CN111053888B - 家蚕抗菌肽Cecropin D在食道癌治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了家蚕抗菌肽Cecropin D在食道癌治疗中的用途，具体为：家蚕抗菌肽Cecropin D在制备用于治疗食道癌或抑制食道癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭的药物中的用途。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述家蚕抗菌肽Cecropin D对两种食道癌细胞均有抑制作用并呈现剂量依赖性，但对人肾原细胞293T无明显增殖抑制能力，具有特异性；(2)本发明所述家蚕抗菌肽Cecropin D能够显著抑制两种食道癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭能力；(3)本发明阐明了家蚕抗菌肽Cecropin D的作用机制，为相关抗肿瘤药物的开发提供了理论基础和实验依据。

Description

家蚕抗菌肽Cecropin D在食道癌治疗中的用途

技术领域

本发明属于肿瘤药物技术领域，涉及家蚕抗菌肽作为肿瘤治疗药物的新用途，具体为家蚕抗菌肽Cecropin D在食道癌治疗中的用途。

背景技术

食道癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。早期食道癌主要通过手术结合放疗和化疗进行治疗，但是食道癌患者的总生存率仍然很低。化学疗法是治疗食道癌的常规手段。但是，肿瘤细胞的抗药性，化疗药物的无差别杀伤性以及化疗药物的各种毒副作用会加速疾病的发展。因此，寻找一种安全且对食道癌无耐药性的新型药物迫在眉睫。

家蚕抗菌肽(Bombyx mori Antibacterial peptides，AMPs)是家蚕先天免疫系统中一类极其重要的免疫效应因子，可杀死多种细菌和真菌。家蚕抗菌肽可以特异性杀死肿瘤细胞，但对人体正常细胞没有明显的毒性副作用。与传统的化疗药物相比，家蚕抗菌肽对肿瘤细胞具有特异的细胞毒性，并在联合治疗中具有累加作用，更重要的是，它们具有绕过过度耐药机制的能力。家蚕抗菌肽的这些特性为癌症治疗提供了新思路和新方法。

传统的化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀死正常细胞，引起严重的毒副作用，同时肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生耐药性也是化疗中存在的巨大问题，为此很多研究者尝试寻找更高效、安全的化疗或者化疗辅助药物。抗菌肽作为生物体内的一种免疫效应因子，具有抗细菌、真菌、病毒的活性，自从Moore等首次发现抗菌肽对哺乳动物的肿瘤细胞具有抗肿瘤活性，越来越多的研究表明抗菌肽对人体多种肿瘤细胞如胃癌、肝癌、乳腺癌等具有杀伤能力。抗菌肽可以通过破坏细胞膜直接杀死肿瘤细胞，也可以通过激活肿瘤细胞凋亡途径以及阻滞细胞周期等方式来杀死肿瘤细胞。

研究表明，家蚕Cecropin家族抗菌肽对多种肿瘤细胞具有抑制作用。Zhang等研究证明来自于中国柞蚕的Cecropin对大鼠大肠癌细胞具有明显的抑制作用，但是对于人正常胃上皮细胞无明显毒副作用。Sang等通过用抗菌肽Cecropin A及其类似物对白血病细胞进行实验，结果表明抗菌肽Cecropin A及其类似物对白血病细胞有选择性细胞毒性，通过共聚焦显微镜能够观察到抗菌肽Cecropin A在白血病细胞表面富集，并裂解白血病细胞，但对淋巴细胞无毒副作用，而5－氟脲嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)等传统化疗药物对正常细胞和肿瘤细胞无选择性，在肿瘤治疗方面的副作用大。Xia等人通过构建酵母表达载体成功诱导表达出家蚕抗菌肽Cecropin-XJ，发现家蚕抗菌肽Cecropin-XJ与化疗药物联用对食道癌Eca109细胞的增殖有明显的抑制作用；通过建立荷瘤小鼠模型，证明了在老鼠体内Cecropin-XJ对人食道癌Eca109细胞有显著抑杀作用且对小鼠脏器无毒害。

肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤生物学行为的主要特征，是恶性肿瘤难治愈和引起治疗失败的主要原因之一。Wu等通过构建胃癌老鼠荷瘤模型，确定了家蚕抗菌肽Cecropin-XJ能够在体外和体内抑制肿瘤细胞的增殖，并且通过抑制肿瘤血管的生成，降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。Jeong等研究表明，蜂毒肽能够通过NF-jB和PI3K/Akt/mTOR途径抑制MMP-9的表达以此来降低乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的迁移和侵袭能力。

大部分化疗药物都是通过促进肿瘤细胞的凋亡来达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。抗菌肽作为一种小分子多肽，有着非常复杂的作用机制，研究表明一些抗菌肽可以通过破坏细胞膜机制来杀死肿瘤细胞，某些抗菌肽能够进入肿瘤细胞内部，作用于某些靶点来激活细胞的凋亡。Cecropin家族可以通过诱导细胞凋亡来抑制多种肿瘤细胞。低浓度的Cecropin-XJ可以激活caspase-3的活性来诱导细胞凋亡，最终杀死人胃癌细胞AGS；Xia等研究了家蚕抗菌肽Cecropin-XJ对肝癌细胞Huh-7的抑制作用，实验证明Cecropin-XJ通过诱导肝癌细胞中的S细胞周期停滞和凋亡，以及线粒体膜电位的丧失来抑制肝癌细胞，Cecropin-XJ通过激活caspase-3和poly聚合酶诱导肝癌细胞凋亡。Cerón等研究表明家蚕天蚕素Cecropin A可诱导人早幼粒白血病细胞凋亡，其机制可能是由于Cecropin A促进细胞内活性氧增加，导致磷脂酰丝氨酸外翻以及DNA片段化，使细胞凋亡程序被激活。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种家蚕抗菌肽Cecropin D的新用途，本发明提供了家蚕抗菌肽Cecropin D在食道癌治疗中的用途。本发明通过CCK-8法、流式细胞术等手段检测了固相合成法合成的Cecropin D对人食道癌细胞Eca109、T13的增殖抑制作用，并深入探究其抑制机制。

技术方案：家蚕抗菌肽Cecropin D在制备用于治疗食道癌或抑制食道癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭的药物中的用途。

优选的，所述家蚕抗菌肽Cecropin D由固相合成法获得。

优选的，所述家蚕抗菌肽Cecropin D的C端经过酰胺化处理。

优选的，所述家蚕抗菌肽Cecropin D的序列为SEQ ID NO.1(GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQ)。使用高效液相色谱(HPLC)，测定抗菌肽Cecropin D纯度达到94.67％。同时进行ESI质谱法检测以确保合成的抗菌肽序列是正确的。现有技术中的研究表明，化学合成的Cecropin D在体外和家蚕体内均具有抗菌活性。

优选的，所述食道癌细胞为Eca109或T13。人食道癌细胞系Eca109、T13细胞以及人胚胎肾细胞293T由东南大学医学院病理研究室提供。其中，人胚胎肾细胞293T作为对照组。三种细胞采用以下方法培养：人食道癌细胞系Eca109、T13和人胚胎肾细胞293T接种在含有10％胎牛血清、10⁵U·L^-1青霉素和链霉素双抗的DMEM培养基中，在含有5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养。

优选的，所述家蚕抗菌肽Cecropin D通过激活线粒体凋亡途径来抑制食道癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭。

有益效果：(1)本发明所述家蚕抗菌肽Cecropin D对两种食道癌细胞均有抑制作用并呈现剂量依赖性，但对人肾原细胞293T无明显增殖抑制能力，具有特异性；(2)本发明所述家蚕抗菌肽Cecropin D能够显著抑制两种食道癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭能力；(3)本发明阐明了家蚕抗菌肽Cecropin D的作用机制，为相关抗肿瘤药物的开发提供了理论基础和实验依据。

附图说明

图1是家蚕抗菌肽Cecropin D对两种食道癌细胞以及人肾原细胞293T的增殖影响；其中，A为不同浓度的Cecropin D对食道癌细胞Eca109和T13细胞分别处理12，24，48小时后的增殖抑制率，B为Cecropin D和Dox(阿霉素)对两种食道癌细胞Eca109、T13分别处理12，24，48小时后的增殖抑制率，C为Cecropin D处理两种食道癌细胞Eca109、T13，培养一周后的克隆形成以及克隆形成率*P<0.05,**P<0.01与对照组(0μg/mL Cecropin D)相比；

图2是Cecropin D对两种食道癌细胞Eca109和T13的迁移以及侵袭的影响；其中，A为Cecropin D对食道癌细胞Eca109的迁移能力的影响，B为Cecropin D对食道癌细胞T13的迁移能力的影响，C为Cecropin D对两种食道癌细胞侵袭能力的抑制，阳性对照均为Dox，*P<0.05,**P<0.01与对照组(0μg/mL Cecropin D)相比。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例所述的家蚕抗菌肽Cecropin D通过固相合成法合成，并且在C端进行酰胺化处理；Cecropin D的序列为GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQ。使用高效液相色谱(HPLC)测定抗菌肽Cecropin D纯度达到91.81％。同时进行ESI质谱法检测以确保合成的抗菌肽序列是正确的。现有技术中的研究表明，化学合成的Cecropin D在体外和家蚕体内均具有抗菌活性。人食道癌细胞系Eca109、T13细胞以及人胚胎肾细胞293T由东南大学医学院病理研究室提供，其中，人胚胎肾细胞293T作为本实施例的对照组。

DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；胰蛋白酶(trypsin)购自Hyclone公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、定量试剂盒等购自TaKaRa公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；Matrigel胶购自Corning公司；Transwell小室购自BD公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.试验方法

1.1细胞培养

人食道癌细胞系Eca109、T13和人胚胎肾细胞293T接种在含有10％胎牛血清、10⁵U·L^-1青霉素和链霉素双抗的DMEM培养基中，在含有5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养。

1.2 CCK-8法检测细胞增殖

用0.25％胰蛋白酶消化对数生长的Eca109、T13细胞和293T细胞，将细胞浓度调整为1×10⁴细胞/mL。将细胞悬浮液以每孔100μL，每组三个重复的形式接种在96孔细胞培养板中，并且将不包含细胞的DMEM培养基用作空白对照。

在5％CO₂培养箱中于37℃孵育24小时后，将Eca109、T13细胞和293T细胞用不同浓度的家蚕CecropinD(0、10、20、40、80、100μg/mL)处理12、24、48小时，研究不同浓度CecropinD和不同处理时间对三种细胞增殖的影响。将10μg/mL Dox处理的细胞作为阳性对照。处理后，将10μL CCK-8溶液添加到每个孔中，并将混合物混合并放入培养箱中再放置2小时。用酶标仪在450nm处测量各组的吸光度(OD值)，并记录和分析结果。

细胞增殖抑制率(％)＝[(OD_对照组-OD_实验组)/(OD_对照组-OD_空白组)]×100％

1.3克隆形成实验

通过平板克隆实验测定家蚕CecropinD对食道癌细胞Eca109、T13细胞形成集落能力的影响。将Eca109、T13细胞分别以每孔1×10³个细胞的密度接种在6孔板中，用含有PBS或100μg/mL家蚕CecropinD的DMEM培养液培养，10μg/mL DOX用作阳性对照，设置三组重复，孵育6天。温育后，除去培养基，并将细胞用PBS洗涤两次。加入预冷的0.5mL100％甲醇固定10分钟，除去甲醇，在室温下干燥样品。用新鲜制备的0.1％结晶紫染色10分钟，用PBS漂洗3次，然后拍照并计数细胞集落数。

细胞克隆形成率(％)＝处理组的菌落数/对照组的菌落数×100％

1.4划痕愈合实验

将处于对数生长期的食道癌Eca109、T13细胞分别接种到六孔板中，并在5％CO₂培养箱中培养。当细胞长至覆盖培养皿的90％时，使用10μL微量移液器吸头在细胞层画一条直线。保持划线的宽度一致。丢弃培养液，并用PBS轻轻冲洗3次以除去细胞碎片。对照组为无血清的DMEM培养基，实验组加入含有100μg/mL CecropinD的DMEM培养基，阳性对照组加入含10μg/mL的Dox的DMEM培养基。分别温育0小时，12小时和24小时后，分别取出六孔板，在倒置显微镜(Leica，Nussloch，Germany)下拍摄图像，以评估细胞迁移至伤口区域的能力。

1.5细胞侵袭实验

将Matrigel胶在无血清DMEM培养基中以1：3稀释，每孔60μL均匀地置于Transwell上室中，并在37℃下孵育2-4小时。将对数生长期的食道癌Eca109、T13细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，用PBS洗涤两次，并用无血清DMEM培养基将细胞密度调节至2.5×10⁵细胞/mL。将100μL的细胞悬液添加至上腔室。将500μL的含有10％胎牛血清的DMEM培养基添加至下腔室。最后，将10μL浓度为100μg/mL的CecropinD分别添加到上腔室中，加入等量的PBS作为阴性对照，加入10μg/mL的Dox用作阳性对照，并在培养箱中培养。培养12小时后，取出小室，用PBS轻轻漂洗两次，并用预冷甲醇固定15分钟。最后用新鲜制备的0.1％结晶紫染色10分钟，用PBS冲洗3次。用倒置显微镜观察基底膜下表面的染色细胞，并从5个视角随机选择每个腔室并拍照，以计算通过该膜的细胞数。

1.6统计学处理

实验数据均采用GraphPad Prism 5软件统计分析。实验数据以mean±S.D.形式表示,组间两两比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05、P<0.01表示差异有统计学意义。

2.结果分析

2.1 Cecropin D抑制食道癌细胞Eca109和T13的生长和增殖

通过CCK-8法检测不同浓度的家蚕抗菌肽CecropinD对两种食道癌细胞Eca109和T13的增殖影响，人胚肾细胞293T作为对照。结果显示，CecropinD以剂量依赖性方式显著抑制Eca109和T13细胞的增殖，随着作用时间的增加，抑制能力减弱(图1A)，在阳性对照组中，Dox抑制了两种细胞的生长。CecropinD对Eca109和T13细胞的抑制作用不同于Dox(图1B)。而在实验浓度下，CecropinD处理对293T细胞的生长无显著影响(图1B)。

克隆形成实验中，用100μg/mL的CecropinD处理两种食道癌细胞Eca109和T13，对照组加入等量的无血清培养液，阳性对照组为10μg/mL Dox。结果显示，未经抗菌肽处理的食道癌细胞Eca109和T13在一周后形成的集落数高于用药组，通过对长出的克隆数进行克隆形成率计算，设定对照组的克隆形成率为100％，CecropinD处理的Eca109组克隆形成率为(73.25±0.45)％，T13组的克隆形成率为(74.3±1.4)％，具有显著性差异(P<0.05)。以上结果说明，CecropinD对食道癌细胞Eca109和T13的克隆形成均有抑制作用(图1C)。

2.2 CecropinD抑制食道癌细胞Eca109和T13的迁移和侵袭

肿瘤细胞的迁移是肿瘤扩散的重要原因。因此，本实验通过划痕愈合实验来研究CecropinD影响食道癌细胞迁移的能力。结果表明，未经处理的Eca109和T13细胞在24h时的划痕覆盖面积大于实验组。培养12h和24h后，经100μg/mL CecropinD处理的T13实验组分别迁移了(20.53±0.69)％、(28.47±0.47)％，阴性对照组12h和24h的T13细胞的迁移率分别为(51.62±0.44)％、(69.53±0.54)％。上述结果表明实验组的食道癌细胞迁移能力显著减弱(P<0.05)，并伴有大量细胞死亡(图2A、B)，说明CecropinD对Eca109和T13细胞的迁移有抑制作用。

在Transwell实验中，使用100μg/mL的CecropinD分别处理两种食道癌细胞Eca109和T13，与对照组相比，在培养24h之后CecropinD对Eca109细胞的侵袭抑制率为(38.27±4.49)％，对T13细胞的侵袭抑制率为(14.97±3.34)％(图2C)，以上结果表明CecropinD能够显著抑制Eca109细胞的侵袭(P<0.05)。

3.结论

本课题组前期通过固相合成法得到家蚕抗菌肽CecropinD，体外抑菌实验证明其具有抗菌活性。因此，本研究采用CCK-8法检测CecropinD对食道癌细胞Eca109和T13的增殖抑制能力，结果表明家蚕抗菌肽CecropinD对两种食道癌细胞有抑制作用并呈现剂量依赖性，但对人肾原细胞293T无明显增殖抑制能力。克隆形成实验结果表明家蚕抗菌肽CecropinD能够显著抑制食道癌细胞Eca109和T13的克隆形成能力。以上结果说明家蚕抗菌肽CecropinD对两种食道癌细胞Eca109和T13具有抑制能力，并且对人肾原细胞293T无明显毒副作用，其选择性杀伤食道癌细胞的机制有待进一步研究。

本研究用CecropinD处理体外培养的食道癌细胞24h，结果表明CecropinD可以显著抑制Eca109和T13细胞的迁移和侵袭。

本研究通过CCK-8法、流式细胞术等手段检测了固相合成法合成的Cecropin D对人食道癌细胞Eca109、T13的增殖抑制作用，并深入探究其抑制机制。结果表明，Cecropin D可以抑制人食道癌细胞Eca109、T13的增殖，降低食道癌细胞的迁移和侵袭能力，可能通过激活食道癌细胞的线粒体凋亡途径以达到杀死食道癌细胞的效果，说明Cecropin D能够比较全面的抑制食道癌细胞Eca109、T13的生长，为今后开发Cecropin D相关的抗肿瘤药物提供了理论基础和实验依据。

序列表

<110> 镇江市高等专科学校

<120> 家蚕抗菌肽Cecropin D在食道癌治疗中的用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 1

Gly Asn Phe Phe Lys Asp Leu Glu Lys Met Gly Gln Arg Val Arg Asp

1 5 10 15

Ala Val Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Asp Thr Leu Ala Lys Ala Lys

20 25 30

Ala Leu Gly Gln

35

Claims (4)

1.家蚕抗菌肽Cecropin D在制备用于治疗食道癌或抑制食道癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭的药物中的用途，其特征在于，所述家蚕抗菌肽Cecropin D的序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述家蚕抗菌肽Cecropin D由固相合成法获得。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述家蚕抗菌肽Cecropin D的C端经过酰胺化处理。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食道癌细胞为Eca109和T13。

Images