WO2019083256A2 - 변형된 egf 단백질, 이의 생산 방법 및 용도 - Google Patents

변형된 egf 단백질, 이의 생산 방법 및 용도

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WO2019083256A2
WO2019083256A2 PCT/KR2018/012569 KR2018012569W WO2019083256A2 WO 2019083256 A2 WO2019083256 A2 WO 2019083256A2 KR 2018012569 W KR2018012569 W KR 2018012569W WO 2019083256 A2 WO2019083256 A2 WO 2019083256A2
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protein
egf
skin
culture
modified egf
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양정윤
남은주
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주식회사 프로젠
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
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    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to a modified EGF protein, a method for producing the same, and a use thereof.
  • EGF epidermal growth factor
  • EGF Extracellular Growth Factor
  • the EGF is used variously in cosmetics for improving skin condition, treatment for diabetic foot ulcers, treatment for wound healing, etc.
  • the wound area is difficult to reach and persistence is relatively low. Therefore, it is necessary to develop a new substance having increased in vivo permeability and persistence of EGF protein.
  • the present inventors have found a modified EGF protein having an excellent cell permeability, in vivo durability and stability as compared to a conventional EGF protein, and completed the present invention.
  • the present invention provides a modified EGF protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding said modified EGF protein.
  • the present invention also provides a host cell transfected with said expression vector.
  • the present invention provides a method for producing a modified EGF protein, comprising: 1) culturing a host cell producing a modified EGF protein at a temperature of 35 0 C to 38 ° C; And 2) provides, the modified EGF protein production method comprises the step of lowering the culture, the culture temperature to a temperature of 32 ° C to 34 0 C.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for improving skin condition comprising the modified EGF protein of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases, which comprises the modified EGF protein of the present invention as an active ingredient.
  • the modified EGF protein according to the present invention binds to the cell membrane and efficiently transports EGF into the cell, thereby increasing the cell permeability and half-life.
  • the modified EGF protein can be effectively applied to cosmetic compositions and pharmaceutical compositions having short storage periods due to protein denaturation, which are difficult to store and distribute, because EGF is maintained in an intact form even under harsh conditions to improve long-term stability.
  • the modified EGF protein production method according to the present invention can be produced as a modified EGF protein having an active form, and can be commercially used because of its excellent productivity through establishment of optimal culture temperature and pH conditions.
  • the present invention in one embodiment, produced a modified EGF protein exhibiting a productivity of at least 2.3 g / L and a yield of at least 7, thereby demonstrating the superiority of the modified EGF protein production method according to the present invention. Therefore, the modified EGF protein of the present invention is superior to conventional EGF protein in cell permeability, in vivo persistence and stability, and can be utilized as a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
  • Figure 1 is a schematic representation of the construction of a gene construct capable of expressing an EGF-skin protein.
  • FIG. 2 shows the results of SDS-PAGE of EGF-skin proteins expressed in six candidate RCB candidate cell lines.
  • FIG. 3 is a graph showing the productivity and the doubling time of the EGF-skin protein measured during the passage of the 35th passage in order to confirm the long-term passive stability of the final cell line.
  • 4A to 4C are graphs showing the activity of EGF-skin protein over time under severe conditions.
  • 4A shows the activity of EGF-der i protein at the initial stage
  • FIG. 4B shows the activity after 2 months
  • FIG. 4C shows the activity of EGF-der i protein after 3 months.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in EGF-skin protein activity over time according to the number of times of frozen and thawed (F / T) repetition. At this time, the F / T process was repeated 5 times in total.
  • FIG. 6 shows the results of treatment of FITC-labeled PBS, EGF, EGF-skin, and EGF l iposome proteins in the skin of Balb / c mice and SKH-1 hairless mice, respectively, after 6 hours and 12 hours after the confocal fluorescence microscopy The permeability of each protein in the skin layer is analyzed and shown.
  • FIG. 7 shows blood levels of EGF after treatment with FITC-labeled PBS, EGF, EGF-skin, and EGF liposome proteins in the skin of Balb / c mice and SKH-1 hairless mice, respectively.
  • EGF s. C.
  • FIGS. 8A to 8C show the results of selecting optimum supplementary condition for culturing process development.
  • FIG. 8A to 8C show the results of selecting optimum supplementary condition for culturing process development.
  • Figures 9a-9c show the productivity survival rate and the density of living cells according to the final established culture conditions.
  • FIGS 10a and 10b show the purification yield and purity established according to the established purification process.
  • Figure 11 shows the in vitro activity of EGF-skin protein versus standard EGF.
  • the present invention provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Gt; EGF < / RTI >
  • EGF is a protein having a molecular weight of 6 kDa and consisting of 53 amino acids (SEQ ID NO: 1).
  • the EGF promotes the division and proliferation of epidermal cells, thereby restoring skin damage, accelerating the healing of corneal ulcers, regenerating skin, and the like, and is involved in the formation of new blood vessels, proliferation of fibroblasts, secretion of collagen synthesis enzyme Function.
  • the term " modified EGF protein" may refer to an EGF-derivative (hereinafter referred to as EGF-skin).
  • the EGF-skin may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, which may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the EGF-skin comprising the signal sequence may comprise a signal sequence and the EGF-skin comprising the signal sequence may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: .
  • the EGF-skin has increased in vivo transmission and persistence as compared with the standard EGF, and protein activity can be maintained over a long period under severe conditions. As a result, It can be very effectively applied to cosmetic compositions which are difficult to store and distribute.
  • the present invention provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding the modified EGF protein, wherein the host cell transfected with the expression vector is provided.
  • the expression vector may be pAD15 EGF derivative ive.
  • the host cell may be a Chinese hamster ovary cell (CHO cell).
  • an expression vector pAD15 EGF derivative ive expressing EGF-skin protein was prepared using an expression vector system (ProGen, Korea). Then, the vector was transfected into CHO (Chinese hamster ovary) -DG44 DHFR (-) cells, followed by screening twice to select EGF-skin protein-expressing cell lines.
  • the invention in yet another aspect, the following steps: 1) that the host cell to produce the modified EGF protein incubated at a temperature of 35 ° C to 38 0 C; And 2) lowering the culture temperature to a temperature of 32 0 C to 34 ° C to cultivate the modified EGF protein.
  • the host cell may be a Chinese hamster ovary cell
  • the EGF protein may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the culture of step 1) and / or step 2) may be a fed-batch culture.
  • the term " oil-rich culture " is a culture method in which the nutrient medium is gradually added to the culture vessel while the culture is proceeding and the culture medium is not extracted from the culture vessel until the end of the culture.
  • the concentration of the component in the culture can be controlled to an arbitrary set value.
  • the term " medium" means a nutrient solution for maintenance, growth, proliferation or expansion of cells in an artificial in vitro environment that is external to the multicellular organism or tissue.
  • the medium may be optimized for specific cell cultures, for example, a basic culture medium prepared for supporting cell growth, a production medium prepared to promote monoclonal antibody production, and a concentrated medium made by concentrating nutrients at a high concentration have.
  • the basic culture medium means a medium capable of supporting the growth of cells to a minimum.
  • the basic culture medium provides trace elements, vitamins, energy sources, complete systems and amino acids as well as standard inorganic salts such as zinc, iron, magnes, fowl and potassium.
  • the basic culture medium according to the present invention can be used at the initial stage of the growth of cells. In one embodiment of the present invention, Hycel's CHO medium was used as the primary culture medium.
  • the modified EGF protein production method according to the present invention comprises culturing the host cell producing the modified EGF protein of the present invention at 35 ° C to 38 ° C. Specifically, the culture may be performed at a temperature of 37 ° C and may be performed at a pH of 6.8 to 7.3.
  • Culturing said host cell in a 35 0 C to 38 ° C is a step of growing the cells, the timing of cell growth progresses rapidly.
  • the culture conditions for cell growth may vary depending on the type of the cell, the kind of target protein to be produced, and the like.
  • CHO cells used in the present invention it is known that cell numbers are most actively increased at a temperature of 37 and a pH range of 6.8 to 7.3.
  • the cell growing period may be 3 days to 8 days, more specifically 4 days to 7 days from the initial stage of culturing. According to one embodiment of the present invention, the cell growth period may be 7 days from the initial stage of culture. In addition, the culture of the cell growing machine The temperature may be 37 0 C, according to one embodiment of the present invention.
  • the modified EGF protein production process comprises the steps of culturing by lowering the culture temperature to 32 ° C to 34 0 C.
  • the incubation temperature may be lowered when the number of cultured cells in step 1) is 6 x 10 s to 9 x 10 6 cells / s .
  • the culture can be performed at a temperature of 33 0 C and can be performed at a pH of 6.8 to 7.1.
  • the cells enter the protein producer under the culture conditions for maximizing the production of the target protein.
  • the culture conditions can be varied when the cultured viable cell density is about 80/4 to 90% of the maximum viable cell density.
  • the culture conditions can be changed when the viable cell density is about 90%.
  • the incubation temperature of the cells for entry into the protein producer in the cell growing machine may be 33 ° C. If more than the cultivation temperature 35 ° C, there is a case where the modified EGF protein production may become unstable, not more than 31 0 C, does not grow as a single cell is cheungbun production rate falls problems.
  • the culture temperature change according to the present invention can be carried out from 6 days to 8 days of culture, and according to one embodiment of the present invention, it can be carried out on the 7th day of culture.
  • 32 0 C to about 34 ° period by lowering the culture in C is 35 ° C to 38 7 days to 12 days after the culture is completed at 0 C, specifically 8 Lt; / RTI > to 10 days.
  • viable cell density refers to the amount or number of living cells in a given space.
  • the cell survival density is measured in order to change the culture conditions when an appropriate number of cells are viable.
  • the cell survival density can be determined by measuring the absorbance of the cells.
  • the present invention can supply a supplement to the basic culture medium for protein production.
  • supplement &quot is a substance additionally included in the basic culture medium for the supply of abundant nutrients to maintain the health and produce the protein when the cell enters the protein producer, Lipids, amino acids, vitamins, growth factors, etc.
  • the types of rib agents that can be used for the production of proteins include conventional (E.g., Act iCHC GE Healthcare), Cel l Boost (GE Healthcare), ASF Feed 2 (Aj inomoto), and the like.
  • the supplements may be CB (cel 1 boost) 5 and ASF Feed 2.
  • Said ribosomes may be added in appropriate amounts for the production of high levels of recombinant protein and may be used individually or in combination.
  • the ribosome may be added immediately before the cell enters the protein producer through the growth period.
  • the ribosome may be added 1 to 3 days before the temperature is lowered to produce the protein.
  • it may be added for 3 days before the temperature is lowered for protein production. Since the ribosome is consumed in the cell's survival and protein production process, additional injections must be made continuously. Generally, it can be added periodically with intervals of 1 to 3 days from the addition of the layering agent. In one embodiment of the present invention, the layering agent was introduced at intervals of two days.
  • the concentration of CB5 may be 3.0% to 5%. In one embodiment, the concentration of CB5 may be 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, or 5.0%, but is not limited thereto and preferably the concentration of CB5 may be 3.0%. Further, when ASF Feed 2 is used as the above-mentioned supplement, the concentration of ASF Feed 2 may be 0.53 ⁇ 4> 2%. In one embodiment, the concentration of the ASF Feed 2 may be 0.5%, 1%, 1.5%, or 2%, but is not limited thereto. Preferably, the concentration of the ASF Feed 2 may be 2.0%. In addition, in the step of culturing the host cells, CB5 or ASF Feed2 may be used alone or in combination.
  • CB5 or ASF Feed2 was added as a filler to 0.5% of CB5 4.5% + ASF Feed2, 3.5% of CB5 + 1.5% of ASF Feed2, , 5.0% of CB5, 4.0% of CB5 + 1.0% of ASF Feed2 or 3.0% of CB5 + 2.0% of ASF Feed2.
  • CB5 or Feed2 was added as a sowing agent, it showed excellent survival cell density, cell viability and modified EGF protein productivity.
  • the culture for producing the modified EGF protein according to the present invention may last 10 to 20 days, specifically 12 to 18 days, and may last for 15 days according to one embodiment of the present invention.
  • the modified EGF protein production method according to the present invention may further include the step of purifying the modified EGF protein obtained from the culture.
  • Affinity chromatography can be performed to purify and obtain high EGF-modified EGF proteins.
  • affinity chromatography-modified EGF proteins can be obtained using a Protein-A protein-coupled column that is layered with a resin, that is, as a ligand of a resin.
  • culture solution &quot refers to a culture medium containing various factors including the proteins produced and secreted from cells after culturing the cells. After completion of the cultivation, cells are removed by centrifugation .
  • affinity chromatography is a method for separating a target substance using one of two kinds of substances having high biologically specific affinity as a fixed phase, using the difference in affinity for the fixed phase, It is one of the graphical methods. Therefore, in the step of obtaining the modified EGF protein from the culture solution, the culture can be purified into a column layered with a resin bound with Protein A protein.
  • the resin used in the affinity chromatography is composed of a matrix, a hydrophilic cross-linking agent and a ligand.
  • the matrix may be a cross-linked agarose, for example a highly cross-linked high-f low agarose.
  • the ligand may be a Protein-A protein that is a protein that specifically binds to the modified EGF protein of the present invention.
  • the resin can selectively bind to the modified EGF protein because the modified EGF protein is covalently linked to the agarose fragment.
  • the ligand in the resin has a long crosslinking agent having hydrophilicity, the target protein to be separated can easily bind.
  • the resin may be, for example, MabSelect.
  • the term " Protein-A protein" can be specifically bound to recognize a specific subunit of a modified EGF protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 as an epitope.
  • the EGF protein modified with a glycine solution can be eluted from a column packed with the protein-protein-bound resin.
  • the solution may be added at an appropriate concentration to prevent binding with the Protein-A protein within a range that does not alter the quality and activity of the target protein and pH can be used.
  • An appropriate concentration range of the solution may be from 50 mM to 150 mM, and according to one embodiment of the present invention, the concentration of the solution may be 0.1 M.
  • an appropriate pH range may be 3.4 to 4.4, and according to one embodiment of the present invention, the pH of the solution may be 3.8.
  • the modified EGF protein production method according to the present invention is not only economical in production process, but also has excellent activity of the produced modified EGF protein, so that the modified EGF protein produced by the above- .
  • the present invention provides a cosmetic composition for improving skin condition comprising modified EGF protein produced according to the modified EGF protein production method of the present invention as an active ingredient.
  • the skin condition improvement may be selected from the group consisting of suppression of wrinkle formation, skin aging suppression, skin elasticity improvement, skin regeneration, wound or wound healing, Means to protect the skin from the degradation or loss of cells or to improve the skin condition.
  • the present invention provides a method for improving the skin condition using the cosmetic composition.
  • the method for improving the skin condition may include applying the cosmetic composition according to the present invention to the skin of a subject in need thereof.
  • the subject may be a mammal, and in particular a human.
  • the step of applying to the skin may comprise directly applying or spraying the cosmetic composition according to the present invention to the skin according to its form.
  • the application amount of the cosmetic composition and the number of daily use times can be appropriately set according to the user's age, sex, use, degree of symptom, etc.
  • an appropriate amount of the cosmetic composition may be administered at a frequency of 1 to 6 times a day It can be applied to the skin.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases which comprises modified EGF protein produced according to the modified EGF protein production method of the present invention as an active ingredient.
  • the skin disease may be selected from the group consisting of foot ulcers, compression ulcers, oral mucositis, burns, and combinations thereof.
  • the pharmaceutical composition may additionally comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is present in an amount ranging from about 1% to about 99.99%, from 5% to 90%, from 10% to 85%, from 20% to 60% by weight, 90% by weight to about 99.99% by weight.
  • the present invention provides a method for preventing or treating skin diseases using the above pharmaceutical composition.
  • the method for preventing or treating skin diseases may include applying the pharmaceutical composition according to the present invention to the skin of a subject in need thereof.
  • the subject to which the pharmaceutical composition may be applied may be a mammal, and in particular a human.
  • the step of applying to the skin may comprise directly applying or spraying the pharmaceutical composition according to the present invention to the skin according to its form.
  • the application amount of the pharmaceutical composition and the number of daily use times can be appropriately set according to the user's age, sex, use, degree of symptom, etc.
  • the appropriate amount of the pharmaceutical composition may be administered once to six times a day It can be applied to the skin.
  • Example 1 Production of transformed EGF protein vector and cell line development
  • Expression vector pAD15 EGF-der ivat ive expressing EGF-der i protein was prepared using an expression vector system (Progen, Korea). The structure of the gene construct inserted into the expression vector is shown in FIG. The vector was transferred to CHO Chinese hamster ovary) -DG44 DHFR (-) cells, followed by two rounds of high expression monoclonal cell lines.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • HT hyperxanthine & thymidine
  • dTMP is a precursor of dTMP, which cells can use to synthesize dTMP.
  • the molecular weight of the EGF-skin protein was confirmed to be about 62 kDa.
  • EGF-skin proteins accounted for more than 80% of the 6 cell line cultures selected. Most of the EGF-skin proteins were in monomeric form (62 kDa) with active oligo, dimer form (124 kDa) in 5% or less, and no cleaved form was observed.
  • Experimental Example 1 Confirmation of long-term stability of RCB candidate cell line
  • the productivity and doubling time must be kept constant within the set period during which the production is completed.
  • the RCB cell line selected in Example 1 is manufactured by WCB (working cell bank) in MCBOnaster cel bank, it is necessary to culture at least 10 passages.
  • culture of 5 or more lines is required for culturing the seed culture for 200 L or more of the main culture, and cultivation of 20 or more lines is required for the present culture. Therefore, it is necessary to maintain the productivity and doubling time of the passage 35 or more to be used for the manufacture of medicines.
  • EGF-skin protein productivity and doubling time of the selected RCB candidate cell lines were measured.
  • the cell solution under low culture was centrifuged and suspended at a concentration of 5x10 5 cel / ml in a new culture medium. Then, 5 ml was cultured in a T-25 flask for 3 days. Then, 1 ml was taken and the cell number was measured with a 0.5 ml culture. 0.5 ml was centrifuged and the productivity per lxlO 6 cell was measured by human IgG ELISA for the supernatant. The doubling time (Td) was measured as follows. The cells were inoculated in a 125 ml flask at 0.3 ⁇ 10 6 cel / ml for 3 days and counted.
  • tl and t2 are the incubation start and end times, and xl and ⁇ 2 are the survival cells before and after culturing Number.
  • the cell lines exhibiting the best long-term passive stability among the selected RCB candidate cell lines were selected as the final cell lines for drug development, and the productivity and the doubling time measured during the passage of the 35th passage of the F cell line selected as the final cell line are shown in Table 3 3.
  • EGF-skin protein of 126 / g / was stored for 3 months under severe conditions of temperature of 40 ° C and relative humidity of 75 ⁇ 5% Activity was observed.
  • the content of EGF-skin protein over time is shown in Table 4, and the activity of EGF-skin protein over time is shown in Table 5 and FIGS. 4A to 4C.
  • mice and SKH-1 hairless mice deprived as experimental animals were prepared.
  • Balb / c mice which has hair removed from the back skin using hair removal cream and genetically hairless hairless hairless mouse, Thus confirming the difference in the skin permeability of EGF-skin protein.
  • the two types of mice were classified into the PBS group EGF group, EGF-skin group, and EGF l iposome (H & At this time, each protein was labeled with fluorescence labeling reagent FITC (fluorescein isothiocyanate) so that the degree of penetration of individual proteins could be confirmed.
  • FITC fluorescence labeling reagent
  • mice When the FITC-labeled protein solution was applied to the dorsal skin of the mice of each of the above-mentioned groups 6 hours and 12 hours later, mice were sacrificed and the skin tissue was removed. The skin tissue was stored in a vertical section using a low temperature holding device, and permeability of the skin layer was analyzed through a confocal fluorescence microscope. The results are shown in Fig. '
  • a clone of 0.5x10 s cel / s was cultured (growth period) for 6 days at 37 ° C in Hycel l CHO medium (Hyclone, USA), and the temperature was changed to 33 and then cultured for 15 days.
  • the pH of the culture was changed from pH 6.9 to pH 7.3 for the growth period and from pH 6.9 to pH 7.1 for the product ion period.
  • Agitation speed was started at 150 rpm, increased to 200 rpm on day 4 of culture, and increased to 250 rpm on day 6 of culture.
  • Glucose was maintained at 3.0 g / L or more daily.
  • Cel l Boost 5 CB5, GE Healthcare, USA
  • ASF Feed2 Aj inomoto
  • cell viability (cel 1 viability) was found to be 15 days under conditions of 3.0% of CB5 + 2.0% of ASF Feed2 and 3.5% of CB5 + 1.5% of ASF Feed2 The best results were obtained over 90% during the culture.
  • FIG. 8B cell viability (cel 1 viability) was found to be 15 days under conditions of 3.0% of CB5 + 2.0% of ASF Feed2 and 3.5% of CB5 + 1.5% of ASF Feed2 The best results were obtained over 90% during the culture.
  • the modified EGF protein productivity at the 15th day after the completion of culture was 1.0 g / L for CB5 5.0%, 1.294 g / L for CB5 4.5% + ASF Feed2 0.5% , 1.44 g / L for CB5 4.0% + ASF Feed2 1.0%, 1.70 g / L for CB5 3.5% + ASF Feed2 1.5% and 1.74 g / L for CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0% Respectively.
  • Hycel l CH0 was added to the basal medium a) and inoculated at a concentration of 0.5 x 10 6 cel ls / mL.
  • the incubation temperature was maintained at 37 ° C until the 7th day of growth and 33 ° C until the 15th day.
  • Culture pH was conducted during the culture in the culture (growth phase), the pH is 6.9 to pH from pH 6.9 to pH 7.3 condition and 33 hour incubation at 0 C (saengsangi) 7.1 conditions at 37 ° C.
  • the culture stirring speed was started at 150 rpm, increased to 200 rpm on the fourth day of culture, and increased to 250 rpm on the sixth day of culture.
  • Glucose concentration was maintained above 3.0 g / L throughout the incubation period.
  • the results are shown in Figs. 9A to 9C.
  • the optimal purification method of EGF-skin is as follows. First, a column with Protein-A protein as a stationary phase was prepared with the Mabselect system, and the prepared cell supernatant was loaded on the column so as to have an amount of 14 g protein. Subsequently, debris was removed sequentially using wash buffer 1 at pH 7.0 consisting of 50 mM sodium phosphate and 500 mM NaCl, and wash buffer 2 at pH 4.5 composed of 50 mM sodium acetate. Then, using a elution buffer of pH 3.8 composed of 100 mM Glycine, The modified EGF protein was eluted while being injected. The experimental results are shown in Table 10, 10A and 10B.
  • NRK-49F cell line (ATCC CRL-1570, rat kidney) was cultured in a culture medium (5% Newborn calf serum (Gibco, Cat # 2610-074) + DMEM (ATCC, Cat # 30-2002 TM) + 1% Antibiotic Gibco, Cat # 15240-062).
  • the cells were then incubated for 72 hours at 37 +/- 0.5 [deg.] C and 5 soil 0.5% CO 2 incubator. After completion of the incubation, 100 mL of Cell titer-Glo 2.0 assay reagent was dispensed per well, followed by shaking for 10 minutes at room temperature.
  • the EC 50 value was then calculated based on the measurement under the conditions of Luminescence integration: 500 and Emission: Lm 1. The results are shown in Fig. As shown in FIG. 11, the biological activity of the modified EGF-protein of the present invention, EGF-skin, was similar to the biological activity of standard EGF purchased from NIBSC.

Abstract

본 발명은 변형된 EGF 단백질, 이의 생산 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질은 세포막과 결합하여 EGF를 효율적으로 세포 내로 전달함으로써 세포 투과율 및 반감기를 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 변형된 EGF 단백질은 가혹한 조건 속에서도 EGF가 온전한 형태로 유지되어 장기적인 안정성이 향상됨으로써 단백질 변성으로 인해 보존 기간이 짧고, 보관 및 유통이 까다로운 화장료 조성물 및 약학 조성물에 매우 효과적으로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산 방법은, 활성을 갖고 있는 형태의 변형된 EGF 단백질로 생산 가능하며, 최적의 배양 온도 및 PH 조건 확립을 통해 생산성이 우수하여 상업적으로 활용 가능하다. 본 발명은 일 실시예에서, 2.3g/L 이상의 생산성 및 75% 이상의 정제 수율을 나타내는 변형된 EGF 단백질을 생산하였으며, 이를 통해 본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산 방법의 우수성을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 변형된 EGF 단백질은 기존의 EGF 단백질 대비 세포 투과성, 생체 내 지속성 및 안정성이 우수한 바, 화장료 조성물 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
변형된 EGF 단백질， 이의 생산 방법 및 용도 【기술분야】
본 발명은 변형된 EGF 단백.질, 이의 생산 방법 및 용도에 관한 것이다. 【배경기술】
화장품 산업이 지속적으로 발전함에 따라, 화장품 산업 전반에 걸쳐 소재에 신기술을 접목한 고 기능성 화장품의 개발이 이루어지고 있다. 또한, 미백， 주름개선， 및 피부재생과 같은 효과를 요구하는 소비자들이 늘어남에 따라, 화장품 산업에서 기능성 화장품의 가치가 더욱 높아지고 있으며， 다양한 소재를 화장품에 융합시키기 위한 연구들이 활발히 진행되고 있다. 최근에는 표피 성장 인자 (epidermal growth factor , EGF)가 뛰어난 피부재생능력 등으로 많은 주목을 받고 있다.
EGF(epidermal growth factor )는 6 kDa의 작은 단백질로서， 세포핵에 작용하여 표피세포의 분열과 증식 속도를 촉진시켜 피부 재생 과정에 관여한다. 또한， 이는 콜라겐 합성 효소의 분비를 조절하며， 각막 궤양 및 손상의 회복에 효과가크다 (Young Seok Kim, 2006) . 상기 EGF는 피부 상태 개선용 화장품, 당뇨병성 족부궤양 치료제， 상처 치료제 등에 다양하게 사용되고 있으나， 상처 부위 전달성, 지속성 등이 상대적으로 낮은 문제점이 있다. 따라서, EGF 단백질의 생체 내 투과성 및 지속성이 증가된 새로운 물질 개발이 필요한 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 기존 EGF 단백질 대비 세포 투과성， 생체 내 지속성 및 안정성이 우수한 형태의 변형된 EGF 단백질을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 변형된 EGF 단백질, 이의 생산 방법 및 용도를 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 변형된 EGF 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변형된 EGF 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 백터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
또한， 본 발명은 1) 변형된 EGF 단백질을 생산하는 숙주세포를 350C 내지 38°C의 온도 조건에서 배양하는 단계; 및 2) 배양 온도를 32°C 내지 340C의 온도로 낮추어 배양하는 단계를 포함하는, 변형된 EGF 단백질 생산 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 본 발명의 변형된 EGF 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명의 변형된 EGF 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
【발명의 효과】
본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질은 세포막과 결합하여 EGF를 효율적으로 세포 내로 전달함으로써 세포 투과율 및 반감기를 증가시킬 수 있다. 또한， 상기 변형된 EGF 단백질은 가혹한 조건 속에서도 EGF가 온전한 형태로 유지되어 장기적인 안정성이 향상됨으로써， 단백질 변성으로 인해 보존 기간이 짧고， 보관 및 유통이 까다로운 화장료 조성물 및 약학 조성물에 매우 효과적으로 적용될 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산 방법은, 활성을 갖고 있는 형태의 변형된 EGF 단백질로 생산 가능하며， 최적의 배양 온도 및 pH 조건 확립을 통해 생산성이 우수하여 상업적으로 활용 가능하다. 본 발명은 일 실시예에서， 2.3g/L 이상의 생산성 및 7 이상의 정제 수율을 나타내는 변형된 EGF 단백질을 생산하였으며, 이를 통해 본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산 방법의 우수성을 입증하였다. 따라서， 본 발명의 변형된 EGF 단백질은 기존의 EGF 단백질 대비 세포 투과성, 생체 내 지속성 및 안정성이 우수한 바， 화장료 조성물 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 EGF-deri 단백질을 발현시킬 수 있는 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한 것이다.
도 2는 선별된 6종의 RCB research cel l bank) 후보 세포주에서 발현된 EGF-deri 단백질에 대하여 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 최종 세포주의 장기 계대 안정성을 확인하기 위하여， 35 계대 배양이 진행되는 동안에 측정된 EGF-deri 단백질의 생산성 및 배가시간을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 가혹 조건에서 시간 경과에 따른 EGF-deri 단백질의 활성을 나타낸 그래프이다. 이때， 도 4a는 초기， 도 4b는 2개월 경과 후， 도 4c는 3개월 경과 후의 EGF-der i 단백질의 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 시간에 따른 EGF-deri 단백질 활성의 변화를 냉동 및 해동 (F/T) 반복 횟수에 따라그래프로 나타낸 것이다. 이때， F/T 과정을 총 5회 반복하였다.
도 6은 Balb/c 마우스와 SKH-1 무모 마우스 피부에 FITC가 라벨된 PBS, EGF, EGF-deri , 및 EGF l iposome 단백질을 각각 처리하여 6시간 및 12시간 경과 후， 공초점 형광 현미경을 통해 각 단백질의 피부 층별 투과성을 분석하여 나타낸 것이다.
도 7은 Balb/c 마우스와 SKH-1 무모 마우스 피부에 FITC가 라벨된 PBS, EGF, EGF-deri , 및 EGF l iposome 단백질을 각각 처리한후, 시간에 따른 혈중 EGF농도를 측정하여 나타낸 것이다. 이때， EGF(s .c . )는 EGF를 피하주사한 그룹을 의미한다. 도 8a 내지 도 8c는 배양공정 개발에서 최적의 보충제 조합 조건을 선정한 결과이다.
도 9a 내지 도 9c는 최종 확립된 배양 조건에 따른 생산성 생존율 및 살아있는 세포의 밀도를 나타낸 것이다.
도 10a 및 도 10b는 구축된 정제공정에 따라 확립된 정제 수율 및 순도를 나타낸 것이다.
도 11은 표준 EGF 대비 EGF-deri 단백질의 in vitro 활성을 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명은 일 측면으로, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 변형된 EGF 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 , "EGF"는 6 kDa의 분자량을 가지며 53개의 아미노산으로 구성되는 단백질이다 (서열번호 1) . 상기 EGF는 표피세포의 분열과 증식속도를 촉진시켜 피부 손상의 회복, 각막궤양의 치유 촉진， 피부의 재생 등의 작용을 하며, 신생혈관의 형성， 섬유아세포의 증식, 콜라겐 합성 효소의 분비 등의 기능을 한다.
본 명세서에서 사용된 용어， "변형된 EGF 단백질"은 EGF-derivat ive (이하， EGF-deri )일 .수 있다. 본 발명에서， 상기 EGF-deri는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있고， 이는 서열번호 5의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 일 실시예에서， 상기 EGF-deri에 신호서열을 포함할 수 있고， 상기 신호서열을 포함한 EGF-deri는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있고， 이는 서열번호 3의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는， EGF-deri는 표준 EGF 대비 생체 내 전달성 및 지속성이 증가하였을 뿐 아니라， 가혹 조건에서도 장기적으로 단백질 활성이 유지될 수 있는 바， 단백질 변성으로 인해 보존 기간이 짧고， 보관 및 유통이 까다로운 화장료 조성물에 매우 효과적으로 적용될 수 있다. 본 발명은 다른 측면으로， 상기 변형된 EGF 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터를 제공하며， 상기 발현 백터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 이때， 상기 발현 백터는 pAD15 EGF derivat ive일 수 있다. 또한, 상기 숙주세포는 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cel l , CHO cel l )일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는， 발현 백터 시스템 (ProGen, 한국)을 이용하여 EGF-deri 단백질을 발현하는 발현 백터 pAD15 EGF derivat ive를 제조하였다. 이후， 상기 백터를 CH0(Chinese hamster ovary) -DG44 DHFR (-) 세포에 형질감염 시킨 후 2회의 스크리닝 과정을 거쳐 EGF-deri 단백질 고발현 세포주를 선별하였다. 본 발명은 또 다른 측면으로， 1) 변형된 EGF 단백질을 생산하는 숙주세포를 35°C 내지 380C의 온도 조건에서 배양하는 단계; 및 2) 배양 온도를 320C 내지 34°C의 온도로 낮추어 배양하는 단계를 포함하는， 변형된 EGF 단백질 생산 방법을 제공한다. 이때， 상기 숙주세포는 중국 햄스터 난소 세포일 수 있고， 상기 변형된 EGF 단백질은 서열번호 2또는서열번호 4의 아미노산서열을 가질 수 있다.
본 발명의 변형된 EGF 단백질 생산 방법에서, 상기 단계 1) 및 /또는 단계 2)의 배양은 유가배양 ( fed-batch culture)일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "유가배양' '은 배양의 진행과 동시에 영양배지를 배양 용기에 서서히 첨가하면서 배양종료까지 배양 용기에서 배양액을 뽑지 않는 배양 방법이다. 유가배양은 특정 물질의 첨가속도를 미생물에 의한 소비속도와 비례하게 함으로써 배양 중 그 성분의 농도를 임의의 설정 값으로 제어할수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "배지 "는 다세포 유기체 또는 조직의 외측인 인공적인 시험관 내 환경에서 세포의 유지， 성장， 증식 또는 팽창을 위한 영양소 용액을 의미한다. 배지는 특정 세포 배양을 위해 최적화될 수 있으며, 그 예로는 세포 성장의 지지를 위해 조제된 기본 배양 배지, 또는 단클론 항체 생산을 촉진하도록 조제된 생산 배지， 및 영양소들을 고농도로 농축시켜 만든 농축 배지가 있다. 상기 기본 배양 배지는 세포의 성장을 최소한으로 지지할 수 있는 배지를 의미한다. 기본 배양 배지는 표준 무기 염, 예컨대 아연， 철， 마그네슴, 칼슴 및 칼륨뿐만 아니라, 미량원소， 비타민， 에너지원， 완층 시스템 및 아미노산을 공급한다. 본 발명에 따른 기본 배양 배지는 세포의 성장기인 배양 초기에 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는， 기본 배양 배지로서 Hycel l CHO 배지가 사용되었다.
본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산 방법은 본 발명의 변형된 EGF 단백질을 생산하는 숙주세포를 350C 내지 380C에서 배양하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 배양은 37°C의 온도에서 수행될 수 있고, 6.8 내지 7.3의 pH 조건에서 수행될 수 있다.
상기 숙주세포를 350C 내지 38°C에서 배양하는 단계는 세포를 성장시키는 단계로서, 세포의 성장이 급격하게 진행되는 시기이다. 일반적으로, 세포의 성장을 위한 배양 조건은 세포의 종류， 생산하고자 하는 목적 단백질의 종류 등에 따라 변화할 수 있다. 본 발명에서 사용한 CH0 세포의 경우， 37 의 온도 및 6.8 내지 7.3의 pH 범위에서 가장 활발하게 세포 수가증가하는 것으로 알려져 있다.
한편， 본 발명의 배양 단계에서 세포의 성장기는 배양 초기부터 3일 내지 8일， 구체적으로는 4일 내지 7일일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면， 세포의 성장기는 배양 초기부터 7일일 수 있다. 또한, 상기 세포 성장기의 배양 온도는 본 발명의 일 실시예에 따르면， 370C일 수 있다.
본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산 방법은 배양 온도를 32°C 내지 340C로 낮추어 배양하는 단계를 포함한다. 이때， 상기 배양 온도는 상기 단계 1)에서 배양된 세포수가 6x 10s 내지 9x l06 cel ls/ 가 되었을 때 낮추는 것일 수 있다. 구체적으로， 상기 배양은 330C의 온도에서 수행될 수 있고， 6.8 내지 7.1의 pH조건에서 수행될 수 있다.
상기 단계에 따라 세포의 배양 온도를 낮추게 되면， 세포는 표적 단백질의 생산을 극대화하기 위한 배양 조건하에서 단백질 생산기로 진입하게 된다. 세포 성장기에서 단백질 생산기로의 진입을 위해， 배양된 생존 세포 밀도가 최대 생존 세포 밀도의 약 80¾ 내지 90%일 때 배양 조건을 변경할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면， 생존 세포 밀도가 약 90%일 때 배양조건을 변경할 수 있다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따르면， 세포 성장기에서 단백질 생산기로의 진입을 위한 세포의 배양 온도는 330C일 수 있다. 상기 배양 온도가 35°C 이상인 경우， 생산된 변형된 EGF 단백질이 불안정해지고， 310C 이하인 경우, 세포가층분한 수로 자라지 않아 생산율이 떨어진다는 문제점이 있다. 또한， 본 발명에 따른 배양 온도 변경은 배양 6일 내지 8일째에 수행할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 배양 7일째에 수행할 수 있다. 한편, 본 발명의 변형된 EGF 단백질 생산 방법에서 320C 내지 34°C로 낮추어 배양하는 기간은 35°C 내지 380C에서의 배양이 종료된 후로부터 7일 내지 12일， 구체적으로는 8일 내지 10일일 수 있다.
상기 용어 "생존 세포 밀도 (viable cel l density, VCD) "는 일정한 공간 내 살아있는 세포의 양 또는 수를 나타낸다. 본 발명에서는 표적 단백질을 고효율로 생산하기 위해， 적절한 수의 세포가 생존해 있을 때 배양 조건을 변경하기 위하여 세포 생존 밀도를 측정한다. 세포 생존 밀도는 세포의 흡광도를 측정함으로써 알 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하는 단계에서, 단백질 생산을 위해 기본 배양 배지에 보충제를 공급할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "보층제 (supplement )' '는 세포가 단백질 생산기로 진입하였을 때， 건강을 유지하며 단백질을 생산할 수 있도록 풍부한 영양분 공급을 위해 기본 배양 배지에 추가적으로 포함되는 물질로， 일반적으로 지질, 아미노산， 비타민, 성장인자 등을 포함한다. 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있는 보층제의 종류는 통상의 기술분야에 잘 알려져 있으며， 예로서는 Act iCHC GE Healthcare) , Cel l Boost (GE Healthcare) , ASF Feed2(Aj inomoto)등이 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로， 상기 보충제는 CB(cel l boost )5 및 ASF Feed2일 수 있다.
상기 보층제는 높은 수준의 재조합 단백질 생산을 위하여 적정한 양으로 첨가될 수 있고， 이들을 각각 또는 흔합하여 사용할 수 있다. 상기 보층제는 세포가 성장기를 지나 단백질 생산기로 진입하기 직전부터 첨가될 수 있고， 본 발명의 배양에 따르면, 단백질 생산을 위해 온도를 낮추는 1일 내지 3일 전부터 첨가할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면， 단백질 생산을 위해 온도를 낮추는 3일 전부터 첨가할 수 있다. 보층제는 세포의 생존 및 단백질 생산 과정에서 소모된다는 점에서 지속적으로 추가 투입이 이루어져야 한다. 일반적으로, 보층제 추가일로부터 1일 내지 3일의 간격을 두고 주기적으로 첨가될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는， 2일 간격으로 보층제를 투입하였다.
상기 보층제로서 CB5가 사용되는 경우， CB5의 농도는 3.0% 내지 5. 일 수 있다. 일 구체예로， 상기 CB5의 농도는 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5% 또는 5.0%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게, 상기 CB5의 농도는 3.0%일 수 있다. 또한, 상기 보충제로서 ASF Feed2가사용되는 경우， ASF Feed2의 농도는 0.5¾> 내지 2%일 수 있다. 일 구체예로， 상기 ASF Feed2의 농도는 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며， 바람직하게， 상기 ASF Feed2의 농도는 2.0%일 수 있다. 또한， 상기 숙주세포를 배양하는 단계에서 보층제로서 CB5 또는 ASF Feed2를 각각 단독 또는 병용 처리할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서， 변형된 EGF 단백질 생산을 위한 최적의 보층제 조합 조건을 찾기 위하여， 보층제로서 CB5 또는 ASF Feed2를 CB5 4.5% + ASF Feed2 0.5%, CB5 3.5% + ASF Feed2 1.5%, CB5 5.0%, CB5 4.0% + ASF Feed2 1.0%또는 CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0%의 조합으로 배양시 처리하였다. 그 결과, 배양시 보층제로서 CB5 또는 Feed2를 첨가하였을 때， 우수한 생존 세포 밀도， 세포 생존율 및 변형된 EGF 단백질 생산성을 나타내었고, 특히， CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0%조합에서 가장우수한 결과를 나타내었다.
본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산을 위한 배양은 10 내지 20일， 구체적으로는 12 내지 18일 동안 지속할 수 있고， 본 발명의 일 실시예에 의하면, 15일 동안 지속할 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산 방법은 상기 배양액으로부터 수득한 변형된 EGF 단백질을 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 높은 수을로 변형된 EGF 단백질을 정제하여 수득하기 위하여, 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 특히， Protein-A 단백질이 결합된 레진으로 층진된 컬럼, 즉 레진의 리간드로서 Protein-A 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피로 변형된 EGF 단백질을 수득할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "배양액' '은 세포를 배양하고 난 뒤， 세포에서 생산되어 분비된 단백질을 포함하는 다양한 인자들이 포함된 배양 배지를 나타내며， 배양이 완료된 후 원심분리로 세포를 제거하여 얻을 수 있다.
상기 용어 "친화성 크로마토그래피 (aff inity chromatography)"는 생물학적으로 높은 특이적 친화성을 갖는 두 종류의 물질 중 한쪽을 고정상으로 사용하여 그 고정상에 대한 친화성의 차이를 이용해 표적 물질을 분리해 내는 크로마토그래피 방법 중 하나이다. 따라서， 상기 배양액으로부터 변형된 EGF 단백질을 수득하는 단계에서， 배양액은 Proteinᅳ A 단백질이 결합된 레진으로 층진된 컬럼으로 정제할 수 있다.
상기 친화성 크로마토그래피에 사용되는 레진은 매트릭스， 친수성 가교제 및 리간드로 구성된다. 여기서， 매트릭스는 교차결합된 아가로스, 예를 들면， 고도 가교성 고유동 아가로스 (highly cross—l inked high-f low agarose)일 수 있다. 리간드는 본 발명의 변형된 EGF 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질인 Protein-A 단백질일 수 있다. 상기 레진은 변형된 EGF 단백질이 아가로즈 단편에 공유결합으로 연결되어 있어ᅳ 변형된 EGF 단백질에 선택적으로 결합할 수 있다. 또한， 상기 레진에서 리간드는 친수성을 가진 긴 가교제를 가지고 있으므로， 분리하고자 하는 표적 단백질이 쉽게 결합할 수 있다. 상기 레진은 일례로 MabSelect일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "Protein-A 단백질 "은 상기 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 갖는 변형된 EGF 단백질의 특정 서브유닛을 에피토프로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 Protein-A 단백질이 결합된 레진으로 충진된 컬럼에서 글리신 (glycine) 용액으로 변형된 EGF 단백질을 용출할 수 있다. 상기 용액은 표적 단백질의 품질 및 활성을 변화시키지 않는 범위 내에서 Protein-A 단백질과의 결합을 방해할 수 있는 적절한 농도 및 pH로 사용할 수 있다. 상기 용액의 적절한 농도 범위는 50 mM 내지 150 mM일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 의하면， 상기 용액의 농도는 0. 1 M일 수 있다. 한편, 적절한 pH 범위는 3.4 내지 4.4일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 의하면， 상기 용액의 pH는 3.8일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 확립된 방법으로 정제공정을 수행하였을 때, 일반적으로 알려진 EGF 생산과 비교하여 높은 단백질 수율 및 순도를 나타내었으며, 유사한 활성을 보였다.
따라서， 본 발명에 따른 변형된 EGF 단백질 생산 방법은， 생산 공정이 간소하고 경제적일 뿐만 아니라, 생산된 변형된 EGF 단백질의 활성도 우수하여, 상기 방법으로 생산된 변형된 EGF 단백질은 소비자에게 공급되는 가격을 낮출 수 있다. 또한, 본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명의 변형된 EGF 단백질 생산 방법에 따라 생산된 변형된 EGF 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
이때， 상기 피부 상태 개선은 주름의 발생 억제, 피부 노화 억제， 피부 탄력 개선， 피부 재생， 상처 또는 창상 회복 (wound heal ing) , 각막 재생， 피부자극완화 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는， 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선시키는 것을 의미한다.
본 발명은 상기 화장료 조성물을 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법을 제공한다.
상기 피부 상태를 개선시키는 방법은 본 발명에 따른 화장료 조성물을 이를 필요로 하는 대상의 피부에 도포하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대상은 포유동물일 수 있고, 구체적으로는 인간일 수 있다.
피부에 도포하는 단계는 본 발명에 따른 화장료 조성물을 그 형태에 따라 피부에 직접 도포하거나， 분무하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물의 도포량 및 하루 사용 횟수는， 사용자의 연령， 성별, 용도， 증상의 정도 등에 따라 적절하게 설정될 수 있고， 예를 들면， 상기 화장료 조성물의 적당량을 하루 1 내지 6회의 빈도로 피부에 도포할 수 있다. 또한， 본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명의 변형된 EGF 단백질 생산 방법에 따라 생산된 변형된 EGF 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
이때, 상기 피부 질환은 족부궤양, 압박궤양, 구강 점막염， 화상 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량 내지 약 99.99 중량 %， 5 중량 % 내지 90 중량 %， 10 중량 % 내지 85 중량 %, 20 중량 % 내지 60중량 %， 바람직하게는 약 90 중량 %내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다.
본 발명은 상기 약학 조성물을 이용하여 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상의 피부에 도포하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물이 도포될 수 있는 대상은 포유동물일 수 있고， 구체적으로는 인간일 수 있다.
피부에 도포하는 단계는 본 발명에 따른 약학 조성물을 그 형태에 따라 피부에 직접 도포하거나, 분무하는 것을 포함할 수 있다. 이때， 상기 약학 조성물의 도포량 및 하루 사용 횟수는， 사용자의 연령, 성별， 용도， 증상의 정도 등에 따라 적절하게 설정될 수 있고， 예를 들면， 상기 약학 조성물의 적당량을 하루 1 내지 6회의 빈도로 피부에 도포할 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 변형된 EGF단백질 발현 백터 제작 및 세포주 개발
발현 백터 시스템 (Progen, 한국)을 이용하여 EGF-der i 단백질을 발현하는 발현 백터 pAD15 EGF-der ivat ive를 제조하였다. 이때, 상기 발현 백터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도 1에 나타내었다. 상기 백터를 CHO Chinese hamster ovary)-DG44 DHFR (-) 세포에 형질감염 시킨 후， 2회에 걸쳐 고 발현 단일 클론 세포주를 선별하였다. DHFR(dihydrofolate reductase)은 세포 증식 과정인 유전자 복제에 필요한 4가지 구성성분 중에서 dTMPWeoxythymidine monophosphate) 합성에 반드시 필요한 효소이다. HT(hypoxanthine & Thymidine) 물질은 dTMP의 전구물질로서 세포가 이를 이용하여 dTMP를 합성할 수 있다.
CH0-DG44 DHFR (-) 세포에 DHFR 유전자를 포함하고 있는 발현 백터를 형질 전환하기 이전에는 HT를 포함하는 배지에서 배양을 해야만이 세포 성장이 가능하다. 따라서， 상기 발현 백터의 형질전환 이후에는 HT를 포함하지 않는 배지에서 배양함으로써， 타겟 유전자와 DHFR를 발현하는 플라스미드가 안정하게 삽입되어 DHFR 단백질을 발현하는 세포주만 살아남는 세포주를 선별하게 되는데， 이를 HT select ion 단계라 한다. HT select ion 단계를 통하여 DHFR 및 EGF-deri 단백질을 발현하는 세포주를 선별한 후， DHFR 효소의 강력한 억제제인 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX)의 농도를 단계적으로 증가시키면서 고발현 세포주를 선별하였다. 이후， 1 μΜ의 ΜΤΧ 농도에서 60 /106 내지 80 ^g/106 cel ls/day 생산성을 갖는 세포주를 선별하였다. 이후， 1 μΜ의 ΜΤΧ 농도에서 60 Mg/106내지 80 Mg/106 cel ls/day 생산성을 갖는 세포주를 선별하였다. 상기 선별된 세포주 6종을 하기 표 1에 나타내었으며， RCB후보 세포주로 선정하였다.
【표 11
Figure imgf000013_0001
실시예 2. EGF-deri 단백질 발현 확인
상기 선별된 RCB 후보 세포주 6종에 대하여 EGF-deri 단백질이 잘 발현이 되는지 확인하기 위하여， 상기 6종 세포주 배양액에 대하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 이때, 각 레인에 로딩한 배양액을 하기 표 2에 나타내었으며， 각 배양액에 대한 SDS-PAGE 결과를 하기 도 2에 나타내었다.
【표 2】 Lane # Sample
1 Standard Marker
2 CH0-DG44 DHFR (-) 배양액
3 EGF-der i 단백질을 A
4 안정적으로 발현하는 B
5 CH0-DG44 DHFR (-) 배양액 C
6 D
7 E
8 F 도 2에 나타난 바와 같이, EGF-deri 단백질의 분자량은 약 62 kDa으로 확인되었다. 또한, 상기 선별된 6종 세포주 배양액은 EGF-deri 단백질이 80% 이상을 차지하였다. 상기 EGF-deri 단백질의 대부분은 활성올 갖는 모노머 (Monomer) 형태 (62 kDa)로 존재하였고， 5% 이하의 다이머 (Dimer) 형태 (124 kDa)도 관찰되었으며, 절단된 형태는 관찰되지 않았다. 실험예 1. RCB후보세포주의 장기 계대 안정성 확인
의약품 생산용 세포주로 사용하기 위해서는 생산이 완료되는 기간 동안 생산성 및 배가시간 (doubl ing t ime)이 설정된 기준 내에서 일정하게 유지되어야 한다. 상기 실시예 1에서 선별된 RCB 세포주는 MCBOnaster cel l bank)에서 WCB (working cel l bank)로 제조할 경우, 약 10 계대 (passage) 이상의 배양이 필요하다. 또한, 200L 이상의 본 배양을 위한 종균 배양에 5 계대 이상의 배양이 필요하며 , 본 배양에 20 계대 이상의 배양이 필요하다. 따라서, 35 계대 이상의 생산성과 배가시간이 안정적으로 유지되어야 의약품 제조에 사용할 수 있다. 이를 확인하기 위해， 상기 선별된 RCB 후보 세포주의 EGF-deri 단백질 생산성 및 배가시간을 측정하였다. 생산성 측정을 위해 저 배양중인 세포액을 원심 분리하여 새로운 배양액으로 5xl05 cel ls/ml 농도로 suspension 하였다. 이후， 5 ml을 T-25 플라스크에서 3일 동안 배양하였다. 그 다음， 1 ml을 취하여 0.5 ml 배양액으로는 세포 수를 측정하고， 0.5 ml은 원심분리하여 상층액에 대하여 human IgG ELISA를 통하여 lxlO6 세포당 생산성을 측정하였다. 배가시간 (doubl ing t ime , Td)은 다음과 같이 측정하였다. 125 ml 플라스크에서 0.3xl06 cel ls/ml 로 접종하여 3일간 배양한 후 세포 수를 측정하였다. Td= ln2/m (m=lnx2-lnxl/t2-tl) 수식으로 산출하였다. tl 과 t2는 배양 시작 및 종료 시간이며 xl과 χ2는 배양 전과 배양 후의 생존 세포 수이다. 상기 선별된 RCB 후보 세포주 중에서 가장 우수한 장기 계대 안정성을 나타낸 세포주를 의약품 개발 최종 세포주로 선정하였고， 최종 세포주로 선정된 F 세포주의 35 계대 배양이 진행되는 동안 측정된 생산성 및 배가시간을 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.
【표 3】
Figure imgf000015_0001
표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이， 최종 세포주의 생산성은 100% 내지 132% 범위로 유지되었고， 배가시간은 25시간 근처에서 일정하게 유지되었다. 이는 상기 선정된 최종 세포주가 의약품 생산용 세포주로 사용될 수 있음을 의미한다. 실험예 2. EGF-deri 단백질의 가흑조건에서의 안정성 확인
EGF-deri 단백질의 가흑조건에서의 안정성을 확인하기 위하여， 126 / g/ 의 EGF-deri 단백질을 온도 40oC 및 상대습도 75±5%의 가혹 조건에서 3개월 동안 보관하여 EGF-deri 물질의 활성을 관찰하였다. 시간 경과에 따른 EGF-deri 단백질의 함량을 하기 표 4에 나타내었고, 시간 경과에 따른 EGF-deri 단백질의 활성을 하기 표 5 및 도 4a내지 도 4c에 나타내었다.
【표 4】
Figure imgf000015_0002
【표 5]
Figure imgf000015_0003
표 4에 나타난 바와 같이， 40oC의 가혹 조건에서 시간이 경과함에 따라 EGF-deri 단백질의 형태가 79%， 49.5%, 및 32%로 점차 감소했으나, 표 5 및 도 4a 내지 도 4c에 나타난 바와 같이, EGF-deri 단백질의 생물학적 활성은 대부분 유지되었다. 이는 가혹 조건에서 일부 EGF-deri의 분해가 발생하지만， 분해된 EGF-deri 물질이 대부분 정상 EGF로 활성을 유지함을 의미한다. 이를 통해, EGF-deri 단백질이 가혹조건에서도 활성이 거의 소실되지 않고 유지되어 높은 안정성을 나타냄을 알수 있었다. 실험예 3. EGF-deri 단백질의 Formulation, 및 넁동 및 해동
EGF-deri 단백질의 formulat ion 버퍼로서 ρΗ 7.2±0·2의 50 mM Tris-HCl을 사용하였다. 이후， -80oC 내지 70oC의 온도에서 냉동 보관하였다. 상기 버퍼로 formulat ion된 EGF-deri 단백질의 넁동 및 해동 (F/T) 과정을 총 5회 반복하였다. 그 결과를 하기 표 6 및 도 5에 나타내었다.
【표 6】
Figure imgf000016_0001
표 6 및 도 5에 나타난 바와 같이， EGF-deri 단백질의 냉동 및 해동 과정 횟수가증가할수록 Peak 2가 증가하였고， Main Peak는 감소하였다. 1차 넁동 및 해동 과정을 진행할 때 peak 2의 증가폭이 가장 높게 나타났고, 넁동 및 해동 과정을 총 5회 반복하였을 때, Main Peak는 약 감소하였다. 결론적으로, 총 5회의 냉동 및 해동 과정을 진행한 후에도 약 97% 이상의 순도가 유지되었으므로， EGF-deri 단백질이 넁동 및 해동을 반복하는 가혹 조건에서도 활성이 거의 소실되지 않고 유지되어 높은 안정성을 나타냄을 알수 있었다. 실험예 4. EGF-deri 단백질의 피부 투과분석
EGF-deri 단백질의 피부 투과성을 확인하기 위하여, 실험동물로서 제모시킨 Balb/c 마우스와 SKH-1 무모 마우스를 준비하였다. 제모크림을 이용하여 등 피부에서 털을 제거시킨 Balb/c 마우스와 유전적으로 털이 나지 않는 않는 무모 마우스, 두 종류의 마우스를 이용함으로써， 제모로 인한 피부의 인위적인 손상에 따라 EGF-deri 단백질의 피부 투과율에 차이가 나는지 확인하였다. 상기 두 종류의 마우스를 각각 피부에 처리하는 단백질에 따라 PBS 그룹 EGF그룹, EGF-deri 그룹， 및 EGF l iposome(H&A 파마캠) 그룹으로 분류하였다. 이때， 상기 각 단백질은 형광표지 시약인 FITC( f luorescein isothiocyanate)를 라벨하여 개별 단백질의 피부 투과 정도를 확인할 수 있도록 하였다. 각 그룹의 마우스의 피부에 FITC가 라벨된 각 단백질 용액을 FITC 기준 200 ng씩 떨어뜨리고 붓을 이용하여 도포하였다. 실험예 4.1. EGF-deri 단백질의 경피 전달
상기 FITC가 라벨된 각 단백질 용액을 상기 각 그룹의 마우스의 등 피부에 도포한 지 6시간 및 12시간이 지났을 때 , 마우스를 희생하고 피부조직을 떼어냈다. 상기 피부 조직은 저온 유지 장치를 이용하여 세로 단면으로 보관한 후, 공초점 형광 현미경을 통해 피부 층별 투과성을 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. '
도 6에 나타난 바와 같이， 경피 전달 6시간 및 12시간 후， EGF-deri 그룹에 속하는 마우스의 피하조직 (hypodermis)층에서 FITC 시그널이 관찰되었다. 이러한 양상은 마우스의 종과 관계없이 동일하게 관찰되었다. 또한， 이러한 피부 투과도는 일반적으로 경피 전달에 효율적인 전달체로 알려진 l iposome과 비슷한 정도로 나타났다. 실험 수행 시 경피 전달 투과도에 있어서， 개체 간의 차이는 있었으나 전체적인 양상은 재현성 있게 나타났다. 이는 EGF-deri 단백질이 높은 피부 투과성을 가지고 있음을 의미한다. 실험예 4.2. EGF-deri 단백질의 안전성 평가를 위한 채혈 실험
상기 FITC가 라벨된 각 단백질 용액을 상기 각 그룹의 마우스의 둥 피부에 도포한후， eye-bleeding을 통해 시간 경과에 따른 혈중 EGF농도를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, EGF 그룹, EGF-deri 그룹, 및 EGF l iposome 그룹 모두 음성 대조군인 PBS 그룹과 비교하였을 때, 혈중 EGF 농도의 증가 및 변화가 관찰되지 않았으며， 이는 EGF 피하주사 그룹에서도 동일하게 관찰되었다. 이는 혈액으로 전달되는 EGF의 양이 혈중 EGF 농도에 비해 매우 낮으며， EGF는 체내에서 효소에 의해 빠르게 분해되어 장기적인 혈중 EGF 농도에 영향을 미치지 않음을 의미한다. 또한， 이를 통해 EGF-deri 단백질은 화장품 또는 의약품으로 안전하게 사용 가능함을 알수 있었다. 실험예 5. 변형된 EGF단백질 생산을 위한세포 배양조건 확인 실험예 5.1. 최적의 보충제 확인
변형된 EGF 단백질 생산을 위한 최적의 보층제 (supplements) 조건을 확립하기 위하여, 다양한 보층제 조합 조건에서 세포를 배양하였다. 먼저， 0.5x10s cel ls/ 의 클론을 Hycel l CH0 배지 (Hyclone, USA)로 370C에서 6일간 배양 (성장기)하고， 33 로 온도를 전환한 후 15일까지 배양 (생산기)하였다. 이때， 배양 pH는 성장 (Growth)기에는 pH 6.9 내지 pH 7.3으로 진행하였고， 생산 (Product ion)기에는 pH 6.9 내지 pH 7.1로 진행하였다. 배양 교반 속도 (Agitat ion speed)는 150 rpm으로 시작하여 배양 4일차에 200 rpm으로 증가시키고, 배양 6일차에 250 rpm으로 증가시켰다. 글루코오스 (glucose)는 매일 3.0g/L 이상으로 유지하였다.
최적의 보층제 조합 조건을 찾기 위하여, 배양 4， 6， 8 , 10， 12 및 14일에 보층제로 Cel l Boost 5(CB5, GE Healthcare, USA)와 ASF Feed2(Aj inomoto)를 하기와 같은 조합으로 첨가하였다: CB5 4.5% + ASF Feed2 0.5%, CB5 3.5% + ASF Feed2 1.5%, CB5 5.0%, CB5 4.0% + ASF Feed2 1.0% 및 CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0%. 이를 하기 표 7, 도 8a 내지 도 8c에 구체적으로 나타내었다.
【표 7】
Figure imgf000018_0001
5 CB(Cel l Boost )5 3.0%
+ ASF Feed2 (Aj inomoto) 2.0%
Treatment days Cul ture days 4， 6, 8， 10， 12， and 14 Fixed
Agi tat ion speed 150rpm ® 200rpm (Cul ture day D4) Fixed
® 250rpm (Cul ture day D6)
Glucose ≥3.0g/L Fixed
Cul ture durat ion (days) 15 Fixed 도 8a에 나타난 바와 같이 CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0%, CB5 4.0% + ASF Feed2 1.0% 및 CB5 3.5% + ASF Feed2 1.5%조건에서 VCD( viable cel l densi ty) 값은 7.0 x 106 cel ls/mL 내지 8.0 x 106 cel l s/mL을 나타냈다. 이 중， CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0% 조건에서 가장 우수한 VCD 값을 나타내었다. 또한, 도 8b에 나타난 바와 같이， 5종의 다른 보충제 조합 조건 중에서 , CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0% 및 CB5 3.5% + ASF Feed2 1.5% 조건에서 세포 생존율 (cel l vi abi l i ty)이 15일 배양 동안 90% 이상으로 가장 우수한 결과를 나타냈다. 또한， 도 8c에서 나타난 바와 같이， 배양 종료되는 15일차에 변형된 EGF 단백질 생산성 (product ivi ty)이 CB5 5.0%조건에서는 1.0 g/L, CB5 4.5% + ASF Feed2 0.5% 조건에서는 1.294 g/L, CB5 4.0% + ASF Feed2 1.0% 조건에서는 1.44g/L, CB5 3.5% + ASF Feed2 1.5%조건에서는 1.70 g/L, 그리고 CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0%조건에서는 가장높은 생산성인 1.74 g/L를 나타냈다.
상기 결과를 통하여， 변형된 EGF 단백질 생산을 위한 최적의 보충제 조합 조건은 CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0%임을 알 수 있었다. 실험예 5.2. 확립된 최적의 조건하에서 생존 세포 밀도， 세포 생존율 및 EGF 단백질 생산성 확인
상기 실험예 5. 1에서 확립된 변형된 EGF 단백질 생산을 위한 최적의 보층제 조합 조건은, 하기 표 8에 기술한 바와 같이 유가배양 (Fed-batch) 방식으로 Hycel l CH0를 기본 배지 (basal medi a)로 사용하여 0.5 x 106 cel ls/mL의 농도로 접종하였다. 배양 온도는 성장기인 배양 7일차 까지는 37°C, 이후 15일까지는 33°C로 유지했다. 배양 pH는 37°C에서 배양시 (성장기)에는 pH 6.9 내지 pH 7.3 조건에서, 330C에서 배양시 (생산기)에는 pH 6.9 내지 pH 7. 1 조건에서 배양을 진행하였다. 배양 교반 속도는 150 rpm으로 시작하여 배양 4일차에는 200 rpm으로, 배양 6일차에는 250 rpm으로 증가시켰다. 글루코오스 농도는 배양 기간 내내 3.0 g/L 이상으로 유지하였다. 배양 4, 6, 8， 10， 12 및 14일차에， 보충제로서 CB5 3.0% + ASF Feed2 2.0% 조합을 투여하였다. 그 결과를 도 9a 내지 도 9c에 나타내었다.
【표 8】
Figure imgf000020_0001
도 9a 내지 도 9c에 나타난 바와 같이， 2개의 배치 (batch)를 통하여 얻은 결과는, VCD 값이 8.0 X 106 cel ls/mL 내지 12.0 x 106 cel ls/mL을 나타냈고 (도 9a)， 세포 생존율이 배양 14일까지는 9OT 이상, 마지막 배양일인 15일차에는 80% 이상을 나타내었다 (도 9b) . 변형된 EGF 생산성은 2.3 g/L 이상을 나타내었다 (도 9c) . 상기 결과는 하기 표 9에 간략히 나타내었다. 상기 결과를 통해， 표준 EGF 대비 월등히 우수한 배양 생산성 공정이 구축됨을 확인할수 있었다.
【표 9】
Figure imgf000020_0002
실험예 5.3. 변형된 EGF단백질의 정제
EGF-deri의 최적화된 정제 방법은 다음과 같다. 먼저, Mabselect 시스템으로 Protein-A 단백질을 고정상으로 하는 컬럼을 제작하여 준비된 세포 상층액을 14 g 단백질 ^의 양이 되도록 컬럼에 로딩하였다. 이후, 50 mM sodium phosphate와 500 mM NaCl로 구성된 pH 7.0의 세척버퍼 (wash buffer) 1 및 50 mM sodium acetate로 구성된 pH 4.5의 세척버퍼 2를 순차적으로 사용하여 블순물을 제거하였다. 이후， 100 mM Glycine으로 구성된 pH 3.8의 용출 버퍼 (elut ion buffer)를 사용하여 컬럼에 주입하면서 변형된 EGF 단백질을 용출하였다. 그 실험 결과를 하기 표 10, 도 10a 및 도 10b에 나타내었다.
【표 10】
Figure imgf000021_0001
도 10a 및 도 10b에 나타난 바와 같이， SDS-PAGE 및 SE-HPLC( size-exclusion
HPLC) 결과를 통해 변형된 EGF 단백질이 잘 정제됨을 알 수 있었다. 또한， 표 10에 나타난 바와 같이, 정제된 변형된 EGF 단백질의 정제 수율 (purification yield)은 75%이상， 순도 (purity)는 97%이상을 나타내었다. 실험예 6. 표준 EGF및 EGF-deri의 생물학적 활성 비교
표준 EGF 및 EGF-deri의 생물학적 활성을 비교하기 위하여， 다음과 같은 방법으로 실험을 진행하였다. 이때， 본 실험에서 사용한 표준 EGF는 NIBSC(nat ional institute for biological standards and control)로부터 입수하였다. 먼저 , NRK-49F 세포주 (ATCC CRL-1570, 래트 신장)를 배양 배지 (5% Newborn calf serum (Gibco, Cat # 2610—074) + DMEM( ATCC, Cat# 30-2002™) + l%Antibiotic(Gibco, Cat#15240-062))에서 배양하였다. 이후, 실험 당일， 분석 배지 (0.5% Newborn calf serum(Gibco, Cat# 2610-074) + DMEM(ATCC, Cat# 30-2002™))를 이용하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 0.5 X 103 개를 50 mL부피로 시딩하였다. 그리고， 2종의 시료인 NIBSC EGF 및 EGF-deri를 각각 최종 농도가 100ng/mL, lOng/raL, Ing/mL, 0.5ng/mL, 0.2 ng/mL, O.lng/mL, 0.05ng/mL, O.Olng/mL및 O.OOlng/mL가 되도록， 동일한분석 배지로 희석하여 플레이트 각 웰에 50 mL부피로 첨가하였다. 이후, 37 ± 0.5°C및 5 土 0.5% C02 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후， 각 웰당 Cell titer-Glo2.0 assay reagent 100 mL를 분주한 뒤， 차광된 상태로 실온에서 10분 동안 반웅시켰다. 이후, Luminescence integration: 500 및 Emission: Lm 1의 조건에서 측정하여 , 이를 바탕으로 EC50 값을산출하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이， 본 발명의 변형된 EGF 단백질인 EGF-deri의 생물학적 활성은 NIBSC에서 구입한 표준 EGF의 생물학적 활성과 유사하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
서열번호 4의 아미노산서열을 갖는 변형된 EGF 단백질.
【청구항 2]
겨 U항에 있어서,
상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 변형된 EGF 단백질은 서열번호 5의 염기서열에 의해 코딩되는 것인, 변형된 EGF 단백질.
【청구항 3]
제 1항의 변형된 EGF 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터.
【청구항 4]
제 3항의 발현 백터로 형질감염된 숙주세포.
【청구항 5】
제 4항에 있어서，
상기 숙주세포는 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cel l , CHO cel l )인 것을 특징으로 하는, 형질감염된 숙주세포.
【청구항 6】
1) 변형된 EGF 단백질을 생산하는 숙주세포를 35°C 내지 380C의 온도 조건에서 배양하는 단계; 및
2) 배양 온도를 320C 내지 340C의 온도로 낮추어 배양하는 단계를 포함하는, 변형된 EGF 단백질 생산 방법 .
【청구항 7]
거 16항에 있어서，
상기 단계 1)의 배양은 3일 내지 8일 동안 수행되는 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법 .
【청구항 8]
제 6항에 있어서，
상기 단계 1)의 배양온도는 37°C인 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법.
【청구항 9]
제 6항에 있어서，
상기 단계 1)의 배양은 6.8 내지 7.3의 pH 조건에서 수행되는 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법 .
【청구항 10】
제 6항에 있어서,
상기 단계 2)의 배양은 7일 내지 12일 동안 수행되는 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법 .
【청구항 11】
제 6항에 있어서，
상기 단계 2)의 배양온도는 330C인 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법.
【청구항 12】
제 6항에 있어서,
상기 단계 2)의 배양은 및 6.8 내지 7. 1의 pH 조건에서 수행되는 것인, 변형된 EGF 단백질 생산 방법 .
【청구항 13]
제 6항에 있어서，
상기 단계 1)에서 배양된 세포수가 6 106 내지 9x l06 cel ls/ 가 되었을 때， 배양 온도를 낮추는 것인, 변형된 EGF 단백질 생산 방법.
【청구항 14]
제 6항에 있어서,
상기 단계 1) 및 /또는 단계 2)의 배양은 유가배양인 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법 .
【청구항 15]
제 6항에 있어서，
상기 방법은 배양액으로부터 수득한 변형된 EGF 단백질을 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는, 변형된 EGF 단백질 생산 방법 .
【청구항 16】
제 15항에 있어서,
상기 정제는 친화성 크로마토그래피로 수행되는 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법 .
【청구항 17]
제 16항에 있어서,
상기 친화성 크로마토그래피는 Protein-A 단백질이 결합된 레진을 사용하는 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법.
【청구항 18】
제 6항에 있어서，
상기 숙주세포는 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cel l , CHO cel l )인 것을 특징으로 하는， 변형된 EGF 단백질 생산 방법.
【청구항 19]
제 6항에 있어서，
상기 변형된 EGF 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것인， 변형된 EGF 단백질 생산 방법.
【청구항 20】
계 1항에 따른 변형된 EGF 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
【청구항 21】
제 20항에 있어서,
상기 피부 상태 개선이 주름의 발생 억제, 피부 노화 억제, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 상처 또는 창상 회복 (wound heal ing) , 각막 재생, 피부자극완화 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인， 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
【청구항 22]
제 1항에 따른 변형된 EGF 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
【청구항 23]
제 22항에 있어서，
상기 피부 질환이 족부궤양， 압박궤양， 구강 점막염, 화상 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인， 피부 질환 예방또는 치료용 약학 조성물.
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