WO2004108927A1

WO2004108927A1 - ラミニン５ｂ

Info

Publication number: WO2004108927A1
Application number: PCT/JP2004/007779
Authority: WO
Inventors: Kaoru Miyazaki; Yoshinobu Kariya
Original assignee: Yokohama Tlo Company, Ltd.
Priority date: 2003-06-04
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2004-12-16
Also published as: JPWO2004108927A1; JP4798560B2

Abstract

本発明は、α３Ｂ鎖、β３鎖、およびγ２鎖の各サブユニットから構成されるヒトラミニン５Ｂ蛋白質を提供する。ここで、α３Ｂ鎖は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、β３鎖は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、γ２鎖は、配列番号６で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有する。本発明のラミニン５Ｂは、細胞増殖促進活性、細胞接着促進活性、細胞運動促進活性、および神経突起伸展促進活性を有する。

Description

明細書

ラミニン 5 B 技術分野

本発明は、細胞増殖促進、細胞接着促進、細胞運動促進、および神経突起伸展促進活性を有するヒトラミニン 5 B、ならびにこれを含む細胞増殖促進剤、細胞接着促進剤、細胞運動促進剤、および神経突起伸展促進剤に関する。背景技術

ラミニンは基底膜の重要な成分であり、細胞表面レセプターと相互作用することによって細胞機能を調節している。ラミニン分子は、《、 β、了の 3つの鎖がジスルフィド結合で会合したヘテロ三量体蛋白質であり、特徴的な十字架構造をとっている。現在までに、 5種類のひ鎖、 3種類の /3鎖、 3種類のァ鎖の異なる組み合わせによって 15種類のァイソフォームが同定されている。各アイソフォームは異なる組織分布を示し、それぞれ異なる役割分担を果たすと考えられるが、その詳細は明らかではない。

ラミニン分子は、 3本鎖のアミノ（Ν) 末端部分（短腕）で互いに会合したり、他のマトリクス分子と会合して、基底膜を構築する。一方、ひ鎖の力ルポキシル (C) 末端には 5つの相同な球状ドメイン（G1—G5ドメインまたは LG1— LG5) が存在し、主にこの部分でインテグリンやその他のレセプターと結合する。 .

ラミニン 5は、 3鎖、 33鎖、ァ 2鎖からなるラミニン分子であり、表皮細胞が産生するマトリクス分子（ラドシン、カリニン、ェピリグリン、ナイセインとも称される）として見いだされた。この分子は、表皮の真皮への結合に中心的な役割を果たしており、ほとんどの細胞においてィンテグリン 0； 3 β 1に優先的に結合するが、細胞によってはインテグリンひ 6 ]31、ひ 6 i34にも結合する。ラミニン 5における《 3鎖 G2ドメインの a 3G2 A配列（RERFN I STP AFRGCMKNLKKTS) や G3ドメインの KRD配列がインテグリンに対する主要な結合部位であることが解明されている。また、 α 3鎖の C末端に存在する G 4および G 5ドメインはラミニン 5が分泌された直後に蛋白質分解酵素によって切断除去されることが知られている。通常の方法で単離されるラミニン 5 には G4、 G5ドメインが存在しない。このようなラミニン 5は、細胞の接着促進活性、運動促進活性、および神経再生促進活性を有することが知られている。 ' ラミニン 5に含まれる α 3鎖には短鎖型（ひ 3Α) と長鎖型（ο;3Β) が存在し、それらの各組織における発現パターンが異なることが報告されている（J. Biol. Chem. , 270 (1995), 21820-21826) 。 a 3 Α鎖は α 3 Β鎖の Ν末端側が欠失した構造を有する。 a 3 Α鎖の全長 cDN Αはヒトゃマウスなどでクロ一ニン' グされているのに対して、ひ 3 B鎖に関してはマウスで全長 cDNAが、ヒトでは不完全な cDNAがクローニングされている（FEBS Letters 417 (1997), 65- 70) 。しかし、これまでに a 3 B鎖を有するラミニン 5 Bは単離されていない。発明の開示

本発明者らは、ヒトラミニン 3 B鎖、 ]33鎖およびァ 2鎖からなるラミニン 5 B分子を培養細胞中で安定して発現させることに成功し、ラミニン 5Bが優れた細胞増殖促進効果、細胞接着促進効果、細胞運動促進効果、および神経突起伸展促進効果を有することを見いだした。

本発明は、 a3B鎖、）63鎖、およびァ 2鎖の各サブユニットから構成されるラミニン 5 B蛋白質を提供する。ここで、ひ 3B鎖は、配列番号 2で示されるァミノ酸配列、またはこの配列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、 jS 3鎖は、配列番号 4で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、ァ 2鎖は、配列番号 6で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有する。

本発明のラミニン 5 B蛋白質は、ラミニン 5と同様に、分泌された直後に蛋白質分解酵素によって G4および G 5ドメインが切断される。すなわち、別の観点においては、本発明は、 a3B#3鎖、 /33鎖、およびァ 2鎖の各サブュニットから構成されるラミニン 5 B蛋白質を提供する。ここで、ひ 3B#3鎖は、配列番号 8で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1またはそれ以上のァミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、 ^ 3鎖は、配列番号 4で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、ァ2鎖は、配列番号 6で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有する。本発明はまた、上述の本発明のラミニン 5 B蛋白質を含む細胞増殖促進剤、細胞接着促進剤、細胞運動促進剤ならびに神経突起伸展促進剤を提供する。本発明はまた、上述の本発明のラミニン 5 B蛋白質を用いることを特徴とする、細胞増殖を促進する方法、細胞接着を促進する方法、細胞運動を促進する方法、ならびに神経突起伸展を促進する方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のラミニン 5 B蛋白質の構造を示す。

図 2は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの S D S— P AG Eの結果を示す。図 3は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bのィムノブロッティングの結果を示す。図 4は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの細胞接着アツセィの結果を示す。図 5は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの細胞接着活性に及ぼす抗インテグリン抗体の阻害効果を示す。

図 6は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの細胞のスキヤッ夕リング活性のアツセィの結果を示す。

図 7は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの細胞の細胞運動促進活性のァッセィの結果を示す。

図 8は、ラミニン 5またはラミニン 5 Bでトランスフエクトした H E K細胞の増殖曲線を示す。

図 9は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの細胞増殖促進活性のアツセィの結果を示す。

図 1 0は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの細胞増殖促進活性のアツセィの結果を示す。図 11は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの腎臓尿細管上皮細胞の増殖促進活性のアツセィの結果を示す。

図 12は、ラミニン 5およびラミニン 5 Bの神経突起伸展促進活性のアツセィの結果を示す。

図 13は、ラミニンひ 3 B鎖の全長塩基配列を示す。

図 14は、ラミ.ニン ο; 3 B鎖の全長アミノ酸配列を示す。

図 15は、ラミ.ニン β 3鎖の塩基配列を示す。

図 16は、ラミ.ニン β 3鎖の全長アミノ酸配列を示す。

図 17は、 'ラミ.ニンァ 2鎖の塩基配列を示す。

図 18は、ラミ.ニン Ύ 2鎖の全長アミノ酸配列を示す。

図 19は、' ラニン 3 Β # 3鎖の塩基配列を示す。

図 20は、ラニン Q! 3B#3鎖のアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明

図 1に、ラミニン 5 (LN 5) 蛋白質および本発明のラミニン 5 B (LN 5 B) 蛋白質の構造を示す。 LN5は Q!3A鎖、 3鎖、およびァ 2鎖からなり、 LN5B鎖は α3Β鎖、 j33鎖、およびァ 2鎖からなる。 α3Β鎖は α;3Α鎖の約 2倍の大きさをもち、ひ 3Β鎖の C末端側約半分の構造はひ 3 Α鎖と共通である。ひ 3 B鎖と α 3 A鎖の C末端部分には球状（G) ドメインが存在し、それは 5つのサブドメイン（またはモジュール）（G1〜G5) に分かれている。 LN 5や L N 5 Bが細胞から分泌されると直ちに蛋白質分解酵素により G 3と G 4の間（黒矢じり）で完全に切断される。従って、培養液中には G4と G 5を欠損する LN5または LN5Bが分泌される。また、 α 3 B鎖、ひ 3 Α鎖、およびァ 2 鎖の N末端部分（白矢じり）でも部分的な切断が起こる。

本発明のラミニン 5 B蛋白質は、当該技術分野において知られる組換え DNA 技術を用いて各サブュニットを発現させることにより製造することができる。本発明のラミニン 5 Bの各サブユニットをコードする cDNAは、配列番号 1、 3 または 5に記載される塩基配列に基づいてプライマ一を設計し、適当な c DNA ライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。このような PCR手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、 " PCR P r o t oc o 1 s , A Gu i de t o Me t hod s and Ap p 1 i c a t i o n s " , Ac ademi c P r e s s, Mi cha e l, e t a 1. , e d s. ， 1990に記載されている。

ラミニン 5 Bの各鎖遺伝子をコ一ドする DN Aを、適当な発現ベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して、それぞれの鎖を発現させることにより所望の蛋白質を得ることができる。本発明の蛋白質を発現させるために用いることができる宿主細胞の例としては、限定されないが、大腸菌、枯草菌等の原核生物宿主、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。宿主として有用な哺乳動物細胞には、 He La 細胞、線維芽細胞由来の細胞、例えば VEROまたは CHO— Kl、またはリンパ球由来の細胞、およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞: には、 S Ρ 2Ζ0および J 558 L、ならびに神経芽細胞腫細胞株、例えば I M R 332が含まれる。さらに、植物細胞および昆虫細胞、例えばショウジヨウバェの細胞もまた宿主として利用可能である。

ベクタ一とは、細胞にトランスフエクトすることができ、細胞ゲノム中でまた' はそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の核酸分子を表す。発現べク夕一は、 DNAの発現を駆動するプロモー夕一領域を含み、さらに転写および翻訳の制御配列、例えば TATAボックス、キヤッピング配列、 CAAT配列、 3' 非コード領域、ェンハンサ一等を含んでいてもよい。プロモータ一の例としては、原核生物宿主中で用いる場合には、 b 1 aプロモーター、 c a tプロモーター、 1 a c Zプロモーター、真核生物宿主中で用いる場合には、マウスメタ口チォネイン I遺伝子配列のプロモーター、ヘルぺスウィルスの TKプロモーター、 SV 40初期プロモータ一、酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモータ一等が挙げられる。ベクターの例には、限定されないが、 pBR322、 pUC 118、 pUCl l 9、 λ g t 10, λ g t 11, pMAM-n e o、 pKRC、 BPV、ワクチニァ、 SV40、 2—ミクロン等が含まれる。

発現ベクターは、これを含有する宿主細胞を選択することができるように、 1 またはそれ以上のマーカーを有することが好ましい。マーカーとしては、栄養要求性宿主に対する栄養、抗生物質耐性（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、八ィグロマイシン等）、または重金属耐性（例えば銅）を与えるものを用いることができる。

さらに、シグナル配列を用いて本発明の蛋白質を分泌発現させるように、あるいは、本発明の蛋白質を別の蛋白質との融合蛋白質の形で発現させるように、ベクタ一を構築することができる。融合蛋白質を用いることにより、蛋白質の安定性を改良し、または精製を容易にすることができる。そのような発現べクタ一の構築は当該技術分野においてよく知られている。

ラミニン 5 Bの各鎖をコードする D N Aは、一つの発現べクタ一内に組み込んで発現させてもよく、または別個の発現ベクターに組み込んで、これらのベクタ一を同じ細胞にトランスフエクトして発現させてもよい。《3鎖、）3 3鎖および Τ 2鎖の各サブュニットはいずれも非常に大きなポリペプチドであるため、好ましくは後者の方法を用いる。

本発明のラミニン 5 Bを発現するよう構築したベクターは、トランスフォーメ —シヨン、トランスフエクシヨン、コンジユゲーシヨン、プロトプラスト融合、エレクト口ポレーシヨン、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクシヨン等により、適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクタ一を含む細胞を適当な培地中で成長させて本発明の蛋白質を産生させ、細胞または培地から所望の組換え蛋白質を回収し、精製することにより、本発明のラミニン 5 B蛋白質を得ることができる。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、 H P L C、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一等を用いて行うことができる。

本発明のラミニン 5 Bの各鎖は、対応する配列番号で示されるァミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような天然の蛋白質と相同の蛋白質も本願発明の範囲内である。

アミノ酸の保存的変更を行って、元の機能を保持している蛋白質またはポリべプチドを得ることができることは、当該技術分野においてよく知られている。そのような置換には、アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること、例えば、 1つの脂肪族残基 (I 1 e、 Va 1、 1 611または八1 a) を別のもので、または塩基性残基 L y sと A r g、酸性残基 G 1 uと A s p、アミド残基 G i nと As n、ヒドロキシル残基 S e rと Ty r、または芳香族残基 Ph eと Ty rとの間で置き換えることが含まれる。

また、配列番号 2、 4、 6または 8に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも 50%、 60%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%または 9 9%の同一性を有し、かつ細胞増殖促進活性、細胞接着促進活性、細胞運動促進活性、または神経突起伸展促進活性を有する蛋白質も本願発明の範囲内である。同一性は、同一である残基の数を、既知の配列または既知の配列のドメイン中の残基の総数で割り、 100を乗ずることにより計算する。標準的なパラメ一夕を用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム、例えば、 Gapped BLASTまたは PS I -BLAST (A 1 t s c hu 1 , e t a 1. (1997) Nuc l e i c Ac i d s Re s. 25 : 338 9-3402) , BLAST (A l t s chu l, e t a 1. (1990) J. Mo 1. B i o l. 215 : 403— 410) 、およびスミス一ゥォ一ターマン (Sm i t -Wa t e rma n) (Smi t h, e t a 1. (1981) J. Mo 1. B i o l. 147 : 195- 197) が利用可能である。好ましくは、これらのプログラムのデフォルト設定を用いるが、所望によりこれらの設定を変更してもよい。

また、本発明のラミニン 5 Bを構成する各鎖の一部が欠失している蛋白質も本願発明の範囲内である。例えば、本発明のラミニン 5 Bの 3 B鎖は、プロテア —ゼによって G 4および G 5が切断除去されるが、ラミニン 5 Bとしての活性を有する限り、切断型または非切断型を問わず本発明において用いることができる。さらに、ヒト以外の種の生物に由来する、ヒトラミニン 5 Bと同様の活性を有する蛋白質も本発明の範囲内である。このような蛋白質をコードする遺伝子は、配列番号 1、 3、 5または 7に示される配列を有するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをプローブまたはプライマーとして用いて、ハイブリダィゼーシヨンまたは PC R等の手法を用いて容易に単離することができる。このようにして得られる相同遺伝子は、配列番号 1、 3、 5または 7に記載の塩基配列に対して少なくとも 50%以上、好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、特に好ましくは 90%以上、最も好ましくは 9 5%以上の相同性を有する。あるいは、相同遺伝子は、ストリンジエンドなハイプリダイゼーシヨン条件下で配列番号 1、 3、 5または 7に記載の塩基配列を有する遺伝子とハイブリダィズすることができる。

ハイブリダィズという用語は、 DNAまたはこれに対応する RNAが、溶液中でまたは固体支持体上で、別の DNAまたは RNA分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは、ハイブリダィゼ一ション条件のストリンジェンシ一を変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性によって、種々のストリンジエンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、ストリンジエンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節することができる。そのようなストリンジエンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、 "Mo l e c u l a r C 1 o n i n g： A Labo r a t o ry Manu a l 第 2版.. Co l d Sp r i ng Ha rbo r Labo r a t o ry, S a mb r ook, F r i t s c h, &M an i a t i s, e d s. ， 1989) に記載されている。

ストリンジェントなハイブリダィゼ一ション条件とは、 50 %ホルムアミドの存在下で、 70 OmMの NaC 1中 42 、またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダイゼ一ション条件の一例は、 50 %ホルムアミド、 5XSSC、 50mMNaH₂PO₄、 pH6. 8、 0. 5%SDS、 0. 1 m gZmL超音波処理サケ精子 DNA、および 5 Xデンハルト溶液中で 42°〇でー夜のハイブリダィゼーシヨン； 2XSSC、 0. 1 %SDSで 45°Cでの洗浄；および 0. 2XSSC、 0. 1 %SDSで 45°Cでの洗浄である。

本発明のラミニン 5 B蛋白質は、細胞増殖促進活性、細胞接着促進活性、細胞運動促進活性、ならびに神経突起伸展促進活性を有する。ラミニン 5 Bの細胞増殖促進活性は、細胞を培養する培養液中に本発明のラミニン 5 Bを添加して、対照と比較した細胞増殖速度を測定することによりァッセィすることができる。細胞接着促進活性は、プレートに本発明のラミニン 5 Bをコーティングし、このプレートに適当な細胞を播種し、所定時間ィンキュベ一トした後に接着した細胞の数を測定することによりアツセィすることができる。細胞運動促進活性は、プレ —トに本発明のラミニン 5 Bをコ一ティングし、このプレート上に適当な細胞を播種し、所定時間経過後に細胞の分散の程度を測定することによりァッセィすることができる。また、細胞の運動の様子をビデオにて撮影し、画像解析により細胞運動の速度を求めてもよい。ラミニン 5 Bの神経突起伸展促進活性は、プレートに本発明のラミニン 5 Bをコーティングし、このプレート上に、ラット副腎髄質褐色腫由来の神経系細胞 P C 1 2等の神経細胞由来培養細胞株を播種し、所定時間経過後に画像解析などを用いて神経突起の長さを測定することにより、アツセィすることができる。，

本発明のラミニン 5 B蛋白質を、細胞増殖促進剤、細胞接着促進剤、細胞運動促進剤、または神経突起伸展促進剤として用いる場合には、ラミニン 5 Bを細胞の培養液中に添加するか、または培養プレートもしくは培養シ一ト上に塗布または固定ィ匕することにより使用することができる。あるいは、培養プレートもしくは培養シート上で増殖させたフィーダ一細胞上に塗布してもよい。殆どの動物細胞は生存条件として基質（足場）に接着することが必須であり、さらに増殖因子の刺激を受けて分裂する。下記の実施例 8の結果から分かる'ように、正常細胞は一般に増殖速度が低い。ラミニン 5 Bは細胞接着活性と、増殖因子としての増殖促進活性の両方をもつことから、増殖速度が低い多様な細胞の増殖促進剤として有効である。例えば、皮膚、肝臓、勝臓、軟骨、神経、血管などにおける正常細胞やがん細胞、各組織の幹細胞、胚性幹（E S ) 細胞などの培養に使用できる。一方、本発明のラミニン 5 Bを薬学的に許容される担体とともに外用製剤として処方して、皮膚、粘膜等の表面に塗布してもよい。本発明のラミニン 5 B蛋白質は、細胞増殖促進効果を有するため、軟膏、皮膚パッチ、移植用培養細胞シート、人工マトリクスなどの形態で、創傷治療用製剤として用いることができる。また、ラミニン 5 Bの高い細胞接着効果を利用して、生体組織に埋め込む種々の医療ィンプラントの塗布剤として用いることができる。さらに、ラミニン 5 Bの神経突起伸展促進作用を利用して、怪我などによる末梢神経障害の治療、脳梗塞、痴呆症などの中枢神経障害の治療剤として用いることができる。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2003— 159006号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。実施例

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例 1. 発現ベクターの構築

ラミニンひ 3 A鎖、 β 3鎖および r 2鎖の発現に用いたコンストラクトは Ka r i yaら (J Biochem 132 (2002), 607-612) にしたがって構築した。簡単には、 3 A鎖をコ一ドする c DNAをハイグロマイシン耐性哺乳動物発現べクタ — pcDNA3. lHyg r o (+) (I nv i t r ogen) 中に、 β 3鎖をコ一ドする c DN Αをゼォシン耐性哺乳動物発現べクタ一 p cDNA3. 1 Z e o (+) (I n V i t r o g e n) 中に、ァ 2鎖をコードする c DNAをネオマイシン耐性哺乳動物発現べクタ一 p cDN A 3 (I nv i t r ogen) 中に、それぞれクローニングした。

ラミニン α 3B鎖の cDNAクローンは、以下のようにして構築した。まず、ラミニン α 3B鎖の cDNAは、先に報告されている cDNA配列（Gen B ank受託番号 AF 005258) 、および 2つのゲノムクローン、 RP 11— 609K12および R P 11-666022 (それぞれ G enBan k受託番号 AC 067796および AC 090366) から推定される配列を参照した。ォ —バ一ラップする c DNAクローンを得るために、ヒト肺 5， -STRETCH PLUS cDNAライブラリ一（C 1 on t e c h， CA) を ECL直接核酸標識および検出システムを用いてスクリーニングし、合成オリゴヌクレオチドおよび ExTaqポリメラーゼ（Taka r a， Tokyo) を用いて PCR増幅を行った。 PCRに用いたプライマーを表 1に示す。表 1 プラスミドテンプレー卜プライマープライマーの配列配列番号

5'-(1) オリゴヌクレオチド a3b-Met+EcoRV TTGATATCATGGCGGCGGCCGCGCGGCCTCGGGGTCGG 9

a3b-5' (1)3' GCGGCCCCGGGATCCCGAGCGGT 1 0

5' -（II) 才リゴヌクレオチド a3b - 5' (11)5' GATCCCGGGGCCGCGGCCGGGCTCAG 1 1 a3b- 5' (ΙΙ)3' AGTAGAGCTCGGGCTGGGGCCTC 1 2

5'-(111) 才リゴヌクレオチド a3b-5' (111)5' CCGAGCTCTACTGCAAGTTGGTCGGG 1 3 a3b-5' (111)3' TCCATCGATGGCATTGGTGACAGG 1 4

VI-7 cDNA ライブラリー a3b VI -5' GCGGATCCAGGAAAGCACATCCTGTCACC 1 5 a3b VI-3' GCGAATTCCTGTGTTGTGCTGACAGTTAATGC 1 6

VI/V-10 cDNA ライブラリー a3b-VI/V 5' -2 TACTATGATCCAGATGTTGAGCG 1 7 a3b VI/V-3' AGTTGATGGTACCAGCTGGGTC Ί 8

V/IVb-3 cDNA ライプラリー a3b-V/IVb 5' AGGTTCCAGCAGTGCTTGTGACC 1 9 a3b-V/IVb 3' GAACAGACCCGGAGCTCTTCAC 20

IVb/lllb-8 cDNA ライブラリー a3b-IVb/IMb 5' GTTGATGTGAATGTGAAGAGCTCC 21 a3b-lVb/!llb 3' CCACAATTGGTGATAAACTCGAGTG 22 lllb/IVa-7 cDNA ライブラリー a3b-l 1 Ib/IVa 5' CTATGACTACCAAATACTTCAC 23 a3b-lllb/IVa 3' CACATCTGCCAGTCTAGACAGC 24

PCRにより得られた cDNAフラグメントをすベて p GEM T-E a s y ベクター（P r ome g a, Mad i s on, WI ) 中にクローニングし、配列決定してその配列を確認した。 cDNAの塩基配列は配列番号 1に、推定アミノ酸配列は配列番号 2に示される。互いにオーバーラップする異なる c DNAフラグメントをライゲーシヨンし、約 10， 000塩基対の cDNAを p CDNA3. 1/Hyg r o (+) 哺乳動物発現ベクター（I nv i t r o g e n) 中の^ c oRV部位に正しい配列で挿入することにより、ラミニン α 3 Β鎖完全長 cDN Aを発現する発現ベクター（LNo! 3Bp cDNA3. lHy g r o (+) ) とそこから G4— G5ドメインを除去した発現ベクター（LNo! 3 B# 3 p cDN A3. lHyg r o (+) ) を作製した。 α 3 B # 3鎖の DNA配列およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号 7および 8に示される。組換えラミニン 5 Bの発現のためには、 LNo! 3B#3 p cDNA3. lHyg r o (+) を使用した。実施例 2. 組換えラミニン 5 Bの発現

ヒト胎児腎臓由来細胞株（HE K— 293， ATCC CRL— 1573) は、 Ame r i c an Type Cu l t u r e Co l l e c t i on (ATC C) から購入した。ヒト膀胱癌細胞株 E J— 1は、 J CRB細胞パンクから入手した。バッファローラット肝臓由来上皮細胞株 BRLは D r. G. H. S a t o (Un i ve r s i ty o f Ca l i f o rn i a, S an D i e o) から入手した（PNAS 90 (1993), 11767-11771) 。自発的に不死化したヒトケラチノサイト細胞株である HaC a tは、 Dr. N. E. Fu s e i ng (D e u t s che s Kr eb s f o r s chung s z en t rum, He i de l be r g, Ge rmany) から贈与された。これらの細胞は、 10%ゥシ胎児血清（FCS) 、ペニシリンおよび硫酸ストレプトマイシンを補充した DMEM ZF 12培地（ I n V i t r o g e n) 中で維持した。

HEK293細胞を、 L i p o f e c t AMINE PLUS (登録商標） ( I n v i t r o g e n) を用いてラミニンァ 2鎖発現ベクター（n e o+) をトランスフエクトし、 500 gZm 1の G418 (S i gma) により選択した。コンディション培地を抗ァ 2mAbD4B 5を用いてウエスタンプロッティングすることにより、ラミニンァ 2鎖を安定かつ高度に発現するクローンをスクリーニングした。次にこのクローンにラミニン j83鎖発現べクタ一（Z e o+) をトランスフエクトした。 300 M g/m 1のゼォシン（ I n V i t r o g e n) を用いて安定なコロニーを選択し、カリニン B 1 (ラミニン 33鎖に対するモノクローナル抗体）を用いるウエスタンブロッテイングにより、各クローンのラミニン β 3分泌を分析した。このようにして得られた j83およびァ 2鎖の両方を安定かつ高度に発現するクローンに、上述の LNa 3B#3 p CDNA3. 1 Hyg r o (+) をトランスフエクトし、 100 gZm 1のハイグロマイシン (Wako, Os aka) により安定なクローンを選択した。以上のようにして、 CK 3B鎖、 jS 3鎖およびァ 2鎖を発現するトランスフエクタントを得た。また、同様にして α 3 A鎖、 β 3鎖およびァ 2鎖を発現するトランスフエクタントを得た。なお、 j83鎖おょぴァ 2鎖を強制発現させた HE Κ細胞は、内在性の 3 B 鎖の発現により、少量のラミニン 5 Bを分泌したが、このラミニン 5 Bの a 3 B 鎖 C末端部分の G 4— 5ドメインはプロテア一ゼによって完全に切断 ·除去されていた（図 1) 。ラミニン 5の α 3 A鎖においても G 4— 5が完全に切断されることが知られている。実施例 3. 組換えラミニン— 5 (LN5) およびラミニン— 5B (LN5B) の精製

実施例 2で得られた、ラミニン α 3Α、；63およびァ 2鎖の 3つの発現べクタ —でトランスフエクトした ΗΕΚ293クローンをコンフルェントまで成長させ、無血清 D MEM/ F 12培地中でインキュベートし、 2日ごとに無血清コンディシヨン培地 (CM) を回収した。回収した CMを 80%飽和硫酸アンモニゥムによる蛋白質沈澱により濃縮し、次に、セファロ一ス 4Bカラム（Ame r s ha m Pha rmac i a B i o t e c h, U p s a l a, Swe de n) のモレキュラーシーブクロマトグラフィ一で分離した。 L N 5を含む画分をプールし、ゼラチン一セファロ一ス 4 Bカラムを通してフイブロネクチンを除去した。ゼラチンカラムからの未結合画分中の LN 5を、抗ラミニン α 3モノクローナル抗体 (LS α 3 c 6) を用いて免疫ァフィ二ティークロマトグラフィーにより精製した。結合した蛋白質を 0· 05% (v/v) トリフルォロ酢酸でァフィニティ一力ラムから溶出させ、速やかに少量の 1M T r i s -HC 1 (pH8. 0) で中和した。このようにして精製した組換え LN 5蛋白質は、 0. 005% B r i j 35および 0. 1 % CHAP Sの存在下で保存した。

組換えラミニン 5 Bの精製のためには、実施例 2で得られたラミニン α 3 B# 3、 β 3およびァ 2鎖の 3つの発現べクタ一でトランスフエクトした ΗΕΚ29 3クローンをポリ一 L一リジンを予めコ一ティングした口一ラーポトルにて無血清培地中で培養し、 CMを回収した。これを硫酸アンモニゥムで濃縮し、次にセファロ一ス 4 Bカラム {Ame r s h am Pha rmac i a B i o t e'c h, Upp s a l a, Swe den) のモレキュラーシーブクロマトグラフィーで分離した。ラミニン 5 Bを含む画分をプールし、ゼラチン—セファロース 4 B カラムを通して、フイブロネクチンを除去した。ゼラチンカラムからの未結合画分中のラミニン 5 Bを、抗ラミニンひ 3モノクローナル抗体を用いる免疫ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一により精製した。結合した蛋白質を 0. 05% (V /v) トリフルォロ酢酸でァフィ二ティーカラムから溶出し、速やかに 1M T r i s—HC l (pH8. 0) で中和した。このようにして精製した組換えラミニン 5 B蛋白質は、 0. 005%B r i j 35および 0. 1%CHAPSの存在下で保存した。蛋白質濃度は、 B i o— R ad蛋白質アツセィキット（B i o- Rad， He r cu l e s, CA) を用い、ゥシ血清アルブミンを標準として用いて決定した。実施例 4. SDS— PAGEおよびィムノブロッテイング

精製したラミニン 5およびラミニン 5 Bを、 5%ゲルまたは 4— 7. 5%勾配ゲルで、還元条件または非還元条件で SDS— PAGEにより分析した。分離した蛋白質をクマシ一ブリリアントブル一（CBB) で染色した。結果を図 2に示す。 +MEは還元条件を、 —MEは非還元条件を示す。 3351?:0&の0!38鎖および 160 kD aのひ 3 A鎖は、プロテアーゼにより切断されて、いずれも 1 45 kD aのフラグメントを生ずる。

ィムノブロッティング分析のためには、 SDS— PAGEで分離した蛋白質をニトロセルロース膜に移し、各鎖に対する抗体を結合させ、 ECL検出試薬（A me r s ham Pha rmac i a B i o t e c h) を用いて検出した。ヒトラミニン α 3鎖（L sひ c 3) およびァ 2鎖（D4B 5) のァミノ末端領域に対するマウスモノクローナル抗体は既に報告されているものを用いた（J Biochem 132 (2002), 607-612; Horm Res 50 (1998)， 7-14) 。ヒトラミニン j8 3鎖に対するモノクローナル抗体（Ka l i n i n B 1) は Tr an s duc t i on Labo r a t o r i e s (Lex i ng t on, KY) 力、ら購入した。

ィムノブロッテイングの結果を図 3に示す。括弧内数値はおおよその分子サイズ（kDa) を示す。なお 3B (145) 鎖はひ 3B (335) 鎖の N末端部分が切断された分子である（図 1参照）。 L N 5 Bの活性は主に 3 B (33 5) 鎖（非切断型）を含む分子によるものであるが、本発明の LN5Bはひ 3B (145) 鎖（切断型）を部分的に含んでいてもよい。また、ァ 2 (105) 鎖はァ 2 (150) 鎖の N末端部分が切断された分子である（図 1参照）。本発明の LN5Bはァ 2 (150) 鎖のみ、あるいはァ 2 (105) 鎖のみを含んでいてもよい。

それぞれのサブュニットに対応する抗体により、予測された分子量の α 3 Bまたは α 3Α (いずれも G4， G 5ドメインを欠失したもの）、ならびに 33鎖およびァ 2鎖が発現されていることが確認された。 . 実施例 5. 細胞接着アツセィ

細胞接着アツセィは、以下のようにして行った。 96ゥエル EL I SAプレ一ト（Co s t a r, Camb r i dge, MA) の各ゥエルを示された濃度のラミニン 5またはラミニン 5 B蛋白質で被覆し、次にゥシ血清 7ルブミンでブロッキングした。ラット上皮性肝細胞である B R Lまたは不死化した表皮細胞である HaCa t (2X 10⁵個）を無血清 DMEMZF 12培地とともに各ゥエルに加え、 37 :で 1時間インキュベートした。非接着細胞を除去した後、接着した細胞を固定し、 Hoe ch s t 33432で染色した。 Cy t oF l uo r 23 50蛍光計（Mi l l i po r e, Bed f o r d, MA) を用いて、プレートの各ゥエルの蛍光強度を測定した。結果を図 4に示す（黒四角： LN5B ；白丸： LN5) 。いずれの細胞においても、 LN5BはLN5と比較して濃度基準で約 2倍、モル基準で約 3倍の細胞接着活性を示した。

次に、抗インテグリン抗体による細胞接着の阻害を調べた。阻害アツセィのためには、細胞をゥエルに播種する前に、細胞懸濁液を機能ブロッキング用の抗ィンテグリン抗体あるいは阻害試薬とともに室温で 20分間ィンキュベートした後、上述と同様に接着細胞数を測定した。ィンテグリンに対する機能プロッキング抗体としては、抗 2インテグリン抗体 (P 1 E 6) 、抗ひ 3インテグリン抗体 (P 1 B 5) 、抗《 5インテグリン抗体（P 1D6) および抗 jS 1インテグリン抗体（6S 6) (いずれも Ch em i c o n、 Teme c u 1 a， CAより）、および抗《 6インテグリン抗体（Go.H3) (Pha rM i nge n (S an D i e go, CA) より）を用いた。結果を図 5に示す。抗 α 3抗体および抗 ;3 1抗体による阻害に加えて、 LN 5 Βについては抗 a 2抗体、抗 α 5抗体、および抗 α 6钪体による若干の阻害が認められた。このことは、ラミニン α 3 Β鎖においては、 Gドメインの他にアミノ末端側のドメインにもインテグリンの認識部位があることを示唆する。また、 LN5A、 LN 5 Bのいずれにおいてもへパリンでは阻害されず、 EDT Aにより完全に阻害された。実施例 6. 細胞のスキヤッ夕リング活性のァッセィ

組換えラミニン 5または組換えラミニン 5 B蛋白質の細胞のスキヤッ夕リング活性は、以下のようにしてアツセィした。 BRL細胞（7X 10³) を 1%牛胎児血清（FCS) を含む DMEMZF 12に懸濁し、 24ゥエルプレートの各ゥエルに播種した。示された濃度の LN 5または LN 5 Bを培養物に直接加え、 3 7°Cで約 40時間インキュベートした後、分散した細胞を顕微鏡下で計数した。結果を図 6に示す。この結果から、 LN 5と LN 5 Bとはほぼ同等の細胞スキヤッ夕リング活性を有することがわかる。実施例 7. 細胞運動促進活性のアツセィ

24ゥエルプレートの各ゥエルを、 10 gZm 1のフイブロネクチン（F N) 、 10 gZm 1のラミニン 1 (LN1) 、 10 gZm 1のラミニン 2 Z 4 (LN2/4) 、 2 gZmlの LN5、 l /ig/mlの LN5B、または 2 gZmlの LN10Z11で、 4°Cで一晩コーティングした。 BRL細胞（7 X 10³) を 1 %FCSを含む DMEMZF 12に懸濁し、コーティングしたゥエルに播種し、細胞の運動の様子をビデオにて 8時間撮影し、画像解析により細胞運動速度を求めた。結果を図 7に示す。 L N 5 Bは非常に高い細胞運動促進活性を示すことがわかる。実施例 8. 細胞増殖のアツセィ

細胞を 60 mmディッシュ（ 1 x 10⁴個）または 35 mmディッシュ（ 5 x

10³個）に播種し、 10%FCSを含む DMEMZF 12中で 2日ごとに培地交換をしながら成長させた。示された日に、トリプシン処理細胞を回収し、位相差顕微鏡下で血球計を用いて細胞数を数えた。

図 8は、 LN5または LN5Bでトランスフエクトした HEK細胞の 6 Omm ディッシュ上での増殖曲線を示す。 LN5または LN5Bを発現する細胞は、対照である親 HEK細胞と比較して、細胞の増殖速度が非常に上昇していることがわかる。

図 9は、 35 mmディッシュを使用し、 10 %F C Sおよび 100 n gの LN 5または LN 5 Bを含む 2mlの DMEMZF 12中で HEK細胞を培養したときの増殖曲線を示す。図 10は、 1 %FCSおよび 500 n gの LN 1、 100 ngのLN5またはl 00118の1^ 5：6を含む21111の DMEMZF 12中で HEK細胞を培養したときの増殖曲線を示す。これらの結果から、 LN5Bが高い細胞増殖促進効果を有することがわかる。実施例 9. 腎臓近位尿細管上皮細胞に対する増殖促進活性のァッセィ

2mlの増殖培地に懸濁した 2x10⁴個のヒト正常腎臓近位尿細管上皮細胞 (renal proximal tubule epithelial cells, RPTEC) を 2. 5%FCS含有ブレキット RE GM培地（C 1 one t i c s社）を含む 35 mmディッシュに播種した。播種した翌日に LN1を 50 Ong (終濃度 0. 32 nM) , LN5を 250 ng (終濃度 0. 32 nM) , LN5Bを 370 ng (終濃度 0. 32η Μ) 培地中に添加した。添加 3日後に細胞をトリプシンにて剥がした後、血球計算盤にて細胞数を計測した。結果を図 11に示す。 LN 5 Βが最もよく細胞の増殖を促進した。実施例 10. 神経突起伸展促進活性のアツセィ

24ゥエルプレートを、 39 g/m 1のタイプ Iコラーゲン（COL) 、 5 gZm 1のフイブロネクチン（FN) 、 5 gZm 1のラミニン一 1 (LN 1) 、 2 gZm 1のラミニンー 5 (LN5) 、または 2 g/ml) のラミニンー 5B (LN5B) の接着基質で予めコートした。このプレートに、ラット神経系腫瘍細胞（副腎髄質褐色腫細胞） PC 12細胞（クローン HS) (1 X 1 0⁴個ゥエル）を、無血清 RPMI 1640培地中で神経成長因子（NGF) (10 Ong/ml) の存在下で播種した。 24時間後に画像解析により神経突起の長さを計測した。結果を図 12に示す。 LN 5 Bが最もよく神経突起伸展を促進した。産業上の利用性

本発明のラミニン 5 Bは、細胞増殖促進剤、細胞接着促進剤、細胞運動促進剤、または神経突起伸展促進剤として、生化学および分子生物学の研究および医薬品の開発に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有する 3 B鎖、配列番号 4で示されるアミノ酸配列を有する ;8 3鎖、および配列番号 6で示されるアミノ酸配列を有するァ 2鎖の各サブユニットから構成される蛋白質、または、これらの配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されているァミノ酸配列を有し、かつ細胞増殖促進活性、細胞接着促進活性、細胞運動促進活性、および神経突起伸展促進剤からなる群より選択される 1またはそれ以上の活性を有する蛋白質。

2 . 配列番号 8で示されるアミノ酸配列を有するひ 3 B # 3鎖、配列番号 4で示されるアミノ酸配列を有する 3鎖、および配列番号 6で示されるアミノ酸配列を有するァ 2鎖の各サブユニットから構成される蛋白質、または、これらの配列において、 1またはそれ以上のアミ酸残基が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有し、かつ細胞増殖促進活性、細胞接着促進活性、細胞運動促進活性、および神経突起伸展促進剤かちなる群より選択される 1またはそれ以上の活性を有する蛋白質。

3 . 請求項 1または 2に記載の蛋白質を含む細胞増殖促進剤。

4. 請求項 1または 2に記載の蛋白質を含む細胞接着促進剤。

5 . 請求項 1または 2に記載の蛋白質を含む細胞運動促進剤。

6 . 請求項 1または 2に記載の蛋白質を含む神経突起伸展促進剤。

7 . 請求項 1または 2に記載の蛋白質を用いることを特徴とする、細胞増殖を促進する方法。

8 . 請求項 1または 2に記載の蛋白質を用いることを特徴とする、細胞接着を促進する方法。

9 . 請求項 1または 2に記載の蛋白質を用いることを特徴とする、細胞運動を促進する方法。

1 0 . 請求項 1または 2に記載の蛋白質を用いることを特徴とする、神経突起伸展を促進する方法。