CN103842509B - 用于烷酰基辅酶a合成的基因和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

鉴定和表征了具有烷酰基辅酶A活性的多肽以及编码这些多肽的核酸。核酸的表达或过表达会改变生物体中大麻素化合物的水平。所述多肽可用于体内或体外产生大麻素化合物。

Description

用于烷酰基辅酶A合成的基因和蛋白质
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2011年7月13日提交的美国临时专利申请序号USSN61/507,331的优先权，该申请以引用的方式全文并入本文。
发明领域
本发明涉及与烷酰基辅酶A硫代酯的合成相关的核酸分子和蛋白质，和所述核酸分子和蛋白质用于植物、微生物或无细胞系统中的大麻素生物合成工程的用途以及用于培育具有增强或降低的大麻素含量的大麻植物的用途。
发明背景
大麻（CannabissativaL.;cannabis,hemp,marijuana）是一种最古老且用途最广的种植植物，现今发现它可用作药品、食品、化妆品和工业产品的来源。大麻还因含有作用于精神的大麻素（如Δ9-四氢大麻酚，Δ9-THC）而用作非法毒品而闻名。目前正在探索作用于哺乳动物大麻素受体的大麻素和其它药物对不同病症的治疗，所述病症如慢性疼痛、多发性硬化症和癫痫。
大麻素的生物合成起源于聚酮和萜类的代谢作用，他们被称为萜酚(terpenophenolic)或戊二烯聚酮（PageJ.,NagelJ.(2006)Biosynthesisofterpenophenolicsinhopandcannabis.InJTRomeo,ed,IntegrativePlant Biochemistry,Vol.40.Elsevier,Oxford,pp179-210.）。大麻素生物合成主要发生在以高密度覆盖雌花的腺毛中。大麻素通过三步生物合成过程形成：聚酮的形成、芳香族异戊烯化和环化（见图1）。
大麻素生物合成中的第一个酶促步骤是戊基二羟基苯酸(olivetolicacid)的生成，其通过聚酮合成酶催化己酰辅酶A（CoA）与三分子丙二酰辅酶A的缩合形成。主要的大麻素包括Δ9-四氢大麻酚酸和大麻二酚酸，它们由前体己酰辅酶A形成，所述前体己酰辅酶A是中链脂肪酰辅酶A（见图1）。其它含不同侧链的大麻素由不同长度脂族辅酶A形成（如Δ9-四氢次大麻酚酸(Δ9-tetrahydrocannabivarinicacid)是由正丁酰辅酶A引物(primer)形成的）。
植物中己酰辅酶A和其它酰基辅酶A硫代酯通过酰基活化酶（AAE，也称为酰基辅酶A合成酶）使用ATP催化羧酸底物的活化而合成。这些酶作用于多种羧酸，包括短链、中链、长链和极长链脂肪酸、茉莉酮酸前体、苯丙素衍生酸（如肉桂酸）和其它有机酸如丙二酸、乙酸和柠檬酸。在自然界中，此前很少有已经鉴定的中链酰基辅酶A合成酶。在植物中，来自拟南芥(A.thaliana)的三种酶AAE7、At4g05160和At5g63380已证明由己酸形成己酰辅酶A（SchneiderK等.(2005)Anewtypeofperoxisomalacyl-coenzymeAsynthetasefromArabidopsisthalianahasthecatalyticcapacitytoactivatebiosyntheticprecursorsofjasmonicacid.TheJournalofBiologicalChemistry280:13962-72；ShockeyJM,FuldaMS,BrowseJ(2003)Arabidopsiscontainsalargesuperfamilyofacyl-activatingenzymes.Phylogeneticandbiochemicalanalysisrevealsanewclassofacyl-coenzymeasynthetases.PlantPhysiology132:1065-76.）。来自假单胞菌(Pseudomonasspp.)的酰基辅酶A合成酶已证明作用于中链脂肪酸如己酸（Fernandez-ValverdeM,RegleroA,Martinez-BlancoH,LuengoJM(1993)PurificationofPseudomonasputidaacylcoenzymeAligaseactivewitharangeofaliphaticandaromaticsubstrates.AppliedEnvironmentalMicrobiology59:1149-1154.）。
大麻素是珍贵的天然产物。编码涉及大麻素生物合成的酶的基因将可用于大麻代谢工程，以生产含极低水平或不含THCA的植物和通过靶向诱变（如TILLING）或其它基因敲除技术生产其它大麻素。这些基因还证明可用于经由标记物辅助的选择产生特定大麻种类，以用于生产基于大麻素的药物，或可用于在异源生物体如细菌或酵母中重建大麻素生物合成，或可用于在利用重组蛋白的无细胞系统中生产大麻素。
编码大麻素生物合成的酶的基因也用于大麻素类似物的合成和大麻素前体类似物的合成。在此之前，大麻素类似物已被合成并可用作药物产品。
本领域仍需要鉴定涉及芳香族聚酮合成的酶和编码这些酶的核苷酸序列。
发明内容
已经从大麻中发现两个新基因，其编码此前未知的烷酰基辅酶A合成酶。本文提到的这两个新的烷酰基辅酶A合成酶用大麻己酰辅酶A合成酶1（CsHCS1）和大麻己酰辅酶A合成酶2（CsHCS2）表示。
因此，本发明第一个方面提供一种分离或纯化的核酸分子，所述核酸分子包含与SEQIDNO:1具有至少75%序列同一性的核苷酸序列或其密码子简并序列。
本发明的第二个方面提供一种分离或纯化的核酸分子，所述核酸分子包含与SEQIDNO:3具有至少75%序列同一性的核苷酸序列或其密码子简并序列。
本发明的第三个方面提供一种分离或纯化的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:2具有至少85%序列同一性的氨基酸序列或其保守性置换的氨基酸序列。
本发明的第四个方面提供一种分离或纯化的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:4具有至少85%序列同一性的氨基酸序列或其保守性置换的氨基酸序列。
本发明的第五个方面提供一种包含本发明的核酸分子的载体、构建体或表达系统。
本发明的第六个方面提供一种用本发明的核酸分子转化的宿主细胞。
本发明的第七个方面提供一种在本发明的酶的存在下合成烷酰基辅酶A的方法。
本发明的第八个方面提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括使用本发明的核酸分子或其一部分在生物体、细胞或组织中使编码催化烷酰基辅酶A合成的酶的基因沉默。
本发明的第九个方面提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括使生物体、细胞或组织中的基团突变，并使用本发明的核酸分子筛选包含编码催化烷酰基辅酶A合成的酶的基因的突变体或变体的生物体、细胞或组织。
本发明的第十个方面提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括与在相似条件下培养但不表达或过表达核酸分子的相似种类的生物体、细胞或组织相比，在所述生物体、细胞或组织中表达或过表达本发明的核酸分子。
本发明的第十一个方面提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括与在相似条件下培养但不表达或过表达核酸分子的相似种类的生物体、细胞或组织相比，在所述生物体、细胞或组织中表达或过表达编码本发明的多肽的核酸分子。
本发明的第十二个方面提供一种在生物体、细胞或组织中合成天然存在的大麻素化合物或非天然存在的大麻素化合物类似物的方法，所述方法包括在羧酸和辅酶A的存在下表达本发明的核酸分子。
本发明的第十三个方面提供一种在体外无细胞反应中合成烷酰基辅酶A的方法，所述方法包括：在本发明的酶的存在下使羧酸与辅酶A反应。
催化烷酰基辅酶A合成的多肽是酶，并且编码这种酶的核苷酸序列现已经被鉴定和表征。所述核苷酸序列可用于通过育种、筛选或基因工程产生能够过量或不足量产生大麻素化合物、大麻素化合物类似物或其混合物的大麻植物。这些核苷酸序列还可单独或与编码大麻素合成途径中其它步骤的基因组合用于在其它植物或在微生物（如酵母、细菌、真菌）或其它原核或真核生物体或在无细胞系统中的大麻素生物合成工程。此外，阻断或降低大麻中这些基因的表达可以用来阻断大麻素生物合成，由此降低大麻素的产量。
根据以下的详细描述过程，本发明的进一步特征将得以阐释或变得显而易见。
附图简述
为了更清晰地理解本发明，结合附图将其实施例以示例的形式进行详细描述，其中：
图1示出一种在大麻中得到主要大麻素类型的建议途径。缩略语：THCA合成酶是Δ9-四氢大麻酚酸合成酶；CBDA合成酶是大麻二酚酸合成酶；CBCA合成酶是大麻环萜酚酸合成酶。
图2A-2F表示的是大麻己酰辅酶A合成酶的酶活性的液相色谱-质谱法/质谱法（LC-MS/MS）分析。图2A-2F的每幅图的垂直轴示出离子丰度（m/z866>359），水平轴示出时间（分钟）。图2A和2B表示真正的己酰辅酶A标准品的保留时间。图2C表示CsHCS1蛋白、辅酶A、MgCl2、己酸钠、ATP和HEPES缓冲液的分析，己酰辅酶A在其中生成并被检测。图2D表示CsHCS2蛋白、辅酶A、MgCl2、己酸钠、ATP和HEPES缓冲液的分析，己酰辅酶A在其中生成。图2E表示其中预先通过在95℃下煮沸15分钟灭活的CsHCS1蛋白、辅酶A、己酸钠、ATP和HEPES缓冲液的分析，没有己酰辅酶A在其中生成。图2F表示其中预先通过在95℃下煮沸15分钟灭活的CsHCS2蛋白、辅酶A、己酸钠、ATP和HEPES缓冲液的分析，没有己酰辅酶A在其中生成。
图3所示两个图表证明羧酸底物被本发明的酶利用。图3A表示羧酸底物被CsHCS1利用。图3B表示羧酸底物被CsHCS2利用。
图4示出通过耦合酶测定产生的产物的高效液相色谱法分析，所述耦合酶测定由大麻己酰辅酶A合成酶CsHCS2、丙二酰辅酶A合成酶（MCS）、大麻“戊基二羟基苯合成酶”/聚酮合成酶、和大麻戊基二羟基苯酸合成酶组成。通过263nm处的吸光度检测到洗脱的化合物，并通过具有与分离的标准品具有相同保留时间和通过采用单四级质量检测器测定它们的质量而鉴定。戊基二羟基苯和戊基二羟基苯酸的检测表明，CsHCS2能够为戊基二羟基苯酸的合成提供足够的己酰辅酶A底物。不含CsHCS2、辅酶A或己酸的测定中没有生成任何聚酮产物。HTAL=己酰三乙酸内酯，PDAL=戊基二乙酸内酯，OA=戊基二羟基苯酸，OL=戊基二羟基苯。
图5所示的图示出在酵母细胞中的戊基二羟基苯酸产生，所述酵母细胞被工程化以如下产生戊基二羟基苯酸：采用CsHCS1和CsHCS2合成己酰辅酶A，并使用大麻“戊基二羟基苯合成酶”/聚酮合成酶（PKS）和戊基二羟基苯酸合成酶（OAS）的融合蛋白来形成戊基二羟基苯酸。
图6示出CsHCS1、CsHCS2和CBDA合成酶在大麻品种“Finola”的不同组织中表达的qRT-PCR分析。将叶片表达赋值为1，将相对于肌动蛋白的基因表达值绘制为与叶片相比的倍数差异。插图示出在含毛状体和不含毛状体的雌花中的基因表达，其值也指示为与叶片相比的倍数差异。R表示根；S表示茎；L表示叶；FF+表示含毛状体的雌花；FF-表示采用Beadbeater法去除毛状体的雌花；T表示毛状体；MF表示雄花。值为平均值±SD，n=3。
优选实施例的描述
deom大麻的毛状体特异性cDNA文库经测序产生9157个表达序列标签（“EST”），其组装为4113个独特序列（1227个重叠群(contig)，2886个单一序列(singleton)）。采用名为blastx的在线搜索和比较工具，通过与UniProtTM蛋白质数据库比较对非重复基因序列进行注释。通过采用名为tblastn的在线搜索和比较工具，利用拟南芥酰基活化酶序列来查询组装的大麻EST，鉴别大麻酰基活化酶蛋白。根据在cDNA文库中的转录物丰度鉴别并命名了十一个酰基活化酶。CsHCS1是基于转录物水平的丰度最高（42EST）的酰基活化酶。CsHCS2有较低的丰度（5EST）。基于其在毛状体中的高转录水平和CsHCS1的定位于细胞质，可能该酶是涉及将己酰辅酶A供应给大麻素途径的酰基活化酶。CsHCS2定位于过氧化物酶体，可能不参与大麻素形成。但是，其动力学性质使得其成为用于在异源宿主或在无细胞系统中合成己酰辅酶A的有用的酶。
CsHCS1基因的序列如下所示：
大麻CsHCS1—2163bp（SEQIDNO:1）
ATGGGTAAGAATTACAAGTCCCTGGACTCTGTTGTGGCCTCTGACTTCATAGCCCTAGGTATCACCTCTGAAGTTGCTGAGACACTCCATGGTAGACTGGCCGAGATCGTGTGTAATTATGGCGCTGCCACTCCCCAAACATGGATCAATATTGCCAACCATATTCTGTCGCCTGACCTCCCCTTCTCCCTGCACCAGATGCTCTTCTATGGTTGCTATAAAGACTTTGGACCTGCCCCTCCTGCTTGGATACCCGACCCGGAGAAAGTAAAGTCCACCAATCTGGGCGCACTTTTGGAGAAGCGAGGAAAAGAGTTTTTGGGAGTCAAGTATAAGGATCCCATTTCAAGCTTTTCTCATTTCCAAGAATTTTCTGTAAGAAACCCTGAGGTGTATTGGAGAACAGTACTAATGGATGAGATGAAGATAAGTTTTTCAAAGGATCCAGAATGTATATTGCGTAGAGATGATATTAATAATCCAGGGGGTAGTGAATGGCTTCCAGGAGGTTATCTTAACTCAGCAAAGAATTGCTTGAATGTAAATAGTAACAAGAAATTGAATGATACAATGATTGTATGGCGTGATGAAGGAAATGATGATTTGCCTCTAAACAAATTGACACTTGACCAATTGCGTAAACGTGTTTGGTTAGTTGGTTATGCACTTGAAGAAATGGGTTTGGAGAAGGGTTGTGCAATTGCAATTGATATGCCAATGCATGTGGATGCTGTGGTTATCTATCTAGCTATTGTTCTTGCGGGATATGTAGTTGTTTCTATTGCTGATAGTTTTTCTGCTCCTGAAATATCAACAAGACTTCGACTATCAAAAGCAAAAGCCATTTTTACACAGGATCATATTATTCGTGGGAAGAAGCGTATTCCCTTATACAGTAGAGTTGTGGAAGCCAAGTCTCCCATGGCCATTGTTATTCCTTGTAGTGGCTCTAATATTGGTGCAGAATTGCGTGATGGCGATATTTCTTGGGATTACTTTCTAGAAAGAGCAAAAGAGTTTAAAAATTGTGAATTTACTGCTAGAGAACAACCAGTTGATGCCTATACAAACATCCTCTTCTCATCTGGAACAACAGGGGAGCCAAAGGCAATTCCATGGACTCAAGCAACTCCTTTAAAAGCAGCTGCAGATGGGTGGAGCCATTTGGACATTAGGAAAGGTGATGTCATTGTTTGGCCCACTAATCTTGGTTGGATGATGGGTCCTTGGCTGGTCTATGCTTCACTCCTTAATGGGGCTTCTATTGCCTTGTATAATGGATCACCACTTGTTTCTGGCTTTGCCAAATTTGTGCAGGATGCTAAAGTAACAATGCTAGGTGTGGTCCCTAGTATTGTTCGATCATGGAAAAGTACCAATTGTGTTAGTGGCTATGATTGGTCCACCATCCGTTGCTTTTCCTCTTCTGGTGAAGCATCTAATGTAGATGAATACCTATGGTTGATGGGGAGAGCAAACTACAAGCCTGTTATCGAAATGTGTGGTGGCACAGAAATTGGTGGTGCATTTTCTGCTGGCTCTTTCTTACAAGCTCAATCATTATCTTCATTTAGTTCACAATGTATGGGTTGCACTTTATACATACTTGACAAGAATGGTTATCCAATGCCTAAAAACAAACCAGGAATTGGTGAATTAGCGCTTGGTCCAGTCATGTTTGGAGCATCGAAGACTCTGTTGAATGGTAATCACCATGATGTTTATTTTAAGGGAATGCCTACATTGAATGGAGAGGTTTTAAGGAGGCATGGGGACATTTTTGAGCTTACATCTAATGGTTATTATCATGCACATGGTCGTGCAGATGATACAATGAATATTGGAGGCATCAAGATTAGTTCCATAGAGATTGAACGAGTTTGTAATGAAGTTGATGACAGAGTTTTCGAGACAACTGCTATTGGAGTGCCACCTTTGGGCGGTGGACCTGAGCAATTAGTAATTTTCTTTGTATTAAAAGATTCAAATGATACAACTATTGACTTAAATCAATTGAGGTTATCTTTCAACTTGGGTTTACAGAAGAAACTAAATCCTCTGTTCAAGGTCACTCGTGTTGTGCCTCTTTCATCACTTCCGAGAACAGCAACCAACAAGATCATGAGAAGGGTTTTGCGCCAGCAATTTTCTCACTTTGAATGA
CsHCS2基因的序列如下所示：
大麻CsHCS2—1547bp（SEQIDNO:3）
ATGGAGAAATCTTTTTCAGAAACTCATCTTCATACCCACAAAAGCCAGCTCTCATTGATTCCGAAACCAACCAAATACTCTCCTTTTCCCACTTCAAATCTACGGTTATCAAGGTCTCCCATGGCTTTCTCAATCTGGGTATCAAGAAAAACGACGTCGTTCTCATCTACGCCCCTAATTCTATCCACTTCCCTGTTTGTTTCCTGGGAATTATAGCCTCTGGAGCCATTGCCACTACCTCAAATCCTCTCTACACAGTTTCCGAGCTTTCCAAACAGGTCAAGGATTCCAATCCCAAACTCATTATCACCGTTCCTCAACTCTTGGAAAAAGTAAAGGGTTTCAATCTCCCCACGATTCTAATTGGTCCTGATTCTGAACAAGAATCTTCTAGTGATAAAGTAATGACCTTTAACGATTTGGTCAACTTAGGTGGGTCGTCTGGCTCAGAATTTCCAATTGTTGATGATTTTAAGCAGAGTGACACTGCTGCGCTATTGTACTCATCTGGCACAACGGGAATGAGTAAAGGTGTGGTTTTGACTCACAAAAACTTCATTGCCTCTTCTTTAATGGTGACAATGGAGCAAGACCTAGTTGGAGAGATGGATAATGTGTTTCTATGCTTTTTGCCAATGTTTCATGTATTTGGTTTGGCTATCATCACCTATGCTCAGTTGCAGAGAGGAAACACTGTTATTTCAATGGCGAGATTTGACCTTGAGAAGATGTTAAAAGATGTGGAAAAGTATAAAGTTACCCATTTGTGGGTTGTGCCTCCTGTGATACTGGCTCTGAGTAAGAACAGTATGGTGAAGAAGTTTAATCTTTCTTCTATAAAGTATATTGGCTCCGGTGCAGCTCCTTTGGGCAAAGATTTAATGGAGGAGTGCTCTAAGGTTGTTCCTTATGGTATTGTTGCTCAGGGATATGGTATGACAGAAACTTGTGGGATTGTATCCATGGAGGATATAAGAGGAGGTAAACGAAATAGTGGTTCAGCTGGAATGCTGGCATCTGGAGTAGAAGCCCAGATAGTTAGTGTAGATACACTGAAGCCCTTACCTCCTAATCAATTGGGGGAGATATGGGTGAAGGGGCCTAATATGATGCAAGGTTACTTCAATAACCCACAGGCAACCAAGTTGACTATAGATAAGAAAGGTTGGGTACATACTGGTGATCTTGGATATTTTGATGAAGATGGACATCTTTATGTTGTTGACCGTATAAAAGAGCTCATCAAATATAAAGGATTTCAGGTTGCTCCTGCTGAGCTTGAAGGATTGCTTGTTTCTCACCCTGAAATACTCGATGCTGTTGTGATTCCATTTCCTGACGCTGAAGCGGGTGAAGTCCCAGTTGCTTATGTTGTGCGCTCTCCCAACAGTTCATTAACCGAAAATGATGTGAAGAAATTTATCGCGGGCCAGGTTGCATCTTTCAAAAGATTGAGAAAAGTAACATTTATAAACAGTGTCCCGAAATCTGCTTCGGGGAAAATCCTCAGAAGAGAACTCATTCAGAAAGTACGCTCCAACATGTGA
如实施例1描述，CsHCS1和CsHCS2为PCR扩增序列且烷酰基辅酶A合成酶或辅酶A连接酶活性按实施例2描述测定。如图2所示，CsHCS1和CsHCS2催化烷酰基辅酶A由羧酸和辅酶A的产生。
本发明的一些实施例涉及分离或纯化的核酸分子，所述核酸分子具有SEQIDNO:1或与SEQIDNO:1具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性。
本发明的一些实施例涉及分离或纯化的核酸分子，所述核酸分子具有SEQIDNO:3或与SEQIDNO:3具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性。
更进一步地还包括杂交到上述公开的核酸序列的核酸分子。杂交条件可以是严格的，其中当与编码本发明的酶的核酸分子至少90%、95%或97%序列同一性时，杂交才能发生。严格的条件可以包括用于已知Southern杂交的那些条件，如在含有50%甲酰胺、5×SSC（150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠）、50mM磷酸钠（pH7.6）、5xDenhardt's溶液、10%硫酸葡萄糖、和20微克/毫升变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中在42℃下培养过夜，然后在约65℃下在0.1×SSC中洗涤杂交支承物。其它已知杂交条件是熟知的并描述于Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)。
本领域技术人员将理解，核酸序列的微小变化并不一定改变所编码多肽的氨基酸序列。本领域技术人员将理解，改变编码多肽的氨基酸序列的特定基因序列中核苷酸种类的改变会导致基因的有效性减少或增加，并且在一些应用中（如反义、共抑制或RNAi），部分序列常如全长形式一样有效起作用。如检测经改变基因的有效性的方法一样，可以改变或缩短核苷酸序列的方法是本领域技术人员熟知的。在某些实施例中，可以容易地测得有效性，例如，通过常规的气相色谱法。因此，所有所述基因的改变都包括作为本发明公开的一部分。
本领域技术人员将理解，以上描述的核酸分子的长度取决于其预期用途。例如，若预期用途是作为引物或探针，如用于PCR扩增或用于筛选文库，则核酸分子的长度将小于全长序列，如，15-50个核苷酸。在这些实施例中，引物或探针可以与核酸序列的高度保守区基本相同或可以与DNA序列的5’或3’末端基本相同。在一些情况下，这些引物或探针在一些位点可使用通用碱基来满足“基本相同”但又在序列识别中提供灵活性。值得注意的是，合适的引物和探针杂交条件是本领域熟知的。
本发明还包含CsHCS1酶。CsHCS1的氨基酸序列（SEQIDNO:2）为：
MGKNYKSLDSVVASDFIALGITSEVAETLHGRLAEIVCNYGAATPQTWINIANHILSPDLPFSLHQMLFYGCYKDFGPAPPAWIPDPEKVKSTNLGALLEKRGKEFLGVKYKDPISSFSHFQEFSVRNPEVYWRTVLMDEMKISFSKDPECILRRDDINNPGGSEWLPGGYLNSAKNCLNVNSNKKLNDTMIVWRDEGNDDLPLNKLTLDQLRKRVWLVGYALEEMGLEKGCAIAIDMPMHVDAVVIYLAIVLAGYVVVSIADSFSAPEISTRLRLSKAKAIFTQDHIIRGKKRIPLYSRVVEAKSPMAIVIPCSGSNIGAELRDGDISWDYFLERAKEFKNCEFTAREQPVDAYTNILFSSGTTGEPKAIPWTQATPLKAAADGWSHLDIRKGDVIVWPTNLGWMMGPWLVYASLLNGASIALYNGSPLVSGFAKFVQDAKVTMLGVVPSIVRSWKSTNCVSGYDWSTIRCFSSSGEASNVDEYLWLMGRANYKPVIEMCGGTEIGGAFSAGSFLQAQSLSSFSSQCMGCTLYILDKNGYPMPKNKPGIGELALGPVMFGASKTLLNGNHHDVYFKGMPTLNGEVLRRHGDIFELTSNGYYHAHGRADDTMNIGGIKISSIEIERVCNEVDDRVFETTAIGVPPLGGGPEQLVIFFVLKDSNDTTIDLNQLRLSFNLGLQKKLNPLFKVTRVVPLSSLPRTATNKIMRRVLRQFSHFE
一些实施例涉及分离或纯化的多肽，所述多肽具有SEQIDNO.2或与如SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
本发明还包含CsHCS2酶。CsHCS2的氨基酸序列（SEQIDNO:4）为：
MEKSGYGRDGIYRSLRPPLHLPNNNNLSMVSFLFRNSSSYPQKPALIDSETNQILSFSHFKSTVIKVSHGFLNLGIKKNDVVLIYAPNSIHFPVCFLGIIASGAIATTSNPLYTVSELSKQVKDSNPKLIITVPQLLEKVKGFNLPTILIGPDSEQESSSDKVMTFNDLVNLGGSSGSEFPIVDDFKQSDTAALLYSSGTTGMSKGVVLTHKNFIASSLMVTMEQDLVGEMDNVFLCFLPMFHVFGLAIITYAQLQRGNTVISMARFDLEKMLKDVEKYKVTHLWVVPPVILALSKNSMVKKFNLSSIKYIGSGAAPLGKDLMEECSKVVPYGIVAQGYGMTETCGIVSMEDIRGGKRNSGSAGMLASGVEAQIVSVDTLKPLPPNQLGEIWVKGPNMMQGYFNNPQATKLTIDKKGWVHTGDLGYFDEDGHLYVVDRIKELIKYKGFQVAPAELEGLLVSHPEILDAVVIPFPDAEAGEVPVAYVVRSPNSSLTENDVKKFIAGQVASFKRLRKVTFINSVPKSASGKILRRELIQKVRSNM
一些实施例涉及分离或纯化的多肽，所述多肽具有SEQIDNO.4或与如SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
一些实施例涉及含有分离或纯化的多核苷酸的载体、构建体或表达系统，所述多核苷酸具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的序列，或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。并且，提供了一种用于制备包含这样的序列或其部分的载体、构建体或表达系统的方法，用于将以有义或反义取向的序列或部分序列或其互补体引入细胞。
在一些实施例中，分离和/或纯化的核酸分子，或包含这些分离和/或纯化的核酸分子的载体、构建体或表达系统，可用于产生转基因生物体或生物体细胞，所述转基因生物体或生物体细胞产生催化芳香族聚酮的合成的多肽。因此，一个实施例涉及包含分离和/或纯化的核酸分子的转基因生物体、所述生物体的细胞或生殖组织，所述核酸分子具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
优选地，所述生物体是植物、微生物或昆虫。植物优选是大麻属，如大麻、印度大麻（CannabisindicaLam）和莠草大麻（CannabisruderalisJanisch）。特别优选的是大麻。微生物优选是细菌（如大肠杆菌（Escherichiacoli））或酵母（如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae））。昆虫优选是草地夜蛾（Spodopterafrugiperda）。
本实施例中的生物体、细胞和生殖组织可以具有改变的大麻素化合物。参照图1，本领域技术人员可以理解，本发明核酸分子的表达或过表达会导致催化己酰辅酶A合成的酶的表达或过表达，该己酰辅酶A与其它酶组合可以导致大麻素化合物的产生或产生增加，所述大麻素化合物如大麻萜酚酸（CBGA）、Δ9-四氢大麻酚酸（THCA）、大麻二酚酸（CBDA）、大麻环萜酚酸（CBCA）、Δ9-四氢大麻酚（THC）、大麻二酚（CBD）、大麻环萜酚（CBC）等。相似地，基于使用的底物，导致催化己酰辅酶A合成的酶的表达或过表达的本发明核酸分子的表达或过表达可以导致大麻素化合物类似物或此类化合物的前体的类似物的产生或产生增加。
生物体、细胞或组织中该基因的沉默会导致酶的低表达，这可以造成前体的积累，所述前体如己酸（六个碳）、辛酸（八个碳）、壬酸（九个碳）、戊酸（五个碳）、庚酸（七个碳）或其它羧酸，和/或大麻素如THCA（THC的前体）或CBDA（CBD的前体）的减少。
本发明包括一个改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，该方法如下进行：与在相似条件下培养但不表达或过表达本发明的外源酶的相似种类的生物体、细胞或组织相比，在所述生物体、细胞或组织中表达或过表达本发明的外源酶。
本发明核酸分子的表达或过表达可以结合编码大麻素生物合成途径中一种或多种酶的一种或多种其它核酸的表达或过表达来完成。其它核酸的一些实例包括编码下述酶的那些：Ⅲ型聚酮合成酶、聚酮环化酶、芳香族异戊二烯转移酶和大麻素生成氧化酶(cannabinoid-formingoxidocylase)。这些酶的具体实例包括“戊基二羟基苯合成酶”/聚酮合成酶、戊基二羟基苯酸合成酶、香叶基焦磷酸:戊基二羟基苯酯香叶基转移酶、Δ9-四氢大麻酚酸合成酶、大麻二酚酸合成酶或大麻环萜酚酸合成酶。在本发明的酶多肽的存在下，烷酰基辅酶A的合成可以在体内或体外完成。如前面所提到的，此类体内合成可通过在生物体、细胞或组织中表达或过表达本发明的核酸分子来完成。
烷酰基辅酶A的体外合成可发生在无细胞系统中。作为体外无细胞系统的一部分，可以将本发明的羧酸和酶在合适的反应容器中一起混合进行反应。
在体外，本发明的多肽也可用于与其它酶组合以实现从前体到大麻素化合物的完整合成。例如，此类其它酶可以与图1所述大麻素生物合成途径有关（如“戊基二羟基苯合成酶”PKS、戊基二羟基苯酸合成酶、芳香族异戊二烯转移酶、THCA合成酶、CBDA合成酶、CBCA合成酶）。
本发明的多肽可体内或体外用于合成大麻素化合物类似物，所述类似物不天然存在于宿主物种内。此类类似物可使用羧酸化合物产生，所述羧酸化合物不是植物中用于产生天然大麻素化合物的那些。例如，乙酸、丁酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、支链酸如异戊酸、和羟基肉桂酸如肉桂酸。
术语：
为了便于理解本文公开的各实施例，具体术语的解释如下：
烷酰基辅酶A：烷酰基辅酶A是含有通过硫化物桥键合到羰基碳原子上的辅酶A部分的脂肪族羰基化合物。优选的烷酰基辅酶A化合物在化合物的脂肪族羰基部分中含2到10个碳原子。更优选地，烷酰基辅酶A是CoA-S-C(O)-(CH2)n-CH3，其中n是0到8的整数。烷酰基辅酶A化合物的一些实例有：乙酰辅酶A、丁酰辅酶A、己酰辅酶A和辛酰辅酶A。乙酰辅酶A的使用为所得芳香族聚酮提供甲基侧链；丁酰辅酶A的使用提供丙基侧链；己酰辅酶A的使用提供戊基侧链。己酰辅酶A是特别优选的。大麻中存在含较短侧链的大麻素（如具有丙基侧链的四氢次大麻酚酸而不是含戊基侧链的THCA）。
密码子的简并性：将被理解的是，本公开内容涵盖本领域普通技术人员可以理解的密码子简并用法，如表1所示。
表1密码子简并性
氨基酸 密码子
Ala/A GCT，GCC，GCA，GCG
Arg/R CGT，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG
Asn/N AAT，AAC
Asp/D GAT，GAC
Cys/C TGT，UGC
Gln/Q CAA，CAG
Glu/E GAA，GAG
Gly/G GGT，GGC，GGA，GGG
His/H CAT，CAC
Ile/I ATT，ATC，ATA
Leu/L TTA，TTG，CTT，CTC，CTA，CTG
Lys/K AAA，AAG
Met/M ATG
Phe/F TTT，TTC
Pro/P CCT，CCC，CCA，CCG
Ser/S TCT，TCC，TCA，TCG，AGT，AGC
Thr/T ACT，ACC，ACA，ACG
Trp/W TGG
Tyr/Y TAT，TAC
Val/V GTT，GTC，GTA，GTG
START ATG
Stop TAG，TGA，TAA
互补的核苷酸序列：序列的“互补的核苷酸序列”理解为表示其核苷酸与本文公开序列的核苷酸是互补的并且其取向是相反的（反向平行序列）的任一核酸分子。
保守性置换：本领域技术人员理解，保守性置换可以发生在多肽的氨基酸序列中，且不破坏该多肽的三维结构或功能。因此，本发明包括含保守性置换的CsHCS1和CsHCS2的多肽。技术人员通过彼此替换具有相似疏水性、极性和R-链长度的氨基酸来完成保守性置换。此外，通过比较来自不同物种的同源蛋白的比对序列，可以通过定位物种之间已突变的氨基酸残基且编码的蛋白质的基本功能没有改变来鉴定保守性置换。表2提供了保守性置换的示例列表。
表2保守性置换
氨基酸类型 可置换的氨基酸
疏水性 Ala，Pro，Gly，Glu，Asp，Gln，Asn，Ser，Thr
巯基 Cys
脂肪族 Val，Ile，Leu，Met
碱性 Lys，Arg，His
芳香族 Phe，Tyr，Trp
序列同源性程度或百分比：术语“序列同源性程度或百分比”是指最适比对后两个序列之间的序列同一性程度或百分比。
同源的分离和/或纯化的序列：“同源的分离和/或纯化的序列”理解为是指分离和/或纯化的序列，所述序列与核苷酸序列的碱基或多肽序列的氨基酸具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、或99.7%的同一性百分比。该百分比为纯统计学的，并且可能在两条核苷酸或氨基酸序列之间随机或在其全长上分布差异。序列的同一性可以通过，例如，设计为执行单个和多重序列比对的计算机程序进行测定。
增加、减少、调节、改变等：本领域技术人员将理解，此类术语是指与在相似条件下但是没有导致增加、减少、调节或改变的修饰的相似品种或品系生长的比较。在一些情况下，其可以为未经转化的对照、经假转化的对照、或经载体转化的对照。
分离：本领域技术人员将理解，“分离”是指已从其天然环境中“分离”的多肽或核酸。
核苷酸、多核苷酸、或核酸序列：“核苷酸、多核苷酸、或核酸序列”将理解为是指单体和二聚体（所谓串联）形式的双链或单链及其转录产物。
序列同一性：当两条序列中的氨基酸或核苷酸序列如下文所述进行最大匹配度比对时两者相同，则两条氨基酸或核苷酸序列被称为“同一的”。序列同一性百分比（或同一性程度）通过在比较窗口比较两条最佳比对序列测定，其中比较窗口中的多肽或多核苷酸序列的部分与用于两条序列最佳比对的参考序列（不包含添加或缺失）相比可能含添加或缺失（如，间隔）。百分比如下计算：测定在两条序列中出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位点的数量从而得到配对位点的数量，将配对位点的数量除以比较窗口中位点的总数量，然后将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可通过Smith和WatermanAd.App.Math2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性算法、Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的相似性检索法、这些算法的计算机化实现（WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr.,Madison,Wis.)、或者肉眼检查来进行。
上述给出的序列同一性的定义是本领域技术人员使用的定义。定义本身无需任何算法的帮助，所述算法只有在得到序列最佳比对时有帮助，而不是在序列同一性的计算中有帮助。
从上述给出的定义，可以得出两个比较序列之间的序列同一性仅有一个准确定义且唯一的值，该值与最佳或最适比对序列得到的值相对应。
严格杂交：在严格条件下与核苷酸序列杂交理解为表示在选择的温度和离子强度的条件下杂交，所述条件使得它们允许在两个互补的核酸分子片段之间维持杂交。
本文描述的从其它生物体获得的新基因的同系物，例如，从植物中，可通过筛选包含同系物的合适文库来获得，其中筛选使用本发明特定基因的核苷酸序列或其部分或探针来进行，或通过使用如BLAST或FASTA的序列比对检索程序进行序列同源性检索来鉴定。
核酸的分离和克隆是熟知的。类似地，分离的基因可以插入到载体中并通过本领域技术人员已知的常规技术手段转化至细胞中。核酸分子可转化至生物体中。如本领域已知，可以通过多种方法将基因、载体、构建体和表达系统引入到生物体中，并且转化和组织培养技术的组合已经成功地整合成为用于产生转基因生物体的有效策略。可用于本发明中的这些方法已经在其它地方描述过（PotrykusI(1991)Genetransfertoplants:Assessmentofpublishedapproachesandresults.Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.42:205-225；VasilIK(1994)Molecularimprovementofcereals.PlantMol.Biol.25:925-937.WaldenR,WingenderR(1995)Gene-transferandplantregenerationtechniques.TrendsinBiotechnology13:324-331；SongstadDD,SomersDA,GriesbachRJ(1995)AdvancesinalternativeDNAdeliverytechniques.PlantCellTissueOrganCult.40:1-15），并为本领域人员所熟知。
合适的载体为本领域技术人员所熟知并描述于通用技术参考文献如Pouwels等，CloningVectors.ALaboratoryManual,Elsevier,Amsterdam(1986)。特别合适的载体包括Ti质粒载体。例如，本领域技术人员可以确定地知道，除了通过真空浸染（BechtoldN,EllisJ,PelletierG(1993)InplantaAgrobacterium-mediatedgenetransferbyinfiltrationofadultArabidopsisthalianaplants.CRAcadSciParis,Sciencesdelavie/Lifesciences316:1194-1199.）或伤口接种（KatavicV,HaughnGW,ReedD,MartinM,KunstL(1994)InplantatransformationofArabidopsisthaliana.Mol.Gen.Genet.245:363-370.）的农杆菌（Agrobacterium）介导的拟南芥转化，同样可以使用农杆菌Ti质粒介导的转化来转化其它植物品物种（如下胚轴（DeBlockM,DeBrouwerD,TenningP(1989)TransformationofBrassicanapusandBrassicaoleraceausingAgrobacteriumtumefaciensandtheexpressionofthebarandneogenesinthetransgenicplants.PlantPhysiol.91:694-701）或子叶叶柄（MoloneyMM,WalkerJM,SharmaKK(1989)HighefficiencytransformationofBrassicanapususingAgrobacteriumvectors.PlantCellRep.8:238-242.）伤口浸染、粒子轰击/基因枪法（SanfordJC,KleinTM,WolfED,AllenN(1987)Deliveryofsubstancesintocellsandtissuesusingaparticlebombardmentprocess.J.Part.Sci.Technol.5:27-37.）或聚乙二醇辅助的原生质体转化法（RhodesCA,PierceDA,MettlerIJ,MascarenhasD,DetmerJJ(1988)Geneticallytransformedmaizeplantsfromprotoplasts.Science240:204-207）。
对本领域技术人员来说同样明显的是，如其它地方描述的（MeyerP(1995)Understandingandcontrollingtransgeneexpression.TrendsinBiotechnology13:332-337；DatlaR,AndersonJW,SelvarajG(1997)Plantpromotersfortransgeneexpression.BiotechnologyAnnualReview3:269-296），可以利用可操作地连接到核酸分子的启动子来指导任何预期上调或下调的转基因表达，其中使用非调节（即组成型）启动子（如基于CaMV35S的那些启动子），或通过使用下述启动子：所述启动子可以使基因表达靶向至特定细胞、组织（如用于转基因在发育种子子叶中表达的napin启动子）、器官（如，根）或特定的发育阶段或响应于特定外界刺激（如，热激）。
本发明使用的启动子可以是诱导型的、组成型的、或组织特异性的或具有这些特性的不同组合。有用的启动子包括，但不限于，组成型启动子,如香石竹蚀环病毒（CERV）启动子、花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、或更特别的是包含两个串联的CaMV35S启动子（被称为“双35S”启动子）的双重增强的花椰菜花叶病毒启动子。在某些情况下，可能需要使用组织特异性或发育调节启动子代替组成型启动子。组织特异性启动子允许在某些组织中过表达而不影响在其它组织中的表达。
启动子和终止调节区在宿主细胞中有功能且对细胞和基因而言可以是异源的（即，非自然存在的）或同源的（源自宿主物种的）。
终止调节区可以源自获得启动子的基因的3’区，或来自另一基因。可用的合适终止区是本领域熟知的，包括根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶终止子（Tons），根癌农杆菌甘露碱合成酶终止子（Tmas）和CaMV35S终止子（T35S）。用于本发明的特别优选的终止区包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亚基终止区（TrbcS）或Tnos终止区。用于本发明的基因构建体可以适用于活性筛选，例如，通过经由农杆菌转化至宿主植物中并筛选改变的大麻素水平。
本发明的核酸分子或其片段可用于阻断生物体中天然产生大麻素化合物的大麻素生物合成。使用本发明核酸分子的沉默可通过本领域公知的多种方法完成，例如，RNA干扰技术（RNAi）、人工微小RNA技术、病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术、反义技术、有义共抑制技术和靶点诱变技术。
RNAi技术涉及用RNA干扰（RNAi）质粒构建体的稳定转化（HelliwellCA,WaterhousePM(2005)ConstructsandmethodsforhairpinRNA-mediatedgenesilencinginplants.MethodsEnzymology392:24-35）。此类质粒由将要沉默的目的基因的片段以反向重复结构组成。反向重复片段通过通常为内含子的间隔子隔开。RNAi构建体通过合适的启动子驱动，例如，花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子，所述RNAi构建体被整合到植物基因组中，随后转基因的转录使RNA分子自身折回形成双链发夹RNA。该双链RNA结构可被植物识别并切割成被称为小干扰RNA（siRNA）的小RNA（大约21个核苷酸长）。所述siRNA与蛋白质复合物（RISC）相关，所述蛋白质复合物继续指导目的基因的mRNA的降解。
人工微小RNA（amiRNA）技术利用微小RNA（miRNA）途径，所述途径在植物和其它真核生物内起使内源基因沉默的作用（SchwabR,OssowskiS,RiesterM,WarthmannN,WeigelD(2006)HighlyspecificgenesilencingbyartificialmicroRNAsinArabidopsis.PlantCell18:1121-33；AlvarezJP,PekkerI,GoldshmidtA,BlumE,AmsellemZ,EshedY(2006)EndogenousandsyntheticmicroRNAsstimulatesimultaneous,efficient,andlocalizedregulationofmultipletargetsindiversespecies.PlantCell18:1134-51）。在该方法中，待沉默基因的21个核苷酸长的片段被引入到pre-miRNA基因中形成pre-amiRNA构建体。pre-amiRNA构建体利用本领域技术人员显而易见的转化方法转移到生物体基因组中。pre-amiRNA转录后，处理得到amiRNA，所述amiRNA靶向与该21个核苷酸的amiRNA序列共有核苷酸同一性的基因。
在RNAi沉默技术中，有两个因素能影响片段长度的选择。片段越短越不易达到有效沉默，但过长的发夹会增加细菌宿主菌株重组的机会。沉默的有效性也表现出了基因依赖性并能反映目标mRNA的可访问性或目标mRNA和基因被激活的细胞中的发夹RNA的相对丰度。100至800bp、优选300至600bp的片段长度通常适于使得到的沉默效率最大化。另一个考虑是待靶向的目的基因部分的。可以使用5’UTR、编码区和3’UTR片段，得到同样好的结果。由于沉默机制依赖于序列同源性，涉及的mRNA序列存在交叉沉默的可能性。这种交叉沉默是不可取的，因此应当选择与其它序列有低序列相似性的区域，如5’或3’UTR。避免同源交叉沉默出现的规则是使用这样的序列：所述序列在构建体与非目标基因序列之间不含超过20个碱基的序列同一性的块。许多这些同样的原则适用于设计amiRNA目标区域的选择。
病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术是一种变型的RNAi技术，它利用了植物的内源抗病毒防御性。用包含宿主DNA片段的重组VIGS病毒浸染植物导致目标基因的转录后基因沉默。在一个实施例中，基于烟草脆裂病毒（TRV）的VIGS系统可与本发明的核苷酸序列一起使用。
反义技术涉及向植物中引入反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与由目的基因产生的信使RNA（mRNA）结合。“反义”寡核苷酸具有与基因的信使RNA（mRNA）互补的碱基序列，这一序列被称为“有义”序列。mRNA的有义片段的活性被反义mRNA片段阻断，由此有效地灭活基因表达。导致植物中基因沉默的反义的应用更详细地描述于StamM,deBruinR,vanBloklandR,vanderHoornRA,MolJN,KooterJM(2000)Distinctfeaturesofpost-transcriptionalgenesilencingbyantisensetransgenesinsinglecopyandinvertedT-DNArepeatloci.PlantJ.21:27-42。
有义共抑制技术涉及向植物中引入高表达的有义转基因，其结果是降低转基因和内源基因的表达（DepickerA,MontaguMV(1997)Post-transcriptionalgenesilencinginplants.CurrOpinCellBiol.9:373-82）。效果取决于转基因与内源基因之间的序列同一性。
靶向诱变技术，例如TILLING（靶向诱导基因组局部损伤技术）和使用快中子轰击的“基因缺失”，可用于敲除生物体中的基因功能（HenikoffS,TillBJ,ComaiL(2004)TILLING.Traditionalmutagenesismeetsfunctionalgenomics.PlantPhysiol135:630-6；LiX,LassnerM,ZhangY.(2002)Deleteagene:afastneutrondeletionmutagenesis-basedgeneknockoutsystemforplants.CompFunctGenomics.3:158-60）。TILLING涉及用诱变剂处理种质或单个细胞从而产生点突变，然后用灵敏的单核苷酸突变检测方法来发现目的基因中的点突变。检测所需的突变（例如，导致目的基因产物失活的突变）可以通过例如PCR技术来完成。例如，可制备源自目的基因的寡核苷酸引物，PCR可用于从诱变种群中的生物体中扩增目的基因区域。扩增的突变基因可被退火至野生型基因，从而发现突变基因与野生型基因之间的错配。检测到的差异可以追溯到含有突变基因的生物体，由此揭示哪个诱变生物体具有所需的表达（例如，目的基因的沉默）。然后这些生物体可以被选择性繁殖从而产生具有所需表达的群体。TILLING可以提供包含错义和敲除突变的等位基因系列，这表现为靶基因表达的降低。TILLING被看作是一种不涉及转基因引入、因此可更易被消费者接受的基因敲除可能方法。快中子轰击诱导生物体基因组的突变，即“缺失”，也可用类似于TILLING的PCR方法检测。
本领域技术人员可以理解的是，本发明的方法还可以在有一种或多种羧酸存在的无细胞环境中实施。
本发明的实施例可以允许除了本文包含的特定实施例外的各种修饰和替换形式。因此，本发明的实施例并不局限于所公开的具体形式。
实施例：
实施例1：CsHCS1和CsHCS2的扩增和克隆
CsHCS1和CsHCS2利用表3所列引物和PhusionTM聚合酶（Finnzymes）从cDNA质粒克隆进行PCR扩增。PCR产物纯化并克隆到pCR8/GW/TOPO入门载体（Invitrogen）中。在转化到大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen）中后，单个克隆通过测序进行验证。CsHCS1和CsHCS2基因通过LR重组酶（Invitrogen）重组到pHIS8/GW目的载体中。将LR反应产物转化到TOP10细胞中并通过测序进行验证。
表3：寡核苷酸
名称 序列(5’-3’)
CsHCS1正向(SEQ ID NO:5) ATGGGTAAGAATTACAAGTCCCT
CsHCS1反向(SEQ ID NO:6) GAGCTCTCATTCAAAGTGAGAAAATTGCTG
CsHCS2正向(SEQ ID NO:7) ATGGAGAAATCTGGGTATGGAAG
CsHCS2反向(SEQ ID NO:8) TCACATGTTGGAGCGTACTTTC
MCS正向(SEQ ID NO:9) ATGAGCAACCATCTTTTCGACG
MCS反向(SEQ ID NO:10) TTACGTCCTGGTATAAAGATCGGC
pHIS8/GW-CsHCS1和pHIS8/GW-CsHCS2被转化到大肠杆菌Rosetta2细胞（Merck）中。将单个菌落用于接种包含氯霉素和卡那霉素的LB液体培养基的小规模培养物，所述小规模培养物用于接种不含抗生素的500mlLB液体培养基。在生长至OD600为0.6后，通过添加IPTG至0.2μM诱导表达。然后表达CsHCS1的培养物在12℃下振摇培养24小时，而CsHCS2培养物在37℃下培养16小时。之所以使用不同的温度是因为观察到CsHCS1在较高温度下没有产生可溶性蛋白。
离心收集细胞并再次悬浮于10mlHis-tag裂解缓冲液（50mMTris-HClpH7、500mMNaCl、2.5mM咪唑、10%v/v甘油、10mMβ-巯基乙醇、1%v/vTweenTM20和750μg/mL溶菌酶)中。将重新悬浮的细胞在冰上孵育1小时，然后通过超声处理裂解。以12000g在4℃下离心分离20min后，可溶性蛋白部分加入到预先用His-tag洗涤缓冲液（HWB；50mMTris-HClpH7、500mMNaCl、2.5mM咪唑、10%甘油、10mMβ-巯基乙醇）洗涤处理的160μL的TalonTM树脂（Clontech）中。试样在4℃下温和振摇培养，然后该树脂通过离心分离（700g，5min）。所述树脂重新悬浮于HWB缓冲液中并在4℃下温和振摇洗涤后离心。随后洗涤步骤重复两次，然后重新悬浮的树脂被装于层析柱后使其排水。用10mLHWB缓冲液洗涤树脂后，His-标记的蛋白通过加入2.5mLHis-tag洗脱缓冲液（50mMTris-HClpH7、500mMNaCl、250mM咪唑、10%v/v甘油、10mMβ-巯基乙醇）洗脱。使用PD10柱（AmershamBiosciences）将洗脱液缓冲交换为存储缓冲液（50mMHEPESpH9、10%v/v甘油、2mMMgCl2和2mM二硫苏糖醇）。分离的蛋白的纯度通过SDS-PAGE验证，并且用Bradford法测定蛋白质的浓度。
实施例2：己酰辅酶A合成酶活性的分析
己酰辅酶A合成酶的活性通过在20μL反应混合物中培养0.1μg的酶测定，所述反应混合物包含50mMHEPESpH9、8mMATP、10mMMgCl2、0.5mMCoA和4mM己酸钠。将反应在40℃下孵育10min，然后用2μL的1NHCl终止反应并储存于冰上直至分析。
用水将反应混合物按1:100稀释，随后用装有AcquityUPLCBEHC18柱(1.7μm粒径，2.1x50mm柱)的WatersAcquityUPLC系统将反应混合物分离，并通过MS/MS用MicromassQuattroUltima三重四级质谱仪进行分析。所用的溶剂系统为缓冲液A：5mMTEA和溶于水的3mM醋酸，和缓冲液B：5mMTEA和溶于95:5甲醇:水的3mM醋酸。流动程序示于表4。质谱仪设置为：ESI正离子模式，碰撞能量27V，锥135V，866>359转换扫描。
表4：液相色谱的流动程序
时间（min） 流速（mL/min） %A %B
0 0.2 94.7 5.3
1 0.2 94.7 5.3
6 0.2 85.0 15.0
10 0.2 0.1 50.0
21 0.2 0.1 99.9
22 0.8 0.1 99.9
24 0.8 0.1 99.9
24.1 0.4 94.7 5.3
27 0.4 94.7 5.3
27.1 0.2 94.7 5.3
如图2所示，CsHCS1和CsHCS2催化从己酸和辅酶A到己酰辅酶A的形成。图2A和2B示出真实的己酰辅酶A标准物的洗脱。图2C示出对包含CsHCS1、50mMHEPESpH9、8mMATP、10mMMgCl2、0.5mMCoA和4mM己酸钠的完整的分析。在9.25分钟可以观察到与真实的己酰辅酶A标准物具有相同质量转变和洗脱时间的化合物。图2D示出对包含CsHCS2、50mMHEPESpH9、8mMATP、10mMMgCl2、0.5mMCoA和4mM己酸钠的完整的分析。在9.25分钟可以观察到与真实的己酰辅酶A标准物具有相同质量转变和洗脱时间的化合物。图2E和2F示出具有灭活（经煮沸）的CsHCS1和CsHCS2酶的阴性对照。从图2E和2F可以看出，这些分析示出没有己酰辅酶A合成。
CsHCS1和CsHCS2都表现出温度和pH分别最佳为40℃和pH为9。在二价阳离子范围的实验中，CsHCS1最佳使用Mg2+并使用Mn2+和Co2+则程度较低。CsHCS2的活性在使用Co2+时最高，但使用Mn2+和Mg2+也观察到较高的活性，并且使用Ca2+则程度较低。使用Co2+的高活性的生物相关性并不明确且Mg2+被用于进一步的实验中。
使用己酸，CsHCS1的Km为6.1±1.0mM，Vmax为15.6±1.7pKat，kcat为4.5sec-1。CsHCS2的Km为320nM，Vmax为1.7pKat，kcat为57.6sec-1。
实施例3：使用不同羧酸的实验
为了测试CsHCS1和CsHCS2可以活化的羧酸的范围，用宽范围的羧酸和限制性ATP进行了酶测定。采用的测定条件与SchneiderK等(2005)中的相似。来自拟南芥的新型过氧化物酰基辅酶A合成酶具有活化茉莉酸的生物合成前体的能力。TheJournalofBiologicalChemistry,280:13962-72。简言之，纯化的HCS酶（1μg）与500μM羧酸底物和100μM辅酶A一起孵育在包含pH为9的100mMHEPES、250μMMgcl2、50μMATP和1mMDTT的测定中。所有羧酸底物都溶解于2%v/vTritonTMX-100中，导致测定中终浓度为0.05%TritonX-100。在29℃下反应3h后，将10μL等分的反应物转移至96孔板中进行基于荧光素/荧光酶的未消耗的ATP的测量。该板用1420Multilabel计数器（PerkinElmer）进行分析。向每个孔中注入90μL包含pH7.8的100mMTris、1mMMgCl2、2.3μg荧光素和0.5μg荧光酶的溶液，振摇2秒钟后荧光度在不具有适当滤光器的情况下测定15秒。与没有羧酸底物的反应物相比，较低读数表明较高量的酶活性和因此的底物利用。结果示于图3，其中误差棒代表比率的误差百分比，n=3。
如图3A所示，可观察到CsHCS1利用己酸（六个碳）、辛酸（八个碳）和壬酸（九个碳），并较小程度地利用戊酸（五个碳）和庚酸（七个碳）作为底物。相比之下，如图3B所示，CsHCS2表现出更强的混杂性，其能利用从丙酸（C3）到廿酸（C20）的宽范围的底物，和多种苯丙素（肉桂酸、阿魏酸，并在较小程度上利用香豆酸）。
在一个独立的实验中，更精确测定了CsHCS1和CsHCS3对辅酶A和代表性短链（丁酸）、中链（己酸和癸酸）和长链（棕榈酸）脂肪酸（表5）的动力学参数。高辅酶A浓度抑制CsHCS1。利用非线性回归底物抑制模型，CsHCS1的Ki估计为5.101±1.8mM。在测试浓度下辅酶A没有抑制CsHCS2。癸酸抑制CsHCS2（Ki=120.8±47.9μM）并在浓度大于4mM（Ki未测定）时轻微抑制CsHCS1。这些数据与上述动力学数据显示了相同的趋势。
表5：CsHCS1和CsHCS2的动力学性质
a由于缺乏催化活性未测定
实施例4：用CsHCS2的戊基二羟基苯酸的合成
CsHCS2被用于芳香族聚酮戊基二羟基苯酸的酶化学合成。戊基二羟基苯酸是大麻素生物合成的第一关键前体。其体外合成利用了4种重组酶：CsHCS2、来自根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)的丙二酰辅酶A合成酶（MCS）、来自大麻的“戊基二羟基苯合成酶”/聚酮合成酶、和来自大麻的戊基二羟基苯酸合成酶。
丙二酰辅酶A合成酶（MCS）是利用MCS正向和MCS反向（见表3）引物从根瘤菌的基因组DNA扩增得到的。PCR产物克隆到pCR8/GW/TOPO载体（Invitrogen）中并重组到pHIS8/GW载体中。通过测序验证后，将质粒转移到大肠杆菌RosettaⅡ（DE3）中。重组的MCS得到表达并按照如对于CsHCS酶所述进行纯化。
“戊基二羟基苯合成酶”/聚酮合成酶和戊基二羟基苯酸合成酶的克隆、表达和纯化按如下进行。对于在大肠杆菌细胞中表达，聚酮合成酶/戊基二羟基苯合成酶和戊基二羟基苯酸合成酶的开放阅读框通过PCR扩增得到，克隆到pHIS8/GW（对于聚酮合成酶/戊基二羟基苯合成酶）或pET100（Invitrogen）（对于戊基二羟基苯酸合成酶）中并转化到大肠杆菌BL21（DE3）（Invitrogen）中。克隆通过测序验证。
戊基二羟基苯酸合成酶在200mL极品肉汤培养基上表达，而聚酮合成酶/戊基二羟基苯合成酶在1L中培养。两个培养物在30℃/150rpm下振摇，用0.5μMIPTG诱导并培养过夜。以16,000g离心培养物20min，并通过溶菌酶和超声波处理将沉淀物裂解。澄清的裂解物与Talon树脂（对于戊基二羟基苯酸合成酶为200μL，对于聚酮合成酶/戊基二羟基苯合成酶为1mL；Clontech）混合，用5mL的His-tag洗涤缓冲液（50mMTris-HCl（pH为7）、150mMNaCl、20mM咪唑、10mMβ-巯基乙醇）洗涤，且利用His-tag洗脱缓冲液（20mMTrisHCl（pH为7）、150mMNaCl、20mM咪唑、10mMβ-巯基乙醇）洗脱重组蛋白。洗脱液通过使用YM10浓缩器浓缩并缓冲交换为储存缓冲液（20mMHEPES（pH为7.5）、25mMNaCl、10%甘油、5mMDTT）。最终的蛋白质溶液通过使用RC/DC蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad）定量，发现0.5mg/mL（戊基二羟基苯酸合成酶）和5.6mg/mL（聚酮合成酶/戊基二羟基苯合成酶）的蛋白质浓度。SDS-PAGE凝胶分析验证两种蛋白质的纯度。
利用廉价的试剂连接己酰辅酶A合成与芳香族聚酮合成的能力通过进行酶测定测试，所述酶测定由4mM己酸、8mM丙二酸、0.4mMCoA、0.4mMATP、5mMMgCl2、2mMDTT、20mMHEPESpH7.5、0.3μgCsHCS2、12μgMCS、8μg“戊基二羟基苯合成酶”/PKS和10μgOAS组成。该反应在室温下孵育16h，然后酸化并用乙酸乙酯萃取。极性馏分回收，蒸发至干燥并再次悬浮于50μL甲醇中。使用LCMS对等分试样（5μL）进行分析，且产物通过他们的保留时间和质量（见图4）确定。
实施例5：利用CsHCS1和CsHCS2在酵母中合成戊基二羟基苯酸
酵母（酿酒酵母）通过用CsHCS1与CsHCS2合成己酰辅酶A，和用大麻“戊基二羟基苯合成酶”/聚酮合成酶（PKS）与戊基二羟基苯酸合成酶（OAS）的融合蛋白形成戊基二羟基苯酸进行工程改造，来生产戊基二羟基苯酸。
利用pESC-Trp酵母表达载体中处于GAL10启动子控制下的编码氨基酸AATSGSTGSTGSTGSGRSTGSTGSTGSGRSHMV（SEQIDNO:11）的合成连接序列，将OAS与“戊基二羟基苯合成酶”/PKS整框克隆。通过Gateway技术，CsHCS1的开放阅读框被克隆到酵母表达载体pYESDEST52-Ura（Invitrogen）中。CsHCS2的开放阅读框被克隆到pESC-Trp酵母表达载体（Stratagene）中处于GAL1启动子的控制下。
酵母细胞（InVScI,Invitrogen）用上述构建体（OAS:仅“戊基二羟基苯合成酶”/PKS融合蛋白，OAS:“戊基二羟基苯合成酶”/PKS融合蛋白和CsHCS1；OAS:“戊基二羟基苯合成酶”/PKS融合蛋白和CsHCS2）转化且转化体在SD-Trp板上28℃下生长3天。对于每个板，单个菌落都接种到3mLSD-Trp葡萄糖培养基中并在28℃下振摇孵育2天。0.5mL起始培养物的等分试样用于接种含1mM己酸钠的10mLSD-Trp葡萄糖培养基并在20℃下培养4天。整个培养物用乙酸乙酯萃取，干燥并将残余物再次悬浮于100μL的30%乙腈/70%水/0.05%甲酸中。产物用LCMS分析（见图5）。
实施例6：CsHCS1和CsHCS2在植物中大麻素生物合成中的作用
通过基于序列的毛状体EST数据集分析和5种AAE的生物化学测定，鉴定了两种具有己酰辅酶A合成酶活性（CsHCS1和CsHCS2）。为了确定这些序列中哪个可能涉及大麻素的生物合成途径，进行了qRT-PCR和亚细胞定位实验。
CsHCS1和CsHCS2表达的qRT-PCR
“Finola”植物从种子生长直至中旬开花期。从三株植物进行根、茎、叶、雌花（带有毛状体且之后使用Beadbeater进行毛状体分离）、毛状体细胞和雄花的抽样。总RNA按上述分离。RNA具有>1.9的Abs260:Abs280且在变性凝胶上显现出清楚的核糖体条带。第一链cDNA是用0.5μgRNA用QuantiTectcDNA合成试剂盒（Qiagen）合成的。每20μL的cDNA样品用水1:4稀释，然后1μL用作PCR模板。基因特异性引物被设计用来产生90-200bp的扩增子。采用StepOnePlus仪（AppliedBiosystems）和基于SYBRGreen的测定（QuantiFastSYBRGreen试剂盒，Qiagen）在96孔板上进行PCR反应（20μL）。所使用的循环参数为95℃5分钟，随后为40个循环的95℃10秒、60℃30秒和标准的溶解操作（95℃15秒、60℃1分钟、以0.3℃增量的60-95℃15秒）。实验通过使用来自三株植物cDNA用两种技术复制物进行。肌动蛋白被用作参考基因，其发现在所有测试组织中稳定表达。采用标准曲线法计算所有引物对的效率为90-110%。Ct值使用StepOne软件（AppliedBiosystems）计算得到。2-ΔΔCt法用于相对基因表达分析。
CsHCS1和CsHCS2的亚细胞定位
YFP:CsHSC1和YFP:CsHSC2融合蛋白通过使用LR重组酶（Invitrogen）重组到pEARLYGATE104中构建（Earley,K.W.,Haag,J.R.,Pontes,O.,Opper,K.,Juehne,T.,Song,K.和Pikaard,C.S.(2006).Gateway-compatiblevectorsforplantfunctionalgenomicsandproteomics.PlantJ.45,616-629.）。为了生成OLS:CFP构建体，在使用LR重组酶重组到pEARLYGATE102之前，缺少终止子的OLS被克隆到pCR8/GW/TOPO中。过氧化物酶体标记物PX-CK（Nelson,B.K.,Cai,X.和Nebenführ,A.(2007).Amulticoloredsetofinvivoorganellemarkersforco-localizationstudiesinArabidopsisandotherplants.PlantJ.51,1126-1136.）来自ABRC（www.arabidopsis.org）。质粒通过电穿孔转化至根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101中并在包含10μL/mL利福平和5μg/mL卡那霉素的LB平板上选择。生长两个星期的本生烟(Nicotianabenthamiana)植物叶片用OD600为0.02的土壤杆菌(Agrobacterium)溶液(Sparkes,I.A.,Runions,J.,Kearns,A.和Hawes,C.(2006).Rapid,transientexpressionoffluorescentfusionproteinsintobaccoplantsandgenerationofstablytransformedplants.Nat.Protocol.1,2019-2025.)浸润。浸润后两天，用ZeissLSM510共聚焦显微镜观察叶表皮细胞。CFP在458nm激发下是可视化的，用475-525nm带通滤波器进行图像收集；YFP在514nm激发下是可视化的，用530-600nm带通滤波器进行图像收集。图像收集和分析采用ZeissLSM软件包。
数据提供了CsHSC1是涉及大麻素生物合成的酶的证据。CsHSC1是EST目录中最丰富的转录物，并且qRT-PCR数据表明，其在毛状体细胞中的表达是在其它组织中的超过100倍之高（图6）。此外，CsHSC1通过亚细胞定位实验定位于细胞溶质，其是推定的大麻素酶OLS定位的相同隔室。CsHSC1的底物优先性提供了其在大麻素生物合成中作用的额外证据，因为与CsHSC2相比其显示了对于己酸和其它短链脂肪酰基辅酶A的更强特异性（图3）。
虽然CsHSC1为可能涉及植物中大麻素生物合成的酶，但是在己酰辅酶A合成中CsHSC2比CsHSC1更高效。然而，CsHSC2定位于过氧化物酶体并且在这一隔室中形成的己酰辅酶A是如何运送至大麻素途径中聚酮合成阶段定位的细胞质中还尚未明确。CsHSC2接受一个很宽范围的底物，这表明它是一种可以在过氧化物酶体β-氧化中起作用的更广义的酰基辅酶A合成酶。
CsHSC1和CsHSC2都是具有价值的工业工具。大麻植物中CsHSC1的敲除可以导致植物中大麻素水平的大幅降低，这对于大麻育种者来说是非常可取的。大麻中CsHSC1的过表达会导致大麻素水平的升高，这对药学目的是有用的。另一方面，CsHSC2在微生物或体外系统中的大麻素形成重构中尤其有用。
实施例7：使用靶向诱导基因组局部损伤技术（TILLING）在CsHSC1和CsHSC2基因的突变体的产生
在CsHSC1或CsHSC2基因中含突变的大麻植物的鉴定可以通过TILLING技术来完成。使用寡核苷酸引物筛选大麻植物的诱变群体并用PCR技术来扩增目的基因。扩增的突变基因被退火至野生型基因，从而发现突变基因与野生型基因之间的错配。检测到的差异用于鉴定在CsHSC1或CsHSC2基因二者之一中包含突变的植物。包含导致氨基酸位置改变的突变的植物不能为大麻素生物合成生产烷酰基辅酶A前体，所述氨基酸位置是对于CsHSC1或CsHSC2蛋白的稳定性或烷酰基辅酶A合成酶的活性是必须的。得到的植物包含水平降低或改变的大麻素产品。
本发明提供了编码来自大麻的两种烷酰基辅酶A合成酶的基因。这些基因可以通过育种、靶向诱变或基因工程产生大麻素产量提高的大麻植物。此外，使本发明的大麻中的基因的失活或沉默可用于阻断大麻素生物合成，由此降低大麻植物（例如工业大麻）中大麻素如THCA（THC的前体）的产量。本发明的基因可与编码大麻素途径中其它酶的基因联合用于其它植物或微生物或无细胞系统中的大麻素生物合成的工程化，或用于生产大麻素化合物类似物或大麻素前体类似物。
本发明公开中所提及的所有出版物，其每一项的全文内容以引用方式并入本文。
本发明的其它固有优点对本领域技术人员而言是显而易见的。本文描述的实施例是示例性的且并不意在限制本发明要求保护的范围。前述实施例的变型对普通技术人员是明显的并且发明人旨在通过下述权利要求所涵盖。

Claims (23)

1.一种分离或纯化的核酸分子，其特征在于，所述分离或纯化的核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO:1中所示或是其密码子简并核苷酸序列。
2.一种分离或纯化的核酸分子，其特征在于，所述分离或纯化的核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO:3中所示或是其密码子简并核苷酸序列。
3.一种分离或纯化的多肽，其特征在于，所述分离或纯化的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示。
4.一种分离或纯化的多肽，其特征在于，所述分离或纯化的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4中所示。
5.根据权利要求3或4所述的多肽，所述多肽具有烷酰基辅酶A活性。
6.一种包含权利要求1或2所述的核酸分子的载体、构建体或表达系统。
7.一种用根据权利要求1或2所述的核酸分子转化的宿主细胞。
8.一种合成烷酰基辅酶A的方法，所述方法包括：在根据权利要求5所述的多肽的存在下使羧酸与辅酶A反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述羧酸具有2到10个碳原子。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述烷酰基辅酶A包括己酰辅酶A。
11.一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括与在相似条件下培养但不使用用于沉默的核酸分子的相似种类的生物体、细胞或组织相比，使用根据权利要求1或2所述的核酸分子或其一部分在所述生物体、组织或细胞中使编码催化烷酰基辅酶A合成的酶的基因沉默。
12.一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括在所述生物体、细胞或组织中突变基因，并且使用根据权利要求1或2所述的核酸分子筛选包含编码催化烷酰基辅酶A合成的酶的基因的突变体或变体的生物体、细胞或组织。
13.一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括与在相似条件下培养但不表达或不过表达外源核酸分子的相似种类的生物体、细胞或组织相比，在所述生物体、细胞或组织中表达或过表达根据权利要求1或2所述的外源核酸分子。
14.一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法，所述方法包括与在相似条件下培养但不表达或不过表达外源核酸分子的相似种类的生物体、细胞或组织相比，在所述生物体、细胞或组织中表达或过表达编码根据权利要求5所述的多肽的外源核酸分子。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述大麻素化合物的水平增加。
16.一种在生物体、细胞或组织中合成天然存在的大麻素化合物的方法，所述方法包括在羧酸和辅酶A的存在下，在所述生物体、细胞或组织中表达根据权利要求1或2所述的核酸分子。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物体或细胞来自微生物。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述微生物是酿酒酵母或大肠杆菌。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其特征在于，在与编码大麻素生物合成途径中的一种或多种酶的一种或多种其它核酸的表达或过表达相组合的情况下，表达或过表达所述核酸分子。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述大麻素生物合成途径中的一种或多种酶是戊基二羟基苯酸合成酶、Ⅲ型聚酮合成酶、聚酮环化酶、芳香族异戊二烯转移酶或大麻素生成氧化酶中的一种或多种。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述大麻素生物合成途径中的一种或多种酶是Ⅲ型聚酮合成酶/戊基二羟基苯合成酶、香叶基焦磷酸:戊基二羟基苯酯香叶基转移酶、Δ9-四氢大麻酚酸合成酶、大麻二酚酸合成酶或大麻环萜酚酸合成酶中的一种或多种。
22.根据权利要求11至21中任一项所述的方法，其特征在于，所述大麻素化合物是大麻萜酚酸、Δ9-四氢大麻酚酸、大麻二酚酸、大麻环萜酚酸、Δ9-四氢大麻酚、大麻二酚或大麻环萜酚中的一种或多种。
23.一种在体外无细胞反应中合成烷酰基辅酶A的方法，所述方法包括：通过根据权利要求5所述的多肽的作用，使羧酸与辅酶A反应。
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