WO2014046481A1 - 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물 - Google Patents

세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물 Download PDF

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    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
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    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase

Definitions

  • the present specification relates to a cell-penetrating peptide derived from telomerase, a conjugate of the cell-penetrating peptide and an active ingredient, and a supernatant including the conjugate.
  • nucleic acid proteins or nanoparticles have great potential as therapeutic materials at the molecular level, but their use is limited to tissue penetration and cell membrane resistance.
  • the development of systems that can transport these substances into cells has been a hot topic in the treatment of molecular methods.
  • intracellular transport is possible by various reagents, electroporation, or heat shock, etc., but in the case of proteins, they move into cells while maintaining their activity. It was a very difficult problem to get a clue to the solution.
  • HIV-TAT protein consisting of 11 amino acid sequences, was found to play an important role in the cellular process of transfection of HIV cells. The study was conducted.
  • Telomere is a genetic material repeatedly present at the end of a chromosome and is known to prevent damage to the chromosome or binding to another chromosome. Each time a cell divides, the telomeres get slightly shorter. After a certain number of cell divisions, the telomeres become very short, and the cells stop dividing and die. On the other hand, elongation of telomeres is known to prolong cell life. For example, cancer cells secrete telomerase, which prevents telomeres from shortening, so cancer cells can continue to proliferate without dying. .
  • One aspect of the invention is to provide a novel peptide. .
  • One aspect of the invention is to provide a polynucleotide encoding a novel peptide.
  • One aspect of the invention is to provide a cell permeable peptide.
  • One aspect of the present invention is to provide a peptide useful as an intracellular active ingredient carrier.
  • Another aspect of the present invention is to provide useful peptides for intracellular effective ingredient delivery, in particular for topical delivery to mitochondria.
  • Another aspect of the present invention is to provide a useful peptide for topically delivering to the mitochondria an active ingredient for ameliorating, preventing or treating mitochondrial-related diseases or disorders.
  • One aspect of the present invention is to provide a conjugate conjugated with the cell-penetrating peptide and the active ingredient (conjugated).
  • One aspect of the present invention is to provide a composition comprising a conjugate of a cell-penetrating peptide and an active ingredient.
  • One aspect of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising a conjugate of a cell-penetrating peptide and an active ingredient.
  • One aspect of the present invention is to provide a functional cosmetic composition comprising a conjugate of the cell-penetrating peptide and the active ingredient.
  • One aspect of the present invention is to provide a health food composition comprising a conjugate of a cell-penetrating peptide and an active ingredient.
  • One aspect of the present invention is to provide a contrast agent comprising a conjugate of a cell-penetrating peptide and an active ingredient.
  • the conjugate according to one aspect of the present invention is a conjugate of a cell-permeable carrier peptide and an active ingredient, wherein the carrier peptide is any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 A peptide comprising, a peptide having at least 80% sequence homology with the depth sequence, or a fragment thereof, wherein the peptide and fragment having at least 80% sequence homology refer to one of SEQ ID NOs: 1 to 6 A conjugate that retains the cellular permeability of the peptide.
  • the fragment may be a fragment consisting of three or more amino acids.
  • the carrier peptide may be a peptide composed of up to 30 amino acids.
  • the carrier peptide is SEQ ID NO:
  • the contrast agent according to one aspect of the present invention may be a contrast agent including any one of the conjugates mentioned above.
  • the contrast material may be for contrasting the cells.
  • the cell may be a stem cell.
  • composition according to one aspect of the invention may comprise any of the conjugates mentioned above.
  • the active ingredient is an active ingredient for the treatment or prevention of a disease
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the active ingredient is an active ingredient of a functional cosmetic
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the active ingredient is an active ingredient of a functional health food, and the composition may be a health food composition.
  • a method according to an aspect of the present invention is a method for delivering an active ingredient into a cell, comprising administering any one of the above-mentioned conjugates to a subject in need thereof.
  • the carrier peptide is a cell-penetrating peptide that performs intracellular delivery of the active ingredient, and peptides and fragments having 80% or more of sequence homology are those of one of SEQ ID NOs: 1 to 6 It may have cell permeability.
  • a method for delivering an active ingredient into a cell may be to locally deliver the active ingredient to the intracellular mitochondria.
  • the polynucleotide according to one aspect of the present invention may be a polynucleotide encoding the above-mentioned cell permeable peptide.
  • the vector according to an aspect of the present invention may be a vector including the polynucleotide.
  • the transformed cell according to an aspect of the present invention may be a transformed cell comprising the vector.
  • peptides disclosed herein or conjugates in which the peptide and the active ingredient are bound
  • the acid it is possible to easily transfer into the cell active ingredients that are difficult to penetrate into the cell. Through this, the efficacy of the active ingredient can be increased, and as a result, the dosage can be lowered, thereby minimizing side effects due to drug administration and increasing the treatment efficiency.
  • local delivery to mitochondria can enhance the effectiveness of the improvement, prevention or treatment of mitochondrial-related diseases or disorders.
  • even a very small amount of active ingredients can produce excellent effects.
  • Conjugation with a contrast agent can be used as a contrast agent to monitor cell transplantation processes or transplanted cells in cell therapy. In particular, it can be effectively used as a contrast agent for stem cells injected in vivo.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a method for preparing a recombinant DNA clone in which peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 are bound to enhanced reporter genes (enhanced green fluorescent protein, EGFP) It is.
  • enhanced reporter genes enhanced green fluorescent protein, EGFP
  • 2 to 7 are diagrams showing the number of cells taken up by binding the FITC to the peptide of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 and then treated in HeLa cell line and analyzed by flow cytometry.
  • the control group was treated only with FITC.
  • the cells were treated with Huh7 cell lines and analyzed by flow cytometry.
  • the control group was treated only with FITC.
  • each human T lymphocyte cell line was treated and analyzed by flow cytometry.
  • the control group was treated with FITC only.
  • 16 to 21 show the results of measuring cell viability and toxicity after binding FITC to peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6, treating each of the HeLa cell lines, and culturing.
  • Proteins, nucleic acids, peptides or viruses have great potential as therapeutic substances. However, due to its molecular size, its use was limited because it could not penetrate tissues and cell membranes. In addition, even small-sized substances do not penetrate the lipid bilayer of the cell membrane due to their properties and structure. Electricity
  • the transcriptional activator protein is known to act as a cell penetrating peptide capable of transporting large active substances into cells. Studies have been actively conducted. In particular, unlike TAT proteins, which are known to cause intracellular toxicity, studies on substances capable of more effectively transferring large molecules such as proteins, nucleic acids, peptides or viruses into target cells without causing toxicity in vivo Proceeded. Thus, through continuous studies, the inventors have found that peptides derived from telomerase have excellent effects as cell-permeable peptides with little cytotoxicity.
  • telomerase 8 is the sequence of human telomerase full-length protein.
  • the "name” in Table 1 below is to distinguish peptides.
  • at least one of the peptides set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 includes a "synthetic peptide" synthesized by selecting a peptide at a corresponding position among peptides contained in telomerase.
  • the term “pep” refers to a peptide having any sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6, or a peptide having 80% or more sequence homology with the sequence, or a fragment of the sequence.
  • One aspect of the present invention provides a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a peptide having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence, or a polynucleotide encoding a fragment thereof. do .
  • the polynucleotides can be used to mass produce peptides.
  • polynucleotides encoding peptides By incorporating the vector into the host cell, the peptide can be mass-produced.
  • the peptides disclosed herein may include peptides having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% homology. have.
  • the peptides disclosed herein, peptides or fragments thereof comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 and one or more amino acids, two or more amino acids, three or more amino acids, four or more amino acids, 5 or more amino acids, 6 or more amino acids, or 7 or more amino acids may comprise a peptide.
  • the amino acid change belongs to the property to change the physicochemical properties of the teat.
  • amino acid changes can be performed, such as improving the thermal stability of the peptide, altering substrate specificity, changing the optimal pH, and the like.
  • amino acid includes D-isomers and modified amino acids as well as 22 standard amino acids that are naturally incorporated into peptides. Accordingly, in one aspect of the present invention, the peptide may be a peptide including D-amino acid. Meanwhile, in another aspect of the present invention, the peptide may include a non-standard amino acid or the like which has been post-translational modified. Examples of post-translational modifications include phosphorylation, glycosylat ion, acylation (eg, acetylation, myristoylat ion and
  • Palmitoylation alkylat ions
  • chemical properties e.g., beta-elimination deimidization, Deamidation
  • structural changes e.g, formation of disulfide bridges
  • Changes in amino acids such as changes in amino acids, such as amino groups, carboxyl groups or side chains, caused by chemical reactions occurring in the process of bonding with crossl inkers.
  • Peptides disclosed herein can be wild-type peptides identified and isolated from native sources.
  • the peptides disclosed herein may be artificial variants in which one or more amino acids comprise an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted and / or inserted compared to the peptides of any one of SEQ ID NOs: 1-6.
  • Amino acid changes in the wild type polypeptide as well as in artificial variants include conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the folding and / or activity of the protein. Examples of conservative substitutions include basic amino acids (arginine, lysine and histidine), Acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and
  • hydrophobic amino acids leucine, isoleucine, valine and methionine
  • aromatic amino acids phenylalanine, tryptophan and tyrosine
  • small amino acids glycine, alanine, serine and threonine
  • the most common exchanges are Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, and Asp / Gly, and vice versa.
  • Other examples of conservative substitutions are shown in the following table.
  • hydrophobic norleucine, met ⁇ ala, val, leu, ile
  • Non-conservative substitutions will be made by exchanging a member of one of these classes for another class. Any cysteine residue that is not involved in maintaining the proper conformation of the peptide can generally be substituted with serine to improve the oxidative stability of the molecule and to prevent abnormal crosslinking. Conversely, cysteine bond (s) can be added to the peptide to improve its stability.
  • Another type of amino acid variant of the peptide is a change in the glycosylation pattern of the antibody.
  • change is meant the deletion of one or more carbohydrate residues found in the peptide and / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the peptide.
  • Glycosylation of peptides is typically either N-linked or 0-linked, wherein an N-linked carbohydrate residue is attached to the side chain of an asparagine residue.
  • Tripeptide sequences asparagine—X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are recognition sequences for enzymatic attachment of carbohydrate moieties to the asparagine side chains.
  • X is any amino acid except proline
  • 0-linked glycosylation means attaching one of the sugars N-acetyl galactosamine, galactose or xylose to hydroxyamino acid, most commonly serine or threonine, but not 5-hydroxyproline or 5-hydroxy Roxylysine can also be used.
  • glycosylation sites to the peptide is conveniently performed by changing the amino acid sequence to contain one or more of the above mentioned tripeptide sequences (for N-linked glycosylation sites). Such changes may be made by adding one or more serine or threonine residues to the sequence of the original antibody or by substituting these residues (for a 0-linked glycosylation site).
  • One aspect of the present invention provides a cell permeable peptide comprising a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6, or fragments thereof, or a peptide or Peptides having at least 80% sequence homology are provided.
  • One aspect of the present invention provides a drug carrier for delivering one or more active ingredients, a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof, or a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence. It provides a pharmaceutical composition comprising a peptide having.
  • a peptide comprising any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, or a fragment thereof, or a peptide having a sequence homology of 803 ⁇ 4> or more with the peptide sequence may act as a safe and excellent cell permeable peptide. In combination with the drug can effectively deliver into the cell.
  • a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6, or a fragment thereof, or a peptide having 80% or more sequence homology with the peptide sequence and an active ingredient to be moved are conjugated to each other.
  • the active ingredient may be one or more selected from protein, nucleic acid, peptide lipids, glycolipids, minerals, sugars, contrast materials, drugs (compounds) and chemicals (compounds).
  • the active ingredient may be a peptide.
  • the peptide as an active ingredient may be a cytokine, an antibody, an antibody fragment, a therapeutic enzyme, a soluble receptor, or a ligand.
  • CPP Cell Penetrating Peptide
  • the term “cargo” includes any substance that can move into a cell in combination with a cell permeable template, for example, any substance that wants to increase cell permeation efficiency, specifically, Active substances in drugs, cosmetics or healthy foods, more specifically substances that are not easily transported into the cell through the general route, and more specifically sugars, nanoparticles such as proteins, nucleic acids, peptides, minerals and glucose Or, but not limited to, biologicals, viruses, contrasts or other chemicals. It is a broad concept including a relief, preventing, treating or substance for diagnosis.
  • carrier peptide refers to a peptide that serves to move an active ingredient to a desired site by binding to an active ingredient.
  • the protein or peptide to be moved includes one or more of hormones, hormone analogs, enzymes, enzyme inhibitors, signal transduction proteins (or peptides), antibodies and vaccines, including but not limited to no.
  • the nucleus Acids may be naturally occurring or artificial DNA or RNA molecules and may be single stranded or double stranded.
  • the nucleic acid molecule may be more than one, and may be nucleic acid molecules of the same type (eg, having the same nucleotide sequence), or may be other types of nucleic acid molecules.
  • the virus may comprise a viral core comprising the entire virus or a nucleic acid of the virus.
  • chemicals are broad concepts, including chemicals that can function as drugs, and include natural or synthetic chemicals.
  • the drug delivered into the cell by the cell-penetrating peptide may further comprise a drug carrier such as liposomes, micelles, nanoparticles, magnetic particles, or tubular dots.
  • contrast 1 is a broad concept that includes all materials used for the imaging of structures or fluids in vivo in medical imaging.
  • Suitable contrast agents are radiopaque contrast media ( radiopaque contrast agents, paramagnetic contrast agents, superparamagnetic contrast agents, computed tomography (CT) contrast agents and other contrast agents, including but not limited to Radiopaque contrast agents (for X-ray imaging) include inorganic iodine compounds and organic iodine compounds (e.g., diatrizoat), radiopaque metals and their salts (e.g.
  • radiopaque compounds eg, calcium salts, barium salts such as barium sulfate, tantalum and tantalum oxide.
  • Gd-DTPA gadolinium diethylene triamine penta acetic acid
  • Gd-DTPA gadolinium di ethylene tr iaminepentaacet ic acid
  • Euopium, erbium, crumb, nickel and cobalt complexes for example 1,4,7, 10-tetraazacyclododecane-N, N ', N ", N"' Tetraacetic acid (D0TA), Ethylenediamintetraacetic acid (EDTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, -N ', ⁇ "-triacetic acid (D03A), 1,4,7 -Triazacyclononane — ⁇ , ⁇ "-triacetic acid (N0TA), 1,4,8,10-tetraazacyclotetradecane ', ⁇ ", ⁇ ' ⁇ tetrateacetic acid ( ⁇ ), hydroxydoxybenzyl Ethylene ⁇ diamine diacetic acid (HBED), etc.
  • Suitable superparamagnetics for example 1,4,7, 10-tetraazacyclododecane-N, N ', N ", N"' Tetraacetic acid (
  • Contrast material for MR imaging is magnetite, superparamagnetic iron oxide iron oxide (SPIO), ultraparamagnetic iron oxide (USPIO) and monocrystalline iron oxide (monocrystai line).
  • SPIO superparamagnetic iron oxide iron oxide
  • USPIO ultraparamagnetic iron oxide
  • monocrystalline iron oxide monocrystai line
  • Other suitable contrast agents may be contrast agents such as iodide and non-iodinated, ionic and nonionic CT contrast agents, and spin-labels, or other diagnostics.
  • contrast agents include, but are not limited to, ⁇ -galactosidase, green fluorescent protein, blue fluorescent protein, luciferase, and the like, which encode proteins that are readily detectable when expressed in cells. Marker genes.
  • Various labels can be used, such as radionuclides, fluorescents, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, ligands (especially hapten), and the like.
  • the contrast material is of the formula (2)
  • Ferrocenecarboxylic acid The structure of ferrocene is shown in Formula 1.
  • the conjugate of the cell-penetrating peptide and the contrast material may be Ferrocenecarboxylic -pep (Ferrocenecarboxylic-pep) of the formula (3). ⁇ 75> [Formula 3]
  • the peptide or composition may be one or more detectable
  • the label can be a compound that can be detected chemically, physically, or enzymatically or directly or indirectly to generate a signal. Labeling and subsequent detection can be performed by methods known in the art (eg, Sambrook, J., and Russel, DW (2001); and Lottspeich, F., and Zorbas H. (1998) Bioanalyt) ik, Spektrum Akademischer Ver 1 ag, Heidelberg / Berlin,
  • Labels include, but are not limited to, fluorescent labels, enzyme labels, chromogenic labels, luminescent labels, radiolabeled hapten, biotin, metal complexes, metals and colloidal gold. All these types of labels are well known in the art and are commercially available from various suppliers.
  • binding methods such as covalent or non-covalent bonds.
  • the subject to be moved may, for example, bind to the N-terminus or C-terminus of the peptide according to one aspect of the invention.
  • a peptide may be used via a disulfide bond or a covalent bond that binds the moving object to an alpha amine ( ⁇ -amine) or C-terminal lysine (K) residue of the peptide N-terminal glutamate (E). You can combine the moving target.
  • one of the peptides and the moving object may be bound to the peptide and the moving object through a non-covalent bond that surrounds the other in a form such as a capsular form.
  • a linker may be used to associate a peptide with a moving object.
  • a hyal (6—hydrazinopyridine-3-carboxylic acid, 6-hydrazinopyridine-3-carboxylic acid) linker may be used for the alpha amine of the peptide N-terminal glutamate or the amine of the C-terminal lysine residue.
  • the moving object can be bound to the peptide by binding the moving object to the linker.
  • the peptide when the moving target is DNA or RA, the peptide is introduced with a SH group (thiol group) and the DNA or RNA with a maleimide group and then a peptide.
  • SH group thiol group
  • the transfer target By linking the SH group and DNA or RA maleimide group, the transfer target can be bound to the peptide.
  • the moving target is a protein or a peptide
  • the transport peptide can be coupled to the carrier peptide in the form of a fusion protein.
  • Specific examples of the binding by the fusion protein are as follows: In preparing a primer for producing the fusion protein, the nucleotide encoding the carrier peptide is attached to the nucleotide expressing the moving target, followed by the obtained nucleotide. Is inserted into a vector, for example, a pET vector as a restriction enzyme, and expressed by introducing (transformation) BL-2KDE3) into, for example, a cell. At this time,
  • Expression inducers such as isopropyl-l-thio- -D-galactopyranoside (IPTG), can be treated to effectively express fusion proteins. After, His tag
  • fusion protein expressed through a method such as purification can be purified, and then dialyzed using PBS, and put into a kit, for example, concentrated by centrifugation for 5 to 20 minutes at 2,000 to 4,000 rpm.
  • the carrier peptide is capable of binding to a dyeing or fluorescent material, specifically fluorescein isothiocyanate (FITC) or green fluorescent protein (GFP).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • GFP green fluorescent protein
  • the FTTC may bind to the amino group (N3 ⁇ 4 + ) of the N′-terminal or C-terminal Lys of the carrier peptide.
  • the peptide and the FITC may be bound by a linker including Lys.
  • a peptide comprising any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 as disclosed herein, or a fragment thereof, or a peptide having at least 80% sequence homology with the peptide sequence may be carried.
  • the molar ratio of CPP: to be moved may be 2: 1 or more. Specifically, it may be 2: 1 or more, 3: 1 or more, 4: 1 or more, 5: 1 or more, 6: 1 or more, 7: 1 or more, 8: 1 or more, 9: 1 or more, or 10: 1 or more. This means that a plurality of carrier peptides can bind to one molecule of movement.
  • the plurality of carrier peptide molecules may be linked in series or in parallel with each other. Linked in series means binding to each other at the terminal amino acid sites of the carrier peptide. In parallel, linked in parallel means binding to each other at portions other than the terminal amino acids of the carrier peptide.
  • the molar ratio of carrier peptide: move target can be 1: 2 or more. This means that a plurality of move target molecules can bind to one carrier peptide molecule.
  • the molar ratio of the carrier peptide to the moving object may be 1: 2. Specifically, it may be 1: 2 or more, 1: 3 or more, 1: 4 or more, 1: 5 or more, 1: 6 or more, 1: 7 or more, 1: 8 or more, 1: 9 or more, or 1:10 or more. .
  • the carrier peptide according to one aspect of the present invention can be used for cell imaging or tracking the intracellular drug delivery route.
  • One aspect of the present invention provides a drug for delivering one or more active ingredients of a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof or a peptide having 80% or more sequence homology with the peptide sequence. It serves as a carrier.
  • One aspect of the invention is a drug; And applying to a subject a cell comprising a composition comprising a peptide comprising any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, or a fragment thereof, or a peptide having at least 80% sequence homology with the peptide sequence.
  • a method of delivering a drug is provided.
  • a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof, or a peptide having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence, and a contrast agent to the subject.
  • a method for tracking the route of application drug delivery to a subject comprising application is provided.
  • a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof or a conjugate of a peptide and a contrast material having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence
  • a method for tracking the route of application drug delivery to a subject including application to the subject.
  • One aspect of the present invention provides a conjugate comprising a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof or a peptide having a sequence homology of 80% or more with the peptide sequence and a conjugate of a drug to be moved.
  • a composition comprising; And a kit for intracellular drug delivery to a subject, including instructions indicative of one or more of the dosage, route of administration, frequency of administration, and redness.
  • One aspect of the present invention is an active ingredient; And a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or fragments thereof, or 80% of the peptide sequence.
  • a cosmetic or food composition comprising a peptide having sequence homology to a phase is provided.
  • Another aspect of the present invention comprises a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof, or a conjugate of an active ingredient with a peptide having at least 80% sequence homology with the peptide sequence.
  • One aspect of the present invention provides a conjugate of an active ingredient with a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof, or a peptide having 80% or more sequence homology with the peptide sequence. Including, it provides a pharmaceutical, cosmetic or food composition excellent effect of delivering the active ingredient into the cell.
  • Mitochondria are the central organs of energy metabolism in nucleated cells and are the first intracellular organs to be associated with human disease (Luft R, Ikkos D, Palmieri G, Ernster L, Afzel ius B: A case of severe hypermetabol i).
  • sm of nonthyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control a correlated clinical, biochemical, and morphological study, J CI in Invest 41: 1776 804, 1962).
  • the organ is also involved in the regulation of intracellular calcium concentrations, and the mitoconcrete respiratory chain acts as an important electron transport system for energy production and can cause the production of free radicals.
  • mitochondrial dysfunction is closely related to adult diseases such as diabetes, cardiomyopathy, infertility, blindness, kidney / liver disease and stroke (Modica-Napolitano KS, Singh KK: April mitochondria as targets for detect ion and treatment of cancer Expert Rev Mol Med 11: 1-19, 2002).
  • the mutation of the mitochondrial gene has been suggested to be involved in the invention of aging, neurodegenerative diseases, cancer diseases.
  • a mitochondrial targeting active ingredient delivery system may be provided.
  • the transport peptide is a peptide that performs local mitochondrial local delivery of the active ingredient as a peptide that migrates locally to the mitochondria in the cell, the sequence homology of> 803 ⁇ 4> Peptides and fragments having a mitochondrial targeting active ingredient delivery system, which possesses the mitochondrial targeting ability of one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 corresponding thereto.
  • compositions for controlling mitochondrial activity And a conjugate of any one of the above-mentioned conjugates, wherein the carrier peptide is a peptide that locally migrates into the mitochondria in the cell and is a peptide that performs mitochondrial local delivery of the active ingredient.
  • Peptides and fragments having more than 80% sequence homology may be a composition for controlling mitochondrial activity, having the mitochondrial targeting ability of one of the corresponding SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
  • the composition is a pharmaceutical composition for the treatment, prevention, inhibition of progression, or alleviation of symptoms of mitochondrial-related diseases or disorders. It may be a component that shows the function of treating, preventing, inhibiting progression or alleviating symptoms of a disease or disorder.
  • Mitochondrial related diseases may include, but are not limited to: Huntington's disease; sclerosis on the muscular atrophy side; MELAS
  • MERRF Myoclonus, epilepsy, and myopathy with ragged red fibers, epilepsy and myopathy of myoclonus with segmented red fibers
  • NARP / MILS Neuroogenic muscular weakness, ataxia, retinitis pigmentosa / Maternal ly inherited Leigh syndrome, neuromuscular weakness, ataxia and pigmented retinitis / maternal hereditary Reye syndrome
  • LHON Lebers hereditary optic neuropathy, lever's hereditary optic neuropathy, mitochondrial blindness
  • KSS Kearns-Sayre Syndrome
  • PMPS Pearson Marrow-Pancreas Syndrome, Pearson Bone Marrow-Pancreas Syndrome
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the polypeptide.
  • Nucleic acid molecules can be introduced into host cells according to techniques known to those of skill in the art. For example, GM GCG CGC CCG GCG CTG CTG ATG AGC CGC CTG CGC ⁇ ATT CCG AAA sequence (SEQ ID NO: 181). Nucleic acid molecules can be introduced into host cells according to techniques known to those of skill in the art. For example,
  • the host cell may be a higher eukaryotic cell, such as a mammalian cell, or a lower eukaryotic cell, such as a yeast cell, or a prokaryotic cell, such as a bacterial cell.
  • Prokaryotic strains suitable for transformation include species belonging to the genus Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Strap Thomas and Micbacteria.
  • Vectors comprising such nucleic acid molecules generally have a replication origin and selectable markers (e.g., dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture) that allow for the transformation of host cells with recombinant expression vectors. Or tetracycline or ampicillin resistance in E. coli, or S. cerevisiae TRP1 gene), and promoters that regulate transcription of protein coating sequences.
  • selectable markers e.g., dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture
  • selectable markers e.g., dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture
  • promoters that regulate transcription of protein coating sequences.
  • Useful expression vectors that can be used are known derivatives such as, for example, SV40 and pcDNA and col El, pCRl, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith, et al., Gene 67: 31-40 (1988))
  • Phage DNA such as bacteria pollasmid, pMB9 and its derivative RP4, phage DNA such as numerous derivatives of phage I such as M989, and phage DNA such as M13 and filamentary single-stranded phage DNA;
  • Yeast plasmids such as vectors derived from a combination of phage DNA and phage DNA modified for use with phage DNA or expression control sequences.
  • Mammalian expression vectors include origins of replication, suitable promoters and enhancers. It may also include essential ribosomal binding sites, polyadenylation sites, splice donor and acceptor sites, transcription termination sequences, and 5 'plumtanking non-transcription sequences. Mammalian expression vectors include inducible promoters, such as those comprising dihydrofolate reductase promoters, Any expression vector containing a DHFR expression cassette or a DHFR / methotrexate co-amplification vector such as pED (Randal J, Kaufman, 1991, Randal J. Kaufman, Current
  • GABA glutamine synthetase / methionine sulfoximine co-amplification vector
  • pEE14 Celltech
  • Vectors that direct episomal expression under the control of Epstein virus (EBV) or nuclear antigen (EBNA), such as pREP4 (Invi trogen), pCEP4 (Invi trogen), pMEP4 (Invi trogen), pREP8 (Invi trogen), pREP9 (Invitrogen), and pEBVHis (Invi trogen) can be used.
  • Selective mammalian expression vectors include Rc / CMV (Invi trogen) and pRc / RSV (Invi trogen).
  • Vaccinia virus mammalian expression vectors that can be used in the present invention include pSCll, pMJ601, pTKgptFIS and the like.
  • Yeast expression systems that can be used in the present invention include non-fusion pYES2.
  • the vector can be introduced into a variety of cellular mammals, in particular human-derived cells, as well as bacteria, yeasts, fungi, insects, lamina and plant cells.
  • suitable cells include VER0. Cells, HELA cells such as ATCC No. CCL2, CH0 cell lines such as ATCC No.
  • COS cells such as COS-7 cells and ATCC No. CRL 1650 cells, W138, BHK, HepG2, 3T3 such as ATCC No. CRL6361, A549, PC12, K562 cells, 293 cells, Sf9 cells, such as ATCC No. CRL1711 and Cvl cells such as ATCC No. CCL70, etc.
  • suitable cells include genus of prokaryotic host cell strains, such as E. coli (such as DH5-a strain), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, or Pseudomonas, Streptomyces and Staphylococcus. There are strains that belong.
  • the composition according to one aspect of the present invention is a peptide comprising any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a peptide thereof or 0.1 to 1 mg / mg peptide having a sequence homology of 80% or more of the peptide sequence
  • the content may be included in an amount of 1; zg / rag to 0.5 mg / iiig, more specifically 10; zg / mg to 0.1 mg / mg.
  • When included in the above range is not only suitable for showing the intended effect of the present invention, but also satisfies both the stability and safety of the composition, it may be appropriate to include in the above range in terms of cost-effectiveness.
  • composition according to one aspect of the present invention can be applied to all animals including humans, dogs, chickens, pigs, cows, sheep, guinea pigs or monkeys.
  • compositions according to one aspect of the present invention may be administered orally, rectal, transdermal, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intramedullary, intradural or subcutaneous.
  • Formulations for oral administration include tablets, pills, soft or hard capsules, granules,
  • Formulations for parenteral administration may be, but are not limited to, injections, drops, lotions, ointments, gels, creams, suspensions, emulsions, suppositories, patches or sprays.
  • the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may include additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, laxatives, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as necessary.
  • additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, laxatives, dispersants, surfactants, colorants, flavoring or sweetening agents as necessary.
  • Pharmaceutical compositions according to one aspect of the invention may be prepared by conventional methods in the art.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention will vary depending on the age, sex, weight, pathology and severity of the subject to be administered, the route of administration, or the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of those skilled in the art and
  • the daily dose may be for example 0.1 zg / kg / day to 1 g / kg / day, specifically 1 / / kg / day to 10 mg / kg / day, more specifically 10 zg / kg / day to 1 mg / kg / day, more specifically, may be 50 1 ⁇ 2 / kg / day to 100 / kg / day, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may be administered once to three times a day, but is not limited thereto.
  • Cosmetic compositions according to one aspect of the invention may be provided in all formulations suitable for topical application.
  • it may be provided in the form of an emulsion obtained by dispersing an oil phase in a solution, an aqueous phase, an emulsion obtained by dispersing an aqueous phase in an oil phase, a suspension, a solid, a gel, a powder paste, a foam, or an aerosol.
  • Such formulations may be prepared according to conventional methods in the art.
  • the cosmetic composition according to one aspect of the present invention may include other ingredients that may give a synergistic effect to the main effect, preferably within a range that does not impair the main effect.
  • the cosmetic composition according to an aspect of the present invention is a moisturizer, an emulsifier, a surfactant, a ultraviolet absorber, a preservative, a fungicide, an antioxidant, a pH adjuster, an organic or inorganic pigment, a fragrance, a cooling agent or a restriction agent. It may include.
  • the blending amount of the above components can be easily selected by those skilled in the art within the range that does not impair the object and effect of the present invention, the blending amount is 0.01 to 5% by weight, specifically 0.01 to 3% by weight based on the total weight of the cosmetic composition Can be.
  • the formulation of the food composition according to one aspect of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, formulated into tablets, granules, powders, solutions, solid preparations, and the like. Each formulation is formulated or formulated with ingredients commonly used in the art in addition to the active ingredient. Depending on the purpose of use, those skilled in the art can select a suitable formulation without difficulty, and synergistic effects may occur when applied simultaneously with other raw materials.
  • the daily dosage thereof is, for example, specifically 1 / g / kg / day to 10 mg / kg / day, more specifically 10 g / kg / day to 1 mg / kg / day, more specifically 50 zg / kg / day to 100 // g / kg / day, but is not limited thereto, and age, health of the subject to be administered It can vary depending on various factors such as condition and complications.
  • Preferred embodiments of the invention include the most optimal mode known to the inventors for carrying out the invention. Variations of the preferred embodiments may become apparent to those skilled in the art upon reading the foregoing description. The inventors expect those skilled in the art to make appropriate use of such variations, and the inventors expect the invention to be practiced in a manner different from that described herein. Accordingly, the invention includes all modifications and equivalents of the subject matter referred to in the appended claims, as permitted by patent law. Moreover, any combination of the above-mentioned components within all possible variations It is included in the present invention unless expressly contradicted or clearly contradicted by context. While the invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments, those skilled in the art will appreciate that various changes in form and detail may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the following claims. .
  • Peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 were prepared according to the solid phase peptide synthesis known in the art. Specifically, peptides were synthesized by coupling amino acids from the C-terminus one by one through Fmoc solid phase synthesis (SPPS) using ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon, Korea). As follows, the first amino acid at the C-terminus of the peptides was attached to the resin. For example:
  • a cocktail (Cleavage Cocktail) was added to separate peptides from Resin. 5) Cooling diethyl ether is added to the mixture, followed by centrifugation to precipitate the obtained peptide.
  • a conjugate in which peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 were conjugated with FITC was prepared as follows.
  • a fusion protein of a protein (enhanced green fluorescent protein, EGFP) (SEQ ID NO: 9, at least 10) is prepared by the following method.
  • the pEGFP-Nl enhanced green the vector as a template, a fluorescent protein (enhanced green fluorescent protein, EGFP) in pET21a (+) vector (Novagen) for cloning and 7 i to include the hanhyo small TABLE 3
  • a fluorescent protein enhanced green fluorescent protein, EGFP
  • pET21a (+) vector Novagen
  • EGFPF (forward) primer contains Ndel and EcoRI restriction enzyme cleavage site
  • EGFP-R reverse included an Xhol restriction enzyme cleavage site and thirty EGFP sequences were added.
  • KM including 5 () mM potassium chloride, 0.1% Triton X-100, ⁇ . ⁇ magnesium chloride, and 150 ⁇ of four deoxynucleotide triphosphates (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) for gene amplification tris-HCl (tris-HCl, H 9.0) was added a primer and Taq DNA polymerase hyosoeul of 2.5U of lOOpmd to the solution and, 10ng pEGFP plasmid DNA using as a template, polymerase chain half for 5 minutes at 95 ° C in the plasmid pEGFP unggi DNA
  • Ndel present in multiple cloning site (MCS) of pET21a vector
  • Each F (forward) primer comprises a Ndel restriction enzyme cleavage site and is made to add a pep (CPP) DNA sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6, each
  • R (reverse) primers were constructed to include the EcoRI restriction enzyme cleavage site and to add the pep (CPP) DNA sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
  • the synthesized oligonucleotide product was digested with Ndel and EcoRI restriction enzymes.
  • pET21a-EGFP-His tag recombinant DNA clone was cloned into Ndel and EcoRI restriction enzyme cleavage sites to prepare pET21a-pep (CPP) -EGFP-His tag recombinant DNA clone of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 (Fig. One).
  • the protein is isolated by transformation. Specifically, E. coli BL2KDE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) is transformed using a 5ml LB / Empicillin medium and then cultured in 100ml medium. In this case, empicillin is added in a 50 lig / ml ratio. Then, after stirring and incubating at 37 ° C. for about 2 to 3 hours, absorbance was measured and grown to within the range of about 0.6 to 0.8, and then 0.1 mM of IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) was used to induce the expression of the fusion protein. After treatment with ⁇ lmM and further incubated at 16 ° C ⁇ 37 ° C for 3 to 16 hours, the cells are centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes,
  • the expressed protein can be visually confirmed that the cell is overexpressed as a result of centrifugation and the cell becomes greenish. His. Remove the tag purification kit, Ni-TAT Protein Isolation Kit (Prod, # 313.14, Quiagen USA) as directed by the manufacturer.
  • the protein is purified by dialysis and concentrated. Specifically dialyzed using sterile 4 ° C PBS. First equilibrate the dialysis bag with PBS, and then take the protein solution separated above using a 5 ml injector and place it in the dialysis bag, and then dialysis overnight at 4 ° C. while stirring. Then, in order to increase the concentration of protein and remove unnecessary substances, dialyzed protein was added to BIBASPIN 20 (Prod, # VS2092, Sartorius Stedin biotech, Germany) and concentrated by centrifugation at 4 ° C at 3,000 rpm.
  • BIBASPIN 20 Prod, # VS2092, Sartorius Stedin biotech, Germany
  • Human cervical cancer cell line (Homo sapiens cervix) from ATCC HeLa cell line, adenocarcinoma cell line, was treated with 10% fetal calf serum (Invitrogen, USA), ear le's salts, non-essential amino acids, sodium pyruvate and 100 ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ penicillin in MEM (Minimum Essential Medium). 100 units / mi
  • Streptomycin was added and cultured in a 37t, 5% C0 2 incubator.
  • the cell lines were treated with peptides of SEQ ID NOs: 1 to 6 of the present invention, pep (CPP), and flow cytometry and confocal microscopy analysis to compare the degree of control and uptake. It was.
  • the cultured cell line was dispensed into chamber wells and added with 10% fetal calf serum (Invitrogen, USA), 100 iizl penicillin and 100 units / m ⁇ streptomycin to the medium at 37: 5% C0. Incubated for 12 hours in two incubators. After PBS washing, MEM (Minim ⁇
  • DAPK4 ' 6-diamidino-2—phenyl indole was stained at room temperature for nuclei, and analyzed by confocal microscopy.
  • Huh7 suspended cell line was used as a carcinoma cell lien.
  • Huh7 cell lines use RPMI 1640 medium. 10% fetal calf serum (Invitrogen, USA), 100 ug / ml penicillin and 100 units / ml streptomycin were added to the culture medium at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • Jurkat's floating cell line was used.
  • Jurkat cell lines use RPMI 1640 medium. 10% fetal calf serum (Invitrogen, USA), 100 ug / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin was added to the culture medium at 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the cultured HeLa cell line was dispensed into a 96-well plate and cultured with 10% fetal bovine serum (Invitrogen, USA), 100 g / u penicillin and 100 units. Streptomycin was added and incubated for 12 hours in a 37 ° C, 5% C02 incubator. After PBS washing, MEM (Minimum Essential Medium) was subjected to starvation for 1 hour. Each carrier peptide was incubated at 20 ° C. for 24 hours, and then cell viability and toxicity were analyzed using ⁇ assay. The results are as shown in FIGS. 16 to 21.
  • HeLa cell line (adenocarcinoma cell line) was treated with 10% fetal calf serum (Invitrogen, USA), Earle's salts, non-essential amino acids, sodium pyruvate and 100 / g / m ⁇ penicillin and 100 units / mi
  • Streptomycin was added and incubated in a 37 ° C, 5% C0 2 incubator.
  • a fusion protein is prepared by binding an enhanced green fluorescent protein (EGFP), which is a reporter gene, to peptides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 of the present invention.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • the cultured cell line is dispensed into chamber wells and 10% fetal calf into medium.
  • Nuclei were stained at room temperature with DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) and analyzed by confocal microscopy.

Abstract

본 명세서에는 세포 투과성 펩티드 및 유효성분의 컨쥬게이트(conjugate), 및 그 용도가 개시된다. 특히, 세포 투과성 펩티드로서 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 한 서열을 갖는 펩티드, 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 한 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트 및 그것을 포함하는 조성물이 개시된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
세포 투과성' 펩티드， 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물 【기술분야】
본 명세서에는 텔로머라제로부터 유래된 세포 투과성 펩티드， 그 세포 투과 성 펩티드와 유효성분과의 컨쥬게이트 및 상기 컨쥬게이트를 포함한 초성물에 관한 것이다.
【배경기술】
저분자 물질， 핵산 단백질 또는 나노입자 등은 분자 수준의 치료 물질로서 큰 잠재력을 가지고 있으나, 조직 침투 및 세포막의 침투 저항성 때분에 사용이 제 한 될 수 밖에 없다. 상기 물질들을 세포 내로 이동 시켜 줄수 있는 시스템의 개발 은 분자적 방법의 치료에서 화두가 되어 왔다. 저분자 물질, 핵산， 또는 나노입자 의 경우ᅳ 다양한 시약， 전기천공법 (electroporation) 또는 열층격 (heat shock) 등의 방법으로 세포 내 수송을 가능케 하였으나， 단백질의 경우, 활성을 그대로 유지하 면서 세포 내로 이동하는 것은 매우 어려운 문제로 해결의 실마리를 얻지 못하고 있었다. 그런데， 1980년대에 HIV의 세포막을 투과하는 연구과정에서 특정 11개의 아미노산 서열로 이루어진 HIV-TAT단백질이 세포 내로의 전달과정에서 중요한 역 할을 수행하는 것으로 밝혀져 1990년대부터 본격적으로 단백질의 세포내 전달 연구 가 진행되었다.
텔로미어 (telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서 , 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분 열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고， 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며， 그 예로 암 세포에서는 텔로머라제 (telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것 을 막기 때문에， 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 일측면은 신규 펩티드를 제공하고자 한다. .
본 발명의 일측면은 신규 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고자 한다. ·
본 발명의 일측면은 세포 투과성 펩티드를 제공하고자 한다. <7> 본 발명의 일측면은 세포 내 유효성분 전달체로서 유용한 펩티드를 제공하고 자 한다.
<8> 본 발명의 다른 측면은 세포 내 유효성분 전달체로서 특히 미토콘드리아로 국소 전달하는 유용한 펩티드를 제공하고자 한다.
<9> 본 발명의 다른 측면은 미토콘드리아 관련 질병 또는 장애의 개선， 예방 또 는 치료용 유효성분을 미토콘드리아로 국소 전달하는 유용한 펩티드를 제공하고자 한다.
<10> 본 발명의 일측면은 세포 투과성 펩티드와 유효성분이 접합된 (conjugated) 컨쥬게이트 (conjugate)를 제공하고자 한다.
<π> 본 발명의 일측면은 세포 투과성 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하 는 조성물을 제공하고자 한다.
<12> 본 발명의 일측면은 세포 투과성 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하 는 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
<13> 본 발명의 일측면은 세포 투과성 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하 는 기능성 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
<14> 본 발명의 일측면은 세포 투과성 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하 는 건강식품 조성물을 제공하고자 한다.
<15> 본 발명의 일측면은 세포 투과성 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하 는 조영제를 제공하고자 한다.
【기술적 해결방법】
<16> 본 발명의 일측면에 따른 컨쥬게이트는， 세포 투과성 운반 펩티드 (carrier peptide) 및 유효성분의 컨쥬게이트 (conjugate)로서, 상기 운반 펩티드는， 서열번 호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드, 상기 뎁티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드， 또는 그것의 단편이며 , 상기 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 및 단편은 그에 대웅하는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 한 펩티드의 세포 투과성을 보유한 것인 컨쥬게이트이다.
<17> 본 발명의 다른 측면에 따른 컨쥬게이트에서， 상기 단편은 3개 이상의 아미 노산으로 구성된 단편일 수 있다.
<18> 본 발명의 다른 측면에 따른 컨쥬게이트에세 상기 운반 펩티드는， 30개 이 하의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다.
<19> 본 발명의 다른 측면에 따른 컨쥬게이트에서， 상기 운반 펩티드는， 서열번호
1 내지 서열번호 6 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 것일 수 있다. <20> 본 발명의 일 측면에 따른 조영제는， 상기에서 언급된 어느 한 컨쥬게이트를 포함하는 조영제일 수 있다.
<21> 본 발명의 다른 측면에 따른 조영제에 있어서， 상기 조영물질은 세포를 조영 하기 위한 것일 수 있다.
<22> 본 발명의 다른 측면에 따른 조영제에 있어서, 상기 세포는 줄기세포일 수 있다.
<23> 본 발명의 한 측면에 따른 조성물은， 상기에서 언급된 어느 한 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
<24> 본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에 있어서， 상기 유효성분은 질병의 치료 또는 예방을 위한 유효성분이며， 상기 조성물은 의약 조성물일 수 있다.
<25> 본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에 있어서， 상기 유효성분은 기능성 화장 료의 유효성분이며， 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
<26> 본 발명의 다른 측면에 따른 조성물에 있어세 상기 유효성분은 기능성 건강 식품의 유효성분이며， 상기 조성물은 건강식품 조성물일 수 있다.
<27> 본 발명의 일 측면에 따른 방법은， 유효성분을 세포 내로 전달하기 위한 방 법으로서， 상기 언급된 컨쥬게이트들 중 어느 한 컨쥬게이트 (conjugate)를 이를 필 요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며， 운반 펩티드는 세포 투과성 펩티드로 서 상기 유효성분의 세포 내 전달을 수행하는 펩티드이며， 80% 이상의 서열 상동성 을 갖는 펩티드 및 단편은 그에 대웅하는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 한 펩티 드의 세포 투과성을 보유한 것일 수 있다.
<28> 본 발명의 다른 측면에 따른， 유효성분을 세포 내로 전달하기 위한 방법 방 법은 유효성분을 세포 내 미토콘드리아로 국소 전달하는 것일 수 있다.
<29> 본 발명의 일측면에 따른 세포 투과성 펩티드는， 서열번호 1 내지 서열번호
6 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 일 수 있다.
<30> 본 발명의 일 측면에 따른 폴리뉴클레오티드는, 상기 언급된 세포 투과성 펩 티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
<31> 본 발명의 일 측면에 따른 백터는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터일 수 있다.
<32> 본 발명의 일 측면에 따른 형질전환세포는， 상기 백터를 포함하는 형질전환 세포일 수 있다.
【유리한 효과]
<33> 본 명세서에 개시된 펩티드， 또는 상기 펩티드와 유효성분이 결합된 컨쥬게 이트를 이용하면 세포 내로 투과되기 어려운 유효성분들을 용이하게 세포 내로 전 달할 수 있다. 이를 통해 유효성분의 효능을 높일 수 있고， 그 결과 투여량을 낮출 수 있으므로， 약물 투여에 따른 부작용을 최소화하고 치료 효율을 높일 수 있다. 특히， 미토콘드리아로 국소 전달함으로써 미토콘드리아 관련 질병 또는 장애의 개 선, 예방 또는 치료 효능을 높일 수 있다. 화장품의 경우에도 극소량의 유효성분만 으로도 뛰어난 효과를 낼 수 있다. 조영물질과의 컨쥬게이트를 이용하면 세포치료 에서의 세포 이식 과정 또는 이식된 세포를 모니터링하기 위한 조영제로 활용될 수 있다. 특히, 생체 내에 주입된 줄기세포를 위한 조영제로서 효과적으로 이용될 수 있다
【도면의 간단한 설명】
<34> 도 1은 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩티드들에 표지 유전자 (reporter gene)인 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)을 결합시킨 재조합 DNA클론 (clone) 제조 방법을 도식화한 것이다.
<35> 도 2내지 도 7은 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩티드에 FITC를 결합시킨 후 각각 HeLa세포주에 처리하고 유세포 분석기 (Flow cytometry )로 분석하여 uptake 된 세포의 수를 나타낸 도면이다. 대조군은 FITC만을 처리한 것이다.
<36> 도 8 내지 도 11은 서열번호 1 내지 서열번호 3 및 서열번호 6의 펩티드에
FITC를 결합시킨 후 각각 Huh7세포주에 처리하고 유세포 분석기 (Flow cytometry) 로 분석하여 uptake 된 세포의 수를 나타낸 도면이다. 대조군은 FITC만을 처리한 것이다.
<37> 도 12 내지 도 15는 서열번호 1 내지 서열번호 3 및 서열번호 6의 펩티드에
FTTC를 결합시킨 후 각각 사람 T림프구 세포주에 처리하고 유세포 분석기 (Flow cytometry)로 분석 하여 uptake 된 세포의 수를 나타낸 도면이다. 대조군은 FITC 만을 처리한 것이다.
<38> 도 16 내지 도 21은 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩티드에 FITC를 결합시 킨 후 각각 HeLa세포주에 처리하고 배양한 후 세포생존율과 독성을 측정한 결과이 다.
<39> 도 22 내지 27은 pep(CPP)- EGFP융합 단백질의 세포 투과능 실험으로서 유 세포 분석기 (Flow cytometry)와 공초점현미경 (Confocal microscopy) 분석을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태]
<40> 단백질， 핵산， 펩티드 또는 바이러스 등은 치료 물질로서 큰 잠재력을 가지 고 있으나， 분자 수준의 크기를 가지므로 조직 및 세포막을 침투하지 못해 그 사용 이 매우 제한적이었다. 또한 크기가 작은 물질이라 하더라도， 그 성질이나 구조상 세포막의 지질 이중층을 투과하지 못 하는 경우가 많다. 이에 전기
천공법 (electroporation) 또는 열 층격 (heatshock) 등으로, 단백질， 핵산， 펩티드 또는 바이러스 등을 세포 내로 이동시키려는 시도가 있었으나， 세포막에 손상을 주 지 않음과 동시에 상기 물질들의 활성을 그대로 유지하면서 상기 물질들을 세포 내 로 이동시키기는 곤란하였다. 그러던 중 인간 면역 결핍 바이러스 (Human
Immuno-def iciency Virus: HIV)로부터 유래된 TAT(Trans-Act i vat ing
Transcriptional activator) 단백질이 거대 활성 물질들을 세포 내로 이동시킬 수 있는 세포 투과성 펩티드 (Cell Penetrating Peptide)로 작용할 수 있음이 알려지면 서， 이에 대한 연구가 활발히 진행되었다. 구체적으로 세포 내 독성을 야기한다고 알려진 TAT단백질과는 달리 생체 내 독성을 야기하지 않으면서도， 더욱 효과적으 로 단백질, 핵산, 펩티드 또는 바이러스 등과 같은 거대 분자를 표적 세포 내로 이 동시킬 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되었다. 이에 본 발명자들은 지속적인 연 구를 통해， 텔로머라제로부터 유래된 펩티드가 세포 독성이 거의 없으면서도 세포 투과성 펩티드로서 우수한 효과를 가짐을 발견하였다.
<4i> 서열번호 1 내지 서열번호 6에 기재된 펩티드는 아래 표 1과 같다. 서열번호
8는 인간의 텔로머라제 전장 단백질의 서열이다. 아래 표 1의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열번호 1 내지 서열 번호 6에 기재된 펩티드 중 하나 이상의 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드 "를 포함한다. 본 명세서에서 "pep"이라 함은 서열번호 1 내지 서열번호 6중 어느 한 서열을 갖는 펩티드, 또는 그 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 상기 서열의 단편을 총칭 하는 용어이다.
<42> [표 1]
9 7800/CT0ZaM/X3d Telomeras [ 1-1132] MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRR 1132 e LGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPP aa
AAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFA LLDGARGGPPEAF SVRSYLPNTVTDALRGSGAWG LLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPP LYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREA GVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEP ERTPVGQGS HPGRTRGPSDRGFCWSPARPAEEA TSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWD TPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSL TGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMR PLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVC AREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVY GFVRACLR LVPPGLWGSRHNERRFLRNT KF I SLG KHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEH RLREE I LAKFLHWLMSVYWELLRSFFYVTETTFQK NRLFFYRKSWSKLQS I G I RQHLKRVQLRELSEAEV RQHREARPALLTSRLRF I PKPDGLRP IVNMDYWGA RTFRREK AERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGA SVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVT GAYDTIPQDRLTEVIASI IKPQNTYCV RYAWQKA AHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPL RDAW I EQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVR I RG KSYVQCQG I PQGS I LSTLLCSLCYGDMENKLFAG I R RDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEY GC NLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPW CGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTS I RASLTFNRGFKA GR MRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIY K I LLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRV I SD TASLCYS I LKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLC HQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGT TLTALEAAANPALPSDFKT I LP
본 발명의 일측면은 서 열번호 1 내지 서 열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티 드 서 열과 80% 이상의 서 열 상동성을 갖는 펩티 드 , 또는 그 단편을 코딩 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다 . 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 펩티드를 대량 생산할 수 있다 . 예컨대 , 펩티드를 코딩 하는 폴리뉴클레오티드를 포 함하는 백터를 숙주 세포에 넣어 배양함으로써， 펩티드를 대량 생산할 수 있다.
<44> 본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상， 85% 이상， 90% 이상, 95% 이상， 96% 이상， 97% 이상， 98% 이상， 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있 다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는， 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하 나를을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미 노산， 3개 이상의 아미노산， 4개 이상의 아미노산， 5개 이상의 아미노산, 6개 이상 의 아미노산또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.
<45> 본 발명의 일측면에서， 아미노산 변화는 티드의 물리화학적 특성이 변경되 도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어， 펩티드의 열안정성을 향상시키고， 기질 특이 성을 변경시키고， 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
<46> 본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라， 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편， 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형 (post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산 화 (phosphorylation)， 당화 (glycosylat ion)， 아실화 (acylation) (예컨대 , 아세틸화 (acetylation), 미리스토일화 (myristoylat ion) 및
팔미토일화 (palmitoylation)를 포함)， 알킬화 (alkylat ion) ,
카르복실화 (carboxylation), 히드록실화 (hydroxylat ion) , 당화반웅 (glycat ion)， 비 오티닐화 (biotinylation), 유비퀴티닐화 (ubiquiUnylation), 화학적 성질의 변화 ( 예컨대 베타 -제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화 (예컨대， 이황화물 브 릿지의 형성) 를 포함한다. 또한， 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한
가교제 (crossl inker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반웅들에 의해 생기는 아 미노산의 변화, 예컨대 아미노기， 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
<47> 본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1 내지 서 열번호 6 중 어느 하나의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치 환 결실 및 /또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는， 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩 (folding) 및 /또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산 (아르기닌, 리신 및 히스티딘)， 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산)， 극성 아미노산 (글루타민 및
아스파라긴)， 소수성 아미노산 (루신， 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미 노산 (페닐알라닌， 트립토판 및 티로신)， 및 작은 아미노산 (글리신， 알라닌， 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val , Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그 리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.
<48> [표 2]
<49> 펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴 리펩티드 골격의 구조， 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서 의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과， 또는 (C) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과 가상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성 에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성 : 노르루이신, met^ ala, val , leu, ile;
(2) 중성 친수성 : cys, ser , thr;
(3) 산성： asp, glu;
(4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비ᅳ보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으 로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성 을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합 ( 들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다
펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및( 또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 .
나타낸다.
펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 0-연결된 것이다, N-연결된 이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴— X-세린 및 아스파라긴 -X-트레오닌 (여기서， X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서， 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으 로써， 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. 0-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸 갈락토사민， 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적 으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만， 5-히드록시프를린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (0- 연결된 글리코실화 부위의 경우).
본 발명의 일측면은 세포 투과성 펩티드로서 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드, 또는 그 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 일측면은 하나 이상 의 유효성분을 전달하기 위한 약물 전달체로서 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어 느 하나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 서열 번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드， 또는 그의 단편들인 펩 티드 또는 상기 펩티드 서열과 80¾> 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 안전하면 서도 우수한 세포 투과성 펩티드로 작용할 .수 있으므로， 약물과 결합하여 약물올 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다.
<6i> 본 발명의 일측면은 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드, 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상 동성을 갖는 펩티드와 이동 대상인 유효성분이 서로 컨쥬게이션된 컨쥬게이트를 제 공한다. 본 발명의 일측면에서， 유효성분은 단백질， 핵산， 펩티드 지질， 당지질， 미네랄， 당， 조영물질， 약물 (drugs) 및 화학 물질 (compounds) 증 선택된 하나 이상 일 수 있다. 본 발명의 일측면에서， 상기 유효성분은 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일측면에서， 상기 유효성분인 펩티드는， 사이토카인， 항체， 항체 단편， 치료용 효 소， 가용성 수용체, 또는 리간드일 수 있다.
<62> 본 명세서에서, "세포 투과성 펩티드 (Cell Penetrating Peptide, CPP)"는 인 ᅳ 비트로 (/ vitro) 및 /또는 인비보 (/ 에서 이동 대상 (cargo)을 세포 내로 이 동시킬 수 있는 펩티드를 의미한다. 본 명세서에서, "이동 대상 (cargo)"은 세포 투 과성 템티드와 결합하여 세포 내로 이동할 수 있는 물질을 모두 포함하며 , 예를 들 어 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질, 구체적으로 약물， 화장품 또는 건 강 식품의 유효 물질， 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 물질, 보다 더 구체적으로 단백질， 핵산， 펩티드， 미네랄, 포도당을 예로 들 수 있는 당, 나노 입자， 생물학적 제제, 바이러스， 조영물질 또는 기타 화 학 물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서， "약물' '은 질병， 상처 또는 특정 증상을 완화， 예방， 치료 또는 진단하기 위한 물질을 포함하는 광 범위한 개념이다.
<63> 본 명세서에서 "운반 펩티드 (carrier peptide)"는 유효성분과 결합하여 유 효성분을 원하는 부위로 이동시키는 역할을 수행하는 펩티드를 의미한다.
<64> 본 발명의 일측면에서, 이동 대상으로서의 단백질 또는 펩티드는 호르몬， 호 르몬 유사체， 효소， 효소 저해제， 신호 전달 단백질 (또는 펩티드)， 항체 및 백신 중 하나 이상을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에서， 핵 산은 자연발생적 또는 인공적 DNA또는 RNA분자일 수 있고， 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데， 동일한 유형의 (예컨대, 동 일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고， 다른 유형으로 핵산 분자 들일 수 도 있다. DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머 (antosense oligomer),
플라스미드 (plasmid) 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되 는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에서, 바이러스는 바이러스 전체 또는 바이러스 의 핵산을 포함하는 바이러스 코어를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 화학 물질은 약물로서 기능할 수 있는 화학 물질을 포함하는 광범위한 개념으로， 천연 또는 합성 화학 물질을 포함한다.
<65> 본 발명의 일측면에서， 세포 투과성 펩티드에 의해 세포 내로 전달되는 약물 은 리포좀， 미셀, 나노 입자， 자성 입자.또는 관팀 도트와 같은 약물 전달체를 더 포함할 수 있다.
<66> 본 명세서에서 "조영물질1'이라 함은 의학적 영상 촬영 (imaging)에서 생체 내 구조 또는 유체의 조영을 위해 사용되는 모든 물질을 포함하는 광범위한 개념이다. 적합한 조영물질은 방사선비투과 조영물질 (radiopaque contrast agent), 상자성 조 영물질 (paramagnetic contrast agent), 초상자성 조영물질 (superparamagnetic contrast agent), CT (computed tomography) 조영물질 및 기타 조영물질을 포함하 나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면， 방사선비투과 조영물질 (X-레이 영상용)은 무기 요오드 화합물 및 유기 요오드 화합물 (예를 들면， 디아트리조아트)， 방사선비 투과 금속 및 그의 염 (예를 들면， 은， 금, 백금 등) 및 기타 방사선비투과 화합물 ( - 예를 들면, 칼슘염， 황산바륨과 같은 바륨염， 탄탈룸 및 산화 탄탈룸)을 포함할 것 이다. 적합한 상자성 조영물질 (MR 영상용)는 가돌리늄 디에틸렌 트리아민펜타아세 트산 (gadolinium di ethylene tr iaminepentaacet ic acid, Gd-DTPA) 및 그의 유도체， 및 기타 가돌리늄， 망간, 철， 디스프로시움 (dysprosium), 구리,
유.로피움 (europium), 에르비움 (erbium), 크름， 니켈 및 코발트 복합체， 예를 들면, 1,4,7, 10-테트라아자시클로도데칸 -N， N '， N"， N" '-테트라아세트산 (D0TA)， 에틸렌디아 민테트라아세트산 (EDTA), 1，4，7，10-테트라아자시클로도데칸 -N，- Ν' ,Ν"- 트리아세트산 (D03A), 1,4，7-트리아자시클로노난—^^ ,Ν"-트리아세트산 (N0TA), 1，4,8,10-테트라아자시클로테트라데칸 ' ,Ν",Ν'Μᅳ테트라아세트산 (ΤΕΤΑ) , 히드톡 시벤질에틸렌ᅳ디아민 디아세트산 (HBED) 등을 포함한다. 적합한 초상자성
조영물질 (MR 영상용)는 자철석 (magnetite), 초상자성 산화철 (super-paramagnetic iron oxide, SPIO) , 초소 초상자성 산화철 (ultrasmal 1 superparamagnetic iron oxide, USPIO) 및 단결정성 (monocrystai line) 산화철을 포함한다. 다른 적합한 조 영물질은 요오드화 및 비요오드화 (non— iodinated), 이온성 및 비이온성 CT조영물 질， 및 스핀 -표지 (spin-label)와 같은 조영물질 , 또는 기타 진단
활성제 (diagnostically effective agent)이다.
<67> 조영물질의 다른 예들은 β-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질， 루시페라아제, 등올 포함하나， 이에 한정되지 않는， 세포에서 발현되는 경 우， 용이하게 검출가능한 단백질을 코딩하는 마커 유전자를 포함한다.
방사선핵종 (radionuclide), 형광물질 (fluor), 효소， 효소 기질, 효소 보조인자， 효 소 저해제， 리간드 (특히， 합텐) 등과 같은 다양한 표지들이 이용될 수 있다.
<68> 본 발명의 일실시예에서， 조영물질은 하기 화학식 2의
페로센카복실산 (ferrocenecarboxylic acid)일 수 있다. 페로센의 구조는 화학식 1. 에 나타나 있다.
<69> [화학식 1]
<71> [화학식 2〕
본 발명의 일실시예에서, 세포 투과성 펩티드와 조영물질의 컨쥬게이트는 하 기 화학식 3의 페로센카복실릭 -pep(Ferrocenecarboxylic-pep)일 수 있다. <75> [화학식 3]
<76>
<77> 본 발명의 일측면에서. 펩티드 또는 조성물은 하나 이상의 검출가능한
표지 (label)와 융합될 수 있다. 표지는 화학적， 물리적, 또는 효소적 반웅에서 검 출 가능한 화합물 또는 신호를 직접 또는 간접적으로 발생시키는 화합물일 수 있다. 표지 및 그 이후의 검출은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다 (예 컨대， Sambrook, J., and Russel, D.W.(2001); 및 Lottspeich, F. , and Zorbas H. (1998) Bioanalyt ik, Spektrum Akademischer Ver 1 ag , Heidelberg/Berlin,
Germany) . 표지는 형광 표지， 효소 표지， 발색 (chromogenic) 표지， 발광 표지， 방 사선 표지 햅텐， 바이오틴， 금속 복합체， 금속 및 콜로이달 금을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 모든 유형의 표지는 당업계에 잘 알려져 있고 다양 한 공급업체로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
<78> 본 발명의 일측면에서, 펩티드에 이동 대상 (cargo)을 직접 결합시킬 수
있다. 본 발명의 다른 일측면에세 공유 결합 또는 비공유 결합을 예로 들 수 있는 ■ 여러 결합 방법을 통해， 펩티드에 이동 대상을 결합시킬 수 있다. 이동 대상은 예 컨대， 본 발명의 일측면에 따른 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다. 예를 들어, 디설파이드 (disulfide) 결합， 또는 펩티드 N-말단 글루타메이트 (E)의 알파 아민 (α-amine) 또는 C-말단 라이신 (K) 잔기의 아민에 이동 대상을 결합시키 는 공유 결합을 통해 펩티드에 이동 대상을 결합시킬 수 있다. 또는 펩티드와 이동 대상 중 어느 하나가 다른 하나를 캡슬 형태를 예로 들 수 있는 형태로 감싸는 비 공유 결합을 통해 펩티드와 이동 대상을 결합시킬 수 있다.
<79> 본 발명의 다른 일측면에서, 링커 (linker)를 통해 펩티드와 이동 대상을 결 합시킬 수 있다. 예를 들어， 펩티드 N-말단 글루타메이트의 알파 아민 (a-amine) 또는 C-말단 라이신 잔기의 아민에 Hynic (6—하이드라지노피리딘 -3-카르복시산， 6-hydrazinopyridine-3-carboxylic acid) 링커와 같은 링커를 도입한 후， 링커에 이동 대상을 결합시킴으로써， 펩티드에 이동 대상을 결합시킬 수 있다. <80> 본 발명의 또 다른 일축면에서， 이동 대상이 DNA또는 R A인 경우， 펩티드에 는 SH 기 (thiol 기)를 도입하고 DNA또는 RNA에는 말레이미드 기 (maleimide group) 를 도입한 후， 펩티드의 SH 기와 DNA또는 R A의 말레이미드 기를 결합시킴으로써， 펩티드에 이동 대상을 결합시킬 수 있다.
<81> 본 발명의 또 다른 일측면에서， 이동 대상이 단백질 또는 펩티드인 경우, 이 동 대상을 발현하는 DNA에 운반 펩티드를 발현하는 DNA를 결합시킨 후 이를 발현시 킴으로쎄 이동 대상과 펩티드의 융합 단백질 형태로 운반 펩티드와 이동 대상올 결합시킬 수 있다. 융합 단백질에 의한 결합의 구체적인 예는 다음과 같다: 융합 단백질을 생산하기 위한 프라이머 (primer) 제작시, 이동 대상을 발현하는뉴클레오 티드 앞에 운반 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드를 붙인 다음, 수득한 뉴클레오티 드를 제한 효소로 pET 백터를 예로 들 수 있는 백터에 삽입하고, BL-2KDE3)을 예 로 들 수 있는 세포에 도입 (transformation)하여 발현시킨다. 이때，
IPTG(isopropyl-l-thio- -D-galactopyranoside)와 같은 발현 유도제를 처리하여 융합 단백질이 효과적으로 발현되도록 할 수 있다. 이후， His tag
정제 (purification)와 같은 방법을 통해 발현시킨 융합 단백질을 정제한 후, PBS를 이용하여 투석하고, 키트에 넣어 예컨대， 2,000 내지 4,000 rpm에서 5 내지 20 여 분간 원심 분리하여 농축시킬 수 있다.
<82> 본 발명의 일측면에서， 운반 펩티드는 염색 물질 또는 형광 물질， 구체적으 로 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC, fluorescein isothiocyanate) 또는 녹 색 형광 단백질 (Green Fluorescent Protein, GFP)과 결합할 수 있다. 본 발명의 일 측면에서 FTTC는 운반 펩티드의 Nᅳ말단 또는 C-말단 Lys의 아미노기 (N¾+)와 결합할 수 있다. 말단에 Lys가 존재하지 않는 펩티드인 경우 Lys를 포함하는 링커에 의해 펩티드와 FITC를 결합시킬 수 있다.
<83> 운반 펩티드로 기능하는 본 명세서에 개시된 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 이동 대상 (cargo)과 1:1의 몰비로 결합할 수 있지만， 그 외 다른 몰비로 결합하는 것도 가능하다. 예컨대, CPP ： 이동 대상 의 몰비가 2:1 이상일 수 있다. 구체적으로, 2:1 이상， 3:1 이상， 4:1 이상， 5:1 이상， 6:1 이상， 7:1 이상， 8:1 이상， 9:1 이상 또는 10:1 이상일 수 있다. 이는 복수개 분자의 운반 펩티드가 하나의 이동 대상 분자와 결합할 수 있음을
의미한다. 복수개의 운반 펩티드 분자는 서로 직렬 또는 병렬로 연결될 수 있다. 직렬로 연결된다는 것은 운반 펩티드의 말단 아미노산 부위에서 서로, 결합함을 의 미하며， 병렬로 연결된다는 것은 운반 펩티드의 말단 아미노산 이외의 부분에서 서 로 결합함을 의미한다. 반대로， 운반 펩티드 ： 이동 대상의 몰비가 1:2 이상일 수 있다ᅳ 이는 하나의 운반 펩티드 분자에 복수개의 이동 대상 분자가 결합할 수 있음 을 의미한다. 예컨대， 운반 펩티드 ： 이동대상의 몰비가 1:2 일 수 있다. 구체적으 로， 1:2 이상， 1:3 이상， 1:4 이상， 1:5 이상， 1:6 이상， 1:7 이상， 1:8 이상, 1:9 이상 또는 1:10 이상일 수 있다.
<84> 플루오레세인 이소티오시아네이트와 결합한 펩티드는 그 이동 경로를 쉽게 파악할 수 있으므로, 본 발명의 일측면에 따른 운반 펩티드는 세포 이미징용 또는 세포 내 약물 전달 경로 추적용으로 활용될 수 있다.
<85> . 본 발명의 일측면은 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동 성을 갖는 펩티드의， 하나 이상의 유효성분을 전달하기 위한 약물 전달체로서의 용 도를 제공한다.
<86> 본 발명의 일측면은 약물; 및 서열번호 1 내지 서열번호 6증 어느 하나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성올 갖는 펩티드를 포함하는 조성물을 대상에게 적용하는 것을 포함하는 대상의 세포 내로 약물을 전달하는 방법을 제공한다.
<87> 본 발명의 일측면은， 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동 성을 갖는 펩티드， 및 조영 물질을 대상에게 적용하는 것을 포함하는 대상의 적용 약물 전달 경로 추적 방법을 제공한다.
<88> 본 발명의 일측면은， 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80%이상의 서열 상동 성을 갖는 펩티드와 조영 물질의 컨쥬게이트를 대상에게 적용하는 것을 포함하는 대상의 적용 약물 전달 경로 추적 방법을 제공한다.
<89> 본 발명의 일측면은 서열번호 1 내지 서열번호 6 증 어느 하나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80%이상의 서열 상동 성을 갖는 펩티드 및 이동 대상인 약물의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물; 및 조성 물의 투여량， 투여 경로， 투여 횟수 및 적웅증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포 함하는 대상의 세포 내 약물 전달용 키트를 제공한다.
<90> 본 발명의 일측면은 유효성분; 및 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나 를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드， 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이 상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함하는 화장품 또는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 측면은 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티 드 또는 그의 단편들인 펩티드， 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성 을 갖는 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하는 화장품 또는 식품 조성물을 제공한다.
<9i> 본 발명의 일측면은 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드， 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상 동성을 갖는 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하여， 유효성분을 세포 내로 전달하는 효과가 우수한 약학， 화장품 또는 식품 조성물을 제공한다.
<92> 미토콘드리아는 유핵세포의 에너지 대사의 중심기관으로서 인간 질병과의 관 련성이 최초로 밝혀진 세포 내 기관이다 (Luft R, Ikkos D, Palmieri G, Ernster L, Afzel ius B: A case of severe hypermetabol i sm of nonthyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control： a correlated clinical, biochemical , and morphological study, J CI in Invest 41:1776ᅳ 804, 1962).
<93> 미토콘드리아는 세포의 에너지 대사와 세포사멸 (apoptosis) 조절에 중요한 역할을 하기 때문에 다양한 치료 약물의 주된 표적으로 작용한다. 또한 이 기관은 세포 내 칼슘 농도 조절에 관여하며， 미토콘크리드 호흡 체인은 에너지 생산에 중 요한 전자전달계로서 작용하고， 활성 산소의 생산을 야기할 수 있다. 결과적으로 미토콘드리아 기능 이상은 당뇨병， 심근병증， 불임， 실명， 신장 /간 질환， 뇌졸중 등의 성인 질병과 밀접한 관계가 있다 (Modica-Napolitano KS, Singh KK: April mitochondria as targets for detect ion and treatment of cancer . Expert Rev Mol Med 11:1-19， 2002). 아울러 미토콘드리아 유전자의 돌연변이는 노화， 퇴행성 신경 질환， 암 질환 등의 발명에 관여할 가능성이 제기되고 있다.
<94> 본 발명의 한 측면에 따르면 미토콘드리아 타켓팅 유효성분 전달 시스템이 제공될 수 있다. 상기에서 안급된 어느 한 컨쥬게이트 (conjugate)를 포함하며, 운 반 펩티드는， 세포 내 미토콘드리아로 국소적으로 이동하는 펩티드로서 상기 유효 성분의 미토콘드리아 국소 전달을 수행하는 펩티드이며， 80¾> 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 및 단편은 그에 대웅하는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 한 펩티드의 미토콘드리아 타겟팅능을 보유한 것인， 미토콘드리아 타켓팅 유효성분 전달 시스템 일 수 있다.
<95> 또한， 본 발명의 일 측면에 따르면 미토콘드리아 활성 조절용 조성물이 제공 될 수 있고, 상기에서 언급된 컨쥬게이트 중 어느 한 컨쥬게이트 (conjugate)를 포 함하며， 운반 펩티드는， 세포 내 미토콘드리아로 국소적으로 이동하는 펩티드로서 상기 유효성분의 미토콘드리아 국소 전달을 수행하는 펩티드이며, 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 및 단편은 그에 대응하는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 한 펩티드의 미토콘드리아 타겟팅능을 보유한 것인， 미토콘드리아 활성 조절용 조성물 일 수 있다.
<96> 본 발명의 일측면에 따른 미토콘드리아 활성 조절용 조성물에 있어세 상기 조성물은 미토콘드리아 관련 질병 또는 장애의 치료， 예방， 진행의 억제， 또는 증 상 완화용 약제학적 조성물이며， 상기 유효성분은 미토콘드리아 관련 질병 또는 장 애의 치료， 예방, 진행의 억제 또는 증상 완화 기능을 나타내는 성분일 수 있다.
<97> 본 명세서에서 언급된 "미토콘드리아 관련 질병' '은 다음을 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다: 헌팅톤 질환; 근위축 측의 경화증; MELAS
'. (Mitochondri l Encephalomyopathy with Lactic Acidemia and Strokeᅳ like
episodes, 락트산 산성혈증 및 발작ᅳ유사 에피소드를 갖는 미토콘드리아
뇌심근병); MERRF (Myoclonus , epilepsy, and myopathy with ragged red fibers , 단편화된 레드 파이버를 갖는 간대성 근경련의 간질 및 근장애); NARP/ MILS (Neurogenic muscular weakness , ataxia, retinitis pigmentosa/Maternal ly inherited Leigh syndrome, 신경성 근육 약화， 실조증 및 색소성 망막염 /모계 유전 성 라이 증후군); LHON (Lebers hereditary optic neuropathy, 레버의 유전적 시신 경병， 미토콘드리아 맹증); KSS (Kearns-Sayre Syndrome, 칸스-사이레 증후군); PMPS (Pearson Marrow-Pancreas Syndrome，피어슨 골수 -췌장 증후군); CPE0( Chronic progressive external opthalnoplegia, 만성 진행성 외안근마비); 라이 증후군; 알 퍼스 증후군; 다발성 mtDNA 결손 증후군; mtDNA 소모 증후군; 복합체 I 결함; 복합 체 II(SDH) 결함; 복합체 III 결함; 시토크름 c 산화효소 (C0X, 복합체 IV) 결함; 복합체 V 결함; 아테닌 뉴클레오티드 운반자 (ANT) 결함; 피루베이트 탈수소효소 (PDH) 결함; 락트산 산성혈증을 갖는 에틸말론산산성뇨증; 락트산 산성혈증을 갖 는 3-메틸 글루타콘산산성뇨증; 감염 동안 쇠미를 나타내는 무반웅성 간질; 감염 동안 쇠미를 나타내는 아스퍼저 증후군; 감염 동안 쇠미를 나타내는 자폐증; 주의 결함 고활동성 질환 (ADHD); 감염 동안 쇠미를 나타내는 뇌성마비; 감염 동안 쇠미 를 나타내는 실독증; 모계 유전성 혈소판 감소증; 백혈병; MNGIE (Mitochondrial myopathy, peri heral and autonomic neuropathy, gastrointestinal dysfunction. And epilepsy, 미토콘드리아 근장애， 말초신경 및 자율신경 장애， 위장 기능부전, 및 간질); MARIAHS 증후군 (미토콘드리아 실조증， 재발성 감염， 실어증, 자요산혈 증 /저수초증， 급발작， 및 디카볼실산 산성뇨증); ND6 이긴장증; 감염 동안 쇠미를 나타내는 순환성 구토 증후군; 락트산 산성혈증을 갖는 3-히드록시 이소부트릭산 산성뇨증, 락트산 산성혈증을 갖는 당뇨병; 유리딘 반웅성 신경성 증후군 (URNS); 가계성 양측의 선조체 괴사 (FBSN); 아미노글리코시드 -관련 난청; 이완된 심근장애; 비장 림프종; 볼프람 증후군; 다발성 미토콘드리아 DNA 결손 증후군; 및 신세뇨관성 산증 /당뇨 /실조증 증후군.
<98> 다른 양태에서 본원은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는， 핵산 분자를
제공하며， 이의 염기서열은 예를 들면 GM GCG CGC CCG GCG CTG CTG ACC AGC CGC CTG CGC ΊΤΤ ATT CCG AAA서열 (서열번호 181)을 가진다. 핵산 분자는 당업자에게 공지된 기법에 따라 숙주 세포 안에 도입될 수 있다. 예를 들면 칼슴
포스페이트법， 리포좀， 일렉트로포레이션， 바이러스와 세포를 접촉시키는 것에 의 한 형질전환， 또는 직접 세포내로 마이크로 주사하는 방법 등이 있다. 숙주 세포는 고등 진핵 세포， 예컨대 포유류 세포， 또는 하급 진핵 세포， 예컨대 효모 세포이거 나， 또는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있다. 형질전환에 적당한 원핵 숙 주로는 대장균, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 타이피뮤리움， 슈도모나스， 스트랩 토마이세스， 마이크박테리아 속에 속하는 종들을 예로 들 수 있다.
<99> 상기 핵산 분자를 포함하는 백터는 일반적으로 재조합 발현 백터로 숙주 세 포의 형질전환을 가능하게 하는 복제 기원 및 선택가능한 마커 (예컨대 진핵 세포 배양을 위한 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성， 또는 이 . 콜라이 에서의 테트라사이클린 또는 암피실린 내성， 또는 S. cerevisiae TRP1 유전자)， 및 단백질 코팅서열의 전사를 조절하는 프로모터를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 유용한 발현 백터는 예를 들면 SV40 및 pcDNA의 유도체 및 col El, pCRl, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX(Smith, et al . , Gene 67:31-40 (1988))와 같은 공지된 박테리 아 폴라스미드， pMB9 및 이것의 유도체 RP4와 같은 플라스미드， M989와 같은 파지 I의 수많은 유도체와 같은 파지 DNA, 및 M13 및 필라멘트형 단일 가닥의 파지 DNA 와 같은 파지 DNA; 효모 플라스미드， 예컨대 파지 DNA 또는 발현 제어 서열을 사용 하기 위해 변형된 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 백터 등이 있다. 포유류 발현 백터는 복제 기원， 적당한 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 또한 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위， 스플라이스 공여체 및 수용체 부위， 전사 종결 서열, 및 5' 플탱킹 비전사 서열을 포함할 수 있다. 포유류 발현 백터는 유도 성 프로모터， 예컨대 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터를 포함하는 백터， DHFR발현 카세트를 포함하는 어떠한 발현 백터 도는 pED와 같은 DHFR/메토트렉세 이트 공 -증폭 백터 (Randal J, Kaufman, 1991， Randal J. Kaufman , Current
Protocols in Molycular Biology, 16, 12 (1991))를 포함한다. 또는 글루타민 합성 효소 /메티오닌 술폭시민 공 -증폭백터， 예컨대 pEE14(Celltech). 엡스타인 바 바이 러스 (EBV) 또는 핵 항원 (EBNA)의 제어하에 에피좀성 발현을 지시하는 벡터, 예컨대 pREP4(Invi trogen) , pCEP4( Invi trogen) , pMEP4( Invi trogen) , pREP8( Invi trogen) , pREP9(Invitrogen), 및 pEBVHis( Invi trogen)가사용될 수 있다. 선택성 포유류 발 현 백터로는 Rc/CMV( Invi trogen), pRc/RSV( Invi trogen) 등이 있다. 본 발명에 사용 될 수 있는 백시니아 바이러스 포유류 발현 백터는 pSCll, pMJ601, pTKgptFIS등이 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 효모 발현 시스템으로는 비 -융합 pYES2
백터 (Invi trogen), 융합 pYESHisA, B, C( Invi trogen) , pRS 백터 등이 있다,
상기 백터는 다양한 세포 포유류 특히 인간 유래 세포， 또한 박테리아， 효모， 진균， 곤충， 선층류 및 식물 세포로 도입될 수 있다. 적당한 세포의 예로는， VER0.세포， HELA세포， 예컨대 ATCC No. CCL2, CH0세포주， 예컨대 ATCC No.
CCL61, COS세포， 예컨대 COS— 7 세포 및 ATCC No. CRL 1650세포， W138, BHK, HepG2, 3T3, 예컨대 ATCC No. CRL6361, A549, PC12, K562 세포， 293세포， Sf9세포， 예컨대 ATCC No. CRL1711 및 Cvl 세포， 예컨대 ATCC No. CCL70등이 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 다른 적당한 세포로는 원핵 숙주 세포 균주， 예컨 대 대장균 (예컨대 DH5-a 균주)， 바실러스 서브틸리스， 살모넬라 타이피뮤리움， 또 는 슈도모나스， 스트렙토마이세스 및 스타필로코쿠스 속에 속하는 균주들이 있다. 본 발명의 일측면에 따른 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하 나를 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는상기 펩티드 서열과 80% 이 상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 0.1 내지 1 mg/mg, 구체적으로 1 ;zg/rag 내지 0.5 mg/iiig, 더 구체적으로 10 ;zg/mg 내지 0.1 mg/mg 함량으로 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐 만 아니라， 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며， 비용 대비 효과 의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개， 닭， 돼지, 소， 양， 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구， 직장， 경피， 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다. <106> 경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제， 연질 또는 경질 캅셀제， 과립제，
산제， 액제 또는 유탁제일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제， 로션, 연고， 겔， 크림， 현탁제， 유제， 좌제， 패취 또 는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
<107> 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제， 부형제， 활택 제， 결합제， 붕해제, 완층제, 분산제， 계면 활성제， 착색제, 향료 또는 감미제 등 의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통 상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
<108> 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효성분은 투여 받을 대상의 연령， 성별， 체중， 병리 상태 및 그 심각도， 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라 질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며 이의
1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 zg/kg/일 내지 1 g/kg/일， 구체적으로는 1 / /kg/ 일 내지 10 mg/kg/일， 더 구체적으로는 10 zg/kg/일 내지 1 mg/kg/일， 보다 더 구 체적으로는 50 ½/kg/일 내지 100 /kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으 나， 이에 제한되는 것은 아니다.
<109> 본 발명의 일측면에 따른 화장품 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으 로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액， 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀견， 유상 에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼， 현탁액， 고체, 겔， 분말 페이스트， 포말 (foam) 또는 에어로졸의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
<πο> 본 발명의 일측면에 따른 화장품 조성물은 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 , 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 일측면에 따른 화장품 조성물은 보습제， 에몰리언트제， 계면 활성제, 자외선 흡수제， 방부제， 살균제， 산화 방지제， pH 조정제, 유기 또는 무기 안료， 향료， 냉감제 또는 제한 (制汗)제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량 은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선 정 가능하며， 그 배합량은 화장품 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량 %, 구체적으로 0.01 내지 3 중량 %일 수 있다.
<πι> 본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나， 예 를 들어， 정제， 과립제， 분말제， 액제， 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제 형은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사 용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료 와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
<112> 상기 유효성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며， 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 /g/kg/일 내지 10 mg/kg/일， 더 구체적으로는 10 g/kg/일 내지 1 mg/kg/일， 보다 더 구체적으로는 50 zg/kg/일 내지 100 //g/kg/일 이 될 수 있으나， 이에 제한되지 않으며， 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
<113> 본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략 된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존 재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는"， "갖는", 및 "함유하는' '은 열린 용 어로 해석된다 (즉， "포함하지만 이에 한정되지는 않는' '의 의미).
<114> 수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치 들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며， 그것이 아님이 명시되어 있지 않는 한， 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있 는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
<Π5> 본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백 히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시 예 또는 예시적 언어 (예컨대， "〜과 같은")를 사용하는 것은， 청구범위에 포함되어 있지 않는 한， 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하 고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실 시에 필수적인 것으로 해석되어져서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서 에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
<Π6> 본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고， 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은， 특허법에 의해 허용되는 것과 같이， 첨 부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이， 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여 기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만， 당 업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서 도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.
<117>
【발명의 실시를 위한 형태】
<118> 실시예 1: 펩티드의 합성
<Π9> 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩티드를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법 에 따라 제조하였다. 구체적으로， 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc. , 대한민국 대 전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법 (solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
<i20> NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
<i2i> NH2-A1 a-2-chloro-Tr i tyl Resin
<i22> NH2-Arg(Pbf )-2-chloro-Tr i tyl Resin
<123>
<124> 펩타이드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로
보호 (protection)되고， 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu
(t-butylester ) , Pbf (2,2,4,6, 7-pent amethy 1 dihydr으 benzofuranᅳ 5_sulfonyl) 등 으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
<i25> Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf )-0H, Fmoc-Glu(0tBu)-0H, Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH , Fmoc-Ser(tBu)-0H, Fmoc-Thr(tBu)-0H,
Fmoc-Lys(Boc)-0H, Fmoc-Gln(Trt)-0H, Fmoc-Trp(Boc)-0H, Fmoc -Met -OH,
Fmoc一 Asn(Trt )一 OH, Fmoc-Tyr ( t Bu ) -OH , Fmoc-Ahx-OH , Tr t-Mercaptoacet i c acid.
<i26> 커플링 시약 (Coup ling reagent)으로는
HBTU [ 2- ( IH-Benzot r i azo 1 e- 1-y 1 ) - 1 , 1 , 3 , 3-t et amet hy 1 am i n i urn hexaf luorophosphate] I HOBt [N-Hydr oxxybenzot r i azo 1 e ] /NMM [4-Methylmorphol ine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF중 피페리딘 (piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩 타이드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일 (Cleavage Cocktail) [TFA (tri f luoroacet ic acid) /TIS (tri isopropylsi lane) I EDT (ethanedithiol) I H20=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.
<127> 아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상 태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반웅시키고 용매로 세척한 후 탈보 호하는 과정을 반복함으로써 각 템티드를 합성하였다. 합성된 템티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고， 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
<128>
<129> 서열번호 7의 Pep 1 (EARPALLTSRLRFIPK) 을 예로 들어 구체적인 과정을 설명 하면 다음과 같다.
<130>
<131> 1) 커플링
<i32> NH2-Ly s ( Boc ) -2-ch 1 or o-Tr i t 1 Resin에 보호된 아미노산 (8당량)와 커플링 시약 HBTI 8당량) /H0B 8당량) /醒(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 반웅하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
<133> 2) Fmoc 탈보호
<134> 20%의 DMF 중의 피페리딘 (piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2 회 반웅하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
<135> 3) 1과 2의 반웅을 반복적으로 하여 펩타이드 기본 골격 .
NH2-E(0tBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chlo ro-Trityl Resin)을 만들었다.
<136> 4) 절단 (Cleavagge) ： 합성이 완료된 펩타이드 Resin에 절단
칵테일 (Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩타이드를 Resin에서 분리하였다. <137> 5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후， 원심 분리하여 얻어 진 펩타이드를 침전시킨다.
<138> 6) Prep-HPLC로 정제 후， LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 powder로 제 조하였다.
<139>
<140> 실시예 2: pep(CPP)-FITC 컨쥬게이트의 제조
<i4i> (1) FITC-pep(CPP) 컨쥬게이트의 제조
<142> 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩티드들을 FITC와 접합시킨 컨쥬게이트를 다 음과 같이 제조하였다. 예를 들어 서열번호 7의 pepl과 FITC의 컨쥬게이트， 즉 FITC-링커 -pepl을 다음과 같이 제조하였다.
<143> 상기 실시예 1과 같이 하여 얻어진 펩타이드 기본 골격 N¾- 링커 -E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(B^ oro-Trityl Resin)에 FITC를 반웅시켰다. 구체적으로， 플루오레세인 -5-이소씨오시
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s»80o/noaMAi:)<i Ϊ81791-0/1-Ϊ0Ζ OAV 확인하고, LC/MS로 분자량을 확인하였다. 그 결과 얻어진 물질이 pepi-FITC임이 입 증되었다. 그 후 동결건조하였다.
<147>
<148> 실시예 3: pep (CPP)-EGFP융합 단백질의 제조 및 발현 정제
<149> 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩티드들과 증강된 녹색 형광
단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP) (서열번호 9， 서멸번호 10) 의 융합 단백질을 다음과 같은 방법으로 제조한다.
<150>
<i5i> (1) pET21a-EGFP-His-tag 재조합 DNA 클론 제조
<152> 먼저， pEGFP-Nl 백터를 주형으로 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)을 pET21a (+) 백터 (Novagen)에 클로닝 하 7ᅵ 위하여 제 한효소를 포함하게 [표 3]과 같이 프라이머 염기서열을 제작한다.
<153>
<154> [표 3]
<i55> EGFPF( forward) 프라이머는 Ndel과 EcoRI 제한 효소 절단 부위를 포함하고
20개의 EGFP 서열을 첨가하게 제작하고， EGFP-R reverse)는 Xhol제한 효소 절단 부 위를 포함하고 30개의 EGFP 서열을 첨가하게 제작하였다.
<156> 유전자 증폭을 위하여 5()mM 염화칼륨， 0.1% 트리톤 X-100, Ι.διτίΜ 염화마그네 슴 및 150 μΜ의 4종의 디옥시뉴클레오티드 삼인산 (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)을 포함 한 K M트리스-염화수소 (Tris-HCl, H 9.0)용액 에 lOOpmd의 프라이머 및 2.5U의 Taq DNA중합효소을 첨가하고， pEGFP 플라스미드 DNA 10ng을 주형으로 하여， 중합효소연쇄반웅기에서 95°C에서 5분간 pEGFP플라스미드 DNA를
변성시키고， 95°C에서 30초, 46°C에서 30초 및 72°C에서 45초의 단위 온도변화로 하는 30회의 사이클로 중합효소연쇄반웅을 수행하고 그 증폭산물을 아가로스젤 전 기영동으로 확인하였다.
<157> pET21a 백터의 다복제구역 (multiple cloning site, MCS)에 존재하는 Ndel 및
Xhol 제한 효소 절단 부위에 클로닝하여 pET21a-EGFP-His · tag 재조합 DNA 클론을 제조한다. <i58> (2) pET21a-pep(CPP)-EGFP-Hi s · tag 재조합 DNA 클론 제조
<159> 서열번호 1 내지 서열번호 6의 pep(CPP)-EGFP-His - tag 융합 단백질 얻기 위 해 [표 4]와 같은 프라이머 염기서열을 제작한다.
<160>
<161> [표 4]
<i62> 각각의 F( forward) 프라이머는 Ndel 제한 효소 절단 부위를 포함하고 서열번 호 1 내지 서열번호 6의 pep(CPP) DNA 염기서열을 첨가하게 제작하고， 각각의
R(reverse) 프라이머는 EcoRI 제한 효소 절단 부위를 포함하고 서열번호 1 내지 서 열번호 6의 pep(CPP) DNA 염기서열을 첨가하게 제작하였다.
<163> 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)의 합성을 위해 10mM 트리스 트리스-염 화수소 (Tris-HCl, pH 7.5-8.0), 50mM 염화칼륨， ImM 에틸렌디아민사아세트산를 포 함한 용액 에 lOuM의 각각의 F-R프라이머를 첨가하고， 중합효소연쇄반웅기에 서 95C에서 2분간 프라이머들을 변성시키고， 천천히 25°C로 온도를 낮춰 45분간 반웅시킨 후에 4°C에서 보관한다.
<164> 합성된 올리고뉴클레오티드 산물을 Ndel 및 EcoRI 제한효소로 절단하고
pET21a-EGFP-His · tag 재조합 DNA클론의 Ndel 및 EcoRI 제한 효소 절단 부위에 클 로닝하여 서열번호 1 내지 서열번호 6의 pET21a-pep(CPP)-EGFP-His · tag 재조합 DNA클론을 제조한다 (도 1).
<!65> (3) 융합 단백질의 발현 및 정제
<i66> pET21a-EGFP-His · tag 재조합 DNA클론과 서열번호 1 내지 서열번호 6의
pET2 la-pe ( CPP ) -EGFP-H i s . tag 재조합 DNA클론을 박테리아에
형질전환 (transformation)하여 단백질을 분리한다. 구체적으로 이콜라이 (E.coli) BL2KDE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 형질전환시킨 후 5ml LB/ 엠피실린 배지에서 키운 후 100ml 배지로 옮겨 배양한다. 이 경우 엠피실린을 50 lig/ml 비을로 첨가한다. 이어 37°C에서 약 2— 3시간 교반 배양한 후 흡광도를 측정 하여 약 0.6~0.8범위 내까지 키운 뒤， 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해 IPTG (Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside)를 0.1mM~lmM을 처리하고 3~16시간 16 °C~37°C에서 추가 배양한 후 세포를 5000rpm에서 5분 원심분리 한다,
<167> 발현시킨 단백질은 원심분리 결과， 세포가 녹색 빛을 띠게 되면 과발현된 것 을 육안으로 확인할 수 있다. 이를 His . tag정제 키트인 Ni-TAT단백질 분리 키트 (Prod, #313.14, Quiagen USA)를 제조자의 안내대로 분리한다.
<168> 분리 후 단백질을 투석하여 정제하고， 농축한다. 구체적으로 멸균된 4°C PBS 를 사용하여 투석한다. 우선 투석백을 미리 PBS로 평형화시킨 후， 여기에 5ml 주사 기를 이용하여 위에서 분리한 단백질 용액을 취해 투석 백에 넣어준 후, 교반하면 서 4°C에서 하룻밤 투석한다. 이어 단백질의 농도를 높여주고 불필요한 물질을 제 거해 주기 위하여， BIBASPIN 20 (Prod, #VS2092, Sartorius Stedin biotech, Germany) 에 투석한 단백질을 넣고 3,000rpm으로 4°C에서 원심분리 하는 방법으로 농축한다.
<169>
<170> 실시예 4: pep(CPP)-FITC 컨쥬게이트의 세포 투과능 실험
<i7i> (1) HeLa세포주에서의 세포 투과능 시험
<172> 세포주 배양
<i73> ATCC로부터 얻은 인간의 자궁 경부암의 세포주 (Homo sapiens cervix adenocarcinoma cell line)인 HeLa 세포주를 MEM(Minimum Essential Medium)에 10% 우태아혈청 (Invitrogen, USA)과 Ear le' s salts, non-essent ial amino acids, sodium pyruvate 및 100 μ^/^ί 페니실린과 100 units/mi
스트랩토마이신 (streptomycin)를 첨가하여 37t , 5% C02 배양기에서 배양하였다.
<174>
<175> 유세포 분석기 (Flow cytometry)와 공초점현미경 (Confocal microscopy) 분석
<176> 상기 세포주에 본 발명의 서열번호 1 내지 6의 펩타이드들， pep (CPP)을 처 리하여 control과 uptake 정도를 비교하기 위해 유세포 분석기 (Flow cytometry)와 공초점현미경 (Confocal microscopy) 분석을 실시하였다.
<177> 세포주를 6-well plate에 분주하여 배지에 10% 우태아혈청 (Invitrogen,
USA)과, 100 /g/m^ 페니실린과 100 units/m^ 스트렙토마이신 (streptomycin)를 첨가 하여 37°C, 5% C02 배양기에서 12시간 배양하였다. PBS로 세척한 후， MEM(Minimum
Essential Medium)에 1시간동안 starvation을 시킨다. 각 운반 펩티드 20 uM을 처 리하여 37°C에 1시간 배양하였다. PBS로 세척과정을 3번 반복하고 Trypsin-EDTA를 37°C에서 10분간 처리하여 세포 바깥쪽에 붙은 운반 펩티드를 제거한다, 넁장된 PBS로 세포를 수거한 후 3번 세척 과정을 원심분리를 통해서 반복하였다. 그 후 4¾ Paraformaldehyde가 포함된 PBS에 suspension시켜 FACS Cal ibur(Becton
Dickinson)로 형광을 분석하였다. 운반펩티드를 처리하지 않은 세포 (Control)와 다 양한 접합 펩티드의 eel hilar uptake 양상을 MFKmean fluorescence intensity)로 비교 분석하였다.
<178> 상기 배양된 세포주를 챔버 웰 (chamber well)에 분주하여 배지에 10% 우태아 혈청 (Invitrogen, USA)과， 100 iizl penicillin과 100 units/m^ streptomycin를 첨가하여 37：， 5% C02 배양기에서 12시간 배양하였다. PBS 세척 후， MEM(Minim匿
Essential Medium)에 1시간의 starvation을 시켰다. 각 운반 펩티드 10 υΜ을 처리 하여 37°C에 1시간 배양하였다. PBS로 세척 과정을 3번 반복하고 2¾>(v/v)
Paraformaldehyde로 room temperature에서 15분간 고정 入 1킨 루
DAPK4' ,6-diamidino-2— phenyl indole)로 상온에서 핵을 염색하고， 공초점 현미경으 로 관찰하여 비교 분석하였다.
<179> 그 결과는 도 2 내지 도 7에 나타난 바와 같다.
<180>
<i8i> (2) Huh7 세포주에서의 세포 투과능 시험 <182> 세포주 배양
<i83> ATCC로부터 얻은 인간의 간세포 암의 세포주 (human hepatocellular
carcinoma cell lien) 인 Huh7 의 부유 세포주를 사용하였다. Huh7 세포주는 RPMI 1640 배지를 사용한다. 배지에는 10% 우태아혈청 (Invitrogen, USA)과， 100 ug/ml penicillin, 100 units/ml streptomycin를 첨가하여 37°C , 5% C02 배양기에서 배양 하였다.
<184>
<185> 유세포 분석 (Flow cytometry)을 통한 세포침투능 스크리닝
<186> 펩타이드들의 세포침투능을 살펴보고자 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩타 이드를 처리한 Huh7 세포주에서 유세포 분석을 하였다. 분석방법은 상기 (1)의 Hela 세포주 분석에 기재돤 바와 같다. 분석 결과는 도 8 내지 도 11에
나타내었다.
<187>
<188> (3) 사람 T 림프구 세포주에서의 세포 투과능 시험
<189> 세포주 배양
<i90> ATCC로부터 얻은 인간 T 림프구 세포주 (Human T-cell leukemia cell line)인
Jurkat 의 부유 세포주를 사용하였다. Jurkat 세포주는 RPMI 1640 배지를 사용한다. 배지에는 10%우태아혈청 (Invitrogen, USA)과, 100 ug/ml penicillin, 100 units/ml streptomycin를 첨가하여 37°C, 5% C02 배양기에서 배양하였다.
<i9i> 사람 유래 림프구 (lymphocyte) 분리는 건강한사람에게서 혈액을 채혈 (50 ml)한 후 Biocol 1 Separating Solution (Biochrom AG, Berlin, Germany)를 사용하 여 peripheral blood mononuclear cells (PBMC) 층 및 림프구를 회수한다.
<192>
<193> 유세포 분석 (Flow cytometry)을 통한 세포 침투능 분석
<194> 펩타이드들의 세포침투능을 살펴보고자 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩타 이드를 처리한 사람 T 림프구 세포주에서 유세포 분석을 하였다. 분석방법은 상기 (1)의 Hela 세포주 분석에 기재된 바와 같다. 분석 결과는 도 12 내지 도 15에 나 타내었다.
<195>
<196> (4) 세포생존율 및 독성 분석 '
<197> 한편， 상기 배양된 HeLa 세포주를 96-well plate)에 분주하여 배지에 10%우 태아혈청 (Invitrogen, USA)과， 100 g/u penicillin과 100 units streptomycin를 첨가하여 37 °C, 5% C02 배양기에서 12시간 배양하였다. PBS세척 후, MEM(Minimum Essential Medium)에 1시간의 starvation을 시켰다. 각 운반 펩티 드 20 uM을 처리하여 37°C에 24시간 배양한 후 ΜΊΤ assay방법을 이용하여 세포생 존율 및 독성을 분석하였다. 그 결과는 도 16 내지 도 21에 나타난 바와 같다.
<198>
<199> 실시예 5: pep(CPP)-EGFP융합 단백질의 세포 투과능 실험
<200> 세포주 배양
<20i> ATCC로부터 얻은 인간의 자궁 경부암의 세포주 (Homo sapiens cervix
adenocarcinoma cell line)인 HeLa세포주를 MEM(Minimum Essential Medium)에 10% 우태아혈청 (Invitrogen, USA)과 Earle's salts, non— essent ial amino acids , sodium pyruvate 및 100 /g/m^ 페니실린과 100 units/mi
스트랩토마이신 (streptomycin)를 첨가하여 37 °C, 5% C02 배양기에서 배양하였다.
<202>
<203> 유세포 분석기 (Flow cytometry)와 공초점현미경 (Confocal microscopy) 분석
<204> 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 6의 펩티드들에 표지 유전자 (reporter gene)인 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)을 결합시킨 융합 단백질 (fusion protein)을 제조하여 상기 세포주에 처리하였다. pep(CPP)-EGFP융합 단백질을 처리하지 않는 군과 EGFP단백질만 처리한 군을 대조 군으로 하여 각 pep(CPP)-EGFP융합 단백질 처리군과 상기 세포주의 uptake 정도를 비교하기 위해 유세포 분석기 (Flow cytometry)와 공초점현미경 (Confocal microscopy) 분석을 실시하였다.
<205> 세포주를 12-well plate에 분주하여 배지에 10%우태아혈청 (Invitrogen,
USA)과, 100 zg/me 페니실린과 100 units/i 스트렙토마이신 (streptomycin)를 첨가 하여 37 °C, 5% C02 배양기에서 12시간 배양하였다. PBS로 세척한후， MEM(Minimum
Essential Medium)에 1시간 동안 starvation을 시킨다. 각 pe (CPP) -EGFP융합 단 백질 3uM을 처리하여 37°C에 1시간 배양하였다. PBS로 세척과정을 3번 반복하고 Trypsin-EDTA를 37°C에서 10분간 처리하여 세포 바깥쪽에 붙은 pep(CPP)-EGFP융합 단백질을 제거한다. 넁장된 PBS로 세포를 수거한 후 3번 세척 과정을 원심분리를 통해서 반복하였다. 그 후 4% Paraformaldehyde가 포함된 0.5 PBS에 suspension 시켜 FACS Calibur(Becton Dickinson)로 형광을 분석하였다. pep (CPP) -EGFP융합 단백질을 처리하지 않는 군과 EGFP 단백질만 처리한 군을 대조군으로 하여 각 pep (CPP) -EGFP융합 단백질 처리군의 cellular uptake 양상을 MFKmean fluorescence intensity)로 비교 분석하였다.
<206> 상기 배양된 세포주를 챔버 웰 (chamber well)에 분주하여 배지에 10%우태아
¾청 (Invitrogen, USA)과， 100 g/i penicillin과 100 units/in^ stre tomycin¾- 첨가하여 37°C, 5% C02 배양기에서 12시간 배양하였다. PBS세척 후， MEM(Minimum
Essential Medium)에 2시간의 starvation을 시켰다. 각 pep(CPP)-EGFP융합 단백질 1.5uM을 처리하여 371：에 2시간 배양하였다. PBS로 세척 과정을 3번 반복하고 2%(v/v) Paraformaldehyde로 room temperature에서 15분간 고정 시킨 후
DAPI(4' ,6-diamidino-2-phenylindole)로 상온에서 핵을 염색하고， 공초점 현미경으 로 관찰하여 비교 분석하였다.
<207> 그 결과는 도 22 내지 도 27에 나타난 바와 같다.
【서열목록 프리텍스트】 .
<208> SEQ ID NO: 9
<209> EGFP protein seq. (239. a)
LGMDELYK.
<211>
<212> SEQ ID NO: 10
<213> EGFP nucleotide seq. (717bp)
CTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
세포 투과성 운반 펩티드 (carrier peptide) 및 유효성분의
컨쥬게이트 ( con j ugat e )로서，
상기 운반 펩티드는，
서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나 이상올 포함하는 펩티드, 상기 펩 티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그것의 단편이몌
상기 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 및 단편은 그에 대웅되는 서열 번호 1 내지 서열번호 6 중 한 펩티드의 세포 투과성을 보유한 것인 컨쥬게이트.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서，
상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 컨쥬게이트ᅳ
【청구항 3】
제 1 항에 있어서,
상기 운반 펩티드는, 30개 이하의 아미노산으로 구성된 컨쥬게이트.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서，
상기 운반 펩티드는，
서열 번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 펩티드인 컨 쥬게이트.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서，
상기 유효성분은， 단백질， 핵산, 펩티드， 지질， 당지질， 미네랄, 당， 나노 입자， 생물학적 제제， 조영물질， 약물 (drugs) 및 화학 물질 (compounds) 중 선택된 하나 이상인 컨쥬게이트.
【청구항 6】
제 1항에 있어서， 상기 운반 펩티드와 유효성분은 공유결합에 의해， 선택적으 로 링커에 의해 매개됨으로써， 접합된 것인 컨쥬게이트.
【청구항 7】
제 1항에 있어서, 상기 운반 펩티드와 유효성분은 비공유결합에 의해 접합된 것인 컨쥬게이트.
【청구항 8】 제 7항에 있어서， 상기 유효성분은 단백질 또는 펩티드인 컨쥬게이트.
【청구항 91
게 8항에 있어서， 상기 유효성분은， 사이토카인， 항체 , 항체 단편， 치료용 효 소， 가용성 수용체， 또는 리간드인， 컨쥬게이트.
【청구항 10]
제 1 항에 있어서，
상기 운반 펩티드는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate)와 결합한 것인 컨쥬게이트.
【청구항 11】
제 1 항에 있어서，
상기 운반 펩티드는 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescent Protein, GFP)과 결합한 것인 컨쥬게이트.
【청구항 12】
제 5항에 있어서,
상기 조영물질은 방사선 비투과성 조영물질 (radiopaque contrast agent), 상 자성 (paramagnetic) 조영물질， 초상자성 (superparamagnet ic) 조영물질， 및 CT조영 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
【청구항 13]
제 12항에 있어서， 상기 조영물질은 철 -기반 물질인 컨쥬게이트.
【청구항 14】
제 13항에 있어서， 상기 조영물질은 페로센 카복실레이트인 컨쥬게이트.
【청구항 15】
게 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 조영제.
【청구항 16】
제 15항에 있어서， 상기 조영제는 세포를 조영하기 위한 것인 조영제.
【청구항 17】
제 16항에 있어서， 상기 세포는 줄기세포인 조영제.
【청구항 18】
유효성분으로서, 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 포 함하는 조성물.
【청구항 19】
제 18항에 있어서， 상기 유효성분은 질병의 치료 또는 예방을 위한 유효성분이며， 상가조성물 은 약학 조성물인 조성물.
【청구항 20]
제 18 항에 있어서，
상기 유효성분은 기능성 화장료의 유효성분이며， 상기 조성물은 화장료 조성 물인 조성물,
【청구항 21】
제 18 항에 있어서，
상기 유효성분은 기능성 건강식품의 유효성분이며, 상기 조성물은 건강식품 조성물인 조성물.
[청구항 22】
유효성분을 세포 내로 전달하기 위한 방법으로서，
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트 (conjugate)를 이를 필 요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며，
운반 펩티드는, 세포 투과성 펩티드로서， 상기 유효성분의 세포 내 전달을 수행하는 펩티드이며，
80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 및 단편은 그에 대웅되는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 한 펩티드의 세포 투과성을 보유한 것인， 유효성분의 세포 내 전달 방법ᅳ
【청구항 23】
제 22항에 있어서， 상기 방법은 유효성분을 미토콘드리아로 국소 전달하는 것 인 유효성분의 세포 내 전달방법.
【청구항 24】 .
세포 투과성 펩티드로서，
상기 펩티드는, 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 한 서열로 구성된 펩티 드， 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드， 또는 그것의 단편 인 세포 투과성 펩티드.
【청구항 25】
제 24 항에 따른 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 26】
제 25항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터.
【청구항 27】 제 26항에 따른 백터를 포함하는 형질전환세포
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ES13839102T ES2743919T3 (es) 2012-09-19 2013-09-17 Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado
CN201910049089.3A CN110064056B (zh) 2012-09-19 2013-09-17 细胞穿透性肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物
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CN201380057722.4A CN104768967B (zh) 2012-09-19 2013-09-17 细胞穿透性肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物
JP2015532965A JP6510410B2 (ja) 2012-09-19 2013-09-17 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物
KR1020157009510A KR102201430B1 (ko) 2012-09-19 2013-09-17 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물

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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9540419B2 (en) 2012-05-11 2017-01-10 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
EP3020724A4 (en) * 2013-07-12 2017-01-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same
US9730984B2 (en) 2012-05-11 2017-08-15 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating rheumatoid arthritis
US9907838B2 (en) 2013-04-19 2018-03-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition and methods for treating ischemic damage
US9937240B2 (en) 2014-04-11 2018-04-10 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same
US10034922B2 (en) 2013-11-22 2018-07-31 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having angiogenesis inhibitory activity and composition containing same
US10383926B2 (en) 2013-06-07 2019-08-20 Gemvax & Kael Co., Ltd. Biological markers useful in cancer immunotherapy
US10441632B2 (en) 2016-01-29 2019-10-15 Nexgen Biotechnologies, Inc. Anti-wrinkle and anti-aging cosmetic composition comprising green fluorescent protein-human epidermal growth factor fusion protein as effective component
US10463708B2 (en) 2014-12-23 2019-11-05 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide for treating ocular diseases and composition for treating ocular diseases comprising same
US10561703B2 (en) 2013-06-21 2020-02-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Method of modulating sex hormone levels using a sex hormone secretion modulator
US10835582B2 (en) 2015-02-27 2020-11-17 Gemvax & Kael Co. Ltd. Peptide for preventing hearing loss, and composition comprising same
US10898540B2 (en) 2016-04-07 2021-01-26 Gem Vax & KAEL Co., Ltd. Peptide having effects of increasing telomerase activity and extending telomere, and composition containing same
US10967000B2 (en) 2012-07-11 2021-04-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell-penetrating peptide, conjugate comprising same and composition comprising same
US11015179B2 (en) 2015-07-02 2021-05-25 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having anti-viral effect and composition containing same
US11058744B2 (en) 2013-12-17 2021-07-13 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for treating prostate cancer

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150125438A1 (en) 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
KR102201429B1 (ko) 2012-09-19 2021-01-12 주식회사 젬백스앤카엘 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
KR102578890B1 (ko) 2012-09-19 2023-09-18 주식회사 젬백스앤카엘 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
KR102166544B1 (ko) 2013-10-23 2020-10-16 주식회사 젬백스앤카엘 전립선 비대증 치료 및 예방용 조성물
US10662223B2 (en) 2014-04-30 2020-05-26 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for organ, tissue, or cell transplantation, kit, and transplantation method
JP7000161B2 (ja) 2015-05-26 2022-01-19 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 新規ペプチド及びこれを含む組成物
CN113476589A (zh) * 2015-11-03 2021-10-08 珍白斯凯尔有限公司 肽在制造用于治疗神经退行性疾病的组合物中的用途
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
WO2019241315A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
US20220348937A1 (en) 2019-09-06 2022-11-03 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
WO2021225344A1 (ko) * 2020-05-08 2021-11-11 한림대학교 산학협력단 코로나 바이러스 억제용 펩타이드 및 그 용도

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090186802A1 (en) * 2005-12-16 2009-07-23 Diatos Cell Penetrating Peptide Conjugates for Delivering of Nucleic Acids into a Cell
KR20090103957A (ko) * 2007-01-29 2009-10-01 주식회사 프로셀제약 신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도
WO2010012850A1 (es) * 2008-07-29 2010-02-04 Universitat Pompeu Fabra Péptidos con capacidad de penetración celular y sus usos
JP2010252810A (ja) * 1998-07-08 2010-11-11 Gemvax As テロメラーゼ由来抗原ペプチド
WO2011150494A1 (en) * 2010-05-30 2011-12-08 The Governing Council Of The University Of Toronto Mitochondrial penetrating peptides as carriers for anticancer compounds
KR20120026408A (ko) * 2010-09-09 2012-03-19 서울대학교산학협력단 인간 유래 세포 투과성 펩타이드와 생리활성 펩타이드 결합체 및 그 용도

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610839B1 (en) * 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
WO1998014592A2 (en) * 1996-10-01 1998-04-09 Geron Corporation Telomerase reverse transcriptase
GB0112342D0 (en) * 2001-05-21 2001-07-11 Norsk Hydro As Polypeptides
US20030143228A1 (en) * 2001-10-29 2003-07-31 Baylor College Of Medicine Human telomerase reverse transcriptase as a class-II restricted tumor-associated antigen
US7294708B2 (en) * 2002-05-31 2007-11-13 Beijing Institute Of Biotechnology Telomerase reverse transcriptase fragments and uses thereof
WO2007097561A1 (en) 2006-02-20 2007-08-30 Ewha University - Industry Collaboration Foundation Peptide having cell membrane penetrating activity
EP1994942A1 (en) * 2007-05-25 2008-11-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions comprising telomerase, and uses thereof
DK2310044T3 (en) * 2008-06-16 2016-12-12 Mediolanum Farm S P A Antitumor IMMUNOTHERAPY
EP2337795A2 (en) * 2008-10-01 2011-06-29 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
KR101169030B1 (ko) 2009-01-21 2012-07-26 애니젠 주식회사 신규한 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템
EP2433953B1 (en) 2009-05-20 2015-07-08 Toray Industries, Inc. Cell membrane-permeable peptides
EP2536830B1 (en) 2010-02-16 2019-07-17 Ultimovacs AS Polypeptides
KR101263212B1 (ko) 2010-05-28 2013-05-10 성신여자대학교 산학협력단 신규한 세포막 투과성 펩타이드 및 그의 용도
JP6466833B2 (ja) 2012-05-11 2019-02-06 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 抗炎症活性を有するペプチド、及びそれを含む組成物
CN104822698B (zh) 2012-07-11 2018-08-10 珍白斯凯尔有限公司 细胞穿透肽以及包含该肽的缀合物和组合物
KR102578890B1 (ko) 2012-09-19 2023-09-18 주식회사 젬백스앤카엘 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
KR102201429B1 (ko) 2012-09-19 2021-01-12 주식회사 젬백스앤카엘 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
KR101778244B1 (ko) 2014-05-13 2017-09-26 한양대학교 산학협력단 세포 투과성 펩티드 및 이를 이용한 생물학적 활성 물질의 전달방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010252810A (ja) * 1998-07-08 2010-11-11 Gemvax As テロメラーゼ由来抗原ペプチド
US20090186802A1 (en) * 2005-12-16 2009-07-23 Diatos Cell Penetrating Peptide Conjugates for Delivering of Nucleic Acids into a Cell
KR20090103957A (ko) * 2007-01-29 2009-10-01 주식회사 프로셀제약 신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도
WO2010012850A1 (es) * 2008-07-29 2010-02-04 Universitat Pompeu Fabra Péptidos con capacidad de penetración celular y sus usos
WO2011150494A1 (en) * 2010-05-30 2011-12-08 The Governing Council Of The University Of Toronto Mitochondrial penetrating peptides as carriers for anticancer compounds
KR20120026408A (ko) * 2010-09-09 2012-03-19 서울대학교산학협력단 인간 유래 세포 투과성 펩타이드와 생리활성 펩타이드 결합체 및 그 용도

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FIRE ET AL., NATURE, vol. 391, 1998, pages 806 - 811
LOTTSPEICH, F.; ZORBAS H.: "Bioanalytik", 1998, SPEKTRUM AKADEMISCHER VERLAG
LUFT R; IKKOS D; PALMIERI G; ERNSTER L; AFZELIUS B: "A case of severe hypermetabolism of non thyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control : a correlated clinical, biochemical, and morphological study", J CLIN INVEST, vol. 41, 1962, pages 1776 - 804
MODICA-NAPOLITANO KS; SINGH KK: "April mitochondria as targets for detection and treatment of cancer", EXPERT REV MOL MED, vol. 11, 2002, pages 1 - 19
NOVINA; SHARP, NATURE, vol. 430, 2004, pages 161 - 164
RANA, T. M., NAT. REV. MOL. CELL BIOL., vol. 8, 2007, pages 23 - 36
RANDAL J. KAUFMAN, CURRENT PROTOCOLS IN MOLYCULAR BIOLOGY, vol. 16, 1991, pages 12
See also references of EP2899199A4
SMITH ET AL., GENE, vol. 67, 1988, pages 31 - 40
TOMARI, Y.; ZAMORE, P. D., GENES DEV., vol. 19, 2005, pages 517 - 529

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10960056B2 (en) 2012-05-11 2021-03-30 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US11857607B2 (en) 2012-05-11 2024-01-02 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US9730984B2 (en) 2012-05-11 2017-08-15 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating rheumatoid arthritis
US9844584B2 (en) 2012-05-11 2017-12-19 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating sepsis
US9907837B2 (en) 2012-05-11 2018-03-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating cachexia
US9540419B2 (en) 2012-05-11 2017-01-10 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US11369665B2 (en) 2012-05-11 2022-06-28 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US10039811B2 (en) 2012-05-11 2018-08-07 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US10967000B2 (en) 2012-07-11 2021-04-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell-penetrating peptide, conjugate comprising same and composition comprising same
US9907838B2 (en) 2013-04-19 2018-03-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition and methods for treating ischemic damage
US10383926B2 (en) 2013-06-07 2019-08-20 Gemvax & Kael Co., Ltd. Biological markers useful in cancer immunotherapy
US10561703B2 (en) 2013-06-21 2020-02-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Method of modulating sex hormone levels using a sex hormone secretion modulator
EP3020724A4 (en) * 2013-07-12 2017-01-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same
US10034922B2 (en) 2013-11-22 2018-07-31 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having angiogenesis inhibitory activity and composition containing same
US11058744B2 (en) 2013-12-17 2021-07-13 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for treating prostate cancer
US9937240B2 (en) 2014-04-11 2018-04-10 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same
US10463708B2 (en) 2014-12-23 2019-11-05 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide for treating ocular diseases and composition for treating ocular diseases comprising same
US11077163B2 (en) 2014-12-23 2021-08-03 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide for treating ocular diseases and composition for treating ocular diseases comprising same
US10835582B2 (en) 2015-02-27 2020-11-17 Gemvax & Kael Co. Ltd. Peptide for preventing hearing loss, and composition comprising same
US11015179B2 (en) 2015-07-02 2021-05-25 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having anti-viral effect and composition containing same
US10441632B2 (en) 2016-01-29 2019-10-15 Nexgen Biotechnologies, Inc. Anti-wrinkle and anti-aging cosmetic composition comprising green fluorescent protein-human epidermal growth factor fusion protein as effective component
US10898540B2 (en) 2016-04-07 2021-01-26 Gem Vax & KAEL Co., Ltd. Peptide having effects of increasing telomerase activity and extending telomere, and composition containing same

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