JP5816426B2 - Cgrp応答性抑制剤 - Google Patents
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Description
(1)ワレモコウ、ユキノシタ、メマツヨイグサ、ヒマラヤンラズベリー及びそれらの抽出物からなる群より選択されるうちの少なくとも1を有効成分とする細胞のCGRP応答性抑制剤。
(2)細胞が血管平滑筋細胞である、(1)の抑制剤。
(3)ワレモコウ、ユキノシタ、メマツヨイグサ、ヒマラヤンラズベリー及びそれらの抽出物からなる群より選択されるうちの少なくとも1を有効成分とする偏頭痛の予防及び/又は改善剤。
(4)ワレモコウ、ユキノシタ、メマツヨイグサ、ヒマラヤンラズベリー及びそれらの抽出物からなる群より選択されるうちの少なくとも1を有効成分とする知覚過敏の予防及び/又は改善剤。
(5)細胞のCGRP応答性を抑制する方法であって、CGRP受容体を有し且つCGRP応答性を抑制させたい細胞を、ワレモコウ、ユキノシタ、メマツヨイグサ、ヒマラヤンラズベリー及びそれらの抽出物からなる群より選択される素材のうちの少なくとも1の存在下で培養する工程を含む方法。
(6)細胞が血管平滑筋細胞である、(5)の方法。
本発明による細胞のCGRP応答性抑制剤は、CGRPにより惹起される細胞におけるこれらの一連のプロセスの活性化を抑制し得る。例えば、本発明のCGRP応答性抑制剤の作用としては、CGRPとその受容体との結合の阻害、Gタンパク質活性化の抑制、アデニレートシクラーゼ活性化の抑制、細胞内cAMPの増加の抑制、プロテインキナーゼA活性化の抑制、NO産生又はcGMP活性化の抑制、及びK+チャネル開口抑制等が挙げられる。好ましくは、「細胞のCGRP応答性」は、CGRPにより引き起こされる細胞内cAMPの増加抑制の程度を指標として決定され得る。従って、本発明のCGRP応答性抑制剤は、好ましくは、CGRPにより惹起される細胞内cAMPの増加を抑制する。
あるいは、当該「細胞」は、上記で挙げた細胞の細胞片または細胞分画物であってもよく、上記で挙げた細胞を含む組織又は上記で挙げた細胞に由来する培養物であってもよい。
溶剤の使用量としては、植物(乾燥質量換算)1gに対して1〜100mLが好ましい。抽出条件は、0℃〜溶媒沸点の間の抽出温度で、充分な抽出が行える時間抽出を行うのであれば特に限定されないが、通常、低温なら長時間、高温なら短時間の抽出を行う。
抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。
抽出条件の例として、15〜25℃で7日間〜14日間、約70℃で5時間、等が挙げられる。
また、抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、40〜100℃(好ましくは50〜70℃)下、100〜1000rpmで30〜300分間の攪拌が挙げられる。
抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。
さらに、抽出物の薬理活性を向上させる点から、上記抽出物から不活性な夾雑物を除去するため、クロマトグラフィーや液々分配等の分離・精製技術を用いてもよい。
上記飲食品等における上記に挙げた素材の含有量は、乾燥重量として、0.000001〜100質量%とするのが好ましく、0.000002〜75質量%とするのがより好ましく、0.000005〜50質量%とするのがさらに好ましく、0.00001〜30質量%とするのがさらにより好ましく、0.0001〜20重量%とするのがなお好ましい。
あるいは、投与対象は、動物由来の組織、器官、細胞、又はそれらの分画物であり得る。当該組織、器官、細胞、又はそれらの分画物は、CGRP受容体を発現するか又はCGRP受容体を有する、天然由来又は生物学的若しくは生物工学的に改変された組織、器官、細胞、又はそれらの分画物である。
(1)方法
1.細胞培養
正常ヒト冠状動脈平滑筋細胞(HCASMC;クラボウ社、細胞lot# 625723)を増殖用培地(基礎培地HuMedia-SB2 500mlにFBS 25ml、hEGF 0.5ml、hFGF-B 0.5ml、インスリン 0.5ml、抗菌剤 0.5mlを添加したもの;クラボウ社)で培養した。継代には0.025%トリプシン/0.01%EDTAを用いた。
正常ヒト冠状動脈平滑筋細胞を4000個/cm2の密度で増殖用培地を用いて48ウェルプレートに播種し、翌日分化用培地(基礎培地HuMedia-SB2 500mlにFBS 5ml、ヘパリン 0.5ml、抗菌剤 0.5mlを添加したもの;クラボウ社)に交換した。培地を1日おきに交換して7日間培養した。最後の2日間は表1記載の試験物質を0.1%(v/v)の量で含む分化培地にて培養し、その後細胞をCGRP応答性の測定に供した。
細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤(PDI)IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine、500μM;シグマ社)及びRo-20-1724(100μM;和光純薬工業株式会社)、0.1%(v/v)のの量の表1記載の試験物質を含む基礎培地(Humedia-SB2;クラボウ社)で2回洗浄し、さらに同培地を200μl添加して37℃にて60分間培養し、細胞内に阻害剤を浸透させた。培地を除去して0.1%(v/v)の量の表1記載の試験物質、0.5nM CGRP、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む基礎培地を添加し、15分間37℃にて培養した。反応の停止は、cAMP測定EIAキット(cAMP EIA (non-acetylation);GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)に付属の細胞溶解液を添加することにより行い、取扱説明書に記載の方法に従って細胞内cAMP濃度([cAMP]i)を測定した。試験物質のCGRP応答性抑制能は、0.5nM CGRPのみで刺激したときの[cAMP]iを基準(コントロール)とし、これに対する百分率をInhibition Indexとして表した。試験物質のCGRP応答性抑制能は、コントロールの[cAMP]iに対する有意差検定を行い、p値が0.1未満のものを有意に効果があるものとした。
CGRP応答性の測定結果を表2に示す。
異なる量で、表1記載のワレモコウエキスを試験物質として用いて、実施例1と同様の方法により細胞を培養し、細胞のCGRP応答性を測定した。結果を図1に示す。Inhibition Index 100% は、1306.5 fmol/wellの[cAMP]iに相当する。
異なる量で、表1記載のユキノシタエキスを試験物質として用いて、実施例1と同様の方法により細胞を培養し、細胞のCGRP応答性を測定した。結果を図2に示す。Inhibition Index 100% は、1256.0 fmol/wellの[cAMP]iに相当する。
異なる量で、表1記載のメマツヨイグサエキスを試験物質として用いて、実施例1と同様の方法により細胞を培養し、細胞のCGRP応答性を測定した。結果を図3に示す。Inhibition Index 100% は、1306.5 fmol/wellの[cAMP]iに相当する。
異なる量で、表1記載のヒマラヤンラズベリーエキスを試験物質として用いて、実施例1と同様の方法により細胞を培養し、細胞のCGRP応答性を測定した。結果を図4に示す。Inhibition Index 100% は、1306.5 fmol/wellの[cAMP]iに相当する。
Claims (6)
- メマツヨイグサ、ユキノシタ、ヒマラヤンラズベリー及びそれらの抽出物からなる群より選択される素材のうちの少なくとも1を有効成分とする細胞のCGRP応答性抑制剤(但し飲食品として使用する場合、及び遅延型過敏症の予防又は改善剤として使用する場合を除く)。
- 細胞が血管平滑筋細胞である、請求項1記載の抑制剤。
- メマツヨイグサ、ユキノシタ、ヒマラヤンラズベリー及びそれらの抽出物からなる群より選択されるうちの少なくとも1を有効成分とする偏頭痛の予防及び/又は改善剤(但し飲食品として使用する場合を除く)。
- メマツヨイグサ、ユキノシタ、ヒマラヤンラズベリー及びそれらの抽出物からなる群より選択されるうちの少なくとも1を有効成分とする知覚過敏の予防及び/又は改善剤(但し飲食品として使用する場合、及び遅延型過敏症の予防又は改善剤として使用する場合を除く)。
- 細胞のCGRP応答性を抑制する方法であって、CGRP受容体を有し且つCGRP応答性を抑制させたい細胞を、メマツヨイグサ、ユキノシタ、ヒマラヤンラズベリー及びそれらの抽出物からなる群より選択される素材のうちの少なくとも1の存在下で培養する工程を含む方法。
- 細胞が血管平滑筋細胞である、請求項5記載の方法。
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