CN111836826A - 修饰的egf蛋白，其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修饰的EGF蛋白，其制备方法及其用途。根据本发明的修饰的EGF蛋白与细胞膜结合以致EGF可被有效递送到细胞中，由此提高细胞渗透性和半衰期时间。此外，所述修饰的EGF蛋白甚至在严苛条件下仍保持EGF处于完整形式，随之提高长期稳定性，由此可有效用于由于蛋白质变性而具有短的货架寿命并且难于储存和分配的化妆品组合物和药物组合物中。此外，根据本发明的修饰的EGF蛋白制备方法通过确定最优培养温度和pH条件可以生产具有活性的形式的修饰的EGF蛋白并且由于优异的生产率而可以商业应用。在本发明的一个实施方案中，修饰的EGF蛋白以2.3g/L以上的生产率和75％以上的纯化收率生产，这证明了根据本发明的修饰的EGF蛋白制备方法的优越性。因此，本发明的修饰的EGF蛋白在细胞渗透性、体内持久性和稳定性方面优于常规EGF蛋白，并且因此可用作化妆品组合物或药物组合物。

Description

修饰的EGF蛋白，其制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及修饰的EGF蛋白，其制备方法，及其用途。
背景技术
随着化妆品工业的持续发展，在整个化妆品工业中正在开发通过将新技术应用于材料获得的高功能化妆品。此外，随着要求效果如美白、皱纹改善和皮肤再生的消费者数量的增加，功能性化妆品在化妆品工业中正变得更有价值，并且将多种材料整合到化妆品中的研究正在活跃地进行着。最近，表皮生长因子(EGF)由于其优异的皮肤再生能力等而吸引了很多关注。
EGF是一种6kDa的小蛋白并且通过作用于细胞核以促进表皮细胞的分裂与增殖而参与皮肤再生。此外，该蛋白质调节胶原合酶的分泌并且对角膜溃疡或损伤显示极大的作用(Young Seok Kim，2006)。EGF被广泛地用于改善皮肤状况的化妆品、用于糖尿病足部溃疡的治疗剂、创伤愈合剂等中；然而，该蛋白质具有的问题在于向创伤区域的递送，持久性等相对低。因此，有需要开发具有增加的体内渗透性和持久性的新物质EGF蛋白。
发明内容
技术问题
本发明的发明人发现了与已有的EGF蛋白相比具有优异的细胞渗透性、体内持久性和稳定性的修饰的EGF蛋白，因此已经完成了本发明。
本发明的一个目的是提供修饰的EGF蛋白，其制备方法，及其用途。
问题的解决方案
为了实现以上目的，本发明提供具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的修饰的EGF蛋白。
此外，本发明提供表达载体，所述表达载体包含编码所述修饰的EGF蛋白的多核苷酸。
此外，本发明提供用所述表达载体转染的宿主细胞。
此外，本发明提供用于制备修饰的EGF蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：1)在35℃至38℃的温度条件下培养生产所述修饰的EGF蛋白的宿主细胞；及2)在培养温度降至32℃至34℃的温度的状态下培养所述宿主细胞。
此外，本发明提供用于改善皮肤状况的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含本发明的修饰的EGF蛋白作为活性成分。
此外，本发明提供用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的修饰的EGF蛋白作为活性成分。
发明的有益效果
根据本发明的修饰的EGF蛋白与细胞膜结合以致EGF可被有效递送到细胞中，由此显示提高的细胞渗透性和半衰期。此外，所述修饰的EGF蛋白具有增强的长期稳定性，其在于EGF在严苛条件下保持完整形式。因此，该蛋白质可被非常有效地施用于因蛋白质变性而具有短的货架寿命并且难以储存和分配的化妆品组合物和药物组合物。此外，用于制备根据本发明的修饰的EGF蛋白的方法允许修饰的EGF蛋白制备成活性形式，并且可被商业使用，因为此种方法可以通过确定最优培养温度和pH条件而以优异的生产率进行。在本发明的一个实施方案中，以2.3g/L以上的生产率及75％以上的纯化收率生产修饰的EGF蛋白，这证明了根据本发明的用于制备修饰的EGF蛋白的方法的优越性。因此，本发明的修饰的EGF蛋白在细胞渗透性及体内持久性和稳定性方面优于现有的EGF蛋白，并且因此可用作化妆品组合物或药物组合物。
附图说明
图1显示能够表达EGF-deri蛋白(EGF-deri protein)的基因构建体的结构的示意图。
图2显示对选择的六个研究细胞库(RCB)候选细胞系中的每个细胞系表达的EGF-deri蛋白进行SDS-PAGE获得的结果。
图3通过图表显示为了确定最终细胞系的长期传代稳定性在35次传代期间测量的EGF-deri蛋白生产率和翻倍时间。
图4A至4C通过图表显示在严苛条件下EGF-deri蛋白随时间的活性。此处，图4A显示EGF-deri蛋白在初始阶段的活性；图4B显示EGF-deri蛋白在2个月后的活性；图4C显示EGF-deri蛋白在3个月后的活性。
图5通过图表显示取决于冻融(F/T)重复次数的EGF-deri蛋白随时间的活性变化。此处，F/T循环重复总计5次。
图6显示通过利用FITC-标记的PBS、EGF、EGF-deri蛋白和EGF脂质体蛋白中的每种对Balb/c小鼠和SKH-1无毛小鼠的皮肤进行处理并且在6小时和12小时后通过共聚焦荧光显微镜分析每种蛋白对各皮肤层的渗透性获得的结果。
图7显示通过利用FITC-标记的PBS、EGF、EGF-deri蛋白和EGF脂质体蛋白中的每种对Balb/c小鼠和SKH-1无毛小鼠的皮肤进行处理，然后测量随时间的血液中的EGF浓度获得的结果。此处，EGF(s.c.)表示皮下注射EGF的组。
图8A至8C显示用于在开发培养过程中选择补充物的最优组合条件的结果。
图9A至9C显示在最终确定的培养条件下的活细胞密度、生存力和生产率。
图10A和10B显示根据确定的纯化过程获得的纯化收率和纯度。
图11显示EGF-deri蛋白相当于标准EGF的体外活性。
实施发明的最佳方式
在本发明的一个方面，提供修饰的具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的EGF蛋白。
如本文中使用的，术语“EGF”是指分子量为6kDa并且由53个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO:1)。EGF促进表皮细胞的分裂和增殖速率，由此起到恢复皮肤损伤、促进角膜溃疡愈合、再生皮肤等作用，并且发挥形成新血管、使成纤维细胞增殖、分泌胶原合酶等功能。
如本文中使用的，术语“修饰的EGF蛋白”可以指EGF-衍生物(下文中称为EGF-deri)。在本发明，EGF-deri可以具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码。此外，在一个实施方案中，EGF-deri可以含有信号序列。含信号序列的EGF-deri可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码。在本发明的一个实施方案中，所述EGF-deri不仅增加了相当于标准EGF的体内递送和持久性，而且还可以甚至在严苛条件下长期保持蛋白活性。因此，所述EGF-deri可非常有效地应用于由于蛋白质变性而具有短的货架寿命并且难以存储和分配的化妆品组合物。
在本发明的另一方面，提供包含编码所述修饰的EGF蛋白的多核苷酸的表达载体，以及用所述表达载体转染的宿主细胞。此处，所述表达载体可以是pAD15EGF衍生物。此外，所述宿主细胞可以是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在本发明的一个实施方案中，使用表达载体系统(ProGen，Korea)来构建表达EGF-deri蛋白的表达载体pAD15 EGF衍生物。随后，将所述载体转染到中国仓鼠卵巢(CHO)-DG44 DHFR(-)细胞中，然后进行筛选过程两次以选择以高水平表达EGF-deri蛋白的细胞系。
在本发明的另一个方面，提供制备修饰的EGF蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：1)在35℃至38℃的温度条件下培养生产所述修饰的EGF蛋白的宿主细胞；以及2)在培养温度降至32℃至34℃的温度的状态下培养所述宿主细胞。此处，所述宿主细胞可以是中国仓鼠卵巢细胞，并且所述修饰的EGF蛋白可以具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在本发明的用于制备修饰的EGF蛋白的方法中，步骤1)及/或步骤2)中的培养可以是补料分批培养。如本文中使用的，术语“补料分批培养”是指这样的培养方法，其中在开始培养的同时将营养培养基逐步添加到培养容器，并且不将培养液从所述培养容器中收回直至培养结束。在补料分批培养中，可以通过使特定物质的添加速率与微生物对其的消耗速率成比例而将培养物中所述物质的浓度控制至预定的设定值。
如本文中使用的，术语“培养基”是指用于在多细胞生物或组织外的人工体外环境中细胞的维持、生长、增殖或扩增的营养液。可以针对特定细胞对培养基进行优化，并且其实例包括被制备成用于支持细胞生长的基础培养基，被制备成用于促进单克隆抗体的生产的生产培养基，以及通过将营养物浓缩到高浓度制备的浓缩培养基。所述基础培养基是指能够支持最低细胞生长的培养基。基础培养基供应标准无机盐如锌、铁、镁、钙和钾，以及痕量元素、维生素、能量源、缓存系统和氨基酸。根据本发明的基础培养基可以在作为细胞生长期的培养早期使用。在本发明的一个实施方案中，Hycell CHO培养基被用作基础培养基。
根据本发明的用于生产修饰的EGF蛋白的方法包括培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞在35℃至38℃生产本发明的修饰的EGF蛋白。具体地，所述培养可以在37℃的温度并在6.8至7.3的pH条件下进行。
在35℃至38℃培养所述宿主细胞的步骤是使细胞生长的步骤，其间发生细胞快速生长。通常，用于细胞生长的培养条件可以根据细胞类型、要生产的靶蛋白类型等而不同。对于本发明中使用的CHO细胞，已知细胞数在37℃的温度和6.8至7.3的pH范围下增长最活跃。
同时，在本发明的培养期中，细胞生长期可以为自开始培养起3至8天，具体地4至7天。根据本发明的一个实施方案，细胞生长期可以为自开始培养起7天。此外，根据本发明的一个实施方案，细胞生长期期间的培养温度可以为37℃。
根据本发明的用于生产修饰的EGF蛋白的方法包括在培养温度降至32℃至34℃的状态下培养所述宿主细胞的步骤。此处，可以在步骤1)中培养的细胞的数目达到6×106至9×106个细胞/ml时降低培养温度。具体地，所述培养可以在33℃的温度和6.8至7.1的pH条件下进行。
当根据以上步骤降低细胞的培养温度时，细胞在使靶蛋白生产最大化的培养条件下进入蛋白质生产期。为了从细胞生长期进入蛋白质生产期，可以在由培养引起的活细胞密度达到最大活细胞密度的约80％至90％时改变培养条件。根据本发明的一个实施方案，可以在活细胞密度达到约90％时改变培养条件。
此处，根据本发明的一个实施方案，发生从细胞生长期进入蛋白质生产期的细胞培养温度可以为33℃。如果培养温度为35℃以上，存在生产的修饰的EGF蛋白变得不稳定的问题；如果培养温度为31℃以下，存在由于细胞无法生长至足够的数目所致的显示降低的生产率的问题。此外，根据本发明的培养温度的变化可以在培养的第6天至第8天进行；并且根据本发明的一个实施方案，此种变化可以在培养的第7天进行。另一方面，在生产本发明的修饰的EGF蛋白的方法中，在培养温度降至32℃至34℃的状态下进行培养的时间段为从在35℃至38℃进行的培养结束起7至12天，具体地8至10天。
术语“活细胞密度(VCD)”是指给定面积中活细胞的量或数目。在本发明中，为了高效地制备靶蛋白，测量活细胞密度以在适当数目的细胞存活时改变培养条件。活细胞密度可以通过测量细胞的吸光度来确定。
此外，在本发明中，在培养宿主细胞的步骤中，可以将补充物补充到基础培养基中用于蛋白生产。如本文中使用的，术语“补充物”是指用于充分地供应营养以致当细胞进入蛋白质生产期时细胞能够在保持其健康的同时生产蛋白质的额外包含在基础培养基中的物质。通常，补充物包括脂质、氨基酸、维生素、生长因子等。可用于蛋白质生产的补充物的类型是本领域中已知的，并且其实例包括但不限于：ActiCHO(GE Healthcare)、Cell Boost(GE Healthcare)、ASF Feed2(Ajinomoto Co.,Inc.)。具体地，所述补充物可以是CellBoost(CB)5和ASF Feed2。
补充物可以合适的量添加以用于高水平的重组蛋白质生产，并且这些可以单独使用或组合使用。补充物可以从细胞就要通过生长期并进入蛋白质生产期的时间点开始添加。根据本发明的培养，补充物可以从温度降低以用于蛋白质生产前的1至3天开始添加。根据本发明的一个实施方案，补充物可以从温度降低以用于蛋白质生产前的3天开始添加。鉴于在细胞存活和蛋白质生产期间会消耗补充物，此种补充物应当连续添加。通常，补充物可以从其添加日期起以1至3天的间隔周期性添加。在本发明的一个实施方案中，补充物以2天的间隔添加。
当将CB5用作补充物时，CB5的浓度可以为3.0％至5.0％。在一个实施方案中，CB5的浓度可以为(但不限于)3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％，其中3.0％是优选的。此外，当将ASF Feed2用作补充物时，ASF Feed2的浓度可以为0.5％至2％。在一个实施方案中，ASF Feed2的浓度可以为(但不限于)0.5％、1％、1.5％或2％，其中2.0％是优选的。此外，在培养宿主细胞的步骤中，作为补充物的CB5或ASF Feed2可以单独施用或组合施用。
在本发明的一个实施方案中，为了发现用于生产修饰的EGF蛋白的补充物的最优组合条件，在培养期间在以下组合下施用作为补充物的CB5或ASF Feed2：CB5 4.5％+ASFFeed2 0.5％、CB5 3.5％+ASF Feed2 1.5％、CB5 5.0％、CB5 4.0％+ASF Feed2 1.0％、或CB5 3.0％+ASF Feed2 2.0％。结果，当在培养期间添加CB5或Feed2作为补充物时，观察到优异的活细胞密度、细胞生存力和修饰的EGF蛋白生产率；并且特别地，CB5 3.0％+ASFFeed2 2.0％的组合观察到最佳结果。
用于生产根据本发明的修饰的EGF蛋白的培养可以持续10至20天，具体地12至18天；并且根据本发明的一个实施方案，所述培养可以持续15天。
此外，用于生产根据本发明的修饰的EGF蛋白的方法还可以包括纯化从培养液获得的修饰的EGF蛋白的步骤。可以进行亲和层析从而以高收率纯化并获得修饰的蛋白质。特别地，可能的是通过亲和层析使用填充有蛋白A偶联树脂的柱(即，使用蛋白A作为树脂配体)获得修饰的EGF蛋白。
如本文中使用的，术语“培养液”是指细胞培养后的培养基，其含有包括细胞生产和分泌的蛋白质在内的多种因子，并且可以通过在完成培养后进行离心以除去细胞来获得。
术语“亲和层析”是指一种层析方法，其中彼此具有高特异性的生物亲和力的两种类型的物质中的一种被用作固定相并且目标物质的分离利用对该固定相的亲和力的差异来实现。因此，在从培养液获得修饰的EGF蛋白的步骤中，可以通过填充有蛋白A偶联树脂的柱来纯化所述培养液。
用于亲和层析的树脂由基质、亲水交联剂和配体组成。此处，基质可以是交联琼脂糖，例如，高度交联的高流动琼脂糖。配体可以是蛋白A，其是特异性结合本发明的修饰的EGF蛋白的蛋白质。在树脂中，修饰的EGF蛋白与琼脂糖片段共价连接，并且因此可以选择性地结合修饰的EGF蛋白。此外，因为树脂中的配体具有长的亲水交联剂，要分离的靶蛋白可以容易地与其结合。树脂的实例可以是MabSelect。
如本文中使用的，术语“蛋白A”是指能够识别具有SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的修饰的EGF蛋白的特定亚基作为表位并且与其特异性结合的蛋白质。根据本发明的一个实施方案，在填充有蛋白A偶联树脂的柱中，可以用甘氨酸溶液来洗脱修饰的EGF蛋白。所述溶液可以适当的浓度和pH来使用，所述浓度和pH可以此种溶液不改变靶蛋白的品质和活性的程度阻止靶蛋白与蛋白A结合。所述溶液的适当的浓度范围可以为50mM至150mM；并且根据本发明的一个实施方案，所述溶液可以具有0.1M的浓度。另一方面，所述溶液的适当的pH范围可以为3.4至4.4；并且根据本发明的一个实施方案，所述溶液可以具有3.8的pH。
在本发明的一个实施方案中，当通过以上确定的方法进行纯化过程时，与已知的EGF生产相比，观察到高的蛋白质收率和纯度，同时显示相似的活性。
因此，在用于生产根据本发明的修饰的EGF蛋白的方法中，不仅使用简单且经济的生产方法，而且生产的修饰的EGF蛋白还具有优异的活性，这允许通过以上方法制备生产的修饰的EGF蛋白以较低的价格供应给消费者。
此外，在本发明的另一个方面，提供用于改善皮肤状况的化妆品组合物，该化妆品组合物包含根据用于制备本发明的修饰的EGF蛋白的方法生产的修饰的EGF蛋白作为活性成分。
此处，改善皮肤状况是指保护皮肤免于皮肤细胞功能的退化或丧失或选自有以下组成的的组中的皮肤状况的改善：抑制皱纹形成、抑制皮肤老化、改善皮肤弹性、皮肤再生、损伤或创伤愈合、角膜再生、减轻皮肤刺激、及其组合。
在本发明中，提供用于改善皮肤状况的方法，该方法使用所述化妆品组合物。
用于改善皮肤状况的方法可以包括向需要其的受试者的皮肤施用根据本发明的化妆品组合物的步骤。所述受试者可以是哺乳动物，具体是人。
向皮肤施用根据本发明的化妆品组合物的步骤可以包括根据其制剂将所述化妆品组合物直接涂覆或喷洒至皮肤。此处，所述化妆品组合物的施用量和每日使用次数可以根据使用者的年龄、性别、目的用途、症状严重度等合适地设定。例如，可以每天1至6次的频率将适当量的所述化妆品组合物施用至皮肤。
此外，在本发明的另一个方面，提供用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据用于生产本发明的修饰的EGF蛋白的方法生产的修饰的EGF蛋白作为活性成分。
此处，所述皮肤疾病可以选自由以下各项组成的组：足部溃疡、压力溃疡、口腔黏膜炎、灼伤、及其组合。
所述药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。基于本发明的药物组合物的总重量，可以包含量为约1重量％至约99.99重量％5重量％至90重量％，10重量％至85重量％，20重量％至60重量％，并且优选地约90重量％至约99.99重量％的所述载体。
在本发明中，提供用于预防或治疗皮肤疾病的方法，所述方法使用所述药物组合物。
所述用于预防或治疗皮肤疾病的方法可以包括向需要其的受试者的皮肤施用根据本发明的药物组合物的步骤。可以施用所述药物组合物的受试者可以是哺乳动物，具体是人。
向皮肤施用根据本发明的药物组合物的步骤可以包括根据其制剂将所述药物组合物直接涂覆或喷洒至皮肤。此处，所述药物组合物的施用量和每日使用次数可以根据使用者的年龄、性别、目的用途、症状严重度等合适地设定。例如，可以每天1至6次的频率将适当量的所述药物组合物施用至皮肤。
本发明的方式
下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不受其限制。
实施例1.修饰的EGF蛋白的表达载体的构建和细胞系的开发
使用表达载体系统(ProGen，Korea)构建表达EGF-deri蛋白的表达载体pAD15EGF-衍生物。此处，插入到表达载体中的基因构建体的结构显示在图1中。将所述载体转染到中国仓鼠卵巢(CHO)-DG44 DHFR(-)细胞中，然后筛选高表达单克隆细胞系两次。二氢叶酸还原酶(DHFR)是脱氧胸苷一磷酸(dTMP，作为细胞增殖过程的基因复制所需的四种组分之一)的合成所必需的的酶。物质HT(次黄嘌呤和胸苷)是dTMP的前体并且可被细胞用于合成dTMP。
在用含DHFR基因的表达载体转染CHO-DG44 DHFR(-)细胞之前，为了允许细胞生长必须在含HT的培养基中进行培养。因此，在用表达载体进行转染后，在不含HT的培养基中进行培养以致仅使表达靶基因和DHFR的质粒已稳定插入从而表达DHFR蛋白的细胞系存活并被选择。这被称为HT选择步骤。在通过HT选择步骤选择表达DHFR和EGF-deri蛋白的细胞系后，在增加甲氨蝶呤(MTX，DHFR酶的有效抑制剂)浓度的同时选择高表达细胞系。然后，选择在1μM的MTX浓度具有60μg/106个细胞/天至80μg/106个细胞/天的生产率的细胞系。然后，选择在1μM的MTX浓度具有60μg/106个细胞/天至80μg/106个细胞/天的生产率的细胞系。选择如下表1中所示的选择的六株细胞系作为RCB候选细胞系。
[表1]
Figure BDA0002553579450000121
实施例2.EGF-deri蛋白表达的鉴定
为了鉴定在选择的六株RCB候选细胞系中EGF-deri蛋白是否良好表达，对六株细胞系的培养液进行SDS-PAGE。此处，各泳道上加载的培养液显示在表2中，并且各个培养液的SDS-PAGE结果显示在图2中。
[表2]
Figure BDA0002553579450000122
如图2中所示，确定EGF-deri蛋白的分子量为约62kDa。此外，在选择的六株细胞系的培养液中，EGF-deri蛋白占其80％以上。对于EGF-deri蛋白，其中大部分以有活性的单体形式(62kDa)存在，也观察到其中的5％以下为二体形式(124kDa)，并且没有观察到被切割的形式。
实验例1.鉴定RCB候选细胞系的长期传代稳定性
为了使特定细胞系用作用于药物产品生产的细胞系，在直至完成生产的时间段内生产率和翻倍时间应当在设定标准内保持恒定。当将实施例1中选择的每种RCB细胞系经由母细胞库(MCB)制备成工作细胞库(WCB)时，需要约10次以上的传代。此外，当目的是200L以上的主要培养物时，需要5次以上传代用于种子培养，并且需要20次以上传代用于主要培养。因此，为了将RCB细胞系用于药物产品生产，生产率和翻倍时间应当在35次以上传代期间保持稳定。为了确定这一点，测量选择的每种RCB候选细胞系的EGF-deri蛋白的生产率和翻倍时间。对于生产率测量，首先将培养的细胞培养物离心并且悬浮至5×105个细胞/ml的浓度作为新的培养液。随后，在T-25烧瓶中将5ml的所述悬液培养3天。然后，取1ml的培养液，其中的0.5ml用于测量细胞数目；并且余下的0.5ml被离心并且使用上清来测量(利用人IgG ELISA)每1×106个细胞的生产率。翻倍时间(Td)测量如下。将培养的细胞溶液以0.3×106个细胞/ml接种于125ml烧瓶中并培养3天。然后，测量细胞数目。使用以下公式进行计算：Td＝ln2/m(m＝lnx2-lnx1/t2-t1)。t1和t2是培养的起始时间和结束时间，x1和x2是培养前后的活细胞数目。在选择的RCB候选细胞系中，选择显示最佳长期传代稳定性的细胞系作为最终的用于药物产品开发的细胞系。对于被选作最终细胞系的细胞系F，35次传代期间测量的生产率和翻倍时间显示在下表3和图3中。
[表3]
传代 生产率(μg/ml) 百分比(％)
P1-7 49.41 100
P8-14 52.64 106.54
P15-21 55.75 112.84
P22-28 65.10 131.76
P29-35 57.57 116.5
如表3和图3中所示，对于最终的细胞系，生产率保持在100％至132％的范围，翻倍时间保持恒定在约25小时。这表明所选择的最终细胞系可用作用于药物产品生产的细胞系。
实验例2.鉴定EGF-deri蛋白在严苛条件下的稳定性
为了鉴定EGF-deri蛋白在严苛条件下的稳定性，将126μg/ml的EGF-deri蛋白在40℃的温度和75±5％的相对湿度的严苛条件下存储3个月，并且观察物质EGF-deri的活性。EGF-deri蛋白随时间的量显示在下表4中，并且EGF-deri蛋白随时间的活性显示在下表5和图4A至4C中。
[表4]
Figure BDA0002553579450000141
[表5]
Figure BDA0002553579450000142
如表4中所示，在40℃的严苛条件下EGF-deri蛋白的形态随时间逐渐下降至79％，49.5％和32％。然而，如表5和图4A至4C中所示，EGF-deri蛋白的生物学活性大部分得到保持。这表明虽然在严苛条件下发生EGF-deri蛋白的部分降解，但是大部分降解的EGF-deri物质是正常的EGF的并且保持活性。由这些结果发现，从甚至在严苛条件下也保持活性而几乎没有损失的角度出发，EGF-deri蛋白显示高度的稳定性。
实验例3.EGF-deri蛋白的制剂，及其冻融
将50mM Tris-HCl pH 7.2±0.2用作EGF-deri蛋白的制剂缓冲液。然后，将用所述缓冲液配制的EGF-deri蛋白在-80℃至-70℃的温度下冷冻存储。重复配制的EGF-deri蛋白的冻融(F/T)循环总计5次。结果显示在下表6和图5中。
[表6]
样品 峰1 峰2 主峰 各循环的峰2的增量
EGF-deri蛋白(对照) 0.06 0.17 99.77
EGF-deri蛋白(1F/T) 0.07 0.92 99.01 0.75
EGF-deri蛋白(2F/T) 0.06 1.4 98.54 0.48
EGF-deri蛋白(3F/T) 0.07 1.76 98.17 0.36
EGF-deri蛋白(4F/T) 0.05 2.18 97.76 0.42
EGF-deri蛋白(5F/T) 0.06 2.46 97.48 0.28
如表6和图5中所示，当EGF-deri蛋白的冻融循环的次数增加时，峰2增加并且主峰减小。在第一次冻融循环期间，峰2显示最高的增加，并且当冻融循环被重复总计5次时，主峰减小约2％。总之，甚至在总计5次冻融循环后EGF-deri蛋白保持约97％以上的纯度。由这些结果发现，从甚至在重复冻融循环的严苛条件下也保持活性而几乎没有损失的角度出发，EGF-deri蛋白显示高度的稳定性。
实验例4.分析EGF-deri蛋白的皮肤渗透
为了检验EGF-deri蛋白的皮肤渗透性，预备去毛的Balb/c小鼠和SKH-1无毛小鼠作为实验动物。使用两种类型的小鼠，即，已使用拔毛膏将毛发从背部皮肤去除的Balb/c小鼠，以及遗传无毛小鼠，检验EGF-deri蛋白的皮肤渗透性是否取决于由毛发去除引起的人为皮肤损伤而不同。根据要被施用到皮肤上的蛋白质，将两种类型的小鼠分别划分成PBS组、EGF组、EGF-deri组和EGF脂质体(H&A PharmaChem)组。此处，各蛋白质用异硫氰酸荧光素(FITC，一种荧光标记试剂)标记以致可以鉴别个体蛋白质的皮肤渗透性。以基于FITC的200ng的量将用FITC标记的各蛋白质的溶液滴加在各组小鼠的皮肤上并且使用刷子涂抹。
实验例4.1.EGF-deri蛋白的经皮递送
当将用FITC标记的各蛋白质的溶液施用在各组小鼠的背部皮肤上后，经过6小时和12小时时，将小鼠处死并取其皮肤组织。使用低温恒温器以纵切片存储所述皮肤组织，然后通过共聚焦显微镜分析其对各皮肤层的渗透性。结果显示在图6中。
如图6中所示，在经皮递送后6小时和12小时，在属于EGF-deri组的小鼠的真皮层中观察到FITC信号。不论小鼠物种为何，都同样观察到此模式。此外，此种皮肤渗透性类似于已知作为经皮递送的有效递送系统的脂质体的皮肤渗透性。在实验期间经皮递送的渗透性中，虽然个体间存在差异，总体模式足够相似以致是可再现的。这表明EGF-deri蛋白具有高的皮肤渗透性。
实验例4.2.用于评估EGF-deri蛋白的安全性的血液收集实验
将用FITC标记的各蛋白质的溶液施用在各组小鼠的背部皮肤上，然后通过眼出血测量随时间的血液中的EGF浓度。结果显示在图7中。
如图7中所示，与阴性对照PBS组相比，在所有EGF组，EGF-deri组和EGF脂质体组中都没有观察到血液中EGF浓度的增加或变化。甚至在皮下注射EGF的组中也同样观察到此种现象。这表明递送到血液中的EGF的量相当于血液中的EGF浓度非常低，并且在身体中EGF被快速地酶解并且不影响长期的血液EGF浓度。此外，由这些结果发现，可将EGF-deri蛋白安全地用作化妆品或药物产品。
实验例5.鉴定用于生产修饰的EGF蛋白的细胞培养条件
实验例5.1.鉴定最优补充物
为了确定用于生产修饰的EGF蛋白的补充物的最优条件，在补充物的多种组合条件下培养细胞。首先，以0.5×105个细胞/ml将克隆在37℃在Hycell CHO培养基(HyClone，USA)(生长期)中培养6天；并将温度改变为33℃然后培养克隆直至第15天(生产期)。此处，关于培养物pH，在生长期期间在pH 6.9至7.3下进行培养，而在生产期期间在pH 6.9至7.1下进行培养。由150rpm开始的搅拌速度在培养的第4天提高至200rpm并且在培养的第6天提高至250rpm。葡萄糖每天保持在3.0g/L以上。
为了发现补充物的最优组合条件，在培养的第4天、第6天、第8天、第10天、第12天和第14天以如下组合添加作为补充物的Cell Boost 5(CB5，GE Healthcare，USA)和ASFFeed2(Ajinomoto Co.,Inc.)：CB5 4.5％+ASF Feed2 0.5％、CB5 3.5％+ASF Feed21.5％、CB5 5.0％、CB5 4.0％+ASF Feed2 1.0％、以及CB5 3.0％+ASF Feed2 2.0％。这具体显示在下表7和图8A至8C中。
[表7]
Figure BDA0002553579450000171
Figure BDA0002553579450000181
如图8A中所示，在CB5 3.0％+ASF Feed2 2.0％、CB5 4.0％+ASF Feed2 1.0％和CB5 3.5％+ASF Feed2 1.5％的条件下，活细胞密度(VCD)值为7.0×106个细胞/ml至8.0×106个细胞/ml。其中，在CB5 3.0％+ASF Feed2 2.0％的条件下观察到最佳VCD值。此外，如图8B中所示，在补充物的五种不同组合条件中，在CB5 3.0％+ASF Feed2 2.0％和CB53.5％+ASF Feed2 1.5％的条件下观察到最佳结果：在15天的培养期间细胞生存力保持在90％以上。此外，如图8C中所示，在培养结束时(在第15天)，修饰的EGF蛋白的生产率在CB55.0％的条件下为1.0g/L，在CB5 4.5％+ASF Feed2 0.5％的条件下为1.294g/L，在CB54.0％+ASF Feed2 1.0％的条件下为1.44g/L，在CB5 3.5％+ASF Feed2 1.5％的条件下为1.70g/L，并且在CB5 3.0％+ASF Feed2 2.0％的条件下为1.74g/L(这是最高的生产率)。
由这些结果发现，用于生产修饰的EGF蛋白的补充物的最优组合条件为CB53.0％+ASF Feed2 2.0％。
实验例5.2.鉴定EGF蛋白在确定的最优条件下的活细胞密度、细胞生存力和生产率
如下表8中所示，使用Hycell CHO作为分批补料方法中的基础培养基，在实验例5.1中确定的用于生产修饰的EGF蛋白的补充物的最优组合条件下以0.5×106个细胞/ml的浓度进行接种。培养温度保持在37℃直至培养的第7天(即，在生长期期间)，然后保持在33℃直至培养的第15天。关于培养物pH，在37℃的培养期间(生长期)在pH 6.9至7.3的条件下进行培养，并且在33℃的培养期间(生产期)在pH 6.9至7.1的条件下进行培养。由150rpm开始的培养的搅拌速度在培养的第4天提高至200rpm并且在培养的第6天提高至250rpm。在整个培养期将葡萄糖浓度保持在3.0g/L以上。在培养的第4天、第6天、第8天、第10天、第12天和第14天，添加CB5 3.0％+ASF Feed2 2.0％的组合作为补充物。结果显示在图9A至9C中。
[表8]
Figure BDA0002553579450000191
如图9A至9C中所示，参见通过两个批次获得的结果，VCD值为8.0×106个细胞/ml至12.0×106个细胞/ml(图9A)；并且细胞生存力直至培养的第14天为90％以上并且直至培养的第15天(培养的最后一天)为80％以上(图9B)。修饰的EGF的生产率为2.3g/L以上(图9C)。所述结果概述于下表9中。由以上结果发现，建立了相对于标准EGF具有好得多的培养生产率的方法。
[表9]
项目 内容
最大细胞密度 ≥11×10<sup>6</sup>个细胞/ml
在培养的第15天的生存力 ≥80％
生产率 ≥2.3g/L
实验例5.3.修饰的EGF蛋白的纯化
用于EGF-deri的优化的纯化方法如下。首先，利用Mabselect系统准备具有蛋白A作为固定相的柱子，并且将准备的细胞上清液上样到柱上以具有14g蛋白质/L的量。随后，通过顺序使用由50mM磷酸钠和500mM NaCl组成的pH7.0的洗涤缓冲液1和由50mM乙酸钠组成的pH 4.5的洗涤缓冲液2除去杂质。随后，在将由100mM甘氨酸组成的pH 3.8的洗脱缓冲液注射到柱子中的同时洗脱修饰的EGF蛋白。实验结果显示在下表10以及图10A和10B中。
[表10]
项目 内容 注意
纯化收率 ≥75％ -
纯度 ≥97％ -
如图10A和10B中所示，由SDS-PAGE和尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)结果发现，修饰的EGF蛋白被很好的纯化。此外，如表10中所示，纯化的修饰的EGF蛋白具有75％以上的纯化收率和97％以上的纯度。
实验例6.标准EGF和EGF-deri的生物学活性的比较
为了比较标准EGF和EGF-deri的生物学活性，以如下方式进行实验。此处，该实验中使用的标准EGF获得自国立生物学标准和对照研究所(National Institute forBiological Standards and Control，NIBSC)。
首先，在培养基(5％新生牛血清(Gibco，目录号2610-074)+DMEM(ATCC，目录号30-2002TM)+1％抗生素(Gibco，目录号15240-062))中培养NRK-49F细胞系(ATCC CRL-1570，大鼠的肾)。随后，在实验当天，将0.5×103个细胞接种至96孔板的各孔中，体积为50mL，使用测定培养基(0.5％新生牛血清(Gibco，目录号2610-074)+DMEM(ATCC，目录号30-2002TM))。然后，将两种样品，NIBSC EGF和EGF-deri，用相同的测定培养基稀释以致其终浓度分别为100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL、0.01ng/mL和0.001ng/mL，并添加至平板的各孔中，体积50mL。随后，在5±0.5％CO2培养箱中在37±0.5℃进行培养达72小时。在完成培养后，每孔分配100mL的Cell titer-Glo 2.0试剂，然后使反应在室温在避光状态下进行10分钟。随后，在以下条件下进行测量：500的发光积分(luminescence integration)和Lm 1的发射。基于测量计算EC50值。结果显示在图11中。
如图11中所示，本发明的修饰的EGF蛋白EGF-deri与购自NIBSC的标准EGF具有相似的生物学活性。
序列表
<110> 普罗根有限公司
<120> 修饰的EGF蛋白，其制备方法及其用途
<130> PCB809101PRG
<150> KR 10-2017-0137132
<151> 2017-10-23
<150> KR 10-2017-0137140
<151> 2017-10-23
<150> KR 10-2018-0125012
<151> 2018-10-19
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF(表皮生长因子)氨基酸序列
<400> 1
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 2
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF-衍生物氨基酸序列
<400> 2
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro
20 25 30
Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile
35 40 45
Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly
50 55 60
Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Arg Asn
65 70 75 80
Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys Glu Glu
85 90 95
Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln
100 105 110
Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
145 150 155 160
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
165 170 175
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
180 185 190
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
210 215 220
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
245 250 255
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
275 280 285
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
305 310 315 320
Leu Gly Lys
<210> 3
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF-衍生物核酸序列
<400> 3
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggagc cgtgttcgtg 60
agccccagcc acgccaacag cgacagcgag tgccccctga gccacgatgg ctactgcctg 120
cacgatggcg tgtgcatgta catcgaggcc ctggacaagt acgcctgcaa ctgcgtggtg 180
ggctacatcg gcgagaggtg ccagtacaga gacctgaagt ggtgggagct gagaaggaac 240
accggcagag gaggcgagga gaagaaaggc agcaaggaga aggaggagca ggaagagaga 300
gagaccaaga cacccgagtg ccccagccac acccagcccc tgggcgtgtt cctgttccct 360
cccaagccca aagacaccct gatgatcagc agaacacccg aggtgacctg cgtggtcgtg 420
gatgtgagcc aggaagatcc cgaagtgcag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaagtg 480
cacaacgcca agaccaagcc cagagaagag cagttcaact ccacctacag agtggtgagc 540
gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc 600
aacaaaggcc tgcccagctc catcgagaag accatcagca aagccaaagg ccagcccaga 660
gaaccccagg tgtacaccct gcctcccagc caggaagaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 720
ctgacctgcc tggtgaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggaaagcaac 780
ggccagcccg agaacaatta caagacaacc cctcccgtgc tggatagcga tggcagcttc 840
tttctgtaca gcagactgac cgtggacaag agcagatggc aggaaggcaa cgtgttcagc 900
tgcagcgtga tgcacgaagc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gtccctgagc 960
ctgggcaag 969
<210> 4
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF-衍生物氨基酸序列
<400> 4
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys
50 55 60
Gly Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro
65 70 75 80
Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro
85 90 95
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
100 105 110
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
115 120 125
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
130 135 140
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
145 150 155 160
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
165 170 175
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
180 185 190
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
195 200 205
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
210 215 220
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
225 230 235 240
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
245 250 255
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
260 265 270
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
275 280 285
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
290 295
<210> 5
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGF-衍生物核酸序列
<400> 5
aacagcgaca gcgagtgccc cctgagccac gatggctact gcctgcacga tggcgtgtgc 60
atgtacatcg aggccctgga caagtacgcc tgcaactgcg tggtgggcta catcggcgag 120
aggtgccagt acagagacct gaagtggtgg gagctgagaa ggaacaccgg cagaggaggc 180
gaggagaaga aaggcagcaa ggagaaggag gagcaggaag agagagagac caagacaccc 240
gagtgcccca gccacaccca gcccctgggc gtgttcctgt tccctcccaa gcccaaagac 300
accctgatga tcagcagaac acccgaggtg acctgcgtgg tcgtggatgt gagccaggaa 360
gatcccgaag tgcagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc 420
aagcccagag aagagcagtt caactccacc tacagagtgg tgagcgtgct gaccgtgctg 480
caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa aggcctgccc 540
agctccatcg agaagaccat cagcaaagcc aaaggccagc ccagagaacc ccaggtgtac 600
accctgcctc ccagccagga agagatgacc aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg 660
aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaaa gcaacggcca gcccgagaac 720
aattacaaga caacccctcc cgtgctggat agcgatggca gcttctttct gtacagcaga 780
ctgaccgtgg acaagagcag atggcaggaa ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 840
gaagccctgc acaaccacta cacccagaag agcctgtccc tgagcctggg caag 894

Claims (23)

1.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的修饰的EGF蛋白。
2.如权利要求1所述的修饰的EGF蛋白，其特征在于，所述具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的修饰的EGF蛋白由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码。
3.表达载体，其包含编码如权利要求1所述的修饰的EGF蛋白的多核苷酸。
4.宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求3所述的表达载体转染而得。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。
6.用于制备修饰的EGF蛋白的方法，所述方法包含以下步骤：
1)在35℃至38℃的温度条件下培养生产修饰的EGF蛋白的宿主细胞；及
2)在培养温度降至32℃至34℃的温度的状态下培养所述宿主细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中的培养进行3至8天。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中的培养温度为37℃。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中的培养在6.8至7.3的pH条件下进行。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中的培养进行7至12天。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中的培养温度为33℃。
12.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中的培养在6.8至7.1的pH条件下进行。
13.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当步骤1)中培养的细胞数目达到6×106至9×106个细胞/ml时降低所述培养温度。
14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)及/或步骤2)中的培养是补料分批培养。
15.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括纯化获得自培养液的修饰的EGF蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述纯化通过亲和层析进行。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在所述亲和层析中使用蛋白A偶联树脂。
18.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。
19.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述修饰的EGF蛋白具有SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的氨基酸序列。
20.用于改善皮肤状况的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含如权利要求1所述的修饰的EGF蛋白作为活性成分。
21.如权利要求20所述的化妆品组合物，其特征在于，所述改善皮肤状况选自由以下各项组成的组：抑制皱纹形成、抑制皮肤老化、改善皮肤弹性、皮肤再生、损伤或创伤愈合、角膜再生、减轻皮肤刺激及其组合。
22.用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1所述的修饰的EGF蛋白作为活性成分。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述皮肤疾病选自由以下各项组成的组：足部溃疡、压力溃疡、口腔黏膜炎、灼伤及其组合。
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