維持のために、細胞培養器具への細胞の付着に効果的な量のｒ―ラミニン５を供
給することによる、培養中の細胞の増殖のための改良された細胞培養器具を提供
する。

【００４２】別の態様において、本発明は、ｒ―ラミニン５を含む細胞培養成長サプリメン
トを提供する。さらなる態様において、本発明は、改良された細胞培養成長培地
であって、この改良がｒ―ラミニン５の添加を含んでいるような培地を提供する
。

【００４３】好ましい実施形態の簡単な説明すべての参考文献、特許および特許出願はその全体が参考文献としてここに含
まれる。

【００４４】この出願においては、特に言明しない限り、利用される技術は（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｏｏ
ｋ，ｅｔａｌ．，１９８９，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ）、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５、
Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、１９９１年、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙの”タンパ
ク精製へのガイド”（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０年）
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃ）、ＰＣＲプロトコー
ル、動物細胞の培養の方法と応用（Ｉｎｎｉｓ、ｅｔａｌ．，１９９０年）Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；基本技術マニュアル第２版（Ｒ．Ｉ．
Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７年、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ）
、遺伝子トランスファーと発現のプロトコルｐ１０９−１２８、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒ
ｒａｙ編、ＴｈｅＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓＩｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ
．Ｊ．）およびＡｍｂｉｏｎ１９９８年カタログ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ
，ＴＸ）の中に利用される周知の技術において見出されている。

【００４５】ここで「ラミニン５」と示したものは、γラミニン５と、天然発生資源から得
たヘテロトリメリック・ラミニン５の両者を含む。

【００４６】「γ−ラミニン５」なる用語は、α３、β３およびγ２ラミニンポリペプチド
鎖、あるいは細胞加工イベントの結果得られたバージョン同様に、ヘテロトリメ
リック・ラミニン５を形成できる各々の差の一部をコードするポリヌクレオチド
から成る発現ベクターによって外因的に形質転換された細胞に発現される組換え
ヘテロメリックラミニン５を含む。このようなγラミニン５は、単一または異な
る複数の有機体に由来するα３、β３およびγ２配列から成る。ラミニン５鎖の
ＤＮＡ配列と、そのコードタンパクがこの発明中で周知である。（参考文献とし
て、たとえば、Ｇｅｒｅｃｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
９巻、１１０７３−１１０８０ページ（１９９４年）、Ｋａｌｌｕｎｋｉｅｔ
ａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１９巻、６７９−６９３ページ（１９９
２年）、Ｒｙａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、２２７
７９−２２７８７ページ（１９９４年）、Ｉｉｖａｎａｎｉｎｅｎｅｔａｌ
．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４巻、１４１０７−１４１１１ページ（１９
９９年）、Ｇａｌｌｉａｎｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０
巻、２１８２０−２２１８２６ページ（１９９５年）、Ｓｕｇｉｙａｍａｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８巻、１２０−１２８ページ（１
９９５年）を参照し、その全体が本発明の参考文献として含まれる）。

【００４７】本発明においては、γラミニン５は分泌タンパクであり、ＥＲ、分泌担体を指
向し、シグナル配列を含む必要がない状態でこれらタンパクが細胞外腔へ放出さ
れるのと同様に、細胞外腔をも指向している。分泌タンパクが細胞外腔へ放出さ
れるならば、分泌タンパクは細胞外工程を介して「成熟した」タンパクを作りだ
すことができる。このような加工イベントは可変性を有し、最終的な「成熟」タ
ンパクには多様なバージョンのものが得られることになる。

【００４８】実質的に精製された本発明のγラミニン５は、全長鎖と、このように加工され
たあらゆるラミニン５鎖の両方から構成される。

【００４９】ここで利用されるように、ラミニン５ポリペプチド鎖は、次の（ａ）１Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３２Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（ｅ）３Ｒ３４Ｒ３（ｅ）５Ｒ１−Ｒ３６Ｒ１−Ｒ３（ｅ）７Ｒ２−Ｒ３８Ｒ２−Ｒ３（ｅ）から成る群から選択されたポリペプチド構造であって、Ｒ１はアミノ末端メチオ
ニンであり、Ｒ２はポリペプチドの分泌指向性を有し、ここでシグナル配列は特
別なラミニン鎖、他の分泌タンパクに対する天然シグナル配列、および人工配列
であって、Ｒ３はα３鎖、β３鎖、γ２鎖から選択された分泌ラミニン鎖であり
、Ｒ３（ｅ）はさらに（後述するように）エピトープタグから構成されるα３鎖、
β３鎖、γ２鎖から選択された分泌ラミニン鎖であり、ラミニン鎖アミノ酸配列
中においてあらゆる位置で置換可能であり、および／または、（ｂ）は（配列番号ＮＯＳ．１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１
９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５）に開示されたラミニン
ポリヌクレオチド配列またはその一部と実質的に同様のポリヌクレオチドにコー
ドされ、（ｃ）は（（配列番号ＮＯＳ．１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，
１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５）に開示された１つま
たは複数の組換えラミニン５鎖ＤＮＡ配列あるいはその一部をコードする領域に
対して高度または軽度に厳重性を有する条件でハイブリダイズするポリヌクレオ
チドによりコードされ、（ｄ）は、開示されたラミニンポリヌクレオチド鎖アミノ酸配列（配列番号ＮＯ
Ｓ．２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６
，２８，３０，３２，３４，３６）に対して少なくとも７０％の相同性を有する
か、好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を有する配列、
からなる１つ以上のポリペプチドである。

【００５０】「実質的に同様の」という用語は、ここに開示されたラミニン５配列のうち１
つまたは複数の定常領域を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を参
照して使われ、消去、挿入、転換、反復および置換された領域も参照されるがこ
れには限定されず、こうして生じたラミミン鎖はここに開示された配列と機能的
にみて同等である。

【００５１】例えば、定常的なポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域
の両者またはいずれか一方において変性していることがある。特に好ましいのは
、ポリヌクレオチドバリアントがサイレント置換、付加または消去をもたらすよ
うな変化を含むことがあっても、コードされたポリペプチドの機能または活性を
変化させていないことである。サイレント置換によって産生されたヌクレオチド
バリアントは、遺伝子コードのデジェネラシーの点からみて好ましい。さらには
、５−１０個、１−５個、または１−２個のアミノ酸が置換、消去、またはいず
れかの組み合わせによって行われていることも好ましい。ポリヌクレオチドバリ
アントは、様々な理由から産生することが可能であり、特定の宿主にとってのコ
ドン発現を最適化することもこれに含まれるが、それには限定されないものとす
る（ヒトのｍＲＮＡにおけるコドンがＥ．Ｃｏｌｉ等の細菌性宿主によってその
ｍＲＮＡのコドンに変化している）。

【００５２】天然発生型定常バリアントは「アリール性バリアント」と呼ばれ、一つの有機
体上における１本の染色体において、該当するローカスを担う遺伝子に対する複
数の変化型のうち１つを意味している（ＧｅｎｅｓＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，
ｅｄ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８５年
））。

【００５３】これらのアリールバリアントにはポリヌクレオチドレベルまたはポリペプチドレ
ベルの両者またはいずれかのレベルでばらつきがある。ばらつきがない場合は、
突然変異技術または直接合成技術によって、非天然発生型定常バリアントが産生
される。

【００５４】周知のタンパク合成法および組換えＤＮＡ技術の方法を使い、定常ポリヌクレ
オチドバリアントを作成して、発現されたラミニン鎖ポリペプチドの特徴を改善
または変化させることがある。例えば、分泌タンパクのＮ−末端またはＣ−末端
から１つまたは複数のアミノ酸が消去することがある（Ｇａｙｌｅｅｔｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：１９９−２１６ページ。アンプ
ルの証拠により、バリアントが天然型のタンパクとしばしば同様の生物活性を保
持していることが示されている（例えば、Ｇａｙｌｅｅｔｅｔａｌ．，Ｊ．
ＢｉｏｌＣｈｅｍ２６８巻：２２１０５−２２１１１ページを参照のこと）
。さらには、ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端においてアミノ酸が１個ま
たは複数消去した結果、１つまたは複数の生物活性に変化が生じるかまたは欠損
し、その他の生物学的活性は保持されていることもある。

【００５５】表現型からみてサイレントなアミノ酸の置換方法を考慮したガイダンスがＢｏ
ｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７巻：１３０６−１３１
０ページ（１９９０年）に提供されており、ここでは著者が、変化に対するアミ
ノ酸配列の耐性について研究した主要な方策２つについて指摘されている。

【００５６】第１の方策では、進化の過程において自然選択により起こるアミノ酸置換への
耐性について探っている。異種間におけるアミノ酸配列を比較することによって
、定常的アミノ酸配列を同定可能である。このような定常アミノ酸はタンパクの
機能にとって重要である。これとは対照的に、自然選択による置換に耐えてきた
アミノ酸の部位では、このような部位がタンパク機能にとって重要なものでない
ことを示唆している。このようにして、部位耐性アミノ酸置換はタンパクの生物
活性を保持しながらも変化を受けることが可能である。

【００５７】第２の方策では、遺伝子合成法を用いて、クローニングされた遺伝子上の特定
の部位におけるアミノ酸を変化させ、タンパク機能にとって重要な領域を同定す
る。たとえば、部位指向性突然変異またはアラニン走査性突然変異（分子中のす
べての残基において１個のアラニン突然変異を起こす）を利用できる（Ｃｕｎｎ
ｉｎｇｈａｍａｎｄＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４巻：１０８１−１
０８５ページ（１９８９年））。こうしてできた突然変異分子は生物活性の試験
に利用できる。

【００５８】著者が論ずるように、こういった２つの方策から、タンパクがアミノ酸置換に
対して驚くべき耐性を有していることが明らかとなっている。著者らはさらに、
特定のタンパク内において、どのアミノ酸の変化が一定のアミノ酸の部位でｐｅ
ｒｍｉｓｓｉｖｅとなりやすいかをも指摘している。たとえば、（タンパクの４
次構造内部に）ほとんど埋没しているアミノ酸残基は非極性側鎖を必要としてい
るのに対して、表面に出ている側鎖のほとんどは遺伝的に保護されていない。さ
らには、耐性を生じる定常アミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ
、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換、ヒドロキシル基ＳｅｒおよびＴｈｒの
置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ、塩
基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、
小型のアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換に関与し
ている。

【００５９】本発明において「実質的に同様の」特性にはまた、（ｉ）１つまたは複数の非
定常型アミノ酸残基の置換であって、置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードに
コードされるか、またはコードされないもの、（ｉｉ）１個の置換基を有する１
つまたは複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉｉ）ポリペプチドの安定性および／
または可溶性を増大させる化合物（例えばポリエチレングリコールなど）と成熟
ポリペプチドとの融合、および／または（ｉｖ）さらなるアミノ酸とポリペプチ
ドとの融合、例えばＩｇＧＦｃ融合領域ペプチド、またはリーダー配列あるい
は分泌性配列、あるいは配列促進目的の精製をも含む。このようなバリアントポ
リペプチドは、本発明における指導から得られた周知の技術の目的に含まれるも
のとする。

【００６０】例えば、別の荷電性アミノ酸によって荷電を帯びたアミノ酸、または中性アミ
ノ酸を含むポリペプチドバリアントは、凝集しにくくなるなど性質が改善されて
いることがある。薬理学的処方が凝集すると、凝集物の免疫活性が低下すること
によって活性が上昇し、クリアランスが上昇することがある。（ピンカードらの
臨床実験免疫学：Ｐｉｃｋａｒｄｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．２巻：３３１−３４０ページ（１９６７年）、ロビンらの糖尿病：Ｒｏ
ｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ３６巻：８３８−８４５ページ
（１９８７年）、Ｃｌｅｌａｎｄｅｔａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ第１０巻：３０７
−３７７ページ（１９９３年））。

【００６１】「ハイブリダイゼーションの厳重性」という用語は、核酸が安定している条件
下において使われる。転換もまた、本発明において開示されたラミニン鎖ポリヌ
クレオチドノコード配列のすべてまたは一部に対する高度に厳重な条件において
（本発明で定義するように）においてハイブリダイズする核酸を含む。融合する
核酸の融合部は長さが少なくとも５０塩基対であることが多い。本発明において
周知であるように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔ_Ｍ）に反
映する。Ｔ_Ｍは配列の相同性が１％低下するごとにほぼ１−１．５℃ずつ低下
する。一般には、厳重性を低くした条件ではハイブリッドの反応性は達成され、
続いてばらつきが洗い去られると、厳重性は高くなる。ハイブリダイゼーション
の厳重性に対する参照は、このような洗浄条件に関係している。このようにして
、本発明で使用されるように、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭの
ＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ
７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストランから構成される溶液中
で４２℃で一晩培養し、２０μｇを変性させて、サケ精子ＤＮＡでシアし、続い
て０．１ｘＳＳＣにより約６５℃でフィルタを洗うことによって高い厳重性を得
た。

【００６２】この他の実施形態は、厳重性の低い条件下で本発明のポリヌクレオチドにラミ
ニン５−コード核酸配列をハイブリダイズさせるものである。ハイブリダイゼー
ションとシグナル検出の厳重性を変化させることは、原則的にはホルムアミド濃
度（ホルムアミドの濃度を下げることによって厳重性が下がる）、塩濃度、また
は温度の調節を介して達成できる。たとえば、厳重性の低さには６ＸＳＳＰＥ（
２０ＸＳＳＰＥ＝３ＭＮａＣｌ、０．２ＭＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０２ＭＥ
ＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍ
ｌサケ精子ブロックＤＮＡからなる溶液で３７℃で培養し、続いて５０℃で１Ｘ
ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗うことが含まれる。さらに、より厳重性を低くす
るには、（５ＸＳＳＣ等の）塩濃度を上げることによって厳重なハイブリダイゼ
ーションの後に洗浄すればよい。

【００６３】上記の条件は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを低く
抑える目的で代用ブロック液を加えたり、あるいは置換したりすることで達成で
きることに留意されたい。代表的なブロック液には、デンハート液、ＢＬＯＴＴ
Ｏ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、市販の適正な処方が含まれる。特異的ブロ
ック液には、互換性の問題があるために、上記のハイブリダイズ条件を変更する
ことの必要なものがある。

【００６４】本発明で使われるように、２つのアミノ酸または核酸における「同一性のパー
セント」は、カーリンおよびアルツシュルのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎａｎ
ｄＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７巻
：２２６４−２２６８ページ、１９９０年）の方法、カーリンおよびアルツシュ
ルらによる変法（（ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻：５８７３―５８７７ページ、１９９３
年）を使って決定される。このようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔ
ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３−４１０ページ、１９９０年
）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに含まれている。ＢＬＡＳＴヌ
クレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラムを使って実行され、スコア＝１０
０、単語長＝１２により本発明の核酸分子に対する核酸配列の相同性を得ること
ができる。ＢＬＡＳＴタンパクサーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラムによって実行
され、スコア＝５０、単語長＝３により本発明のポリペプチドに対するアミノ酸
配列の相同性を得ることができる。比較目的でギャップアライメントを得るには
、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを使い、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．ＲｅｓＲｅｓ２５巻、３３８９−３４０２ページ、１９
９７年）に示すように利用する。ＢＬＡＳＴプログラムとＧａｐｐｅｄＢＬＡ
ＳＴを使うには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（すなわちＸＢ
ＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使う。ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。

【００６５】本発明における更なる実施形態は、配列番号ＮＯＳ．２，４，６，８，１０，
１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４に
含まれる１個または複数のポリペプチド配列あるいは画分との間に、少なくとも
７０％、好ましくは８０％、さらにもっとも好ましくは９０％の同一性を有する
ラミニン鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが含まれる。

【００６６】本発明において使用されるように、「α３ポリヌクレオチド」は同一名のα３
ラミニン鎖をコードするポリヌクレオチドを示す。このようなポリヌクレオチド
は次の（ａ）配列番号ＮＯＳ．２，４，６，８，１０，１２またはその画分に示
す前期ポリヌクレオチドの核酸、（ｂ）配列番号ＮＯＳ．２，４，６，８，１０
，１２またはその画分に示す配列に対して少なくとも７０％の同一性を共有し、
さらには８０％、理想的には９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号ＮＯＳ．１，３，５，７，９，１１に示すコ
ード配列またはその一部と高いあるいは低い厳重性においてハイブリダイズする
α３ポリヌクレオチド、（ｄ）（１）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３、（２）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ
３（ｅ）、（３）Ｒ３、（４）Ｒ３（ｅ）、（５）Ｒ１−Ｒ３、（６）Ｒ１−Ｒ
３（ｅ）、（７）Ｒ２−Ｒ３、（８）Ｒ２−Ｒ３（ｅ）から選択された一般構造
のポリペプチドをコードし、ここでＲ１とＲ２が前述のごとくであって、Ｒ３と
Ｒ３（ｅ）が前述のごとくではあるが分泌α３鎖ポリペプチドを構成しない、の
うち１つまたは複数の特徴を有する。

【００６７】ここで使われるように、「β３ポリヌクレオチド」は同一名のβ３ラミニン鎖
をコードするポリヌクレオチドをいう。このようなポリヌクレオチドは以下に示
す（ａ）配列番号１４，１６，１８，２０，２２，２４に示す配列のうち１つま
たは複数の配列または一部と実質的に同一なアミノ酸配列を１個含む前記ポリヌ
クレオチドの核酸、（ｂ）配列番号１４，１６，１８，２０，２２，２４に示す
配列のうち１つまたは複数の配列または一部と少なくとも７０％、好ましくは８
０％、理想的には９０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド、（ｃ）配列番号１３，１５，１７，１９，２１，２３に示す配列のうち
１つまたは複数のコード配列または相補的配列に対して低いまたは高い厳重性を
もってハイブリダイズするβ３ポリヌクレオチド、（ｄ）（１）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ
３、（２）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（ｅ）、（３）Ｒ３、（４）Ｒ３（ｅ）、（５）Ｒ
１−Ｒ３、（６）Ｒ１−Ｒ３（ｅ）、（７）Ｒ２−Ｒ３、（８）Ｒ２−Ｒ３（ｅ
）から選択された一般構造のポリペプチドをコードするβ３ポリヌクレオチドで
あって、Ｒ１とＲ２が前述のごとくであって、Ｒ３とＲ３（ｅ）が前述のごとく
ではあるが分泌β３鎖ポリペプチドを構成しない、のうち１つまたは複数の特徴
を有することができる。

【００６８】ここで使われるように、「γ２ポリヌクレオチド」は同一名のγ２ラミニン鎖
をコードするポリヌクレオチドをいう。このようなポリヌクレオチドは、（ａ）
配列番号２６，２８，３０，３２，３４，３６に示す１つまたは複数の配列に実
質的に同様なアミノ酸１個をコードする前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２６，２８，３０，３２，３４，３６に示す配列またはその一部
と少なくとも７０％、好ましくは８０％、理想的には９０％の同一性を共有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２５，２７，２９
，３１，３３，３５に示す配列またはその一部のうち１つまたは複数の配列に対
して高いまたは低い厳重性の条件のもとにハイブリダイズするγ２ポリヌクレオ
チド、（ｄ）（１）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３、（２）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（ｅ）、（３）
Ｒ３、（４）Ｒ３（ｅ）、（５）Ｒ１−Ｒ３、（６）Ｒ１−Ｒ３（ｅ）、（７）
Ｒ２−Ｒ３、（８）Ｒ２−Ｒ３（ｅ）から選択された一般構造のポリペプチドを
コードするβ３ポリヌクレオチドであって、Ｒ１とＲ２が前述のごとくであって
、Ｒ３とＲ３（ｅ）が前述のごとくではあるが分泌γ２鎖ポリペプチドを構成し
ない、のうち１つまたは複数の特徴を有することができる。

【００６９】ここで使われるように、「エピトープタグ」という用語は、キメラタンパクの
一部として発現しているポリペプチド配列をいい、ここでエピトープタグはエピ
トープタグに対して発生する抗体の認識部位としての役割をなすか、またはタグ
を含む配列のアフィニティー精製に使うその他の分子の結合部位としての役割を
なしている。

【００７０】ここで使われるように、「生物学的互換性の増大」という用語は、急性または
慢性炎症反応の誘導を低下することをいい、協働性の非コード生物材料と比べた
場合、ラミニン５−コート性生物材料に対する移植片の周辺組織での適正な分化
の阻害を低下させることをいう。

【００７１】ここで使われるように、「移植片」は天然型およびプロステチックな移植片お
よび移植物の両方を意味する。

【００７２】一つの態様において、本発明はα３、β３、γ２ラミニン５鎖から構成される
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと人工的に連結させるプロモータ配
列から構成される組換え発現ベクターで全体的に形質転換させた細胞を提供する
。多数回形質転換させたあと、細胞は各々の組換えラミニン５鎖を発現し、ヘテ
ロトリマーに組み込まれて、細胞培養中の培地から精製することができる。

【００７３】好ましい実施形態においては、α３、β３およびγ２ラミニンポリペプチド鎖
またはその一部から構成されるｃＤＮＡｓコードタンパクは、発現ベキター中へ
サブクローニングすることができる。クローニングできない場合は、１つまたは
複数のイントロンを含み、可変性５’領域と非可変性３’領域を含むラミニン５
α３、β３、および／またはγ２遺伝子配列を利用できる。

【００７４】 γ−ラミニン５を発現し分泌することのできる細胞ならば何でも利用できる。
好ましくは、真核細胞が使われ、もっとも好ましくは哺乳類細胞が使われるが、
腎ア脂肪及び上皮細胞株が使われるが、これに限定されない。特に好ましいのは
内因性のラミニン５を発現しない哺乳類細胞である。炭化水素及びジスルフィド
の翻訳後修飾にはラミニン５タンパクの保持とその機能が必要であるといわれて
いる。このため、たとえば抗体産生に対する抗原を得るために別の系が有用であ
っても、機能性γ−ラミニン５を産生する真核細胞を利用できる。

【００７５】「組換え発現ベクター」は、遺伝子産物の発現を有効にする能力をもつすべて
のプロモータに対する核酸コード領域または遺伝子と人為的に連結するベクター
を含む。ラミニン５の個々の鎖を発現させるために使われるプロモータ配列は（
ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦ等のあらゆるプロモータの組み合わ
せを含むがこれに限定されず）コンスティチューティブであるか、または（テト
ラサイクリン、エクジソン、ステロイド反応性を含むがこれに限定されない）誘
導性を有する。この発現ベクターは、エピソームとして宿主中で置換できるか、
または宿主の染色体ＤＮＡへ統合させる必要がある。より好適な実施形態では、
発現ベクターはプラスミドから構成されている。しかし、本発明はウイルスベク
ター等、これと同等の機能を有する別の発現ベクターを含むことを強調している
。

【００７６】１つの実施形態において、少なくともラミニン鎖ポリペプチド配列またはその
一部は、「エピトープタグ」をコードする核酸配列に人為的に連結しており、こ
れによって少なくとも鎖の一つが発現されたエピトープタグを伴う融合タンパク
として発現している。このエピトープタグは、結果としてできたヘテロトリメリ
ックγ−ラミニン５が機能を残している限りは、アミノ末端、カルボキシ末端、
またはγ−ラミニン５鎖の末端部内部として発現している。結果としてできたγ
−ラミニン５ヘテロトリマーのアフィニティー精製を基本として利用できる限り
は、あらゆるエピトープタグが利用される。このようなエピトープの例は、ＦＬＡＧ
（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ｍｙｃ（９Ｅ１
０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、６−Ｈｉｓ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、およびＨＡ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むが、こ
れに限定されない。

【００７７】他の実施形態では、γ−ラミニン５鎖が１番目のエピトープタグのついた機能
性タンパクとして発現しており、少なくとも１つの別のγ−ラミニン鎖が２番目
のエピトープタグのついた機能性タンパクとして発現している。これにより、何
回も精製可能となっている。この代用としては、同一のエピトープタグを使い、
１個以上のγ−ラミニン鎖を有する融合タンパクを創出することができる。

【００７８】さらなる実施形態において、エピトープタグはγ−ラミニン５鎖から開裂させ
るよう合成することができる。この代用としては、γ−ラミニン５鎖にエピトー
プタグをつけず、γ−ラミニン５を標準クロマトグラフ法により精製する方法が
あるが、ラミニン５特異性抗体またはその他のラミニン５結合分子を使ったアフ
ィニティークロマトグラフ法、イオン交換法、疎水性交換法も含まれるが、これ
に限定されない。

【００７９】発現ベクターの宿主への形質転換は周知のあらゆる技術を使って実施可能であ
り、標準細菌形質転換法、リン酸カルシウムによる沈殿反応、エレエエクトロポ
レーション、リポソームを媒体とする方法、ＤＥＡＥデキストランを媒体とする
方法、ポリカチオンを媒体とする方法、またはウイルスを媒体とする方法が含ま
れるがこれらに限定されない。

【００８０】さらに好適な実施形態では、細胞が安定して形質転換される。安定したトラン
スフェクションを実施する方法と適正な形質転換細胞の選択法は本発明において
周知である。もっとも好適な実施形態において、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス
）プロモータ作動性発現ベクターはヒト腎胎児性２９３細胞株において使用され
る。

【００８１】１個のラミニン鎖により形質転換した細胞から採取した培地を最初にウエスタ
ンブロット法にて、鎖特異性抗ラミニン−５抗体で解析した。トランスフェクシ
ョン後、１本のラミニン鎖による発現は一般的に細胞内で起こっている。個々の
形質転換鎖に対する反応性を示すクローンは、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、または核
酸ハイブリダイゼーション等の適正な方法で修正し、形質転換遺伝子が取り込ま
れていることを確認している。好ましくは、ラミニン鎖特異性プライマー対を使
い、ＰＣＲによってこのようなクローンのゲノムＤＮＡを解析する。形質転換し
、この３つの鎖すべてを産生するクローンから得た培地を、ヘテロトリメリック
ラミニン５分泌および／または活性についてウエスタンブロット法や、ケラチノ
サイト細胞接着アッセイ等の細胞への結合アッセイ等、適正な方法で詳しく解析
している。

【００８２】別の目的において、本発明は、α３鎖、β３鎖、γ２鎖から構成され、実質的
に精製されたγ−ラミニン５と、実質的に精製されたγ−ラミニン５を産生する
方法を提供する。１つの実施形態において、γ−ラミニン５は、配列番号２，４
，６，８，１０，１２に示す少なくとも１つの配列またはその一部と実質的に同
様なポリペプチドから構成される１つ目の鎖と、配列番号１４，１６，１８，２
０，２２，２４に示す少なくとも１つの配列またはその一部と実質的に同様なポ
リペプチドから構成される２つ目の鎖と、配列番号２６、２８、３０、３２、３
４、３６に示す少なくとも１つの配列またはその一部と実質的に同様なポリペプ
チドから構成される３つの鎖とで構成され、１つ目、２つ目、３つ目のポリペプ
チドは組換えによって産生され、１つ目、２つ目、３つ目の鎖は組換えヘテロト
リメリック・ラミニン５に組み込まれる。

【００８３】別の実施形態において、実質的に精製されたγ−ラミニン５は配列番号２、４
、６、８、１０、１２に示す配列またはその一部と実質的に少なくとも７０％の
同一性を有する１つ目のポリペプチドと、配列番号１４、１６、１８、２０、２
２、２４に示す配列またはその一部と実質的に少なくとも７０％の同一性を有す
る２つ目のポリペプチドと、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６に示
す配列またはその一部と実質的に少なくとも７０％の同一性を有する３つ目の鎖
とから構成され、１つ目、２つ目、３つ目のポリペプチドは組換えヘテロトリメ
リックラミニン５に組み込まれる。

【００８４】好適な実施形態において、実質的に精製されたヒトγ−ラミニン５を構成する
１つ目、２つ目、３つ目のポリペプチドは、エピトープタグのついた融合タンパ
クとして発現している。

【００８５】代用としては、γ−ラミニン５はヘテロトリメリックなポリペプチド構造から
なり、個々の鎖は、（１）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３、（２）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（ｅ）、
（３）Ｒ３、（４）Ｒ３（ｅ）、（５）Ｒ１−Ｒ３、（６）Ｒ１−Ｒ３（ｅ）、
（７）Ｒ２−Ｒ３、（８）Ｒ２−Ｒ３（ｅ）から選択された一般構造から成る。
ここでＲ１はアミノ末端メチオニンであり、Ｒ２はポリペプチドの分泌を指向す
る能力のあるシグナル配列であり、ここでシグナル配列は特別なラミニン鎖に対
する天然のシグナル配列か、別の分泌タンパクのシグナル配列か、あるいは人工
的配列である。Ｒ３は分泌されたα３、β３、またはγ２ラミニン鎖であり、Ｒ
３（ｅ）は分泌されたラミニンα３、β３、及びγ２鎖であって、さらにエピト
ープタグ（前述のように）を構成し、ラミニン鎖ノアミノ酸配列内部のどこでも
置換可能である。

【００８６】好ましい実施形態において、γ−ラミニン５の精製は、トランスフェクトされ
た細胞からの培地をアフィニティカラムへ通すことにより達成される。例えば、
少なくとも１つの組換え鎖で発現したペプチドエピトープと結合する抗体又はそ
の他の結合分子をアフィニティカラムに接着させ、培地へ分泌されたγ−ラミニ
ン５を結合させる。過剰のペプチドをカラムに通すことにより、γ−ラミニン５
をカラムから取り出す。その後、溶出したタンパク質を、所望により、さらに精
製してもよい。

【００８７】溶出した画分を、ゲル電気泳動及びウェスタンブロット分析を含む任意の適切
な方法により分析する。さらなる実施形態において、精製後にペプチドエピトー
プを分解することができる。その他の実施形態において、２回又は３回の精製及
び２重又は３重に精製されたγ−ラミニン５を許容する異なるエピトープタグを
各々有する、２個又は３個の別々のγ−ラミニン鎖を、融合タンパク質として発
現させる。エピトープタグは、精製後に（１つ又は複数の）γ−ラミニン５鎖か
ら分解可能であるよう工作することができる。又は、いずれのγ−ラミニン５鎖
にもエピトープタグを融合させず、これらに限定されないが、ラミニン５特異的
抗体又はその他のラミニン５結合分子を使用したアフィニティクロマトグラフィ
を含む標準的な技術により、γ−ラミニン５を精製する。

【００８８】もう１つの態様において、本発明は、配列番号：２１−２２、２３−２４、２
９−３０、及び３１−３２として開示された核酸配列及びタンパク質からなる、
新規なラミニンβ３及びγ２鎖の核酸及びタンパク質を提供する。

【００８９】本発明は、既に開示されたようなγ−ラミニン５と、薬学的に許容される担体
とを含む薬学的組成物をさらに提供する。本発明のこの態様によると、これらに
限定されないが、コラーゲン、他のラミニン型、フィブロネクチン、インテグリ
ン、糖タンパク質、プロテオグリカン、ヘパラン及びヘパラン硫酸プロテオグリ
カン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、
及び角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）のような増殖因子、グリコサミノグリカン、エ
ンタクチン、ナイドジェン、並びにそれらのペプチド断片を含む、その他の薬剤
が、治療を受ける状態に応じて、薬学的組成物に含まれていてもよい。

【００９０】 γ−ラミニン５を含む薬学的調製物は、任意の適当な形態で調製され、一般的
には、周知の薬学的に許容される担体と組み合わせてγ−ラミニン５を含む。担
体は、注射可能担体、局所担体、経皮担体等でありうる。調製物は、有利には、
軟膏、ゲル、クリーム、スプレー、分散剤、懸濁液、又はペーストのような、局
所投与用の形態であり得る。調製物は、さらに有利には、保存剤、抗菌剤、抗真
菌剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、及び類似の材料を、通常の組成及び量で含む。
本発明に従い使用するための適当な溶液は、無菌であり、意図された適用にとっ
て無害であり、かつ滅菌のような通常の薬学的操作を施すことが可能であり、か
つ／又は保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等のような通常の佐剤を含有
していてもよい。本発明の組成物の製剤化の援助のため、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ,第１５版，Ｍａｃｋ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９７５）を参照する
ことができる。

【００９１】本発明のγ−ラミニン５を使用した様々な治療のための投薬計画は、損傷又は
状態の型、個体の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重度、及び投与経路を
含む、多様な要因に基づく。従って、投薬計画は、大きく変動しうるが、標準的
な方法を使用して医師により日常的に決定されうる。ラミニンは、極めて強力な
分子であり、１細胞当たり１個又は数個の分子が効果を生じうる。従って、輸送
が最適化された場合、１ミリリットル当たりピコグラム範囲の有効量が可能であ
る。ラミニンは、基底膜に不溶性の形態で存在する場合があり、ラミニンアイソ
フォーム及び条件によって、約５０μｇ／ｍｌという低い濃度範囲で重合する能
力を有する。ラミニンは、２〜３ｍｇ／ｍｌという濃度でゲルへと重合すること
もできる。従って、およそ１ｎｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは約１
μｇ／ｍｌと約３ｍｇ／ｍｌの間の投薬レベルが、本明細書に開示された全ての
方法にとって有用である。

【００９２】治療計画も、損傷の型、個体の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重度、
及び投与経路を含む多様な要因に基づく、対象の状態によって変動するであろう
。例えば、γ−ラミニン５は、包帯剤を交換する必要がある頻度と同じ頻度で、
そして包帯剤を創傷表面に適用する間中、患者の創傷と接触させる創傷包帯剤を
コーティングするために使用されうる。

【００９３】同様に、投与経路は、損傷の型、個体の年齢、体重、性別、医学的状態、及び
状態の重度を含む多様な要因に基づく、対象の状態によって変動するであろう。

【００９４】さらなる態様において、本発明は、創傷治癒及び組織再生を加速するため、γ
−ラミニン５又は本発明の薬学的組成物を使用する方法を提供する。好ましい実
施形態において、γ−ラミニン５は、糖尿病性足潰瘍、静脈潰瘍、褥瘡、皮膚手
術、重度の熱傷、及び急性創傷における皮膚の治癒、並びに皮膚移植片（自家及
び人工の両方）の増強された性能を加速するために使用される。もう１つの態様
において、本発明は、有効量のラミニン５又はγ−ラミニン５と、本発明を実施
するためにラミニン５を使用するための説明書とを含む、これらの方法を実施す
るためのキットを提供する。

【００９５】１つの実施形態において、γ−ラミニン５、又はγ−ラミニン５を含む薬学的
組成物は、移植された培養ケラチノサイト又はその他の上皮細胞の、哺乳動物又
はヒトの真皮のような下層基質への接着を促進することにより、創傷治癒を増強
するために使用される。基質には、創傷表面、移植すべき培養上皮細胞のコンフ
ルエント層の基底表面、又は層を移植部位へ設置する前に創傷表面へと適用され
る創傷包帯剤のような基質が含まれうる。γ−ラミニン５は、薬学的に許容され
る担体中に、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌと約１０ｍｇ／ｍｌの間の量で供給され
うる。

【００９６】カリニンを含有する（即ち、ラミニンを含有する）単離された細胞マトリック
スの使用は、移植された培養ケラチノサイトの下層基質への接着を増強すること
が以前に示されている（Ｂｕｒｇｅｓｏｎｅｔａｌ．、米国特許第５，７７
０，５６２号）。従って、これ及びその他の研究は、ラミニン５が上皮細胞の接
着及び拡散を刺激し、従って皮膚の治癒及び皮膚移植片の使用を助長する適切な
表面を提供することを証明した（ＱｕａｒａｎｔａａｎｄＨｏｒｍｉａ、米
国特許第５，４２２，２６４号；Ｊｏｎｅｓ、米国特許第５，５４１，１０６号
；ＱｕａｒａｎｔａａｎｄＨｏｒｍｉａ、米国特許第５，６５８，７８９号
；Ｈｏｒｍｉａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９
５年１０月１０５（４）：５５７−５６１；Ｔａｋｅｄａｅｔａｌ．，Ｊ
．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９９年７月：１１３（１）：３８−４
２；Ｇｏｌｄｆｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１９９９；
１１２（Ｐｔ．１６）：２６１５−２６２９）。

【００９７】従って、損傷を負った適切な組織へのγ−ラミニン５の添加は、細胞増殖、細
胞移動を促進し、組織再生を加速することができる。加速された治癒は、炎症反
応及び斑痕を減少させるという付加的な利益を有する。これは、γ−ラミニン５
又は本発明の薬学的組成物を（皮膚、歯周上皮細胞のような）創傷範囲に単純に
コーティングすることによって達成される場合もあるし、これらに限定されない
が、創傷包帯剤及びマトリックス、移植片基質、及び歯科用橋脚歯を含む、γ−
ラミニン５が固定されている適当な基質を提供することによって達成される場合
もある。

【００９８】組換えγ−ラミニン５の創傷修復包帯剤及びマトリックス並びに組織移植片へ
の取り込みは、正常な細胞接着、細胞増殖、及び組織発達を促進するための、天
然リガンド相互作用性表面を提供するであろう。多くの移植片は、基底板と接着
した上皮細胞層を有する組織を交換するために使用される。移植後に不適切な表
面がこれらの細胞に提供された場合、移植片は正常細胞層を回復させることがで
きない危険がある。これらの移植片へのγ−ラミニン５のコーティングの利点は
、細胞再集合を促進するために十分な程度に正常基底板表面を再現する表面が作
出される点である。

【００９９】皮膚移植片は、広範囲の皮膚表面が熱傷又は損傷を負った症例において使用さ
れる。γ−ラミニン５及び／又は本発明の薬学的組成物の適用は、斑痕組織形成
を最小限に抑えつつ、損傷を負った組織への皮膚移植片の接着及び「生着」を有
意に促進し、正常な皮膚治癒過程を促進する。

【０１００】コラーゲンに基づくマトリックスも、下層真皮の増殖を促進し、皮膚移植片の
生着を改善するため、重度の皮膚損傷に適用される。γ−ラミニン５によるコラ
ーゲンマトリックスのコーティングは、より自然なリガンド相互作用性表面を作
出し、細胞移動、細胞増殖、及び真皮の再生を促進するであろう。真皮再生及び
皮膚移植片生着の加速により、斑痕組織形成は最小限に抑えられるであろう。

【０１０１】精製されたラミニン５は、歯の内側基底板への上皮細胞の接着を支持すること
が証明されており（Ｍｕｌｌｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ
．Ｒｅｓ．１９９９年１月３４（１）：１６−２４；Ｈｏｒｍｉａｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．１９９８年７月；７７（７）：１４７９−１４８
５）、エナメル芽細胞（即ち、エナメル質産生細胞）のエナメル質マトリックス
への固定を強化すると考えられている（Ｙｏｓｈｉｂａｅｔａｌ．，Ｃｅｌ
ｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ．１９９８年４月；２９２（１）：１４３−１４９）
。従って、もう１つの実施形態において、γ−ラミニン５又は本発明の薬学的組
成物は、歯の内側基底板への上皮細胞の接着、及び歯のエナメル質マトリックス
へのエナメル芽細胞の接着を刺激するために使用される。そのような治療は、こ
れらに限定されないが、口腔潰瘍、歯肉炎、及び歯周炎を含む、歯周病の治療に
有用である。例えば、歯から歯肉の剥離を促進する、これらに限定されないが歯
肉炎及び歯周炎を含む歯肉（付着上皮）の疾患の治療として、γ−ラミニン５又
は本発明の薬学的組成物により既存の歯をコーティングすることができる。これ
らの疾患状態は、歯肉と歯との間隙への食物及びその他の外来物質の蓄積を可能
にし、感染をもたらす。γ−ラミニン５は、歯肉の歯への再接着を促進し、従っ
て、外来物質の侵入及びその後の感染を防止するであろう。

【０１０２】歯肉炎及びその他の歯周の疾患及び障害の治療において使用するため、本発明
の薬学的組成物は、トゥースクリーム（ｔｏｏｔｈｃｒｅａｍｓ）、トゥースペ
ースト（ｔｏｏｔｈｐａｓｔｅｓ）、液体磨歯剤（ｌｉｑｕｉｄｄｅｎｔｉｆ
ｒｉｃｅｓ）、トゥースパウダー（ｔｏｏｔｈ−ｐｏｗｄｅｒｓ）、チューイン
ガム、錠剤等の形態であり得る。本発明の薬学的組成物は、香料、着色料、甘味
料、保存剤、界面活性剤等も含有しうる。

【０１０３】精製されたラミニン−５は、初代細胞培養物のための効率的な接着基質を提供
することにより、上皮細胞（Ｇｏｎｚａｌｅｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．１９９９年２月；１０（２）：２５９−２７０；Ｂａｋｅｒｅ
ｔａｌ．，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．１９９６年１１月１日；２２８（２）
２６２−２７０）、膵臓ベータ島細胞（Ｔｏｄｏｒｏｖｅｔａｌ．，Ｔｒａ
ｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．１９９８年３月；３０（２）：４５５；Ｑｕａｒａ
ｎｔａａｎｄＪｏｎｅｓ、米国特許第５，５１０，２６３号；Ｈａｌｂｅｒ
ｓｔａｄｔｅｔａｌ．、米国特許第５，６８１，５８７号；Ｈａｌｂｅｒｓ
ｔａｄｔｅｔａｌ．、米国特許第５，６７２，３６１号）、及びＴ細胞（Ｖ
ｉｖｉｎｕｓ−Ｎｅｂｏｔｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９９９
年２月８日；１４４（３）：５６３−５７４）のインビトロ増幅を促進すること
が示されている。従って、本発明のもう１つの態様において、γ−ラミニン５は
、細胞の接着、及びその後の増殖、分化、又は維持のための効率的な接着基質を
提供するために有効な量のγ−ラミニン５と、細胞を接触させることにより、こ
れらに限定されないが膵臓ベータ島細胞、上皮細胞、又はＴ細胞を含む細胞の増
殖、分化、又は維持のための細胞の接着を増強するために使用される。γ−ラミ
ニン５は、細胞培養培地補足物として細胞培養培地中に供給されてもよいし、又
は細胞増殖基質の表面上へコーティングされてもよい。いずれの場合にも、γ−
ラミニン５は、好ましくは、約１ｎｇ／ｍｌと約１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で使
用される。場合によって、これらに限定されないがコラーゲン、他のラミニン型
、フィブロネクチン、インテグリン、糖タンパク質、プロテオグリカン、ヘパラ
ン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、エンタクチン、ナイドジェン
、及びそれらのペプチド断片を含む、細胞の接着、増殖、分化、及び／又は維持
を促進するその他の化合物と、細胞を接触させてもよい。

【０１０４】細胞は、初代細胞であっても、又は細胞系であってもよい。本発明のこの態様
の方法は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで使用されうる。

【０１０５】好ましい実施形態において、γ−ラミニン５は、細胞の基質への接着を促進し
、細胞の増殖、分化、及び／又は維持を刺激するため、基質の表面をコーティン
グするために使用される。ここで使用される基質は、任意の所望の基質であり得
る。研究的使用の場合、基質は、ガラス又はプラスチックのような単純なもので
ありうる。インビボ使用の場合、基質は、細胞増殖を支持することができる任意
の生物学的に適合性の材料でありうる。適当な基質材料には、コラーゲン、再生
コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリガラクトース、ポリ乳酸、又はそれらの誘
導体のような材料で作成された、又はそれらでコーティングされた成形品；チタ
ン及びステンレス鋼のような生体適合性の金属；ヒドロキシアパタイトのような
プロテーゼ材料を含むセラミック材料；ポリエステル及びナイロンを含む合成重
合体；ポリスチレン；ポリアクリレート；ポリテトラフルオロエチレン、及び生
物学的分子が容易に接着しうる事実上任意のその他の材料が含まれる。特定の材
料の、本発明のγ−ラミニン５の接着を支持する能力の決定は、当業者による日
常的な実験のみを必要とする。

【０１０６】さらなる態様において、本発明は、細胞のための効率的な接着基質を提供する
ために有効な量のγ−ラミニン５と膵臓ベータ細胞を接触させ、インスリン産生
膵臓ベータ島細胞の増殖を増加させること、及びその細胞をその必要のある患者
へ投与することを含む、その必要がある患者においてＩ型糖尿病を治療する方法
を提供する。

【０１０７】２百万人近いアメリカ人が、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病に罹患している
。Ｉ型糖尿病においては、膵臓の島細胞内に見られるインスリン分泌ベータ細胞
が破壊される自己免疫障害のため、膵臓がインスリン分泌能を欠損している。イ
ンスリン注射は、ベータ細胞破壊を補償することができるが、血糖レベルは依然
として劇的に変動しうる。血中からのグルコース取り込み能の異常は、毒性産物
が蓄積し、失明、腎臓疾患、神経損傷を含む合併症を来す副作用を引き起こし、
そして最終的には昏睡及び死亡をもたらす。

【０１０８】（米国特許第５，６７２，３６１号）増殖させたい膵臓ベータ島細胞を、標準的な組織培養技術を使用して、マトリ
ックスでコーティングされた基質の上に置くか、又は適用した後、γ−ラミニン
５の存在下で、（米国特許第５，６７２，３６１号の開示のような）標準的な細
胞増殖培地中で増幅させる。マトリックスでコーティングされた基質上での成体
島細胞の増強された増殖を支持することができる任意の培地が、前述のように、
本発明の範囲内に含まれる。

【０１０９】糖尿病患者への移植のため、胎児膵臓島細胞をγ−ラミニン５の存在下でイン
ビトロ増殖させることもできる。γ−ラミニン５の存在下での胎児膵臓島細胞の
増殖は、移植のための島細胞の収量を増加させ、従って比較的大量にこれらの細
胞を作製する必要性を解決する。さらに、その他の増殖因子の成体島細胞培養培
地への包含は、島細胞の収量をさらに増加させるであろうと企図される。

【０１１０】ラミニン、又はラミニンを含有する細胞抽出物は、二相性に血管新生を制御す
ることが示されている（例えば、Ｎｉｃｏｓｉａｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉ
ｏｌ．１６４：１９７−２０６（１９９４）；Ｂｏｎｆｉｌｅｔａｌ．，Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５８：２３３−２３９（１９９４））。比較的低い濃
度（３０〜３００μｇ／ｍｌ）において、ラミニン−エンタクチン複合体は、３
次元培養物中で血管新生を刺激し、３０００μｇ／ｍｌにおいては、同複合体は
血管新生に対して阻害的であった。従って、もう１つの態様において、本発明は
、血管新生を制御するために有効な量のラミニン５又はそれらの薬学的組成物と
、組織又は培養基質を接触させることを含む、血管形成を制御する方法を提供す
る。一つの実施形態において、ラミニン５は、血管新生を促進するために有効な
量のラミニン５と、組織又は培養基質を接触させることにより、血管新生を促進
するために使用される。もう１つの実施形態において、ラミニン５は、血管新生
を阻害するために有効な量のラミニン５と組織又は培養基質を接触させることに
より、血管新生を阻害するために使用される。血管新生を制御するためにラミニ
ン５と接触させられる培養基質の例は、組織工学目的のため使用されるものであ
る。

【０１１１】本明細書において使用されるように、「血管新生」という用語は、血管の形成
をさす。特に、血管新生は、内皮細胞が病巣において退化し、基底膜へと侵入し
、血管新生刺激の方向へ間質内を移動し、移動先の近位で増殖し、血管へと組織
化され、そして新たに合成された基底膜へと再接着する、多段階の過程である（
Ｆｏｌｋｍａｎｅｔａｌ．，Ａｄｖ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，第４３巻，
１７５−２０３頁（１９８５）参照）。血管新生を促進する化合物は、創傷治癒
及び皮膚移植、臓器移植（人工臓器を含む）、再閉塞による移植片不全を防止す
るための血管移植片の内皮細胞被覆の加速を促進するため、虚血状態を治療する
ため、そして炎症性疾患を治療するために使用されうる。

【０１１２】さらなる態様において、本発明は、培養物中の細胞の接着、増殖、又は維持に
とって有効な量のγ−ラミニン５を含む細胞基質を提供する。基質は、前述の基
質のうちの任意のものを含みうる。好ましくは、γ−ラミニン５は、約１ｎｇ／
ｍｌと約１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度の溶液を使用して、基質表面上にコーティン
グされる。

【０１１３】本発明のもう１つの態様において、改良された細胞培養培地が提供される。こ
こで、改良には、細胞の接着、増殖、及び／又は維持を促進するために有効な量
のγ−ラミニン５の細胞培養培地への添加が含まれる。細胞の増殖を支持するこ
とができる任意の細胞培養培地が、本発明において使用されうる。そのような細
胞培養培地には、これらに限定されないが、イーグル基本培地（ＢａｓａｌＭ
ｅｄｉａＥａｇｌｅ）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）、イスコブ改変ダルベッコ培
地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）、マッ
コイ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、最少必須培地（ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｆ−１０栄養混合物（Ｎｕｔｒｉｅｎ
ｔＭｉｘｔｕｒｅ）、オプチ（Ｏｐｔｉ）−ＭＥＭ（登録商標）血清減少培地
（Ｒｅｄｕｃｅｄ−ＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ培地、及びマクロフ
ァージ−ＳＦＭ培地、又はそれらの組み合わせが含まれる。

【０１１４】改良された細胞培養培地は、濃縮形態（即ち：１０×）又は非濃縮形態のいず
れかで供給され、液体、粉末、又は凍結乾燥物のいずれかとして供給されうる。
細胞培養物は、化学的に規定されていてもよいし、又は血清補足物を含有してい
てもよい。培養培地は、ＧＩＢＣＯＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
）及びＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のような多くの供給元から市販さ
れている。又は、γ−ラミニン５は、細胞培養補足物として使用され、細胞培養
培地に別個に添加されてもよい。

【０１１５】精製されたγ−ラミニン５は、重合体、ヒドロキシアパタイト、及び金属を含
む、極めて多様な生体材料への上皮細胞の接着を促進し、従って生体材料の生体
適合性を改良することも示されている（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．、米国特許第
５，５８５，２６７号；ＥｌＧｈａｎｎａｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９９８年７月；４１（１）：３０−４０）。

【０１１６】そこで、さらに別の態様において、本発明は、装置を本発明によるγ−ラミニ
ン５単独で被覆するか、装置表面の生体適合性を高める他のタンパク質または薬
剤と組み合わせて被覆することにより、生体適合性を改善した医療装置を包含す
る。被覆された装置は、細胞の付着を促進するとともに、装置の挿入部位におけ
る炎症および／または感染の危険性を抑える。この装置は、歯肉炎および歯周炎
の治療において、ガム付着上皮の接着を促進するために使用することもできる。

【０１１７】装置は、成形製品、具体的には留置カテーテルかまたは経皮カテーテル、ポリ
テトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、拡張ＰＴＦＥ（ＥＰＴＦＥ）、針、金属
ピン、金属棒、結腸造瘻術、経皮カテーテル、歯科アバットメント部品、外科用
メッシュであることが好ましい。さらに別の好ましい実施形態において装置は生
体内で使用される。できれば、装置は、ステンレス鋼またはチタンのような生体
に適合する金属で作られるか、または被覆されることが好ましい。あるいは、装
置はセラミクス材料か、またはポリエステル、ポリグリコール酸、ポリガラクト
ース−ポリグリコール酸共重合体などのポリマーで作られるか、被覆される。

【０１１８】本発明の一つの具体的な用途は、目標とする表面への外皮の接着性を高めるこ
とである。たとえば、歯科埋め込みのための補綴を本発明のγ−ラミニンで被覆
して、歯周細胞への接着を促進することができる。典型的なケースでは、これら
の補綴には２つの分離した部品、骨に挿入されるインプラントおよび、実際に付
着上皮と接触するアバットメントが含まれる。あるいは、インプラントとアバッ
トメント部品とを単一ユニットとして入手することもできる。

【０１１９】装置が天然素材か、または生分解性人工素材でメッシュ、シートまたは織物の
形で製造される場合、γ−ラミニン５は直接それらの表面に付けることができる
。次に、上皮細胞はマトリクス上で培養して、たとえば歯科アバットメント部品
、針、金属ピンまたは金属棒、留置カテーテル、結腸造瘻術用管、外科用メッシ
ュ、その他γ−ラミニンによる被覆が好ましいあらゆる装置を含め、移植または
埋め込みが可能な装置を形成させることができる。あるいは、装置を埋め込んで
細胞を生体内で接着させることもできる。上皮細胞で被覆した外科用メッシュは
、皮膚の修復に必要な皮膚となる同種異系移植に有用であろう。

【０１２０】 γ−ラミニン５の結合は、共有結合によらなくてももよいし（たとえば吸着）
、共有結合でて行ってもよい。具体的には、装置を本発明のγ−ラミニン５に浸
漬するか、その中で加温するか、装置にγ−ラミニン５を吹き付けることによっ
て行うことができる。好ましい実施形態によれば、装置を被覆するためのγ−ラ
ミニン５の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌの範囲にある。

【０１２１】さらに本発明は、外皮細胞を加温する前に、装置をγ−ラミニン５で被覆する
ことを特徴とする、装置に外皮細胞を接着させる方法を提供する。

【０１２２】本発明に従って作られるγ−ラミニン５の治療への応用は、たとえばタイプＩ
の糖尿病；糖尿病による足の潰瘍；血管の潰瘍、褥瘡、皮膚の外科的治療、火傷
、急性の負傷、皮膚移植；潰瘍の潰瘍；胃腸潰瘍；歯肉炎；および歯周炎を含む
、様々な状況や疾病の治療に使用することができる。これらの状況および疾患に
対して使用される治療上有効な量は、通常の方法によって容易に確認することが
できる。

【０１２３】本発明は、次に挙げる実施例を参照することによってさらによく理解すること
ができよう。もちろん、本発明は、本明細書の特許請求の範囲に規定されており
、ここに挙げる実施例は、単に理解を助けるために記載されるものであって、本
発明の範囲を限定するものではない。

【０１２４】実施例ラミニン５は、ラミニン５分子の鎖、すなわちα３、β３およびγ２をコード
するｃＤＮＡｓを含むベクターを、哺乳動物細胞に逐次移入して作られる。発現
されるヘテロ三量体組み換えラミニン５分子をアフィニテイによって精製しやす
くするため、β３遺伝子のアミノ末端に、「フラッグ」ペプチド（ＤＹＫＤＤＤ
ＤＫ）をコードするポリヌクレオチドの配列を追加的に加えた。

【０１２５】ＩＶ．実験材料および方法 α３のための発現ベクター構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ） α３ｃＤＮＡの全コード配列［配列番号：１］は、標準法に従い、Ｚｅｏｃｉ
ｎ耐性選択遺伝子を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（インビトロゲ
ン社）にクロニングした。発現ベクターは、製造者の使用説明書に従って、安定
した細胞株を作るのに使用した。

【０１２６】第二のα３発現ベクターを作るために、ｐＺｅｏα３発現構造体から、Ｋｐｎ
Ｉ−ＮｏｔＩ制限酵素で完全長α３ｃＤＮＡを切り出した。２回消化α３断片を
発現ベクターｐＴａｒｇｅＴ（プロメガ社製；マジソン、ウィスコンシン州）に
挿入してｐＴｇＴα３を調製した。この発現構造体は耐性クロン選択性Ｇ４１８
耐性遺伝子を含んでいる。両発現構造体は、制限酵素によるマッピングとＤＮＡ
の塩基配列の決定によって分析した。

【０１２７】完全長β３鎖構造体二つのｃＤＮＡ断片、ＫａＩ５−５ｃおよびＫａＩ９２−１は、バージソン博
士の研究室から入手した（４）。両者は、それぞれ別々にｐＣＲＩＩベクター（
インビトロゲン社）にクロニングされ、両者を合わせるとラミニン５の完全なβ
３鎖［配列番号：１９］をコードする。２つの断片は、単一ベクターにクロニン
グして完全長のβ３鎖、プラスミドＰＣＲＩＩβ３を得た。

【０１２８】 β３のための発現ベクター構造体ラミニンβ３発現ベクター、ｐＲＣＸ３β３Fは、ｐＣＲＩＩβ３およびアミ
ノ酸末端に付加されるフラッグエピトープに対して得られる全長β３を含んで構
築された［配列番号：１７−１８］。ｐＲＣＸ３はｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロ
ゲン社）から誘導されるベクターで、便利なクロニング部位の枠内にＧ４１８ス
ルファート、ＢＭ４０（ＳＰＡＲＣ）シグナルペプチド配列およびフラッグペプ
チド配列を有するゲネチシン耐性選択遺伝子を含む。

【０１２９】第２の発現ベクターは、ｐＲＣＸ３β３Fプラスミドから、完全なラミニンβ
３フラグペプチドをコードする領域を切り出し、それをｐｃＤＮＡ３．１に導入
することによって構築した。この発現構造体はゼオチン耐性選択遺伝子を含む。

【０１３０】両β３発現構造体は、制限酵素によるマッピングとＤＮＡの塩基配列の決定に
よって分析した。

【０１３１】 γ２のための発現ベクター構造体完全長γ２ｃＤＮＡ［配列番号：２９］は、ｐＶＬ１３９３γ２（スエーデン
、カロリンスカ研究所、カルル・トリッグヴァソン博士から入手）から、Ｂａｍ
ＨＩ−ＫｂａＩ制限酵素で切断して切り出した。２回消化γ２断片を発現ベ
クターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（インビトロゲン社）の該当する部位に挿入し
てｐＺｅｏγ２発現構造体を作った。この発現構造体はゼオシン耐性選択遺伝子
を含んでいる。

【０１３２】同様に、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ完全長γ２ｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐＴ
ａｒｇｅＴ（プロメガ社製）にクロニングしてｐＴｇＴγ２を作った。この発現
構造体は耐性クロン選択性Ｇ４１８耐性遺伝子を含んでいる。

【０１３３】両発現構造体は、制限酵素によるマッピングとＤＮＡの塩基配列の決定によっ
て分析した。

【０１３４】発現構造体の塩基配列の決定発現ベクター構造体の塩基配列は決定されており、報告された配列と発表され
ている配列とを比較した。表２は、異なるラミニン鎖に対するアミノ酸のミスマ
ッチをまとめたものである。

【０１３５】 α３鎖：報告された配列は発表されている配列と合致した。

【０１３６】 β３鎖：発表されている配列といくつかの食い違いが見られた。一個および複
数個の塩基の欠失、および挿入を配列に沿って示している。これらの塩基変化に
よってサイレント突然変異、アミノ酸の置換および挿入が生じた。これらの変化
があっても早期に終止コドンをもたらさない。従って、β３鎖は「完全長」を有
し、タンパク質が産生するものと思われる。

【０１３７】 γ２鎖：この鎖は３個所に塩基の変化があり、その結果３個所でアミノ酸が置
換されていると報告された。

【０１３８】

【表２】ヒト腎臓の２９３細胞の移入標準的な方法によって、野生型ヒト腎臓２９３細胞に異なる発現構造体を移入
した。二種類の移入試薬、ＧＩＢＣＯ社製（メリーランド州ロックビル）のＬＩ
ＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥTRおよびキアジェン社製（カリフォルニア州バレンシア
）のＳＵＰＥＲＦＥＣＴTRを使用した。実験結果（下記参照）からは、２９３細
胞は検知できるだけの内因性ラミニンα３、β３またはγ２鎖を発現しないこと
を示唆している。

【０１３９】簡単に述べると、両方法とも、移入試薬と対象となるＤＮＡとを混合し、それ
から短時間室温で保温し、混合物を細胞に加えるこ必要があった。移入日の細胞
密集率が５０〜８０％であるように、その前日に細胞を分割した。ＬＩＰＯＦＥ
ＣＴＡＭＩＮＥTRの移入に対してはＤＮＡ−試薬複合物を無血清培地で、ＳＵＰ
ＥＲＦＥＣＴTRの移入に対しては完全培地で、２〜３時間保温した。つづいて培
地を新しい増殖培地に取り換えて、選択過程が始まるまで保温を続けた。

【０１４０】選択過程は、Ｇ４１８耐性の選択にはゲネチシン（Ｇ４１８スルファート）を
４００μｇ／ｍｌ、ゼオシン耐性の選択にはゼオシンを５０μｇ／ｍｌ含むＤＭ
ＥＭＦ１２／１０％ＦＢＳ中で行った。選択培地に分割し、その後、細胞増殖
巣の形成が確認されるまで２日おきに新しい選択培地を細胞に供給した。両抗生
物質を含む培地を使って、３種類のラミニン鎖を移入され、培地にγ−ラミニン
５を分泌するクローンを選別した。

【０１４１】結果１本の鎖だけを移入されたヒト腎臓２９３細胞からの培地を、まず、鎖特異的
アンチ−ラミニン５抗体を使ってウェスタンブロット法で分析した。細胞画分ば
かりでなく、細胞を緩衝液中に掻き出す時に得られる「マトリクス様」のものも
含む細胞も分析した。野生型２９３細胞培養物のウェスタンブロット分析からは
、ラミンニンα３、β３またはγ２鎖タンパク質は検出されなかった。

【０１４２】移入後の単一ラミニン鎖の発現は、アンチフラッグ抗体を使用するウェスタン
ブロット分析で培地にβ３鎖反応性を示す少数のβ３クロン以外は、一般に細胞
内的である。

【０１４３】移入された遺伝子の組み込みを確認するため、フラッグ抗体の反応性を示すす
べてのクロンをＰＣＲ法で調べた。このようなクロンからのゲノムＤＮＡ調製物
のＰＣＲによる分析は、ラミニン鎖特異的プライマー対を使用して行った。増幅
生成物と、最初の発現構造体をテンプレートにしたポジテイブ対照群とを比較し
た。結果を表３に示す。同じラミニン鎖特異的プライマーおよび全ＲＮＡおよび
／またはｍＲＮＡ調製物をテンプレートとして使用し、ＲＴ−ＰＣＲ法によって
少数のクロンを分析した。その結果を表２に示す。

【０１４４】その他のデータ（図示せず）によれば、γ−ラミニン５の成分のいくつかは分
子の大きさは精製ラミニン５のそれと違っていることを示した。具体的には、純
粋なラミニン５におけるα３の主要成分は１６５ｋＤであったのに対して、γ−
ラミニン５のα３バンドは１５０ｋＤおよび９５ｋＤの２本の鎖として移動した
。

【０１４５】さらに、３本すべての鎖を作り出す確認された同時移入クロン（ゲノムＰＣＲ
法およびＲＴ−ＰＣＲ法の両分析法で検定）をケラチン細胞の細胞接着結合測定
法で分析した。

【０１４６】ラミニン５のＨＦＫ細胞接着測定使用される方法で様々なクロンからのコンデイショニングした培地に存在する
ラミニン５を測定した。試験培地に存在するラミニン５をアンチラミニンα３抗
体を通して９６ウェルにトラップした（Ｃ２５）。ヒトの包皮ケラチン細胞（Ｈ
ＦＫ）を蛍光標識し、処理されたウェルに加え、３０分間接着させた。ＰＢＳで
洗浄する前後の蛍光強度を測定した。細胞接着百分率は、ウェルに保持された蛍
光分率に等しい。対照として、細胞をウェルに加える前に、抗インテグリンα３
β１阻害抗体（Ｐ１Ｂ５）（α３β１はラミニン５の細胞受容体である）または
非特異的対照抗体（ＳＰ２）とあらかじめ保温した。培地対照（ケラチン細胞増
殖培地（「ＫＧＭ」と略記））またはＤＭＥＭＦ１２培養基（単に「培地」と
略記）も使用した。「a２Fの表記」は関連性のないフラッグを含むタンパク質を
発現させるために移入された２９３細胞はからの培養基を示す。

【０１４７】結果を表２（最後の欄）および図１に示す。図１では次の表示法が使用してあ
る。Ｃ５およびＦ１０：クロンＣ５およびＦ１０を作るγ−ラミニン５からのコ
ンデイショニングされた培養基；＊Ｃ６および＊Ｆ１０：以前に収集、冷蔵して
いたコンデイショニングされた培養基。これらのデータから、いくつかのクロー
ンからの培地は細胞接着試験で陽性の結果を示していることが分かる。これは、
クロンによって作られたγ−ラミニンが生物活性を示していることを示す。この
活性はインテグリンα３β１抗体の存在によって阻害された。このことは、γ−
ラミニンがα３β１インテグリンを介して細胞に結合することを裏づけている。

【０１４８】ヘテロ三量体γ−ラミニン５分子の精製を助けるために、ラミニンβ３鎖をア
ミノ末端でフラッグ配列で標識した。３本すべての鎖を移入され、３本すべての
鎖を発現することが明らかにされているクロンからの培地をアンチフラッグのカ
ラムに流し、過剰のフラッグペプチドで溶離した。溶離したフラクションをゲル
電気泳動で分析した。得られたデータは、γ−ラミニンが作られ、そして単離さ
れたことを証明している。

【０１４９】

【表３】上のクロンのいくつかを選んで以下の分析を行った。すなわち、クロンＦ１０
−５から培養基１リットルを調製し、上で述べた方法によってγ−ラミニン５を
精製した。得られたγ−ラミニン５は、ＨＫＦ細胞接着試験に使用し、プレート
に直接付着させた点を除き、上に記載した手順通りに行った。結果を図２に示す
。これによれば、γ−ラミニンは、試験したすべての濃度でＨＦＫ細胞の接着性
を格段に高めることが分かる。

【０１５０】電子顕微鏡写真による分析精製したγ−ラミニンタンパク質を５０μｇ／ｍｌ濃度に希釈したのち、７０
％グリセロール／３０％０．１５Ｍ炭酸水素アンモニウムに調節し、標準的な
方法に従って、ロータリーシャドーを行った。図３は、８０，０００倍で撮影し
た（Ａ）γ−ラミニン５および（Ｂ）非組み換えγ−ラミニン（ＳＣＣ−２５（
扁平細胞のがん細胞株）コンデイショニング培地からＢＭ１６５モノクロン抗体
アフィニテイクロマトグラフィによって精製）の電子顕微鏡写真である。写真右
下の横棒の長さは５０ｎｍに相当する。これらの結果から、γ−ラミニン５およ
び非組み換え精製γ−ラミニン５は、ラミニンに典型的な、類似の断面構造を形
成することが確認された。

【０１５１】本発明は上で述べた好ましい実施形態に限定されるものではない。通常の当業
者であれば本発明の精神から逸脱することなく、ここに開示された好ましい実施
形態の様々な変更および修正を行うことができよう。そしてそのような変更およ
び修正はすべて本発明の範囲内に包含されるものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、多様なＨＦＫ細胞における多様なクローンを対象に、培地中において
γラミニン５の活性を見た細胞接着アッセイを示す棒グラフである。

【図２】図２は、γラミニン５が平板上に直接コートされた状態での、細胞接着アッセ
イを示す棒グラフである。ｐｌｂ５は抗インテグリンα３β１抗体、ｓｐ２は非
特異性対照ＩｇＧを示し、Ｃ２９は抗ラミニン５抗体を示す。

【図３】図３は、γラミニン５のロータリーシャドー解析である。精製γラミニン５タ
ンパクを５０μｇ／ｍｌに希釈し、７０％グリセロール／３０％の０．１Ｍ重炭
酸アンモニウムとなるよう調整して、標準法を使い、ロータリーシャドーにかけ
た。ＳＣＣ−２５（扁平細胞癌細胞株）のコンディション培地から、約８０．０
００倍の磁場が示されており、（Ａ）γラミニン５、（Ｂ）「未処理の」ラミニ
ン５（ＢＭ１６５モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーで示さ
れている。棒印は５０ｎｍを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｌ 29/00 Ａ６１Ｐ 1/02 ４Ｃ０８７ 31/00 1/04 ４Ｈ０４５Ａ６１Ｐ 1/02 9/14 1/04 17/00 9/14 17/02 17/00 27/02 17/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 27/02 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:91 5/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｅ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号６０／１５５，９４５ (32)優先日平成11年９月24日(1999．9．24) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA03 HA12 HA15 4B064 AG02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BB19 BC41 CA24 CA44 4C081 AB01 AB19 AB31 AC08 BA12 BB04 CD112 CD34 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 CA25 DC50 NA14 ZA331 ZA361 ZA671 ZA681 ZA891 ZA892 4C087 AA01 AA02 AA03 BB51 BB64 NA05 NA14 ZA66 4H045 AA10 AA20 AA30 BA53 CA40 DA01 DA86 EA22 EA24 EA27 EA34 FA74 GA21 GA26 HA07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えラミニン５−発現細胞。
【請求項２】これらの細胞が、下記のもの：実質的にα３ラミニン鎖に類似したポリペプチドを含む第一鎖；実質的にβ３ラミニン鎖に類似したポリペプチドを含む第ニ鎖；実質的にγ２ラミニン鎖に類似したポリペプチドを含む第三鎖；を含む組換えラミニン５を発現し、ここにおいて、第一、第二、及び第三鎖が、組換えヘテロトリマーラミニン５
に集合されている、請求項１に記載の組換えラミニン５―発現細胞。
【請求項３】これらの細胞が、下記のもの：配列番号：２、４、６、８、１０、１２のうちの１つ又はそれ以上、又はこれ
らの断片と少なくとも７０％同一である組換えポリペプチドを含む第一鎖；配列番号：１４、１６、１８、２０、２２、２４のうちの１つ又はそれ以上、
又はこれらの断片と少なくとも７０％同一である組換えポリペプチドを含む第ニ
鎖；配列番号：２６、２８、３０、３２、３４、３６のうちの１つ又はそれ以上、
又はこれらの断片と少なくとも７０％同一である組換えポリペプチドを含む第三
鎖；を含む組換えラミニン５を発現し、ここにおいて、この細胞が、第一、第二、及び第三鎖を発現し、第一、第二、
及び第三鎖が、培養された細胞によって培地中に分泌される組換えヘテロトリマ
ーラミニン５に集合する、請求項１に記載の組換えラミニン５―発現細胞。
【請求項４】これらの細胞が、下記のもの：高い緊縮条件下に配列番号：１、３、５、７、９、１１のうちの１つ又はそれ
以上、又はこれらの断片のコーディング領域にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドによってエンコードされた第一鎖；高い緊縮条件下に配列番号：１３、１５、１７、１９、２１、２３のうちの１
つ又はそれ以上、又はこれらの断片のコーディング領域にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドによってエンコードされた第ニ鎖；高い緊縮条件下に配列番号：２５、２７、２９、３１、３３、３５のうちの１
つ又はそれ以上、又はこれらの断片のコーディング領域にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドによってエンコードされた第三鎖；を含む組換えラミニン５を発現し、ここにおいて、この細胞が、第一、第二、及び第三鎖を発現し、第一、第二、
及び第三鎖が、培養された細胞によって培地中に分泌される組換えヘテロトリマ
ーラミニン５に集合する、請求項１に記載の組換えラミニン５―発現細胞。
【請求項５】これらの細胞が、第一、第二、及び第三ポリペプチド鎖を含
む組換えラミニン５を発現し、ここにおいて第一、第二、及び第三ポリペプチド
鎖が各々、（１）Ｒ１―Ｒ２―Ｒ３；（２）Ｒ１―Ｒ２―Ｒ３（ｅ）；（３）Ｒ
３；（４）Ｒ３（ｅ）；（５）Ｒ１―Ｒ３；（６）Ｒ１―Ｒ３（ｅ）；（７）Ｒ
２―Ｒ３；及び（８）Ｒ２―Ｒ３（ｅ）から成る群から選ばれる一般構造を含ん
でおり、ここにおいてＲ１は、アミノ末端メチオニンであり；Ｒ２は、ポリペプチドの
分泌を命令しうるシグナル配列であり、ここにおいてこのシグナル配列は、特別
なラミニン鎖のための天然のシグナル配列、すなわち別の分泌タンパク質のもの
であってもよく、あるいはこれは人工的な配列であってもよく；Ｒ３は第一ポリ
ペプチド鎖用の分泌されたα３ラミニン鎖、第二ポリペプチド鎖用の分泌された
β３ラミニン鎖、及び第三ポリペプチド鎖用のγ２ラミニン鎖であり；Ｒ３（ｅ
）はＲ３と同一であるが、さらにエピトープタグをも含んでいる、請求項１に記載の組換えラミニン５―発現ホスト細胞。
【請求項６】下記のもの：ａ．請求項１〜５のうちのいずれか１つに記載の真核細胞を供給すること、ｂ．組換えラミニン５鎖の発現を刺激するための条件下に細胞培養培地におい
てこれらの細胞を成長させること；ｃ．細胞培養培地を、親和クロマトグラフィーカラムに通すことであって、こ
のカラムが、エピトープタグに特異的に結合する化合物を含んでいること；ｄ．未結合材料を除去するために親和カラムを洗浄すること；及びｅ．このカラムから結合組換えラミニン５を溶離すること、を含む、組換えラミニン５の精製方法。
【請求項７】請求項６に記載の方法により単離された精製組換えラミニン
５。
【請求項８】精製組換えラミニン５。
【請求項９】下記のもの：実質的にα３ラミニン鎖に類似したポリペプチドを含む第一鎖；実質的にβ３ラミニン鎖に類似したポリペプチドを含む第ニ鎖；実質的にγ２ラミニン鎖に類似したポリペプチドを含む第三鎖；を含み、ここにおいて、第一、第二、及び第三鎖が、組換えヘテロトリマーラミニン５
に集合されている、請求項８に記載の実質的に精製された組換えラミニン５。
【請求項１０】下記のもの：配列番号：２、４、６、８、１０、１２のうちの１つ又はそれ以上、又はこれ
らの断片と少なくとも７０％同一である組換えポリペプチドを含む第一鎖；配列番号：１４、１６、１８、２０、２２、２４のうちの１つ又はそれ以上、
又はこれらの断片と少なくとも７０％同一である組換えポリペプチドを含む第ニ
鎖；配列番号：２６、２８、３０、３２、３４、３６のうちの１つ又はそれ以上、
又はこれらの断片と少なくとも７０％同一である組換えポリペプチドを含む第三
鎖；を含み、ここにおいて、第一、第二、及び第三鎖が、組換えヘテロトリマーラミニン５
に集合されている、請求項８に記載の精製組換えラミニン５。
【請求項１１】下記のもの：高い緊縮条件下に配列番号：１、３、５、７、９、１１のうちの１つ又はそれ
以上、又はこれらの断片のコーディング領域にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドによってエンコードされた第一鎖；高い緊縮条件下に配列番号：１３、１５、１７、１９、２１、２３のうちの１
つ又はそれ以上、又はこれらの断片のコーディング領域にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドによってエンコードされた第ニ鎖；高い緊縮条件下に配列番号：２５、２７、２９、３１、３３、３５のうちの１
つ又はそれ以上、又はこれらの断片のコーディング領域にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドによってエンコードされた第三鎖；を含み、ここにおいて、第一、第二、及び第三鎖が、組換えヘテロトリマーラミニン５
に集合されている、請求項８に記載の精製組換えラミニン５。
【請求項１２】第一、第二、及び第三ポリペプチド鎖を含み、ここにおい
て、第一、第二、及び第三ポリペプチド鎖が各々、（１）Ｒ１―Ｒ２―Ｒ３；（
２）Ｒ１―Ｒ２―Ｒ３（ｅ）；（３）Ｒ３；（４）Ｒ３（ｅ）；（５）Ｒ１―Ｒ
３；（６）Ｒ１―Ｒ３（ｅ）；（７）Ｒ２―Ｒ３；及び（８）Ｒ２―Ｒ３（ｅ）
から成る群から選ばれる一般構造を含んでおり、ここにおいてＲ１は、アミノ末端メチオニンであり；Ｒ２は、ポリペプチドの
分泌を命令しうるシグナル配列であり、ここにおいてこのシグナル配列は、特別
なラミニン鎖のための天然のシグナル配列、すなわち別の分泌タンパク質のもの
であってもよく、あるいはこれは人工的な配列であってもよく；Ｒ３は第一ポリ
ペプチド鎖用の分泌されたα３ラミニン鎖、第二ポリペプチド鎖用の分泌された
β３ラミニン鎖、及び第三ポリペプチド鎖用の分泌されたγ２ラミニン鎖であり
；Ｒ３（ｅ）はＲ３と同一であるが、さらにエピトープタグをも含んでいる、請求項８に記載の精製組換えヘテロトリマーラミニン５。
【請求項１３】下記のもの：ａ．請求項７〜１２のうちのいずれか１つに記載の組換えラミニン５；及びｂ．製薬的に許容しうるキャリヤー、を含む製薬組成物。
【請求項１４】傷の治療を加速するのに有効な量の、請求項７〜１２のう
ちのいずれか１つに記載の組換えラミニン５を、これを必要としている患者に投
与することを含む、傷の治療を加速するための方法。
【請求項１５】この傷が、糖尿病性足潰瘍、静脈潰瘍、とこずれ、皮膚手
術、やけど、急性外傷、皮膚移植片、角膜潰瘍化、胃腸潰瘍、歯周炎、及び歯肉
炎からなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】医療器具の生体適合性を改良するのに有効な量の、請求項
７〜１２のうちのいずれか１つに記載の組換えラミニン５と医療器具とを接触さ
せることを含む、医療器具の生体適合性の改良方法。
【請求項１７】表面への細胞接着を促進するのに有効な量の、請求項７〜
１２のうちのいずれか１つに記載の組換えラミニン５と細胞とを接触させること
を含む、表面への細胞接着の促進方法。
【請求項１８】Ｉ型糖尿病の生体外治療を必要とする患者における改良治
療方法であって、この改良が、すい臓島ベータ細胞の表面への接着を促進するの
に有効な量の、請求項７〜１２のうちのいずれか１つに記載の組換えラミニン５
の存在下に、単離されたすい臓島ベータを培養すること、これらの細胞を培養す
ること、及びこれらの細胞を患者に再導入することから成る方法。
【請求項１９】血管形成を調節するために、血管形成を促進するのに有効
な量のラミニン５と、これを必要としている組織とを接触させることを含む、血
管形成の調節方法。
【請求項２０】このラミニン５が、請求項７〜１２のうちのいずれか１つ
に記載の組換えラミニン５を含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】改良が、細胞成長基質への細胞付着を促進するのに有効な
量の、請求項７〜１２のうちのいずれか１つに記載の組換えラミニン５で被覆さ
れた細胞成長基質を供給することから成る、改良された細胞成長基質。
【請求項２２】改良が、細胞成長基質への細胞付着を促進するのに有効な
量の、請求項７〜１２のうちのいずれか１つに記載の組換えラミニン５を供給す
ることから成る、改良された細胞培養培地。
【請求項２３】改良が、医療用移植器具への細胞付着を促進するのに有効
な量の、請求項７〜１２のうちのいずれか１つに記載の組換えラミニン５で被覆
された医療用移植器具を供給することから成る、改良された医療用移植器具。
【請求項２４】医療用移植器具が、人工移植片、体内留置又は経皮カテー
テル、ポリテトラフルオロエチレン、膨張ポリテトラフルオロエチレン、針、金
属ピン、金属ロッド、結腸フィステル形成管、経皮カテーテル、歯科用アバット
メントピース、又は外科用メッシュから成る群から選ばれる、請求項２３に記載
の改良された医療用移植器具。
【請求項２５】傷の治療を加速するのに有効な量の、請求項１３に記載の
製薬組成物を、これを必要としている患者に投与することを含む、傷の治療の加
速方法。
【請求項２６】この傷が、糖尿病性足潰瘍、静脈潰瘍、とこずれ、皮膚手
術、やけど、急性外傷、皮膚移植片、角膜潰瘍化、胃腸潰瘍、歯周炎、及び歯肉
炎からなる群から選ばれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】医療器具の生体適合性を改良するのに有効な量の、請求項
１３に記載の製薬組成物と医療器具とを接触させることを含む、医療器具の生体
適合性の改良方法。
【請求項２８】表面への細胞接着を促進するのに有効な量の、請求項１３
に記載の製薬組成物と細胞とを接触させることを含む、表面への細胞接着の促進
方法。
【請求項２９】Ｉ型糖尿病の生体外治療を必要とする患者における改良治
療方法であって、この改良が、すい臓島ベータ細胞の表面への接着を促進するの
に有効な量の、請求項１３に記載の製薬組成物の存在下に、単離されたすい臓島
ベータを培養すること、これらの細胞を培養すること、及びこれらの細胞を患者
に再導入することから成る方法。
【請求項３０】血管形成を調節するために、血管形成を調節するのに有効
な量の請求項１３に記載の製薬組成物と、これを必要としている組織とを接触さ
せることを含む、血管形成の調節方法。
【請求項３１】改良が、細胞成長基質への細胞付着を促進するのに有効な
量の、請求項１３に記載の製薬組成物で被覆された細胞成長基質を供給すること
から成る、改良された細胞成長基質。
【請求項３２】改良が、医療用移植器具への細胞付着を促進するのに有効
な量の、請求項１３に記載の製薬組成物で被覆された医療用移植器具を供給する
ことから成る、改良された医療用移植器具。
【請求項３３】医療用移植器具が、人工移植片、体内留置又は経皮カテー
テル、ポリテトラフルオロエチレン、膨張ポリテトラフルオロエチレン、針、金
属ピン、金属ロッド、結腸フィステル形成管、経皮カテーテル、歯科用アバット
メントピース、又は外科用メッシュから成る群から選ばれる、請求項３２に記載
の改良された医療用移植器具。
【請求項３４】配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２９、配列
番号：３１から成る群から選ばれる、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３５】配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：３０、及び
配列番号：３２から成る群から選ばれる、単離されたポリペプチド配列。