JP2005506276A - 抗アレルギー複合体分子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規抗アレルギー複合体分子、特にペプチド又はペプチド様分子であって、細胞透過に適切な第１部分及び肥満細胞脱顆粒を減少又は消失させることができ、特に肥満細胞のヒスタミン分泌及び蛋白質キナーゼ活性化を含むアレルギー伝達物質を減少又は消失させることができる第２部分を含み、屈曲又は回転を形成することによって立体構造の束縛を生じるリンカー又は直接結合によって該第１部分を該第２部分に連結した分子を開示する。
Description
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規な抗アレルギー複合体分子を開示し、特に、細胞透過能を有する第一の部分と、肥満細胞脱顆粒、特に、肥満細胞から分泌されるヒスタミンなどのアレルギー伝達物質を減少又は消失させることができる第２部分とを含み、屈曲又は回転を形成することによって立体構造の拘束を生じさせるリンカー又は直接結合で、第１部分が第２部分に連結された、ペプチド分子又はペプチド様分子を開示する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アレルギー性鼻炎、喘息、蕁麻疹及び血管浮腫などのアレルギー性疾患は、臨床に携わる医師が最もよく遭遇する疾患である。アレルギーとは、活性化した肥満細胞から放出された広範囲の生物学的に活性な物質が組織炎症及び機能不全を引き起こす疾患のことである。本質的には、いかなるアレルギー反応も、１以上の標的器官において組織障害を引き起こすことがある（たとえば、Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、１９９３を参照のこと）。
【０００３】
細胞レベルにおいて、肥満細胞は、アレルギー反応の重要な媒介物であり、炎症反応伝達物質を貯蔵する５００個から１０００個の顆粒が詰まっている。これらには、ヒスタミンなどの血管作用伝達物質、走化性物質及び蛋白分解酵素が含まれる。さらに、肥満細胞が活性化された後、いくつかの伝達物質が新たに生じ、放出される。これらには、ロイコトリエン及びプロスタグランジンなどアラキドン酸代謝物及びいくつかの多機能性サイトカインが含まれる。肥満細胞から生じた因子はまた、好酸球、好中球及び単核細胞など他の炎症細胞を動員し活性化させる。したがって、肥満細胞から生じた伝達物質は、アレルギー反応に関連する、痒み、腫脹、咳及び気道内閉塞の症状を誘発するために必要な特性を全て備えている（Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ他、１９８７）。これらの伝達物質は、肥満細胞内のいくつかの異なる経路を経るプロセスに応じて放出される。したがって、アレルギー及び関連する炎症状態を効果的に治療するためには、アレルギー経路のいずれかの箇所を妨害しなければならない。
【０００４】
アレルギーに対する現在の治療薬としては、ヒスタミンの生体活性を遮断するＨ1及びＨ2ブロッカーがある。クロロフェニルアミン、アザチジン、ケトチフェン、ロラチジンなどがその例である。しかし、抗ヒスタミン薬は、ヒスタミンと一緒に放出される他の伝達物質によって生じる炎症反応を妨げることができない。したがって、抗ヒスタミン薬は、アレルギーに対して信頼性の高い防護をもたらすことができない。
【０００５】
アレルギーのより良い治療法は、肥満細胞の脱顆粒を阻害することによって分泌過程を遮断することである。現在この目的で有用な薬剤としては、ヒドロコルチゾン及びクロモグリク酸二ナトリウムがある。しかし、クロモグリク酸二ナトリウムは全ての種類のヒスタミン分泌を阻害することはできず、常に完全な効果があるわけではない。他方、ステロイド剤は肥満細胞の脱顆粒の遮断に効果的であるが、多くの許容しがたい副作用を有する。したがって、重大な副作用を伴わないで肥満細胞の脱顆粒を防ぐことができ、それ故、神経炎症（詳細は以下を参照のこと）などのアレルギーに関連した臨床症状の発症を予防若しくは著しく減少することができる治療薬は、アレルギー及び関連症状の治療に非常に有用と思われる。
【０００６】
肥満細胞の脱顆粒は、少なくとも２つの異なる経路が関与する複雑なプロセスである。肥満細胞は、２つの主要経路である、ＩｇＥ（イムノグロブリンＥ）依存性経路及びＩｇＥ非依存性経路によって制御されたエキソサイトーシス（脱顆粒）プロセスにおいて顆粒成分を分泌する。ＩｇＥ依存性経路は、肥満細胞の細胞表面上に存在するＩｇＥに高い親和性のある受容体（Ｆc εＲＩ）が凝集することよって誘発される、免疫誘導に応答して引き起こされる。この応答は、対応抗原（アレルゲン）と細胞結合性ＩｇＥ抗体との架橋結合を必要とする。
【０００７】
ＩｇＥ非依存性経路又はペプチド作用性経路は、肥満細胞の基本的な分泌促進物質として総括的に知られるいくつかのポリカチオン化合物に応じて引き起こされる。これらの化合物としては、合成化合物４８／８０、天然に生じるポリアミン及び神経伝達物質サブスタンスＰ等の正に荷電されたペプチドがある（Ｅｎｎｉｓ他、１９８０、Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９９３、Ｃｈａｈｄｉ他、１９９８）。
【０００８】
サブスタンスＰが肥満細胞の脱顆粒を誘導する能力があることは、サブスタンスＰを含有する神経末端周辺に肥満細胞が密集して存在していることが観察されたこととともに、肥満細胞が媒介することによりサブスタンスＰが神経炎症を誘導することを示す（Ｆｏｒｅｍａｎ １９８７ａ、ｂ、Ｐｅａｒｃｅ他、１９８９）。皮膚やその他の箇所で、サブスタンスＰ等の神経伝達物質の放出による神経炎症が、急性蕁麻疹、心因性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛、多発硬化症等の様々な疾患に対する一因となることは充分確立されている（Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ １９９６の概説）。さらに、このＩｇＥ非依存性経路による脱顆粒はまた、蛇毒、蜂毒及びスズメバチ毒、細菌毒素及びアヘン剤等の特定の薬剤によって引き起こされ得る。
【０００９】
肥満細胞脱顆粒を活性化する情報伝達経路は、まだ充分に解明されてはいないが、いくつかの細胞の事象は肥満細胞が刺激された後に生じることが示されている。これらの事象としては、ＬＣ、ＰＬＤ及びＰＬＡ２等のホスホリパーゼの活性化、細胞質Ｃａ2+の上昇、並びにセリン及びチロシンキナーゼの活性化がある（Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｒ．「肥満細胞エキソサイトーシスの情報伝達経路（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ」、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＵＫ．ｐｐ．７１〜８８、１９９３に概説されている）。
【００１０】
但し、これらの過程では、ＧＴＰ結合蛋白質（Ｇ蛋白質）が関与することが充分確立されている。例えば、ＧＴＰ−γ−ＳのようなＧＴＰの非加水分解性類似体を、ＡＴＰ-4透過性肥満細胞へ導入すると、ＰＬＣ活性及び脱顆粒が刺激される。
【００１１】
これらの知見やその他の知見から、少なくとも２種の異なるＧ蛋白質が関与しており、１つはＰＬＣ及びＣａ2+活性化（Ｇp）に関与し、もう１つは直接エキソサイトーシスを調節していることが示唆されている（Ｇｏｍｐｅｒｔｓ １９９０、Ｇｏｍｐｅｒｔｓ他、１９９１、Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ １９９３の概説）。その後実際に、基本的な分泌促進物質はＧE、百日咳毒素感受性ヘテロ３量体Ｇ蛋白質と受容体依存性で直接相互作用することによってヒスタミン分泌を誘導することが示された（Ａｒｉｄｏｒ他、１９９０、Ａｒｉｄｏｒ＆Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ １９９０）。このＧ蛋白質はその後、Ｇｉ3と同定され、肥満細胞においてエキソサイトーシスをもたらすペプチド作用性経路を媒介することが明らかにされている。特に、Ｇαｉ3のＣ末端配列（ＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ）に相当する合成ペプチドは、透過可能な肥満細胞へ導入するとヒスタミンの放出を阻害することができた（Ａｒｉｄｏｒ他、１９９３）。
【００１２】
しかし、細胞膜は一般にほとんどのペプチドに対して非透過性である。したがって、細胞内の標的を対象とする治療剤としてプチドを使用するには、ペプチドが膜透過障壁を乗り越えられる特殊な機構が必要となる。
【００１３】
１つの可能なアプローチとしては、選択されたペプチドと、シグナルペプチド配列である「ｈ」領域を含む特定の疎水性配列との融合に基づくものがある。このような疎水性領域の例には、カポシ肉腫繊維芽細胞増殖因子のシグナル配列（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ、Ｌｉｎ他、１９９５、Ｒｏｊａｓ他、１９９７）及びヒトインテグリンβ3のシグナル配列（ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ、Ｌｉｕ他、１９９６、Ｈａｗｉｇｅｒ、１９９７の概説）がある。
【００１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究のみが記載され、シグナルペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの作用が示されていないが、輸送能力のあるシグナルペプチドを目的の生体活性分子に結合させることによって、その生体活性分子を細胞内に特異的に輸送することは、米国特許第５８０７７４６号に開示されている。シグナルペプチドは、複合体全体を細胞内へ輸送させ、次いで、理論的には、生体活性分子が、細胞内でその効果を発揮することができる。このような直接輸送は、治療化合物を細胞に導入するために役立つが、複合体による効能が制限されて、その生体活性分子が、殆ど又は全くその効果を発揮しないことがある。生体活性分子の効果に影響を及ぼすものとしては、不活性なハイブリッド分子を生じることがある、シグナルペプチドへの生体活性分子の結合による影響、複合体全体による細胞内での予測不能な効果、及びシグナルペプチドの存在にも関わらず生じる、細胞内への複合体全体の輸送不能がある。
【００１５】
加えて、アレルギー治療に適切な生体活性分子を同定することもまた、困難なことがある。例えば、公知の分泌遮断化合物等の非ペプチド分子を、シグナルペプチドに結合することは、困難である上に不安定な分子を生じることがある。ペプチドを、分泌遮断化合物として使用することができるが、このようなペプチドは、注意深く選択され、試験されねばならない。最後に、組織培養した細胞に透過する能力によって、必ずしもヒト又は動物被験対象における複合体の効果を予測することはできないので、完全な複合体は、試験、とりわけｉｎ ｖｉｖｏでの試験が必要である。従って、米国特許第５８０７７４６号は、開示されているのはｉｎ ｖｉｔｒｏのデータのみであるという欠点があり、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるシグナルペプチドの単独、又は複合体の一部としての効果は、解かっていない。従って、アレルギー治療用に、標的を絞った特異的かつ適切な治療薬は現在のところ入手できず、開発は、潜在的に、複雑で困難である。
【００１６】
従って、肥満細胞の脱顆粒を遮断し、それによってヒスタミンの放出を阻害するが、特異的に脱顆粒経路を標的とし、それによって副作用がほとんどないアレルギー及び関連する炎症症状を治療するための治療剤が求められており、そしてそのような治療剤を得ることは有用である。
【００１７】
今までの研究で、いくつかのペプチドについては、肥満細胞脱顆粒を遮断する能力があることが示された。例えば、第１部分としてＮ末端（下線部）に輸送に適切なシグナルペプチドを含み、第２部分としてＣ末端にＧαｉ3のＣ末端配列を含むように設計、合成された、ペプチド２と称する新規ペプチド（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ）は、活性化肥満細胞からのヒスタミンの放出を阻害した（ＷＯ００／７８３４６）。この開示された他の活性ペプチドには、
が含まれる。
【００１８】
本発明は、上記出願で開示され、請求されたいかなるペプチドも含むものではなく、それらは、以下に開示される原理によれば、公知のペプチドであるので、本発明から明確に除外される。
【００１９】
本明細書で言及した全ての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物、特許及び特許出願が、あたかも本明細書中に組み込まれて明確に述べられたのと同様に、本明細書での言及により、それらの全体を、本明細書において援用する。さらに、本出願で参考文献を引用しても、このような参考文献を本発明の従来技術として有用であると認めたと解釈すべきものではない。
【発明の開示】
【００２０】
（発明の概要）
本発明は、アレルギー及び関連する炎症症状の特異的で直接的なターゲット治療法のための治療複合体分子であって、複合体分子を肥満細胞に輸送する能力のある第１部分と、肥満細胞脱顆粒を遮断又は有意に減少させることで、ヒスタミンの放出を遮断又は有意に減少させる第２部分とを含む分子を開示する。現在の好ましい実施形態によれば、第１部分は、複合体を肥満細胞に輸送する能力のあるシグナルペプチドを含み、一方、第２部分は、肥満細胞脱顆粒過程へのＧ蛋白質の関与を遮断できるペプチド等の生体活性分子を含む。本発明の最も好ましい実施形態では、蛋白質キナーゼ活性化によって誘導される遅延型炎症伝達物質を含む、アレルギー反応に関する炎症伝達物質を減少又は消失させ、肥満細胞からのヒスタミン分泌を阻害する。
【００２１】
本発明によれば、少なくとも、肥満細胞に分子を輸送する能力のある第１部分と、肥満細胞中で抗アレルギー効果を発揮するための第２部分とを有し、第１部分がリンカーによって第２部分に結合されている分子を含む、抗アレルギー剤が提供される。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態によれば、リンカーは共有結合である。本発明の現在のより好ましい実施形態では、この共有結合はペプチド結合である。
【００２３】
ここで、リンカーは、意外にも、第１部分と第２部分の接合部分又はその近傍で、立体構造上の拘束を生じさせるような特性のものでなければならない。リンカーとしては、直線状又は２次元的な構造で、第１部分が第２部分と接触することを妨げるものが好ましく、リンカーが、屈曲か回転を生じさせるものがより好ましい。現在の最も好ましい特定の実施形態において、立体構造の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００２４】
プロリンの他、適切な立体構造をもたらす部分の具体例としては、サルコシンなどのＮ−メチルアミノ酸、プロリンに代わるヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸があるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
第２部分は、少なくとも肥満細胞の脱顆粒を有意に減少させることによって抗アレルギー効果を発揮する。第２部分は、ペプチド、ペプチド様物質、及びポリペプチドから選択することが好ましく、ペプチド又はペプチド様物質であることがより好ましい。第１部分もまた、ペプチド又はペプチド様物質であることがより好ましい。
【００２６】
ここで、抗アレルギー活性を形成する第２部分は、環状構造を有するペプチドであることが最も好ましい。環状構造は、水素結合、イオン結合又は共有結合から成る群から選択された結合によって安定化されることが好ましい。
【００２７】
本発明の分子の抗アレルギー部分は、Ｇ蛋白質のＣ末端配列から得られたペプチドであることが好ましく、エキソサイトーシスに関与するＧ蛋白質のＣ末端配列から得られたペプチドであることがより好ましい。有用なペプチドの具体例としては、Ｇαｉ3及びＧαｔがある。本発明のペプチドの抗アレルギー部分としては、
の群から選択されたアミノ酸配列を有するものが最も好ましい。
【００２８】
本発明の範囲内には、これら配列の活性の類似体、相同体、及び環式誘導体を含む誘導体の全てが含まれる。
【００２９】
本発明の分子の輸送能を有する部分は、シグナルペプチド配列から得られたペプチドであることが好ましい。これらの有用な例には、カポシ肉腫繊維芽細胞増殖因子又はヒトインテグリンβ３のシグナルペプチド配列が含まれる。
【００３０】
本発明の特に好ましい実施形態において、この分子は、
から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００３１】
本発明の範囲内には、環式誘導体に限定されることなく、これらの配列の活性類似体、相同体、及び環式誘導体を含む誘導体の全てが含まれる。特に、活性類似体は、スクシニル化誘導体などのエステルを含むことを意味するが、それだけには限定されない。
【００３２】
本発明の他の実施形態によれば、活性成分として治療有効量の抗アレルギー剤を含有するものであって、該抗アレルギー剤が、複合分子を含有し、この複合分子が、該複合分子を肥満細胞内へ輸送する能力を持つ第１部分と、肥満細胞内で抗アレルギー効果を発揮する第２部分とを含んでいる、被験対象のアレルギー症状を治療するための医薬組成物において、前記第１部分が、屈曲又は回転を形成することによって立体構造上の拘束を生じさせる、リンカー、又は直接結合によって第２部分に連結している、医薬組成物が提供される。
【００３３】
現在の最も好ましい実施形態において、立体構造上の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００３４】
本発明の他の好ましい実施形態において、この医薬組成物は、活性成分として、
の群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドを、抗アレルギー部分として持つ複合ペプチドを含む。
【００３５】
さらに、この医薬組成物は、活性成分として、
から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する複合ペプチドを含むことが好ましい。
【００３６】
本発明の範囲内には、これらの配列の全ての活性類似体、相同体及び環式誘導体が含む誘導体が含まれる。
【００３７】
本発明のさらに他の実施形態によれば、被験対象に治療有効量の抗アレルギー剤を投与する工程を含む被験対象のアレルギー症状を治療する方法であって、該抗アレルギー剤が、複合分子を含有し、この複合分子が、該複合分子を肥満細胞内へ輸送する能力を持つ第１部分と、肥満細胞内で抗アレルギー効果を発揮する第２部分とを含んでおり、該第１部分が、屈曲又は回転を形成することによって立体構造上の拘束を生じさせる、リンカー、又は直接結合によって第２部分に連結している治療する方法が提供される。
【００３８】
現在の最も好ましい特定の実施形態において、当該立体構造上の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００３９】
プロリンの他、適切な立体構造をもたらす部分の具体例としては、サルコシンなどのＮ−メチルアミノ酸、ヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸があるが、これらに限られるものではない。
【００４０】
アレルギー症状としては、アレルギー性鼻炎、被験対象の目のアレルギー反応、被験対象の皮膚のアレルギー反応、急性蕁麻疹、乾癬、心因性又はアレルギー性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛、多発硬化症から成る群から選択されることが好ましい。
【００４１】
投与経路としては、経口が好ましいが、他の投与経路として、非限定的に、鼻腔内、眼内、皮下及び非経口投与が挙げられる。治療剤は、局所投与によって投与することがより好ましく、この局所投与は、被験対象の皮膚に対して行うことが最も好ましい。本発明の他の好ましい実施形態において、治療剤は、鼻腔内又は吸入によって投与する。
【００４２】
ここで、本発明によるペプチドは、ヒスタミン放出の阻害に加えて、予想外にも、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を阻害することを明らかにしている。これらの蛋白質キナーゼの活性化は、ロイコトリエン及びプロスタグランジンのデノボ合成(synthesis de novo)等の遅延型炎症反応の活性化を導く重要な事象であることは既に実証されている。
【００４３】
従って、本発明のさらに他の実施形態によれば、被験対象に治療有効量の抗アレルギー剤を投与する工程を含む、蛋白質キナーゼ活性によって誘導される遅延型炎症応答の予防方法であって、該抗アレルギー剤は複合分子を含有し、この複合分子が、少なくとも該複合分子を肥満細胞内へ輸送する能力を持つ第１部分と、肥満細胞内で抗アレルギー効果を発揮する第２部分とを含んでおり、該第１部分は、リンカーによって第２部分と結合し、当該リンカーによって両部分の連結部又はその近傍に屈曲又は回転がもたらされている、治療方法が提供される。
【００４４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗アレルギー性ペプチドの被験対象の細胞への輸送を促進する方法であって、
（ａ）屈曲又は回転を形成するリンカー又は直接結合を介して抗アレルギー性ペプチドにペプチドからなるリーダー配列を結合させ、複合ペプチド分子又は複合ペプチド様分子を形成する工程と、
（ｂ）被験対象にこの複合ペプチド又はペプチド様分子を投与する工程と、
（ｃ）リーダー配列によって細胞内に複合体分子を輸送することで、抗アレルギー性ペプチドを細胞内に輸送する工程と、を含む方法を提供する。
【００４５】
以後、「生体活性」という用語は、生体系で効果を発揮できる分子又はその複合体を意味する。以後、「断片」又は「部分」という用語は、分子又はその複合体の部分を意味し、その部分は分子又はその複合体の全体より実質的に小さいものが含まれる。
【００４６】
以後、「アミノ酸」という用語は、他のこのような分子とペプチド結合を形成できる天然分子及び合成分子の両者を意味する。以後、「天然アミノ酸」という用語は、標準的な及び非標準的な天然アミノ酸の両者を含めた天然に生じるアミノ酸全てを意味する。以後、「標準的な天然アミノ酸」という用語は、通常蛋白質の成分として利用されるαアミノ酸を意味する。以後、「非標準的な天然アミノ酸」という用語は、ほ乳類又はほ乳類以外の真核細胞、又は原核細胞によって産生され、通常真核細胞又は原核細胞の蛋白質の成分として利用されない天然に生じるアミノ酸を意味する。以後、「合成アミノ酸」という用語は、人工的に産生され、真核細胞又は原核細胞で天然に生ぜず、前述のアミノ酸に必要な特性を満たした分子全てを意味する。以後、「ペプチド」という用語には、天然、合成又は組換え体に関わらず、いずれのアミノ酸配列の鎖も含まれる。以後、「ペプチド様物質」という用語には、合成アミノ酸及び天然アミノ酸を有する類似体を含む、実質的に機能が類似又は同様のペプチド類似体及び擬似体の両者が含まれ、ペプチド結合を、他の共有結合と置き換わることが可能なものである。
【００４７】
本発明は、添付の図面を参照して、実施例のみによって以下に説明する。
【００４８】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、少なくとも肥満細胞に複合体分子を輸送する能力を有する第１部分と、肥満細胞の脱顆粒を遮断又は有意に減少させることで、ヒスタミンの放出を遮断又は有意に減少させる第２部分と持つ分子を含有する、アレルギー及び関連炎症症状の特異的で直接的なターゲット治療のための治療用複合体分子を開示する。
【００４９】
ここで、リンカーは、本発明の重要な要素であり、それが複合分子の２つの部分の連結部又はその近傍で特定の立体構造上の拘束を付与するものでなければならないことを明示する。第１部分は、リンカー又は直接結合によって第２部分と連結し、このリンカーは屈曲又は回転を形成することによって立体構造上の拘束を形成する。現在の最も好ましい特定の実施形態において、この立体構造の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００５０】
プロリンの他、適切な立体構造を導入する部分の具体例としては、サルコシン等のＮ−メチルアミノ酸、ヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
第１部分は、一の分子であり、好ましくはペプチド又はペプチド様物質であり、より好ましくはシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、細胞膜を透過することができ、蛋白質又はペプチドの移出及び／又は移入を可能にするペプチドである。本明細書において、適切なシグナルペプチドは、蛋白質、ペプチド又はその他の分子を細胞に移入する能力を持つペプチドである。このようなシグナルペプチドは、一般的に約１０〜５０個のアミノ酸を有するのが特徴で、その大部分が一般的に疎水性であるため、疎水性の油溶性部分を備えている。シグナルペプチドはまた、複合体分子を移入する細胞タイプによって選択されることが好ましく、特定の細胞種によって産生されたシグナルペプチド、又は特定の細胞種によって産生されたペプチド及び／又は蛋白質から得られるシグナルペプチドが、複合体分子を当該細胞種に移入するために使用することができる。そのようなシグナルペプチドの例は、前述した通りであり、また、シグナルペプチドに関する教示について、本明細書中で完全に述べられたかのように組み込まれた米国特許第５８０７７４６号に開示されている。
【００５２】
第２部分は、好ましくは、肥満細胞の脱顆粒を阻止することによって、これら肥満細胞からのヒスタミンの放出を阻害して、抗アレルギー効果を発揮する分子であることが好ましい。この分子は、好ましくはペプチドであり、より好ましくは肥満細胞でエキソサイトーシスを誘導するペプチド経路を媒介することが明らかなＧαi3のＣ末端配列から得られたペプチドである。更に、第２部分は、ペプチド様物質、ポリペプチド又は蛋白質から成る群から選択される。
【００５３】
第１部分を第２部分に連結するリンカーは、共有結合であることが好ましい。第１部分及び第２部分の少なくとも１つがペプチドであるならば、この共有結合はペプチドであってよい。ここで、リンカーは、本発明の重要な要素であり、複合分子の２つの部分の連結部又はその近傍に特定の立体構造上の拘束を付与するものでなければならない。
【００５４】
第１部分は、屈曲又は回転を形成することで立体構造上の拘束を形成するリンカー又は直接結合により、第２部分に連結される。現在の最も好ましい特定の実施形態において、この立体構造上の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００５５】
プロリンの他、適切な立体構造を導入する部分の具体例としては、サルコシン等のＮ−メチルアミノ酸、ヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
本発明の複合体分子の連結部又はその近傍で、適切に拘束された立体構造を形成する様々な方法は、当業界において周知である。立体構造を拘束する古典的方法としては、アミノ酸を構造的に変更したり、可撓性のあるペプチド結合以外の結合を導入するものがある。その他の形式の立体構造上の制限において、アミノ酸の立体配座及び構造の変更、局所的な主鎖の変更、狭い範囲、中程度の範囲及び広範囲での環化が、本発明によるペプチドの活性立体構造を最適化するために有用である（Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１、１８９（１９８２）、Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．、２１、５１２（１９８２）、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｗ．、ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ，Ｓ．、ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．、Ｖｏｌｕｍｅ ６ ｐ．２５４（１９８４）、Ｖｅｂｅｒ，Ｄ．Ｆ．ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８、３９２（１９８５）、Ｍｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．Ｊ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０、７０（１９８９））。
【００５７】
治療上活性なペプチドは、代謝安定性を実現し、効能を高め、選択性を付与若しくは増強し、且つ生物学的利用能を制御するため、環化される。直鎖状ペプチドを環化すると、これらの重要な薬理学的特性を制御することが可能なので、当業界で知られているように、中程度及び広範囲の環化を利用して天然の生物活性ペプチドを、ペプチド様薬剤に変換することがなされた。環化はまた、立体構造の均一性を高め、立体構造の分析を容易にする構造的拘束をもたらす（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．、２１、５１２（１９８２））。さらに、構造上の硬直化と活性との関係に関する研究と、立体構造分析とを組み合わせることで、直鎖状ペプチドの生物学的に活性な立体構造についての知見が得られる。
【００５８】
本発明ではまた、アレルギーの治療方法を開示する。以後、「治療」という用語には、アレルギー状態の予防並びにアレルギー症状の実質的な軽減又は除去の両方が含まれる。本発明の治療剤が有用なアレルギー症状としては、アレルギー性鼻炎、目の炎症及びアレルギー反応、あらゆる種類のアレルゲンによって誘導される発疹又はその他の皮膚刺激若しくは炎症を含む皮膚でのアレルギー反応、急性蕁麻疹、乾癬、心因性又はアレルギー性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛、並びに多発硬化症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
このような治療は、例えば、皮膚アレルギーや皮膚アレルギー反応のために、局所的に実施することができ、そのような症状としては、非限定的に、アレルゲンとの皮膚接触による接触皮膚炎、虫さされに対する反応、及び食物を対象者が消化した後に現れる蕁麻疹等の全身性アレルゲンに対する皮膚反応を含む。選択的に及び／又は追加的に、このような治療は治療用複合体の全身投与によって実施することができる。投与経路としては経口が好ましいが、他の投与経路としては、非限定的に、鼻腔内、眼内、皮下及び非経口投与がある。他の投与経路及びそれらの適切な薬剤の処方は、以下で、より詳細に説明する。
【００６０】
既に記載したように、本発明の現在最も好ましい特定の実施形態において、第１及び第２部分は、いずれもペプチドであり、両者は、ペプチド結合によって結合している。
【００６１】
本発明において、新規なペプチドについて試験がなされ、以下のペプチドを指摘した。
【００６２】
既に、第１部分として明確な輸送能を持つシグナルペプチドをＮ末端に含み、第２部分としてＧαｉ3又はＧαｔのＣ末端配列をＣ末端に含むように設計、合成された特定のペプチドが、活性を有することが示されており（ＷＯ００／７８３４６）、そのようなペプチドとしては、以下に挙げるものがある。
【００６３】
さらに、以下のペプチドが既に合成され、不活性であることが示されている。
【００６４】
このペプチドは、従前ペプチド１と称されているが、本発明の新規ペプチドと比較するために、以下の本明細書中では、ＷＡＬＬ００９と表す。
【００６５】
これらの既に開示及びクレームされた公知のペプチドは、本発明から明確に除外される。
【００６６】
新規ペプチドについて、化合物４８／８０によって誘導された精製ラット腹膜肥満細胞からのヒスタミン分泌に対する阻止能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調べた。従って、このスクリーニングで活性なペプチドは、肥満細胞依存性アレルギーに有用である。このようなアレルギーには、非限定的に、肥満細胞脱顆粒が、第２部分の前記ペプチドが得られるＩｇＥ非依存性経路によって媒介されるアレルギーが含まれる。このようなアレルギーの例には、非限定的に、急性蕁麻疹、乾癬、心因性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛及び多発硬化症を含む、皮膚及びその他の場所の神経炎症が含まれる。
【００６７】
ここで、本発明の特徴を、以下の実施例により説明するが、これらは限定的なものと解釈すべきではない。当業者であれば、例示した特定の実施形態の多くの改良及び変更が本発明の範囲内で実施し得ると理解するであろう。
【実施例１】
【００６８】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのペプチドの試験
前述のような本発明のペプチドに対して、肥満細胞からのヒスタミン分泌を阻止する能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。ラット腹膜細胞及びヒト皮膚肥満細胞はいずれもＩｇＥ非依存性機構によってサブスタンスＰに応じてヒスタミンを放出することが既に示されているので、ラット腹膜肥満細胞を実験モデルとして選択した（Ｄｅｖｉｌｌｉｅｒ他、１９８６、Ｆｏｒｅｍａｎ １９８７ａ、ｂ、Ｃｏｌｕｍｂｏ他、１９９６）。また、同一のペプチド作用経路が、ラット腹膜肥満細胞及びヒト皮膚肥満細胞のいずれにも関与していることが示されている（Ｍｏｕｓｌｉ他、１９９４、Ｅｍａｄｉ−Ｋｈｉａｖ他、１９９５）。
【００６９】
化合物４８／８０は、総体的に肥満細胞の基本的な分泌促進物質であることが知られているポリカチオン化合物の１つであるため、アレルゲンとして選択した。化合物４８／８０は、ヒト肥満細胞の脱顆粒を誘導することが知られている。特に、皮膚の肥満細胞に対して非常に活性がある。化合物４８／８０は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト肥満細胞の放出能力を評価したり、慢性蕁麻疹に対する薬剤の効果を測定したり、アトピー性皮膚炎における痒み及び発赤を研究したりするための診断薬として使用されてきた（Ｋｉｖｉｔｙ他、１９８８、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ他、１９９１）。従って、化合物４８／８０が誘導するヒスタミン放出の阻害は、サブスタンスＰ、蛇毒、蜂毒、スズメバチ毒、細菌毒素、及びアヘン等の特定の薬剤などその他の基本的な分泌促進物質によって誘導されるアレルギーにも当てはまり、直接関連する。
【００７０】
次に、試験ペプチドそれぞれが、化合物４８／８０で誘導した肥満細胞脱顆粒を阻害する能力を試験した。この実験方法は以下の通りである。
【００７１】
材料及び方法
（ペプチド合成）
ペプチドは、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｌｆｅｎｂｕｔｔｅｌ、ドイツ）によって合成された。ペプチドは、固相法によって合成され、純度は＞９５％であった。正確な組成及びペプチドの純度はＨＰＬＣ、質量分析及びアミノ酸分析によって確認した。凍結乾燥したペプチドは、−２０℃で保存された。ペプチド保存溶液（Ｈ2Ｏに溶かした１０％ジメトキシスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で５ｍｇ／ｍｌとする）は実験毎に新たに調製した。
【００７２】
（肥満細胞の単離及び精製）
Ｃ．Ｒ．ラット腹腔の肥満細胞をタイロード緩衝液（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4 ０．４ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ2 １．０ｍＭ、グルコース ５．６ｍＭ、ＢＳＡ １ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ ７．２）で単離して、フィコール勾配で精製した。０．１％ＢＳＡを含有する緩衝生理食塩水に溶かした３０％フィコール４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）の緩衝剤表面に、洗浄した腹腔細胞の懸濁液を積層し、次いで１５０ｘｇで１５分間遠心した。試験管底部から回収した肥満細胞の純度は、トルイジンブルー染色によって評価したところ＞９０％であった。
【００７３】
（インタクト細胞からのヒスタミン放出の誘発）
精製した肥満細胞（１０5細胞／０．５ｍｌ、２試料）を、タイロード緩衝液中で、緩衝液又は所望濃度の指適したペプチドととともに、３７℃で２時間インキュベートした。その後、ヒスタミン放出を、タイロード緩衝液に溶かした化合物４８／８０（Ｓｉｇｍａ）０．１μｇ／ｍｌによって誘発した。化合物４８／８０とのインキュベートを、３７℃で２０分間実施した。反応は試験管を氷上に置くことによって停止させた。細胞を短時間（１２０００ｇ×２０ｓ）遠心することによって沈降させ、上清を収集した。ヒスタミン放出の量は、既に記載された通りに測定した（Ａｒｉｄｏｒ他、１９９０）。簡単に説明すると、細胞ペレットを０．１Ｎ ＮａＯＨ ０．１ｍｌを使用して溶解し、各試料の量をＨ2Ｏで０．５ｍｌに調節した。ヒスタミン含量は、Ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＴ）蛍光法を使用して測定した（Ｓｈｏｒｅ他、１９５９）。上清及び細胞溶解物の一部（０．４ｍｌ）を、Ｈ2Ｏ １．６ｍｌ、１Ｎ ＮａＯＨ ０．４ｍｌ及びメタノールに溶かした１０ｍｇ／ｍｌ ＯＰＴ ０．１ｍｌととともに、室温で４分間インキュベートした。反応は３Ｎ ＨＣｌ ０．２ｍｌを添加することによって停止させた。試料を１５０ｇで５分間遠心し、試料０．２ｍｌを９６ウェルプレートに移した。マイクロタイタープレートで、マイクロプレートリーダー（ＦＬ−６００、Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を使用してヒスタミン分光蛍光アッセイを実施した。試料を３４０ｎｍの光で励起して、４４０ｎｍで測定した。ヒスタミン放出は、各試料中の全ヒスタミン含量に対するパーセントとして算出した（上清／ペレット＋上清）。各データは、２つの試料における測定値の平均を示す。自然に放出されたヒスタミンについては、差し引いた。統計分析およびプロットは、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｌｔｄ．、ワシントン、米国）で実施した。
【００７４】
（ＰＴＫ（蛋白質チロシンキナーゼ）及びＭＡＰキナーゼの活性化）
精製した肥満細胞（（１０5細胞／０．５ｍｌ）を、０．１ｍＭバナジン酸塩の存在下、ペプチド２を６００μｇ／ｍｌ入れた又は入れない、タイロード緩衝液中で、３７℃で１時間インキュベートした。細胞は、３７℃、２０分間のインキュベートで、タイロード緩衝液に溶解した５μｇ／ｍｌの化合物４８／８０（Ｓｉｇｍａ）又はＨ2Ｏ2／ＶＯ3によって誘発された。インキュベート終了時に、細胞を沈降させ、細胞抽出液を調製した。この試料をＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥに溶解し、抗ホスホ−Ｔｙｒ抗体及び抗活性化ＭＡＰＫ抗体でイムノブロットした。
【実施例２】
【００７５】
ペプチドの変更
既に開示された結果（国際特許出願公開ＷＯ００／７８３４６号）によって、数種のペプチドにおける肥満細胞の脱顆粒を阻止する能力が示されている。例えば、第１部分としてＮ末端に輸送能を有するシグナルペプチドを含み、第２部分としてＣ末端にＧαｉ3のＣ末端配列（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ）を含むように、設計、合成された新規ペプチドは、活性化肥満細胞からのヒスタミン放出を阻害した。
【００７６】
本発明は、点変異や化学的修正を導入した、数種の新規ペプチドを使用した構造と活性との関係に関する研究結果に基づくものである。これらの新規ペプチドは、以下の目的を実施するために設計し、試験された。
目的Ｉ：生体効果を高める。
目的ＩＩ：ペプチド安定性及び／又は溶解性を高める。
目的ＩＩＩ：活性に必須で、したがって失活させずで置換することができないアミノ酸残基を特定する。
目的ＩＶ：構造／機能の関係を測定する。
【００７７】
これらの目的に取り組むために、以下に示したように新規ペプチドを合成した。
【００７８】
１．ペプチドＷＡＬ００６
活性分子のコンピュータによる分子設計によって、活性抗アレルギー配列のポジション２にあるペプチドにおける１８位のアスパラギンは、ペプチド内の活性抗アレルギー部分の環状３次構造を維持するために重要であることが実証された。コンピュータによる分子設計によれば、水素結合によってこのアスパラギンは２６位のチロシン残基と結合する（国際特許出願公開ＷＯ００／７８３４６号）。この仮説を試すために、１８位のアスパラギン残基をグルタミンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ００６を形成した。
【００７９】
ペプチドＷＡＬＬ００６：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＱＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００８０】
この実施例では、Ａｓｎをグルタミンで置換すると（ペプチドＷＡＬＬ００６）、活性はあるが、効果の少ないペプチドが得られることを示した。
【００８１】
他の置換としては、このアスパラギンのセリン、アラニン、又はグルタミン酸での置換、並びに２８位のチロシンのパラ−アミノ−フェニルアラニンでの置換がある。また変異ペプチドは全て、溶解性を高めるためにＮ末端にスクシニル基を結合させて合成した。これらの置換の目的は、１８位のアミノ酸とチロシン残基との間に想定される水素結合の寄与を明らかにし、１８位に、中性、極性又は荷電アミノ酸を有するペプチドの活性を比較することである。
【００８２】
２．ペプチドＷＡＬＬ０１５
この配列は、ＷＡＬＬ００６と同一であるが、Ｎ末端にスクシニル基を有する。
【００８３】
ペプチドＷＡＬＬ０１５：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＱＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００８４】
３．ペプチドＷＡＬＬ０１１
１８位のアスパラギン残基をセリンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ０１１を形成した。
【００８５】
ペプチドＷＡＬＬ０１１：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＳＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００８６】
４．ペプチドＷＡＬＬ０１２
１８位のアスパラギン残基をグルタミン酸で置換して、ペプチドＷＡＬＬ０１２を形成した。
【００８７】
ペプチドＷＡＬＬ０１２：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＥＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００８８】
５．ペプチドＷＡＬＬ０１３
１８位のアスパラギン残基をアラニンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ０１３を形成した。
【００８９】
ペプチドＷＡＬＬ０１３：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＡＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００９０】
６．ペプチドＷＡＬＬ００５
ペプチドのＣ末端、２６位のチロシン残基を、チロシンのＯＨ基と同様に水素結合を形成できるパラ−アミノ−フェニルアラニンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ００５を形成した。
【００９１】
ペプチドＷＡＬＬ００５：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬ−パラ−アミノ−Ｆ
【００９２】
７．ペプチドＷＡＬＬ０１４
ペプチドＷＡＬＬ００５のスクシニル型である。
ペプチドＷＡＬＬ０１４：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬ−パラ−アミノ−Ｆ
【００９３】
８．ペプチドＷＡＬＬ００７
ペプチドの効能を高めるとともにペプチドの酸化の可能性を回避して、それによってペプチドの安定性を高めるために、２３位のシスチン残基をバリンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ００７を形成した。
【００９４】
ペプチドＷＡＬＬ００７：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ
【００９５】
９．ペプチドＷＡＬＬ０１６
ＷＡＬＬ００７のスクシニル型である。
ペプチドＷＡＬＬ０１６：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ
【００９６】
複合ペプチドの２つの部分の間の結合の重要性、特に輸送部分と機能部分との間の連結点としてプロリン残基の生物活性の重要性を調べるために、以下のペプチドを合成し試験した。
【００９７】
１０．ペプチドＷＡＬＬ００４
輸送部分と機能部分との接合点である１６位のプロリンをアラニンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ００４を形成した。
【００９８】
ペプチドＷＡＬＬ００４：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＡＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００９９】
プロリンによってもたらされる強固な屈曲又は回転の重要性を確認するために、３個の他のペプチドを合成し、生体活性を試験した。
【０１００】
１１．ペプチドＷＡＬＬ００８
サルコシンでプロリンを置換したものである。再度スクシニルを添加することによって、溶解性を増大することができる。
【０１０１】
ペプチドＷＡＬＬ００８：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡ−Ｓａｒ−ＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
【０１０２】
１２．ペプチドＷＡＬＬ００９
これは、以前に不活性であることが示された配列であるが（ＷＯ００／７８３４６で開示されている）、同様に活性のある抗アレルギー配列（最後の１０個のアミノ酸）を含有し、溶解性に問題がない。
【０１０３】
ペプチドＷＡＬＬ００９：ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
【０１０４】
１３．ペプチドＷＡＬＬ０１０
これは、ＷＡＬＬ００９と同じ不活性な配列であるが、この新規ペプチドは活性配列にリーダー配列を連結するプロリン残基を含む。このペプチドは、２個の部分の連結部に屈曲を形成する堅いアミノ酸（プロリン）を含めることによって活性ペプチドに変換可能かどうかを試験するために合成した。
【０１０５】
ペプチドＷＡＬＬ０１０：ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
【０１０６】
１４．ペプチドＷＡＬＬ０２３
Ｇαｉ3の活性配列の陰性対照として役立つペプチドを作製するために、ペプチド２の最後の１０個のアミノ酸をアンチセンス配列で置換した。
【０１０７】
ペプチドＷＡＬＬ０２３：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＹＬＧＣＥＫＬＮＮＫ
【０１０８】
実験結果
１）ペプチドＷＡＬＬ００６：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＱＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００６とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった。実際、このペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して基底レベルでヒスタミン分泌の阻害が生じた（図１Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００６は、アレルギー性の副作用を生じさせないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に、様々な濃度のペプチドとインキュベートした。
【０１０９】
図１Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００６は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は５６０μｇ／ｍｌで、濃度６μｇ／ｍｌでの最大阻害率は５７％であった。
【０１１０】
これらの結果によって、１８位のアスパラギン残基をグルタミンで置換すると単離した肥満細胞のヒスタミン分泌を阻害する活性ペプチドが得られることが示される。しかし、ペプチドＷＡＬＬ００６はまだ活性があるが、元の変更していないペプチド（特許出願公開ＷＯ００／７８３４６のペプチド２）よりも効果は弱い。
【０１１１】
２）ペプチドＷＡＬＬ０１５：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＱＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１５とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった（図２Ａ）。実際、このペプチドでインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでのヒスタミン分泌に対してわずかな阻害を生じた（図２Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１５は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドとインキュベートした。図２Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１５は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は３００μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は７５％であった。
【０１１２】
これらの結果によって、Ｎ末端にスクシニルを添加したＷＡＬＬ００６と同一のペプチド配列は、スクシニル化されていない型と比較してより有効な肥満細胞ヒスタミン分泌阻害剤として機能することが可能であることが示された。
【０１１３】
３）ペプチドＷＡＬＬ０１１：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＳＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１１とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった（図３Ａ）。さらに、濃度４００〜６００μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌が少し阻害された（図３Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１１は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドとインキュベートした。図３Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１１は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は１６０μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は８７％であった。
【０１１４】
これらの結果によって、ペプチド配列の１８位のアスパラギン残基をセリンで置換すると、単離肥満細胞のヒスタミン分泌を阻害する活性ペプチドが生じることが示される。
【０１１５】
４）ペプチドＷＡＬ０１２：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＥＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１２とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった（図４Ａ）。さらに、濃度４００〜６００μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌が少し阻害された（図４Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１２は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図４Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１２は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は３２０μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は９７．５％であった。
【０１１６】
これらの結果によって、１８位のアスパラギン残基をグルタミン酸で置換すると、単離肥満細胞のヒスタミン分泌を阻害する活性ペプチドが生じることが示された。
【０１１７】
５）ペプチドＷＡＬＬ０１３：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＡＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１３とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった（図５Ａ）。さらに、ペプチドでインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルで、ヒスタミン分泌が少し阻害された（図５Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１３は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図５Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１３は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は２４５μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は１００％であった。
【０１１８】
ペプチドＷＡＬＬ００６、ＷＡＬＬ０１１、ＷＡＬＬ０１２ ＷＡＬＬ０１３及びＷＡＬＬ０１５で得られた結果によって、１８位のアスパラギンを以下のグルタミン、セリン、グルタミン酸又はアラニンの１つで置換すると肥満細胞のヒスタミン分泌を有意に阻害する活性ペプチドが得られることが示された。アスパラギン、グルタミン、セリン及びグルタミン酸は、ペプチドのＣ末端に位置するチロシン残基と水素結合を形成することができるので、環状３次元構造はこの結合によって形成されることが示唆される。しかし、アラニンは水素結合を形成できなくても活性ペプチドを生じたので、おそらく他の結合もまた活性のある環状３次元構造の形成に関与及び寄与しているのものと考えられる。
【０１１９】
６）ペプチドＷＡＬＬ００５：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＮＮＬＫＥＣＧＬ−パラ−アミノ−Ｆ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００５とインキュベートしたところ、濃度を増加させるとヒスタミン分泌が生じた（図６Ａ）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００５は、アレルギー性の副作用を生じる可能性が示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻害能を試験した。この阻害能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドとインキュベートした。図６Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００５は化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌に影響を与えなかった。これらの結果によって、Ｃ末端のチロシン残基をパラ−アミノ−Ｆで置換するとペプチドの活性が妨害されることが示される。ペプチドＷＡＬＬ００５は溶解性に重大な問題があるので、観察された効果はペプチド凝集が原因かもしれない。そこで、このペプチドのスクシニル化型の活性についても試験した。
【０１２０】
７）ペプチドＷＡＬＬ０１４：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬ−パラ−アミノ−Ｆ
ペプチドＷＡＬＬ０１４は、Ｎ末端にスクシニル基が付加した以外はペプチドＷＡＬＬ００５と同一である。
【０１２１】
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１４とインキュベートしたところ、濃度を増加してもヒスタミン分泌は生じなかった（図７Ａ）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１４は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図７Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１４は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は２３０μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は８３％であった。
【０１２２】
これらの結果によって、Ｃ末端２６位のチロシン残基がパラ−アミノ−Ｆと置換した溶解性ペプチドは、生体活性を維持しており、ｃ４８／８０によって誘導されるヒスタミン放出を阻止し、それ自体副作用を有さないことが示される。
【０１２３】
これらの結果は、ペプチドが生体活性を維持するためには、芳香環及び水素結合を含むＣ末端アミノ酸が頭部を形成することが必要であることを示唆している。
【０１２４】
８）ペプチドＷＡＬＬ００７：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００７とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった。実際、ペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌の阻害が生じた（図８Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００７は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。
【０１２５】
図８Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００７は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害した。４００μｇ／ｍｌの濃度で既に強力な阻害能が示されたが、最大阻害濃度は６００μｇ／ｍｌで示された。これらの条件下では、ヒスタミン分泌のレベルは対照細胞のヒスタミン分泌の基底レベルを下回った。
【０１２６】
これらの結果によって、２３位のシステイン残基をバリンで置換すると、ペプチドが酸化する危険性は減少するうえ、ペプチド効果も減少することが示される。図８Ｂに示したように、ＩＣ50は、未修正ペプチド（特許出願公開ＷＯ００／７８３４６のペプチド２）が４００μｇ／ｍｌであるのに対して、ペプチドＷＡＬＬ００７では、２３０μｇ／ｍｌまで減少した。したがって、ペプチドＷＡＬＬ００７（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ）は肥満細胞脱顆粒の新規阻害剤となる可能性がある。
【０１２７】
これらの結果によって、２３位に位置するアミノ酸をバリンで置換すると効果の増強が示されることが明らかであろう。しかし、システイン残基をセリンと置換し、配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＳＧＬＹを形成すると、完全なペプチドの活性の損失が生じることを既に示した（特許出願公開ＷＯ００／７８３４６号）。したがって、肥満細胞脱顆粒を阻害する活性ペプチドは、ペプチド活性の必須条件として、２３位にシステイン又は酸化や化学的修飾を受けにくいバリンなどの安定な等配電子残基を含有しなければならない。
【０１２８】
９）ペプチドＷＡＬＬ０１６：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１６とインキュベートしたところ、濃度を高めてもヒスタミン分泌は生じなかった（図９Ａ）。実際、ペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌の阻害が生じた（図９Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１６は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図９Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１６は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は２９５μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は７９．６％であった。
【０１２９】
これらの結果によって、２３位のシステイン残基をバリンと置換し、ペプチドのＮ末端にスクシニル基を付加すると、肥満細胞からのヒスタミン分泌を阻止する能力を示す活性ペプチドがもたらされることが示される。
【０１３０】
複合ペプチドの２個の部分を連結する、すなわち輸送配列と機能配列とを連結する結合の種類の重要性を示すために、次の一連のペプチドを合成し、分析した。特に、輸送部分と機能部分との連結部であるプロリン残基の生体活性の重要性を評価した。
【０１３１】
１０）ペプチドＷＡＬＬ００４：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＡＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００４とインキュベートしたところ、濃度を増加させると、特にペプチド濃度が２００μｇ／ｍｌを上回ると中程度のヒスタミン分泌が生じた（図１０Ａに示す）。これらの結果によって、このペプチドはアレルギー性の副作用をほんのわずか引き起こすか、又は全く引き起こさず、肥満細胞エキソサイトーシスの有効な阻害剤として役立ち得ることが示唆された。
【０１３２】
このペプチドが化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌を阻止する能力についてもまた、試験した。肥満細胞を様々な濃度のペプチドでインキュベートした後、化合物４８／８０によってヒスタミン分泌を誘導した。
【０１３３】
図１０Ｂに示したように、試験濃度範囲ではペプチドＷＡＬＬ００４は、化合物４８／８０によって誘導されるヒスタミン分泌を阻止することはできなかった。これらの結果は、１６位のプロリン残基をアラニンで置換すると所望のペプチド活性の完全な損失が引き起こされることを示す。したがって、アミノ酸プロリン、或いはその他の天然若しくは非天然アミノ酸、又は共有結合若しくは（細胞透過に適切な）輸送部分と（肥満細胞脱顆粒の減少又は消失に効果的な）機能部分とを屈曲又は回転を生じるように共有結合する部分は、所望のペプチド活性の保持に必須であることが示唆される。例としては、この位置のプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸又はＮ−メチル化アミノ酸、２重結合又は３重結合などが挙げられる。
【０１３４】
プロリンに加えて、適切な立体構造をもたらす部分の具体例には、サルコシンなどのＮ−メチルアミノ酸、ヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３５】
１１）ペプチドＷＡＬＬ００８：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡ−Ｓａｒ−ＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００８とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった。実際、ペプチドでインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌の阻害が生じた（図１１Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００８は、アレルギー性の副作用を生じないことが示された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図１１Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００８は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は２２０μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌで最大阻害率は９８．７％であった。
【０１３６】
これらの結果によって、ペプチド配列の１６位のプロリン残基をプロリン残基に類似したサルコシンと置換するとペプチド主鎖に立体構造の拘束が導入され、単離された肥満細胞のヒスタミン分泌を阻害する活性ペプチドが生じることが示される。
【０１３７】
１２）ペプチドＷＡＬＬ００９：ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００９とインキュベートしたところ、濃度を増加させるとペプチド濃度の関数としてヒスタミン分泌が生じた（図１２Ａ）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００９は肥満細胞の有効な分泌促進物質であり、したがってアレルギー性の副作用を生じる可能性があることが示された。このペプチドはまた、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌を阻止する能力について試験した。この目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図１２Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００９は化合物４８／８０誘導のヒスタミン放出を阻害しなかった。
【０１３８】
これらの結果によって、ヒトインテグリンβ３のシグナル配列のリーダーモチーフ、及びＧαｉ3のＣ末端配列を含み、これらの２部分を結合するプロリン残基を有さないペプチドＷＡＬＬ００９は不活性であることを示した以前の結果（ＷＯ００／７８３４６のペプチド１）が確実となった。
【０１３９】
１３）ペプチドＷＡＬＬ０１０：ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００１０とインキュベートしたところ、濃度を増加させるとペプチド濃度の関数としてヒスタミン分泌が生じた（図１３Ａ）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１０は肥満細胞の有効な分泌促進物質であり、したがってアレルギー性の副作用を生じる可能性があることが示された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図１３Ｂに示したように、ペプチドＷＡＬＬ０１０は化合物４８／８０によって誘導されるヒスタミン放出を弱く阻害することが示され、濃度２００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は１６．７％であった。
【０１４０】
これらの結果は、輸送部分と機能部分との間の連結部分にプロリン残基を付加すると、それ自体肥満細胞の分泌促進活性を示す不活性なペプチド（ＷＡＬＬ００９）を化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌を阻害できる活性ペプチドに変換できることを示す。この場合、（ペプチドＷＡＬＬ０１０で示したように）ヒスタミン分泌を阻害する活性配列の能力はリーダー配列の分泌促進活性によって遮蔽されて、したがって弱い阻害及び効果しか生じない可能性がある。それにもかかわらず、輸送部分と機能部分との間の結合部にプロリン残基を付加すると、ペプチド活性は有効な肥満細胞分泌促進物質からヒスタミン分泌阻害剤へと著しく変化することが明白である。
【０１４１】
１４）ペプチドＷＡＬＬ０２３：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＹＬＧＣＥＫＬＮＮＫ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで６００μｇ／ｍｌのペプチドＷＡＬＬ０２３とインキュベートしたところ、ヒスタミン分泌は生じなかった。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０２３は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図１４に示したように、ペプチドＷＡＬＬ０２３は化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に影響を及ぼさなかった。
【０１４２】
これらの結果によって、Ｇｉ3の不活性な配列（アンチセンス配列）を含むペプチドは、化合物４８／８０によって誘導されるヒスタミン分泌を阻害できないことが示され、化合物４８／８０によって誘導されるヒスタミン放出の阻止は特異的で、Ｇｉ3活性化に左右されることが示される。
【０１４３】
１５）蛋白質キナーゼによる遅延型炎症反応の阻害
基本的な分泌促進物質に曝露した後、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を本発明のペプチドが特異的に阻害できることを示す実験を実施した。精製したインタクトな肥満細胞を６００μｇ／ｍｌのペプチド２とインキュベートし、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を確認した。その結果、百日咳毒素感受性Ｇｉ3を直接活性化する基本的な分泌促進物質である化合物４８／８０によって誘導されるＰＴＫ及びＭＡＰＫ活性を、ペプチド２が阻害することが示された（図１５Ａ及び１６Ａ）。対照的に、ペプチド２は、蛋白質チロシンホスファターゼを阻害することによって、百日咳毒素非感受性で、蛋白質チロシンのリン酸化を刺激するＨ2Ｏ2／ＶＯ3誘導性の蛋白質チロシンキナーゼ及びＭＡＰＫの活性化を阻害しなかった（図１５Ｂ及び１６Ｂ）。
【０１４４】
これらの結果は、ペプチド２は、ヒスタミン放出に加えて、基本的な分泌促進物質によって誘導されるＰＴＫ及びＭＡＰＫの活性化を阻害することを示す。これらの蛋白質キナーゼの活性化は、ロイコトリエン及びプロスタグランジンのデノボ合成など遅延型炎症反応の活性化をもたらす重要な事象として以前に示されている。したがって、我々の結果は、このペプチドはまた、ロイコトリエン及びプロスタグランジンなどの炎症伝達物質のデノボ産生に寄与する経路も阻害することを示す。我々はまた、ペプチド２は、Ｇｉ3活性化に左右され得る百日咳毒素感受性のＰＴＫ及びＭＡＰＫの特異的活性化を阻害することを示した。
【０１４５】
ペプチドＷＡＬＬ００４、ＷＡＬＬ００８、ＷＡＬＬ００９及びＷＡＬＬ０１０によって示された前述の結果は、リンカーが本発明の重要な要素で、それによってリンカーは分子の２つの部分の連結部又はその近傍に立体構造上の拘束を生じさせ、生体活性単位を生じさせることを裏付けている。したがって、第１部分は、リンカー又は直接の結合によって第２部分に結合しなければならず、リンカー等は屈曲又は回転を形成して立体構造上の拘束を生じるものでなければならない。例としては、プロリン若しくはプロリン様物質、サルコシンなどのＮ−メチルアミノ酸、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
表１にｉｎ ｖｉｔｒｏ系で得られた結果をまとめて示す。
【０１４６】
【表１】
【実施例３】
【０１４７】
本発明による処置のｉｎ ｖｉｖｏでの効果確認試験
本発明のペプチドがｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力について、アレルゲンとして化合物４８／８０を使用してラットの皮膚で試験した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで効果が示されたペプチドＷＡＬＬ００７、ＷＡＬＬ００８、ＷＡＬＬ０１２、ＷＡＬＬ０１３、ＷＡＬＬ０１４、ＷＡＬＬ０１５及びＷＡＬＬ０１６は、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的にアレルギー応答を阻止することが示された。
【０１４８】
実験方法は以下に記載する。
【０１４９】
（材料及び方法）
ＣＲラットの腹部の体毛を電気バリカンと脱毛クリームで注意深く除去した。各動物の腹部領域を、ペンで印を付けて６等分した。各領域をペプチド処理するか、又は対照として使用した。以下のようにペプチドを皮内注射した。すなわち、２７ゲージ滅菌針を使用して異なる濃度のペプチド溶液２０μｌ（ＤＤＷによる１０％ＤＭＳＯ溶液に溶解）を指示した腹部領域に皮内注射した。
【０１５０】
ペプチドを適用してから０．５時間、又は１時間後に皮膚試験を実施した。皮膚試験は、アレルゲン（ＤＤＷに溶解した、０．１ｍｇ／ｍｌ化合物４８／８０）又はＤＤＷ単独（溶媒）２０μｌを２７ゲージ滅菌針を使用して腹部皮膚の印をした各部位の中央に皮内注射することによって実施した。アレルギー応答は、アレルゲン又は溶媒処理に応じて生じた膨疹の輪郭をマーカーペンで描いて観察した。
【０１５１】
皮膚試験の結果を定量するために、マーカーペンの印を接着テープで紙に移した。膨疹領域の輪郭を描き、コンピュータソフトウェア（ＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ）で算出した。
【０１５２】
（実験結果）
試験ペプチドを局所適用した後、化合物４８／８０又は生理食塩水の注射に応じて生じた膨疹の領域を記録する。
【０１５３】
表２〜８は、各試験ペプチドを皮内注射して０．５時間後又は１時間後に注射した化合物４８／８０又はＤＤＷに応じて生じた膨疹領域の平均を示した表である。各ペプチドについて、２種類の用量、２０μｇ及び２００μｇについて試験した（それぞれ、１ｍｇ／ｍｌ又は１０ｍｇ／ｍの保存溶液２０μｌを注射した）。処理それぞれについて膨疹領域の平均を算出し、スチューデンドＴ検定を使用して結果の有意性を調べた。
【０１５４】
表２
表２に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ００７を皮内注射することによって用量に依存してアレルギー反応が抑えられ、アレルギー誘導の０．５時間又は１時間前に投与すると有意に阻害できることを示す。したがって、これらの結果は、ペプチドＷＡＬＬ００７はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有することを示している。
【０１５５】
表３
表３に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１６を皮内注射することによって用量に依存して化合物４８／８０誘導性のアレルギー反応が抑えられ、アレルギー誘導の０．５時間又は１時間前に投与するといずれも有意に阻害できることを示す。したがって、これらの結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１６はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有することを示している。
【０１５６】
表４
表４に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ００８を皮内注射することによって用量に依存してアレルギー反応が抑えられ、アレルギー誘導の０．５時間前に投与すると有意に阻害できることを示す。したがって、これらの結果は、ペプチドＷＡＬＬ００８はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有することを示している。
【０１５７】
表５
表５に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１２を皮内注射することによって用量に依存して化合物４８／８０誘導性のアレルギー反応が抑えられ、アレルギー誘導の０．５時間前に投与すると有意に阻害できることを示す。したがって、これらの結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１２はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有することを示している。
【０１５８】
表６
表６に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１３の皮内注射は、アレルギー反応を誘導する０．５時間前に適用すると１ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度で化合物４８／８０誘導性のアレルギー反応を有意に抑えることを示す。したがって、ペプチドＷＡＬＬ０１３はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有する。
【０１５９】
（表７に示した）代表的実験は、ペプチドＷＡＬＬ０１５を皮内注射することによってｉｎ ｖｉｖｏで化合物４８／８０誘導性のアレルギー反応が阻止されることを示す。ペプチドＷＡＬＬ０１５は、アレルギー誘導を誘導する０．５時間前に適用すると、１及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度でアレルギー反応を抑えた。
【０１６０】
表８に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１４を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、アレルギー反応を誘導する０．５時間前に適用した場合に、化合物４８／８０が惹起したアレルギー反応を有意に抑制したことを示す。対照的に、化合物４８／８０の１時間前に適用すると、有意な阻害は示されなかった（データは示していない）。したがって、ペプチドＷＡＬＬ０１４はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有する。
【０１６１】
それぞれのペプチドを単独で皮内注射すると、皮膚のアレルギー反応を刺激する効果は発揮されず、したがって、各化合物はそれ自体ではアレルギー性がない。このことは、注目すべき点である（表２〜８参照のこと）。
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【０１６２】
前記のｉｎ ｖｉｖｏの結果は、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を裏付け、本発明の活性ペプチドは皮膚のアレルギー反応などｉｎ ｖｉｖｏのアレルギー反応をまた阻止する能力を有することを示している。
【実施例４】
【０１６３】
投与の方法及び組成物
本発明のペプチド、及びその相同体又は関連化合物は、以後「本発明の治療剤」と称するが、当業界で周知の様々な投与経路によって被験対象に投与することができる。以後、「治療剤」という用語には、既に定義されたペプチド、特に本明細書で実例を挙げたペプチド及び／又はそれらの相同体、類似体若しくは擬似体、又は既に定義されたものと実質的に同様の効果を有する生物学的に活性な物質が含まれる。
【０１６４】
以後、「被験対象」という用語は、治療剤を投与するヒト又はより下等な動物を意味する。たとえば、投与は、局所的（眼動脈内、膣内、直腸内、鼻腔内及び吸入によって）、経口的、又は非経口的、たとえば点滴又は腹腔内、皮下、又は筋肉内注射によって実施することが可能である。
【０１６５】
局所投与用製剤としては、ローション、軟膏、ジェル、クリーム、座剤、滴剤、液剤、噴霧剤及び粉末剤を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。従来の製薬上の担体、水性、粉末状若しくは油性の基剤、増粘剤などが必要とされ、又は望まれることがある。
【０１６６】
経口投与用組成物としては、粉末剤若しくは顆粒剤、水若しくは非水性溶媒による液剤若しくは懸濁剤、サシェ、カプセル剤又は丸剤を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１６７】
非経口投与用製剤としては、緩衝剤、希釈剤及びその他の適切な添加物をも含めることができる滅菌水性溶液を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【０１６８】
用量は、症状の重症度及び治療剤に対する被験対象の反応性によっても左右される。当業者であれば、容易に最適用量、投与方法及び反復割合を決定することができる。
【実施例５】
【０１６９】
アレルギー症状の治療方法
前述のように、本発明の治療剤は肥満細胞の脱顆粒を阻止し、それによってアレルギー症状を予防及び／又は緩和するアレルギー過程の効果的な阻害剤であることが示された。以下の実施例により、本発明の治療剤でアレルギー症状を治療する方法の一例を例示するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１７０】
この方法には、前述の実施例４で記載した製薬上許容される担体に入れた治療剤を治療すべき被験対象に投与する段階が含まれる。この治療剤は、効果的な投与方法によって、好ましくは予め決定した終了点に達するまで、たとえば被験対象のアレルギー状態の症状がなくなるまで、又は被験対象の症状などの出現が予防されるまで投与される。
【０１７１】
本発明の治療剤が有用なアレルギー症状としては、アレルギー性鼻炎、目の刺激又はアレルギー反応、アレルギー誘発性発疹又はその他の皮膚刺激若しくは炎症を含めたあらゆる種類の皮膚のアレルギー反応、急性蕁麻疹、乾癬、心因性又はアレルギー性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛、及び多発硬化症など自己免疫疾患を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【実施例６】
【０１７２】
本発明の治療複合体の製造方法
本発明の治療複合体は、様々な方法で製造することができる。たとえば、治療複合体の第１部分及び第２部分の少なくとも１つにペプチドが含まれる場合、又は治療複合体全体がペプチドの場合、このようなペプチドは当業界で周知のペプチド合成方法によって製造することができた。
【０１７３】
また、このようなペプチドは当技術分野で周知の分子生物学用の研究技術によってシグナル配列と生体活性部分とを結合することによって生成することができる。
【０１７４】
非限定的実施例として例示する目的で、Ｎ末端のペプチド透過配列と、好ましくは最後の１０個のアミノ酸を含むＧαt又はＧαi3のＣ末端とを特徴とする組換え融合蛋白質を、細菌で産生するために調製することができた。この目的のために、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、精製する。配列を確認した後、これらのＤＮＡ配列を、適切なベクター中で、連結、クローニングした。得られた組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉで発現し、細菌抽出物から組換え蛋白質を精製した。
【実施例７】
【０１７５】
立体構造分析及びコンピュータプロトコール
（立体構造のサンプリング）
１０残基のペプチドに可能な立体構造全てを完全に列挙することは実際的ではないので、分子の立体構造空間の代表的なサンプルを作製する目的で、サンプリング方法を適用する必要がある。多くの方法が分子立体構造サンプリングに利用できるが、それぞれ利点と限界を有している。本発明の研究に採用したサンプリング方法は、生理学的ｐＨで適当な時間ペプチドが最も安定な立体構造をとる傾向があることに基づいている。この目的を実現するために、２段階サンプリング方法を適用した。第１に、１０００Ｋでの高温分子動力学軌跡（high temperature molecular dynamics trajectory）によって立体構造をサンプリングする。次に、高温で採取した各立体構造を、分子動力を利用しながら徐々に３００Ｋまでアニール処理する。冷却段階の後、各立体構造のエネルギーを直接最小化によって消滅させる。アニールして、最小化された立体構造を、その分子の立体構造サンプルとする。徐々にアニールすることによって、得られる立体構造が実際上３００Ｋ多様体により決定され（すなわち、３００Ｋで影響されやすい）、その一方、高温でのサンプリングにより、高エネルギー障壁を超えることを可能とすることが保証される。
【０１７６】
技術的には、各サンプリング方法は、１０００Ｋでの５００ｐｓ分子動力学軌跡（molecular dynamics trajectory）（２ｆｓのタイムステップを使用して刺激）で開始する。立体構造は、１ｐｓ毎の高温軌跡（high temperature molecular trajectory）で採取して、全部で５００個の立体構造が得られる。次に短時間の分子動力学軌跡（molecular dynamics trajectory）（１ｆｓのタイムステップで刺激）を適用し、各高温立体構造を３００Ｋまで（温度は１００Ｋ段階で減少）冷却する。冷却相後、各構造をｔｏｔａｌ ｇｒａｄｉｅｎｔが０．０１に達するまで、２００の最大傾斜法段階とその後の調整済基本的ニュートン−ラファーソン法（ＡＢＮＲ）最小化段階の組み合わせ方法によって最小化する。分子動力学的表示及び様々なエネルギー計算は、ＣＨＡＲＭＭプログラム及びＣＨＲＭＭ ａｌｌ ａｔｏｍ ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄで実施した。明確な水分子は含まれておらず、エネルギーカットオフは適用せず、距離依存性誘電率を使用した。立体構造の試料それぞれにおいて、最もエネルギーの低い立体構造を配列の最も安定な立体構造を表すために選択した。
【０１７７】
分子系
１０残基ペプチド類似体４個を調べた。これらのペプチドは中性のＮ末端及び負に荷電したＣ末端を備えていた。サンプリング方法で使用したペプチドの最初の立体構造は全て、完全に伸長した立体構造であった。しかし、ペプチドｃとペプチドｂの差及びペプチドｄとペプチドａの差はほんの１残基なので、他のサンプリングをペプチド３及び４に適用した。ペプチドｃ及びｄに対するこれらの他のサンプリングは、それぞれペプチドｂ及びａの最も安定な立体構造に基づいた。
【０１７８】
溶媒化の影響はペプチド１においてのみ調べた。このシミュレーションは、ＣＨＡＲＭＭ分子動力学プログラムを使用して実施した。このシミュレーションではタイムステップ１ｆｓ、ＳＨＡＫＥによって水素原子の結合を束縛、誘電率ε＝１、及びエネルギーカットオフ１５Åを使用した。確率結合条件を使用して、ペプチドを１４Å球体のＴＩＰ３水分子に包埋した。水球体を２段階で添加し、いずれにも水分子の無作為な方向での平衡化水球体のオーバーレイと、その後の３００Ｋでの２０ｐｓ平衡化が含まれる。この刺激では、第１段階で３０５個の水分子をモデルに添加し、第２段階で６個の水分子を添加して、合計３１１個の水分子を生じた。この刺激では原子の総数（ペプチド及び水）が１０９９個であった。
【０１７９】
これらのコンピュータの方法に基づいて、抗アレルギー活性を有するペプチドは環状立体構造を有し、伸長した、又は直鎖状の立体構造は不活性であることが示された。さらに、複合ペプチドの分析によって、活性種は輸送に適切な部分と抗アレルギー部分との連結部又は近傍に屈曲又は回転があることが示される。
【０１８０】
ＮＭＲ技術に基づいた立体構造分析を確実にする立体構造測定は、当業界で公知の通りに実施する。
【０１８１】
本発明をその特定の実施形態に関して説明したが、多くの代替、変更及び変形を当業者が理解できることは明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲に含まれるこのような代替、変更及び変形は全て包含されるものとする。
【０１８２】
（参考文献）
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Ａｒｉｄｏｒ Ｍ．ａｎｄ Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｒ．（１９９０）．「ネオマイシンは関連するＧＴＰ結合蛋白質を直接活性化する肥満細胞の有効な分泌促進物質である。（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ ｏｆ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａ ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ．）」Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：２８８５〜２８９１。
Ａｒｉｄｏｒ Ｍ．，Ｒａｊｍｉｌｅｖｉｃｈ Ｇ．，Ｂｅａｖｅｎ Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｒ．（１９９３）．「ヘテロ３量体Ｇ蛋白質Ｇi3によるエキソサイトーシスの活性化。（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇi3．」）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１５６９〜１５７２。
Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ Ｊ．，Ｔｏｍｉｏｋａ Ｍ．，Ｓｔｅａｄ Ｒ．，Ｅｒｎｓｔ Ｐ．，Ｊｏｒｄａｎａ Ｍ．，Ｇａｕｌｄｉｅ Ｊ．，Ｄｏｌｏｖｉｃｈ Ｊ．ａｎｄ Ｄｅｎｂｕｒｇ Ｊ．（１９８７）．「様々な炎症過程における肥満細胞の関与。（Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．）」Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３５：Ｓ５〜Ｓ８。
Ｃｈａｈｄｉ Ａ．，Ｍｏｕｓｌｉ Ｍ．ａｎｄ Ｌａｎｄｒｙ Ｙ．（１９９８）．「Ｇ蛋白質又は細胞表面での肥満細胞エキソサイトーシス作用のサブスタンスＰ関連阻害剤。（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ−ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｃｔ ｏｎ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｒ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ．）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４１、３２９〜３３５。
Ｃｏｌｕｍｂｏ Ｍ．，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｅ．Ｍ．，Ｋａｇｅｙ−Ｓｏｂｏｔｋａ Ａ．ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ Ｌ．Ｍ．（１９９６）．「サブスタンスＰは百日咳感受性及び蛋白質キナーゼＣ依存性機構によってヒト皮膚肥満細胞からのヒスタミン放出を活性化する。（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．）」Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐ．８１，６８〜７３。
Ｄｅｖｉｌｌｉｅｒ Ｐ．，Ｒｅｇｏｌｉ Ｄ．，Ａｓｓｅｒａｆ Ａ．，Ｄｅｓｃｏｕｒｓ Ｂ．，、Ｍａｒｓａｃ Ｊ．ａｎｄ Ｒｅｎｏｕｘ Ｍ．（１９８６）．「ヒスタミン放出及びサブスタンスＰ及びその他のほ乳類タキキニンに対するラット及びヒト皮膚の局所応答。（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｌｏｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｔｏ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３２：３４０〜３４７。
Ｅｍａｄｉ−Ｋｈｉａｖ Ｂ．，Ｍｏｕｓｌｉ Ｍ．，Ｂｒｏｎｎｅｒ Ｃ．ａｎｄ Ｌａｎｄｒｙ Ｙ．（１９９５）．「ヒト及びラットの皮膚肥満細胞：ペプチド様刺激に対する応答におけるＧ蛋白質の関与。（Ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｒａｔ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｅｐｔｉｄｅｒｇｉｃ ｓｔｉｍｕｌｉ．）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２７２，９７〜１０２。
Ｅｎｎｉｓ Ｍ．．，Ｐｅａｒｃｅ Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｗｅｓｔｏｎ Ｐ．Ｍ．（１９８０）．「ポリリジンによって誘発された肥満細胞からのヒスタミン放出の研究。（Ｓｏｍｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｆｒｏｍ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ．）」Ｂｒ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７０：３２９〜３３４。
Ｆｏｒｅｍａｎ Ｊ．Ｃ．（１９８７ａ）．「神経ペプチド及びアレルギーの病因（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ．）Ａｌｌｅｒｇｙ ４２：１〜１１。
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Ｇｏｌｄｂｅｒｇ Ａ．，Ｋｏｒｚｅｔｓ Ｚ．，Ｂｅｒｎｈｅｉｍ Ｊ．Ａｎｄ Ｍｅｋｏｒｉ Ｙ．Ａ．（１９９１）．「慢性腎不全患者のヒスタミン、化合物４８／８０及びコデインに対する皮膚応答。（Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ，ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０ ａｎｄ ｃｏｄｅｉｎｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ．）Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ ６７： ５２５〜５２８。
Ｇｏｍｐｅｒｔｓ Ｂ．Ｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｅｒ Ｙ．，Ｋｏｆｆｅｒ Ａ．，Ｌｉｌｌｉｅ Ｔ．Ｈ．Ｗ．，Ｔａｔｈａｍ Ｐ．Ｅ．Ｒ．ａｎｄ Ｗｈａｌｌｅｙ Ｔ．Ｄ（１９９１）．「肥満細胞のエキソサイトーシス分泌を制御する細胞内機構（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｅｘｏｃｙｔｏｔｉｃ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ．）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４：３８〜４６。
Ｈａｗｉｇｅｒ Ｊ．１９９７．「細胞内シグナリングを遮断する機能性ペプチドの細胞輸送。（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｐｏｒｔ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｂｌｏｃｋ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１８９〜１９４。
Ｋｉｖｉｔｙ Ｓ．，Ｓｎｅｈ Ｅ．，Ｇｒｅｉｆ Ｊ．，Ｔｏｐｉｌｓｋｙ Ｍ．ａｎｄ Ｍｅｋｏｒｉ Ｙ．Ａ．（１９８８）．「食品関連運動誘導性蕁麻疹血管浮腫患者における化合物４８／８０に対する皮膚応答における食品及び運動の影響。（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆｏｏｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｘｅｒｃｉｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｕｔｒｉｃａｒｉａ−ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ．）」Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１１５５〜１１５８。
Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ Ｌ．Ｍ（１９９３）．「アレルギー及び免疫系。（Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．）」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６９：１１６〜１２４。
Ｌｉｎ Ｙ．Ｚ．，Ｙａｕ Ｓ．Ｙ．，Ｖｅａｃｈ Ｒ．Ａ．，Ｔｏｒｇｅｒｓｏｎ Ｔ．Ｒ ａｎｄ Ｈａｗｉｇｅｒ Ｊ．（１９９５）．「細胞膜透過性モチーフ及び核局在配列を含有する合成ペプチドによる転写因子ＮＦ−ｋＢの核移行の阻害。（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＮＦ−ｋＢ ｂｙ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｍｏｔｉｆ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５〜１４２５８。
Ｌｉｕ Ｘ．Ｙ．，Ｔｉｍｍｏｎｓ Ｓ．，Ｌｉｎ Ｙ．Ｚ．ａｎｄ Ｈａｗｉｇｅｒ Ｊ．（１９９６）．「細胞透過性ペプチド類似体を使用することによるインテグリンβ３の細胞質尾部の機能的輸送配列の同定。（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ β３ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ．）Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１８１９〜１１８２４。
Ｍｏｕｓｌｉ Ｍ．，Ｈｕｇｌｉ Ｔ．Ｅ．Ｌａｎｄｒｙ Ｙ．ａｎｄ Ｂｒｏｎｎｅｒ Ｃ．（１９９４）．「ヒト皮膚及びラット腹腔肥満細胞活性化におけるペプチド性経路。（Ｐｅｐｔｉｄｅｒｇｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ａｎｄ ｒａｔ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．）」Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２７：１〜１１。
Ｐｅａｒｃｅ Ｆ．Ｌ．，Ｋａｓｓｅｓｓｉｎｏｆｆ Ｔ．Ａ．，Ｌｉｕ Ｗ．Ｌ．（１９８９）．「神経ペプチドによって誘導されたヒスタミン放出の特性：アレルギー及び炎症におけるペプチド−肥満細胞相互作用の関係の意味。（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．）」Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８：１２９〜１３１。
Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ Ａ．（１９９６）．「親水性化合物の細胞への導入。ペプチド類似体からの教え。（Ｇｅｔｔｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｏｍｅｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：６２９〜６３４。
Ｒｏｊａｓ Ｍ．，Ｙａｕ Ｓ．Ｙ．ａｎｄ Ｌｉｎ Ｙ．Ｚ．（１９９６）．「リン酸化上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体に類似した細胞透過ペプチドによる無傷細胞のＥＧＦ刺激性Ｒａｓ活性化の制御。（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＥＧＦ）−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）」Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、２７４５６〜２７４６１。
Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｒ．（１９９３）．「肥満細胞エキソサイトーシスのシグナル伝達経路。肥満細胞及び好塩基細胞の免疫薬理学。（Ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂａｓｏｐｈｉｌｓ．）」
Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｒ．，Ｂｅｎ−Ｎｅｒｉａｈ Ｚ．，Ｐｅｃｈｔ Ｉ．，Ｔｅｒｒｙ Ｓ．ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｓ．（１９８３）．「ニューロテンシン断片の肥満細胞脱顆粒能力における構造−活性の関係（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．）」Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍ．２２：１９７〜２０１。
Ｓｈｅｆｌｅｒ Ｉ．，Ｔａｕｂｅ Ｚ．，Ｍｅｄａｌｉａ Ｏ．ａｎｄ Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｒ．（１９９８）．「基本的分泌促進物質は新規蛋白質キナーゼＣ及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ依存性機構によって肥満細胞で蛋白質チロシンリン酸化及びアラキドン酸の放出を活性化する。（Ｂａｓｉｃ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３４６８〜３４７８。
Ｓｕｓｓｍａｎ Ｇ．Ｌ．，Ｈａｒｖｅｙ Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈｏｃｋｅｔ Ａ．Ｌ（１９８２）．「２種類の測定技術を使用した皮膚試験応答の評価。（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．）」Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ ４８：７５〜７７。
Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ Ｔ．Ｃ．（１９９６）．「肥満細胞：神経免疫物質内分泌の主役（ Ｔｈｅ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ：ａ ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｍａｓｔｅｒ ｐｌａｙｅｒ．）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ．１８：１〜２１。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００６の用量に対する応答を示した図である。
【図２】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１５の用量に対する応答を示した図である。
【図３】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１１の用量に対する応答を示した図である。
【図４】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１２の用量に対する応答を示した図である。
【図５】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１３の用量に対する応答を示した図である。
【図６】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００５の用量に対する応答を示した図である。
【図７】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１４の用量に対する応答を示した図である。
【図８】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００７の用量に対する応答を示した図である。
【図９】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１６の用量に対する応答を示した図である。
【図１０】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００４の用量に対する応答を示した図である。
【図１１】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００８の用量に対する応答を示した図である。
【図１２】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００９の用量に対する応答を示した図である。
【図１３】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１０の用量に対する応答を示した図である。
【図１４】インタクト肥満細胞からの化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関するペプチドＷＡＬＬ０２３の用量に対する応答を示した図である。
【図１５】化合物４８／８０（Ａ）又はＨ2Ｏ2／ＶＯ3（Ｂ）、続いてペプチド２の処理によって誘導された蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）活性化を示した図である。
【図１６】化合物４８／８０（Ａ）又はＨ2Ｏ2／ＶＯ3（Ｂ）、続いてペプチド２の処理によって誘導されたマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を示した図である。
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規な抗アレルギー複合体分子を開示し、特に、細胞透過能を有する第一の部分と、肥満細胞脱顆粒、特に、肥満細胞から分泌されるヒスタミンなどのアレルギー伝達物質を減少又は消失させることができる第２部分とを含み、屈曲又は回転を形成することによって立体構造の拘束を生じさせるリンカー又は直接結合で、第１部分が第２部分に連結された、ペプチド分子又はペプチド様分子を開示する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アレルギー性鼻炎、喘息、蕁麻疹及び血管浮腫などのアレルギー性疾患は、臨床に携わる医師が最もよく遭遇する疾患である。アレルギーとは、活性化した肥満細胞から放出された広範囲の生物学的に活性な物質が組織炎症及び機能不全を引き起こす疾患のことである。本質的には、いかなるアレルギー反応も、１以上の標的器官において組織障害を引き起こすことがある（たとえば、Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、１９９３を参照のこと）。
【０００３】
細胞レベルにおいて、肥満細胞は、アレルギー反応の重要な媒介物であり、炎症反応伝達物質を貯蔵する５００個から１０００個の顆粒が詰まっている。これらには、ヒスタミンなどの血管作用伝達物質、走化性物質及び蛋白分解酵素が含まれる。さらに、肥満細胞が活性化された後、いくつかの伝達物質が新たに生じ、放出される。これらには、ロイコトリエン及びプロスタグランジンなどアラキドン酸代謝物及びいくつかの多機能性サイトカインが含まれる。肥満細胞から生じた因子はまた、好酸球、好中球及び単核細胞など他の炎症細胞を動員し活性化させる。したがって、肥満細胞から生じた伝達物質は、アレルギー反応に関連する、痒み、腫脹、咳及び気道内閉塞の症状を誘発するために必要な特性を全て備えている（Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ他、１９８７）。これらの伝達物質は、肥満細胞内のいくつかの異なる経路を経るプロセスに応じて放出される。したがって、アレルギー及び関連する炎症状態を効果的に治療するためには、アレルギー経路のいずれかの箇所を妨害しなければならない。
【０００４】
アレルギーに対する現在の治療薬としては、ヒスタミンの生体活性を遮断するＨ1及びＨ2ブロッカーがある。クロロフェニルアミン、アザチジン、ケトチフェン、ロラチジンなどがその例である。しかし、抗ヒスタミン薬は、ヒスタミンと一緒に放出される他の伝達物質によって生じる炎症反応を妨げることができない。したがって、抗ヒスタミン薬は、アレルギーに対して信頼性の高い防護をもたらすことができない。
【０００５】
アレルギーのより良い治療法は、肥満細胞の脱顆粒を阻害することによって分泌過程を遮断することである。現在この目的で有用な薬剤としては、ヒドロコルチゾン及びクロモグリク酸二ナトリウムがある。しかし、クロモグリク酸二ナトリウムは全ての種類のヒスタミン分泌を阻害することはできず、常に完全な効果があるわけではない。他方、ステロイド剤は肥満細胞の脱顆粒の遮断に効果的であるが、多くの許容しがたい副作用を有する。したがって、重大な副作用を伴わないで肥満細胞の脱顆粒を防ぐことができ、それ故、神経炎症（詳細は以下を参照のこと）などのアレルギーに関連した臨床症状の発症を予防若しくは著しく減少することができる治療薬は、アレルギー及び関連症状の治療に非常に有用と思われる。
【０００６】
肥満細胞の脱顆粒は、少なくとも２つの異なる経路が関与する複雑なプロセスである。肥満細胞は、２つの主要経路である、ＩｇＥ（イムノグロブリンＥ）依存性経路及びＩｇＥ非依存性経路によって制御されたエキソサイトーシス（脱顆粒）プロセスにおいて顆粒成分を分泌する。ＩｇＥ依存性経路は、肥満細胞の細胞表面上に存在するＩｇＥに高い親和性のある受容体（Ｆc εＲＩ）が凝集することよって誘発される、免疫誘導に応答して引き起こされる。この応答は、対応抗原（アレルゲン）と細胞結合性ＩｇＥ抗体との架橋結合を必要とする。
【０００７】
ＩｇＥ非依存性経路又はペプチド作用性経路は、肥満細胞の基本的な分泌促進物質として総括的に知られるいくつかのポリカチオン化合物に応じて引き起こされる。これらの化合物としては、合成化合物４８／８０、天然に生じるポリアミン及び神経伝達物質サブスタンスＰ等の正に荷電されたペプチドがある（Ｅｎｎｉｓ他、１９８０、Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９９３、Ｃｈａｈｄｉ他、１９９８）。
【０００８】
サブスタンスＰが肥満細胞の脱顆粒を誘導する能力があることは、サブスタンスＰを含有する神経末端周辺に肥満細胞が密集して存在していることが観察されたこととともに、肥満細胞が媒介することによりサブスタンスＰが神経炎症を誘導することを示す（Ｆｏｒｅｍａｎ １９８７ａ、ｂ、Ｐｅａｒｃｅ他、１９８９）。皮膚やその他の箇所で、サブスタンスＰ等の神経伝達物質の放出による神経炎症が、急性蕁麻疹、心因性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛、多発硬化症等の様々な疾患に対する一因となることは充分確立されている（Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ １９９６の概説）。さらに、このＩｇＥ非依存性経路による脱顆粒はまた、蛇毒、蜂毒及びスズメバチ毒、細菌毒素及びアヘン剤等の特定の薬剤によって引き起こされ得る。
【０００９】
肥満細胞脱顆粒を活性化する情報伝達経路は、まだ充分に解明されてはいないが、いくつかの細胞の事象は肥満細胞が刺激された後に生じることが示されている。これらの事象としては、ＬＣ、ＰＬＤ及びＰＬＡ２等のホスホリパーゼの活性化、細胞質Ｃａ2+の上昇、並びにセリン及びチロシンキナーゼの活性化がある（Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｒ．「肥満細胞エキソサイトーシスの情報伝達経路（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ」、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＵＫ．ｐｐ．７１〜８８、１９９３に概説されている）。
【００１０】
但し、これらの過程では、ＧＴＰ結合蛋白質（Ｇ蛋白質）が関与することが充分確立されている。例えば、ＧＴＰ−γ−ＳのようなＧＴＰの非加水分解性類似体を、ＡＴＰ-4透過性肥満細胞へ導入すると、ＰＬＣ活性及び脱顆粒が刺激される。
【００１１】
これらの知見やその他の知見から、少なくとも２種の異なるＧ蛋白質が関与しており、１つはＰＬＣ及びＣａ2+活性化（Ｇp）に関与し、もう１つは直接エキソサイトーシスを調節していることが示唆されている（Ｇｏｍｐｅｒｔｓ １９９０、Ｇｏｍｐｅｒｔｓ他、１９９１、Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ １９９３の概説）。その後実際に、基本的な分泌促進物質はＧE、百日咳毒素感受性ヘテロ３量体Ｇ蛋白質と受容体依存性で直接相互作用することによってヒスタミン分泌を誘導することが示された（Ａｒｉｄｏｒ他、１９９０、Ａｒｉｄｏｒ＆Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ １９９０）。このＧ蛋白質はその後、Ｇｉ3と同定され、肥満細胞においてエキソサイトーシスをもたらすペプチド作用性経路を媒介することが明らかにされている。特に、Ｇαｉ3のＣ末端配列（ＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ）に相当する合成ペプチドは、透過可能な肥満細胞へ導入するとヒスタミンの放出を阻害することができた（Ａｒｉｄｏｒ他、１９９３）。
【００１２】
しかし、細胞膜は一般にほとんどのペプチドに対して非透過性である。したがって、細胞内の標的を対象とする治療剤としてプチドを使用するには、ペプチドが膜透過障壁を乗り越えられる特殊な機構が必要となる。
【００１３】
１つの可能なアプローチとしては、選択されたペプチドと、シグナルペプチド配列である「ｈ」領域を含む特定の疎水性配列との融合に基づくものがある。このような疎水性領域の例には、カポシ肉腫繊維芽細胞増殖因子のシグナル配列（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ、Ｌｉｎ他、１９９５、Ｒｏｊａｓ他、１９９７）及びヒトインテグリンβ3のシグナル配列（ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ、Ｌｉｕ他、１９９６、Ｈａｗｉｇｅｒ、１９９７の概説）がある。
【００１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究のみが記載され、シグナルペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの作用が示されていないが、輸送能力のあるシグナルペプチドを目的の生体活性分子に結合させることによって、その生体活性分子を細胞内に特異的に輸送することは、米国特許第５８０７７４６号に開示されている。シグナルペプチドは、複合体全体を細胞内へ輸送させ、次いで、理論的には、生体活性分子が、細胞内でその効果を発揮することができる。このような直接輸送は、治療化合物を細胞に導入するために役立つが、複合体による効能が制限されて、その生体活性分子が、殆ど又は全くその効果を発揮しないことがある。生体活性分子の効果に影響を及ぼすものとしては、不活性なハイブリッド分子を生じることがある、シグナルペプチドへの生体活性分子の結合による影響、複合体全体による細胞内での予測不能な効果、及びシグナルペプチドの存在にも関わらず生じる、細胞内への複合体全体の輸送不能がある。
【００１５】
加えて、アレルギー治療に適切な生体活性分子を同定することもまた、困難なことがある。例えば、公知の分泌遮断化合物等の非ペプチド分子を、シグナルペプチドに結合することは、困難である上に不安定な分子を生じることがある。ペプチドを、分泌遮断化合物として使用することができるが、このようなペプチドは、注意深く選択され、試験されねばならない。最後に、組織培養した細胞に透過する能力によって、必ずしもヒト又は動物被験対象における複合体の効果を予測することはできないので、完全な複合体は、試験、とりわけｉｎ ｖｉｖｏでの試験が必要である。従って、米国特許第５８０７７４６号は、開示されているのはｉｎ ｖｉｔｒｏのデータのみであるという欠点があり、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるシグナルペプチドの単独、又は複合体の一部としての効果は、解かっていない。従って、アレルギー治療用に、標的を絞った特異的かつ適切な治療薬は現在のところ入手できず、開発は、潜在的に、複雑で困難である。
【００１６】
従って、肥満細胞の脱顆粒を遮断し、それによってヒスタミンの放出を阻害するが、特異的に脱顆粒経路を標的とし、それによって副作用がほとんどないアレルギー及び関連する炎症症状を治療するための治療剤が求められており、そしてそのような治療剤を得ることは有用である。
【００１７】
今までの研究で、いくつかのペプチドについては、肥満細胞脱顆粒を遮断する能力があることが示された。例えば、第１部分としてＮ末端（下線部）に輸送に適切なシグナルペプチドを含み、第２部分としてＣ末端にＧαｉ3のＣ末端配列を含むように設計、合成された、ペプチド２と称する新規ペプチド（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ）は、活性化肥満細胞からのヒスタミンの放出を阻害した（ＷＯ００／７８３４６）。この開示された他の活性ペプチドには、
【００１８】
本発明は、上記出願で開示され、請求されたいかなるペプチドも含むものではなく、それらは、以下に開示される原理によれば、公知のペプチドであるので、本発明から明確に除外される。
【００１９】
本明細書で言及した全ての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物、特許及び特許出願が、あたかも本明細書中に組み込まれて明確に述べられたのと同様に、本明細書での言及により、それらの全体を、本明細書において援用する。さらに、本出願で参考文献を引用しても、このような参考文献を本発明の従来技術として有用であると認めたと解釈すべきものではない。
【発明の開示】
【００２０】
（発明の概要）
本発明は、アレルギー及び関連する炎症症状の特異的で直接的なターゲット治療法のための治療複合体分子であって、複合体分子を肥満細胞に輸送する能力のある第１部分と、肥満細胞脱顆粒を遮断又は有意に減少させることで、ヒスタミンの放出を遮断又は有意に減少させる第２部分とを含む分子を開示する。現在の好ましい実施形態によれば、第１部分は、複合体を肥満細胞に輸送する能力のあるシグナルペプチドを含み、一方、第２部分は、肥満細胞脱顆粒過程へのＧ蛋白質の関与を遮断できるペプチド等の生体活性分子を含む。本発明の最も好ましい実施形態では、蛋白質キナーゼ活性化によって誘導される遅延型炎症伝達物質を含む、アレルギー反応に関する炎症伝達物質を減少又は消失させ、肥満細胞からのヒスタミン分泌を阻害する。
【００２１】
本発明によれば、少なくとも、肥満細胞に分子を輸送する能力のある第１部分と、肥満細胞中で抗アレルギー効果を発揮するための第２部分とを有し、第１部分がリンカーによって第２部分に結合されている分子を含む、抗アレルギー剤が提供される。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態によれば、リンカーは共有結合である。本発明の現在のより好ましい実施形態では、この共有結合はペプチド結合である。
【００２３】
ここで、リンカーは、意外にも、第１部分と第２部分の接合部分又はその近傍で、立体構造上の拘束を生じさせるような特性のものでなければならない。リンカーとしては、直線状又は２次元的な構造で、第１部分が第２部分と接触することを妨げるものが好ましく、リンカーが、屈曲か回転を生じさせるものがより好ましい。現在の最も好ましい特定の実施形態において、立体構造の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００２４】
プロリンの他、適切な立体構造をもたらす部分の具体例としては、サルコシンなどのＮ−メチルアミノ酸、プロリンに代わるヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸があるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
第２部分は、少なくとも肥満細胞の脱顆粒を有意に減少させることによって抗アレルギー効果を発揮する。第２部分は、ペプチド、ペプチド様物質、及びポリペプチドから選択することが好ましく、ペプチド又はペプチド様物質であることがより好ましい。第１部分もまた、ペプチド又はペプチド様物質であることがより好ましい。
【００２６】
ここで、抗アレルギー活性を形成する第２部分は、環状構造を有するペプチドであることが最も好ましい。環状構造は、水素結合、イオン結合又は共有結合から成る群から選択された結合によって安定化されることが好ましい。
【００２７】
本発明の分子の抗アレルギー部分は、Ｇ蛋白質のＣ末端配列から得られたペプチドであることが好ましく、エキソサイトーシスに関与するＧ蛋白質のＣ末端配列から得られたペプチドであることがより好ましい。有用なペプチドの具体例としては、Ｇαｉ3及びＧαｔがある。本発明のペプチドの抗アレルギー部分としては、
【００２８】
本発明の範囲内には、これら配列の活性の類似体、相同体、及び環式誘導体を含む誘導体の全てが含まれる。
【００２９】
本発明の分子の輸送能を有する部分は、シグナルペプチド配列から得られたペプチドであることが好ましい。これらの有用な例には、カポシ肉腫繊維芽細胞増殖因子又はヒトインテグリンβ３のシグナルペプチド配列が含まれる。
【００３０】
本発明の特に好ましい実施形態において、この分子は、
【００３１】
本発明の範囲内には、環式誘導体に限定されることなく、これらの配列の活性類似体、相同体、及び環式誘導体を含む誘導体の全てが含まれる。特に、活性類似体は、スクシニル化誘導体などのエステルを含むことを意味するが、それだけには限定されない。
【００３２】
本発明の他の実施形態によれば、活性成分として治療有効量の抗アレルギー剤を含有するものであって、該抗アレルギー剤が、複合分子を含有し、この複合分子が、該複合分子を肥満細胞内へ輸送する能力を持つ第１部分と、肥満細胞内で抗アレルギー効果を発揮する第２部分とを含んでいる、被験対象のアレルギー症状を治療するための医薬組成物において、前記第１部分が、屈曲又は回転を形成することによって立体構造上の拘束を生じさせる、リンカー、又は直接結合によって第２部分に連結している、医薬組成物が提供される。
【００３３】
現在の最も好ましい実施形態において、立体構造上の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００３４】
本発明の他の好ましい実施形態において、この医薬組成物は、活性成分として、
【００３５】
さらに、この医薬組成物は、活性成分として、
【００３６】
本発明の範囲内には、これらの配列の全ての活性類似体、相同体及び環式誘導体が含む誘導体が含まれる。
【００３７】
本発明のさらに他の実施形態によれば、被験対象に治療有効量の抗アレルギー剤を投与する工程を含む被験対象のアレルギー症状を治療する方法であって、該抗アレルギー剤が、複合分子を含有し、この複合分子が、該複合分子を肥満細胞内へ輸送する能力を持つ第１部分と、肥満細胞内で抗アレルギー効果を発揮する第２部分とを含んでおり、該第１部分が、屈曲又は回転を形成することによって立体構造上の拘束を生じさせる、リンカー、又は直接結合によって第２部分に連結している治療する方法が提供される。
【００３８】
現在の最も好ましい特定の実施形態において、当該立体構造上の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００３９】
プロリンの他、適切な立体構造をもたらす部分の具体例としては、サルコシンなどのＮ−メチルアミノ酸、ヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸があるが、これらに限られるものではない。
【００４０】
アレルギー症状としては、アレルギー性鼻炎、被験対象の目のアレルギー反応、被験対象の皮膚のアレルギー反応、急性蕁麻疹、乾癬、心因性又はアレルギー性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛、多発硬化症から成る群から選択されることが好ましい。
【００４１】
投与経路としては、経口が好ましいが、他の投与経路として、非限定的に、鼻腔内、眼内、皮下及び非経口投与が挙げられる。治療剤は、局所投与によって投与することがより好ましく、この局所投与は、被験対象の皮膚に対して行うことが最も好ましい。本発明の他の好ましい実施形態において、治療剤は、鼻腔内又は吸入によって投与する。
【００４２】
ここで、本発明によるペプチドは、ヒスタミン放出の阻害に加えて、予想外にも、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を阻害することを明らかにしている。これらの蛋白質キナーゼの活性化は、ロイコトリエン及びプロスタグランジンのデノボ合成(synthesis de novo)等の遅延型炎症反応の活性化を導く重要な事象であることは既に実証されている。
【００４３】
従って、本発明のさらに他の実施形態によれば、被験対象に治療有効量の抗アレルギー剤を投与する工程を含む、蛋白質キナーゼ活性によって誘導される遅延型炎症応答の予防方法であって、該抗アレルギー剤は複合分子を含有し、この複合分子が、少なくとも該複合分子を肥満細胞内へ輸送する能力を持つ第１部分と、肥満細胞内で抗アレルギー効果を発揮する第２部分とを含んでおり、該第１部分は、リンカーによって第２部分と結合し、当該リンカーによって両部分の連結部又はその近傍に屈曲又は回転がもたらされている、治療方法が提供される。
【００４４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗アレルギー性ペプチドの被験対象の細胞への輸送を促進する方法であって、
（ａ）屈曲又は回転を形成するリンカー又は直接結合を介して抗アレルギー性ペプチドにペプチドからなるリーダー配列を結合させ、複合ペプチド分子又は複合ペプチド様分子を形成する工程と、
（ｂ）被験対象にこの複合ペプチド又はペプチド様分子を投与する工程と、
（ｃ）リーダー配列によって細胞内に複合体分子を輸送することで、抗アレルギー性ペプチドを細胞内に輸送する工程と、を含む方法を提供する。
【００４５】
以後、「生体活性」という用語は、生体系で効果を発揮できる分子又はその複合体を意味する。以後、「断片」又は「部分」という用語は、分子又はその複合体の部分を意味し、その部分は分子又はその複合体の全体より実質的に小さいものが含まれる。
【００４６】
以後、「アミノ酸」という用語は、他のこのような分子とペプチド結合を形成できる天然分子及び合成分子の両者を意味する。以後、「天然アミノ酸」という用語は、標準的な及び非標準的な天然アミノ酸の両者を含めた天然に生じるアミノ酸全てを意味する。以後、「標準的な天然アミノ酸」という用語は、通常蛋白質の成分として利用されるαアミノ酸を意味する。以後、「非標準的な天然アミノ酸」という用語は、ほ乳類又はほ乳類以外の真核細胞、又は原核細胞によって産生され、通常真核細胞又は原核細胞の蛋白質の成分として利用されない天然に生じるアミノ酸を意味する。以後、「合成アミノ酸」という用語は、人工的に産生され、真核細胞又は原核細胞で天然に生ぜず、前述のアミノ酸に必要な特性を満たした分子全てを意味する。以後、「ペプチド」という用語には、天然、合成又は組換え体に関わらず、いずれのアミノ酸配列の鎖も含まれる。以後、「ペプチド様物質」という用語には、合成アミノ酸及び天然アミノ酸を有する類似体を含む、実質的に機能が類似又は同様のペプチド類似体及び擬似体の両者が含まれ、ペプチド結合を、他の共有結合と置き換わることが可能なものである。
【００４７】
本発明は、添付の図面を参照して、実施例のみによって以下に説明する。
【００４８】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、少なくとも肥満細胞に複合体分子を輸送する能力を有する第１部分と、肥満細胞の脱顆粒を遮断又は有意に減少させることで、ヒスタミンの放出を遮断又は有意に減少させる第２部分と持つ分子を含有する、アレルギー及び関連炎症症状の特異的で直接的なターゲット治療のための治療用複合体分子を開示する。
【００４９】
ここで、リンカーは、本発明の重要な要素であり、それが複合分子の２つの部分の連結部又はその近傍で特定の立体構造上の拘束を付与するものでなければならないことを明示する。第１部分は、リンカー又は直接結合によって第２部分と連結し、このリンカーは屈曲又は回転を形成することによって立体構造上の拘束を形成する。現在の最も好ましい特定の実施形態において、この立体構造の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００５０】
プロリンの他、適切な立体構造を導入する部分の具体例としては、サルコシン等のＮ−メチルアミノ酸、ヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
第１部分は、一の分子であり、好ましくはペプチド又はペプチド様物質であり、より好ましくはシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、細胞膜を透過することができ、蛋白質又はペプチドの移出及び／又は移入を可能にするペプチドである。本明細書において、適切なシグナルペプチドは、蛋白質、ペプチド又はその他の分子を細胞に移入する能力を持つペプチドである。このようなシグナルペプチドは、一般的に約１０〜５０個のアミノ酸を有するのが特徴で、その大部分が一般的に疎水性であるため、疎水性の油溶性部分を備えている。シグナルペプチドはまた、複合体分子を移入する細胞タイプによって選択されることが好ましく、特定の細胞種によって産生されたシグナルペプチド、又は特定の細胞種によって産生されたペプチド及び／又は蛋白質から得られるシグナルペプチドが、複合体分子を当該細胞種に移入するために使用することができる。そのようなシグナルペプチドの例は、前述した通りであり、また、シグナルペプチドに関する教示について、本明細書中で完全に述べられたかのように組み込まれた米国特許第５８０７７４６号に開示されている。
【００５２】
第２部分は、好ましくは、肥満細胞の脱顆粒を阻止することによって、これら肥満細胞からのヒスタミンの放出を阻害して、抗アレルギー効果を発揮する分子であることが好ましい。この分子は、好ましくはペプチドであり、より好ましくは肥満細胞でエキソサイトーシスを誘導するペプチド経路を媒介することが明らかなＧαi3のＣ末端配列から得られたペプチドである。更に、第２部分は、ペプチド様物質、ポリペプチド又は蛋白質から成る群から選択される。
【００５３】
第１部分を第２部分に連結するリンカーは、共有結合であることが好ましい。第１部分及び第２部分の少なくとも１つがペプチドであるならば、この共有結合はペプチドであってよい。ここで、リンカーは、本発明の重要な要素であり、複合分子の２つの部分の連結部又はその近傍に特定の立体構造上の拘束を付与するものでなければならない。
【００５４】
第１部分は、屈曲又は回転を形成することで立体構造上の拘束を形成するリンカー又は直接結合により、第２部分に連結される。現在の最も好ましい特定の実施形態において、この立体構造上の拘束は、プロリン若しくはプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸、２重結合若しくは３重結合、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分から成る群から選択される。
【００５５】
プロリンの他、適切な立体構造を導入する部分の具体例としては、サルコシン等のＮ−メチルアミノ酸、ヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
本発明の複合体分子の連結部又はその近傍で、適切に拘束された立体構造を形成する様々な方法は、当業界において周知である。立体構造を拘束する古典的方法としては、アミノ酸を構造的に変更したり、可撓性のあるペプチド結合以外の結合を導入するものがある。その他の形式の立体構造上の制限において、アミノ酸の立体配座及び構造の変更、局所的な主鎖の変更、狭い範囲、中程度の範囲及び広範囲での環化が、本発明によるペプチドの活性立体構造を最適化するために有用である（Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１、１８９（１９８２）、Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．、２１、５１２（１９８２）、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｗ．、ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ，Ｓ．、ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．、Ｖｏｌｕｍｅ ６ ｐ．２５４（１９８４）、Ｖｅｂｅｒ，Ｄ．Ｆ．ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８、３９２（１９８５）、Ｍｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．Ｊ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０、７０（１９８９））。
【００５７】
治療上活性なペプチドは、代謝安定性を実現し、効能を高め、選択性を付与若しくは増強し、且つ生物学的利用能を制御するため、環化される。直鎖状ペプチドを環化すると、これらの重要な薬理学的特性を制御することが可能なので、当業界で知られているように、中程度及び広範囲の環化を利用して天然の生物活性ペプチドを、ペプチド様薬剤に変換することがなされた。環化はまた、立体構造の均一性を高め、立体構造の分析を容易にする構造的拘束をもたらす（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．、２１、５１２（１９８２））。さらに、構造上の硬直化と活性との関係に関する研究と、立体構造分析とを組み合わせることで、直鎖状ペプチドの生物学的に活性な立体構造についての知見が得られる。
【００５８】
本発明ではまた、アレルギーの治療方法を開示する。以後、「治療」という用語には、アレルギー状態の予防並びにアレルギー症状の実質的な軽減又は除去の両方が含まれる。本発明の治療剤が有用なアレルギー症状としては、アレルギー性鼻炎、目の炎症及びアレルギー反応、あらゆる種類のアレルゲンによって誘導される発疹又はその他の皮膚刺激若しくは炎症を含む皮膚でのアレルギー反応、急性蕁麻疹、乾癬、心因性又はアレルギー性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛、並びに多発硬化症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
このような治療は、例えば、皮膚アレルギーや皮膚アレルギー反応のために、局所的に実施することができ、そのような症状としては、非限定的に、アレルゲンとの皮膚接触による接触皮膚炎、虫さされに対する反応、及び食物を対象者が消化した後に現れる蕁麻疹等の全身性アレルゲンに対する皮膚反応を含む。選択的に及び／又は追加的に、このような治療は治療用複合体の全身投与によって実施することができる。投与経路としては経口が好ましいが、他の投与経路としては、非限定的に、鼻腔内、眼内、皮下及び非経口投与がある。他の投与経路及びそれらの適切な薬剤の処方は、以下で、より詳細に説明する。
【００６０】
既に記載したように、本発明の現在最も好ましい特定の実施形態において、第１及び第２部分は、いずれもペプチドであり、両者は、ペプチド結合によって結合している。
【００６１】
本発明において、新規なペプチドについて試験がなされ、以下のペプチドを指摘した。
既に、第１部分として明確な輸送能を持つシグナルペプチドをＮ末端に含み、第２部分としてＧαｉ3又はＧαｔのＣ末端配列をＣ末端に含むように設計、合成された特定のペプチドが、活性を有することが示されており（ＷＯ００／７８３４６）、そのようなペプチドとしては、以下に挙げるものがある。
さらに、以下のペプチドが既に合成され、不活性であることが示されている。
このペプチドは、従前ペプチド１と称されているが、本発明の新規ペプチドと比較するために、以下の本明細書中では、ＷＡＬＬ００９と表す。
【００６５】
これらの既に開示及びクレームされた公知のペプチドは、本発明から明確に除外される。
【００６６】
新規ペプチドについて、化合物４８／８０によって誘導された精製ラット腹膜肥満細胞からのヒスタミン分泌に対する阻止能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調べた。従って、このスクリーニングで活性なペプチドは、肥満細胞依存性アレルギーに有用である。このようなアレルギーには、非限定的に、肥満細胞脱顆粒が、第２部分の前記ペプチドが得られるＩｇＥ非依存性経路によって媒介されるアレルギーが含まれる。このようなアレルギーの例には、非限定的に、急性蕁麻疹、乾癬、心因性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛及び多発硬化症を含む、皮膚及びその他の場所の神経炎症が含まれる。
【００６７】
ここで、本発明の特徴を、以下の実施例により説明するが、これらは限定的なものと解釈すべきではない。当業者であれば、例示した特定の実施形態の多くの改良及び変更が本発明の範囲内で実施し得ると理解するであろう。
【実施例１】
【００６８】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのペプチドの試験
前述のような本発明のペプチドに対して、肥満細胞からのヒスタミン分泌を阻止する能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。ラット腹膜細胞及びヒト皮膚肥満細胞はいずれもＩｇＥ非依存性機構によってサブスタンスＰに応じてヒスタミンを放出することが既に示されているので、ラット腹膜肥満細胞を実験モデルとして選択した（Ｄｅｖｉｌｌｉｅｒ他、１９８６、Ｆｏｒｅｍａｎ １９８７ａ、ｂ、Ｃｏｌｕｍｂｏ他、１９９６）。また、同一のペプチド作用経路が、ラット腹膜肥満細胞及びヒト皮膚肥満細胞のいずれにも関与していることが示されている（Ｍｏｕｓｌｉ他、１９９４、Ｅｍａｄｉ−Ｋｈｉａｖ他、１９９５）。
【００６９】
化合物４８／８０は、総体的に肥満細胞の基本的な分泌促進物質であることが知られているポリカチオン化合物の１つであるため、アレルゲンとして選択した。化合物４８／８０は、ヒト肥満細胞の脱顆粒を誘導することが知られている。特に、皮膚の肥満細胞に対して非常に活性がある。化合物４８／８０は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト肥満細胞の放出能力を評価したり、慢性蕁麻疹に対する薬剤の効果を測定したり、アトピー性皮膚炎における痒み及び発赤を研究したりするための診断薬として使用されてきた（Ｋｉｖｉｔｙ他、１９８８、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ他、１９９１）。従って、化合物４８／８０が誘導するヒスタミン放出の阻害は、サブスタンスＰ、蛇毒、蜂毒、スズメバチ毒、細菌毒素、及びアヘン等の特定の薬剤などその他の基本的な分泌促進物質によって誘導されるアレルギーにも当てはまり、直接関連する。
【００７０】
次に、試験ペプチドそれぞれが、化合物４８／８０で誘導した肥満細胞脱顆粒を阻害する能力を試験した。この実験方法は以下の通りである。
【００７１】
材料及び方法
（ペプチド合成）
ペプチドは、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｌｆｅｎｂｕｔｔｅｌ、ドイツ）によって合成された。ペプチドは、固相法によって合成され、純度は＞９５％であった。正確な組成及びペプチドの純度はＨＰＬＣ、質量分析及びアミノ酸分析によって確認した。凍結乾燥したペプチドは、−２０℃で保存された。ペプチド保存溶液（Ｈ2Ｏに溶かした１０％ジメトキシスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で５ｍｇ／ｍｌとする）は実験毎に新たに調製した。
【００７２】
（肥満細胞の単離及び精製）
Ｃ．Ｒ．ラット腹腔の肥満細胞をタイロード緩衝液（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4 ０．４ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ＣａＣｌ2 １．０ｍＭ、グルコース ５．６ｍＭ、ＢＳＡ １ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ ７．２）で単離して、フィコール勾配で精製した。０．１％ＢＳＡを含有する緩衝生理食塩水に溶かした３０％フィコール４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）の緩衝剤表面に、洗浄した腹腔細胞の懸濁液を積層し、次いで１５０ｘｇで１５分間遠心した。試験管底部から回収した肥満細胞の純度は、トルイジンブルー染色によって評価したところ＞９０％であった。
【００７３】
（インタクト細胞からのヒスタミン放出の誘発）
精製した肥満細胞（１０5細胞／０．５ｍｌ、２試料）を、タイロード緩衝液中で、緩衝液又は所望濃度の指適したペプチドととともに、３７℃で２時間インキュベートした。その後、ヒスタミン放出を、タイロード緩衝液に溶かした化合物４８／８０（Ｓｉｇｍａ）０．１μｇ／ｍｌによって誘発した。化合物４８／８０とのインキュベートを、３７℃で２０分間実施した。反応は試験管を氷上に置くことによって停止させた。細胞を短時間（１２０００ｇ×２０ｓ）遠心することによって沈降させ、上清を収集した。ヒスタミン放出の量は、既に記載された通りに測定した（Ａｒｉｄｏｒ他、１９９０）。簡単に説明すると、細胞ペレットを０．１Ｎ ＮａＯＨ ０．１ｍｌを使用して溶解し、各試料の量をＨ2Ｏで０．５ｍｌに調節した。ヒスタミン含量は、Ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＴ）蛍光法を使用して測定した（Ｓｈｏｒｅ他、１９５９）。上清及び細胞溶解物の一部（０．４ｍｌ）を、Ｈ2Ｏ １．６ｍｌ、１Ｎ ＮａＯＨ ０．４ｍｌ及びメタノールに溶かした１０ｍｇ／ｍｌ ＯＰＴ ０．１ｍｌととともに、室温で４分間インキュベートした。反応は３Ｎ ＨＣｌ ０．２ｍｌを添加することによって停止させた。試料を１５０ｇで５分間遠心し、試料０．２ｍｌを９６ウェルプレートに移した。マイクロタイタープレートで、マイクロプレートリーダー（ＦＬ−６００、Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を使用してヒスタミン分光蛍光アッセイを実施した。試料を３４０ｎｍの光で励起して、４４０ｎｍで測定した。ヒスタミン放出は、各試料中の全ヒスタミン含量に対するパーセントとして算出した（上清／ペレット＋上清）。各データは、２つの試料における測定値の平均を示す。自然に放出されたヒスタミンについては、差し引いた。統計分析およびプロットは、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｌｔｄ．、ワシントン、米国）で実施した。
【００７４】
（ＰＴＫ（蛋白質チロシンキナーゼ）及びＭＡＰキナーゼの活性化）
精製した肥満細胞（（１０5細胞／０．５ｍｌ）を、０．１ｍＭバナジン酸塩の存在下、ペプチド２を６００μｇ／ｍｌ入れた又は入れない、タイロード緩衝液中で、３７℃で１時間インキュベートした。細胞は、３７℃、２０分間のインキュベートで、タイロード緩衝液に溶解した５μｇ／ｍｌの化合物４８／８０（Ｓｉｇｍａ）又はＨ2Ｏ2／ＶＯ3によって誘発された。インキュベート終了時に、細胞を沈降させ、細胞抽出液を調製した。この試料をＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥに溶解し、抗ホスホ−Ｔｙｒ抗体及び抗活性化ＭＡＰＫ抗体でイムノブロットした。
【実施例２】
【００７５】
ペプチドの変更
既に開示された結果（国際特許出願公開ＷＯ００／７８３４６号）によって、数種のペプチドにおける肥満細胞の脱顆粒を阻止する能力が示されている。例えば、第１部分としてＮ末端に輸送能を有するシグナルペプチドを含み、第２部分としてＣ末端にＧαｉ3のＣ末端配列（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ）を含むように、設計、合成された新規ペプチドは、活性化肥満細胞からのヒスタミン放出を阻害した。
【００７６】
本発明は、点変異や化学的修正を導入した、数種の新規ペプチドを使用した構造と活性との関係に関する研究結果に基づくものである。これらの新規ペプチドは、以下の目的を実施するために設計し、試験された。
目的Ｉ：生体効果を高める。
目的ＩＩ：ペプチド安定性及び／又は溶解性を高める。
目的ＩＩＩ：活性に必須で、したがって失活させずで置換することができないアミノ酸残基を特定する。
目的ＩＶ：構造／機能の関係を測定する。
【００７７】
これらの目的に取り組むために、以下に示したように新規ペプチドを合成した。
【００７８】
１．ペプチドＷＡＬ００６
活性分子のコンピュータによる分子設計によって、活性抗アレルギー配列のポジション２にあるペプチドにおける１８位のアスパラギンは、ペプチド内の活性抗アレルギー部分の環状３次構造を維持するために重要であることが実証された。コンピュータによる分子設計によれば、水素結合によってこのアスパラギンは２６位のチロシン残基と結合する（国際特許出願公開ＷＯ００／７８３４６号）。この仮説を試すために、１８位のアスパラギン残基をグルタミンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ００６を形成した。
【００７９】
ペプチドＷＡＬＬ００６：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＱＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００８０】
この実施例では、Ａｓｎをグルタミンで置換すると（ペプチドＷＡＬＬ００６）、活性はあるが、効果の少ないペプチドが得られることを示した。
【００８１】
他の置換としては、このアスパラギンのセリン、アラニン、又はグルタミン酸での置換、並びに２８位のチロシンのパラ−アミノ−フェニルアラニンでの置換がある。また変異ペプチドは全て、溶解性を高めるためにＮ末端にスクシニル基を結合させて合成した。これらの置換の目的は、１８位のアミノ酸とチロシン残基との間に想定される水素結合の寄与を明らかにし、１８位に、中性、極性又は荷電アミノ酸を有するペプチドの活性を比較することである。
【００８２】
２．ペプチドＷＡＬＬ０１５
この配列は、ＷＡＬＬ００６と同一であるが、Ｎ末端にスクシニル基を有する。
【００８３】
ペプチドＷＡＬＬ０１５：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＱＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００８４】
３．ペプチドＷＡＬＬ０１１
１８位のアスパラギン残基をセリンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ０１１を形成した。
【００８５】
ペプチドＷＡＬＬ０１１：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＳＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００８６】
４．ペプチドＷＡＬＬ０１２
１８位のアスパラギン残基をグルタミン酸で置換して、ペプチドＷＡＬＬ０１２を形成した。
【００８７】
ペプチドＷＡＬＬ０１２：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＥＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００８８】
５．ペプチドＷＡＬＬ０１３
１８位のアスパラギン残基をアラニンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ０１３を形成した。
【００８９】
ペプチドＷＡＬＬ０１３：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＡＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００９０】
６．ペプチドＷＡＬＬ００５
ペプチドのＣ末端、２６位のチロシン残基を、チロシンのＯＨ基と同様に水素結合を形成できるパラ−アミノ−フェニルアラニンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ００５を形成した。
【００９１】
ペプチドＷＡＬＬ００５：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬ−パラ−アミノ−Ｆ
【００９２】
７．ペプチドＷＡＬＬ０１４
ペプチドＷＡＬＬ００５のスクシニル型である。
ペプチドＷＡＬＬ０１４：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬ−パラ−アミノ−Ｆ
【００９３】
８．ペプチドＷＡＬＬ００７
ペプチドの効能を高めるとともにペプチドの酸化の可能性を回避して、それによってペプチドの安定性を高めるために、２３位のシスチン残基をバリンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ００７を形成した。
【００９４】
ペプチドＷＡＬＬ００７：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ
【００９５】
９．ペプチドＷＡＬＬ０１６
ＷＡＬＬ００７のスクシニル型である。
ペプチドＷＡＬＬ０１６：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ
【００９６】
複合ペプチドの２つの部分の間の結合の重要性、特に輸送部分と機能部分との間の連結点としてプロリン残基の生物活性の重要性を調べるために、以下のペプチドを合成し試験した。
【００９７】
１０．ペプチドＷＡＬＬ００４
輸送部分と機能部分との接合点である１６位のプロリンをアラニンで置換して、ペプチドＷＡＬＬ００４を形成した。
【００９８】
ペプチドＷＡＬＬ００４：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＡＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
【００９９】
プロリンによってもたらされる強固な屈曲又は回転の重要性を確認するために、３個の他のペプチドを合成し、生体活性を試験した。
【０１００】
１１．ペプチドＷＡＬＬ００８
サルコシンでプロリンを置換したものである。再度スクシニルを添加することによって、溶解性を増大することができる。
【０１０１】
ペプチドＷＡＬＬ００８：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡ−Ｓａｒ−ＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
【０１０２】
１２．ペプチドＷＡＬＬ００９
これは、以前に不活性であることが示された配列であるが（ＷＯ００／７８３４６で開示されている）、同様に活性のある抗アレルギー配列（最後の１０個のアミノ酸）を含有し、溶解性に問題がない。
【０１０３】
ペプチドＷＡＬＬ００９：ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
【０１０４】
１３．ペプチドＷＡＬＬ０１０
これは、ＷＡＬＬ００９と同じ不活性な配列であるが、この新規ペプチドは活性配列にリーダー配列を連結するプロリン残基を含む。このペプチドは、２個の部分の連結部に屈曲を形成する堅いアミノ酸（プロリン）を含めることによって活性ペプチドに変換可能かどうかを試験するために合成した。
【０１０５】
ペプチドＷＡＬＬ０１０：ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
【０１０６】
１４．ペプチドＷＡＬＬ０２３
Ｇαｉ3の活性配列の陰性対照として役立つペプチドを作製するために、ペプチド２の最後の１０個のアミノ酸をアンチセンス配列で置換した。
【０１０７】
ペプチドＷＡＬＬ０２３：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＹＬＧＣＥＫＬＮＮＫ
【０１０８】
実験結果
１）ペプチドＷＡＬＬ００６：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＱＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００６とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった。実際、このペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して基底レベルでヒスタミン分泌の阻害が生じた（図１Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００６は、アレルギー性の副作用を生じさせないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に、様々な濃度のペプチドとインキュベートした。
【０１０９】
図１Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００６は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は５６０μｇ／ｍｌで、濃度６μｇ／ｍｌでの最大阻害率は５７％であった。
【０１１０】
これらの結果によって、１８位のアスパラギン残基をグルタミンで置換すると単離した肥満細胞のヒスタミン分泌を阻害する活性ペプチドが得られることが示される。しかし、ペプチドＷＡＬＬ００６はまだ活性があるが、元の変更していないペプチド（特許出願公開ＷＯ００／７８３４６のペプチド２）よりも効果は弱い。
【０１１１】
２）ペプチドＷＡＬＬ０１５：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＱＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１５とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった（図２Ａ）。実際、このペプチドでインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでのヒスタミン分泌に対してわずかな阻害を生じた（図２Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１５は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドとインキュベートした。図２Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１５は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は３００μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は７５％であった。
【０１１２】
これらの結果によって、Ｎ末端にスクシニルを添加したＷＡＬＬ００６と同一のペプチド配列は、スクシニル化されていない型と比較してより有効な肥満細胞ヒスタミン分泌阻害剤として機能することが可能であることが示された。
【０１１３】
３）ペプチドＷＡＬＬ０１１：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＳＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１１とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった（図３Ａ）。さらに、濃度４００〜６００μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌が少し阻害された（図３Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１１は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドとインキュベートした。図３Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１１は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は１６０μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は８７％であった。
【０１１４】
これらの結果によって、ペプチド配列の１８位のアスパラギン残基をセリンで置換すると、単離肥満細胞のヒスタミン分泌を阻害する活性ペプチドが生じることが示される。
【０１１５】
４）ペプチドＷＡＬ０１２：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＥＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１２とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった（図４Ａ）。さらに、濃度４００〜６００μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌が少し阻害された（図４Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１２は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図４Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１２は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は３２０μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は９７．５％であった。
【０１１６】
これらの結果によって、１８位のアスパラギン残基をグルタミン酸で置換すると、単離肥満細胞のヒスタミン分泌を阻害する活性ペプチドが生じることが示された。
【０１１７】
５）ペプチドＷＡＬＬ０１３：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＡＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１３とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった（図５Ａ）。さらに、ペプチドでインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルで、ヒスタミン分泌が少し阻害された（図５Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１３は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図５Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１３は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は２４５μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は１００％であった。
【０１１８】
ペプチドＷＡＬＬ００６、ＷＡＬＬ０１１、ＷＡＬＬ０１２ ＷＡＬＬ０１３及びＷＡＬＬ０１５で得られた結果によって、１８位のアスパラギンを以下のグルタミン、セリン、グルタミン酸又はアラニンの１つで置換すると肥満細胞のヒスタミン分泌を有意に阻害する活性ペプチドが得られることが示された。アスパラギン、グルタミン、セリン及びグルタミン酸は、ペプチドのＣ末端に位置するチロシン残基と水素結合を形成することができるので、環状３次元構造はこの結合によって形成されることが示唆される。しかし、アラニンは水素結合を形成できなくても活性ペプチドを生じたので、おそらく他の結合もまた活性のある環状３次元構造の形成に関与及び寄与しているのものと考えられる。
【０１１９】
６）ペプチドＷＡＬＬ００５：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＮＮＬＫＥＣＧＬ−パラ−アミノ−Ｆ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００５とインキュベートしたところ、濃度を増加させるとヒスタミン分泌が生じた（図６Ａ）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００５は、アレルギー性の副作用を生じる可能性が示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻害能を試験した。この阻害能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドとインキュベートした。図６Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００５は化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌に影響を与えなかった。これらの結果によって、Ｃ末端のチロシン残基をパラ−アミノ−Ｆで置換するとペプチドの活性が妨害されることが示される。ペプチドＷＡＬＬ００５は溶解性に重大な問題があるので、観察された効果はペプチド凝集が原因かもしれない。そこで、このペプチドのスクシニル化型の活性についても試験した。
【０１２０】
７）ペプチドＷＡＬＬ０１４：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬ−パラ−アミノ−Ｆ
ペプチドＷＡＬＬ０１４は、Ｎ末端にスクシニル基が付加した以外はペプチドＷＡＬＬ００５と同一である。
【０１２１】
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１４とインキュベートしたところ、濃度を増加してもヒスタミン分泌は生じなかった（図７Ａ）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１４は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図７Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１４は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は２３０μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は８３％であった。
【０１２２】
これらの結果によって、Ｃ末端２６位のチロシン残基がパラ−アミノ−Ｆと置換した溶解性ペプチドは、生体活性を維持しており、ｃ４８／８０によって誘導されるヒスタミン放出を阻止し、それ自体副作用を有さないことが示される。
【０１２３】
これらの結果は、ペプチドが生体活性を維持するためには、芳香環及び水素結合を含むＣ末端アミノ酸が頭部を形成することが必要であることを示唆している。
【０１２４】
８）ペプチドＷＡＬＬ００７：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００７とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった。実際、ペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌の阻害が生じた（図８Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００７は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。
【０１２５】
図８Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００７は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害した。４００μｇ／ｍｌの濃度で既に強力な阻害能が示されたが、最大阻害濃度は６００μｇ／ｍｌで示された。これらの条件下では、ヒスタミン分泌のレベルは対照細胞のヒスタミン分泌の基底レベルを下回った。
【０１２６】
これらの結果によって、２３位のシステイン残基をバリンで置換すると、ペプチドが酸化する危険性は減少するうえ、ペプチド効果も減少することが示される。図８Ｂに示したように、ＩＣ50は、未修正ペプチド（特許出願公開ＷＯ００／７８３４６のペプチド２）が４００μｇ／ｍｌであるのに対して、ペプチドＷＡＬＬ００７では、２３０μｇ／ｍｌまで減少した。したがって、ペプチドＷＡＬＬ００７（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ）は肥満細胞脱顆粒の新規阻害剤となる可能性がある。
【０１２７】
これらの結果によって、２３位に位置するアミノ酸をバリンで置換すると効果の増強が示されることが明らかであろう。しかし、システイン残基をセリンと置換し、配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＳＧＬＹを形成すると、完全なペプチドの活性の損失が生じることを既に示した（特許出願公開ＷＯ００／７８３４６号）。したがって、肥満細胞脱顆粒を阻害する活性ペプチドは、ペプチド活性の必須条件として、２３位にシステイン又は酸化や化学的修飾を受けにくいバリンなどの安定な等配電子残基を含有しなければならない。
【０１２８】
９）ペプチドＷＡＬＬ０１６：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＫＮＮＬＫＥＶＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ０１６とインキュベートしたところ、濃度を高めてもヒスタミン分泌は生じなかった（図９Ａ）。実際、ペプチドとインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌の阻害が生じた（図９Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１６は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図９Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ０１６は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は２９５μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は７９．６％であった。
【０１２９】
これらの結果によって、２３位のシステイン残基をバリンと置換し、ペプチドのＮ末端にスクシニル基を付加すると、肥満細胞からのヒスタミン分泌を阻止する能力を示す活性ペプチドがもたらされることが示される。
【０１３０】
複合ペプチドの２個の部分を連結する、すなわち輸送配列と機能配列とを連結する結合の種類の重要性を示すために、次の一連のペプチドを合成し、分析した。特に、輸送部分と機能部分との連結部であるプロリン残基の生体活性の重要性を評価した。
【０１３１】
１０）ペプチドＷＡＬＬ００４：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＡＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００４とインキュベートしたところ、濃度を増加させると、特にペプチド濃度が２００μｇ／ｍｌを上回ると中程度のヒスタミン分泌が生じた（図１０Ａに示す）。これらの結果によって、このペプチドはアレルギー性の副作用をほんのわずか引き起こすか、又は全く引き起こさず、肥満細胞エキソサイトーシスの有効な阻害剤として役立ち得ることが示唆された。
【０１３２】
このペプチドが化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌を阻止する能力についてもまた、試験した。肥満細胞を様々な濃度のペプチドでインキュベートした後、化合物４８／８０によってヒスタミン分泌を誘導した。
【０１３３】
図１０Ｂに示したように、試験濃度範囲ではペプチドＷＡＬＬ００４は、化合物４８／８０によって誘導されるヒスタミン分泌を阻止することはできなかった。これらの結果は、１６位のプロリン残基をアラニンで置換すると所望のペプチド活性の完全な損失が引き起こされることを示す。したがって、アミノ酸プロリン、或いはその他の天然若しくは非天然アミノ酸、又は共有結合若しくは（細胞透過に適切な）輸送部分と（肥満細胞脱顆粒の減少又は消失に効果的な）機能部分とを屈曲又は回転を生じるように共有結合する部分は、所望のペプチド活性の保持に必須であることが示唆される。例としては、この位置のプロリン様物質、Ｎ−アルキル化アミノ酸又はＮ−メチル化アミノ酸、２重結合又は３重結合などが挙げられる。
【０１３４】
プロリンに加えて、適切な立体構造をもたらす部分の具体例には、サルコシンなどのＮ−メチルアミノ酸、ヒドロキシプロリン、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）、及び７−アザビシクロヘプタンカルボン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３５】
１１）ペプチドＷＡＬＬ００８：スクシニル−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡ−Ｓａｒ−ＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００８とインキュベートしたところ、濃度を増加させてもヒスタミン分泌は生じなかった。実際、ペプチドでインキュベートすると、対照細胞と比較して、基底レベルでヒスタミン分泌の阻害が生じた（図１１Ａに示す）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００８は、アレルギー性の副作用を生じないことが示された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図１１Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００８は用量に依存して化合物４８／８０誘導ヒスタミン分泌を阻害し、ＩＣ50値は２２０μｇ／ｍｌで、濃度６００μｇ／ｍｌで最大阻害率は９８．７％であった。
【０１３６】
これらの結果によって、ペプチド配列の１６位のプロリン残基をプロリン残基に類似したサルコシンと置換するとペプチド主鎖に立体構造の拘束が導入され、単離された肥満細胞のヒスタミン分泌を阻害する活性ペプチドが生じることが示される。
【０１３７】
１２）ペプチドＷＡＬＬ００９：ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００９とインキュベートしたところ、濃度を増加させるとペプチド濃度の関数としてヒスタミン分泌が生じた（図１２Ａ）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ００９は肥満細胞の有効な分泌促進物質であり、したがってアレルギー性の副作用を生じる可能性があることが示された。このペプチドはまた、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌を阻止する能力について試験した。この目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図１２Ｂに示すように、ペプチドＷＡＬＬ００９は化合物４８／８０誘導のヒスタミン放出を阻害しなかった。
【０１３８】
これらの結果によって、ヒトインテグリンβ３のシグナル配列のリーダーモチーフ、及びＧαｉ3のＣ末端配列を含み、これらの２部分を結合するプロリン残基を有さないペプチドＷＡＬＬ００９は不活性であることを示した以前の結果（ＷＯ００／７８３４６のペプチド１）が確実となった。
【０１３９】
１３）ペプチドＷＡＬＬ０１０：ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧＰＫＮＮＬＫＥＣＧＬＹ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドＷＡＬＬ００１０とインキュベートしたところ、濃度を増加させるとペプチド濃度の関数としてヒスタミン分泌が生じた（図１３Ａ）。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０１０は肥満細胞の有効な分泌促進物質であり、したがってアレルギー性の副作用を生じる可能性があることが示された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図１３Ｂに示したように、ペプチドＷＡＬＬ０１０は化合物４８／８０によって誘導されるヒスタミン放出を弱く阻害することが示され、濃度２００μｇ／ｍｌでの最大阻害率は１６．７％であった。
【０１４０】
これらの結果は、輸送部分と機能部分との間の連結部分にプロリン残基を付加すると、それ自体肥満細胞の分泌促進活性を示す不活性なペプチド（ＷＡＬＬ００９）を化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌を阻害できる活性ペプチドに変換できることを示す。この場合、（ペプチドＷＡＬＬ０１０で示したように）ヒスタミン分泌を阻害する活性配列の能力はリーダー配列の分泌促進活性によって遮蔽されて、したがって弱い阻害及び効果しか生じない可能性がある。それにもかかわらず、輸送部分と機能部分との間の結合部にプロリン残基を付加すると、ペプチド活性は有効な肥満細胞分泌促進物質からヒスタミン分泌阻害剤へと著しく変化することが明白である。
【０１４１】
１４）ペプチドＷＡＬＬ０２３：ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＹＬＧＣＥＫＬＮＮＫ
精製したインタクトな肥満細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで６００μｇ／ｍｌのペプチドＷＡＬＬ０２３とインキュベートしたところ、ヒスタミン分泌は生じなかった。これらの結果によって、ペプチドＷＡＬＬ０２３は、アレルギー性の副作用を生じないことが示唆された。次に、このペプチドについて、化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に対する阻止能を試験した。この阻止能を試験する目的で、肥満細胞を化合物４８／８０で誘発する前に様々な濃度のペプチドでインキュベートした。図１４に示したように、ペプチドＷＡＬＬ０２３は化合物４８／８０誘導性のヒスタミン分泌に影響を及ぼさなかった。
【０１４２】
これらの結果によって、Ｇｉ3の不活性な配列（アンチセンス配列）を含むペプチドは、化合物４８／８０によって誘導されるヒスタミン分泌を阻害できないことが示され、化合物４８／８０によって誘導されるヒスタミン放出の阻止は特異的で、Ｇｉ3活性化に左右されることが示される。
【０１４３】
１５）蛋白質キナーゼによる遅延型炎症反応の阻害
基本的な分泌促進物質に曝露した後、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を本発明のペプチドが特異的に阻害できることを示す実験を実施した。精製したインタクトな肥満細胞を６００μｇ／ｍｌのペプチド２とインキュベートし、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を確認した。その結果、百日咳毒素感受性Ｇｉ3を直接活性化する基本的な分泌促進物質である化合物４８／８０によって誘導されるＰＴＫ及びＭＡＰＫ活性を、ペプチド２が阻害することが示された（図１５Ａ及び１６Ａ）。対照的に、ペプチド２は、蛋白質チロシンホスファターゼを阻害することによって、百日咳毒素非感受性で、蛋白質チロシンのリン酸化を刺激するＨ2Ｏ2／ＶＯ3誘導性の蛋白質チロシンキナーゼ及びＭＡＰＫの活性化を阻害しなかった（図１５Ｂ及び１６Ｂ）。
【０１４４】
これらの結果は、ペプチド２は、ヒスタミン放出に加えて、基本的な分泌促進物質によって誘導されるＰＴＫ及びＭＡＰＫの活性化を阻害することを示す。これらの蛋白質キナーゼの活性化は、ロイコトリエン及びプロスタグランジンのデノボ合成など遅延型炎症反応の活性化をもたらす重要な事象として以前に示されている。したがって、我々の結果は、このペプチドはまた、ロイコトリエン及びプロスタグランジンなどの炎症伝達物質のデノボ産生に寄与する経路も阻害することを示す。我々はまた、ペプチド２は、Ｇｉ3活性化に左右され得る百日咳毒素感受性のＰＴＫ及びＭＡＰＫの特異的活性化を阻害することを示した。
【０１４５】
ペプチドＷＡＬＬ００４、ＷＡＬＬ００８、ＷＡＬＬ００９及びＷＡＬＬ０１０によって示された前述の結果は、リンカーが本発明の重要な要素で、それによってリンカーは分子の２つの部分の連結部又はその近傍に立体構造上の拘束を生じさせ、生体活性単位を生じさせることを裏付けている。したがって、第１部分は、リンカー又は直接の結合によって第２部分に結合しなければならず、リンカー等は屈曲又は回転を形成して立体構造上の拘束を生じるものでなければならない。例としては、プロリン若しくはプロリン様物質、サルコシンなどのＮ−メチルアミノ酸、又はペプチド主鎖に強固な屈曲を導入するその他の部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
表１にｉｎ ｖｉｔｒｏ系で得られた結果をまとめて示す。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
本発明による処置のｉｎ ｖｉｖｏでの効果確認試験
本発明のペプチドがｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力について、アレルゲンとして化合物４８／８０を使用してラットの皮膚で試験した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで効果が示されたペプチドＷＡＬＬ００７、ＷＡＬＬ００８、ＷＡＬＬ０１２、ＷＡＬＬ０１３、ＷＡＬＬ０１４、ＷＡＬＬ０１５及びＷＡＬＬ０１６は、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的にアレルギー応答を阻止することが示された。
実験方法は以下に記載する。
【０１４９】
（材料及び方法）
ＣＲラットの腹部の体毛を電気バリカンと脱毛クリームで注意深く除去した。各動物の腹部領域を、ペンで印を付けて６等分した。各領域をペプチド処理するか、又は対照として使用した。以下のようにペプチドを皮内注射した。すなわち、２７ゲージ滅菌針を使用して異なる濃度のペプチド溶液２０μｌ（ＤＤＷによる１０％ＤＭＳＯ溶液に溶解）を指示した腹部領域に皮内注射した。
【０１５０】
ペプチドを適用してから０．５時間、又は１時間後に皮膚試験を実施した。皮膚試験は、アレルゲン（ＤＤＷに溶解した、０．１ｍｇ／ｍｌ化合物４８／８０）又はＤＤＷ単独（溶媒）２０μｌを２７ゲージ滅菌針を使用して腹部皮膚の印をした各部位の中央に皮内注射することによって実施した。アレルギー応答は、アレルゲン又は溶媒処理に応じて生じた膨疹の輪郭をマーカーペンで描いて観察した。
【０１５１】
皮膚試験の結果を定量するために、マーカーペンの印を接着テープで紙に移した。膨疹領域の輪郭を描き、コンピュータソフトウェア（ＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ）で算出した。
【０１５２】
（実験結果）
試験ペプチドを局所適用した後、化合物４８／８０又は生理食塩水の注射に応じて生じた膨疹の領域を記録する。
【０１５３】
表２〜８は、各試験ペプチドを皮内注射して０．５時間後又は１時間後に注射した化合物４８／８０又はＤＤＷに応じて生じた膨疹領域の平均を示した表である。各ペプチドについて、２種類の用量、２０μｇ及び２００μｇについて試験した（それぞれ、１ｍｇ／ｍｌ又は１０ｍｇ／ｍの保存溶液２０μｌを注射した）。処理それぞれについて膨疹領域の平均を算出し、スチューデンドＴ検定を使用して結果の有意性を調べた。
【０１５４】
表２
表２に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ００７を皮内注射することによって用量に依存してアレルギー反応が抑えられ、アレルギー誘導の０．５時間又は１時間前に投与すると有意に阻害できることを示す。したがって、これらの結果は、ペプチドＷＡＬＬ００７はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有することを示している。
【０１５５】
表３
表３に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１６を皮内注射することによって用量に依存して化合物４８／８０誘導性のアレルギー反応が抑えられ、アレルギー誘導の０．５時間又は１時間前に投与するといずれも有意に阻害できることを示す。したがって、これらの結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１６はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有することを示している。
【０１５６】
表４
表４に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ００８を皮内注射することによって用量に依存してアレルギー反応が抑えられ、アレルギー誘導の０．５時間前に投与すると有意に阻害できることを示す。したがって、これらの結果は、ペプチドＷＡＬＬ００８はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有することを示している。
【０１５７】
表５
表５に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１２を皮内注射することによって用量に依存して化合物４８／８０誘導性のアレルギー反応が抑えられ、アレルギー誘導の０．５時間前に投与すると有意に阻害できることを示す。したがって、これらの結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１２はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有することを示している。
【０１５８】
表６
表６に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１３の皮内注射は、アレルギー反応を誘導する０．５時間前に適用すると１ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度で化合物４８／８０誘導性のアレルギー反応を有意に抑えることを示す。したがって、ペプチドＷＡＬＬ０１３はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有する。
【０１５９】
（表７に示した）代表的実験は、ペプチドＷＡＬＬ０１５を皮内注射することによってｉｎ ｖｉｖｏで化合物４８／８０誘導性のアレルギー反応が阻止されることを示す。ペプチドＷＡＬＬ０１５は、アレルギー誘導を誘導する０．５時間前に適用すると、１及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度でアレルギー反応を抑えた。
【０１６０】
表８に示した結果は、ペプチドＷＡＬＬ０１４を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、アレルギー反応を誘導する０．５時間前に適用した場合に、化合物４８／８０が惹起したアレルギー反応を有意に抑制したことを示す。対照的に、化合物４８／８０の１時間前に適用すると、有意な阻害は示されなかった（データは示していない）。したがって、ペプチドＷＡＬＬ０１４はｉｎ ｖｉｖｏでアレルギー反応を阻止する能力を有する。
【０１６１】
それぞれのペプチドを単独で皮内注射すると、皮膚のアレルギー反応を刺激する効果は発揮されず、したがって、各化合物はそれ自体ではアレルギー性がない。このことは、注目すべき点である（表２〜８参照のこと）。
【表２】
前記のｉｎ ｖｉｖｏの結果は、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を裏付け、本発明の活性ペプチドは皮膚のアレルギー反応などｉｎ ｖｉｖｏのアレルギー反応をまた阻止する能力を有することを示している。
【実施例４】
【０１６３】
投与の方法及び組成物
本発明のペプチド、及びその相同体又は関連化合物は、以後「本発明の治療剤」と称するが、当業界で周知の様々な投与経路によって被験対象に投与することができる。以後、「治療剤」という用語には、既に定義されたペプチド、特に本明細書で実例を挙げたペプチド及び／又はそれらの相同体、類似体若しくは擬似体、又は既に定義されたものと実質的に同様の効果を有する生物学的に活性な物質が含まれる。
【０１６４】
以後、「被験対象」という用語は、治療剤を投与するヒト又はより下等な動物を意味する。たとえば、投与は、局所的（眼動脈内、膣内、直腸内、鼻腔内及び吸入によって）、経口的、又は非経口的、たとえば点滴又は腹腔内、皮下、又は筋肉内注射によって実施することが可能である。
【０１６５】
局所投与用製剤としては、ローション、軟膏、ジェル、クリーム、座剤、滴剤、液剤、噴霧剤及び粉末剤を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。従来の製薬上の担体、水性、粉末状若しくは油性の基剤、増粘剤などが必要とされ、又は望まれることがある。
【０１６６】
経口投与用組成物としては、粉末剤若しくは顆粒剤、水若しくは非水性溶媒による液剤若しくは懸濁剤、サシェ、カプセル剤又は丸剤を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１６７】
非経口投与用製剤としては、緩衝剤、希釈剤及びその他の適切な添加物をも含めることができる滅菌水性溶液を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【０１６８】
用量は、症状の重症度及び治療剤に対する被験対象の反応性によっても左右される。当業者であれば、容易に最適用量、投与方法及び反復割合を決定することができる。
【実施例５】
【０１６９】
アレルギー症状の治療方法
前述のように、本発明の治療剤は肥満細胞の脱顆粒を阻止し、それによってアレルギー症状を予防及び／又は緩和するアレルギー過程の効果的な阻害剤であることが示された。以下の実施例により、本発明の治療剤でアレルギー症状を治療する方法の一例を例示するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１７０】
この方法には、前述の実施例４で記載した製薬上許容される担体に入れた治療剤を治療すべき被験対象に投与する段階が含まれる。この治療剤は、効果的な投与方法によって、好ましくは予め決定した終了点に達するまで、たとえば被験対象のアレルギー状態の症状がなくなるまで、又は被験対象の症状などの出現が予防されるまで投与される。
【０１７１】
本発明の治療剤が有用なアレルギー症状としては、アレルギー性鼻炎、目の刺激又はアレルギー反応、アレルギー誘発性発疹又はその他の皮膚刺激若しくは炎症を含めたあらゆる種類の皮膚のアレルギー反応、急性蕁麻疹、乾癬、心因性又はアレルギー性喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛、及び多発硬化症など自己免疫疾患を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【実施例６】
【０１７２】
本発明の治療複合体の製造方法
本発明の治療複合体は、様々な方法で製造することができる。たとえば、治療複合体の第１部分及び第２部分の少なくとも１つにペプチドが含まれる場合、又は治療複合体全体がペプチドの場合、このようなペプチドは当業界で周知のペプチド合成方法によって製造することができた。
【０１７３】
また、このようなペプチドは当技術分野で周知の分子生物学用の研究技術によってシグナル配列と生体活性部分とを結合することによって生成することができる。
【０１７４】
非限定的実施例として例示する目的で、Ｎ末端のペプチド透過配列と、好ましくは最後の１０個のアミノ酸を含むＧαt又はＧαi3のＣ末端とを特徴とする組換え融合蛋白質を、細菌で産生するために調製することができた。この目的のために、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、精製する。配列を確認した後、これらのＤＮＡ配列を、適切なベクター中で、連結、クローニングした。得られた組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉで発現し、細菌抽出物から組換え蛋白質を精製した。
【実施例７】
【０１７５】
立体構造分析及びコンピュータプロトコール
（立体構造のサンプリング）
１０残基のペプチドに可能な立体構造全てを完全に列挙することは実際的ではないので、分子の立体構造空間の代表的なサンプルを作製する目的で、サンプリング方法を適用する必要がある。多くの方法が分子立体構造サンプリングに利用できるが、それぞれ利点と限界を有している。本発明の研究に採用したサンプリング方法は、生理学的ｐＨで適当な時間ペプチドが最も安定な立体構造をとる傾向があることに基づいている。この目的を実現するために、２段階サンプリング方法を適用した。第１に、１０００Ｋでの高温分子動力学軌跡（high temperature molecular dynamics trajectory）によって立体構造をサンプリングする。次に、高温で採取した各立体構造を、分子動力を利用しながら徐々に３００Ｋまでアニール処理する。冷却段階の後、各立体構造のエネルギーを直接最小化によって消滅させる。アニールして、最小化された立体構造を、その分子の立体構造サンプルとする。徐々にアニールすることによって、得られる立体構造が実際上３００Ｋ多様体により決定され（すなわち、３００Ｋで影響されやすい）、その一方、高温でのサンプリングにより、高エネルギー障壁を超えることを可能とすることが保証される。
【０１７６】
技術的には、各サンプリング方法は、１０００Ｋでの５００ｐｓ分子動力学軌跡（molecular dynamics trajectory）（２ｆｓのタイムステップを使用して刺激）で開始する。立体構造は、１ｐｓ毎の高温軌跡（high temperature molecular trajectory）で採取して、全部で５００個の立体構造が得られる。次に短時間の分子動力学軌跡（molecular dynamics trajectory）（１ｆｓのタイムステップで刺激）を適用し、各高温立体構造を３００Ｋまで（温度は１００Ｋ段階で減少）冷却する。冷却相後、各構造をｔｏｔａｌ ｇｒａｄｉｅｎｔが０．０１に達するまで、２００の最大傾斜法段階とその後の調整済基本的ニュートン−ラファーソン法（ＡＢＮＲ）最小化段階の組み合わせ方法によって最小化する。分子動力学的表示及び様々なエネルギー計算は、ＣＨＡＲＭＭプログラム及びＣＨＲＭＭ ａｌｌ ａｔｏｍ ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄで実施した。明確な水分子は含まれておらず、エネルギーカットオフは適用せず、距離依存性誘電率を使用した。立体構造の試料それぞれにおいて、最もエネルギーの低い立体構造を配列の最も安定な立体構造を表すために選択した。
【０１７７】
分子系
１０残基ペプチド類似体４個を調べた。これらのペプチドは中性のＮ末端及び負に荷電したＣ末端を備えていた。サンプリング方法で使用したペプチドの最初の立体構造は全て、完全に伸長した立体構造であった。しかし、ペプチドｃとペプチドｂの差及びペプチドｄとペプチドａの差はほんの１残基なので、他のサンプリングをペプチド３及び４に適用した。ペプチドｃ及びｄに対するこれらの他のサンプリングは、それぞれペプチドｂ及びａの最も安定な立体構造に基づいた。
溶媒化の影響はペプチド１においてのみ調べた。このシミュレーションは、ＣＨＡＲＭＭ分子動力学プログラムを使用して実施した。このシミュレーションではタイムステップ１ｆｓ、ＳＨＡＫＥによって水素原子の結合を束縛、誘電率ε＝１、及びエネルギーカットオフ１５Åを使用した。確率結合条件を使用して、ペプチドを１４Å球体のＴＩＰ３水分子に包埋した。水球体を２段階で添加し、いずれにも水分子の無作為な方向での平衡化水球体のオーバーレイと、その後の３００Ｋでの２０ｐｓ平衡化が含まれる。この刺激では、第１段階で３０５個の水分子をモデルに添加し、第２段階で６個の水分子を添加して、合計３１１個の水分子を生じた。この刺激では原子の総数（ペプチド及び水）が１０９９個であった。
【０１７９】
これらのコンピュータの方法に基づいて、抗アレルギー活性を有するペプチドは環状立体構造を有し、伸長した、又は直鎖状の立体構造は不活性であることが示された。さらに、複合ペプチドの分析によって、活性種は輸送に適切な部分と抗アレルギー部分との連結部又は近傍に屈曲又は回転があることが示される。
【０１８０】
ＮＭＲ技術に基づいた立体構造分析を確実にする立体構造測定は、当業界で公知の通りに実施する。
【０１８１】
本発明をその特定の実施形態に関して説明したが、多くの代替、変更及び変形を当業者が理解できることは明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲に含まれるこのような代替、変更及び変形は全て包含されるものとする。
【０１８２】
（参考文献）
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Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｒ．（１９９３）．「肥満細胞エキソサイトーシスのシグナル伝達経路。肥満細胞及び好塩基細胞の免疫薬理学。（Ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂａｓｏｐｈｉｌｓ．）」
Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｒ．，Ｂｅｎ−Ｎｅｒｉａｈ Ｚ．，Ｐｅｃｈｔ Ｉ．，Ｔｅｒｒｙ Ｓ．ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｓ．（１９８３）．「ニューロテンシン断片の肥満細胞脱顆粒能力における構造−活性の関係（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．）」Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍ．２２：１９７〜２０１。
Ｓｈｅｆｌｅｒ Ｉ．，Ｔａｕｂｅ Ｚ．，Ｍｅｄａｌｉａ Ｏ．ａｎｄ Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｒ．（１９９８）．「基本的分泌促進物質は新規蛋白質キナーゼＣ及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ依存性機構によって肥満細胞で蛋白質チロシンリン酸化及びアラキドン酸の放出を活性化する。（Ｂａｓｉｃ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３４６８〜３４７８。
Ｓｕｓｓｍａｎ Ｇ．Ｌ．，Ｈａｒｖｅｙ Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈｏｃｋｅｔ Ａ．Ｌ（１９８２）．「２種類の測定技術を使用した皮膚試験応答の評価。（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．）」Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ ４８：７５〜７７。
Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ Ｔ．Ｃ．（１９９６）．「肥満細胞：神経免疫物質内分泌の主役（ Ｔｈｅ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ：ａ ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｍａｓｔｅｒ ｐｌａｙｅｒ．）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ．１８：１〜２１。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００６の用量に対する応答を示した図である。
【図２】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１５の用量に対する応答を示した図である。
【図３】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１１の用量に対する応答を示した図である。
【図４】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１２の用量に対する応答を示した図である。
【図５】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１３の用量に対する応答を示した図である。
【図６】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００５の用量に対する応答を示した図である。
【図７】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１４の用量に対する応答を示した図である。
【図８】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００７の用量に対する応答を示した図である。
【図９】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１６の用量に対する応答を示した図である。
【図１０】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００４の用量に対する応答を示した図である。
【図１１】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００８の用量に対する応答を示した図である。
【図１２】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ００９の用量に対する応答を示した図である。
【図１３】インタクトな肥満細胞からの（Ａ）ヒスタミン分泌及び（Ｂ）化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関する、ペプチドＷＡＬＬ０１０の用量に対する応答を示した図である。
【図１４】インタクト肥満細胞からの化合物４８／８０誘導性ヒスタミン放出に関するペプチドＷＡＬＬ０２３の用量に対する応答を示した図である。
【図１５】化合物４８／８０（Ａ）又はＨ2Ｏ2／ＶＯ3（Ｂ）、続いてペプチド２の処理によって誘導された蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）活性化を示した図である。
【図１６】化合物４８／８０（Ａ）又はＨ2Ｏ2／ＶＯ3（Ｂ）、続いてペプチド２の処理によって誘導されたマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を示した図である。
Claims (44)
- 複合体分子を肥満細胞に輸送する能力のある第１部分と、該肥満細胞内で抗アレルギー効果を表す第２部分とを少なくとも有する複合体分子を含む抗アレルギー剤であって、前記第１部分はリンカーによって前記第２部分に結合しており、前記第２部分がＧαi3由来の抗アレルギー性デカペプチドである場合に、前記第１部分がペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ以外のものであるという条件付きで、前記リンカーが２部分の間の連結部又はその近傍に屈曲又は回転をもたらしている抗アレルギー剤。
- 前記第２部分が、少なくとも前記肥満細胞の脱顆粒を有意に減少させることによって前記抗アレルギー効果を有する請求項１に記載の薬剤。
- 前記第２部分が、ペプチド、ペプチド様物質、又はポリペプチドから成る群から選択される請求項２に記載の抗アレルギー剤。
- 前記第２部分が、水素結合、イオン結合及び共有結合から成る群から選択された結合によって安定化した環状構造を有するペプチドである請求項３に記載の抗アレルギー剤。
- 前記第１部分が、ペプチドである請求項４に記載の抗アレルギー剤。
- 前記リンカーが、共有結合である請求項５に記載の抗アレルギー剤。
- 前記共有結合が、ペプチド結合である請求項６に記載の抗アレルギー剤。
- 前記抗アレルギー部分が、
から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項７に記載の抗アレルギー剤。 - 前記抗アレルギー部分が、Ｇαｉ3のＣ末端配列から得られるペプチドである請求項７に記載の抗アレルギー剤。
- 前記分子が、
から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチド、ならびにこれら配列の活性の類似体、相同体、及び環状誘導体を含む誘導体である請求項７に記載の抗アレルギー剤。 - 被験対象のアレルギー状態を治療するための医薬組成物であって、治療有効量の抗アレルギー剤を含み、前記抗アレルギー剤は複合体分子を肥満細胞に輸送する能力のある第１部分と前記肥満細胞内で抗アレルギー効果を表す第２部分とを少なくとも有する複合体分子を含み、前記第１部分はリンカーによって前記第２部分に結合しており、前記第２部分がＧαi3由来の抗アレルギー性デカペプチドであるときには、前記第１部分はペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ以外であるという条件付で、前記リンカーが２つの部分の間の連結部又はその近傍に屈曲又は回転をもたらしている、医薬組成物。
- 前記アレルギー状態が、アレルギー性鼻炎、被験対象の目のアレルギー反応、被験対象の皮膚のアレルギー反応、急性蕁麻疹、乾癬、心因性若しくはアレルギー性の喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛及び多発硬化症から成る群から選択される請求項１１に記載の医薬組成物。
- 薬剤として許容される添加物、希釈剤又は担体をさらに含む請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が、局所投与に適している請求項１３に記載の医薬組成物。
- 前記局所投与が、被験対象の皮膚に対するものである請求項１４に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が、鼻腔内投与又は吸入に適している請求項１３に記載の医薬組成物。
- 前記第２部分が、少なくとも前記肥満細胞の脱顆粒を有意に減少させることによって前記抗アレルギー効果を有する請求項１１に記載の医薬組成物。
- 前記第２部分が、ペプチド、ペプチド様物質、又はポリペプチドから成る群から選択された請求項１７に記載の医薬組成物。
- 前記第２部分が、環状構造を有し、水素結合、イオン結合及び共有結合から成る群から選択された結合によって安定化されたペプチドである請求項１８に記載の医薬組成物。
- 前記第１部分が、ペプチドである請求項１９に記載の医薬組成物。
- 前記リンカーが、共有結合である請求項２０に記載の医薬組成物。
- 前記共有結合が、ペプチド結合である請求項２１に記載の医薬組成物。
- 前記抗アレルギー部分が、
から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項２１に記載の医薬組成物。 - 前記抗アレルギー部分が、Ｇαｉ3のＣ末端配列から得られたペプチドである請求項２１に記載の医薬組成物。
- 前記分子が、
並びにこれらの配列の活性の類似体、相同体、及び環状誘導体を含む誘導体から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである請求項２１に記載の医薬組成物。 - 被験対象のアレルギー状態の治療方法であって、治療有効量の抗アレルギー剤を前記被験対象に投与する段階を含み、前記抗アレルギー剤が複合体分子を肥満細胞に輸送する能力のある第１部分と前記肥満細胞内で抗アレルギー効果を表す第２部分とを少なくとも有する複合体分子を含み、前記第１部分はリンカーによって前記第２部分に結合しており、前記第２部分がＧαi3由来の抗アレルギー性デカペプチドであるとき、前記第１部分はペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ以外であるという条件付で、前記リンカーは前記部分の間の連結部又はその近傍に屈曲又は回転をもたらす、治療方法。
- 前記アレルギー状態が、アレルギー性鼻炎、被験対象の目のアレルギー反応、被験対象の皮膚のアレルギー反応、急性蕁麻疹、乾癬、心因性若しくはアレルギー性の喘息、間質性膀胱炎、腸疾患、偏頭痛及び多発硬化症から成る群から選択される請求項２６に記載の治療方法。
- 前記抗治療剤の投与段階を局所投与によって実施する請求項２７に記載の治療方法。
- 前記局所投与が被験対象の皮膚又は目に対するものである請求項２８に記載の治療方法。
- 前記治療剤の投与段階を吸入又は鼻腔内投与によって実施する請求項２７に記載の治療方法
- 前記第２部分が、少なくとも前記肥満細胞の脱顆粒を有意に減少させることによって前記抗アレルギー効果を有する請求項２６に記載の治療方法。
- 前記第２部分が、ペプチド、ペプチド様物質又はポリペプチドから成る群から選択される請求項３１に記載の治療方法。
- 前記第２部分が、環状構造を有し、水素結合、イオン結合及び共有結合から成る群から選択された結合によって安定化されたペプチドである請求項３２に記載の治療方法。
- 前記第１部分がペプチドである請求項３３に記載の治療方法。
- 前記リンカーが共有結合である請求項３４に記載の治療方法。
- 前記共有結合がペプチド結合である請求項３５に記載の治療方法。
- 前記抗アレルギー部分が、
から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項３５に記載の方法。 - 前記抗アレルギー部分が、Ｇαｉ3のＣ末端配列から得られたペプチドである請求項３６に記載の治療方法。
- 前記分子が、
ならびにこれら配列の活性の類似体、相同体、及び環状誘導体を含めた誘導体から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである請求項３６に記載の治療方法。 - 蛋白質キナーゼ活性化によって誘導される遅延型炎症応答を防ぐ方法であって、治療有効量の抗アレルギー剤を被験対象に投与する段階を含み、前記抗アレルギー剤は、前記分子を肥満細胞に輸送する能力のある第１部分と前記肥満細胞内で抗アレルギー効果を表す第２部分とを少なくとも有する分子を含み、前記第１部分はリンカーによって前記第２部分に結合しており、前記リンカーは前記部分の間の連結部又はその近傍に屈曲又は回転をもたらしている方法。
- 前記蛋白質キナーゼ活性が、マイトジェン活性化蛋白質キナーゼである請求項４０に記載の方法。
- 前記抗アレルギー剤が、請求項１から１０までのいずれか１項に記載されているものである請求項４０に記載の方法。
- 前記抗アレルギー剤が、ペプチド２、ペプチド２−Ｓｕｃｃ及びペプチド２−Ｃｙｓである請求項４０に記載の治療方法。
- ｉｎ ｖｉｖｏで抗アレルギー性ペプチドの被験対象の細胞への輸送を促進する方法であって、
（ａ）屈曲又は回転を形成するリンカー又は直接結合によって、前記抗アレルギー性ペプチドに、リーダー配列であるペプチドを結合して、複合ペプチド又はペプチド様分子を形成するステップと、
（ｂ）前記複合ペプチド又はペプチド様分子を被験対象に投与するステップと、
（ｃ）前記第２部分がＧαｉ3由来の抗アレルギーデカペプチドであるときに、前記第１部分がペプチドＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ以外であるという条件付で、前記複合体分子を、前記リーダー配列によって細胞に輸送し、それによって前記抗アレルギー性ペプチドを細胞に輸送するステップを含む方法。
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