KR20180101445A

KR20180101445A - 생합성 프로세스에 의해 캡시노이드를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20180101445A
Application number: KR1020187022312A
Authority: KR
Inventors: 후이 첸; 시아오단 유
Original assignee: 코나겐 인크.
Priority date: 2016-01-07
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2018-09-12
Also published as: US20190010522A1; EP3377057A1; WO2017120473A1; CA3010716A1; MX2018008351A; US10655150B2; BR112018013539A2; CN108472279A; EP3377057A4; JP2019500877A; AU2017205501A1

Abstract

캡시에이트 신타제를 혼합물 또는 세포 시스템에 제공하고, 8-메틸-6-노네노일-CoA, 6E-8-메틸노넨산 또는 8-메틸노난산을 혼합물 또는 세포 시스템에 공급하고, 바닐릴 알콜을 혼합물 또는 세포 시스템에 공급하고, 캡시노이드를 혼합물 또는 세포 시스템으로부터 수집하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

생합성 프로세스에 의해 캡시노이드를 제조하는 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 1월 7일자로 출원된, 미국 가출원 번호 62/276,059에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은, 주로 세포 시스템에서, 생합성적으로 캡시에이트, 디히드로캡시에이트, 노르디히드로캡시에이트를 포함한 캡시노이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

캡시에이트, 디히드로캡시에이트, 및 노르디히드로캡시에이트를 포함한 캡시노이드는 칠리 페퍼 (캅시쿰 안눔 엘.(Capsicum annuum L.))에 천연적으로 존재하는 분자이다. 캡시에이트는 주로 레드 페퍼의 비-자극성 재배품종, CH19 스위트에서 발견되고, 캡사이신 수용체의 활성화를 포함한, 캡사이신에 필적할만한 효과를 제공하는 것으로 알려져 있다. 캡시노이드는 캡사이신을 함유하지 않은, 칠리 페퍼의 고유한 변종, CH-19 스위트에서 최초로 단리되었다 (Yazawa et al., 1989).

캡시노이드는, 상기 언급된 바와 같이, CH-19 스위트로 명명된, 페퍼 (캅시쿰 안눔 엘.)의 비-자극성 재배품종의 열매에서 최초로 보고된 캡사이시노이드-유사 물질이다 (Yazawa et al., 1989). 이후에, 캡시에이트 (4-히드록시-3-메톡시벤질 (E)-8-메틸-6-노네노에이트), 디히드로캡시에이트 (4-히드록시-3-메톡시벤질 8-메틸노나노에이트), 및 노르디히드로캡시에이트 (4-히드록시-3-메톡시벤질 7-메틸옥타노에이트)는 CH-19 스위트에서 3종의 주요 캡시노이드로서 확인되었다 (Kobata et al., 1998; Kobata et al., 1999). 캡시노이드에서, 캡사이시노이드의 방향족 부분, 바닐릴아민은 바닐릴 알콜에 의해 대체되지만 그의 아실 잔기는 상응하는 캡사이시노이드의 것들과 동일하다.

이전에 캡사이시노이드는, 에너지 대사를 촉진하고, 체지방 축적을 억제하고 비만 및 당뇨병에 대한 식이 요법을 제공할 가능성을 갖는 것으로 보고된 바 있다. 그러나, 캡사이신은 강력하게 자극성이고 신경독성이며, 이는 인간에 대한 그의 투여를 매우 금지한다 (Masuda et al., 2003). 대조적으로, 캡시에이트는 통증 없이 대량으로 섭취될 수 있으며 에너지 대사 및 체중 감소에 대한 그의 효과는 캡사이신의 것과 유사하다 (Masuda et al., 2003; Snitker et al., 2009). 오늘날 캡시에이트 및 CH-19 스위트 페퍼 추출물은 대사를 부스팅하는 식이 보충제로서 널리 사용된다.

캡시노이드는 핫 페퍼에서 자극성을 야기하는 물질, 캡사이신과 구조적으로 유사하긴 하지만, 캡시노이드는 상당히 덜 자극성이다. 캡시노이드는 캡사이신의 것의 약 1/1000인 추정된 "매운 맛 역치"를 갖는 것으로 알려져 있다. 캡사이신, 및 캡시노이드 패밀리의 구성원 사이의 구조적 차이는 도 1에 제시되어 있다. 캡시노이드는 캡사이신의 아미드 결합과 비교하여 그의 구조에서 에스테르 결합을 갖는다.

캡사이신은 열적 열을 검출하는데 사용되는 혀 상의 감각 수용체를 활성화시키는 것으로 여겨진다 (Szallasi, et al. 1999). 이들 수용체, 일시적 수용체 전위 바닐로이드 1 (TRPV1)은 또한 위 및 다른 기관에 존재한다 (Nagy, et al. 2004). TRPV1 수용체의 활성화는 교감 신경계 (SNS)를 촉발하는 것으로 이해된다 (Iwai, et al., 2003). 캡사이신은 SNS를 활성화시키는 것을 통해 인간 및 동물에서 지방 연소의 증가를 매개할 수 있다.

캡사이신과 같이, 캡시노이드는 감각 수용체 예컨대 일시적 수용체 전위 바닐로이드 1 (TRPV1) 수용체를 활성화시킨다 (Iida et al., 2003). 캡사이신 및 캡시노이드는 SNS를 활성화시키는 것을 통해 인간 및 동물에서 지방 연소의 증가를 매개할 수 있다. 그러나, 캡사이신과 달리, 캡시노이드는 입에서 열 감각을 개시하지 않으며, 이는 캡시노이드가 캡사이신과 비교하여 구조적 차이로 인해 구강에서 TRPV1 수용체에 물리적으로 도달할 수 없기 때문일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 캡시노이드는 위에서 TRPV1 수용체를 활성화시킬 수 있으며, 이는 캡사이신 및 캡시노이드 둘 다의 대사 효과에 중요한 것으로 제시된 바 있다 (Ohnuki et al., 2001)

이들 대사 효과는 항암, 항염증, 및 진통 활성, 뿐만 아니라 체중 관리를 포함한, 캡사이신 및 캡시노이드 둘 다의 많은 건강상 유익한 특성에 기여하는 것으로 여겨진다 (Macho et al., 2003; Sancho et al., 2002; He et al., 2009; Kawabata, et al., 2006; Handler, et al., 2008). 연구는 에너지 대사 (Snitker et al., 2009; Inoue et al., 2007) 및 체온 (Ohnuki et al., 2001; Hachiya, et al., 2007) 상승 둘 다가 인간에서 캡시노이드 또는 CH-19 스위트의 추출물의 투여 후에 발생한다는 것을 제시한 바 있다. 더욱이, 체지방 축적은 캡시노이드 섭취 후에 억제된다 (Ohnuki et al., 2001).

그러나, 스위트 페퍼에서 캡시노이드의 함량은 극도로 낮다. 예를 들어, 단지 캡시노이드 1파운드가, 캡시에이트에 대한 시장 가격을 유도하는, 값비싼 CH-19 스위트 페퍼 10,000 파운드로부터 추출될 수 있으며, 이는 스위트 페퍼로부터 추출된 캡시에이트의 가격을 극도로 비싸게 만든다 (예를 들어, 40% 내지 98% 순도의 캡시에이트의 경우에 US $600 - 25,000; www.alibaba.com/product-detail/High-quality-Capsiate-40-to-98_344832645.html?spm=a2700.7724838.35.1.J77Yht). 따라서, 상당한 양의 캡시노이드를 생산하는 더 효과적인 방법이 요망된다.

개시내용은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 혼합물 또는 세포 시스템을 사용하여 캡시노이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

일부 측면에서, 캡시에이트 신타제 (CS)를 세포 시스템에서 발현하고; 8-메틸-6-노네노일-CoA 및 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 첨가하고; 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법이 제공된다. 다른 측면에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고; 8-메틸노난산 및 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 첨가하고; 디히드로캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 디히드로캡시에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고; 6E-8-메틸노넨산 및 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 첨가하고; 캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고; 중쇄 지방산 및 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 첨가하고; 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법이 제공된다.

상기 방법 중 임의의 하나의 일부 실시양태에서, CS 아미노산 서열은 캅시쿰(Capsicum) 속의 식물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 캅시쿰 속 식물은 고스트 칠리 식물이다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 방법 중 임의의 하나의 일부 실시양태에서, ACS 아미노산 서열은 캅시쿰 속의 식물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 캅시쿰 속 식물은 고스트 칠리 식물이다. 일부 실시양태에서, ACS는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACS는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 방법 중 임의의 하나의 일부 실시양태에서, 세포 시스템은 효모, 비-캡시노이드 생산 식물, 해조류 및 박테리아를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포 시스템은 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 세포 시스템은 이. 콜라이(E. Coli)이다.

상기 방법 중 임의의 하나의 일부 실시양태에서, 방법은 생산된 캡시노이드, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트를 수집하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생산된 캡시노이드, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트를 70% 초과의 순도로 정제하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제 단계는 산-염기 추출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제 단계는 진공 증류를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제 단계는 반정제용 HPLC를 포함한다.

또 다른 측면에서, 캡시에이트 신타제 (CS)를 반응 혼합물에 제공하고; 8-메틸-6-노네노일-CoA 및 바닐릴 알콜을 반응 혼합물에 첨가하고; 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고; 8-메틸노난산 및 바닐릴 알콜을 반응 혼합물에 첨가하고; 디히드로캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 디히드로캡시에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고; 6E-8-메틸노넨산 및 바닐릴 알콜을 반응 혼합물에 첨가하고; 캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고; 중쇄 지방산 및 바닐릴 알콜을 반응 혼합물에 첨가하고; 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법이 제공된다.

상기 방법 중 임의의 하나의 일부 실시양태에서, CS 아미노산 서열은 캅시쿰 속의 식물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 캅시쿰 속 식물은 고스트 칠리 식물이다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 방법 중 임의의 하나의 일부 실시양태에서, CS 및/또는 ACS는 효모, 비-캡시노이드 생산 식물, 해조류 및 박테리아를 포함하는 군으로부터 선택된 세포 시스템에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 세포 시스템은 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 세포 시스템은 이. 콜라이이다.

상기 방법 중 임의의 하나의 일부 실시양태에서, 방법은 생산된 캡시노이드, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트를 반응 혼합물로부터 수집하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생산된 캡시노이드, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트를 70% 초과의 순도로 정제하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제 단계는 산-염기 추출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제 단계는 진공 증류를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제 단계는 반정제용 HPLC를 포함한다.

개시내용은 또한 하기 추가의 실시양태를 제공한다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS)를 혼합물에 제공하고; 8-메틸노네노일-CoA를 혼합물에 공급하고; 바닐릴 알콜을 혼합물에 공급하고; 캡시노이드를 수집하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 제조하는 생물전환 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS)를 혼합물에 제공하고; 아실트랜스퍼라제를 혼합물에 제공하고; 6E-8-메틸노넨산을 공급하고; 바닐릴 알콜을 혼합물에 공급하고; 캡시에이트를 수집하는 것을 포함하는, 캡시에이트를 제조하는 생물전환 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS)를 혼합물에 제공하고; 아실트랜스퍼라제를 혼합물에 제공하고; 8-메틸노난산을 공급하고; 바닐릴 알콜을 혼합물에 공급하고; 캡시에이트를 수집하는 것을 포함하는, 디히드로캡시에이트를 제조하는 생물전환 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, CS 유전자를 세포 시스템에서 발현하고; ACS1 유전자를 세포 시스템에서 발현하고; 중쇄 지방산을 세포 시스템에 공급하고; 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 공급하고; 캡시노이드를 수집하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 제조하는 생물전환 방법이 제공된다.

도 1은 캡시에이트, 디히드로캡시에이트, 및 노르디히드로캡시에이트에 대한 분자 구조를 제시한다.
도 2는 다이어그램 캡시에이트 신타제 (CS)-촉매된 캡시에이트 생합성을 제시한다.
도 3은 6E-8-메틸노넨산 (6E) 및 8-메틸노난산 (8M) 각각으로부터의 추정 캡시에이트 (CQ) 및 디히드로캡시에이트 (DHCQ) 생산의 HPLC 프로파일을 제시한다. VA (바닐릴 알콜), 6E 및 8M 농도는 500 mg/L이다. 도 3에 제시된 바와 같이, 상이한 산물이 6E 및 8M 각각으로부터 형성되었다.
도 4는 VA+6E (VE) 및 VA+8M (VM) 각각으로부터의 CQ 및 DHCQ 생산을 제시한다. 실험은 삼중으로 수행되었다.
도 5는 GC/MS 분석이 배양물에서 CQ 및 DHCQ의 아이덴티티를 확증하기 위해 수행되었다는 것을 제시한다.
도 6은, GC/MS 라이브러리에서 CQ 및 DHCQ 스펙트럼이 없고 가장 가까운 매치는 DHCP (디히드로캡사이신)의 것이므로, GC/MS 라이브러리에서의 DHCP (디히드로캡사이신) 스펙트럼과 유도 샘플로부터 수득된 CQ 및 DHCQ 스펙트럼의 비교를 제시한다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 하기 기재된다.

대상 기술의 변이체 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 서열을 정렬시키고, 필요한 경우에, 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후의, 그리고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않는, 참조 폴리펩티드의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다.

퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적에 대한 정렬은 관련 기술분야의 기술 내의 다양한 방식으로, 예를 들어, 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈라인(Megalign) (디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸친 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, % 아미노산 서열 동일성은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 사용하여 결정될 수 있다. NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 ncbi.nlm.nih.gov에서 다운로드할 수 있다. NCBI BLAST2는 여러 서치 파라미터를 사용하며, 여기서, 이들 서치 파라미터 모두는 예를 들어 언마스크 예스, 스트랜드=전체, 예상된 경우 10, 최소 낮은 복잡도 길이=15/5, 다중-패스 e-값=0.01, 다중-패스에 대한 상수=25, 최종 갭드 정렬에 대한 드롭오프=25 및 점수화 매트릭스=BLOSUM62를 포함한, 디폴트 값으로 설정된다. NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 대비한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (이는 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 대비한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다: 100 x 분율 X/Y, 여기서 X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에서 해당 프로그램 정렬에 의해 동일한 매치로서 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것으로 인지될 것이다.

이러한 의미에서, 아미노산 서열 "유사성"을 결정하기 위한 기술은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 일반적으로, "유사성"은 적절한 위치에서의 2개 이상의 폴리펩티드의 정확한 아미노산 대 아미노산 비교를 지칭하며, 여기서 아미노산은 동일하거나, 또는 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성 예컨대 전하 또는 소수성을 보유한다. 이어서 소위 "퍼센트 유사성"은 비교되는 폴리펩티드 서열 사이에 결정될 수 있다. 핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 또한 관련 기술분야에 널리 알려져 있고, 해당 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것 (통상적으로 cDNA 중간체를 통함), 및 그 안에 코딩된 아미노산 서열을 결정하는 것, 및 이를 제2 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 일반적으로, "동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각에 대한 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 지칭한다. 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 그의 "퍼센트 동일성"을 결정함으로써 비교될 수 있고, 2개 이상의 아미노산 서열도 마찬가지일 수 있다. 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 버전 8 (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)으로부터 입수가능함, 위스콘신주 매디슨)로 입수가능한 프로그램, 예를 들어, GAP 프로그램은 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성, 및 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 및 유사성 둘 다를 각각 계산할 수 있다. 서열 사이의 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 프로그램은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.

달리 명시되지 않는 한, 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 2개의 서열 중 더 짧은 것의 전체 길이에 걸친 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다.

"형질전환"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고 통상적인 의미에 따라 사용되고, 비제한적으로 표적 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 지칭하는데 사용된다. 전달된 폴리뉴클레오티드는 표적 세포의 게놈 또는 염색체 DNA에 혼입되어, 유전적으로 안정한 유전을 유발할 수 있거나, 또는 이는 숙주 염색체와 무관하게 복제될 수 있다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로서 지칭된다.

용어 "형질전환된", "트랜스제닉", 및 "재조합"은, 숙주 세포와 관련하여 본원에 사용될 때, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고 통상적인 의미에 따라 사용되고, 비제한적으로 이종 핵산 분자가 도입되어 있는 숙주 유기체의 세포, 예컨대 식물 또는 미생물 세포를 지칭하는데 사용된다. 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있거나, 또는 핵산 분자는 염색체외 분자로서 존재할 수 있다.

용어 "재조합, "이종", 및 "외인성"은, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에 사용될 때, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 일반적이고 통상적인 의미에 따라 사용되고, 비제한적으로 특정한 숙주 세포에 대한 외래 공급원으로부터 기원하거나, 또는 동일한 공급원으로부터 기원하는 경우에 그의 원래 형태로부터 변형된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 서열 또는 유전자)를 지칭하는데 사용된다. 따라서, 숙주 세포 내 이종 유전자는 특정한 숙주 세포에 대해 내인성이지만, 예를 들어, 위치-지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술의 사용을 통해 변형되어 있는 유전자를 포함한다. 용어는 또한 천연 발생 DNA 서열의 비-천연 발생 다중 카피를 포함한다. 따라서, 용어는 세포에 대해 외래 또는 이종이거나, 또는 세포에 대해 동종이지만 요소가 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 내 위치에 또는 형태로 존재하는 DNA 세그먼트를 지칭한다.

유사하게, 용어 "재조합", "이종", 및 "외인성"은, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 관련하여 본원에 사용될 때, 특정한 숙주 세포에 대한 외래 공급원으로부터 기원하거나, 또는 동일한 공급원으로부터 기원하는 경우에 그의 원래 형태로부터 변형된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 재조합 DNA 세그먼트는 숙주 세포에서 발현되어 재조합 폴리펩티드를 생산할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포 시스템"은 이소성 단백질의 발현을 가능하게 하는 임의의 세포를 지칭한다. 이는 박테리아, 효모, 식물 세포 및 동물 세포를 포함한다. 이는 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 이는 또한 리보솜과 같은 세포 구성성분을 활용하는 단백질의 시험관내 발현을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포 시스템을 성장시키는 것"은 세포가 증식 및 분할하는 것을 가능하게 할 수 있는 배지를 제공하는 것을 포함한다. 이는 또한 자원을 제공하여 세포 또는 세포 구성성분이 재조합 단백질을 번역하고 만들 수 있도록 하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질 발현"은 유전자 발현의 일부로서의 단백질 생산을 지칭한다. 이는 DNA가 메신저 RNA (mRNA)로 전사된 후의 스테이지들로 이루어진다. 이어서 mRNA는 폴리펩티드 쇄로 번역되며, 이는 궁극적으로 단백질로 폴딩된다. DNA는 형질감염, 의도적으로 핵산을 세포에 도입하는 프로세스를 통해 세포에 존재한다. 용어는 종종 진핵 세포에서의 비-바이러스 방법에 사용된다. 이는 또한 다른 방법 및 세포 유형을 지칭할 수 있긴 하지만, 다른 용어가 바람직하다: "형질전환"이 보다 종종 박테리아, 식물 세포를 포함한 비-동물 진핵 세포에서 비-바이러스성 DNA 전달을 기재하는데 사용된다. 형질도입은 종종 바이러스-매개 DNA 전달을 기재하는데 사용된다. 형질전환, 형질도입, 및 바이러스 감염은 본 출원의 경우에 형질감염의 정의 하에 포함된다. 게다가, 단백질 발현은 시험관내 번역을 포함하며, 여기서 단백질은 세포 밖에 있는 세포 소기관을 활용하여 발현된다.

"생물형질전환"으로도 알려진, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물전환"은 더 비싸거나 또는 비생물학적으로 실현가능하지 않을 수 있는 화학 반응을 수행하기 위한 살아있는 유기체 종종 미생물 (예를 들어, 박테리아 및 효모)의 사용을 지칭한다. 이들 유기체는 물질을 화학적으로 변형된 형태로 전환시킨다.

용어 "반응 혼합물" 및 "혼합물"은, 본원에 사용된 바와 같이, 관련 기술분야에 알려진 많은 변형으로 용액, 현탁액, 또는 콜로이드 형태로 혼합될 수 있는 2종 이상의 물질의 물리적 조합을 지칭한다. 반응 혼합물은 재조합 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ACS 및 CS) 및 1종 이상의 시험관내 반응 시스템 구성성분 예컨대 기질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 바닐릴 알콜 (VA), 6E-8-메틸노넨산 (6E), 및/또는 8-메틸노난산 (8M)), 완충제 (예를 들어, 인산칼륨 완충제), 및 염 (예를 들어, MgCl₂)의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 출원인은 HPLC-기반 방법을 사용하여 페퍼 ACSl의 활성을 측정하였다 (Chen et al., 2011). 이러한 시스템에서 반응 혼합물 (400 μM)은 0.1 M 트리스-HCl, pH 7.5, 2 mM DTT, 5 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 0.5 mM CoA, 0.1% 트리톤 및 200 μM 카르복실산을 함유하였다. 반응을 20 μM의 정제된 효소를 첨가함으로써 개시하고 30분 후에 20 마이크로몰 아세트산의 첨가에 의해 정지시켰다. HPLC를 아클라임(Acclaim)® 120 CI 8 역상 칼럼 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific); 3 μ, 120 A, 150 X 3 mm)을 사용하여 디오넥스(Dionex) - 울티메이트(UltiMate)ⓒ 3000 LC 시스템 (써모 사이언티픽)으로 수행하였다. 이동상은 용매 A (0.1% 트리플루오로아세트산) 및 용매 B (아세토니트릴)로 이루어졌다. 구배 용리 절차는 하기와 같았다: 0 내지 5분, 5%의 B; 5 내지 9분, 5 내지 80%의 선형 구배의 B; 9 내지 11분, 80%의 B; 11 내지 12분, 5%의 B. 유량은 0.6 ml/분이었다. 다이오드 어레이 검출기로 200- 내지 400-nm 범위에서 데이터를 수집하였다. 기질 및 산물의 검출 및 정량을 위해, 피크 면적을 257 nm에서 측정하였다.

단수 단어의 사용은 본원에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.

상기 기재된 바와 같이, 캡시노이드, 예컨대 CH-19 스위트 페퍼 추출물에 존재하는 캡시에이트 및 캡시노이드는 많은 목적에 대해 널리 사용되지만, 현재 생산하기가 믿을 수 없을 정도로 비싸다. 캡시에이트는 캡시에이트 신타제 (CS, 또한 캡사이신 신타제로도 지칭됨), 8-메틸-6-노네노일 모이어티를 8-메틸-6-노네노일-CoA로부터 바닐릴 알콜로 전달하여 에스테르 접합체 (도 2)를 형성하는 아실트랜스퍼라제에 의해 페퍼에서 천연적으로 합성되는 것으로 여겨지고, 유전적으로, 그의 생합성은 페퍼에서 Pun1 로커스에 의해 제어된다 (Han et al., 2013).

본원에 기재된 바와 같이, 아실-CoA 신테타제 (ACS), 예컨대 고스트 페퍼 ACS1, 및 캡시에이트/캡사이신 신타제 (CS), 예컨대 고스트 페퍼 AT3/PUN1을 활용하는 발현 시스템을 사용하여 적절한 출발 물질, 예컨대 바닐릴 알콜 (VA) 및 6E-8-메틸노넨산 (6E) 또는 8-메틸노난산 (8M)의 공급 시 캡시노이드를 생산할 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다.

세포 시스템

일부 측면에서, 본 개시내용은 세포 시스템, 예컨대 박테리아 또는 진균 세포에서의 캡시노이드의 생산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포 시스템은 고스트 페퍼 ACS1 및 AT3/PUN1 유전자를 과다발현하는 이. 콜라이 배양물이다. 고스트 페퍼 ACS1 및 AT3/PUN1의 사용은 캡사이시노이드의 생산을 위해 이전에 기재된 바 있다 (예를 들어, 전문이 참조로서 본원에 포함된, PCT 출원 공개 번호 WO2015109168로서 공개된 PCT/US2015/011729 참조). 캡사이시노이드는, 상기 기재된 바와 같이, 구조적으로 및 기능적으로 캡시노이드와 구별가능하다. 도 3에 제시된 바와 같이, 상이한 캡시노이드 산물은 6E-8-메틸노넨산 (6E)과 바닐릴 알콜 (VA)과의 도입 또는 8M과 VA과의 도입으로부터 형성되었다. 보다 정량적인 데이터는 이러한 ACS1-PUN1 시스템이 기질로서 8M을 선호한다는 것을 제시하였다 (도 3).

일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS)를 세포 시스템에서 발현하고; 8-메틸-6-노네노일-CoA 및 바닐릴 알콜을 (함께 또는 별개로) 세포 시스템에 첨가하고; 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고; 8-메틸노난산 및 바닐릴 알콜을 (함께 또는 별개로) 세포 시스템에 첨가하고; 디히드로캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 디히드로캡시에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고; 6E-8-메틸노넨산 및 바닐릴 알콜을 (함께 또는 별개로) 세포 시스템에 첨가하고; 캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고; 중쇄 지방산 및 바닐릴 알콜을 (함께 또는 별개로) 세포 시스템에 첨가하고; 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법이 제공된다.

예시적인 세포 시스템은 효모 세포 (피키아 파스토리스(Pichia Pastoris) 또는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)), 식물 또는 식물 세포 (예를 들어, 비-캡시노이드 생산 식물 또는 식물 세포 예컨대 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 오리자 사티바(Oryza Sativa) 또는 제아 메이스(Zea mays)), 해조류 세포, 및 박테리아 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))를 포함한다.

관심 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간의 양은 생산되는 캡시노이드, 사용된 세포 시스템의 유형, 및 세포 시스템이 유지되는 조건에 따라 달라질 것이다. 박테리아에서 캡시노이드를 생산하기 위한 예시적인 조건은 실시예에 제공된다. 유사한 조건은 생합성적으로 많은 분자를 생산할 수 있는 것으로 제시된 바 있는 사카로미세스 세레비지아에와 같은 효모에 적합화될 수 있다 (예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO2014086842 참조). 본원에 기재된 조건은 또한 생합성적으로 많은 분자를 생산할 수 있는 것으로 또한 제시된 바 있는 식물 세포와의 사용에 적합화될 수 있다 (예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO2010124324 참조).

본 개시내용의 또 다른 실시양태는 CS 유전자를 세포 시스템에서 발현하고, ACS1 유전자를 세포 시스템에서 발현하고, 중쇄 지방산을 세포 시스템에 공급하고, 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 공급하고, 캡시노이드를 수집하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 제조하는 생물전환 방법이다.

본원에 제공된 세포 시스템 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS)가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CS 핵산 및/또는 아미노산 서열은 캅시쿰 속의 식물 (예를 들어, 고스트 칠리 식물 또는 CH19 스위트 식물)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호: 3에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.

고스트 칠리 Pun1/AT3의 예시적인 아미노산 서열

본원에 제공된 세포 시스템 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 아실트랜스퍼라제 (ACS)가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, ACS 핵산 및/또는 아미노산 서열은 캅시쿰 속의 식물 (예를 들어, 고스트 칠리 식물 또는 CH19 스위트 식물)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, ACS는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACS는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ACS는 서열식별번호: 4에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다.

고스트 칠리 ACS의 예시적인 아미노산 서열

반응 혼합물

본 개시내용은 또한, 부분적으로, 적절한 출발 물질 (예를 들어, VA 및 6E 또는 VA 및 8M)이 첨가된, ACS, 예컨대 고스트 페퍼 ACS1, 및/또는 CS, 예컨대 고스트 페퍼 AT3/PUN1을 포함하는 반응 혼합물 (예를 들어, 시험관내 반응 혼합물)을 사용하는 캡시노이드의 생산에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 반응 혼합물에서 캡시에이트 신타제 (CS)를 반응 혼합물에 제공하고; 8-메틸-6-노네노일-CoA 및 바닐릴 알콜을 (함께 또는 별개로)을 반응 혼합물에 첨가하고; 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고; 8-메틸노난산 및 바닐릴 알콜을 (함께 또는 별개로) 반응 혼합물에 첨가하고; 디히드로캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 디히드로캡시에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고; 6E-8-메틸노넨산 및 바닐릴 알콜을 (함께 또는 별개로) 반응 혼합물에 첨가하고; 캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고; 중쇄 지방산 및 바닐릴 알콜을 (함께 또는 별개로) 반응 혼합물에 첨가하고; 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법이 제공된다. 반응 혼합물의 구성성분은, 생성된 반응 혼합물이 일단 인큐베이션 시 목적한 캡시노이드를 생산할 수 있는 한, 함께 또는 별개로, 임의의 순서로 첨가될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

반응 혼합물에 사용하기 위한 효소는 임의의 공급원, 바람직하게는 재조합적으로, 예를 들어 이. 콜라이, 또는 효소를 생산할 수 있는 또 다른 적합한 숙주 세포에서, 또는 합성적으로 생산될 수 있다. 반응 혼합물은 효소, 및 목적한 캡시노이드를 생산하는데 적절할 수 있는 다른 구성성분, 예컨대 출발 물질 (예를 들어, VA 및 6E 또는 VA 및 8M) 및 염을 함유하는 완충 용액일 수 있다. 반응 혼합물은 또한 추가의 구성성분 예컨대 출발 물질 (예를 들어, VA 및 6E 또는 VA 및 8M)이 첨가될 수 있는 세포 용해물 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 효모 세포 용해물)을 함유하거나 또는 그로 구성될 수 있다.

본원에 제공된 반응 혼합물 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 캡시에이트 신타제 (CS)가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CS 핵산 및/또는 아미노산 서열은 캅시쿰 속의 식물 (예를 들어, 고스트 칠리 식물 또는 CH19 스위트 식물)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CS는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

본원에 제공된 반응 혼합물 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 아실트랜스퍼라제 (ACS)가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, ACS 핵산 및/또는 아미노산 서열은 캅시쿰 속의 식물 (예를 들어, 고스트 칠리 식물 또는 CH19 스위트 식물)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, ACS는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACS는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진다.

관심 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간의 양은 생산되는 캡시노이드, 사용된 반응 혼합물의 유형, 및 반응 혼합물이 인큐베이션되는 조건에 따라 달라질 것이다. 반응 혼합물을 사용하는 생합성 생산 분자에 대한 예시적인 조건은 관련 기술분야에 알려져 있다 (예를 들어, 전문이 참조로 포함된, PCT 출원 공개 번호 WO2016/054534 참조).

본 개시내용의 한 실시양태는 캡시에이트 신타제 (CS)를 혼합물에 제공하고, 8-메틸-6-노네노일-CoA를 혼합물에 공급하고, 바닐릴 알콜을 혼합물에 공급하고, 캡시노이드를 수집하는 것을 포함하는, 캡시노이드를 제조하는 생물전환 방법이다.

본 개시내용의 또 다른 실시양태는 캡시에이트 신타제 (CS)를 혼합물에 제공하고, 아실트랜스퍼라제를 혼합물에 제공하고, 6E-8-메틸노넨산을 공급하고; 바닐릴 알콜을 혼합물에 공급하고, 캡시에이트를 수집하는 것을 포함하는, 캡시에이트를 제조하는 생물전환 방법이다.

본 개시내용의 또 다른 실시양태는 캡시에이트 신타제 (CS)를 혼합물에 제공하고, 아실트랜스퍼라제를 혼합물에 제공하고, 8-메틸노난산을 공급하고, 바닐릴 알콜을 혼합물에 공급하고, 캡시에이트를 수집하는 것을 포함하는, 디히드로캡시에이트를 제조하는 생물전환 방법이다.

정제

본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 방법은 캡시노이드 (예를 들어, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트)를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡시노이드는 중량 기준으로 50% 내지 100%의 순도로 정제된다. 일부 실시양태에서, 캡시노이드는 중량 기준으로 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 관심 캡시노이드는 관련 기술분야에 알려지거나 또는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 예시적인 방법은 산-염기 추출, 진공 증류 및 반정제용 HPLC를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Li H.X. et al., Food Science Technology, 57: 446 (2014); 및 Andrade-Eiroa A., et al., An alternative to trial and error methodology in solid phase extraction: an original automated solid phase extraction procedure for analysing PAHs and PAH-derivatives in soot, RSC Advances 4: pp. 33636-44 (2014)] 참조).

조성물

본원에 기재된 방법에 의해 생산된 임의의 캡시노이드는 조성물에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 입에 넣고 이후에 입으로부터 배출되는 물질 및 마시거나, 먹거나, 삼키거나 또는 달리 섭취되는 물질을 포함한, 사람 또는 동물의 입과 접촉되고; 일반적으로 허용가능한 범위의 농도로 사용될 때 인간 또는 동물 소비에 안전한 경구 소비재 제품 (예컨대 음료, 식품 제품, 식이 보충물, 기능식품, 제약 조성물, 치과 위생 조성물 또는 화장품 제품)이다.

본원에 사용된 바와 같이, "식이 보충물(들)"은 식이를 보충하고 식이에서 결손될 수 있거나 또는 충분한 양으로 소비되지 않을 수 있는 영양소, 예컨대 비타민, 무기질, 섬유, 지방산, 아미노산 등을 제공하도록 의도된 화합물을 지칭한다. 관련 기술분야에 알려진 임의의 적합한 식이 보충물이 사용될 수 있다. 적합한 식이 보충물의 예는, 예를 들어, 영양소, 비타민, 무기질, 섬유, 지방산, 허브, 식물성 약품, 아미노산, 및 대사물일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "기능식품(들)"은 질환 또는 장애 (예컨대 피로, 불면증, 노화 영향, 기억 상실, 기분 장애, 심혈관 질환 및 높은 수준의 혈중 콜레스테롤, 당뇨병, 골다공증, 염증, 자가면역 장애 등)의 예방 및/또는 치료를 포함한 의약적 또는 건강상 이익을 제공할 수 있는 임의의 식품 또는 식품의 일부를 포함하는 화합물을 지칭한다. 관련 기술분야에 알려진 임의의 적합한 기능식품이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능식품은 식품 및 음료에 대한 보충물로서, 및 고체 제형, 예컨대 캡슐 또는 정제, 또는 액체 제형, 예컨대 용액 또는 현탁액일 수 있는 장내 또는 비경구 적용을 위한 제약 제제로서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 식이 보충물 및 기능식품은 보호 히드로콜로이드 (예컨대 검, 단백질, 변형된 전분), 결합제, 필름-형성제, 캡슐화 작용제/물질, 벽/쉘 물질, 매트릭스 화합물, 코팅제, 유화제, 표면 활성 작용제, 가용화제 (오일, 지방, 왁스, 레시틴 등), 흡착제, 담체, 충전제, 보조-화합물, 분산제, 습윤제, 가공 보조제 (용매), 유동제, 맛-차단제, 증량제, 젤리화제, 겔-형성제, 항산화제 및 항미생물제를 추가로 함유할 수 있다.

관련 기술분야에 알려진 임의의 적합한 제약 조성물이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 캡시노이드 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 관련 기술분야에 널리 알려진 절차에 따라, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

실시예

이. 콜라이에서의 캡시노이드의 생산

고스트 칠리 페퍼로부터의 ACS1 및 AT3/Pun1 유전자를 이전에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포에서 과다-발현하였다 (예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO2015/066615 참조, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 플라스미드 pCDFDuet-ACS1을 사용하여 적격 이. 콜라이 BL21 (DE3)세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 100 mg/L의 스펙티노마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에서 선택하였다. pCDFDuet-ACSl를 보유하는 생성된 BL21(DE3) 세포를 pETite N-His SUMO-고스트 Pun1 벡터로 제2 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환체를 50 mg/L의 카나마이신 및 100 mg/L의 스펙티노마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에서 선택하였다. 형질전환체에서 ACS1 및 Pun1을 공동-과다발현하는데 사용된 ACS1 및 AT3/Pun1 코딩 서열은 하기 제시된다:

(고스트 칠리 페퍼로부터의) Pun1/AT3 코딩 서열의 서열

(고스트 칠리 페퍼로부터의) ACS1 코딩 서열의 서열

다음에, ACS1 및 PUN1의 생산을 형질전환체에서 유도하였다. 간단하게 말하면, 형질전환체의 밤샘 배양물을 50 mg/L의 카나마이신 및 100 mg/L의 스펙티노마이신을 함유하는 TB 배지 (2%)에서 성장시켰다. 이어서 밤샘 배양물을 희석하고, 37℃에서 0.6의 OD600으로 성장시키고, 16℃로 냉각시켰다. 이어서 1 mM IPTG를 첨가하여 ACS1 및 Pun1의 발현을 유도하였다. 16℃에서 1시간의 인큐베이션 후에, 하기 기질을 배양물에 첨가하였다: (a) 500 mg/L의 바닐릴 알콜 (VA) 및 500 mg/L의 6E-8-메틸노넨산 (6E) 또는 (b) 500 mg/L의 VA 및 500 mg/L의 8-메틸 노난산 (8M). 바닐릴 알콜의 화학 구조는 도 2에 제공된다. 6E 및 8M의 화학 구조는 하기 제공된다.

8-메틸노난산

(6E)-8-메틸-6-노네노에이트

기질의 공급 16시간 후에 샘플을 취하고, 추정 캡시에이트 (CQ) 및 디히드로캡시에이트 (DHCQ)를 에틸 아세테이트로부터 추출하고, 추정 CQ 및 DHCQ 산물을 6E 또는 8M 배양물 각각으로부터 측정하였다 (도 3). 보다 정량적인 데이터는 이러한 ACS1-Pun1 시스템이 기질로서 8M을 선호한다는 것을 제시하였다. 6E+VA 또는 8M+VA 각각으로의 유도 16시간 후에 CQ 및 DHCQ의 생산은 삼중 실험으로 확증하였다 (도 4).

다음에, GC/MS 분석을 수행하여 유도된 배양물에서 CQ 및 DHCQ의 아이덴티티를 확증하였다. GC/MS 분석을 GC/MS-QP2010S 검출기와 커플링된 시마즈(Shimadzu) GC-2010 시스템으로 수행하였다. 칼럼 Rtx-5MS (두께 0.25u; 길이 30m; 지름 0.25 mm)를 분리를 위해 사용하였다. 주입 온도는 265℃였고, 주입 모드는 스플릿이었고, 오븐 온도는 140℃였다. 온도 구배는 하기와 같았다: 0-1분, 140℃; 1-11.25분, 140℃ 내지 263℃, 속도 12; 11.25-21.25분, 263℃. 유도된 배양물로부터의 CQ 및 DHCQ에 대해 수득된 GC/MS 스펙트럼은 도 5에 제시된다. 이어서 이들 스펙트럼을 GC/MS 기계에서의 MS 라이브러리로부터 DHCP (디히드로캡사이신)에 대한 표준 스펙트럼과 비교하였다. DHCP가 CQ 및 DHCQ와 가장 가깝게 매칭되었으며, 이는 MS 라이브러리가 CQ 또는 DHCQ에 대한 표준을 함유하지 않았기 때문이다. DHCQ는 DHCP보다 1 달톤 더 무겁고 CQ는 DHCP보다 1 달톤 더 적으므로, 샘플에서 CQ 및 DHCQ의 아이덴티티는 GC/MS 프로파일에 의해 확고히 달성되었다 (도 6). 이들 결과는 ACS1 및 CS/AT3/Pun1 유전자를 사용하여 출발 물질로서 VA, 및 6E 또는 8M을 사용하는 생합성에 의해 캡시노이드를 생산할 수 있다는 것을 제시한다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Conagen Inc. <120> METHODS OF MAKING CAPSINOIDS BY BIOSYNTHETIC PROCESSES <130> C1497.70003WO00 <150> US 62/276059 <151> 2016-01-07 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <213> Capsicum annuum L <400> 1 Met Ala Phe Ala Leu Pro Ser Ser Leu Val Ser Val Cys Asp Lys Ser 1 5 10 15 Phe Ile Lys Pro Ser Ser Leu Thr Pro Ser Lys Leu Arg Phe His Lys 20 25 30 Leu Ser Phe Ile Asp Gln Ser Leu Ser Asn Met Tyr Ile Pro Cys Ala 35 40 45 Phe Phe Tyr Pro Lys Val Gln Gln Arg Leu Glu Asp Ser Lys Asn Ser 50 55 60 Asp Glu Leu Ser His Ile Ala His Leu Leu Gln Thr Ser Leu Ser Gln 65 70 75 80 Thr Leu Val Ser Tyr Tyr Pro Tyr Ala Gly Lys Leu Lys Asp Asn Ala 85 90 95 Thr Val Asp Cys Asn Asp Met Gly Ala Glu Phe Leu Ser Val Arg Ile 100 105 110 Lys Cys Ser Met Ser Glu Ile Leu Asp His Pro His Ala Ser Leu Ala 115 120 125 Glu Ser Ile Val Leu Pro Lys Asp Leu Pro Trp Ala Asn Asn Cys Glu 130 135 140 Gly Gly Asn Leu Leu Val Val Gln Val Ser Lys Phe Asp Cys Gly Gly 145 150 155 160 Ile Ala Ile Ser Val Cys Phe Ser His Lys Ile Gly Asp Gly Cys Ser 165 170 175 Leu Leu Asn Phe Leu Asn Asp Trp Ser Ser Val Thr Arg Asp His Thr 180 185 190 Thr Thr Ala Leu Val Pro Ser Pro Arg Phe Val Gly Asp Ser Val Phe 195 200 205 Ser Thr Lys Lys Tyr Gly Ser Leu Ile Thr Pro Gln Ile Leu Ser Asp 210 215 220 Leu Asn Glu Cys Val Gln Lys Arg Leu Ile Phe Pro Thr Asp Lys Leu 225 230 235 240 Asp Ala Leu Arg Ala Lys Val Ala Glu Glu Ser Gly Val Lys Asn Pro 245 250 255 Thr Arg Ala Glu Val Val Ser Ala Leu Leu Phe Lys Cys Ala Thr Lys 260 265 270 Ala Ser Ser Ser Met Leu Pro Ser Lys Leu Val His Phe Leu Asn Ile 275 280 285 Arg Thr Met Ile Lys Pro Arg Leu Pro Arg Asn Ala Ile Gly Asn Leu 290 295 300 Ser Ser Ile Phe Ser Ile Glu Ala Thr Asn Met Gln Asp Met Glu Leu 305 310 315 320 Pro Thr Leu Val Arg Asn Leu Arg Lys Glu Val Glu Val Ala Tyr Lys 325 330 335 Lys Asp Gln Val Glu Gln Asn Glu Leu Ile Leu Glu Val Val Glu Ser 340 345 350 Met Arg Glu Gly Lys Leu Pro Phe Glu Asn Met Asp Gly Tyr Glu Asn 355 360 365 Val Tyr Thr Cys Ser Asn Leu Cys Lys Tyr Pro Tyr Tyr Thr Val Asp 370 375 380 Phe Gly Trp Gly Arg Pro Glu Arg Val Cys Leu Gly Asn Gly Pro Ser 385 390 395 400 Lys Asn Ala Phe Phe Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Gly Gln Gly Val Glu 405 410 415 Ala Arg Val Met Leu His Lys Gln Gln Met Ser Glu Phe Glu Arg Asn 420 425 430 Glu Glu Leu Leu Glu Phe Ile Ala 435 440 <210> 2 <211> 658 <212> PRT <213> Capsicum annuum L. <400> 2 Met Ala Thr Asp Lys Phe Ile Ile Glu Val Glu Ser Ala Lys Pro Ala 1 5 10 15 Lys Asp Gly Arg Pro Ser Met Gly Pro Val Tyr Arg Ser Ile Phe Ala 20 25 30 Lys His Gly Phe Pro Pro Pro Ile Pro Gly Leu Asp Ser Cys Trp Asp 35 40 45 Ile Phe Arg Met Ser Val Glu Lys Tyr Pro Asn Asn Arg Met Leu Gly 50 55 60 Arg Arg Glu Ile Val Asp Gly Lys Pro Gly Lys Tyr Val Trp Met Ser 65 70 75 80 Tyr Lys Glu Val Tyr Asp Ile Val Ile Lys Val Gly Asn Ser Ile Arg 85 90 95 Ser Ile Gly Val Asp Val Gly Asp Lys Cys Gly Ile Tyr Gly Ala Asn 100 105 110 Cys Pro Glu Trp Ile Ile Ser Met Glu Ala Cys Asn Ala His Gly Leu 115 120 125 Tyr Cys Val Pro Leu Tyr Asp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Val Glu Phe 130 135 140 Ile Ile Ser His Ala Glu Val Thr Ile Ala Phe Val Glu Glu Lys Lys 145 150 155 160 Leu Pro Glu Leu Leu Lys Thr Phe Pro Asn Ala Ser Lys Tyr Leu Lys 165 170 175 Thr Ile Val Ser Phe Gly Lys Val Thr Pro Glu Gln Lys Lys Glu Leu 180 185 190 Glu Glu Phe Gly Val Val Leu Tyr Ser Trp Asp Glu Phe Leu Gln Leu 195 200 205 Gly Ser Gly Lys Gln Phe Asp Leu Pro Val Lys Lys Lys Glu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ile Met Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Asp Pro Lys Gly Val 225 230 235 240 Leu Ile Ser Asn Thr Ser Ile Val Thr Leu Ile Ala Gly Val Arg Arg 245 250 255 Phe Leu Gly Ser Val Asp Glu Ser Leu Asn Val Asp Asp Val Tyr Leu 260 265 270 Ser Tyr Leu Pro Leu Ala His Ile Phe Asp Arg Val Ile Glu Glu Cys 275 280 285 Phe Ile His His Gly Ala Ser Ile Gly Phe Trp Arg Gly Asp Val Lys 290 295 300 Leu Leu Thr Glu Asp Ile Gly Glu Leu Lys Pro Thr Val Phe Cys Ala 305 310 315 320 Val Pro Arg Val Leu Asp Arg Ile Tyr Ser Gly Leu Gln Gln Lys Ile 325 330 335 Ala Ala Gly Gly Phe Leu Lys Ser Thr Leu Phe Asn Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Tyr Lys His His Asn Leu Lys Lys Gly Arg Lys His Phe Glu Ala Ser 355 360 365 Pro Leu Ser Asp Lys Val Val Phe Ser Lys Val Lys Glu Gly Leu Gly 370 375 380 Gly Arg Val Arg Leu Ile Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Ala Ala His 385 390 395 400 Val Glu Ala Phe Leu Arg Val Val Ala Cys Cys His Val Leu Gln Gly 405 410 415 Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Ala Gly Thr Phe Val Ser Leu Pro Asn 420 425 430 Arg Tyr Asp Met Leu Gly Thr Val Gly Pro Pro Val Pro Asn Val Asp 435 440 445 Val Cys Leu Glu Ser Val Pro Glu Met Ser Tyr Asp Ala Leu Ser Ser 450 455 460 Thr Pro Arg Gly Glu Val Cys Val Arg Gly Asp Val Leu Phe Ser Gly 465 470 475 480 Tyr Tyr Lys Arg Glu Asp Leu Thr Lys Glu Val Met Ile Asp Gly Trp 485 490 495 Phe His Thr Gly Asp Val Gly Glu Trp Gln Pro Asn Gly Ser Leu Lys 500 505 510 Ile Ile Asp Arg Lys Lys Asn Ile Phe Lys Leu Ser Gln Gly Glu Tyr 515 520 525 Val Ala Val Glu Asn Leu Glu Asn Ile Tyr Gly Asn Asn Pro Ile Ile 530 535 540 Asp Ser Ile Trp Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Glu Ser Phe Leu Val Ala 545 550 555 560 Val Ile Asn Pro Asn Gln Arg Ala Val Glu Gln Trp Ala Glu Val Asn 565 570 575 Gly Leu Ser Gly Asp Phe Ala Ser Leu Cys Glu Lys Pro Glu Val Lys 580 585 590 Glu Tyr Ile Leu Arg Glu Leu Thr Lys Thr Gly Lys Glu Lys Lys Leu 595 600 605 Lys Gly Phe Glu Phe Leu Lys Ala Val His Leu Asp Pro Val Pro Phe 610 615 620 Asp Met Glu Arg Asp Leu Leu Thr Pro Thr Phe Lys Lys Lys Arg Pro 625 630 635 640 Gln Leu Leu Lys Tyr Tyr Lys Asp Val Ile Asp Ser Met Tyr Lys Gly 645 650 655 Thr Lys <210> 3 <211> 1323 <212> DNA <213> Capsicum annuum L. <400> 3 atggcttttg cattaccatc atcacttgtt tcagtttgtg acaaatcttt tatcaaacct 60 tcctctctca ccccctctaa acttagattt cacaagctat ctttcatcga tcaatcttta 120 agtaatatgt atatcccttg tgcatttttt taccctaaag tacaacaaag actagaagac 180 tccaaaaatt ctgatgagct ttcccatata gcccacttgc tacaaacatc tctatcacaa 240 actctagtct cttactatcc ttatgcagga aagttgaagg acaatgctac tgttgactgt 300 aacgatatgg gagctgagtt cttgagtgtt cgaataaaat gttccatgtc tgaaattctt 360 gatcatcctc atgcatctct tgcagagagc atagttttgc ccaaggattt gccttgggcg 420 aataattgtg aaggtggtaa tttgcttgta gttcaagtaa gtaagtttga ttgtggggga 480 atagccatca gtgtatgctt ttcgcacaag attggtgatg gttgctctct gcttaatttc 540 cttaatgatt ggtctagcgt tactcgtgat catacgacaa cagctttagt tccatctcct 600 agatttgtag gagattctgt cttctctaca aaaaaatatg gttctcttat tacgccacaa 660 attttgtccg atctcaacga gtgcgtacag aaaagactca tttttcctac agataagtta 720 gatgcacttc gagctaaggt ggcagaagaa tcaggagtaa aaaatccaac aagggcagaa 780 gttgttagcg ctcttctttt caaatgtgca acaaaggcat catcatcaat gctaccatca 840 aagttggttc acttcttaaa catacgtact atgatcaaac ctcgtctacc acgaaatgcc 900 attggaaatc tctcgtctat tttctccata gaagcaacta acatgcagga catggagttg 960 ccaacgttgg ttcgtaattt aaggaaggaa gttgaggtgg catacaagaa agaccaagtc 1020 gaacaaaatg aactgatcct agaagtagta gaatcaatga gagaagggaa actgccattt 1080 gaaaatatgg atggctatga gaatgtgtat acttgcagca atctttgcaa atatccgtac 1140 tacactgtag attttggatg gggaagacct gaaagagtgt gtctaggaaa tggtccctcc 1200 aagaatgcct tcttcttgaa agattacaaa gctgggcaag gcgtggaggc gcgggtgatg 1260 ttgcacaagc aacaaatgtc tgaatttgaa cgcaatgagg aactccttga gttcattgcc 1320 taa 1323 <210> 4 <211> 1977 <212> DNA <213> Capsicum annuum L. <400> 4 atggctacgg acaaatttat tattgaagtt gaatcagcaa aaccggcaaa agatggtcgc 60 ccgagcatgg gcccggtcta tcgttcgatc tttgcgaaac atggctttcc gccgccgatc 120 ccgggtctgg attcatgctg ggacattttt cgtatgtcgg tggaaaaata tccgaacaat 180 cgcatgctgg gccgtcgcga aattgttgat ggcaaaccgg gtaaatacgt ttggatgagc 240 tacaaagaag tctacgacat cgttatcaaa gtcggtaaca gtattcgttc catcggcgtg 300 gatgttggtg acaaatgcgg catttatggt gcaaactgtc cggaatggat tatcagcatg 360 gaagcatgca atgctcatgg cctgtattgt gtcccgctgt acgataccct gggcgcaggt 420 gctgtggaat ttattatctc tcacgcggaa gtgaccatcg ccttcgttga agagaaaaaa 480 ctgccggaac tgctgaaaac ctttccgaat gcgagcaaat atctgaaaac cattgtctct 540 ttcggcaaag tgacgccgga acagaagaaa gaactggaag aatttggtgt ggttctgtac 600 agttgggatg aatttctgca gctgggctcc ggtaaacaat tcgatctgcc ggtgaaaaag 660 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aatggcagcc gaacggtagc ctgaaaatca tcgatcgtaa gaaaaacatc 1560 ttcaaactgt ctcaaggcga atatgtggcc gttgaaaacc tggaaaatat ttacggcaac 1620 aatccgatta tcgacagcat ttggatctat ggtaacagtt ttgaatcctt cctggtcgcg 1680 gtgatcaacc cgaatcagcg tgcagtcgaa caatgggctg aagtgaatgg cctgagtggt 1740 gatttcgcct ccctgtgtga aaaaccggaa gtgaaagaat acattctgcg cgaactgacc 1800 aaaacgggca aagagaaaaa actgaaaggt ttcgaatttc tgaaagcagt tcatctggac 1860 ccggtgccgt ttgatatgga acgtgacctg ctgaccccga cgttcaagaa aaaacgtccg 1920 caactgctga aatactataa agatgtgatc gactcaatgt ataaaggcac gaaataa 1977

Claims

(a) 캡시에이트 신타제 (CS)를 세포 시스템에서 발현하고;
(b) 8-메틸-6-노네노일-CoA 및 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 첨가하고;
(c) 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법.
(a) 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고;
(b) 8-메틸노난산 및 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 첨가하고;
(c) 디히드로캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 디히드로캡시에이트를 생산하는 방법.
(a) 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고;
(b) 6E-8-메틸노넨산 및 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 첨가하고;
(c) 캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 캡시에이트를 생산하는 방법.
(a) 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 세포 시스템에서 발현하고;
(b) 중쇄 지방산 및 바닐릴 알콜을 세포 시스템에 첨가하고;
(c) 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 세포 시스템을 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CS 아미노산 서열이 캅시쿰(Capsicum) 속의 식물로부터 유래되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 캅시쿰 속 식물이 고스트 칠리 식물인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CS가 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, CS가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ACS 아미노산 서열이 캅시쿰 속의 식물로부터 유래되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 캅시쿰 속 식물이 고스트 칠리 식물인 방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ACS가 서열식별번호: 2에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, ACS가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 시스템이 효모, 비-캡시노이드 생산 식물, 해조류 및 박테리아를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 세포 시스템이 박테리아인 방법.
제14항에 있어서, 세포 시스템이 이. 콜라이(E. Coli)인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 생산된 캡시노이드, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트를 수집하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 생산된 캡시노이드, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트를 70% 초과의 순도로 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 정제 단계가 산-염기 추출을 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 정제 단계가 진공 증류를 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 정제 단계가 반정제용 HPLC를 포함하는 것인 방법.
(a) 캡시에이트 신타제 (CS)를 반응 혼합물에 제공하고;
(b) 8-메틸-6-노네노일-CoA 및 바닐릴 알콜을 반응 혼합물에 첨가하고;
(c) 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법.
(a) 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고;
(b) 8-메틸노난산 및 바닐릴 알콜을 반응 혼합물에 첨가하고;
(c) 디히드로캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 디히드로캡시에이트를 생산하는 방법.
(a) 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고;
(b) 6E-8-메틸노넨산 및 바닐릴 알콜을 반응 혼합물에 첨가하고;
(c) 캡시에이트를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 캡시에이트를 생산하는 방법.
(a) 캡시에이트 신타제 (CS) 및 아실트랜스퍼라제 (ACS)를 반응 혼합물에 제공하고;
(b) 중쇄 지방산 및 바닐릴 알콜을 반응 혼합물에 첨가하고;
(c) 캡시노이드를 생산하기에 충분한 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것
을 포함하는, 캡시노이드를 생산하는 방법.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, CS 아미노산 서열이 캅시쿰 속의 식물로부터 유래되는 것인 방법.
제25항에 있어서, 캅시쿰 속 식물이 고스트 칠리 식물인 방법.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, CS가 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, CS가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ACS 아미노산 서열이 캅시쿰 속의 식물로부터 유래되는 것인 방법.
제29항에 있어서, 캅시쿰 속 식물이 고스트 칠리 식물인 방법.
제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, ACS가 서열식별번호: 2에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제31항에 있어서, ACS가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, CS 및/또는 ACS가 효모, 비-캡시노이드 생산 식물, 해조류 및 박테리아를 포함하는 군으로부터 선택된 세포 시스템에서 생산되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 세포 시스템이 박테리아인 방법.
제34항에 있어서, 세포 시스템이 이. 콜라이인 방법.
제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 생산된 캡시노이드, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트를 반응 혼합물로부터 수집하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제36항에 있어서, 생산된 캡시노이드, 캡시에이트 또는 디히드로캡시에이트를 70% 초과의 순도로 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 정제 단계가 산-염기 추출을 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 정제 단계가 진공 증류를 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 정제 단계가 반정제용 HPLC를 포함하는 것인 방법.