CN111601815A - 靶向细胞中c-Myc的嵌合分子 - Google Patents

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CN111601815A CN201880077406.6A CN201880077406A CN111601815A CN 111601815 A CN111601815 A CN 111601815A CN 201880077406 A CN201880077406 A CN 201880077406A CN 111601815 A CN111601815 A CN 111601815A
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Abstract

本文公开了嵌合融合蛋白，其包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeroginosa)外毒素A(‘tPE’)融合的c‑Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内的c‑Myc活性。具体地，tPE包含PE结构域Ia和II，且c‑Myc抑制剂是衍生自c‑Myc的螺旋1羧基区域的H1肽。本文还公开了包含嵌合融合蛋白的药物组合物，嵌合融合蛋白的递送方法、制备方法以及治疗c‑Myc依赖性癌症的用途。

Description

靶向细胞中c-Myc的嵌合分子
本申请要求于2017年11月29日提交的新加坡临时申请No.10201709898X的权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及癌症领域，更具体地，涉及使用嵌合融合蛋白治疗癌症的组合物和方法，所述嵌合融合蛋白包含与c-Myc抑制剂融合的遗传修饰的铜绿假单胞菌(PseudomonasAeroginosa)外毒素A，所述c-Myc抑制剂可以靶向并穿透细胞核，并抑制细胞核内转录因子c-Myc的活性。
背景技术
c-myc是编码转录因子c-Myc的调控基因。在许多癌症中发现c-Myc的突变形式，其导致c-Myc组成型表达并显示致癌活性。这导致许多基因的表达失调，其中一些基因涉及细胞增殖，并导致癌症的形成。
人类癌症中c-myc基因改变的频率使得估计在美国每年大约70,000例癌症死亡与c-myc基因或其表达的改变相关。鉴于c-myc可能导致美国癌症死亡的七分之一，最近的努力已经致力于在癌症生物学中抑制c-Myc蛋白，希望出现治疗上的见解。
因此，存在对检测和/或靶向细胞中c-Myc的方法的未满足的需要。
发明内容
在一个方面，本发明涉及嵌合融合蛋白，其包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
在另一方面，本发明涉及包含嵌合融合蛋白的药物组合物，所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
在又一个方面，本发明涉及将c-Myc抑制剂递送至细胞的细胞核的方法，所述方法包括使包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂的嵌合融合蛋白经受所述细胞的步骤，其中所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
在另一方面，本发明涉及将c-Myc抑制剂递送至细胞的细胞核的方法，所述方法包括以下步骤：将所述c-Myc抑制剂与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合以产生能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内c-Myc活性的嵌合融合蛋白，以及使所述融合蛋白经受所述细胞。
在另一方面，本发明涉及制造能够穿透细胞的细胞核的嵌合融合蛋白的方法，所述方法包括将c-Myc抑制剂与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合以产生能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内c-Myc活性的嵌合融合蛋白的步骤。
在另一方面，本发明涉及预防或治疗受试者中的c-Myc依赖性癌症的方法，所述方法包括向受试者施用与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂的步骤，所述融合蛋白能够穿透受试者的细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
在一个方面，本发明涉及用于预防或治疗受试者中的c-Myc依赖性癌症的嵌合融合蛋白，其中所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透受试者的细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
另一方面，本发明涉及嵌合融合蛋白在制造用于预防或治疗受试者中的c-Myc依赖性癌症的药物中的用途，其中所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透受试者的细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
附图说明
下面将参考附图描述本发明的各种实施方案。
图1：tPE-Omomyc和tPE-H1一级结构的示意图和本发明的原理。(A)显示tPE-Omomyc和tPE-H1各自的一级结构。对于tPE-Omomyc融合蛋白，PE结构域Ia和II与Omomyc肽遗传融合。对于tPE-H1融合蛋白，PE结构域Ia和II与H1肽遗传融合。(B)显示在正常条件下和在c-Myc条件下的E-BOX的示意图。当细胞与tPE-Omomyc温育时，c-Myc/Max复合物不再可以与E-Box启动子结合。以类似的方式，当细胞与tPE-H1温育时，max肽和c-Myc蛋白(与tPE-H1融合蛋白结合)都不可以与E-Box启动子结合。细胞经E-Box启动子表达虫萤光素酶(luciferase)以测量c-myc活性，并经CMV启动子表达海肾萤光素酶(Renilla)作为对照。
图2：亚细胞定位。(A)显示在1小时tPE-H1 200nM处理后的A431细胞分级显示tPE-H1、c-Myc和Max在细胞的细胞核中的位置。C：细胞溶质部分；M：细胞膜部分；N：细胞核部分。在每个印迹的左侧标记抗体。分子量(MW)示出于右侧。(B)显示1小时tPE-Omomyc 200nM处理后的A431细胞分级显示细胞核部分中的tPE-Omomyc。α-微管蛋白用作细胞溶质部分标记物，钙联接蛋白用作细胞膜部分标记物，而Max用作细胞核标部分记物。C：细胞溶质部分，M：细胞膜部分，N：细胞核部分。在每个印迹的左侧标记抗体。MW显示在右侧。结果显示温育1小时后细胞核部分中存在tPE-Omomyc。
图3：tPE-H1对c-Myc/Max复合物的影响。在缺失c-Myc抗体(-Ab，阴性对照)或存在c-Myc抗体(IP c-Myc)的情况下，用Max进行c-Myc共免疫沉淀。细胞用tPE(即PE结构域Ia和II，没有H1肽)和tPE-H1处理，以测试它们的c-Myc/Max相互作用的影响。模拟样品不含有任何形式的tPE。在每个印迹的左侧标记抗体。分子量(MW)示出于右侧。
图4：tPE-H1剂量反应和对于c-Myc转录活性的EC50。在6小时时，tPE-H1对在E-Box启动子控制下表达虫萤光素酶的A431细胞的剂量反应。用几种tPE-H1浓度处理细胞。计算的EC50＝25nM。
图5：对于c-Myc转录活性的tPE-H1动力学。tPE-H1 50nM对在E-Box启动子控制下表达虫萤光素酶的A431细胞的动力学影响。处理细胞并在不同时间点读取虫萤光素酶活性。峰值活性出现在6-8小时并保持稳定。
图6：tPE-H1总结结果和c-Myc特异性。用50nM tPE(阴性对照；SEQ ID NO：10)、包含H1阴性对照的突变形式的tPE-H1(SEQ ID NO：14)或tPE-H1对照(SEQ ID NO：13)处理在E-Box启动子控制下表达虫萤光素酶和在CMV启动子控制下表达海肾萤光素酶的A431细胞6小时。结果表明，当用tPE-H1而不是tPE或tPE-H1-对照处理细胞时，虫萤光素酶降低(黑色柱表示)。海肾萤光素酶不受处理的影响(灰色柱表示)。结果示出tPE-H1对E-Box虫萤光素酶的特异性。
图7：CPP-H1剂量反应和对于c-Myc转录活性的EC50。对在E-Box启动子控制下表达虫萤光素酶的A431细胞上与H1和tPE-H1融合的细胞靶向肽(CPP)进行6小时处理后的比较剂量反应。X轴显示在Log钙联接蛋白(CAD；LLIILLRRRIRKQAHAHSK；SEQ ID NO：2)EC50＝75μM，黑腹果蝇触足肽(Antenapedia)(Int；RQIKIWFQNRRMKWKK SEQ ID NO：3)EC50＝200μM和TAT(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO：4)EC50＝500μM。
图8：tPE-H1对A431细胞增殖的影响。用50、100、200和400nM tPE-H1处理A431细胞超过2周。每4小时进行明场采集并进行分析。结果显示在50nM和100nM tPE-H1细胞增殖较慢，在200nM以上无增殖。
图9：tPE-H1对肝癌HepG2细胞增殖的影响。HepG2细胞用10nM、25nM、50nM和100nMtPE-H1处理超过2周。每4小时进行明场采集并进行分析。结果显示在10nM和25nM tPE-H1细胞增殖较慢，在50nM以上无增殖。
图10：经tPE-H1处理的肝癌HepG2死亡率。在细胞死亡标志物DRAQ7存在下将HepG2用(黑色柱)或不用(灰色柱)100nM tPE-H1处理24小时。计数阳性DRAQ7细胞并在每种条件下进行比较。结果显示用tPE-H1 100nM处理后24小时死亡细胞的数量增加。
图11：tPE-H1对c-Myc生物标志物的影响。在RNA提取之前，先用tPE-H1 100nM处理A431细胞过夜。通过RT-PCRQ对由c-Myc调节的转录物mRNA量进行定量，并比较用或不用tPE-H1处理的情况。以相同的方式分析表达不受c-Myc调节的管家mRNA(HPRT1、GAPDH)。Y轴显示mRNA log2(倍数变化)。与管家基因相比，上调的基因出现负log2(倍数变化)。与管家基因相比，下调的基因出现正log2(倍数变化)。
图12：tPE-Omomyc剂量反应和对于c-Myc的转录活性的EC50。在6小时时，tPE-Omomyc对在E-BOX启动子控制下表达虫萤光素酶的A431细胞的剂量反应(描绘为线图)。细胞用若干tPE-Omomyc浓度处理，如图12的X轴所示。结果显示6小时温育后计算的EC50＝5nM，这比用tPE-H1获得的结果低5倍。
图13：对于c-Myc转录活性的tPE-Omomyc动力学。图13显示描绘tPE-Omomyc 10nM对在E-BOX启动子控制下表达虫萤光素酶的A431细胞的动力学影响的线图。处理细胞并在不同时间点读取虫萤光素酶活性。结果表明，峰值活性发生在温育后16小时并且保持稳定。
图14：tPE-Omomyc对肝癌HepG2细胞增殖的影响。HepG2细胞用1nM、2.5nM、5nM和10nM tPE-Omomyc处理2周。每4小时进行明场采集并进行分析。结果显示在2.5nM和5nMtPE-Omomyc时细胞增殖较慢，在10nM以上无增殖。
图15：经tPE-Omomyc处理的肝癌HepG2细胞死亡。在细胞死亡标志物DRAQ7存在下将HepG2用(黑色柱)或不用(白色柱)10nM tPE-Omomyc处理24小时。计数阳性DRAQ7细胞并对每种条件进行比较。结果显示用浓度为10nM的tPE-Omomyc处理后24小时死亡细胞的数量增加。
序列列表
Figure BDA0002515174420000051
Figure BDA0002515174420000061
Figure BDA0002515174420000071
具体实施方式
本发明人已经开发了铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeroginosa)外毒素A(‘tPE’)的遗传修饰形式，其能够靶向和穿透细胞的细胞核，并且可以用于将治疗/生物活性肽或蛋白质靶向/递送至细胞核。更具体地，本发明人已经开发了包含与tPE融合的c-Myc抑制剂的嵌合融合蛋白，所述tPE可以进入细胞的细胞核。本发明人已经发现该融合蛋白可用于治疗c-Myc依赖性癌症。
根据本发明的第一实施方案，提供了嵌合融合蛋白，其包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
根据本发明的第二实施方案，提供了包含嵌合融合蛋白的药物组合物，所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
根据本发明的第三实施方案，提供了将c-Myc抑制剂递送至细胞的细胞核的方法，所述方法包括使包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂的嵌合融合蛋白经受所述细胞的步骤，其中所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
根据本发明的第四实施方案，提供了将c-Myc抑制剂递送至细胞的细胞核的方法，所述方法包括以下步骤：将所述c-Myc抑制剂与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合，以产生能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性的嵌合融合蛋白，以及使所述融合蛋白经受所述细胞。
根据本发明的第五实施方案，提供了制造能够穿透细胞的细胞核的嵌合融合蛋白的方法，所述方法包括将c-Myc抑制剂与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合以产生能够穿透细胞的细胞核并抑制细胞核内c-Myc活性的嵌合融合蛋白的步骤。
根据本发明的第六实施方案，提供了预防或治疗受试者中的c-Myc依赖性癌症的方法，所述方法包括向受试者施用与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂的步骤，所述融合蛋白能够穿透受试者的细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
根据本发明的第七实施方案，提供了用于在受试者中预防或治疗c-Myc依赖性癌症的嵌合融合蛋白，其中所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透受试者的细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
根据本发明的第八实施方案，提供了嵌合融合蛋白在制备用于预防或治疗受试者中的c-Myc依赖性癌症的药物中的用途，其中所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透受试者的细胞的细胞核并抑制细胞核内的c-Myc活性。
遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)可以是任何合适的形式，只要它能够经由内吞作用被吸收到细胞中，以及靶向并穿透细胞的细胞核。tPE因此可包含一个或多个使其能够跨细胞膜(包括外细胞膜和核膜)易位的结构域。tPE可以任何合适的方式产生。
在一些实例中，tPE包含结构域Ia(成熟裂解蛋白的氨基酸1-252)或其针对跨核膜易位的生物活性片段。在其他实例中，tPE包含结构域II(成熟裂解蛋白的氨基酸253-364)或其针对跨核膜易位生物活性片段。
在另一实例中，tPE包含结构域Ia(成熟裂解蛋白的氨基酸1-252)或其生物活性片段以及结构域II(成熟裂解蛋白的氨基酸253-364)或其生物活性片段。在又一实例中，tPE包含与结构域II(成熟裂解蛋白的氨基酸253-364)融合的结构域Ia(成熟裂解蛋白的氨基酸1-252)。
Myc是编码转录因子的调节基因和原癌基因的家族，其中最熟知的例子是c-myc。Myc的其他实例是l-myc和n-myc。在癌症中，c-myc通常组成型地(并且可能持续地)表达，这又导致许多其他基因的表达增加，其中一些基因被认为参与细胞增殖。因此，不受理论的约束，认为c-myc的整体表达有助于癌症的形成。在子宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌和胃癌中也观察到Myc基因的组成型上调。在人类基因组中，据信c-myc通过与所谓的增强子盒序列(E-Box)结合来调节所有基因中约15％的表达。
如本文所用，术语“抑制剂”是指能够抑制或阻断特定靶标的活性的化合物。这些靶标可以是但不限于酶、受体(作为非限制性实例的神经递质)、蛋白质、基因和具有生物学功能的任何其他分子。各种化合物和药物不限于单一作用，并且因此可以被认为是针对特定靶标的抑制剂，即使它们在结构上不同。也就是说，针对特定靶标的抑制是这些化合物的兼具特性。
因此，在一个实例中，本文公开的抑制剂是c-Myc抑制剂。任何合适类型的c-Myc抑制剂可以与本文公开的主题名称结合使用，条件是它能够直接或间接抑制细胞核内的c-Myc。c-Myc抑制剂可以任何合适的方式产生。
在一个实例中，c-Myc抑制剂与tPE的C-末端融合。在另一个实例中，c-Myc抑制剂与tPE的结构域II的C末端融合。
在一些实施方案中，c-Myc抑制剂可以是任何合适序列和长度的肽。在一些实施方案中，c-Myc抑制剂可以是任何合适序列和长度的多肽。在一些实施方案中，c-Myc抑制剂可以包含与tPE融合的多于两种或更多种肽。所述肽可以彼此相同或不同。在一些实施方案中，c-Myc抑制剂可以包含与tPE融合的多于两种或更多种多肽。所述多肽可彼此相同或不同。在一些实施方案中，c-Myc抑制剂可以包含与tPE融合的多于两种或更多种肽和/或多肽。所述肽和多肽可以彼此相同或不同。
在一些实施方案中，c-Myc抑制剂直接或间接抑制c-Myc。在一些实施方案中，c-Myc抑制剂能够破坏c-Myc依赖性癌症中的c-Myc依赖性通路。在一些实施方案中，c-Myc抑制剂干扰特异性c-Myc DNA结合。在一些实施方案中，c-Myc抑制剂阻断c-Myc/Max二聚化，从而抑制c-Myc的转录活化。
在另一个实例中，c-Myc抑制剂是源自c-Myc的螺旋1(H1)羧基区域的H1肽，其可以干扰特异性c-Myc DNA结合。H1肽可以具有任何合适的序列和长度，但优选为具有氨基酸序列NELKRAFAALRDQI(SEQ ID NO：5)的H1(S6A，F8A)。其他感兴趣的H1 c-Myc-抑制肽序列包括，例如，Omomyc(TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA；SEQ ID NO：6)。
如本文所用，术语“肽”、“蛋白质”、“多肽”和“氨基酸序列”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸残基的聚合物。该聚合物可以是直链的或支链的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以被除氨基酸之外的化学部分中断。该术语还涵盖已经天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标志物或生物活性组分缀合。术语肽涵盖通过共价键(例如，酰胺键)连接的两个或更多个天然存在的或合成的氨基酸。氨基酸残基通过酰胺键连接在一起。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，L-异构体在性质上是优选的。如本文所用的术语多肽或蛋白质涵盖任何氨基酸序列，并且包括但不限于经修饰的序列，如糖蛋白。术语多肽特别旨在涵盖天然存在的蛋白质，以及重组或合成产生的那些。本文所用的基本上纯化的多肽是指基本上不含与其天然相关的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质的多肽。在一个实施方案中，多肽至少50％(例如至少80％)不含与其天然相关的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质。在另一个实施方案中，多肽至少90％不含与其天然相关的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质。在另一个实施方案中，多肽至少95％不含与其天然相关的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质。
提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸取代表是本领域普通技术人员熟知的。以下六组是被认为是彼此保守取代的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
非保守氨基酸取代可由在以下中的变化引起：(a)所述取代的区中氨基酸骨架的结构；(b)氨基酸的电荷或疏水性；或(c)氨基酸侧链的体积。通常预期在蛋白质性质中产生最大变化的取代是下述那些取代，其中：(a)亲水残基取代疏水残基(或被其取代)；(b)脯氨酸取代任何其他残基(或被其取代)；(c)具有大体积侧链的残基(例如苯基丙氨酸)取代不具有侧链的残基(例如甘氨酸)(或被其取代)；或(d)具有电正侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基(histadyl))取代电负性残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)取代(或被其取代)。
变体氨基酸序列可以例如与天然氨基酸序列80％、85％、90％或甚至95％、98％或99％一致。用于确定百分比同一性的程序和算法可以根据本领域已知的方法来执行。
所述细胞可以是分离的哺乳动物细胞，诸如体外培养的细胞(细胞培养物)或从受试者获得的细胞。在一个实例中，所述细胞是人类细胞。在另一个实例中，受试者是但不限于人、犬、猪、牛、鼠、啮齿动物、猫科动物、灵长类(包括非人灵长类)和马。即，嵌合蛋白对哺乳动物细胞的处理、暴露、接触或施用可以在体外或离体进行。
哺乳动物细胞可以是任何合适的类型。它可以是人类细胞、灵长类动物细胞、实验室动物(诸如啮齿动物或兔)的细胞、农场动物或家畜(诸如马、绵羊、山羊或牛)的细胞或伴侣动物(例如狗或猫)的细胞。
同样，受试者可以是人、灵长类动物、实验室动物、农场动物、家畜或伴侣动物。
在一些实施方案中，c-Myc依赖性癌症是子宫颈、结肠、乳腺、肺或胃的癌或肿瘤。
在一些实施方案中，为了蛋白生产和纯化的目的，所述嵌合融合蛋白可以包含合成标签，诸如聚组氨酸标签、HQ标签、HN标签、FLAG标签或HAT标签或多种以上标签。在一些实施方案中，聚组氨酸标签可与tPE结构域Ia的N末端融合。聚组氨酸标签可以是例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个残基的长度。
该药物组合物可以包含药学上可接受的载体或一种或多种其他成分。
该嵌合融合蛋白或药物组合物(下文“组合物”)可以根据所考虑的特定情况所需的预防有效量或治疗有效量向受试者施用。组合物的实际量和施用组合物的比率和时间线将取决于所要治疗的癌症的性质和严重程度或所需的预防。诸如剂量决定之类的治疗处方将在负责对象护理的医学从业者或兽医的技能之内。然而，典型地，用于向受试者施用的组合物将包括约0.01mg至100mg的化合物/kg体重。在另一个实例中，本文公开的组合物以约0.1至10mg/kg体重的量施用。在又一个实例中，组合物或化合物将以0.1mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至5mg/kg、1mg/kg至2.5mg/kg、2.5mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至7.5mg/kg、7.5mg/kg至10mg/kg、至少1mg/kg、至少1.5mg/kg、至少1.8mg/kg、至少2mg/kg、至少2.5mg/kg、至少2.8mg/kg、至少3mg/kg、至少3.2mg/kg、至少3.5mg/kg、至少4mg/kg、至少4.5mg/kg、至少5mg/kg、至少5.5mg/kg、至少6mg/kg、至少6.5mg/kg、至少7mg/kg、至少7.5mg/kg、至少8mg/kg、至少8.5mg/kg、至少9mg/kg、至少9.5mg/kg或至少10mg/kg的量施用。
在一个实例中，本文所述的要施用的量应被理解为每天的施用方案。在另一个实例中，所述药物将每天、每周、每周两次(每一周两次)、每周三次、每两周一次、每月一次(即一月一次))或其任何组合向受试者施用。例如，所述药物可以在第一周每天施用，并且在随后的4周每周施用两次。或者，在另一个实例中，可以在治疗的前2周每周向受试者施用药物两次，然后再3个月每月一次。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”是指治疗疾病状态或症状、预防疾病的建立或以任何方式预防、阻碍、延缓或逆转疾病或其他不良症状的进展的任何和所有应用。
本文所用的术语“治疗(treat或treating)”旨在指提供药学有效量的肽或其相应的药物组合物或药物，其足以预防性地作用以防止变衰弱和/或不健康状态的发展；和/或向受试者提供足够量的复合物或其药物组合物或药物，以减轻或消除疾病状态和/或疾病状态的症状以及变衰弱和/或不健康的状态。
如本文和上文所述的融合蛋白可以配制成适于施用的组合物，例如药物组合物。当适用时，肽或蛋白质可以与药学上可接受的载体一起施用。“载体”可包括任何药学上可接受的载体，只要该载体可与制剂的其他成分相容且对患者无害。因此，可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制用于使用的药物组合物，所述生理学上可接受的载体包含有助于将活性化合物加工成药学上可使用的制剂的赋形剂和助剂。合适的制剂取决于所选择的施用途径。因此，在一个实例中，本公开描述了药物组合物，其包含但不限于本文所述的肽、用于表达所述肽的分离的核酸分子或用于扩增本文所述的分离的核酸分子的载体。在另一个实例中，本公开描述了编码如本文所述的肽的分离的核酸分子。在另一个实例中，本公开描述了包含如本文所述的分离的核酸分子的载体。在一个实例中，该药物组合物包含如本文所述的肽。在又一个实例中，该药物组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、媒介或载体。因此，在一个实例中，如本文公开的肽可以进一步包含选自但不限于药学上可接受的载体、脂质体载体、赋形剂、佐剂或其组合的化合物。
如本文所公开的肽的组成、形状和剂型类型通常将取决于预期用途而变化。例如，用于疾病或相关疾病的急性治疗的剂型可以含有比用于相同疾病的慢性治疗的剂型更大量的一种或多种活性化合物。类似地，与用于治疗相同疾病或病症的口服剂型相比，肠胃外剂型可含有更少量的一种或多种活性化合物。对于本领域技术人员而言，本发明所涵盖的具体剂型彼此不同的这些和其他方式将是显而易见的。剂型的实例包括但不限于：片剂；囊片；胶囊，诸如软弹性明胶胶囊；扁囊剂；锭剂；糖锭；分散剂；栓剂；软膏剂；泥敷剂(巴布剂)；糊剂；粉剂；敷料；乳霜剂；膏药剂；溶液；贴剂；气溶胶(例如，鼻喷雾剂或吸入器)；凝胶；适于患者口服或粘膜施用的液体剂型，包括悬浮剂(例如水性或非水性液体悬浮剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；特别适合于患者肠胃外施用的液体剂型；和可重构以提供适于患者肠胃外施用的液体剂型的无菌固体(例如，结晶或无定形固体)。因此，在一个实例中，本文公开的肽以选自但不限于以下的形式提供：片剂、囊片、胶囊、硬胶囊、软胶囊、软弹性明胶胶囊、硬明胶胶囊、扁囊剂、锭剂、糖锭、分散剂、栓剂、软膏剂、泥敷剂、巴布剂、糊剂、粉剂、敷料、乳霜剂、膏药剂、溶液、贴剂、气溶胶、鼻喷雾剂、吸入器、凝胶、悬浮液、水性液体悬浮液、非水性液体悬浮液、水包油乳液、油包水液体乳液、溶液、无菌固体、结晶固体、无定形固体、用于重构的固体或其组合。
该组合物可以以任何合适的方式向受试者施用，包括：肠胃外、局部、口服、通过吸入喷雾、直肠、鼻、颊、阴道或经由植入式储器。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。
药学上可接受的载体可以包括任何合适的稀释剂、佐剂、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂或抗氧化剂。应当理解，药学上可接受的载体应当是无毒的，并且不应当干扰融合蛋白的效力。载体或组合物的任何其他添加剂的确切性质将取决于施用途径和所需的治疗类型。药物组合物可以例如通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或冻干工艺的方式制备。
组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些形式是本领域技术人员已知的。对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在需要治疗的部位注射，组合物可以是肠胃外可接受的水溶液形式，其具有合适的pH、等渗性和稳定性。
组合物的口服可接受的剂型包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、粉剂、脂质体、颗粒、球、糖衣丸、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮剂等。合适的口服形式是本领域技术人员已知的。片剂可以包括固体载体，如明胶或佐剂或惰性稀释剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液，或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二醇类。这类组合物和制剂通常含有至少0.1wt％的嵌合融合蛋白，且在一个实例中，至多约25wt％，这取决于其在给定载体中的溶解度。
该组合物可以局部施用，特别是当治疗的靶标包括通过局部施用容易接近的区域或器官时，包括眼睛、皮肤或下肠道的癌症。所述组合物可以以溶液、悬浮剂、乳剂、软膏剂、乳霜剂、洗剂、糊剂、凝胶、泡沫或气溶胶的形式施用。合适的局部形式是本领域技术人员已知的。
该组合物可以包括用于将该化合物递送至特定器官、组织或癌症类型和/或用于确保该化合物能够例如通过皮肤吸收或通过肠道摄取而不损失生物功效的递送媒介。递送媒介可以包含例如脂质、聚合物、脂质体、乳剂、抗体和/或蛋白质。脂质体特别优选用于通过皮肤递送化合物。
该组合物可以使用缓释系统递送，例如含有该化合物的固体疏水性聚合物的半渗透基质。各种缓释材料是可获得的并且是本领域技术人员熟知的。缓释胶囊可根据其化学性质释放化合物约1至20周。
可将组合物与一种或多种其他活性剂一起向受试者施用以实现最佳的预防或治疗效果。活性剂可以是例如烷化剂、血管生成抑制剂、抗雄激素、抗雌激素、抗代谢物、细胞凋亡剂、芳香酶抑制剂、细胞周期控制剂、细胞应激物、细胞毒素、细胞保护剂、激素、免疫治疗剂、激酶抑制剂、单克隆抗体、铂剂、呼吸抑制剂、类视黄醇、信号转导抑制剂、紫杉烷和拓扑异构酶抑制剂。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。在发生冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅仅是说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。
定义
除非另外指明，否则如本文所用，以下术语具有其赋予的含义。
如在说明书和权利要求书中使用的，单数形式“一个/种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。标准单或三字母代码用于表示氨基酸。
“片段”是保留至少一部分治疗和/或生物学活性的天然生物活性蛋白的截短形式。
“嵌合”蛋白含有至少一种融合多肽，该融合多肽包含在序列中与天然存在的序列中位置不同的区域。该区域通常可存在于单独的蛋白中，并在融合多肽中集合在一起；或者它们通常存在于同一蛋白质中，但以新的排列位于融合多肽中。例如，可以通过化学合成或通过产生和翻译其中肽区域以所期望关系编码的多核苷酸来产生嵌合蛋白。
“缀合的”、“链接的”和“融合(fused、fusion)”在本文中可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组方式在内的任何方式将两种或更多种化学要素或组分连接在一起。
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中氨基酸在氨基至羧基末端方向上的顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。
“重组体”是指体外克隆、限制和/或连接步骤以及产生可以在宿主细胞中潜在表达的构建体的其他过程的各种组合的产物。
如本文所用，术语“PE”是指铜绿假单胞菌外毒素A(‘PE’)，其是铜绿假单胞菌细菌的毒性毒力因子。PE表达为具有638个氨基酸长度的新生蛋白，但在其N末端的具有25个氨基酸的高度疏水的前导肽在分泌过程中被切割。PE包含不同的功能和结构域。在前导肽之后，PE具有由反平行β折叠组成的受体结合结构域Ia(氨基酸1至252)和具有六个连续α-螺旋的结构域II(氨基酸253至364)，这使得PE能够跨细胞膜易位，例如从内质网易位至细胞溶质。结构域II之后是结构域Ib(氨基酸365-404)和结构域III(氨基酸405-613)。结构域Ib的最后4个残基(氨基酸400-404)与结构域III一起形成具有ADP-核糖基转移酶活性的毒素的催化亚基。
具体实施方式
本发明的优选特征、实施方案和变型可以从本部分中认识到，本部分为本领域技术人员提供了执行本发明的足够信息。不认为本部分以任何方式限制任何前述部分的范围。
材料和方法
基因合成和克隆
使用基因合成(Thermo Fisher Scientific，Carlsbad,CA)合成tPE(SEQ ID NO：10)、tPE-H1(SEQ ID NO：14)和tPE-H1neg(SEQ ID NO：13)的序列，并克隆至pET100/D-TOPO载体中。
细胞系培养和稳定转导
所有细胞系均来自ATCC。根据制造商的说明书(Invitrogen)产生慢病毒。用经E-Box启动子表达虫萤光素酶的Cignal Lenti Myc报道基因(Qiagen)和经CMV启动子表达海肾萤光素酶的CMV-海肾萤光素酶对照CLS-RCL转导WT A431细胞。在菌落分离和虫萤光素酶/海肾萤光素酶表达水平测试后选择单个克隆。于37℃、10％CO2的培养箱中，将所有细胞系(A431和HepG2)均保持在补充有10％胎牛血清的高葡萄糖Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中。所有实验均以解冻后少于10次传代的细胞进行。
虫萤光素酶和海肾萤光素酶活性读数
将40,000个A431-Ebox-luc-CMV-Ren细胞接种在96孔板(Falcon)中48小时。使用Promega Dual-Glo萤光素酶测定系统，根据制造商的方案检测发光，并使用TecanInfinite M200微板读数器使用100ms积分时间读取。
细菌表达
将先前描述的纯化质粒导入大肠杆菌(E.coli)菌株Epicurian BL21(Stratagene,USA)。培养物在37℃生长直至A600达到0.5，然后通过在LB培养基中加入异丙基-b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(0.1mM)诱导蛋白表达。在37℃诱导2小时后，通过在4℃，3000g离心30分钟回收细菌。
tPE、tPE-H1和tPE-H1neg的纯化
将表达tPE、tPE-H1或tPE-H1neg的细菌重悬于3mL裂解缓冲液(Tris50mM pH8，NaCl 170mM，咪唑20mM，脲6M，NP40 0.5％v/v)中，得到相当于60mL细菌培养物的沉淀。
将溶液均化并超声处理。通过在4℃，16,000g离心30分钟弃去不溶性物质。可溶性tPE、tPE-H1或tPE-H1neg在Ni-NTA亲和层析树脂(Qiagen，USA)上纯化。用10倍体积的裂解缓冲液洗涤树脂，所述裂解缓冲液与含有tPE、tPE-H1或tPE-H1neg的细菌提取物在轨道轮上在4℃温育过夜。然后将树脂用10倍体积的洗涤缓冲液(Tris 50mM pH8，NaCl 170mM，咪唑40mM，脲6M，NP40 0.5％v/v)洗涤两次。tPE、tPE-H1或tPE-H1neg用1体积洗脱缓冲液(Tris 50mM pH8，NaCl 170mM，咪唑1M，脲6M，NP40 0.5％v/v)洗脱两次。
将洗脱物注射到Slide-A-lyzer透析盒20,000MWCO(Thermo Scientific)中于3个100体积PBS浴中持续8-16小时。通过在15,000g离心透析液30分钟，将上清液中纯化的蛋白质的量与重悬于相同体积中的沉淀部分进行比较，来测试溶解度。
tPE、tPE-H1、tPE-H1neg定量和质量控制
通过Bradford通过将595nm处的光密度(OD595)与BSA标准品比较来完成纯化的蛋白质定量。
通过将在laemmli蓝中变性并于95℃加热5分钟的样品进行SDS-PAGE，然后进行instablue染色，来进行纯度控制。
使用A431 E-BoxLuc/CMVRen剂量反应模型，通过在10至100nM的浓度温育来测试tPE-H1活性。要求是在37℃温育6小时的tPE-H1 EC50必须在25nM范围，对海肾萤光素酶没有影响。tPE和tPE-H1neg对虫萤光素酶和海肾萤光素酶的影响必须没有显著影响。
在MG63(人骨肉瘤)细胞上测试在200nM温育1小时的tPE、tPE-H1，然后进行细胞裂解，以显示细胞摄取和细胞分级以示出它们在细胞核部分中的存在。
在MG63上测试在500nM温育1小时的tPE、tPE-H1，然后用靶向PE的抗体进行免疫荧光，以显示它们在核相关核内体(NAE)中的存在。
在sec61B和SUN2的RNAi敲低72小时后，在A431E-BoxLuc/CMVRen模型上测试在50nM温育6小时的tPE、tPE-H1。要求是在敲低的情况下必须观察到对萤光素酶的拯救。
RNAi敲低
敲低实验在384孔板(384黑色透明；Greiner)中进行。用25nM siRNA以每孔7.5μlOpti-MEM(GIBCO，Invitrogen)，10％HiPerFect(QIAGEN)进行反向转染。复合物形成20分钟后，向各孔中加入5000A431 EBOX-虫萤光素酶/CMV-海肾萤光素酶，并在37℃、10％CO2温育72小时。Sec61B siRNA序列：GCAAGUACACUCGUUCGUA。SUN2 siRNA序列：CCUAUGGGCUGCAGACAUU。
tPE-H1处理后的细胞分级
将细胞以所需的密度接种到六孔培养皿(Thermo Fisher Scientific)中，并在37℃、10％CO2温育16小时。用模拟(未处理的细胞)或tPE-H1 200nM处理细胞1小时，然后根据制造商的方案用细胞表面蛋白分离试剂盒(#89881，Thermo Fisher Scientific)分级。此外，将细胞溶质部分在15000g离心15分钟以除去膜污染物。将样品在Laemmli蓝2X中变性，并在95℃热变性5分钟。将样品上样至SDS-PAGE，然后进行蛋白质印迹(western blot)。
tPE或tPE-H1处理后的免疫共沉淀
将A431细胞以所需的密度接种到六孔培养皿(Thermo Fisher Scientific)中，并在37℃、10％CO2温育16小时。用模拟、tPE或tPE-H1 200nM处理细胞1小时，然后在4℃在RIPA缓冲液中裂解20分钟，并在4℃在15000g离心20分钟。在4℃在轨道轮上向可溶性部分加入c-myc抗体(#32，Abcam)持续4小时。加入蛋白ASepharose(GE Healthcare)并在轨道轮上在4℃温育过夜。洗涤3次后，将蛋白质在1体积的Laemmli蓝2X中洗脱并在95℃热变性5分钟。在蛋白质印迹前将样品在SDS-PAGE上电泳。将膜在牛奶中封闭，并与抗Max(#199489，Abcam)和抗c-Myc(#32072，Abcam)一起温育。
tPE-H1处理后细胞增殖
细胞以10％到20％的融合度接种。24小时后，将细胞与不同剂量的tPE-H1在37℃、10％CO2温育14天。使用IncuCyte
Figure BDA0002515174420000201
活细胞分析系统进行活体成像。每6小时获取明场图像。使用IncuCyte
Figure BDA0002515174420000202
活细胞分析软件分析图像。
tPE-H1处理后的DRAQ7测定
在96孔板中每孔接种25000个HepG2细胞。在37℃温育24小时后，用100nM tPE-H1以500倍稀释制备DRAQ7染料。
通过使用Operetta机器(Perkin-Elmer)以20x放大倍数以每4小时采集9个明场和远红图像场持续3至5天来追踪细胞死亡。机器保持平板在37℃、8％CO2温育。
值得注意的是，上述实验也使用tPE-Omomcy融合蛋白进行，其结果示于图2B和图12-15中。tPE-Omomyc融合蛋白的浓度如图12和14中的x轴所示；针对图2B，200nM；而针对图13和15，10nM。
tPE-H1处理后的RT-PCRQ
在6孔板(Falcon)的每孔中接种400000个A431细胞持续24小时，然后在37℃与100nM tPE-H1温育16小时。使用RNeasy迷你试剂盒(RNeasy mini kit)(Qiagen，Ref.no74106)按照制造商描述的方案分离总RNA。
使用用于RT-PCR的SuperScript III第一链合成系统(SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR)(Invitrogen，货号18080051)按照制造商描述的方案逆转录10μg总RNA。
通过实时定量RT-PCR确定在RT2 ProfilerTM PCR阵列人类MYC靶标(RT2ProfilerTM PCR Array Human MYC Targets)(Qiagen，Cat.no.PAHS-177Z)中鉴定的c-Myc调控基因的mRNA相对表达。简单地说，制备含有cDNA、RT2 SYBR Green Mastermix(Qiagen，Cat.no.330523)和无RNA酶的水的PCR组分混合物。将25μl的PCR反应物添加至一个阵列板中的每个孔中并且使用ABI7500进行qPCR程序。PCR循环条件包括95℃初始变性步骤10分钟，然后是扩增程序40个循环，每个循环为95℃15秒和60℃60秒，每次延伸结束时获得荧光。使用比较ΔΔCT方法，使用模拟处理的样品作为校准品，并且使用管家基因HPRT作为内部对照，计算处理的和未处理的样品之间的每种基因的相对表达。
结果与讨论
本发明人开发了铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)的遗传修饰形式，其能够穿透哺乳动物细胞并到达它们的细胞核。本发明人将tPE与c-Myc抑制剂即H1肽(‘H1’)融合，产生‘tPE-H1’，Omomyc(产生tPE-Omomyc)，如图1所示。
本发明人显示tPE-H1有效地负调节受c-Myc控制的基因并且减缓细胞增殖。tPE-H1的有效性比与细胞穿透肽(诸如TAT、CAD或int(黑腹果蝇触足肽))融合的H1(以前提出的将肽递送到细胞中的方法)高至少1000倍。
为了测试tPE-H1的活性，本发明人建立了在c-Myc启动子E-Box控制下表达虫萤光素酶的稳定细胞系。在正常条件下，c-Myc与转录因子Max相互作用，结合E-Box元件并促进转录。H1破坏了c-Myc和Max之间的相互作用，这导致虫萤光素酶活性降低。作为对照，细胞在CMV启动子控制下表达海肾萤光素酶。参见图1B。
如图2所示，发现tPE-H1在温育后小于1小时内到达细胞核。tPE-H1破坏c-Myc/Max相互作用，如通过Max与c-Myc的co-IP的损失所证明的(参见图3)。剂量反应显示6小时时c-Myc依赖性虫萤光素酶活性降低，EC50＝25nM(参见图4)。最大抑制发生在温育8小时之后并且超过24小时是稳定的(参见图5)。虫萤光素酶降低是特异性地由于通过tPE将H1肽转运至细胞核。tPE本身和H1的突变形式(NELKRAFAALRDQI；SEQ ID NO：5)对虫萤光素酶没有影响或影响可忽略不计(参见图6)。
在经过6小时温育后，相比于表达E-Box控制的虫萤光素酶的A431上的tPE-H1，与H1融合的最常用的细胞靶向肽(CPP)，针对钙联接蛋白、黑腹果蝇触足肽和TAT的EC50分别为75μM、200μM和500μM(参见图7)(CAD，LLIILLRRRIRKQAHAHSK，SEQ ID NO：2；Int，RQIKIWFQNRRMKWKK，SEQ ID NO:3；TAT，GRKKRRQRRRPPQ，SEQ ID NO:4)。
用tPE-H1处理的A431细胞显示细胞增殖的剂量依赖性降低，并且在200nM以上完全没有生长(参见图8)。然而，不同细胞系的比较显示在50nM以上不存在细胞生长的情况下肝癌细胞HepG2的较高灵敏度(参见图9)且在100nM、24小时后的细胞死亡显示在肝癌治疗中潜在的高tPE-H1效率(参见图10)。在该实验条件下，A431细胞显示在tPE-H1处理下众多上调基因的减少和众多下调基因的增加，但对照基因无此变化，显示在靶(on-target)效应(参见图11)。
Omomyc是一种能结合E-Box启动子并阻止c-myc结合的myc显性负性肽。tPE与Omomyc肽偶联，产生tPE-Omomyc，其示意图示于图1。显示了tPE-Omomyc在温育1小时后位于细胞核部分中(图2B)。
为了测试tPE-Omomyc的活性，进行对A431 E-Box-虫萤光素酶/CMV-海肾萤光素酶的剂量反应，并显示在6小时时Myc依赖性虫萤光素酶活性降低，EC50＝5nM(图12)。最大抑制发生在16小时中毒之后并且稳定超过24小时内(图13)。
将对tPE-H1显示高敏感性的肝癌细胞HepG2用不同剂量的tPE-Omomyc处理，示出细胞增殖的降低并在10nM以上完全不存在生长(图14)。DRAQ7，一种特异性染色死亡细胞的标志物，在10nM tPE-Omomyc处理后24小时显示显著增加(图15)。总之，所获得的结果显示tPE-Omomyc具有比tPE-H1甚至更高的效力。具体来说，tPE-Omomyc在虫萤光素酶检测中的EC50值为5nM；10nM的tPE-Omomyc能够阻止肝癌HepG2细胞生长，并诱导细胞死亡。所有经测试的细胞系对tPE-H1的敏感性是对tPE-Omomyc的约10倍。
本领域已知肽Omomyc尽管具有固有的物理化学性质，但仍示出被动穿过质膜的能力。因此，Omomyc在其靶向c-Myc而不需要其他肽或定位序列以帮助细胞内化的能力方面似乎是自给自足的。
在本申请中，H1或Omomyc与tPE的融合允许它们通过遵循NAE途径递送至细胞核，并且分别导致25nM和5nM的出乎意料低的EC50值。这显示在本文利用的虫萤光素酶的c-myc抑制实验的结果中。此外，100nM tPE-H1和10nM tPE-Omomyc足以阻断HepG2细胞增殖并诱导细胞死亡/凋亡，这与先前描述的Omomyc的作用相比令人惊讶地低。不同启动子亲和力是MYC依赖性基因调控的特异性因素。在本领域中进一步显示，Omomyc EC50在各种测定之间有很大的不同，并且本领域技术人员将理解，当使用相同测定未生成数据时，很难比较EC50值。
虽然本领域已经显示用10μM的Omomyc浓度处理的A549细胞在细胞中显示细胞凋亡，但这与图15中的本申请中显示的数据(显示用10nM tPE-Omomyc处理的细胞的细胞死亡率)相对，图15中的数据显示细胞对10nM tPE-Omomyc敏感。这也适用于本发明人测试的不同细胞系(例如但不限于，HeLa、A431、MG63、MDA-MD231和HCT116；数据未显示)，所有数据均显示对浓度为约10nM的tPE-Omomyc敏感。
对于与tPE融合的H1或Omomyc的机制是相同的。Omomyc具有通过质膜扩散的能力(因此能够在细胞溶质中找到)。H1本身不具有这种能力。因此，在本申请中，发明人迫使这些肽采取替代的摄取途径以将这些肽带入细胞核中。
已知PE野生型(wt)蛋白跟随逆向运输到达细胞溶质。已知有效载荷或载物可以融合至PE结构域Ia和II(在本申请中的tPE)，从而实现细胞溶质递送。已知PE野生型(wt)蛋白遵循NAE途径以易位到细胞核中。然而，没有数据显示tPE被转运到细胞核。而且，以前没有数据显示tPE当与肽或蛋白质融合时导致融合肽被转运到细胞核中。
对于本文公开的Omomyc融合肽，人们会认为将Omomyc肽(10kDa)加入tPE肽(大小为40kDa)会产生50kDa的融合蛋白，这在本领域已知太大而不能被动穿过核孔复合体。因此，除非增加核定位信号，否则不会期望将50kDa的这样的大蛋白递送至细胞核。同样，tPE-H1约42kDa，且不能被动穿过核孔复合体。
此外，技术人员将假定tPE经由逆向运输到达细胞溶质的动力学将为约4至6小时，并且将需要μM浓度范围以有效抑制细胞核中的c-Myc。
本领域技术人员将进一步假定tPE立体效应对H1和Omomyc二者的风险都高，这又预期影响任何tPE融合蛋白对E-Box的亲和力。
本发明人发现与tPE偶联的Omomyc在施用1小时内到达细胞核。在本文所述的虫萤光素酶测定中，tPE-Omomyc导致EC50值为5nM，且tPE-H1 EC50值为25nM。进一步显示10nM的tPE-Omomyc和100nM tPE-H1足以完全抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞死亡/凋亡。
考虑本领域已知的内容，其示例概述于上，鉴于现有技术中关于H1和Omomyc的使用所示出和描述的，发明人已经提供了预料不到的数据。
所述肽，例如本文公开的H1肽，当与tPE融合时显示出体内活性。
这些实例包括
MEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASNELKRAFAALRDQI(SEQ ID NO：14)，和其他实例，例如SEQ ID NO：15所示出的。
总之，发现tPE-H1和tPE-Omomyc都对c-Myc显示出令人惊讶的效力。本领域技术人员可以预期与细胞靶向肽缀合的H1肽与tPE-H1一样起作用。然而，已经显示当将H1与两种类型的细胞靶向肽(Bac和SynBl)融合时，报道的用于C6细胞系细胞杀伤的有效浓度为～40μM。本发明人测试了具有细胞靶向肽的融合肽Int-H1、CAD-H1和Tat-H1。发明人观察到在500μM范围的Tat-H1、在75μM范围的CAD-H1和在200μM范围的int-H1的一些效果(参见图7)。相对比，tPE-H1在25nM具有活性。实际上，发明人观察到，与tPE-H1 50nM温育后Myc报告子活性降低>90％，与Tat-H1 1mM、CAD-H1 150μM和Int-H1 400μM温育后报告子活性降低<75％。
总之，tPE-H1的有效性比与细胞靶向肽融合的H1高1000到10000倍，这是用现有知识无法预测的结果。例如，先前以int-H1获得的数据已经使用商用int-H1构建体获得。然而，当试图使用商用int-H1构建体再现结果时观察到困难，因为没有观察到预期的效果。然后决定合成所有CPP以重复实验并确保可比较的合成条件。使用该方法，本发明人获得本文所述的结果。
在整个说明书中提及‘一个实施方案’或‘实施方案’意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，本说明书各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都指相同的实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式以一种或多种组合来组合。
在本说明书和权利要求中，词语“包含/包括/含有(comprising)”，及其派生词，包括包含包括/含有(comprises/comprise)，包括每个所述整数，但不排除包括一个或多个其他整数。
本说明书中对任何现有技术的引用不是且不应被认为是对现有技术形成公知常识的一部分的承认或任何形式的建议。
序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 靶向细胞中C-MYC的嵌合分子
<130> 9869SG5225
<160> 17
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1-对照 (H1-neg；原始未突变的H1序列)
<400> 1
Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile
1 5 10
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 钙联接蛋白 (CAD)
<400> 2
Leu Leu Ile Ile Leu Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala
1 5 10 15
His Ser Lys
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 黑腹果蝇触足肽(Int)
<400> 3
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT
<400> 4
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的H1 (S6A，F8A；也称作tPE-H1)
<400> 5
Asn Glu Leu Lys Arg Ala Phe Ala Ala Leu Arg Asp Gln Ile
1 5 10
<210> 6
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Omomyc
<400> 6
Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln
1 5 10 15
Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile
20 25 30
Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu
50 55 60
Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His
65 70 75 80
Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala
85 90
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Int-H1
<400> 7
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Asn Glu Leu Lys Arg Ala Phe Ala Ala Leu Arg Asp Gln Ile
20 25 30
<210> 8
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAD-H1
<400> 8
Leu Leu Ile Ile Leu Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala
1 5 10 15
His Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Ala Phe Ala Ala Leu Arg Asp Gln
20 25 30
Ile
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tat-H1
<400> 9
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Asn Glu Leu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Phe Ala Ala Leu Arg Asp Gln Ile
20 25
<210> 10
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPE (包含PE结构域Ia和II)
<400> 10
Met Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val
1 5 10 15
Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro
20 25 30
Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val
35 40 45
Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu
50 55 60
Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu
65 70 75 80
Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser
85 90 95
Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn
100 105 110
Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His
115 120 125
Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys
130 135 140
Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu
145 150 155 160
Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met
165 170 175
Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser
180 185 190
Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile
210 215 220
Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu
245 250 255
Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe
260 265 270
Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly
275 280 285
Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser
290 295 300
Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly
305 310 315 320
Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala
325 330 335
Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg
340 345 350
Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Ser
355 360
<210> 11
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPE，仅包含PE结构域Ia
<400> 11
Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu
1 5 10 15
Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro Ala
20 25 30
Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val Leu
35 40 45
Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser
50 55 60
Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro
65 70 75 80
Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser Trp
85 90 95
Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn Ile
100 105 110
Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His Met
115 120 125
Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu
130 135 140
Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu Met
145 150 155 160
Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met Ala
165 170 175
Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly
180 185 190
Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu
195 200 205
Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile Tyr
210 215 220
Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys Pro
225 230 235 240
Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu
245 250
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPE，仅包含PE结构域II
<400> 12
Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro
1 5 10 15
Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
20 25 30
Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala
35 40 45
Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu
50 55 60
Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu
85 90 95
Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Ser
100 105 110
<210> 13
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPE-H1-对照 (tPE-H1-neg；H1部分突出显示)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (365)..(378)
<223> H1部分
<400> 13
Met Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val
1 5 10 15
Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro
20 25 30
Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val
35 40 45
Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu
50 55 60
Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu
65 70 75 80
Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser
85 90 95
Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn
100 105 110
Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His
115 120 125
Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys
130 135 140
Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu
145 150 155 160
Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met
165 170 175
Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser
180 185 190
Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile
210 215 220
Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu
245 250 255
Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe
260 265 270
Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly
275 280 285
Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser
290 295 300
Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly
305 310 315 320
Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala
325 330 335
Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg
340 345 350
Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Ser Asn Glu Leu Lys
355 360 365
Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile
370 375
<210> 14
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPE-H1 (突变的H1序列突出显示)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (365)..(378)
<223> 突变的H1序列
<400> 14
Met Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val
1 5 10 15
Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro
20 25 30
Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val
35 40 45
Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu
50 55 60
Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu
65 70 75 80
Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser
85 90 95
Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn
100 105 110
Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His
115 120 125
Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys
130 135 140
Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu
145 150 155 160
Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met
165 170 175
Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser
180 185 190
Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile
210 215 220
Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu
245 250 255
Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe
260 265 270
Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly
275 280 285
Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser
290 295 300
Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly
305 310 315 320
Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala
325 330 335
Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg
340 345 350
Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Ser Asn Glu Leu Lys
355 360 365
Arg Ala Phe Ala Ala Leu Arg Asp Gln Ile
370 375
<210> 15
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPE- Omomyc (Omomyc序列突出显示)
<220>
<221> MISC_特征
<222> (365)..(454)
<223> Omomyc序列
<400> 15
Met Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val
1 5 10 15
Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro
20 25 30
Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val
35 40 45
Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu
50 55 60
Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu
65 70 75 80
Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser
85 90 95
Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn
100 105 110
Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His
115 120 125
Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys
130 135 140
Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu
145 150 155 160
Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met
165 170 175
Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser
180 185 190
Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile
210 215 220
Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu
245 250 255
Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe
260 265 270
Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly
275 280 285
Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser
290 295 300
Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly
305 310 315 320
Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala
325 330 335
Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg
340 345 350
Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Ser Thr Glu Glu Asn
355 360 365
Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu
370 375 380
Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu
385 390 395 400
Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala
405 410 415
Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu Ile Ser Glu Ile
420 425 430
Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln
435 440 445
Leu Arg Asn Ser Cys Ala
450
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sec61B siRNA序列
<400> 16
gcaaguacac ucguucgua 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SUN2 siRNA序列
<400> 17
ccuaugggcu gcagacauu 19

Claims (20)

1.一种嵌合融合蛋白，其包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeroginosa)外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制所述细胞核内的c-Myc活性。
2.一种包含嵌合融合蛋白的药物组合物，所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透细胞的细胞核并抑制所述细胞核内的c-Myc活性。
3.一种将c-Myc抑制剂递送至细胞的细胞核的方法，所述方法包括使包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂的嵌合融合蛋白经受所述细胞的步骤，其中所述融合蛋白能够穿透所述细胞的细胞核并抑制所述细胞核内的c-Myc活性。
4.一种将c-Myc抑制剂递送至细胞的细胞核的方法，所述方法包括以下步骤：将所述c-Myc抑制剂与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合以产生能够穿透所述细胞的细胞核并抑制所述细胞核内c-Myc活性的嵌合融合蛋白，和使所述融合蛋白经受所述细胞。
5.一种制造能够穿透细胞的细胞核的嵌合融合蛋白的方法，所述方法包括将c-Myc抑制剂与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合以产生能够穿透所述细胞的细胞核并抑制所述细胞核内c-Myc活性的嵌合融合蛋白的步骤。
6.一种预防或治疗受试者中c-Myc依赖性癌症的方法，所述方法包括向受试者施用与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂的步骤，所述融合蛋白能够穿透所述受试者的细胞的细胞核并抑制所述细胞核内的c-Myc活性。
7.一种用于预防或治疗受试者中的c-Myc依赖性癌症的嵌合融合蛋白，其中所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透所述受试者的细胞的细胞核并抑制所述细胞核内的c-Myc活性。
8.嵌合融合蛋白在制造用于预防或治疗受试者中的c-Myc依赖性癌症的药物中的用途，其中所述嵌合融合蛋白包含与遗传修饰的铜绿假单胞菌外毒素A(‘tPE’)融合的c-Myc抑制剂，所述融合蛋白能够穿透所述受试者的细胞的细胞核并抑制所述细胞核内的c-Myc活性。
9.根据权利要求1或7所述的融合蛋白、根据权利要求2所述的药物组合物、根据权利要求3至6中任一项所述的方法或根据权利要求8所述的用途，其中所述c-Myc抑制剂：能够破坏c-Myc依赖性癌症中的c-Myc依赖性通路；干扰特异性c-Myc DNA结合；或者，阻断c-Myc/Max二聚化。
10.根据权利要求1、7或9所述的融合蛋白、根据权利要求2或9所述的药物组合物、根据权利要求3至6和9中任一项所述的方法或根据权利要求8或9所述的用途，其中所述c-Myc抑制剂与tPE的C末端融合。
11.根据权利要求1、7、9或10所述的融合蛋白、根据权利要求2、9或10所述的药物组合物，根据权利要求3至6和9中任一项或权利要求10所述的方法、或根据权利要求8、9和10中任一项所述的用途，其中所述tPE包含PE结构域Ia或其生物活性片段，优选具有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示的序列。
12.根据权利要求1、7、9或10所述的融合蛋白、根据权利要求2、9或10所述的药物组合物、根据权利要求3至6和9中任一项或权利要求10所述的方法、或根据权利要求8、9和10中任一项所述的用途，其中所述tPE包含PE结构域II或其生物活性片段，优选具有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示的序列。
13.根据权利要求1、7、9或10所述的融合蛋白、根据权利要求2、9或10所述的药物组合物、根据权利要求3至6和9中任一项或权利要求10所述的方法、或根据权利要求8、9和10中任一项所述的用途，其中所述tPE包含PE结构域Ia和PE结构域II，优选具有SEQ ID NO：10所示的序列。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白、根据权利要求13所述的药物组合物、根据权利要求13所述的方法或根据权利要求13所述的用途，其中所述c-Myc抑制剂与tPE的结构域II的C末端融合。
15.根据权利要求1、7或9至14所述的融合蛋白、根据权利要求2或9至14所述的药物组合物、根据权利要求3至6和9至14中任一项所述的方法、或根据权利要求8至14中任一项所述的用途，其中所述c-Myc抑制剂是衍生自c-Myc的螺旋1(H1)羧基区域的H1肽。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白、根据权利要求15所述的药物组合物、根据权利要求15所述的方法或根据权利要求15所述的用途，其中所述H1肽具有序列NELKRAFAALRDQI(SEQ ID.NO：5)。
17.根据权利要求1、7和9至16中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求2和9至16中任一项所述的药物组合物、根据权利要求3至6和9至16中任一项所述的方法、或根据权利要求8至16中任一项所述的用途，其中所述嵌合蛋白包含N-末端聚组氨酸标签。
18.根据权利要求1或权利要求7所述的融合蛋白、根据权利要求2所述的药物组合物、根据权利要求3至6中任一项所述的方法、或根据权利要求8所述的用途，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的序列。
19.根据权利要求1、7和9至18中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求2和9至18中任一项所述的药物组合物、根据权利要求3至6和9至18中任一项所述的方法、或根据权利要求8至18中任一项所述的用途，其中所述细胞是子宫颈、结肠、乳腺、肺或胃的癌细胞。
20.根据权利要求6所述的方法、根据权利要求7所述的融合蛋白或根据权利要求8所述的用途，其中所述受试者是人。
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