WO2014035214A1

WO2014035214A1 - 족제비싸리 추출물을 포함하는 조성물

Info

Publication number: WO2014035214A1
Application number: PCT/KR2013/007890
Authority: WO
Inventors: 김수남; 이우정; 함정엽; 권학철; 정봉철
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-09-03
Filing date: 2013-09-02
Publication date: 2014-03-06
Also published as: KR20140030721A

Abstract

본 발명은 족제비싸리 (Amorpha fruticosa) 추출물을 포함하는 PTP 저해용 PPAR 활성화 조성물에 관한 것이다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

족제비싸리 추출물을 포함하는 조성물

[기술분야]

본 발명은 족제비싸리 (Amorpha fruticosa) 추출물을 포함하는 PTP 저해용 조성물 또는 PPAR 활성화용 조성물에 관한 것이다.

【배경기술]

PTPs (Protein tyrosine phosphatases) 는 정상적인 생리환경에서는 음성 조 절제로 작용하고， 인슐린 내성상태를 유도하는 어떤 역할을 한다고 알려져 있다. (Koren and Fantus, 2007) .

이 중 PTP1B는 당뇨와 비만의 주요 타겟으로 확인되었으며， 이후 PTPs는 새 롭게 기대되는 신호전달 타겟으로 대두되고 있다. (Hooft etal. ,2002).

구체적으로， PTP1B 녹아웃 마우스는 내당능시험 (glucose tolerance test)에 서 인슐린 감수성을 증가시켰고， 그 결과 IRS-1 인산화를 오랫동안 지속시켜서 조 직이 인슐린에 대해서 잘 반웅하여 당내성을 나타내지 않게 하는 좋은 효능을 보여 주었다. (Elcheblyefa/.,1999).

아을러， 마우스모델에서 PTP1B 의 발현 (Expression)을 감소시켰을 때도 인 슐린 감수성이 증가한다는 내용이 보고된 바 있어서 이는 PTP1B의 발현 조절이 인 슐린 감수성 조절에 매우 중요한 요소이며， 비만 및 당뇨의 개선의 주요 타겟이 될 수 있다. (Zinkere a/. ,2002;Gume a/. ,2003).

한편, 퍼옥시좀 (Peroxisome)은 이러한 대사기능 이상의 원인이 되는 세포 내 소기관 중 하나로 오랫동안 세포 기능상에 있어 마이너 (minor)한 역할을 하는 것으 로 여겨져 왔으나 최근의 많은 연구를 통해 산소， 포도당， 지질， 호르몬의 대사 등 에 있어 중요한 역할을 담당하며， 또한， 세포증식 /분화의 조절， 염증 매개체들의 조절에도 폭 넓은 영향을 가지는 것으로 보고 되어지고 있다. 지질대사와 포도당대 사를 통하여 퍼옥시좀은 인슐린 감수성뿐만 아니라 세포막과 비만세포 (adipocyte) 형성에 영향을 주고 산화적 스트레스에 대한 영향을 통해서 노화 및 종양 발생 (tumor igenesis)에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다 (smith. KJ et.al., J Cut an Med Surg 5(3) :231-43， 2001； smith. KJ et.al . , J Cut an Med Surg 5(4) :315-22， 2001) . 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 (peroxisome prol i f erator-act ivated receptors, PPARs)는 48가지의 핵수용체 (nuclear receptors)중 하나이며 리간드 (Hgand) 결합에 의해 유전자 발현을 조절한다.

본 발명자들은 족제비싸리 추출물이 PTP1B 저해시키거나 또는 PPAR 활성화시 켜서， 이에 따라 인슐린 감수성을 증가시켜 비만 /당뇨를 조절할 수 있음을 확인하 고 본 발명을 완성하게 되었다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 천연물을 함유하는 PTP 저해용 또는 PPAR 활성화용 조성물 을 제공하는 것이다.

[기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 족제비싸리 Ai rpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 PTP1B 저해용 조성물을 제공한 다.

본 발명은 또한 족제비싸리 (Aiwrpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 PPARa 활성화용 조성물을 제공한다.

【유리한 효과】

본 발명의 조성물은 족제비싸리 추출물을 포함하여， PTP1B을 저해시킨다. 뿐 만 아니라, 족제비싸리 추출물에서 분리한 아몰파스틸볼 및 5, 7-디하이드록시게라 닐플라바논 화합물 역시 우수한 PTP1B 저해 효능을 가진다. 구체적으로， 본 발명의 조성물은 PTP1B의 활성과 발현 모두를 저해시킴에 따라 인슐린에 대한 감수성을 증 가시켜 혈당을 감소시킬 수 있고， 근육세포내 포도당 uptake에 대해 매우 우수한 활성을 보인다. 더불어， 본 발명의 조성물은 몸무게 증가를 저해시키고， 공복혈당 및 총콜레스테롤， LDL-콜레스테를의 증가를 저하시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 족제비싸리 추출물을 포함하여， PPARa를 활성화시 킨다. 뿐만 아니라， 족제비싸리 추출물에서 분리한 아몰파스틸볼 및 5，7—디하이드 록시게라닐플라바논 화합물 역시 우수한 PPARa 활성화 효능을 가진다。

본 발명의 조성물은 상기와 같은 효능을 가지면서도 천연물을 유효성분으로 함유하여 독성이 없어서， 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료에 유용하다ᅳ

【도면의 간단한 설명】 도 1은 족제비싸리 추출물 및 이로부터 분리된 화합물 각각의 인슐린신호전 달 및 PTP1B발현에 미치는 영향에 관한 것이다.

도 2는정상조건 및 인슐린 내성조건에서 족제비싸리 추출물 및 이로부터 분 리된 화합물 각각의 세포내 포도당 uptake에 대한 활성에 관한 것이다.

도 3은 족제비싸리 추출물 및 분획물 각각의 공복혈당, 총콜레스테를， LDL- 콜레스테를에 미치는 영향을 측정한 것이다.

도 4는 마우스의 간무게를 측정한 결과이다.

도 5는 PPAR α의 활성화 정도를 관찰한 것이다,

도 6은 PPARa 및 이와 관련된 유전자의 활성화에 관한 것이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

본 발명은 일 관점에서， 족제비싸리 Amorpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 PTP1B 저해용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 '족제비싸리 dor^a fruticosa)'는 쌍떡잎식물 장미목 콩과 의 낙엽관목으로, 쪽싸리 또는 왜싸리라고도 하며， 북아메리카가 원산지이다. 잎은 싸리나무와 같고 씨앗은 백태콩깍지와 비슷하다. 높이는 3m 내외이고, 나무가지에 털이 있으나 성장하면서 점점 없어진다. 잎은 어긋나고 1회 깃꼴겹잎이다. 작은 잎 은 11~25개씩이고 달걀 모양 또는 타원형이며 가장자리가 밋밋하다. 꽃은 5~6월에 피고 자줏빛이 도는 하늘색이며 향기가 강하다. 열매는 9월에 결실하며 협과이다. 열매에는 1개의 종자가 들어 있으며 신장 모양이다.

명세서에서 사용되는 족제비싸리는 그 입수 방법에 제한이 없으며, 재배하 여 사용하거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있다. 아울러 본 명세서에서 사용되는 족제비싸리는 족제비싸리 초본의 지상부 또는 지하부의 일부 또는 전부를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 족제비싸리의 지상부 (잎， 잔가지， 줄 기), 뿌리 및 종자를 이용하였으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 상기 'PTP1B'는 단백질 타이로신 탈인산화 효소 (Protein tyrosine phosphatases, FTP)의 일종으로， 상기 PTP는 정상적인 생리환경에서는 음 성 조절제로 작용하고， 인술린 내성상태를 유도할 수 있다.

본 명세서에서 상기 'PTP1B를 저해'한다는 것은 PTP1B 유전자의 활성을 저해 또는 억제하여 상기 유전자의 발현을 저해 또는 억제하거나 PTP1B 효소의 활성을 저해 또는 억제하는 모든 기작을 포함하는 것이나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 '유효성분'은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미하는 것이다. 본 발명의 일 관점인 PTP1B 저해용 조성물에 있어서， 상기 족제비싸리 추출 물은 족제비싸리 -d~C₆ 알코올 추출물을 포함할 수 있고， 구체적으로 족제비싸리-메 탄올 추출물 또는 족제비싸리-에탄올 추출물일 수 있다.

본 명세서에서 상기 '족제비싸리 추출물 '은 물， d-C₆ 알콜， 및 이들이 조합 으로 구성된 그룹에서 선택된 용매의 조추출물일 수 있다. 상기 d-C₆ 알콜은 구체 적으로 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 족제비싸리를 용매로 추출 시 , 족제비싸리 의 약 5 내지 15배 정도에 해당하는 용매를 가하여 추출하는 것이 바람직하며 , 구 체적으로 약 10 배의 용매를 가하여 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것 은 아니다. 상기 추출은 가열 추출, 넁침 추출， 환류넁각 추출， 또는 초음파 추출 등이 이용될 수 있으며 당업자에게 자명한 추출법이라면 제한이 없다. 상기 추출 은 실온에서 수행할 수도 있으나 보다 효율적인 추출을 위해서는 가온 조건 하에 서 수행할 수 있으며， 바람직하게는 약 40 내지 10⁽ C, 더욱 바람직하게는 약 80^°C 의 온도에서 추출할 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 추출시간은 바람직하 게는 약 2 내지 4시간， 더욱 바람직하게는 약 3 시간 동안 수행할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며， 추출 용매 및 추출 온도 등의 조건에 따라 달라질 수 있다. 상기 추출은 활성성분을 보다 다량 수득하기 위해 1 회 이상 여러 번 추출할 수 있 으며, 바람직하게는 1 내지 5회， 더욱 바람직하게는 3회 연속추출하여 합한 추출액 을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 족제비싸리 추출물은 상기와 같이 족제비싸리의 조추출물을 포함할 수 있고, 상기 조추출물을 극성이 낮은 유기 용매로 더욱 추출하여 얻어진 유기 용매의 가용성 분획물로서 포함할 수도 있다. 상기 유기 용매로는 핵산， 메틸 렌클로라이드， 에틸 아세테이트， n-부탄올 등이 이용될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 방법으로 추출한 추출물 또는 그 추출물의 가용성 분획물은 그대로 사용할 수도 있으나, 여과 후 농축하여 엑기스 형태로 사용할 수 있으며, 농축 후 동결 건조하여 동결건조물의 형태로서 사용할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 PTP1B 저해용 조성물에 있어서， 상기 족제비싸리 추출 물 또는 그의 분획물은 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 하나 이상의 화합 물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하며,

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식들에서，

Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, RIO, Rll, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31 또 는 R32은 독립적으로 수소， d 내지 C₁₈의 알킬기， 내지 C₁₈의 알콕시기， 내지

C₁₈의 알케닐기 또는 내지 C₁₈의 알키닐기일 수 있다. 본 명세서에서 '유도체'는 상기 화합물들의 치환 가능한 위치에서 다른 치환 기로 변경되는 모든 화합물을 의미한다. 이러한 치환기의 종류에는 제한이 없으며， 예컨대 각각 독립적으로 히드록실， 페녹시， 티에닐, 푸릴， 피리딜， 시클로핵실， 알 킬알콜， 알킬디알콜 또는 임의 치환된 페닐로 치환될 수 있는 ( ₁₀ 비사이클릭 탄화 수소기; 히드록실, 히드록시메틸， 메틸 또는 아미노로 치환될 수 있는 C₅-₆ 사이클 릭 탄화수소기; 또는 당 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 '당 잔기'라는 용어는 다당류 분자로부터 1개의 수소 원자의 제거시의 기를 의미하며, 따라서 예를 들어 단당류 또는 올리고당으로부터 유래된 잔기를 의 미할 수 있다.

본 명세서에서 '약학적으로 허용 가능'이란 통상의 의약적 복용량 (medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써， 동물 더 구체적으로는 인 간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거 나 승인 받거나， 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다 .

본 명세서에서 '약학적으로 허용 가능한 염'은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물 (parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산， 황산， 질산， 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산， 프로파이은산， 핵사노산， 시클로펜테인프 로피온산， 글라이콜산, 피루브산， 락트산， 말론산， 숙신산， 말산， 말레산 푸마르 산， 타르타르산, 시트르산， 벤조산， 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산， 신남산， 만델 산， 메테인설폰산， 에테인설폰산， 1，2-에테인—디설폰산， 2-히드록시에테인설폰산， 벤젠설폰산, 4—클로로벤젠설폰산， 2-나프탈렌설폰산， 4-를루엔설폰산， 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [₂,2,2]-oct-2-엔 -1-카르복실산， 글루코헵톤산， 3-페닐프로파이 온산， 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산， 글루콘산， 글루탐산， 히드록시나프토산， 살리실산， 스테아르산， 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염 (acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환 될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다. 아울러， 본 명세서에 따른 화합물은 약제학 적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라， 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염， 수화물， 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 PTP1B 저해용 조성물에 있어서, 상기 족제비싸리 추출 물 또는 그의 분획물은 아몰파스틸볼 (Amorphastilbol) 및 5， 7-디히드톡시 -6—게라 닐 플라바논 (5,7-dihydroxy-6-geranyl-flavanone)으로 구성된 군에서 하나 이상의 화합물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함할 수 있다.

[화학식 3] 아몰파스틸볼 (Amorphastilbol)

[화학식 4] 5/7-디히드록시 -6-게라닐 플라바논 (5ᅳ 7-dihydroxy-6-geranyl- f lavanone)

본 발명의 일 관점인 PTP1B 저해용 조성물에 있어서， 상기 조성물은 족제비 싸리 추출물 또는 그의 분획물을 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10중량 %로 함 유할 수 있다. 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물이 조성물 총중량에 대하여 0.001중량 ¾ 미만으로 함유되면， PTP1B의 활성 또는 발현을 저해시키는 효능이 미미 하며， 10중량 %를 초과하여 함유되면， 약제 상의 다론 구성 성분의 함량을 제한하게 된다. 상기와 같은 관점에 있어서, 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물은 조성물 총중량에 대하여， 0.0011 내지 9중량 0.0012 내지 8중량 ¾, 0.0013 내지 7중량 %， 0.0014 내지 6중량 %， 0.0015 내지 5중량 %， 0.0016 내지 4중량 ¾， 0.0017 내지 3중량 %, 0.0018 내지 2중량 % 또는 0.0019 내지 1중량 ¾으로 함유될 수 있으며， 구체적으 로 0.002중량 %로 함유될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점인 FTP1B 저해용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기 화 합물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 조성물 총중량에 대하여 0.000025-0.25중량 %로 함유할 수 있다. 화학식 1의 유도체 또는 약학적으로 허용가 능한 그들의 염이 0.000025중량 % 미만으로 함유되면 PTP1B의 활성 또는 발현을 저 해시키기에 충분하지 못하고, 0.25중량 ¾를 초과하여 함유되면 다른 성분의 함량 및 제형화에 있어서 적절하지 못하다. 상기와 같은 관점에서， 본 발명의 일 관점인 PTP1B 저해용 조성물은 상기 화합물， 그의 유도체 또는 약하적으로 허용가능한 그 들의 염을 조성물 총중량에 대하여 0.00005~0.2중량 0.000075~0.15중량， 0.0001-0.1중량 또는 0.000125-0.05중량의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 PTP1B 저해용 조성물에 있어서， 상기 조성물은 혈당을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은 혈당을 감소시켜서 비만 또는 당뇨와 관련 된 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다. - 본 발명의 일 관점인 PTP1B 저해용 조성물에 있어서， 상기 조성물은 콜레스 테를을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은 콜레스테를을 감소시켜서 비만 또는 당뇨와 관련된 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 관점인 PTP1B 저해용 조성물에 있어서， 상기 조성물은 비만， 당뇨， 고지질혈증, 고인슐린혈증， 고요산혈증， 저 HLD-콜레스테를증， 고 LDL-콜레 스테를증, 고트리글리세라이드혈증 및 고중성지방혈증으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 치료 또는 예방용을 포함한다.

본 발명은 다른 관점에서， 족제비싸리 ( iwrpha fruticosa) 추출물 또는 그 의 분획물을 유효성분으로 포함하는 PPARa 활성화용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 상기 'PPARa '는 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 (peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)의 일종으로, 상기 PPARa는 주로 혈관 벽， 간， 심장, 근육 신장， 갈색지방조직에서 발견된다.

본 명세서에서 상기 'PPARa를 활성화'한다는 것은 PPARa 유전자의 활성을 증진시켜 상기 유전자의 발현을 촉진하거나 또는 PPARa에서 수용체의 활성을 촉진 하는 모든 기작을 포함하는 것이나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점인 PPARa 활성화용 조성물에 있어서, 상기 족제비싸리 추 출물 또는 그의 분획물은 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 하나 이상의 화합 물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하며 ,

[화학식 1]

[화학식 2]

R20

R19 R21 상기 화학식들에서，

Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, RIO, Rll, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31 또 는 R32은 독립적으로 수소， Ci 내지 C₁₈의 알킬기， 내지 C₁₈의 알콕시기， 내지

C₁₈의 알케닐기 또는 내지 C₁₈의 알키닐기일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 PPARa 활성화용 조성물에 있어서， 상기 족제비싸리 추 출물 또는 그의 분획물은 아몰파스틸볼 및 5, 7-디히드록시 -6-게라닐 플라바논 (5,7-dihydroxy-6-geranyl-f lavanone)으로 구성된 군에서 하나 이상의 화합물， 그 의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 PPARa 활성화용 조성물에 있어서， 상기 조성물은 족제 비싸리 추출물 또는 그의 분획물을 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10중량 %로 함유할 수 있다. 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물이 조성물 총중량에 대하여 0.0이중량 % 미만으로 함유되면， PPARa를 층분히 활성화시킬 수 없고， 10중량 %를 초과하여 함유되면， 약제 상의 다른 구성 성분의 함량을 제한하게 된다. 상기와 같 은 관점에 있어서， 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물은 조성물 총중량에 대하 여， 0.0011 내지 9중량 %， 0.0012 내지 8중량 ¾， 0.0013 내지 7중량 ¾， 0.0014 내지 6 중량 ¾， 0.0015 내지 5중량 %, 0.0016 내지 4중량 ¾>， 0.0017 내지 3증량 %， 0.0018 내 지 2중량 % 또는 0.0019 내지 1중량 %으로 함유될 수 있으며， 구체적으로 0.002중량 % 로 함유될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점인 PPARa 활성화용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기 화합물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 조성물 총중량에 대하 여 0.000025~0.25중량 %로 함유할 수 있다. 화학식 1, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그들의 염이 0.000025중량 % 미만으로 함유되면 PPARa을 층분히 활성화 시킬 수 없고， 0.25중량 %를 초과하여 함유되면 다른 성분의 함량 및 제형화에 있어 서 적절하지 못하다, 상기와 같은 관점에서， 본 발명의 일 관점인 PPA a 활성화용 조성물은 상기 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그들의 염을 조성 물 총중량에 대하여 0.00005-0.2중량， 0.000075-0.15중량， 0.0001-0.1중량 또는 0.000125-0.05중량의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 PPARa 활성화용 조성물에 있어서， 상기 조성물은 PPAR α를 활성화시켜서 혈당을 감소시키거나또는 콜레스테를을 감소시킬 수 있다. ^' 본 발명의 일 관점인 PPARa 활성화용 조성물에 있어서ᅳ 상기 조성물은 CPT1 a , AC02 및 GAPDH으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진 할 수 있다. 상기 조성물은 CPTla, AC02 및 GAPDH으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하거나 또는 상기 단백질의 활성을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서， 상기 조성물은 건강식품 조성물을 포 함한다.

상기 조성물은 이를 포함하는 드링크제， 발효유, 치즈， 요구르트， 주스， 생 균제제 및 건강보조식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형 태로 사용될 수 있다.

일실시예에서 상기 조성물은， 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키 지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들에 물성 개선을 위하여 향료， 색소， _*살균제, 산화방지제， 방부제， 보습제， 점증제， 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도， 수용성 비타민， 유용성 비타민， 고분자 펩티드， 고분자 다당 및 해초 액기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨 가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 제형은 용액， 유화물, 점성형 흔합물， 타블렛， 분 말 등의 다양한 형태일 수 있으며， 이는 단순 음용， 주사 투여， 스프레이 방식 또 는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서， 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있 다.

본 발명에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우에는， 상기 조성물을 유효성 분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체， 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 흑은 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제재로서는 정제 환제， 과립제， 캡슐제， 산제， 세립 제, 분제， 유탁제， 시럽제， 펠¾제 등을 들 수 있다. 또한， 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제， 점적제， 연고， 로션， 스프레이， 현탁제, 유제， 좌제 등을 들 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료， 보존료， 안정 제, 완층제， 현탁제， 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구， 비경구, 직장， 국소， 경피， 정맥 내, 근육 내， 복강 내， 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한， 상기 유효 성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령， 성별， 체중과， 치 료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도， 투여경로 및 처방 자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적인 투여량은 0.001 //g/kg/일 내지 2000 /ig/kg/일 보다 구 체적으로는 0.5 /kg/일 내지 1500 ^g/kg/일이다.

본 발명의 일 관점은 또한 족제비싸리 (Amorpha fruticosa) 추출물 또는 그 의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물로 PPARa를 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 관점은 족제비싸리 (Amorpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물로 PTP1B를 저해시키는 방법에 관한 것이 다.

더불어 본 발명의 일 관점은 본 발명의 일 관점은 PPARa를 활성화용 조성물 의 제조에 있어서， 족제비싸리 (Amorpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물의 용 도 또는 PTP1B를 저해용 조성물의 제조에 있어서 족제비싸리 (Amorpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물의 용도에 관한 것일 수 있다.

아울러 본 발명의 일 관점은 PTP1B 저해 용도에 있어서. 족제비싸리 (Amorpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물을 포함하고， PTP1B 저해용 조성물에 제조에 있어서 족제비싸리 {Amorpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물의 용도를 포함한다.

본 발명의 일 관점은 또한 PPARa 활성화 용도에 있어서， 족제비싸리 {Amorpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물을 포함하고， PPARa 활성화용 조성 물의 제조에 있어서 족제비싸리 morpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물의 용도를 포함한다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있 어서 자명할 것이다.

본 발명에서 사용한 족제비싸리나무는 대관령 고탱지에서 자생하고 있는 것 을 사용하였다. [실시예 1] 족제비싸리 지상부 추출물의 제조

[실시예 1-1] 족제비싸리 지상부의 메탄올 추출물의 제조

잎과 잔가지， 줄기를 포함한 족제비싸리나무 지상부 100 g을 100 % 메탄을 1

L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 12.5 g을 얻었다.

[실시예 1-2] 족제비싸리 지상부의 물 추출물의 제조

잎과 잔가지， 줄기를 포함한 족제비싸리나무 지상부 100 g을 물 1 L에 담구 어 3 시간 동안 환류 추출하였다, 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 9.5 g을 얻었다.

[실시예 1-3] 족제비싸리 지상부의 에탄을 추출물의 제조

상기 족제비싸리나무 지상부 _{100 g}을 100 % 에탄올 1 L에 담구어 3 시간 동 안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농 축물 1으 5 g을 얻었다.

[실시예 2] 족제비싸리 뿌리 추출물의 제조

[실시예 2—1] 족제비싸리 뿌리의 메탄올 추출물의 제조

족제비싸리나무 뿌리 100 g을 100 % 메탄올 1 L에 담그고 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 Π.2 g을 얻었다.

[실시예 2-2]족제비싸리 뿌리의 물 추출물의 제조

족제비싸리나무 뿌리 100 g을 물 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였 다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 9.3 g을 얻 었다.

[실시예 2-3] 족제비싸리 뿌리의 에탄올 추출물의 제조

족제비싸리나무 뿌리 100 g을 100 % 에탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 10.0 g을 얻었다.

[실시예 3] 족제비싸리 종자 추출물의 제조

[실시예 3-1] 족제비싸리 종자의 메탄을 추출물의 제조

잘 익은 족제비싸리나무 종자 loo g을 ₁₀o % 메탄올 1 L에 담구어 3시간 동 안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농 축물 14.7 g을 얻었다.

[실시예 3-2] 족제비싸리 종자의 물 추출물의 제조

잘 익은 족제비싸리나무 종자 _{100 g}을 물 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추 출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 10.7 g을 얻었다.

[실시예 3-3] 족제비싸리 종자의 에탄을 추출물의 제조

잘 익은 족제비싸리나무 종자 100 g을 100 % 에탄올 1 L에 담구어 3 시간 동 안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농 축물 12.7 g을 얻었다.

[실시예 4] 족제비싸리 추출물로부터 분획물의 제조

상기 [실시예 3-1]에서 제조한 족제비싸리 종자의 메탄올 추출물을 일반적인 극성에 따른 용매분획법의 단계를 따라 분획하였다. 메탄올추출물 10 g을 물 500 ml에 현탁한 후 메틸렌클로라이드로 진탕추출하고， 정치하여 메틸렌클로라이드층을 분리하였다. 2회 더 분획한 후 메틸렌클로라이드층을 모두 합하여 감압건조하여 메 틸렌클로라이드분획 (<4M>)을 얻었다. 이어서 남은 물층에 핵산 (<4H>), 에틸아세테 이트 (<4E>), 부탄을 (<4B>)로 차례차례 분획하고 남은 층을 물 (<4W>)분획으로 하였 다. 위 분획을 감압농축하여 메틸렌클로라이드분획 0.8 g, 핵산분획 1.1 g, 에틸 아세테이트분획 2.1 g, 부탄을분획 2.5 g, 물분획 3.5 g을 수득하였다.

[실시예 5] 아몰파스틸볼의 분리

상기 [실시예 3-1]에서 제조한 족제비싸리 종자의 메탄을 추출물을 50( l 물 에 현탁한 후 500 ml 에틸아세테이트로 3회 분획하여 분획한 액을 감압농축하여 에 틸아세테이트 분획을 15 g 제조하였다. 이 분획을 n-핵산-에틸아세테이트 그레디언 트 시스템 (10:1 - 100% 메탄올)을 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 적용하여 14 개의 소분획으로 나누었다 (4E1-4E14). 이중 4번째 분획을 클로로포름-메탄올 (100:1) 용매시스템으로 다시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 3개의 소분획으로 다시 나누었고, 이중 2번째 소분획에서 preparative HPLC (Waters DeltaPrep 150 mL System, SunFire Silica 150 x 10 mm Column; mobile phase n- hexaneethylacetate(95:5)； f lowrate5ml/min,UVdetect ionat254nm)를 사~§ "하여 아몰 파스틸볼을 분리 (3 mg)하였다. 상기 아몰파스틸볼의 구조는 NMR 및 MS를 사용하여 규명하였다.

ΙΊ> ESI -MS m/z 347 [M-H] ；

：8> ¾ NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 7.48 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.35 (2H, t, J =

7.5 Hz), 7.25 (1H, br t, J = 7.5 Hz), 7.01 (1H, d, J = 16.5 Hz), 6.94 (1H, d, J = 16.5 Hz), 6.59 (2H, s), 5.22 (1H, m) , 5.18 (1H, s), 5.06 (1H, m)， 3.44 (2H, d, J= 7.0 Hz), 2.10 (4H, m) , 1.83 (3H, s), 1.69 (3H, s), 1.60 (3H, s)

:9>

o> [실시예 6] 5, 7-디히드록시 -6-게라닐 플라바논의 분리

ι> 상기 [실시예 3-1]에서 제조한 족제비싸리 종자의 메탄을 추출물을 500ml 물 에 현탁한 후 500 ml 에틸아세테이트로 3회 분획하여 분획한 액을 감압농축하여 에 틸아세테이트 분획을 15 g 제조하였다. 이 분획을 n-핵산-에틸아세테이트 그레디언 트 시스템 (10:1 - 100% 메탄올)을 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 적용하여 14 개의 소분획으로 나누었다 (E1-E14). 이중 4번째 분획을 클로로포름-메탄을 (100:1) 용매시스템으로 다시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 3개의 소분획으로 다시 나누 었고， 이중 1번째 소분획에서 preparative HPLC (Waters DeltaPrep 150 mL System, SunFire Silica 150 x 10 mm Column; mobi le phase n- hexaneethyl acetate (95 :5)； f lowrate5ml/min,UVdetect ionat254nm)¾- 사용하여 5,7- 디히드톡시 -6-게라닐 플라바논을 분리 (3 mg)하였다. 상기 5， 7-디히드록시 -6-게라닐 플라바논의 구조는 NMR 및 MS를 사용하여 규명하였다.

2> ESI-MS m/z 391 [M-H]+;

3> ¾ NMR (500 MHz, CD₃CN) δ 12.40 (1H, s)ᅳ 7.46-7.40 (5H, m)， 6.34 (1H, s), 6.02 (1H, s), 5.40 (1H, dd, J = 3.0, 13.0 Hz), 5.26 (1H, dt， J = 1.0， 7.0 Hz), 5.05 (1H, t, J = 7.0 Hz), 3.37 (2H, d, J = 7.0 Hz), 3.08 (1H, dd, J = 13.0, 17.0 Hz), 2.82 (1H, dd, J = 3.0, 17.0 Hz), 2.12-2.05 (4H, m)， 1.81 (3H, s), 1.67 (3H, s), 1.59 (3H, s).

4>

5> [실험예 1] PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase IB) 활성억제 실험

6> PTP1B 효소 활성은 기질인 p-NPP (para-nitrophenyl phosphate)을 사용하여 측정하였다. 50 mM citrate buffer (pH 6.0), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA 및 1 mM DTT 이 포함되어진 완층용액에 20 mM p-NPP, PTP1B (0.05 yg) 및 상기 실시예 각각의 추출물과 분획물 및 분리된 화합물을 넣고 37°C에서 30분간 반응시킨 후, 10 N NaOH 10 μ ΐ를 첨가하여 반웅을 종결하였다. ρ—나이트로페놀 (p-nitrophenol)은 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 저해율 (%)은 완층용액에 효소와 기질만 넣 고 반응시켜 측정한 값을 100% 로 하고 효소만 넣어 측정한 값을 ◦%로 하여 계산한 후 이에 대한 비율로 나타내었다. 각 추출물， 분획 또는 화합물에 대하여 각각 50% 저해농도 (IC₅₀)를 구하여 아래 표 1에 나타내었다.

【표 1】

그 결과 (표 1), 족제비싸리 추출물 및 그의 분획물은 뛰어난 PTP1B 저해 효 능을 가지는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라， 상기 족제비싸리 추출물에서 분리한 아몰파스틸볼 및 5， 7-디하이드록시게라닐플라바논 화합물 역시 우수한 PTP1B 저해 효능을 가지는 것으로 관찰되었다.

[실험예 2] 근육세포에서 인슐린 신호전달 및 PTP1B 발현에 미치는 영향 족제비싸리추출물 및 이로부터 분리한 화합물들이 실제로 인슐린 감수성을 증가시키는지를 확인하기 위하여 근육세포인 심장세포 C2C12를 사용하여 인술린 신 호전달에 미치는 영향 및 PTP1B 발현에 미치는 영향을 웨스턴블랏을 사용하여 측정 하였다.

C2C12 (ATCC사 (American Type Cultuur Collection) (Manassas, VA, USA)). 심장세포를 10% 우태아혈청 (FBS)과 1% 항생제 (penicillin/streptomycin)가 함유된 DMEM (Dulbecco' s modified Eagle' s medium)배지에서 배양하였다. 이후 세포를 2% 말혈청이 함유된 DMEM배지로 갈아주어 4일동안 분화시켰다. 정상조건을 주기위 해 2% BSA (Bovine Serum Albumin)와 10% FBS가 함유된 DMEM에서 16시간동안 배양 하였으며, 인술린 내성 조건을 주기 위해 정상조건과 동일한 배지 조건에 팔미틴산 0.75mM을 더한 조건으로 16시간 동안 배양하였다. 이후 인슐린 100 nM을 10분 처리 한 후 세포를 수확하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 항체는 Akt, phosphor-Ser473 Akt, IRp， phosphor-Tyrll35/1136 IGF-1 R|3 /Tyr 1150/ 1151 IR , phosphor-Ser9 Gsk3 , Gsk3p , GAPDH (Cell Signaling, Beverly, MA, USA)를 사용하였다.

그 결과 (도 1)， 족제비싸리추출물 및 이로부터 분리된 화합물들은 정상 및 인슐린 내성조건에서 인슬린 신호전달 증가의 마커가 되는 Akt 473번 serine 잔기 의 인산화를 증가시켰으며 GSK3|3의 9번 serine 잔기의 인산화 또한 증가시켰다. 그러므로 인슐린 내성 조건에서 족제비싸리추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 PTP1B의 활성과 발현 모두를 저해시킴에 따라 인슐린에 대한 감수성을 증가시켜 혈 당올 강하시키는 효능을 가짐을 확인하였다.

[실험예 3] 포도당 uptake에 대한 효능

족제비싸리추출물 및 이로부터 분리한 화합물들이 실제로 인슐린 감수성을 증가시켜 세포내로 당이동을 증가시키는지 확인하기 위하여 근육세포인 심장세포 C2C12를 사용하여 직접 포도당 uptake 양을 측정하였다.

C2C12 (ATCC, CRL-1772) 심장세포를 10% 우태아혈청 (FBS)과 1% 항생제 (penici Uin/streptomycin)가 함유된 DMEM (Dulbecco' s modified Eagle' s medium)배지에서 배양하였다. 96웰 검은 플레이트에 심은 후 2% 말혈청이 함유된 DMEM배지로 갈아주어 4일동안 분화시켰다. 정상조건을 주기위해 2% BSA (Bovine Serum Albumin)와 10% FBS가 함유된 DMEM에서 16시간 동안 배양하였으며， 인슐린 내성조건을 주기 위해 정상조건과 동일한 배지 조건에 팔미틴산 0.75m을 더한 조 건으로 16시간 동안 배양하였다. 이후 인슬린 100 nM을 1 시간 처리하였으며， 마지 막 15분 동안 형광을 면 포도당 유도체인 2-NBDG (Invitrogen, Carlsbad, CA) 50uM 을 처리한 후 세포내로 이동된 형광의 정도를 Infinite M1000 microplate reader (TEC AN)를 사용하여 excitation 485nm, emission at 535nm에서 측정하여 포도당 uptake를 측정하였다.

그 결과 (도 2)， 정상조건과 인술린 내성 조건 모두에서 족제비싸리 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들은 근육세포내 포도당 uptake에 대해 매우 우수한 활 성을 보임을 확인하였다.

[실험예 4] 대사질환 조절효과

[실험예 4-1] 몸무게, 먹이 섭취량 및 식이효율의 측정

웅성 7주령 C57BL/6 마우스 (Shizuoka Laboratory Animal Center, Japan) 를 구입하여 실험실에서 1주간 적웅시킨 후 실험에 사용하였다. 정상 식이군을 대조군 으로 하고 고지방식이군 및 고지방식이에 더하여 각 족제비싸리추출물 (200 mg/Kg) 및 5개의 분획 (각 40 mg/Kg)을 주 5회 8주간 투여하였다. 족제비싸리추출물 (200 mg/Kg) 및 5개의 분획 (각 40 mg/Kg)을 8주간 투여하면서 매일 몸무게， 먹이, 음료 섭취량을 측정하였다. 식이효율은 8주간의 몸무게 증가를 8주간의 음식섭취량으로 나눈 것으로서, 다음 수학식으로 계산하였다.

[수학식 1]

feed efficiency = [weight gain (g/8wk) I food intake (g/8wk)]

【표 2】

그 결과 (표 2)， 족제비싸리 추출물 및 분획물은 몸무게 증가를 저해하는 것 을 확인하였다. 특히， 족제비싸리 추출물은 고지방식이 대조군보다 몸무게 증가를 43%나 저해하는 것으로 관찰되었다.

[실험예 4-2] 공복혈당, 총콜레스테를, LDL 콜레스테롤 측정

웅성 7주령 C57BL/6 마우스 (Shizuoka Laboratory Animal Center, Japan)를 구입하여 실험실에서 1주간 적웅시킨 후 실험에 사용하였다. 정상 식이군을 대조군 으로 하고 고지방식이군 및 고지방식이에 더하여 각 족제비싸리추출물 (200 mg/Kg) 및 5개의 분획 (각 40 mg/Kg)을 주 5회 8주간 투여하였다.

상기 투여가 끝나고 12시간 절식 후 각각의 실험군의 공복혈당을 측정하였 다. 혈당은 마우스의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 Accu-Chek (Roche, 독일) 으로 측정하였다 (도 3).

이어서， 마우스를 절개하여 혈액을 채취하고 간 무게를 측정하였다. 간무게 는 저울에서 직접 적출한 장기무게를 측정하여 마우스의 몸무게로 나누어 비교하였 다. 그 결과 (도 4)， 본 추출물 및 분획을 투여한 실험군에서는 고지방식이에서 발 견되는 간비대 (약 40% 정도 간무게 증가 및 지방간 소견 보임) 현상이 나타나지 않아서 간독성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다.

> 혈액 중의 총콜레스테를은 SICDIA L T-CHO reagents (Eiken Chemical,

Tokyo, Japan)를 사용한 효소적 방법으로 측정하였고， LDL-콜레스테를은 L-Type LDL-C (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan)를 사용한 효소적 방법으로 측정하였다 (도 3).

> 그 결과 (도 3), 본 추출물 및 분획을 투여한 실험군은 공복혈당 및 총콜레 스테를， LDL-콜레스테롤을 저하시키는 것을 확인하였다. 이에 따라， 본 발명의 조 성물은 혈당을 저하시키고， 혈액중의 지질을 개선할 수 있음을 확인하였다.

>

> [실험예 5] PPARa활성화 시험

> 플라스미드 (Plasmid)는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버셜 프로모 터 (universal promoter) 뒤에 PPARa 유전자를 지닌 것， 리간드 결합형의 PPARa가 결합하여 활성화되는 PPRE(PPARs Response Element)를 프로모터로 가지고 뒤에 리 포터로서 역할을 하는 반디불 루시퍼라아제 (firefly luciferase) 유전자를 지닌 것 그리고 레퍼런스 (reference)로 사용될 유니버셜 프로모터에 레닐라 루시퍼라아제 (Renilla luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드 (pRL-SV40, Pr omega, USA)가 사 용되었다 (KLIEWER SA.， Proc. Nadl. Acad. Sci. USA, 91： 7355-7359, 1994) .

> CV-1 세포를 5xl0⁴의 농도로 24-웰 (well)형 플레이트에 깐 후 24시간 배양 후 상기 세 종류의 플라즈미드 유전자를 일시적 주입 (transient transfect ion) 하 였다. 이후 24시간 배양 후 1 X 인산완층식염수 (Phosphate Buffered Saline, PBS)로 세척한 후， 본 발명의 물질들을 농도별로 처리 24시간 배양 후 lxPBS로 세 척 후 lxPLB로 세포를 깬 후 듀얼-루시퍼라아제 수용체 분석 시스템 키트 (Dual-

Lucif erase Reporter Assay System kit , Promega , USA)를 사용하여 사용자 지시서 에 따라 샘플과 레퍼런스 (reference)의 루시퍼라아제 활성 (luciferase activity)을 측정하였다. 본 실험에서 양성대조군은 PPARa의 리간드 중 가장 강력한 것으로 알려진 Wy-14,643(Sigmaᅳ USA)을 사용하였고 음성대조군은 무처리군으로 하였다. > 【표 3】

그 결과 (표 3 및 도 5)에 나타나는 바와 같이 족제비싸리 추출물, 이의 분 획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5，7-디하이드록시 ᅳ 6-게라닐플라바논은 상기 물질들을 처리하지 않은 대조군에 비해 처리하였을 때 PPARa의 활성화 정도가 더욱 높은 수치를 나타내었으며 , 처리량이 높을수록 수치 가 더 높아졌음을 확인하였다.

[실험예 6] PPARa 및 지방산 산화에 관련된 유전자들의 발현

사람의 간암세포주인 HepG2 세포 (HB-8065, ATCC, USA)를 60 파이 디쉬 (dish) 에 I X 10⁶개의 농도로 깔고， 24시간 후 최종농도가 10 uM이 되게 양성대조군인 Wy- 14,643, 아몰파스틸블과 5, 7-디하이드록시 -6-게라닐플라바논을 각각 처리하였다. 24시간 후에 트리졸 (trizol)을 이용하여 전체 R A를 추출하고 RT-PCR을 통해 지방 산 산화 관련 유전자들의 발현 정도를 확인하였다. 상기 RT-PCR에서 역전사 (reverse transcript ion)는 시중에 판매되는 키트 (reverse transcription system, Promega)를 사용하여 수행하였으며， PCR은 변성 (denaturat ion)은 94^°C， 1분， 풀림 (annealing)은 54^°C, 1분, 연장 (extension)은 72^°C, 1분씩 총 30사이클 (cycle)로 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머 (primer)들은 아래와 같다.

PPARa

포워드 (forward) 5 acggaaagcccactctgccccctctc 3' (서열번호 1)

리버스 (reverse) 5 c 11 gt ccccgcagat t ct acat t eg 3' (서열번호 2)

CPTla

포워드 (forward) 5 agacggtggaacagaggctgaag 3' (서열번호 3) * 리버스 (reverse) 5 tgagaccaaacaaagtgatgatgtcag 3' (서열번호 4)

AC02

포워드 (forward) 5 gcggacatggctactcaaagc 3' (서열번호 5)

리버스 (reverse) 5 gcagtgcaccttagcagcctg 3' (서열번호 6)

GAPDH

포워드 (forward) 5 accacagtccatgccatcac 3' (서열번호 7)

리버스 (reverse) 5 tccaccaccctgttgctgta 3' (서열번호 8) 그 결과 도 6에서 나타나는 바와 같이 PPARa 및 이와 관련된 유전자인 CPT1 a (Carnitine Palmitoyl Transferase I alpha) , AC02(Acyl^~CoA Oxidase 2)는 아몰 파스틸볼과 5,7-디하이드록시 -6-게라닐플라바논을 처리한 각 군은 양성대조군으로 사용한 Wy-14643을 처리한 군만큼 증가함을 확인함으로써， 지방산 산화에 관여함을 알 수 있었다.

[실험예 7] 족제비싸리 추출물， 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화 합물의 독성실험

족제비싸리 추출물， 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재 (SPF) SD계 랫트 (중앙실험동물, 한국)를 사용하여 급 성 독성실험을 실시하였다. 족제비싸리의 추출물， 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물을 각각 0.5% 메틸샐를로오스 용액에 현탁하여 5 g/kg/15 의 용량 으로 단회 경구 투여하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사 여부， 임상 증상, 체중 변화를 관찰하여 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며， 부검하여 육안으로 복강장기와흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다.

실험 결과， 실험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐 사된 동물은 없었으며， 체중변화， 혈액검사, 혈액생화학검사， 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다.

그 결과, 랫트에서 5 g/kg까지 독성 변화를 나타내지 않으며， 경구 투여 최 소 치사량 (LD₅₀)은 5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

아래 상기 조성물의 제형예를 설명하나， 이는 본 발명을 한정하는 것이 아니 라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 연질 캡슐

족제비싸리 추출물 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 팜유 2mg, 식물성 경 화유 ¾n_g> 황납 4mg 및 레시틴 9mg을 흔합하고， 통상의 방법에 따라 흔합하여 연질 캡술 층진액을 제조한다. 1 캡슐당 400mg씩 층진하여 연질 캡슐을 제조한다. 그리 고, 상기와 별도로 젤라틴 66 중량부 글리세린 24 중량부 및 솔비틀액 10 중량부 의 비율로 연질 캡술 시트를 제조하고 상기 층진액을 층진시켜 본 발명에 따른 조 성물 400mg이 함유된 연질 캡슬을 제조한다.

[제형예 2] 정제

족제비싸리 추출물 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 갈락토올리고당 200 mg, 유당 60mg 및 맥아당 MOrag을 흔합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르 (sugar ester) 6mg을 첨가한다. 이들 조성물 500mg을 통상의 방법으로 타정하여 정제를 제조한다.

[제형예 3] 드링크제

족제비싸리 추출물 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 을리고당 25g을 흔합한 후, 정제수 300 를 가하여 각 병에 200ιιΛ씩 되도톡 충진한다, 병에 충진한 후 130^°C에서 4~5초간 살균하여 드링크제를 제조한 다.

[제형예 4] 과립제

족제비싸리 추출물 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 무수결정 포도당 250 mg 및 전분 550mg을 흔합하고， 유동충 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조한다.

[제형예 5] 주사제

족제비싸리 추출물. 20 mg

주사용 멸균 증류수

H조절제

통상의 주사제의 제조 방법에 따라 1 앰플당 (2 ) 상기의 함량으로 주사제를 제조한다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 웅용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

[제제예 6] 건강 음료의 제조

족제비싸리 추출물 1000 mg

구연산 1000 mg 을리고당 100 g 매실농축액 2 g 타우린 1 g 정제수를 가하여 전체 900

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음, 약 1시간 동 안 85^°C에서 교반 가열한 후， 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 용기에 취득하 여 밀봉 멸균한 뒤 넁장보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합조 성하였지만 수요계층이나， 수요국가， 사용 용도 등 지역적， 민족적 기호도에 따라 서 그 배합비율을 임의로 변형 실시하여도 무방하다. 본 발명이 속한 기술 분야에 서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양 한 웅용 및 변형올 행하는 것이 가능할 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통 상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며， 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정 의된다고 할 것이다.

【산업상 이용가능성】

본 발명의 조성물은 족제비싸리 추출물을 포함하여， PTP1B을 저해시킨다. 뿐 만 아니라， 족제비싸리 추출물에서 분리한 아몰파스틸볼 및 5，7-디하이드록시게라 닐플라바논 화합물 역시 우수한 PTP1B 저해 효능을 가진다. 구체적으로， 본 발명의 조성물은 PTP1B의 활성과 발현 모두를 저해시킴에 따라 인슐린에 대한 감수성을 증 가시켜 혈당을 감소시킬 수 있고, 근육세포내 포도당 uptake에 대해 매우 우수한 활성을 보인다, 더불어， 본 발명의 조성물은 몸무게 증가를 저해시키고， 공복혈당 및 총콜레스테를， LDL-콜레스테롤의 증가를 저하시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 족제비싸리 추출물을 포함하여， PPARa를 활성화시 킨다. 뿐만 아니라, 족제비싸리 추출물에서 분리한 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드 록시게라닐플라바논 화합물 역시 우수한 PPARa 활성화 효능올 가진다.

본 발명의 조성물은 상기와 같은 효능을 가지면서도 천연물을 유효성분으로 함유하여 독성이 없어서， 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료에 유용하다.

【서열목록 프리텍스트】

PPARa

포워드 (forward) 5' acggaaagcccact ct gccccct c t c 3' (서열번호 1)

리버스 (reverse) 5' c 11 gt ccccgcagat t ct acat t eg 3' (서열번호 2)

CPTla

포워드 (forward) 5' agacggt ggaacagaggc t gaag 3' (서열번호 3)

리버스 (reverse) 5' tgagaccaaacaaagtgatgatgtcag 3' (서열번호 4)

AC02

포워드 (forward) 5' gcggacat ggct act caaagc 3' (서열번호 5)

리버스 (reverse) 5' gcagtgcaccttagcagcctg 3' (서열번호 6)

GAPDH

포워드 (forward) 5' accacagtccatgccatcac 3' (서열번호 7)

리버스 (reverse) 5' tccaccaccctgttgctgta 3' (서열번호 8)

Claims

【청구의 범위】

【청구항 11

족제비싸리 morpha fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 PTP1B 저해용 조성물.

【청구항 2]

제 1항에 있어서，

상기 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물은 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 하나 이상의 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하며，

[화학식 1]

상기 화학식들에서

Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, RIO, Rll, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31 또 는 R32은 독립적으로 수소， d 내지 C₁₈의 알킬기, 내지 C₁₈의 알콕시기， 내지 C₁₈의 알케닐기 또는 내지 C₁₈의 알키닐기인， PTP1B 저해용 조성물.

【청구항 3】

제 1항에 있어서，

상기 족제비싸리 추출물또는 그의 분획물은 아몰파스틸볼 (Amorphastilbol) 및 5 ,7-디히드톡시 -6-게라닐 플라바논 (5,7-dihydroxy-6-geranyl-flavanone)으로 구성된 군에서 하나 이상의 화합물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는, PTP1B 저해용 조성물.

【청구항 4】

제 1항에 있어서，

상기 조성물은 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물을 조성물 총중량에 대하 여 0.001 내지 10중량 %로 함유하는， PTP1B 저해용 조성물.

【청구항 5】

제 2항 또는 제 3항에 있어서，

상기 조성물은 상기 화합물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 조성물 총중량에 대하여 0.000025~0.25중량 %로 함유하는， PTP1B 저해용 조성 물.

【청구항 6]

제 1항 내지 제 3항 증 어느 한 항에 있어서， 상기 조성물은 혈당을 감소시키 는， PTP1B 저해용 조성물.

【청구항 7]

제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서，

상기 조성물은 콜레스테롤을 감소시키는, PTP1B 저해용 조성물.

【청구항 8】

제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서

상기 조성물은 비만， 당뇨， 고지질혈증， 고인슐린혈증， 고요산혈증 저 HLD- 콜레스테를증， 고 LDL-콜레스테를증， 고트리글리세라이드혈증 및 고중성지방혈증으 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 치료 또는 예방용인， PTP1B 저해용 조성물.

【청구항 9]

족제비싸리 Amorpla fruticosa) 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 PPARa 활성화용 조성물.

【청구항 10] 거 19항에 있어서，

상기 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물은 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 하나 이상의 화합물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하며，

[화학식 1]

상기 화학식들에서，

Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8ᅳ R9, RIO, Rll, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31 또 는 R32은 독립적으로 수소， d 내지 C₁₈의 알킬기ᅤ 내지 C₁₈의 알콕시기， 내지

C₁₈의 알케닐기 또는 내지 C₁₈의 알키닐기인， PPARa 활성화용 조성물.

【청구항 113

제 9항에 있어서,

상기 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물은 아몰파스틸볼 및 5,7-디히드록 시 -6-게라닐 플라바논 (5,7-dihydroxy-6-geranyl-flavanone)으로 구성된 군에서 하 나 이상의 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는ᅳ

PPARQ 활성화용 조성물.

【청구항 12】

제 9항에 있어서，

상기 조성물은 족제비싸리 추출물 또는 그의 분획물을 조성물 총중량에 대하 여 0.001 내지 10중량 %로 함유하는， PPARa 활성화용 조성물.

【청구항 13]

제 10항 또는 제 11항에 있어서，

상기 조성물은 상기 화합물， 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 조성물 총중량에 대하여 0.000025~0.25중량 %로 함유하는， PPARa 활성화용 조 성물.

【청구항 14]

제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서，

상기 조성물은 혈당을 감소시키는， PPARa 활성화용 조성물.

【청구항 15】

제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서，

상기 조성물은 콜레스테롤올 감소시키는， PPARa 활성화용 조성물.

【청구항 16】

제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서，

상기 조성물은 비만, 당뇨， 고지질혈증， 고인슐린혈증, 고요산혈증， 저 HLD- 콜레스테를증， 고 LDL-콜레스테롤증, 고트리글리세라이드혈증 및 고중성지방혈증으 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 치료 또는 예방용인， PPARa 활성 화용 조성물.

【청구항 17】

제 9항에 있어서，

상기 조성물은 CPTl aᅳ AC02 및 GAPDH으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이 상의 유전자의 발현을 촉진하는， PPARa 활성화용 조성물.

【청구항 18】

제 1항또는 제 9항에 있어서,

상기 조성물은 건강식품 조성물인， 조성물.

【청구항 19]

제 1항 또는 제 9항에 있어서， 상기 조성물은 약학 조성물인， 조성물