JP2018519853A - Ｔｈｃａ合成酵素の発現を改変したアサ植物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規な遺伝的に改変した植物およびその方法または物質（同様の物を生成するためのポリヌクレオチド、発現カセット、またはベクター）に関する。さらに、本発明は、植物のカンナビノイド含量を変化させること、およびそのような植物に由来する医療用組成物に関する。特別の実施態様において、本発明は、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の発現を改変したアサ植物および、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を改変することによって、アサのデルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）の量を改変する方法に関する。

Description

関連出願の参照
本出願は、2015年5月28日に出願された米国仮特許出願第62/167,462号の利益を主張し、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
配列表の取り込み
コンピューターで読み出せる形式の配列表を、電子申請によって本明細書と共に出願する。配列表は、参照によってその全体が取り込まれ、2016年5月23日に作成されたファイルに含まれ、そのファイル名は「TWED002WO_ST25.txt」であり、サイズは112kb（MS-Windowsオペレーティングシステムで測定）である。
本発明の分野
本発明は、遺伝子改変したアサ植物およびアサ植物派生製品ならびに発現カセット、ベクター、組成物および物質、ならびにこれらを生成する方法に関する。特に本発明は、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の発現を改変したアサ植物および、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を改変することによって、アサのデルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）の量を改変する方法に関する。
アサ（マリファナ(marihuana)または大麻(marijuana)とも呼ばれる）は、歴史を通して、医療用の目的で用いられてきた。アサは、食欲刺激薬として、制吐薬として、鎮痛薬として、ならびに緑内障、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症および慢性炎症を含む様々な状態の管理において、治療効果を与えることが示されてきた。
アサは、多数の化学的に異なる成分を含み、これらの多くは治療上の性質を持つ。医療用のアサの主要な治療成分は、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）である。ＴＨＣはアサの主要な向精神性成分であり、制吐薬、鎮痛薬として、および緑内障の管理において治療効果を与えることが示されてきた。逆に、ＴＨＣを高い比率で含む医療用のアサの系統は、不安の感情および／または失見当識を引き起こすことがある。ＣＢＤはアサの主要な、精神過程に影響しない成分である。ＣＢＤはセロトニン受容体のアゴニストであり、神経障害性の痛みおよび神経性の炎症の治療に効果があることが示されてきた。高投与量のＣＢＤの副作用は、不定の眠気および鎮静作用を含む。
アサの特定の成分の量は、治療の有効性および潜在的な副作用に影響を与え得る。したがって、治療成分のプロファイルを改変したアサ植物は、医療用のアサの生成において有用であり得、かつ／または特定の成分の生成においても有用であり得る。
アサ植物における１以上のカンナビノイドの含量を変化させる方法を記述し、本方法は、アサ植物におけるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の活性を下方制御することを含む。特別な実施態様において、本方法は、アサ植物において、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）含量を減少させること、カンナビジオール（ＣＢＤ）含量を増加させること、または、ＴＨＣを減少させ、かつＣＢＤ含量を増加させることを含み、本方法は、アサ植物におけるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の活性を下方制御することを含む。ある実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の活性を下方制御することは、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を抑制するのに有効なアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする選択されたＤＮＡを含む発現カセットを、植物に導入することを含み、この選択されたＤＮＡは異種プロモーターに作動可能に連結している。特別な実施態様において、本方法は、発現カセットを含まない類似の遺伝子型のアサ植物と比較して、ＴＨＣＡ合成酵素のｍＲＮＡのレベルが減少したアサ植物を選択すること、または、発現カセットを含まない類似の遺伝子型のアサ植物と比較して、ＴＨＣ含量が減少したアサ植物、ＣＢＤ含量が増加したアサ植物、もしくはＴＨＣ含量が減少し、かつＣＢＤ含量が増加したアサ植物を選択することをさらに含んでもよい。特別な実施態様において、発現カセットを導入することは、形質転換を含む。いくつかの実施態様において、異種プロモーターを、葉特異的(leaf-specific)プロモーター、花特異的(flower-specific)プロモーター、ＴＨＣＡ合成酵素プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター、およびｔＣＵＰプロモーターからなる群から選択してもよい。ある態様において、ｓｉＲＮＡは、配列番号６１、６３、６４、６９、７１、７２、６８およびそれらの相補体からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド配列；または、配列番号６１、６３、６４、６９、７１、７２、６８およびそれらの相補体からなる群から選択される配列の、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド配列、または、ＴＨＣＡ合成酵素もしくはその相補体の少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド配列、によってコードされ、このＴＨＣＡ合成酵素は、配列番号１〜４７からなる群から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を持つ。他の態様において、アンチセンスＲＮＡは、配列番号８１、またはそのフラグメントであって、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を減少させることができるフラグメント、を含むポリヌクレオチド配列、または配列番号８１の少なくとも２００個の連続するヌクレオチドと少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド配列、によってコードされ、ここで選択されたＤＮＡの転写は、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を抑制する。
他の実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の活性を下方制御することは、アサ植物またはその細胞に、（ｉ）少なくとも１つの核局在シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型(RNA-guided)エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ、または少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、および場合により、（ｉｉｉ）少なくとも１つのドナーポリヌクレオチド、を導入すること；および、アサ植物またはその細胞を、各ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列の標的部位に誘導するように、培養し、そこでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは標的部位に二本鎖切断を導入し、この二本鎖切断はＤＮＡ修復過程によって、染色体配列を改変するように修復され、ここで標的部位がＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子に位置し、染色体の改変がＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の転写および／または翻訳を妨げ、または阻害する、ことを含む。
さらなる実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の活性を下方制御することは、アサ植物またはその細胞のＤＮＡ配列において、少なくとも１つのＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座を同定すること、少なくとも１つのＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座において、少なくとも１つのカスタム(custom)エンドヌクレアーゼ認識配列を同定すること、少なくとも１つのアサ植物またはその細胞に、少なくとも第一のカスタムエンドヌクレアーゼを導入すること（ここでアサ植物またはその細胞は、カスタムエンドヌクレアーゼの認識配列を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座内またはその近位に含み、カスタムエンドヌクレアーゼは一過性または安定に発現される）、アサ植物またはその細胞を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座を構成するＤＮＡ、またはそれに隣接するＤＮＡにおけるカスタムエンドヌクレアーゼを介する改変について、アッセイすること、およびアサ植物、その細胞またはその子孫細胞を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座に改変を含むものとして同定すること、を含む。
様々な実施態様において、本方法で作成したトランスジェニックアサ植物およびトランスジェニック植物の種子を含み、ここでこの種子は、発現カセットを含む。
さらなる実施態様は、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）含量が減少したアサ植物、カンナビジオール（ＣＢＤ）含量が増加したアサ植物、または、ＴＨＣが減少し、かつＣＢＤ含量が増加したアサ植物を含み、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の発現の減少を含む。ある態様において、アサ植物は、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を抑制するのに有効なアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする選択されたＤＮＡを含み、この選択されたＤＮＡは異種プロモーターに作動可能に連結しており、ここでアサ植物は、選択されたＤＮＡを含まない類似の遺伝子型のアサ植物と比較して、ＴＨＣ含量の減少、ＣＢＤ含量の増加、またはＴＨＣ含量の減少かつＣＢＤ含量の増加を含む。特別な態様において、アサ植物の種子、細胞または一部および、その植物からの、アサ植物派生製品を含む。
特別な実施態様において、アサ植物派生製品は、総重量で約１８％〜約６０％の濃度の、カンナビジオール酸とカンナビジオール、および／または総重量で約０％〜約３％の濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールとテトラヒドロカンナビノール酸を含む。様々な実施態様において、アサ植物派生製品は、アサの油、アサのチンキ、乾燥したアサの花および／または乾燥したアサの葉を含み、かつ／または吸入、経口摂取、舌下摂取または局所摂取に適合してもよい。
特別な実施態様において、医療用のアサの組成物を生成する方法を含み、本方法は、アサ植物を得ること、アサ植物を植物成長条件下で成長させ、アサ植物から植物組織を生成させること、およびその植物組織から医療用のアサの組成物を調製することを含む。
異種プロモーターに作動可能に連結された選択されたＤＮＡを含む、組換え型の発現カセットを記述し、この選択されたＤＮＡは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の遺伝子発現を抑制するのに有効な、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡをコードする。特別な実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子は、配列番号１〜４７からなる群から選択される配列と、少なくとも８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、異種プロモーターは、葉特異的プロモーターまたは花特異的プロモーターであり；植物において機能的なプロモーターであり；かつ／または、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＦＭＶ３５ＳプロモーターおよびｔＣＵＰプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである。様々な実施態様において、選択されたＤＮＡは、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の少なくとも２１個の連続するヌクレオチドと相補的な配列を含むｓｉＲＮＡをコードし；配列番号８１または、そのフラグメントであって、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現を減少させることができるフラグメント、を含むアンチセンスＲＮＡをコードし；配列番号６１、６３、６４、６９、７１、７２、６８およびそれらの相補体からなる群から選択される配列と、少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み；かつ／または、配列番号６１、６３、６４、６９、７１、７２、６８およびそれらの相補体からなる群から選択される配列の少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含む、ｓｉＲＮＡをコードし；ここでｓｉＲＮＡは、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現を減少させることができる。
さらなる実施態様において、選択されたＤＮＡは、アンチセンス方向でプロモーターと作動可能に連結している。特別な実施態様において、選択されたＤＮＡは、遺伝子サイレンシング、ｍＲＮＡ切断、またはＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子のｍＲＮＡの翻訳の抑制を誘導し；かつ／または、選択されたＤＮＡは、配列番号８１またはその相補体の少なくとも２００個の連続した配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であり；または、配列番号６１、６３、６４、６９、７１、７２、６８もしくはそれらの相補体の少なくとも１８、１９、２０、２１または２２個の連続したヌクレオチドを含み、ここで選択されたＤＮＡの転写が、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現を抑制する。発現カセットを含むベクターもまた、記述され；トランスジェニック植物は、特許請求の範囲に記載の発現カセットを含む。特定の実施態様において、トランスジェニック植物はアサ植物として定義され、ここでこのアサ植物は、発現カセットを含まない同一の遺伝子型のアサ植物と比較して、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の減少およびカンナビジオール（ＣＢＤ）の増加を含む。特別な実施態様において、トランスジェニック植物はさらに、Ｒ０トランスジェニック植物として定義され；かつ／またはＲ０トランスジェニック植物の任意の世代の子孫植物として定義され、ここでこのトランスジェニック植物は、Ｒ０トランスジェニック植物から選択されたＤＮＡを受け継いだものである。ある実施態様において、トランスジェニック植物の種子もまた記述され、この種子は発現カセットを含み；トランスジェニック植物のトランスジェニック細胞も記述され、この細胞は発現カセットを含む。
別の態様において、植物またはその子孫の加工製品を与え、加工製品は、発現カセットを含まない同一の遺伝子型のアサ植物の加工製品と比較して、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の減少およびカンナビジオール（ＣＢＤ）の増加を含む。様々な実施態様において、加工製品は、アサの油、チンキ、乾燥したアサの花および／または乾燥したアサの葉を含み；かつ／または吸入、経口摂取、舌下摂取または局所摂取に適合する。
別の態様において、植物またはその部分への局所適用のための組成物を記述し、これは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の遺伝子発現を抑制するのに有効なＴＨＣＡ合成酵素の阻害化合物の量を含み、ＴＨＣＡ合成酵素の阻害化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ、またはＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現を抑制するのに有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸を含む。ある実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の阻害化合物は、少なくとも１８から約２４個、約２５から約５０個、約５１から約１００個、約１０１個から約３００個、約３０１個から約５００個または少なくとも約５００個以上の長さのヌクレオチドであるポリヌクレオチド分子を含み、ここでこの植物はアサであり、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子は、配列番号１〜４７からなる群から選択される配列と少なくとも８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド配列を含む。
他の実施態様は、アサ植物のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の活性を下方制御する方法を提供し、この方法は、請求項１の発現カセットを植物に導入し；かつ、発現カセットを導入していない植物と比較して、ＴＨＣＡ合成酵素のｍＲＮＡの存在量が減少した植物を選択し；または、発現カセットを含まない類似の遺伝子型のアサ植物と比較して、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）含量が減少し、および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）含量が増加した植物を選択する、ことを含む。ある態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子は、配列番号１〜４７からなる群から選択される配列と少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特別な態様において、発現カセットを導入することは、形質転換を含む。
他の態様において、医療用のアサの組成物を生成する方法を記述し、この方法は、この植物を得ること、この植物を植物成長条件下で成長させ、この植物から植物組織を生成させること；およびその植物組織から、ヒトまたは動物のための医療用のアサの組成物を調製すること、を含む。
さらなる実施態様は、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現が減少し、または欠失している植物を同定する方法を記述し、この方法は、複数のアサ植物を得、その複数のアサ植物をＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現量についてスクリーニングし、発現カセットを含まない同系のアサ植物におけるＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現量と比較して、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現の減少を含む、１以上のスクリーニングされたアサ植物を選択することを含む。特別な実施態様において、本方法は、選択された１以上のアサ植物を、発現カセットを含まない同系のアサ植物に対する、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）含量の減少および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）含量の増加について、検定することをさらに含み；複数のアサ植物を、ランダム変異または部位特異的変異によって得；その複数の植物はトランスジェニック植物であり；かつ／または、その複数の植物は、１０、１００、１０００またはそれ以上の植物を含む。特別な実施態様において、本方法は、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現が減少した１以上のアサ植物を、異なる植物と交雑することをさらに含む。
他の態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子と遺伝的に関係のある遺伝子多型を同定する方法を記述し、これは植物の集団のＤＮＡを得ること（その集団のメンバーはＴＨＣＡ合成酵素の発現量が様々である）；および、前記集団における（この遺伝子多型を含まない集団のメンバーと比較して減少したＴＨＣＡ合成酵素の発現に関連する）少なくとも第一の遺伝子多型を同定することを含む。
異なる態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子において改変された染色体配列を含む、アサ植物細胞を作成する方法を記述し、この方法は、アサ植物細胞に、（ｉ）少なくとも１つの核局在シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、および場合により、（ｉｉｉ）少なくとも１つのドナーポリヌクレオチド、を導入すること；および、アサ植物細胞を、各ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列の標的部位に誘導するように、培養し、そこでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは標的部位に二本鎖切断を導入し、この二本鎖切断はＤＮＡ修復過程によって、染色体配列を改変するように修復し、ここで標的部位がＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子に位置し、染色体の改変がＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の転写および／または翻訳を妨げ、または阻害すること、を含む。特別な実施態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来し；ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡであり；かつ／または、その改変は挿入もしくは欠失である。特別な実施態様において、このＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含むベクターの一部であり、アサ植物細胞をこの方法によって得る。特別な実施態様において、アサ植物はその細胞を含み、ここでこの植物は、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の染色体配列が改変されていない同系のアサ植物と比較して、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）含量の減少および／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）含量の増加を含む。
他の態様は、植物細胞のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座を改変する方法を含み、この方法は、植物細胞のＤＮＡ配列において、少なくとも１つのＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座を同定すること、少なくとも１つのＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座において、少なくとも１つのカスタムエンドヌクレアーゼ認識配列を同定すること、少なくとも１つの植物細胞に少なくとも第一のカスタムエンドヌクレアーゼを導入すること（ここでこの細胞は、カスタムエンドヌクレアーゼの認識配列を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座内またはその近位に含み、カスタムエンドヌクレアーゼは一過性または安定に発現される）、その細胞を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座を構成するＤＮＡ、またはそれに隣接するＤＮＡにおけるカスタムエンドヌクレアーゼを介する改変について、アッセイすること、およびその細胞またはその子孫細胞を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座に改変を含むものとして同定すること、を含む。特別な実施態様において、カスタムエンドヌクレアーゼは、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」、「ＧＩＹ−ＹＩＧ」、「Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス」、「ＺＦＮ」または「ＨＮＨ」配列モチーフを含み；かつ／または、エンドヌクレアーゼ認識配列は、前記植物細胞のゲノム中に１つのみ存在する。ある実施態様において、本方法は、対象の遺伝子座において、少なくとも第二のカスタムエンドヌクレアーゼ認識配列を、同定することをさらに含み；または、植物細胞に、少なくとも第二のカスタムエンドヌクレアーゼを導入することをさらに含み、ここでこの細胞は、第二のカスタムエンドヌクレアーゼの第二の認識配列を含む。特別な実施態様において、エンドヌクレアーゼを介する改変を、ジェノタイピング反応、ＰＣＲ反応、ハイスループットなシークエンシング、他の分子遺伝学的アッセイ、生化学的アッセイ、視覚的アッセイ、免疫学的アッセイまたは他の表現型マーカーのアッセイを用いて検出する。そして、ある態様において、本方法で作成した植物を記述する。
図１は、カンナビス・サティバ(Cannabis sativa)のテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の配列をコードする領域のアライメントを示す。アライメントを、world wide web.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2で利用できる、CLUSTAL O (1.2.1)マルチプルシークエンスアライメントで行った。下記の配列を配列比較した：JQ437488.1 (配列番号１);JQ437487.1 (配列番号２);JQ437486.1 (配列番号３);JQ437485.1 (配列番号４);JQ437484.1 (配列番号５）;JQ437483.1 (配列番号６); JQ437482.1 (配列番号７); JQ437481.1 (配列番号８); JQ437492.1 (配列番号１２); JQ437491.1 (配列番号１３); JQ437490.1 (配列番号14); JQ437489.1 (配列番号１５); AB212841.1 (配列番号１６); AB212840.1 (配列番号17); AB212839.1 (配列番号１８); AB212838.1 (配列番号１９); AB212837.1 (配列番号２０); AB212836.1 (配列番号２１); AB212835.1 (配列番号２２); AB212834.1 (配列番号２３); AB212833.1 (配列番号２４); AB212832.1 (配列番号２５); AB212831.1 (配列番号２６); AB212830.1 (配列番号２７); AB212829.1 (配列番号２８); AB731220.1 (配列番号３９); AB057805.1 (配列番号４０); AB292683.1 (配列番号４１); AB292682.1 (配列番号４２);およびAB292684.1 (配列番号４３)。
図２は、ＮＣＢＩのＴＨＣＡ合成酵素の配列を含む、ＤＫ−１系およびＳＨ−４系由来の、カンナビス・サティバのテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素をコードする配列のアライメントを示す。下記の配列を配列比較した：AB057805.1 (配列番号４０); AB212829.1 (配列番号２８); AB212833.1 (配列番号２４); AB292683.1 (配列番号４１); JQ437487.1 (配列番号２); JQ437491.1 (配列番号１３); DK-1_full (配列番号４６);およびSH-4_full (配列番号４７)。同一の配列（コンセンサス）（配列番号８６）を含む領域も示す。
図３は、ＲＮＡｉのアクセスしやすさの分析を示し、この分析は、ＴＨＣＡ遺伝子のＮ末端領域（５’末端に対応）に位置するＲＮＡｉ標的について、ＴＨＣＡ遺伝子における良い候補領域（良いＲＮＡのアクセスしやすさ）を示す。この領域の遺伝子は、いかなる保存されたタンパク質ドメインもコードせず、それゆえ、オフターゲット効果の最小限のリスクでのＲＮＡｉ標的に適している。この領域を、小ヘアピンＲＮＡ干渉コンストラクトの設計において用いた。RNAxs Webserver（rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAxsで利用できる）を用いて分析を行った。
図４は、ＲＮＡｉのアクセスしやすさの分析を示し、この分析は、ＲＮＡｉ標的のための、ＴＨＣＡ遺伝子における候補領域（ＲＮＡのアクセスしやすさ）を示す。Ｃ末端のＢＢＥ保存ドメインを示す。このドメインは他の二次代謝酵素内に存在し得るため、この領域を、他の二次代謝酵素をコードする遺伝子のサイレンシングを誘導するリスクのために回避した。RNAxs Webserver（rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAxsで利用できる）を用いて分析を行った。
図５は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースを用いて分析した、ＴＨＣＡ合成酵素の保存されたタンパク質ドメインを示す。下記の保存されたタンパク質ドメインを見出した：ベルベリンおよびベルベリン様（４８０−５３８のアミノ酸区間）、ＦＡＤ結合ドメイン（８１−２１８のアミノ酸区間）、ＦＡＤ／ＦＭＮ含有デヒドロゲナーゼ（８１−５４０のアミノ酸区間）、ならびにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｃＤ、８１−５４０のアミノ酸区間）。保存されたタンパク質ドメインの模式図に対して、全長アンチセンスＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡ、および大ヘアピンＲＮＡも示す。
図６は、アンチセンスコンストラクトおよびＲＮＡｉコンストラクトのクローニングに利用する、ｐＣＡＭ１３９１−３５ＳベクターのＴ−ＤＮＡの図を示す。カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（３５Ｓ、図６の右側および中央の矢印のボックス）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩＩ）；３５Ｓターミネーター（３５Ｓ、図６の左側）；ノパリンシンターゼターミネーター（ＮＯＳ）を示す。３５ＳとＮＯＳとの間の対象の遺伝子のクローニングのための、ＭＣＳにおける制限部位も示す。ベクターを、アグロバクテリウムを介する形質転換、微粒子銃パーティクルボンバードメント法および植物のプロトプラスト形質転換に用いることができる。
配列の簡単な説明
配列番号１〜３８は、カンナビス・サティバＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子、またはそれらを部分的にコードする配列（ｃｄｓ）である。
配列番号３９は、カンナビス・サティバの仮想タンパク質の遺伝子であり、完全なｃｄｓである。
配列番号４０は、カンナビス・サティバのＴＨＣＡ合成酵素の前駆体のｍＲＮＡであり、完全なｃｄｓである。
配列番号４１は、カンナビジオール酸合成酵素ホモログ（ＣＢＤＡＳ２）のｍＲＮＡであり、完全なｃｄｓである。
配列番号４２は、カンナビス・サティバのカンナビジオール酸合成酵素のＣＢＤＡＳのｍＲＮＡであり、完全なｃｄｓである。
配列番号４３は、カンナビス・サティバのカンナビジオール酸合成酵素ホモログ（ＣＢＤＡＳ３）のｍＲＮＡであり、完全なｃｄｓである。
配列番号４４は、カンナビス・サティバＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子である。
配列番号４５は、カンナビス・サティバＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子である。
配列番号４６は、ＤＫ−１系カンナビス・サティバのカンナビス・サティバＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子配列である。
配列番号４７は、ＳＨ−４系カンナビス・サティバのカンナビス・サティバＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子配列である。
配列番号４８は、Kojomaらの順方向プライマー（ＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣ）である。
配列番号４９は、Kojomaら(2006)の逆方向プライマーの相補体（ＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＧＡ）である。
配列番号５０は、Kojomaらの実際の逆方向プライマー（ＴＣＴＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧ）である。
配列番号５１は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＳＮ−Ｆ１（センス、順方向）ＲＮＡｉコンストラクトプライマーである。
配列番号５２は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＳＮ−Ｒ１（センス、逆方向）ＲＮＡｉコンストラクトプライマーである。
配列番号５３は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＡＳ−Ｆ１（アンチセンス、順方向）ＲＮＡｉコンストラクトプライマーである。
配列番号５４は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＡＳ−Ｒ１（アンチセンス、逆方向）ＲＮＡｉコンストラクトプライマーである。
配列番号５５は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＳＮ−Ｆ２ ＲＮＡｉコンストラクトプライマーである。
配列番号５６は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＳＮ−Ｒ２ ＲＮＡｉコンストラクトプライマーである。
配列番号５７は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＡＳ−Ｆ２ ＲＮＡｉコンストラクトプライマーである。
配列番号５８は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＡＳ−Ｒ２ ＲＮＡｉコンストラクトプライマーである。
配列番号５９は、ＴＨＣＡ−ＦｕｌｌＡＳ−Ｆコンストラクトプライマーである。
配列番号６０は、ＴＨＣＡ−ＦｕｌｌＡＳ−Ｒコンストラクトプライマーである。
配列番号６１は、小ヘアピンコンストラクトのセンス配列である。
配列番号６２は、小ヘアピンコンストラクトのループ配列である。
配列番号６３は、小ヘアピンコンストラクトのアンチセンス配列である。
配列番号６４は、小ヘアピンコンストラクトの完全挿入配列である。
配列番号６５は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＳＮ−Ｆ１（センス、順方向）プライマーである。
配列番号６６は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＳＮ−Ｒ１（センス、逆方向）プライマーである。
配列番号６７は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＡＳ−Ｆ１（アンチセンス、順方向）ＲＮＡｉプライマーである。
配列番号６８は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＡＮ−Ｒ１（アンチセンス、逆方向）プライマーである。
配列番号６９は、大ヘアピンコンストラクトのセンス鎖である。
配列番号７０は、大ヘアピンコンストラクトのループ鎖である。
配列番号７１は、大ヘアピンコンストラクトのアンチセンス鎖である。
配列番号７２は、大ヘアピンコンストラクトの完全挿入配列である。
配列番号７３は、ＳａｃＩ−ＭｌｕＩを有する、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＳＮ−Ｆ２（センス、順方向）プライマーである。
配列番号７４は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＳＮ−Ｆ２（センス、順方向）プライマーである。
配列番号７５は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＳＮ−Ｒ２プライマーである。
配列番号７６は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＳＮ−Ｒ２プライマーである。
配列番号７７は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＡＳ−Ｆ２プライマーである。
配列番号７８は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＡＳ−Ｆ２プライマーである。
配列番号７９は、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＡＳ−Ｒ２プライマーである。
配列番号８０は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＡＳ−Ｒ２プライマーである。
配列番号８１は、完全なアンチセンスＴＨＣＡ合成酵素である。
配列番号８２は、ＴＨＣＡ−Ｆｕｌｌ ＡＳ−Ｆ（アンチセンス、順方向）プライマーである。
配列番号８３は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−Ｆｕｌｌ ＡＳ−Ｆ（アンチセンス、順方向）プライマーである。
配列番号８４は、ＴＨＣＡ−Ｆｕｌｌ ＡＳ−Ｒ（アンチセンス、逆方向）プライマーである。
配列番号８５は、制限部位を含まない、ＴＨＣＡ−Ｆｕｌｌ ＡＳ−Ｒ（アンチセンス、逆方向）プライマーである。
配列番号８６は、制限部位を含まない、コンセンサスなＴＨＣＡ−Ｆｕｌｌ ＡＳ−Ｒ（アンチセンス、逆方向）プライマーである。
遺伝的に改変したアサ植物およびアサ植物派生製品ならびに発現カセット、ベクター、組成物および物質ならびにこれらを生成する方法を記述する。特に、本発明は、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の発現を改変したアサ植物および、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を改変することによって、アサのデルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）の量を改変する方法に関する。
アサ（カンナビス・サティバ）は、よく知られており、医療用のアサの生産に広く用いられる。主要なアサの化合物であるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣ）と共に、アサはまた、医薬品として証明され、潜在的な価値を有する様々な他の二次代謝物を生成する。しかしながら、この植物ではわずかなレベルでしか生成しないため、生成および精製の高いコストが、これらの医薬品の商業化の主要な障害となっている。アサの二次代謝物の生合成経路の代謝工学は、ＴＨＣの生合成から代替の化合物に向けて、生化学反応、中間体およびエネルギーを変更できる。この手法は、新規な医薬品の生成という付加価値を有する、新たなアサの系統の開発をもたらし得る。
植物の二次代謝物の生成は、厳密に制御された生合成経路に起因し、これは、植物組織において種々の濃度で蓄積する１以上の生理活性代謝物の生成をもたらす。これらの経路の代謝工学を用いて、対象の特定の代謝物の生成量が増加した植物の系統を作成できる。植物の遺伝子工学技術を適用し、ＴＨＣ生合成に関与する重要な酵素の下方制御を通して、アサの二次代謝物を選択的に改変できる。多様な真核生物での多くの研究において示されるように、代謝経路の重要な工程の下方制御は、中間体およびエネルギーを代替の代謝経路に向かわせ、他の最終代謝物の生成量および蓄積量の増加をもたらす。アサが生成するＴＨＣおよび他の有用な医薬化合物は、二次代謝生合成経路において、特定の工程および中間体を共有するため、ＴＨＣ生成量の減少は、対象の他の化合物の生成量の増加を期待させる。
ある実施態様において、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の改変は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を用いて、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって誘導される標的遺伝子サイレンシングによって、達成できる。ＲＮＡを介する遺伝子制御機構は共に、自然界の全ての真核生物において発見されており、現在では遺伝子サイレンシングツールとして、多くの生物にうまく適用されている。このような遺伝子改変戦略の利点は、遺伝子サイレンシングをもたらすコンストラクトの形質転換が、特定の遺伝子座を標的とすることによって、全ての遺伝子のノックアウトを必要としないことである。さらに、作成された遺伝的に改変した植物の系統は、種々のレベルの標的遺伝子の下方制御を有することができ、最も望ましい医薬化合物群の生成量についてスクリーニングできる。
ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子を、様々なカンナビス・サティバの系から単離したゲノムＤＮＡからクローニングしてもよい。異なるカンナビス・サティバの系におけるこの遺伝子の配列のばらつきが、アサ化合物の生成量に影響を与えることが示されているため、特定の系統由来のこの遺伝子のクローニングおよびシークエンシングは、必須の工程である。ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子のコンセンサス配列を用いて、アンチセンスＲＮＡおよびＲＮＡ干渉コンストラクトを設計および作成してもよい。合成されたＲＮＡサイレンシングコンストラクトを、植物の形質転換用に設計されたベクターに導入してもよい。種々のプロモーター（種々の強度および起点の構成的プロモーターなど）を用いて、ＲＮＡサイレンシングの発現を駆動してもよい。さらに、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子制御領域（プロモーター）を用いて、同一の組織において、および天然の遺伝子における同一の植物の発生段階中に、サイレンシングコンストラクトを直接発現させてもよい。この手法は、標的でない植物組織における導入遺伝子発現を回避し、遺伝子改変において起こり得るが、望ましくない他の効果のリスクを最小化するのに役立つ。
ある実施態様において、ベクターは、対となる制限酵素部位（ＲＥＳ）を方向性クローニングに用いることができるように、新規なポリリンカーを含んでもよい。相対的にまれなＲＥＳを選択することによって、クローニングするＤＮＡにおいてそれらが存在する可能性は低くなる。たとえそれらが起こっても、異なる対のＲＥＳを使用でき、標的ＤＮＡの小片において４つ全ての酵素が存在する可能性は、ほとんどない。
ある実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子を、配列類似性に基づいて、クローニングしてもよい。
ある実施態様において、ベクターからａｓＤＮＡを転写するために、ａｓＲＮＡを、ベクター内の強力なプロモーターを用いて合成してもよい。数種の手法を用いることができる：ある手法では、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子全体を、アンチセンス方向でクローニングする。したがって潜在的に任意の遺伝子領域が、植物のセンスｍＲＮＡとアンチセンス複合体を形成し得、このｍＲＮＡは翻訳されず、機能的なＴＨＣＡ合成酵素を作成できない。
別の手法では、その遺伝子の一部に対応する様々なａｓＤＮＡを次の方向で発現できる：その遺伝子由来の約３０塩基対またはその相補体−ループ領域−相補的な方向の、その遺伝子と同一の遺伝子。これは、多様な生物でうまく使用されてきたｓｉＲＮＡを生成する。
ａｓＤＮＡおよびベクターの両方の作製において、ＰＣＲ＋ＲＥＳの混合またはＤＮＡ合成の手法を用いてもよい。
アサ植物および／またはアサ植物細胞の代謝生合成経路を改変する、ポリヌクレオチドおよび方法を記述し、ここでアサ植物および／またはアサ植物細胞は、改変された代謝生合成経路を示す。特に、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性を調節することにより、アサ植物のＴＨＣおよび／またはＣＢＤの生成量を改変する方法、ならびにＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性を改変したアサ植物を記述する。
したがって、ある実施態様において、本発明はＴＨＣの生成量を下方制御する方法を提供する。特別な実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性を下方制御する方法を提供する。また、ＴＨＣの生成量を改変した植物および／または植物細胞を提供する。ある態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性が下方制御されたアサ植物および／または細胞を提供する。
代謝経路における重要な工程の下方制御は、中間体およびエネルギーを代替の代謝経路に向かわせ、他の最終代謝物の生成量および蓄積量の増加をもたらす。ＴＨＣおよび他のアサの代謝物は、生合成経路を共有する；カンナビゲロール酸はＴＨＣ、ＣＢＤおよびカンナビクロメンの前駆体である。特にＴＨＣＡ合成酵素は、カンナビゲロール酸からのデルタ−９−テトラヒドロカンナビノール酸の生成を触媒する；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール酸は熱変換を起こし、ＴＨＣを形成する。ＣＢＤＡ合成酵素は、カンナビゲロール酸からのカンナビジオール酸の生成を触媒する；カンナビジオール酸はＣＢＤへの熱変換を起こす。ＣＢＣＡ合成酵素は、カンナビゲロール酸からのカンナビクロメン酸の生成を触媒する；カンナビクロメン酸はカンナビクロメンへの熱変換を起こす。
ＴＨＣ、ＣＢＤまたはカンナビクロメンの生成の減少は、この共有される経路における残りの代謝物の生成を増強する。例えば、ＣＢＤおよび／またはカンナビクロメンの生成は、ＴＨＣの生成を阻害することによって、増強される。ＴＨＣの生成は、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の発現および／または活性を阻害することによって、阻害され得る。
ある実施態様において、生合成経路を共有する１以上の代謝物の生成を下方制御することによって、１以上の二次代謝物の生成を増強することを記述する。ある実施態様は、ＴＨＣの生成の下方制御によって、ＴＨＣ生合成経路の工程および中間体を共有する１以上の二次代謝物の生成を増強する方法を提供する。特定の実施態様において、ＴＨＣの生成を阻害することにより、ＣＢＤおよび／またはカンナビクロメンの生成を増強する方法を提供する。
ある実施態様は、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性の下方制御による、ＴＨＣ生合成経路の工程および中間体を共有する１以上の二次代謝物の生成を増強する方法を提供する。特定の実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性の下方制御によって、ＣＢＤおよび／またはカンナビクロメンの生成を増強する方法を提供する。
また、生合成経路を共有する１以上の代謝物の生成を改変した植物および植物細胞を提供する。ある実施態様において、１以上の二次代謝物の生成が増強され、生合成経路を共有する１以上の他の代謝物が下方制御された、アサ植物および細胞を提供する。ある実施態様において、ＴＨＣ生合成経路における、１以上の二次代謝物の生成が増強され、１以上の他の代謝物が下方制御された、アサ植物および細胞を提供する。ある実施態様において、ＴＨＣ生合成経路における１以上の二次代謝物の生成が増強され、ＴＨＣ生成が下方制御された、アサ植物および細胞を提供する。特定の実施態様において、ＣＢＤおよび／またはカンナビクロメンの生成が増強され、ＴＨＣの生成が下方制御された、アサ植物および細胞を提供する。
ある実施態様は、ＴＨＣ生合成経路の工程および中間体を共有する１以上の二次代謝物の生成が増強され、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性が下方制御された、アサ植物および／または細胞を提供する。特定の実施態様において、ＣＢＤおよび／またはカンナビクロメンの生成が増強され、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性が下方制御された、アサ植物および／または細胞を提供する。
定義
本明細書の記述および表において、多くの用語が使用される。本明細書および特許請求の範囲の、明確で一貫した理解を提供するため、下記の定義を与える。他に言及がない限り、用語は関連する分野の当業者による従来の用法に従って理解される。
用語が単数形で与えられる場合、発明者は、その用語の複数形によって記述される本発明の態様をも想定する。
本明細書において、用語「テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素阻害化合物」は、ＴＨＣＡ合成酵素の酵素活性または、ＴＨＣＡ合成酵素の発現（例えば、ＴＨＣＡ合成酵素をコードするｍＲＮＡの合成（転写）および／またはＴＨＣＡ合成酵素ｍＲＮＡからのＴＨＣＡ合成酵素ポリペプチドの合成（翻訳）など）を抑制または減少させる化合物を指す。いくつかの実施態様において、選択されたＴＨＣＡ合成酵素阻害化合物は、ＴＨＣＡ合成酵素を特異的に阻害し、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の形成を減少させ、かつ／または、カンナビジオール（ＣＢＤ）を増加させる。
本明細書において、用語「発現カセット」は、転写するために選択されたＤＮＡを含むＤＮＡ分子を指す。さらに、発現カセットは、少なくとも発現に必要な全てのＤＮＡ要素を含む。形質転換の成功後、発現カセットは、選択されたＤＮＡをＲＮＡに転写するように、細胞の機構を導く。ある実施態様において、発現カセットは、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を抑制する、アンチセンスＲＮＡ、ｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する。
正しい調節配列を用いる限り、種々の発現カセットを、細菌、酵母、植物および哺乳類細胞を含む種々の生物に形質転換できる。
本明細書において、用語「発現」は、ポリペプチドを生成する構造遺伝子などのコードＤＮＡ分子によって起こる転写および翻訳を含む、細胞内プロセスの組合せを指す。アンチセンスＲＮＡ、ｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの発現は、ＤＮＡをＲＮＡに転写する工程を指す。
本明細書において、用語「タンパク質の存在量」は、全タンパク質の量に対する、または検定される細胞、組織、植物もしくは植物の部分の重量もしくは体積に対する、特定のタンパク質の量を指す。
本明細書において、用語「ｍＲＮＡの存在量」は、全タンパク質の量に対する、または検定される細胞、組織、植物もしくは植物の部分の重量もしくは体積に対する、特定のｍＲＮＡの量を指す。
本明細書において、用語「形質転換」は、ＤＮＡ配列またはコンストラクト（例えば、ベクターまたは発現カセット）を、細胞またはプロトプラストに導入する工程を指し、ここで外来性ＤＮＡは染色体内に取り込まれ、自己複製が可能である。
本明細書において、用語「異種の」は、その配列が現在発見されている遺伝学的状況において、所定のホストのゲノムに通常存在しない配列を指す。この点において、この配列は、ホストのゲノムに対して天然であってもよいが、ホスト配列中の他の遺伝子配列に対して再配置されてい得る。例えば、調節配列は、天然の調節配列とは異なるコード配列と連結しているという点で、異種であり得る。
本明細書において、用語「得る」は、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物と組み合わせて用いる場合、非トランスジェニック植物細胞または非トランスジェニック植物を形質転換し、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を作成することを意味し、またはトランスジェニック植物の種子を植え、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を生成することを意味する。このようなトランスジェニック植物の種子は、Ｒ０トランスジェニック植物由来でもよく、または始めの親のトランスジェニック植物由来の所定の遺伝子導入配列を受け継ぐ、その任意の世代の子孫由来でもよい。加えて、「得る」は、繁殖を通して植物を得ることを含む。
本明細書において、用語「Ｒ０トランスジェニック植物」は、形質転換された植物、または形質転換された植物細胞もしくは細胞から再生した植物を指す。
本明細書において、用語「形質転換コンストラクト」は、形質転換によってホストのゲノムに導入するために設計された、キメラＤＮＡ分子を指す。好ましくは、形質転換コンストラクトは、１以上の外来性遺伝子の発現を導くのに必要な全ての遺伝的要素を含む。本発明の特別な実施態様において、形質転換コンストラクトを、発現カセットの形式で、ホスト細胞に導入することが望まれ得る。
本明細書において、用語「導入遺伝子」は、ホストのゲノムに取り込まれ、またはホスト細胞中で自己複製でき、かつ１以上のコード配列の発現を生じることができる、ＤＮＡ断片を指す。代表的な導入遺伝子は、対応する形質転換されていない細胞または植物に対して、新規な表現型を有する、ホスト細胞またはそこから再生した植物を与える。導入遺伝子は、形質転換によって植物に直接導入されてもよく、ＤＮＡ断片で形質転換された任意の前世代の植物から受け継いでもよい。
本明細書において、用語「トランスジェニック植物」は、その植物またはその子孫のＤＮＡが、同系統の非トランスジェニック植物において天然には存在しない、導入された外来性ＤＮＡ断片を含む、植物またはその植物由来の任意の次世代の子孫植物を指す。トランスジェニック植物は、形質転換される植物に天然である配列をさらに含んでもよいが、ここでその「外来性」遺伝子は、その遺伝子の発現のレベルまたはパターン変えるために、例えば１以上の異種の調節要素または他の要素の使用によって変更されたものである。
本明細書において、用語「ベクター」は、ホスト細胞への形質転換のために設計されたＤＮＡ分子を指す。いくつかのベクターは、ホスト細胞中で複製可能でもよい。プラスミドおよびそこから単離される発現カセットは、代表的なベクターである。
本明細書において、用語「ＤＮＡ」、「ＤＮＡ分子」および「ＤＮＡポリヌクレオチド分子」は、デオキシリボヌクレオチド塩基のポリマーまたはＤＮＡポリヌクレオチド分子など、ゲノム起源または合成起源の一本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＤＮＡ分子を指す。
本明細書において、用語「ＤＮＡ配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。ｓｓＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡを指し；ｄｓＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを指す。
本明細書において、用語「ＲＮＡ」、または「ＲＮＡ分子」は、一本鎖領域または二本鎖領域を含むリボヌクレオチド塩基のポリマーなど、ゲノム起源または合成起源の一本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子を指す。「ｓｓＲＮＡ」は一本鎖ＲＮＡを明確に指し；「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを指す。
他の記述がない限り、本明細書におけるヌクレオチド配列は、左から右へ読む場合に、５’から３’方向となるように与えられる。本明細書で用いる命名法は、３７番目の米国連邦行政命令集１．８２２条によって必要とされるものであり、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１および表３における表に説明されている。
本明細書において、ポリヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡの形であってもよく、ｄｓＤＮＡに相当するもの、ｄｓＲＮＡに相当するもの、ｓｓＲＮＡに相当するもの、ｓｓＲＮＡ相補体、ｓｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ相補体を包含し得る。
本明細書において、第一の核酸配列、選択されたＤＮＡ、またはポリヌクレオチドは、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、第二の核酸配列と「作動可能に」結合または「連結」している。例えば、プロモーターがＲＮＡまたはコードする配列の転写または発現を与える場合、プロモーターは、ＲＮＡおよび／またはタンパク質コード配列、またはｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコードする配列、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸と、作動可能に連結している。一般的に、作動可能に連結しているＤＮＡ配列は近接しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、同一のリーディングフレーム内にある。
ある実施態様において、選択されたＤＮＡはアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉコンストラクトをコードする。別の実施態様において、選択されたＤＮＡは、リボザイムまたはＺｎフィンガータンパク質をコードする。
本明細書において、語句「ここで、前記植物は導入遺伝子を含まない」は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結しているプロモーターを含むＤＮＡ分子または組換えウイルスベクターのいずれも含まない植物を指す。
本明細書において、用語「転写産物」は、転写の工程によって遺伝子から生成する任意のＲＮＡに対応する。したがって、遺伝子の転写産物は、イントロンを含み得る主要な転写生成物を含んでもよく、またはイントロンを含まない成熟ＲＮＡを含んでもよい。
本明細書において、「ヌクレアーゼ」は、天然および設計（すなわち改変）された、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」、「ＧＩＹ−ＹＩＧ」、「Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス」およびＨＮＨファミリー(例えば、Chevalier and Stoddard, 2001) の触媒活性および配列モチーフを有する、エンドヌクレアーゼならびに、所定の標的特異性において天然に生じ、または設計されたＺｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（例えば、Durai et al., 2005;米国特許第7,220,719号）、など）を意味する。別の想定されるエンドヌクレアーゼは、サッカロミケス・ケレウィシアエ（出芽酵母、Saccharomyces cerevisiae）ＨＯヌクレアーゼ（例えば、Nickoloff et al., 1986）またはその変異体である。
本明細書において、「カスタムエンドヌクレアーゼ」は、１以上の認識配列において、またはそれらに近接して切断するように進化、または合理的に設計したエンドヌクレアーゼ（例えば、WO06097853、WO06097784、WO04067736またはUS20070117128）を意味する。このようなカスタムエンドヌクレアーゼは、その認識、結合および／またはヌクレアーゼ活性を操作できるような遺伝子改変を可能とする性質を持つ。
本明細書において、「対立遺伝子」は、特定の遺伝子座における代替の配列を指す；対立遺伝子の長さは、１ヌクレオチド塩基と同程度に短くてもよいが、典型的にはより長い。対立遺伝子配列を、核酸配列またはその核酸配列によってコードされるアミノ酸配列として表示してもよい。あるいは、対立遺伝子は遺伝子の１つの形態であってもよく、単純に優勢または劣勢の性質を示してもよく、または、１以上の他の対立遺伝子に対する、不完全優性、共優性、条件優性、エピスタシスまたは１以上のそれらの組合せなどのより複雑な遺伝的関係を示してもよい。
「遺伝子座」は、基準点によって通常見出されるゲノム配列上の位置である；例えば、遺伝子、遺伝子の一部または遺伝子間領域の一部である短いＤＮＡ配列。本発明の遺伝子座は、ある集団における１以上の遺伝子多型を含む；すなわち、代替の対立遺伝子がいくつかの個体に存在する。
核酸
本発明は、ＴＨＣＡ合成酵素およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を含む核酸を提供する。核酸は、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのフラグメントおよびそれらの改変物を含む。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、複数のヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指してもよく、一般的に「オリゴヌクレオチド」（１８〜２５ヌクレオチド長のポリヌクレオチド分子）および２６ヌクレオチド以上のより長いポリヌクレオチドの両方を指す。本発明の実施態様は、１８〜２５ヌクレオチドの長さ（１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、または２５塩基）およびより長い長さのオリゴヌクレオチド、または２６ヌクレオチド以上の長さを有する中程度の長さのポリヌクレオチド（２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、または約３００ヌクレオチドのポリヌクレオチド）、または約３００ヌクレオチドを超える長さを有する長いポリヌクレオチド（例えば、約３００ないし約４００ヌクレオチド、約４００ないし約５００ヌクレオチド、約５００ないし約６００ヌクレオチド、約６００ないし約７００ヌクレオチド、約７００ないし約８００ヌクレオチド、約８００ないし約９００ヌクレオチド、約９００ないし約１０００ヌクレオチド、約３００ないし約５００ヌクレオチド、約３００ないし約６００ヌクレオチド、約３００ないし約７００ヌクレオチド、約３００ないし約８００ヌクレオチド、約３００ないし約９００ヌクレオチド、または約１０００ヌクレオチドの長さ、または約１０００ヌクレオチドをも超える長さ（例えば、ＴＨＣＡ合成酵素のコード部分もしくは非コード部分またはコード部分および非コード部分の両方を含む、標的のＴＨＣＡ合成酵素遺伝子の全長に至る長さ）のポリヌクレオチド）を含む構成物を含む。ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その長さは塩基対に関して同様に記述できる。
本発明の様々な実施態様で使用されるポリヌクレオチドの構成物は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはその両方の混合物を含む構成物を含み；ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合型、化学修飾されたオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらの混合物を含む。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せであってもよい（例えば、主にリボヌクレオチドからなるが、１以上の末端デオキシリボヌクレオチドを含む、合成ポリヌクレオチド、または、主にデオキシリボヌクレオチドからなるが、１以上の末端ジデオキシリボヌクレオチドを含む、合成ポリヌクレオチド）。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、イノシン、チオウリジンまたはプソイドウリジンなどの非標準ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドを含む。化学修飾されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの例は、当分野でよく知られている；例えば、米国特許出願公開第2011/0171287号、米国特許出願公開第2011/0171176号、米国特許出願公開第2011/0152353号、米国特許出願公開第2011/0152346号、および米国特許出願公開第2011/0160082号参照、ここで、これらは参照によって本明細書に取り込まれる。具体例は、限定されないが、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、またはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合修飾で部分的または完全に修飾され得る、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、天然に生じるリン酸ジエステル骨格、修飾されたヌクレオシド塩基、または修飾された糖を、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの合成に用いてもよいこと、およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、蛍光成分（例えば、フルオレセインまたはローダミン）または他の標識（例えば、ビオチン）で標識してもよいことを含む。
ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ複合型、およびそれらの改変された類似体でもよい。本発明のある実施態様において、植物細胞中の一本鎖ＲＮＡを与えるポリヌクレオチドは：（ａ）一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ）、（ｂ）自己ハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡを形成する一本鎖ＲＮＡ分子、（ｃ）二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）、（ｄ）一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）、（ｅ）自己ハイブリダイズし、二本鎖ＤＮＡ分子を形成する一本鎖ＤＮＡ分子、（ｆ）ＲＮＡ分子に転写されることを含む一本鎖ＤＮＡ分子、（ｇ）二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）、（ｈ）ＲＮＡ分子に転写される二本鎖ＤＮＡ分子、および（ｉ）二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ分子複合型、またはそれらの組合せであってもよい。ある実施態様において、これらのポリヌクレオチドは、リボ核酸残基およびデオキシリボ核酸残基の両方を含み得る。ある実施態様において、これらのポリヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドまたは非標準ヌクレオチドを含む。本方法のある実施態様において、ポリヌクレオチドは、分子内ハイブリダイゼーションによって形成する二本鎖ＤＮＡ、分子間ハイブリダイゼーションによって形成する二本鎖ＤＮＡ、分子内ハイブリダイゼーションによって形成する二本鎖ＲＮＡ、または分子間ハイブリダイゼーションによって形成する二本鎖ＲＮＡを含む。ある実施態様において、ポリヌクレオチドがｄｓＲＮＡである場合、アンチセンス鎖は、標的のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子に本質的に相補的な、少なくとも１８個のヌクレオチドを含んでもよい。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、自己ハイブリダイズし、少なくとも部分的に二本鎖構造を持つヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを含み、この二本鎖構造は、抑制する標的遺伝子から転写されたＲＮＡとハイブリダイズする少なくとも１つの部分を含む。いかなる機構によっても拘束されることを意図しないが、このようなポリヌクレオチドは、抑制する標的遺伝子から転写されたＲＮＡとハイブリダイズする少なくとも１つの部分を含む、一本鎖ＲＮＡであり、またはそれを生成すると考えられる。
本発明のポリヌクレオチド分子を、内在性ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の制御または抑制を誘導することによって、発現を調節し、アサ植物のＴＨＣの含量を減少し、および／またはＣＤＢ含量を増加するように設計し、かつ、植物の内在性ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子のヌクレオチド配列または植物の内在性ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子から転写されたＲＮＡ配列と、本質的に同一または本質的に相補的なヌクレオチド配列を含むように設計し、ここで、この配列はコード配列でもよく、または非コード配列でもよい。発現を調節するこれらの効果的なポリヌクレオチド分子は、本明細書では「トリガー」と呼ばれる。
「本質的に同一」または「本質的に相補的」は、トリガーのポリヌクレオチド（または二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一本鎖）が、内在性遺伝子または内在性ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、転写産物）と、内在性ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現を抑制する（例えば、遺伝子転写産物および／またはコードされたタンパク質のレベルまたは活性の減少をもたらす）のに、十分同一または相補的であることを意味する。本方法のポリヌクレオチドおよび本明細書における構成物は、内在性ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現を抑制する（例えば、遺伝子転写産物またはコードされたタンパク質のレベルまたは活性の減少をもたらす）ために、内在性ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子または内在性ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子から転写されたＲＮＡ（すなわち、転写産物）と１００％同一の相補性を有する必要はない。したがって、ある実施態様において、ポリヌクレオチドまたはその一部は、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（例えば、転写産物）のいずれかにおける少なくとも１８個または１９個の連続するヌクレオチド配列と、本質的に同一または本質的に相補的となるように設計される。ある実施態様において、「本質的に同一」のポリヌクレオチドは、内在性標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、転写産物）のいずれかにおける１８個以上の連続するヌクレオチド配列と比較して、１００％の配列同一性または少なくとも約８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する。ある実施態様において、「本質的に相補的」なポリヌクレオチドは、標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡのいずれかにおける１８個以上の連続するヌクレオチド配列と比較して、１００％の配列相補性または少なくとも約８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列相補性を有する。ポリヌクレオチドの相補体は、基準の配列と完全に相補的な配列および完全に逆相補的な配列を含む。
ある実施態様において、本方法で用いるポリヌクレオチドおよび本明細書における構成物は、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の保存領域またはＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の非保存領域のいずれかと本質的に同一または本質的に相補的であってもよい。このような領域と本質的に同一または本質的に相補的なこのようなポリヌクレオチドを用いて、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）を減少させ、かつ／またはカンナビジオール（ＣＢＤ）を増加させてもよい。
したがって、標的遺伝子または転写産物とのミスマッチを含むポリヌクレオチドを、ある実施態様における構成物および本明細書における方法に用いてもよい。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、前記遺伝子または前記転写産物と本質的に同一または本質的に相補的な、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含んでもよく、標的遺伝子または標的遺伝子の転写産物と本質的に同一または本質的に相補的な少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む。ある実施態様において、内在性標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば転写産物）と本質的に同一または本質的に相補的な、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチドは、標的遺伝子または転写産物に対して、１個または２個のミスマッチを有してもよい。ある実施態様において、内在性標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡと同一または相補的な連続する１９ヌクレオチド長を含む、２０ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドは、標的遺伝子または転写産物に対して、１個または２個のミスマッチを有してもよい。ある実施態様において、内在性標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば転写産物）と本質的に同一または本質的に相補的な、２１個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチドは、標的遺伝子または転写産物に対して、１、２または３個のミスマッチを有してもよい。ある実施態様において、内在性標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡと同一または相補的な連続する２１ヌクレオチド長を含む、２２ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドは、標的遺伝子または転写産物に対して、１、２または３個のミスマッチを有してもよい。内在性標的遺伝子または標的遺伝子から転写されたＲＮＡとのミスマッチを有するポリヌクレオチドの設計において、許容される可能性がより高い、特定の種および特定の位置におけるミスマッチを用いてもよい。ある代表的な実施態様において、アデニン残基とシトシン残基またはグアノシン残基とウラシル残基との間で形成されるミスマッチを、Du et al. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 5 1671-1677で記述されるように用いてもよい。ある代表的な実施態様において、１９塩基対のオーバーラップ領域におけるミスマッチは、Du et al. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 5 1671-1677に記述されるように、よく許容されるヌクレオチドミスマッチ残基での（標的の１９ヌクレオチドの５’末端から）５、７、８または１１番目の許容性の低い位置、３、４および１２〜１７番目の中程度に許容される位置および／または相補性領域のいずれかの末端（すなわち、１、２、１８および１９番目）の許容性の高いヌクレオチドの位置においてでもよい。許容されるミスマッチを、ポリヌクレオチドが本明細書における方法を介して、植物に適用される場合のアッセイにおいて、ならびにＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子発現の抑制または有効期間の改善および収穫後の損失の減少についてアッセイされた、処理された植物において、経験的に決定してもよいと想定される。
ある実施態様において、ポリヌクレオチド分子を、所定のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子のコード配列または非コード配列の１つの対立遺伝子または１つのファミリーメンバーと、１００％の配列同一性または配列相補性を有するように設計する。標的のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子は、配列番号１〜４７のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子を含む。他の実施態様において、ポリヌクレオチド分子を、所定の標的遺伝子の複数の対立遺伝子または複数のファミリーメンバーと１００％の配列同一性または配列相補性を有するように設計する。
ある実施態様において、本明細書で提供されるポリヌクレオチドの構成物および方法は典型的に、少なくとも１週間またはそれ以上の処理された植物の生存期間中に、典型的に全体的な様式で、遺伝子発現の制御または調節（例えば、抑制）をもたらす。例えば、植物の葉を本発明のポリヌクレオチドの構成物で処理して数日以内に、主要でかつ推移的なｓｉＲＮＡを、処理した葉の外側および上の他の葉および頂端組織中で検出できる。ある実施態様において、植物において遺伝子発現を全体的に抑制する方法を提供し、この方法は、前記植物を、少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび伝達剤(transfer agent)を含む構成物で処理することを含み、ここで前記ポリヌクレオチドは、植物のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子をコードする遺伝子または転写産物と、本質的に同一または本質的に相補的な少なくとも１８個または少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含み、これによって、前記植物またはその子孫の遺伝子発現は、構成物で処理されていない対照の植物と比較して、全体的に抑制される。
標的遺伝子を抑制するために用いる構成物は、複数の遺伝子、または１以上の遺伝子の複数の断片と本質的に同一または本質的に相補的な１以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。ある実施態様において、標的遺伝子を抑制するために用いる構成物は、標的遺伝子の複数の連続した断片、標的遺伝子の複数の不連続な断片、標的遺伝子の複数の対立遺伝子または１以上の種由来の複数の標的遺伝子と本質的に同一または本質的に相補的な１以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。
ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、（１８ヌクレオチド以上の）ヌクレオチド配列の２以上のコピーを含み、このコピーは直列式で配置される。別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、（１８ヌクレオチド以上の）ヌクレオチド配列の２以上のコピーを含み、このコピーは逆方向反復式で配置される（少なくとも部分的に自己相補鎖を形成する）。ポリヌクレオチドは、直列のコピーと逆方向反復のコピーの両方を含んでもよい。直列式で配置されるか、逆方向反復式で配置されるかによって、各コピーは直接次のコピーに隣接でき、またはコピー対は１以上のヌクレオチドの任意のスペーサーによって分離され得る。任意のスペーサーは、無関係の配列（すなわち、コピーと本質的に同一または本質的に相補的でなく、内在性標的遺伝子または内在性標的遺伝子から転写されたＲＮＡの１８個以上の連続するヌクレオチド配列と本質的に同一または本質的に相補的でない）であってもよい。あるいは、任意のスペーサーは、コピーの標的である部分に隣接する内在性標的遺伝子の部分に相補的な配列を含んでもよい。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、約２０ないし約３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列の２つのコピーを含み、この２つのコピーを、そのヌクレオチド配列の長さ以下のスペーサーによって分離する。
ある実施態様において、核酸分子は、GenBank目録番号JQ437488.1 （配列番号１）；JQ437487.1 （配列番号２）；JQ437486.1 （配列番号３）；JQ437485.1 （配列番号４）；JQ437484.1 （配列番号５）；JQ437483.1 （配列番号６）；JQ437482.1 （配列番号７）；JQ437481.1 （配列番号８）；JQ437496.1 （配列番号９）；JQ437495.1 （配列番号１０）、JQ437494.1 （配列番号１１）；JQ437493.1 （配列番号３８）；JQ437492.1 （配列番号１２）；JQ437491.1 （配列番号１３）；JQ437490.1 （配列番号１４）；JQ437489.1 （配列番号１５）；AB212841.1 （配列番号１６），AB212840.1 （配列番号１７）；AB212839.1 （配列番号１８）；AB212838.1 （配列番号１９）；AB212837.1 （配列番号２０）；AB212836.1 （配列番号２１）；AB212835.1 （配列番号２２）；AB212834.1 （配列番号２３）；AB212833.1 （配列番号２４）；AB212832.1 （配列番号２５）；AB212831.1 （配列番号２６）；AB212830.1 （配列番号２７）；AB212829.1 （配列番号２８）；AB183705.1 （配列番号２９) AB183704.1 （配列番号３０）；AB183703.1 （配列番号３１）；AB183702.1 （配列番号３２）；AB183701.1 （配列番号３３）；AB183700.1 （配列番号３４）；AB183699.1 （配列番号３５）；AB183698.1 （配列番号３６），EU839988.1 （配列番号３７）；AB057805.1 （配列番号４０）；E33090.1 （配列番号４４），E33091.1 （配列番号４５），AB731220.1 （配列番号３９）；に記述される配列もしくは配列の相補体、それらの変異体またはフラグメント、または核酸分子と、少なくとも約８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の配列同一性または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、このフラグメントは少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、８０、１００、１５０、または２００個の連続するヌクレオチドを有する。
ある実施態様において、核酸分子は、GenBank目録番号AB731220.1 （配列番号３９）；AB292682.1 （配列番号４２）；AB292683.1 （配列番号４１）；AB292684.1 （配列番号４３）；AB212829.1 （配列番号２８）；AB212838.1 （配列番号１９）；AB212837.1 （配列番号２０）；AB212835.1 （配列番号２２）；AB212834.1 （配列番号２３）；AB212832.1 （配列番号２５）；AB057805.1 （配列番号４０）； AB731220.1 （配列番号３９）；AB212833.1 （配列番号２４）；AB212836.1 （配列番号２１）；AB212841.1 （配列番号１６）；AB212831.1 （配列番号２６）；AB212839.1 （配列番号１８）；AB212830.1 （配列番号２７）；AB212840.1 （配列番号１７）；JQ437490.1 （配列番号１４）；JQ437485.1 配列番号４）；JQ437487.1 （配列番号２）；JQ437486.1 （配列番号３）；JQ437481.1 （配列番号８）；JQ437482.1 （配列番号７）；JQ437483.1 （配列番号６）；JQ437484.1 （配列番号５）；JQ437488.1 （配列番号１）；JQ437492.1 （配列番号１２）；JQ437489.1 （配列番号１５）；JQ437491.1 （配列番号１３）；に記述される配列もしくは配列の相補体、それらの変異体またはフラグメント、または核酸分子と、少なくとも約８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の配列同一性または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、このフラグメントは少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、８０、１００、１５０、または２００個の連続するヌクレオチドを有する。
他の実施態様において、ＴＨＣＡ合成酵素をコードする配列およびそのフラグメントまたはその相補体と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む核酸を提供する。
本発明のいくつかの実施態様において、ヌクレオチド配列は１以上の置換、挿入および／または欠失を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド配列は１以上のＴ−ＤＮＡの挿入を含む。他の実施態様において、核酸は選択マーカーカセットを含む。他の実施態様において、ヌクレオチド配列は１以上の点変異を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド配列は欠失を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド配列は再編成を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド配列はフレームシフトを含む。
本発明の核酸またはその相補体とハイブリダイズする核酸をまた、提供する。ある実施態様において、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーの条件下で、それらの配列のいずれかとハイブリダイズする核酸を提供する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）が、核酸間の相補性の程度、関係する条件のストリジェンシー、形成したハイブリッドのＴｍ、および核酸のＧ：Ｃ比などの要素によって影響を受けることを、当業者は容易に理解できる。そのような当業者は、適切なストリンジェントな条件を容易に決定できる（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 9.50-51, 11.48-49および11.2-11.3参照）。
典型的に、高いストリジェンシー条件下において、非常に類似した配列のみがハイブリダイズする（典型的に＞９５％の同一性）。中程度のストリジェンシー条件下において、典型的に８０％よりも高い同一性を有するこれらの配列がハイブリダイズし、低いストリジェンシー条件下において、５０％よりも高い同一性を有するこれらの配列がハイブリダイズする。
核酸のハイブリダイゼーションに関して用いる際の「高いストリジェンシー条件」の限定されない例は、約５００ヌクレオチド長のプローブを利用する場合に、５ＸＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調製）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハルトの試薬および１００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合またはハイブリダイゼーション後、次いで、０．１ＸＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することに相当する条件を含む。核酸のハイブリダイゼーションに関して用いる際の「中程度のストリジェンシー条件」の限定されない例は、約５００ヌクレオチド長のプローブを利用する場合に、５ＸＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調製）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハルトの試薬および１００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合またはハイブリダイゼーション後、次いで、１．０ＸＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することに相当する条件を含む。核酸のハイブリダイゼーションに関して用いる際の「低いストリジェンシー条件」の限定されない例は、約５００ヌクレオチド長のプローブを利用する場合に、５ＸＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調製）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハルトの試薬および１００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合またはハイブリダイゼーション後、次いで、５ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することに相当する条件を含む。核酸は、追加の配列を含んでもよい。例えば、核酸は、複数の制限部位、追加のコード配列（例えば、精製タグ、局在化シグナル、融合タンパク質としての追加のコード配列、プレタンパク質としての追加のコード配列、など）を、および／または非コード配列（例えば、イントロンもしくはインテイン、プロモーター（ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター（根特異的プロモーター、花特異的プロモーター、果実特異的プロモーター、種子特異的プロモーターまたは葉特異的プロモーターなど）を含む）、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントなど）と共に、および／または、転写因子もしくは転写因子ホモログポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが内在性遺伝子もしくは外来性遺伝子であるベクターまたはホスト環境中に、含んでもよい。植物／植物細胞に用いる、適切な追加のコード配列（例えば、精製タグ、局在化シグナル、融合タンパク質としての追加のコード配列、プレタンパク質としての追加のコード配列、など）、非コード配列（イントロン、プロモーター（構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターを含む）、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントなど）、およびベクターは、当分野で公知である。
調節エレメント
核酸配列の発現のための代表的なプロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Odell et al., 1985）などの植物プロモーター、またはＣａＭＶ １９Ｓ（Lawton et al., 1987）、ｎｏｓ（Ebert et al., 1987）、Ａｄｈ（Walker et al., 1987）、スクロースシンターゼ（Yang and Russell, 1990）、チューブリン、アクチン（Wang et al., 1992）、ｃａｂ（Sullivan et al., 1989）、ＰＥＰＣａｓｅ（Hudspeth and Grula, 1989）またはＲ遺伝子複合体に結合するそれら(Chandler et al., 1989)などの他のプロモーターを含む。根細胞特異的プロモーター（Conkling et al., 1990）などの組織特異的プロモーターおよび組織特異的エンハンサー（Fromm et al., 1986）ならびにＡＢＡ誘導性プロモーターおよび膨圧誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターもまた、有用であると想定される。ＰＡＬ２プロモーターは、本発明に特に有用であり得る（米国特許出願公開第2004/0049802号、その全体の開示が参照によって本明細書に明確に取り込まれる）。
転写開始部位とコード配列の開始点の間のＤＮＡ配列（すなわち、翻訳されないリーダー配列）はまた、遺伝子発現に影響し得る。したがって、特定のリーダー配列を、本発明の形質転換コンストラクトと共に用いることが望まれ得る。好ましいリーダー配列は、付随する遺伝子の最適な発現を導くことが予測される配列を含むリーダー配列を含むこと（すなわち、ｍＲＮＡの安定性を増強または維持し、翻訳の不適当な開始を防ぎ得る、好ましいコンセンサスリーダー配列を含むこと）が想定される。このような配列の選択は、本開示を考慮して、当業者に知られている。植物において強く発現する遺伝子に由来する配列が、典型的に好ましい。
本発明において使用されるベクターを、ｏｃｓエンハンサー要素を含むように構築してもよいことが想定される。この要素は、アグロバクテリウムのオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子由来の１６ｂｐのパリンドロームエンハンサーとして、最初に同定され(Ellis et al., 1987)、少なくとも１０個の他のプロモーター中に存在する(Bouchez et al., 1989)。エンハンサー要素の使用（ｏｃｓ要素および特にその要素の複数のコピーなど）は、植物の形質転換に関して適用される場合、隣接するプロモーターからの転写のレベルを増加するように作用し得る。
ポリヌクレオチド配列または選択されたＤＮＡ配列を、新規なプロモーターもしくはエンハンサーなど、または相同なプロモーターもしくは組織特異的プロモーターまたは調節エレメントの制御下に、導入してもよいことが想定される。トランスジェニック植物の遺伝子の組織特異的なターゲティングにおいて使用するベクターは、典型的に組織特異的プロモーターを含み、また、エンハンサー配列などの他の組織特異的な調節エレメントを含んでもよい。特定の植物組織における特異的、または増強した発現を導くプロモーターは、本開示を考慮して、当業者に知られている。例えば、これらは、緑色組織に特異的なｒｂｃＳプロモーター；根または傷ついた葉組織中でより高い活性を示すｏｃｓ、ｎｏｓおよびｍａｓプロモーターを含む。ある実施態様において、プロモーターを、選択されたＤＮＡの発現量を低くするために用いてもよい。低発現プロモーターを、高発現量を生じるプロモーターのＤＮＡ要素の変異および／または組換えによって、または、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現を低い存在比で生じる遺伝子の上流の調節エレメントを選択することによって、得てもよい。
プロモーターは当分野で記述されてきた；したがって本発明は、ある実施態様において、プロモーターと選択されたＤＮＡの新規の組合せを提供する。一つの実施態様では、形質転換細胞において、選択されたＤＮＡを構成的に発現するため、構成的プロモーターを５’から選択されたＤＮＡにクローニングする。
別の実施態様において、誘導性プロモーターを用いて、特定の条件下で選択されたＤＮＡの発現を活性化してもよい。例えば、選択されたＤＮＡの上流にクローニングされた低温ショックプロモーターを用いて、低温条件下で選択されたＤＮＡを誘導してもよい。他の環境誘導性プロモーター(environmentally inducible promoter)が記述されており、選択されたＤＮＡとの新規な組合せで使用できる。別種の誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーター(chemically-inducible promoter)である。このようなプロモーターは、化学誘導剤の適用によって、正確に活性化され得る。化学誘導性プロモーターの例は、ステロイド誘導性プロモーターおよびクオラムセンシングプロモーターを含む（例えば、You et al., 2006;米国特許出願公開第2005/0227285号参照）。近年、リガンド特異的アプタマーおよびリボスイッチを含む、改変されたＲＮＡ分子を用いて、標的遺伝子の発現を化学的に制御できることが示されてきた（Tucker et al, 2005;国際公開第WO2006073727号）。このようなリボレギュレーターを用いて、化学的リガンドの添加または除去によって、ＴＡＬＥＲをコードする遺伝子の発現を制御してもよい。
このコンストラクトは、ホスト細胞で機能するプロモーター配列と作動可能に連結している、本発明のヌクレオチド配列を含んでもよい。このようなプロモーターは組織特異的であってもよく、例えば、害虫駆除(pest attack)の対象となる組織型に特異的でもよい。例えばルートワームの場合、葉に優先的な発現を与えるプロモーターを用いることが望まれ得る。
種々の植物種において機能するプロモーターもまた、当分野でよく知られている。植物におけるポリペプチドの発現に有用なプロモーターは、Odell et al. (1985)に記述されるように、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、合成プロモーターまたは構成的プロモーターを含み、かつ／または、時間的に制御されたプロモーター、空間的に制御されたプロモーターおよび時空間的に制御されたプロモーターを含む。好ましいプロモーターは、増強されたＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＦＭＶ３５Ｓプロモーターを含む。本発明の目的のため、例えば、根を餌とする種の最適な制御のため、植物の根におけるこれらの遺伝子の最も高いレベルの発現量を達成することが好ましいことがある。多数の根で増強するプロモーターが同定され、当分野で知られている(Lu et al., 2000; 米国特許第5,837,848号および第6,489,542号)。
葉特異的プロモーターの例が米国特許第6,229,067号に記述され、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれ、花特異的プロモーターは当分野で知られており、Du L., et al., Plant Molecular Biology Reporter, February 2014, Volume 32, Issue 1, pp 234-245に記述されている。
ターミネーター
本発明に従って調製した形質転換コンストラクトは、転写を終結させるシグナルとして作用する３’末端のＤＮＡ配列を典型的に含み、プロモーターに作動可能に連結しているコード配列によって生成するｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にする。これに関連して有用であると考えられるターミネーターの例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ ３’末端）由来のターミネーター（Bevan et al., 1983）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子由来のＴ７転写産物におけるターミネーター、およびジャガイモまたはトマト由来のプロテアーゼ阻害剤ＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端を含む。Ａｄｈイントロン（Callis et al., 1987）、スクロースシンターゼイントロン（Vasil et al., 1989）またはＴＭＶオメガエレメントなどの調節エレメントを、望ましい場合はさらに含んでもよい。
マーカー遺伝子
選択可能またはスクリーニング可能なマーカータンパク質を利用することによって、形質転換体を同定する能力を提供または増強できる。「マーカー遺伝子」は、マーカータンパク質を発現する細胞に明確な表現型を与え、したがってそのような形質転換細胞を、マーカーを持たない細胞と区別することを可能にする。そのような遺伝子は、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードし得、これはマーカーが化学的手段によって、すなわち選択剤（例えば、除草剤、抗生剤など）の使用を通して「選択」できる形質を与えるか、またはマーカーが単純に、観測または検定を通して、すなわち「スクリーニング」（例えば、緑色蛍光タンパク質）によって同定できる形質であるか、に依存する。言うまでもなく、適切なマーカータンパク質の多くの例が当分野で知られており、本発明の実行において利用できる。
用語としての選択可能またはスクリーニング可能なマーカーはまた、形質転換細胞を同定または選択する手段として、その分泌を検出できる「分泌可能なマーカー」をコードする遺伝子を含む。実施例は、抗体相互作用によって同定できる分泌可能な抗原であるマーカー、または触媒活性によって検出できる分泌可能な酵素であるマーカーさえも含む。分泌可能なタンパク質は多数の種類に分けられ、それは、例えばＥＬＩＳＡで検出できる、低分子で拡散性のタンパク質；細胞外溶液中で検出できる低分子活性酵素（例えば、アルファ−アミラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）；および細胞壁に挿入または捕捉されるタンパク質（例えば、エクステンシンまたはタバコＰＲ Ｓの発現ユニット中に見出されるリーダー配列などのリーダー配列を含むタンパク質）を含む。
多くの選択可能なマーカーをコードする領域が知られており、本発明と共に使用することができ、それらは限定されないが、ｎｅｏ(Potrykus et al., 1985)（カナマイシン耐性を与え、カナマイシン、Ｇ４１８、パロモマイシンなどを用いて選択できる）；ｂａｒ（ビアラホス耐性またはホスフィノトリシン耐性を与える）；グリホサート耐性を与えるＥＰＳＰシンターゼタンパク質変異体(Hinchee et al., 1988)；ブロモキシニル耐性を与えるクレブシエラ・オゼネ由来のｂｘｎなどのニトリラーゼ(Stalker et al., 1988)；イミダゾリノン耐性、スルホニルウレア耐性または他のＡＬＳ阻害化学物質耐性を与えるアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）変異体(欧州特許出願第154, 204, 1985号)；メトトレキセート耐性ＤＨＦＲ(Thillet et al., 1988)、ダラポン除草剤耐性を与えるダラポンデハロゲナーゼ；または５−メチルトリプトファン耐性を与えるアントラニル酸シンターゼ変異体を含む。
形質転換体を選択するための系において使用できる、選択可能なマーカーの具体的な実施態様は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス由来のｂａｒ遺伝子またはストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)由来のｐａｔ遺伝子などの、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードする選択可能なマーカーである。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）酵素は、ビアラホス除草剤、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）除草剤中の活性成分を不活化する。ＰＰＴはグルタミンシンテターゼを阻害し(Murakami et al., 1986; Twell et al., 1989)、アンモニアの急速な蓄積および細胞死を引き起こす。
利用され得るスクリーニング可能なマーカーは、様々な発色基質が知られている酵素をコードする、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）もしくはｕｉｄＡ遺伝子；植物組織のアントシアニン色素（赤色）の生成を制御する生成物をコードする、Ｒ遺伝子座(Dellaporta et al., 1988)；様々な発色基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）が知られている酵素をコードする、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子(Sutcliffe, 1978)；発色性カテコールに変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子(Zukowsky et al., 1983)；アルファ−アミラーゼ遺伝子(Ikuta et al., 1990)；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンへ酸化できる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子(Katz et al., 1983)（ここで、ＤＯＰＡおよびドーパキノンは次々に縮合し、容易に検出できる化合物であるメラニンを形成する）；発色基質がある酵素をコードするベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子；生物発光の検出が可能なルシフェラーゼ（ｌｕｘ）遺伝子(Ow et al., 1986)；カルシウム感受性生物発光の検出に利用できるエクオリン遺伝子(Prasher et al., 1985)；または緑色蛍光タンパク質(Sheen et al., 1995; Haseloff et al., 1997; Reichel et al., 1996; Tian et al., 1997; WO 97/41228)をコードする遺伝子、を含む。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子はまた、特に有用なレポーター遺伝子(Sheen et al., 1995; Haseloff et al., 1997; Reichel et al., 1996; Tian et al., 1997; WO 97/41228)として想定される。緑色蛍光タンパク質の発現を、特定の波長の光による照射に続く蛍光として、細胞中または植物中で可視化してもよい。
ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性を改変した植物／植物細胞
野生型の植物（例えば、原品種）と比較して、ＴＨＣの生成量を改変したアサ植物および／またはアサ植物細胞を記述する。ある実施態様において、野生型の植物（例えば、原品種）と比較して、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性を下方制御したアサ植物および／または細胞を提供する。ある実施態様において、このアサ植物および／または細胞はＴＨＣの生成量が減少し、またはＴＨＣを生成しない。ＴＨＣの生成量が減少した、またはＴＨＣを生成しない、アサ植物および／または細胞のある実施態様において、ＴＨＣ生合成経路上の他の代謝物の生成量が増加する。
ある実施態様において、ＴＨＣ生合成経路の１以上の二次代謝物の生成が増強され、ＴＨＣの生成が下方制御された、アサ植物および細胞を提供する。特定の実施態様において、ＣＢＤおよび／またはカンナビクロメンの生成が増強され、ＴＨＣの生成が下方制御されたアサ植物および細胞を提供する。
ある実施態様において、ＴＨＣ生合成経路における工程および中間体を共有する１以上の二次代謝物の生成が増強され、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性が下方制御された、アサ植物および／または細胞を提供する。特定の実施態様において、ＣＢＤおよび／またはカンナビクロメンの生成が増強され、ＴＨＣＡ合成酵素の発現および／または活性が下方制御された、アサ植物および／または細胞を提供する。
アサ植物を、ＴＨＣＡ合成酵素に加えて、他のタンパク質の発現および／または活性を改変するように設計してもよい。例えば、アサ植物はまた、ＣＢＤＡ合成酵素、ＣＢＣＡ合成酵素などの、ＴＨＣＡ合成酵素と中間体を共有する他の酵素の発現および／または活性の改変を含んでもよい。同様に、本発明のアサ植物を、特定の表現型を有する植物と交雑してもよい。
二次代謝物の生成を改変したアサ植物は、変異誘発されていなくてもよく、変異誘発されていてもよく、またはトランスジェニックであってもよく、およびその子孫でもよい。
ある実施態様において、二次代謝物の改変を示すアサ植物は、自然突然変異の結果である。
ある実施態様において、二次代謝物の改変を示すアサ植物は、化学的手段または物理的手段によって変異誘発されている。例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を変異原として用いてもよく、ｘ線照射、ガンマ線照射および高速中性子照射などの照射を変異原として用いてもよい。
ある他の実施態様において、二次代謝物の改変を示すアサ植物は、遺伝子操作されている。
アンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ
アンチセンスまたはＲＮＡ干渉の手法を用いて、例えば植物の表現型を調節するためのさらなる機構として、本発明の核酸の発現を下方制御してもよい。本発明の核酸のアンチセンス配列またはそのサブシークエンスを用いて、天然に生じる類似の核酸の発現を遮断してもよい。例えば、LichtensteinおよびNellen(Antisense Technology: A Practical Approach IRL Press at Oxford University, Oxford, England, 1997)に記述されるような、多様なセンスおよびアンチセンスの技術を使用できる。
ある実施態様において、センス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入し、それらを転写する。そのような配列は、単純なオリゴヌクレオチド配列およびリボザイムなどの触媒性配列の両方を含んでもよい。
ある実施態様において、トランスジェニック植物におけるＴＨＣＡ合成酵素の発現の減少または消失（すなわち、「ノックアウト」または「ノックダウン」）を、ＴＨＣＡ合成酵素をコードする鎖またはそのフラグメントのアンチセンスを発現するコンストラクトの導入によって、引き起こす。アンチセンス抑制のため、ＴＨＣＡ合成酵素のｃＤＮＡまたはそのフラグメントを、発現ベクターにおけるプロモーター配列に対して（コード配列に対して）逆向きに配置する。ある実施態様において、導入される配列は、全長ｃＤＮＡまたは全長の遺伝子に対応する必要はなく、形質転換される植物で見出されるｃＤＮＡまたは遺伝子と同一である必要はない。
ある実施態様において、アンチセンス配列は、標的遺伝子または対象のＲＮＡとハイブリダイズできることのみが必要とされる。したがって、導入される配列の長さがより短い場合、内因性転写因子配列との高度な相同性が、効率的なアンチセンス抑制のために必要とされる。様々な長さのアンチセンス配列を利用できるが、いくつかの実施態様において、ベクターに導入されるアンチセンス配列は、ある実施態様において少なくとも３０ヌクレオチド長である。ある実施態様において、アンチセンス配列の長さを増大すると、アンチセンス抑制の向上が観測される。いくつかの実施態様において、ベクターにおけるアンチセンス配列の長さは１００ヌクレオチドを超える。記述されるようなアンチセンスコンストラクトの転写は、抑制される内在性遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の逆相補体の配列を含むＲＮＡ分子の生成をもたらす。アンチセンス核酸はまた、さらなる配列を含んでもよい。
ある実施態様において、トランスジェニック植物におけるＴＨＣＡ合成酵素の発現の減少または消失（すなわち、「ノックアウト」または「ノックダウン」）を、ＴＨＣＡ合成酵素を標的とするｓｉＲＮＡを発現するコンストラクトの導入によって達成する。ある実施態様において、ｓｉＲＮＡは、２つのオーバーハングした核酸を有する、リン酸化された５’末端およびヒドロキシル化された３’末端を持つ、短い（２０〜２４ｂｐ）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。
アンチセンス処理およびＲＮＡｉ処理は、本発明においてＴＨＣＡ合成酵素の活性を変化させる一つの方法を示す。特に、ＴＨＣＡ合成酵素をコードする配列（そのフラグメントを含む）を、アンチセンス配向またはセンス配向とアンチセンス配向の組合せで含む、コンストラクトを用いて、植物におけるＴＨＣＡ合成酵素の発現を減少または効果的に消失させてもよく、本明細書で記述されるように有効期間の向上を得てもよい。したがって、これを用いて、ＴＨＣＡ合成酵素またはその相同配列を「ノックアウト」してもよい。
ＲＮＡｉのための技術は当分野でよく知られており、例えばLehner et al., (2004)およびDownward (2004)に記述される。この技術は、二本鎖ＲＮＡが、一方または他方の鎖に相補的な配列を含むメッセンジャーＲＮＡの分解を導くことができるという事実に基づく(Fire et al., 1998)。したがって、センス配向およびアンチセンス配向での特定のコード配列の発現によって、対応するコード配列のフラグメントまたはより長い部分のいずれかとして、そのコード配列の発現を下方制御できる。
アンチセンスの方法論およびいくつかの態様におけるＲＮＡｉの方法論は、核酸が「相補的な」配列と対を作る傾向にあるという事実を利用する。相補的とは、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン−クリックの相補性の規則に従って、塩基対を形成できることを意味する。より大きなプリンは、より小さいピリミジンと塩基対を作り、シトシンと対を作るグアニンの組合せ（Ｇ：Ｃ）および、ＤＮＡではチミンと対を作るアデニンの組合せ（Ａ：Ｔ）またはＲＮＡではウラシルと対を作るアデニンの組合せ（Ａ：Ｕ）を形成する。イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびハイブリダイズする配列における他の塩基などの、より一般的でない塩基の包含は対形成を妨害しない。
二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを、ポリヌクレオチドを用いて標的とすることは、三重らせんの形成を導く；ＲＮＡを標的とすることは、二重らせんの形成を導く。アンチセンスのオリゴヌクレオチドを標的細胞に導入すると、その標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、ＲＮＡプロセッシング、輸送、翻訳および／または安定性に干渉する。アンチセンスコンストラクトおよびＲＮＡｉコンストラクトまたはそのようなＲＮＡをコードするＤＮＡを用いて、遺伝子転写または翻訳またはその両方を、ホスト細胞において、インビトロ(in vitro)またはインビボ(in vivo)（ホストの植物細胞など）で、阻害してもよい。本発明のある実施態様において、そのようなオリゴヌクレオチドは、本明細書で与えられる核酸配列の任意の特有な部分を含んでもよい。本発明のある実施態様において、そのような配列は、ＴＨＣＡ合成酵素の核酸配列の、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上の連続する核酸および／またはその相補体を含み、それはセンス配向および／またはアンチセンス配向であってよい。センス配向およびアンチセンス配向の両方の配列を含むことによって、対応するコード配列の抑制の増大を達成し得る。
コンストラクトを、遺伝子のプロモーターおよび他の調節領域、エキソン、イントロンまたはエキソン−イントロン境界の全部または一部と相補的になるように設計してもよい。最も効果的なコンストラクトは、イントロン／エキソンスプライス部位と相補的な領域を含むことが想定される。したがって、一つの実施態様は、イントロン−エキソンスプライス部位の５０〜２００塩基の領域と相補的なコンストラクトを含む。いくつかのエキソン配列を、その標的選択性に大きな影響を与えずに、コンストラクトに含むことができることが観察されてきた。含有されるエキソンの物質の量は、用いる特定のエキソン配列およびイントロン配列に依存して様々である。インビトロのコンストラクトを検定し、標準的な細胞機能が影響されているか、または相補的な配列を持つ関連する遺伝子の発現が影響されているか、を単純に決定することによって、過剰量のエキソンＤＮＡを含んでいるかを容易に検定できる。
上述されるように、「相補的」または「アンチセンス」とは、その全長に渡って実質的に相補的であり、塩基のミスマッチがほとんどないポリヌクレオチド配列を意味する。用語「相補体」はまた、基準の配列と逆相補的である配列を含む。例えば、１５塩基長の配列が、１３個または１４個の位置において相補的なヌクレオチドを有する場合、それらを相補的と呼んでもよい。当然、完全に相補的な配列とは、その全長に渡って完全に相補的であり、塩基のミスマッチがない配列である。より低い程度の相同性を有する他の配列もまた想定される。例えば、高い相同性の制限された領域を有するが、相同的でない領域（例えばリボザイム；上記参照）も含む、ＲＮＡｉコンストラクトまたはアンチセンスコンストラクトを設計できる。これらの分子は、５０％未満の相同性を有するが、適切な条件下で標的配列に結合する。
ゲノムＤＮＡの一部とｃＤＮＡまたは合成配列を組み合わせることは、特定のコンストラクトを作成するのに有利であり得る。例えば、イントロンが最終的なコンストラクトに望まれる場合、ゲノムのクローンを用いる必要がある。ｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドは、コンストラクトの残りの部分により簡便な制限部位を与え得り、したがって配列の残りの部分において用いられる。
タイリング
ポリヌクレオチドのトリガー分子を、部分的に重複した領域（例えば、標的遺伝子の長さに沿って約２５ヌクレオチドの重複領域）を持つランダム長（例えば２００〜３００ポリヌクレオチド長）のフラグメントにおいて、遺伝子標的を「タイリング」することによって同定できる。複数の遺伝子標的配列を配列比較でき、共通の相同性を有するポリヌクレオチド配列領域を、複数の標的における潜在的なトリガー分子として同定する。複数の標的配列を配列比較でき、相同性の低い配列領域を、標的を選択的に識別する潜在的なトリガー分子として同定する。単一の遺伝子を選択的に抑制するため、トリガー配列を、転写領域または非コード領域（例えば、プロモーター領域、３’非翻訳領域、イントロンなど）のいずれかにおける標的遺伝子に特有の領域から選択してもよい。
いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド配列のランダム設計または経験的な選択を、遺伝子サイレンシングに効果的なポリヌクレオチド配列の選択において、用いる。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド配列を、対象の植物のゲノムＤＮＡに対して、他の遺伝子の意図しないサイレンシングを最小化するようにスクリーニングする。
挿入変異
一つの実施態様において、トランスジェニック植物におけるＴＨＣＡ合成酵素の発現の減少または消失（すなわち「ノックアウト」）を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴ−ＤＮＡまたは選択マーカーカセットまたは任意の他の非センスＤＮＡフラグメントを用いる挿入変異によって、得てもよい。挿入変異の作成後、変異体をスクリーニングし、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子における挿入を含む変異体を同定してもよい。所望の遺伝子における１以上の導入遺伝子の挿入イベントを含む植物を交雑し、Koncz et al., (Methods in Arabidopsis Research; World Scientific, 1992)に記述されるように、変異のホモ接合植物を作成してもよい。
リボザイム
遺伝子発現の抑制を、リボザイムを用いて達成してもよい。リボザイムは、非常に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムの生成および使用は、米国特許第4,987,071号および米国特許第5,543,508号に開示されており、これらは参照によってその全体が組み込まれる。アンチセンスＲＮＡを含む合成リボザイム配列を用いて、アンチセンスＲＮＡとハイブリダイズする内在性ｍＲＮＡ分子を切断するように、アンチセンスＲＮＡ上にＲＮＡ切断活性を与えてもよく、これは次に、内在性遺伝子発現のアンチセンス阻害の増強を導く。
ドミナントネガティブの転写因子
転写因子ｍＲＮＡの変異型（例えば、１以上の終止コドンまたはナンセンス変異を含む配列）を発現するベクターを用いて、ＴＨＣＡ合成酵素などの遺伝子の発現を抑制し、それによってその活性を減少または消失し、１以上の形質を改変してもよい。そのようなコンストラクトを生成する方法は、米国特許第5,583,021号に記述され、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。ある実施態様において、そのようなコンストラクトを、未成熟終止コドンを、転写因子遺伝子に導入することによって、作成してもよい。あるいは、植物の形質を、Sharp (Genes and Development 13: 139-141, 1999)に記述されるような二本鎖ＲＮＡを用いて、遺伝子サイレンシングによって改変してもよい。
相同組換えまたは部位特異的変異
植物の表現型を、内在性遺伝子を消失することによって（例えば相同組換え(Kempin et al. (1997) Nature 389: 802)によって）、変えてもよい。
標的ゲノムの改変は、植物細胞の遺伝子操作における有力な手段である。例えば、外来性配列を標的のゲノム位置に組み込んでもよく、かつ／または特定の内在性染色体配列を欠失、不活化または改変してもよい。ある実施態様において、設計したヌクレアーゼ酵素（例えば、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）など）を用いる。
ある実施態様において、分子生物学の方法を用いてカスタム設計された(custom designed)ゲノム改変酵素を用いてもよい。少なくとも１つの植物細胞を、カスタムエンドヌクレアーゼの少なくとも１つの認識配列を含むように、得てもよく、ここで、カスタムエンドヌクレアーゼは融合タンパク質であり、この融合タンパク質はＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインまたはＶｉｒタンパク質ドメインを含む。さらに、カスタムエンドヌクレアーゼはポリペプチド、触媒活性ＲＮＡ、ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼまたは合成アプタマーを含んでもよい。カスタムエンドヌクレアーゼは、例えばメガヌクレアーゼであってもよく、ここでメガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩからなる群から選択される。カスタムエンドヌクレアーゼは、例えば、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」、「ＧＩＹ−ＹＩＧ」、「Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス」、「ＺＦＮ」または「ＨＮＨ」配列モチーフを含んでもよい。
ある実施態様において、カスタムエンドヌクレアーゼは、タンパク質または核酸分子として、輸送される。核酸分子を、植物細胞中で活性のプロモーターと作動可能に連結してもよく、ここでこのプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞周期制御プロモーターまたは発生制御プロモーターである。核酸コンストラクトは、１以上のＴ−ＤＮＡの境界と隣接する、少なくとも１つのカスタムエンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子を含んでもよい。このコンストラクトは選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。
植物細胞は第二の外来性カスタムエンドヌクレアーゼをさらに含んでもよく、ここで第一および第二の外来性カスタムエンドヌクレアーゼは、植物細胞のゲノム中に異なる認識配列をそれぞれ含み、前記認識配列の近位での切断を生成できる。植物細胞は選択されたＤＮＡをさらに含んでもよく、ここで選択されたＤＮＡは、プロモーター、イントロン、コード配列または３’ＵＴＲを含む。
植物細胞の対象の遺伝子座を、植物細胞中に少なくとも第一のカスタムエンドヌクレアーゼを導入することによって改変し、ここでこの細胞は、対象の遺伝子座内またはその近位にカスタムエンドヌクレアーゼの認識配列を含み；カスタムエンドヌクレアーゼが、対象の遺伝子座を構成するＤＮＡまたは対象の遺伝子座に隣接するＤＮＡに二本鎖切断を作り出すことを可能にし；その細胞またはその子孫細胞を、前記対象の遺伝子座に改変を含むものとして同定する。
特定の場合において、単一のカスタムエンドヌクレアーゼ認識配列を植物細胞のゲノムに導入し；あるいは、少なくとも２つのカスタムエンドヌクレアーゼを植物細胞に導入してもよく、ここでこの細胞は、第二のカスタムエンドヌクレアーゼの第二の認識配列を含み、少なくとも第二のエンドヌクレアーゼは、第一のエンドヌクレアーゼと同時、または連続的な形質転換下で導入される。植物細胞に導入した任意のエンドヌクレアーゼは、過渡的または安定に発現し得る。
少なくとも１つのカスタムエンドヌクレアーゼおよび選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子をコードする発現コンストラクトを用いる、過渡的または安定な植物細胞の形質転換後、植物または植物細胞を、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子の存在に基づいて、選択またはスクリーニングしてもよい。
形質転換後、カスタムエンドヌクレアーゼは、認識配列の近位の植物細胞のゲノムにおいて二本鎖切断を生成し得、ここで二本鎖切断は、対象の遺伝子産物をコードする配列内で起こる。さらに、対象の遺伝子座における改変は、遺伝子変換、遺伝子置換、相同組換え、非相同組換え(heterologous recombination)、欠失または類似相同組換え(homeologous recombination)を含み、ここでこの改変は、対象の遺伝子の発現を制御する配列内で起こる。
改変の証明のために、細胞またはその子孫細胞をアッセイするための当分野で知られた方法（遺伝子型のアッセイ、表現型のアッセイまたは植物の遺伝子型と植物の表現型の結合を含む）を用いる。遺伝子型のアッセイは、ＰＣＲまたは核酸シークエンシングを含む。表現型のアッセイは：視覚的なアッセイ、農学的パラメータの測定、生化学的アッセイまたは免疫学的アッセイを含んでもよい。
したがって、本発明は、植物ゲノムの対象の遺伝子座における対立遺伝子を変化させる方法を提供し、この方法は：植物細胞において第一および第二のカスタムエンドヌクレアーゼを発現し、ここで第一および第二のカスタムエンドヌクレアーゼは、対象の遺伝子座に隣接する二本鎖切断を導入すること；および、遺伝子組換えが対象の遺伝子座で生じることを可能にすること、を含む。この方法は、植物細胞に標的ＤＮＡを導入することをさらに含んでもよく、ここで遺伝子組換えは、標的ＤＮＡと共に対立遺伝子の置換をもたらす。
植物の形質を、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステム（例えば、米国特許第5,658,772号に記述）を用いて改変してもよい。植物のゲノムを、第一および第二のｌｏｘ部位を含むように改変してもよく、これらの部位は次にＣｒｅリコンビナーゼと接触する。これらのｌｏｘ部位が同じ配向である場合、２つの部位間の介在ＤＮＡ配列を切除する。これらのｌｏｘ部位が逆向きの配向である場合、介在配列が反転する。
加えて、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）システムを用いるサイレンシングの手法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる相補的な成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）システムを用いて、ＴＨＣＡ合成酵素変異体の下方制御またはノックアウトを行ってもよい。ドミナントネガティブの手法を用いて、ＴＨＣＡ合成酵素変異体の下方制御またはノックアウトを行ってもよい。
部位特異的変異の他の例は、限定されないが、メガヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮを含み、また翻訳後遺伝子サイレンシングを用いて、遺伝子発現を下方制御できることが理解される。
ある実施態様において、トランスジェニック植物（または植物細胞、または植物の外植片または植物組織）を、上述した、または当分野で公知の多様な技術によって、生成してもよい。ベクターの作成後、ベクターまたはポリヌクレオチドを、対象の植物、植物細胞、植物の外植片、または植物組織に導入する。ある実施態様において、植物細胞、外植片または組織を再生し、トランスジェニック植物を生成してもよい。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
ある実施態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを用いて、ガイドＲＮＡを含むタンパク質−ＲＮＡ複合体の一部分として、標的配列をサイレンシングしてもよい。ガイドＲＮＡはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用し、エンドヌクレアーゼを特定の標的部位に導き、ここでガイドＲＮＡの５’末端は特定のプロトスペーサー配列と塩基対を作る。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム由来でもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型システムでもよい。適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の限定されない例は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６を含む。
一般的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメインはガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡｓｅドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体形成ドメインおよび他のドメインを含んでもよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、改変したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または野生型もしくは改変したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質を改変し、核酸の結合親和性および／または特異性を増大し、酵素活性を変え、かつ／またはこのタンパク質の別の性質を変化させてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質のヌクレアーゼ（すなわちＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインを改変、欠失または不活化してもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質を切断し、融合タンパク質の機能に必要ではないドメインを除去してもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質を切断または改変し、融合タンパク質のエフェクタードメインの活性を最適化してもよい。
形質転換
適切な形質転換の技術は、限定されないが：植物のプロトプラストのエレクトロポレーション；リポソームを介する形質転換；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介する形質転換；ウイルスを用いる形質転換；植物細胞のマイクロインジェクション；植物細胞の微粒子銃；真空浸潤；およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumeficiens)を介する形質転換、を含んでもよい。形質転換は、ヌクレオチド配列を、その配列の安定または過渡的な発現を生じる様式で、植物に導入することを意味する。
この技術分野の現在の知識を説明するのに役立ち、参照によって本明細書に取り込まれる、クローン化した配列での形質転換による植物の特徴の改変の例は：米国特許第5,571,706号; 5,677,175号; 5,510,471号; 5,750,386号; 5,597,945号; 5,589,615号; 5,750,871号; 5,268,526号; 5,780,708号; 5,538,880号; 5,773,269号; 5,736,369号;および5,610,042号を含む。
形質転換後、植物を、形質転換ベクターに包含される優性の選択可能なマーカーを用いて、選択してもよい。ある実施態様において、そのようなマーカーは、形質転換される植物に抗生剤耐性または除草剤耐性を与え、形質転換体の選択は、植物を適切な濃度の抗生剤または除草剤に暴露することによって、達成できる。形質転換植物を選択し、成熟させた後、形質の改変を示す植物を同定する。改変された形質は、上述の任意の形質であってよい。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルまたは活性を、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡシークエンスもしくはマイクロアレイを用いてｍＲＮＡ発現、または免疫ブロット、ウエスタンブロットもしくはゲルシフトアッセイを用いてタンパク質発現を分析することによって、決定してもよい。
本発明で用いる植物細胞または他の細胞の形質転換における適切な方法は、ＤＮＡを細胞に導入できる実質的にあらゆる方法（ＤＮＡの直接輸送、プロトプラストのＰＥＧを介する形質転換(Omirulleh et al., 1993)、乾燥／阻害を介するＤＮＡの取り込み(Potrykus et al., 1985)、エレクトロポレーション（米国特許第5,384,253号、参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）、炭化ケイ素繊維を用いる撹拌（Kaeppler et al., 1990；米国特許第5,302,523号、参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる；および米国特許第5,464,765号、参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）、アグロバクテリウムを介する形質転換（米国特許第5,591,616号および米国特許第5,563,055号；両者は参照によって本明細書に具体的に取り込まれる）およびＤＮＡ被覆粒子の加速（米国特許第5,550,318号；米国特許第5,538,877号；および米国特許第5,538,880号；それぞれは参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）など）を含むと考えられる。これらなどの技術の適用を通して、実質的にあらゆる植物種の細胞を安定に形質転換でき、これらの細胞はトランスジェニック植物に発達する。
アグロバクテリウムを介する形質転換
アグロバクテリウムを介する導入は、ＤＮＡを植物組織全体に導入でき、それによってプロトプラストから無傷の植物を再生する必要性を無視できるため、遺伝子を植物細胞に導入するのに広く応用できるシステムである。ＤＮＡを植物細胞に導入するための、アグロバクテリウムを介する植物組み込み用ベクターの使用は、当分野でよく知られている。例えば、Fraley et al., (1985)、Rogers et al., (1987)および米国特許第5,563,055号を参照、これらは参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる。
アグロバクテリウムを介する形質転換は、双子葉植物において最も効率的であり、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、アルファルファおよびジャガイモを含む、双子葉類の形質転換の好ましい方法である。実際、アグロバクテリウムを介する形質転換は長年、双子葉植物に日常的に用いられてきたが、最近、単子葉植物にも適用可能になってきた。アグロバクテリウムを介する形質転換技術の進歩によって、現在、ほとんど全ての単子葉植物に適用可能な技術となっている。例えば、アグロバクテリウムを介する形質転換技術は、現在、イネ（Hiei et al., 1997；米国特許第5,591,616号、これは参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）、コムギ（McCormac et al., 1998）、オオムギ（Tingay et al., 1997; McCormac et al., 1998）、アルファルファ（Thomas et al., 1990）およびトウモロコシ（Ishidia et al., 1996）に適用されている。
現代のアグロバクテリウムの形質転換ベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウムにおいて複製でき、記述されるような（Klee et al., 1985）簡便な操作を可能にする。さらに、アグロバクテリウムを介する遺伝子導入におけるベクターの最近の技術の進歩は、ベクターの遺伝子および制限部位の配置を改善し、様々なポリペプチドをコードする遺伝子を発現できるベクターの作成を促進した。記述される(Rogers et al., 1987)ベクターは、挿入されるポリペプチドをコードする遺伝子の直接発現のための、プロモーターおよびポリアデニル化部位に隣接する便利なマルチリンカー領域を有し、本発明の目的に適している。さらに、武装(armed)Ｔｉ遺伝子と非武装(disarmed)Ｔｉ遺伝子の両方を含むアグロバクテリウムを、形質転換に用いてもよい。これらの植物の系統において、アグロバクテリウムを介する形質転換が効率的である場合、遺伝子導入の容易かつ明確な性質のため、選択される方法である。
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションによる形質転換をもたらすため、細胞の懸濁培養液などの脆弱な組織または胚発生カルスのいずれかを利用してもよく、あるいは、未熟胚または他の組織化した組織を直接形質転換してもよい。この技術では、選択された細胞の細胞壁を、ペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）に暴露することによって、または制御された様式で力学的に傷つけることによって、部分的に分解する。無傷の細胞のエレクトロポレーションによって形質転換された、いくつかの種の例は、トウモロコシ（米国特許第5,384,253号；Rhodes et al., 1995; D’Halluin et al., 1992）、コムギ（Zhou et al., 1993）、トマト（Hou and Lin, 1996）、ダイズ（Christou et al., 1987）およびタバコ（Lee et al., 1989）を含む。
植物のエレクトロポレーションの形質転換のためにプロトプラストを用いてもよい(Bates, 1994; Lazzeri, 1995)。例えば、子葉由来のプロトプラストのエレクトロポレーションによるトランスジェニックダイズ植物の生成が、DhirおよびWidholmによってIntl. Patent Appl. Publ. No. WO 9217598（参照によって、本明細書に具体的に取り込まれる）に記述されている。プロトプラストの形質転換が記述されている種の他の例は、オオムギ（Lazerri, 1995）モロコシ（Battraw et al., 1991）、トウモロコシ（Bhattacharjee et al., 1997）、コムギ（He et al., 1994）およびトマト（Tsukada, 1989）を含む。
微粒子銃
形質転換ＤＮＡ断片を本発明における植物細胞に送達する別の方法は、微粒子銃（米国特許第5,550,318号、米国特許第5,538,880号、米国特許第5,610,042号およびＰＣＴ出願WO 94/09699；これらはそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる。）である。この方法では、粒子を核酸で被覆し、推進力によって細胞に送達できる。代表的な粒子は、タングステン、白金、および好ましくは金で構成される粒子を含む。いくつかの例において、金属粒子上のＤＮＡ沈殿は、微粒子銃を用いる受容細胞へのＤＮＡの送達に必須ではないことが想定される。しかしながら、粒子はＤＮＡで被覆されるのではなく、ＤＮＡを含んでもよいことが想定される。したがって、ＤＮＡで被覆された粒子は、微粒子銃を介するＤＮＡ送達のレベルを増加し得るが、それら自体は必須ではないと考えられる。
微粒子銃において、懸濁液中の細胞をフィルターまたは固体培地上で、濃縮する。あるいは、未熟胚または他の標的細胞を固体培地上に配置してもよい。照射される細胞を、マクロプロジェクタイル(macroprojectile)停止プレート下に適切な距離で配置する。
加速によって植物細胞中にＤＮＡを送達する方法の具体的な実施態様は、遺伝子銃粒子送達システム(Biolistics Particle Delivery System)であり、これを用いて、ＤＮＡまたは細胞で被覆された粒子を、スクリーン（ステンレス鋼またはNytexスクリーンなど）を介して、懸濁液中で培養した単子葉植物細胞で覆われたフィルター表面上に推進させることができる。スクリーンは、粒子が大きな凝集体として受容細胞に送達されないように、粒子を分散させる。微粒子銃の技術は広く適用でき、微粒子銃を用いて実質的にあらゆる植物種を形質転換できる。微粒子銃によって形質転換できた種の例は、トウモロコシ（ＰＣＴ出願WO 95/06128）、オオムギ（Ritala et al., 1994; Hensgens et al., 1993）、コムギ（米国特許第5,563,055号、これは参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）、イネ（Hensgens et al., 1993）、オートムギ（Torbet et al., 1995; Torbet et al., 1998）、ライムギ（Hensgens et al., 1993）、サトウキビ（Bower et al., 1992）、およびモロコシ（Casa et al., 1993; Hagio et al., 1991）などの単子葉種；ならびに、タバコ（Tomes et al., 1990; Buising and Benbow, 1994）ダイズ（米国特許第5,322,783号、これは参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）、ヒマワリ（Knittel et al., 1994）、ピーナッツ（Singsit et al., 1997）、ワタ（McCabeおよびMartinell, 1993）、トマト（VanEck et al., 1995）、および一般的なマメ科植物（米国特許第5,563,055号、これは参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）を含む多数の双子葉類、を含む。
他の形質転換方法
プロトプラストの形質転換を、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションおよびこれらの処理の組合せに基づく方法（例えば、Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Omirulleh et al., 1993; Fromm et al., 1986; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988を参照）を用いて達成してもよい。
これらのシステムの、種々の植物の系統への適用は、プロトプラストから特定の植物の系統を再生する能力に依存する。プロトプラストからの穀類の再生における具体的な方法が記述されてきた（Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986; Omirulleh et al., 1993および米国特許第5,508,184号、これらはそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）。穀類のプロトプラストの直接取り込みの形質転換の使用の例は、イネ（Ghosh-Biswas et al., 1994）、モロコシ（BattrawおよびHall, 1991）、オオムギ（Lazerri, 1995）、オートムギ（ZhengおよびEdwards, 1990）およびトウモロコシ（Omirulleh et al., 1993）の形質転換を含む。
プロトプラストからうまく再生できない植物の系統を形質転換するため、ＤＮＡを無傷の細胞または組織に導入する他の方法を利用できる。例えば、未熟胚または外植片からの穀類の再生を、記述されるように達成できる（Vasil, 1989）。また、炭化ケイ素繊維を介する形質転換を、プロトプラスト化を伴って、または伴わずに、用いてもよい（Kaeppler, 1990; Kaeppler et al., 1992;米国特許第5,563,055号、これは参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる）。この技術での形質転換は、炭化ケイ素繊維を、細胞と共にＤＮＡ溶液中で撹拌することによって、達成される。細胞に穴が開くため、ＤＮＡは受動的に侵入する。この技術は、例えば単子葉穀類であるトウモロコシ（ＰＣＴ出願番号WO 95/06128、これは参照によってその全体が本明細書に具体的に取り込まれる；Thompson, 1995）およびイネ（Nagatani, 1997）でうまく使用されてきた。
組織培養
組織培養を、形質転換のための細胞の調製およびそれ由来の植物の再生における特定の形質転換技術において用いてもよい。組織培養の維持には、培地の使用および制御された環境が必要である。「培地」は、インビトロで細胞を増殖させるために用いられる、多数の栄養の混合物を指し、ここでインビトロは無傷の生物の外部である。培地は通常、ほとんどの細胞種の増殖に必要とされる、様々な種類の成分（塩、アミノ酸、増殖因子、糖、緩衝液）の懸濁液である。しかしながら、それぞれの固有の細胞種は、増殖のために固有の範囲の成分比を必要とし、最適な増殖のためにさらにより固有の範囲の処方を必要とする。細胞の増殖速度はまた、その細胞種の増殖が可能である一連の培地で開始した培養の間で、様々である。
栄養培地は液体として調製されるが、この液体に固体支持体を与えることができる物質を添加することで、凝固させてもよい。寒天はこの目的のために最も一般的に用いられる。バクトアガー、ハゼルトン（Hazelton）寒天、ゲルライト（Gelrite）及びゲルグロ（Gelgro）は、組織培養での植物細胞の増殖に適した固体支持体の特定の種類である。
いくつかの細胞種は、液体懸濁液中または固体培地上のいずれかで成長し、分裂する。本明細書で開示されるように、植物細胞を懸濁液中または固体培地上で成長させるが、懸濁液培養からの植物の再生は、典型的に、発達のいくつかの時点で液体培地から固体培地への移行を必要とする。培養中の細胞の分化の種類または程度は、使用する培地の種類および環境（例えば、ｐＨ）によって、ならびに培地が固体か液体かによって、影響される。
培地で成長できる組織は、分裂組織細胞、Ｉ型カルス、ＩＩ型カルス、ＩＩＩ型カルス、未熟胚、および配偶子細胞（小胞子細胞、花粉細胞、精細胞および卵細胞など）を含む。Ｉ型カルス、ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスを、限定されないが、未熟胚、実生の頂端分裂組織、根、葉、小胞子などを含む組織源から開始してもよい。カルスとして増殖可能なこれらの細胞はまた、形質転換における受容細胞である。
体細胞には様々な種類がある。胚発生(Embryogenic)細胞は、胚形成を介して植物を再生するために誘導され得る、体細胞の一つの例である。非胚発生(Non-embryogenic)細胞は、このような様式で典型的に応答しない細胞である。特定の技術を用いて、細胞集団における受容細胞を濃縮してもよい。例えば、ＩＩ型カルスの発達に続く、脆弱な胚発生組織の手動の選択および培養は、一般的に細胞の濃縮をもたらす。標的細胞を選択するために利用できる手動の選択の技術は、例えば細胞の形態および分化を評価することを含み、または、様々な物理的もしくは生物学的手段を用いてもよい。凍結保存はまた、受容細胞を選択し得る方法である。
（例えば、ＩＩ型カルスの表面から胚発生細胞を選択することによる）受容細胞の手動の選択は、培養（固体培地上での培養または懸濁液中での培養）前に、特定の細胞のために濃縮を行う試みにおいて使用され得る、一つの手段である。
使用する培養細胞を、固体支持体上または液体懸濁液という形式のいずれかで成長させてよい。いずれかの例において、栄養素を、培地という形で細胞に提供してもよく、環境条件は調節される。様々なアミノ酸、塩、糖、増殖制御因子およびビタミンで構成される多種の組織培養培地がある。本発明の実施に用いるほとんどの培地は、いくつかの類似の構成要素を含有するが、想定される特定の応用に依存して、それらの成分の組成および比が異なり得る。例えば、様々な細胞種が通常、２以上の種類の培地において成長するが、成長培地に依存して、種々の成長速度および種々の形態を示す。いくつかの培地において、細胞は生存するが分裂しない。植物細胞の培養に適した様々な種類の培地が、従前記述されてきた。これらの培地の例は、限定されないが、Chu et al. (1975)に記述されるＮ６培地およびＭＳ培地（MurashigeおよびSkoog, 1962）を含む。
安定に形質転換した植物の生成および特徴
外来性ＤＮＡの受容細胞への送達を生じた後、次の工程は一般的に、さらなる培養および植物の再生のために、形質転換細胞を同定することに関する。形質転換体を同定する能力を向上するため、本発明において調製した形質転換ベクターと共に、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を利用することが望まれ得る。この場合、潜在的な形質転換細胞集団を、その細胞を選択剤に暴露することによって一般的にアッセイし、または細胞を所望のマーカー遺伝子形質でスクリーニングする。
選択
任意のある研究において、ＤＮＡは、少数の標的細胞のみに導入されると考えられる。ＤＮＡを受け取り、ゲノム中に組み込んだこれらの細胞を同定する、効率的なシステムを提供するため、安定に形質転換したこれらの細胞を選択する手段を用いてもよい。そのような方法の一つの代表的な実施態様は、ホスト細胞に、いくつかの標準的な阻害剤（抗生剤または除草剤など）に対する耐性を与えるマーカー遺伝子を導入することである。使用できる抗生剤の例は、アミノグリコシド系抗生物質であるネオマイシン、カナマイシンおよびパロモマイシンまたは抗生物質であるハイグロマイシンを含む。アミノグリコシド系抗生物質への耐性は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）またはＮＰＴ Ｉなどのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ酵素によって与えられ、ハイグロマイシンへの耐性は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼによって与えられる。
そして、潜在的な形質転換細胞を、選択剤に暴露する。一般的に、耐性を与える遺伝子が組み込まれ、細胞の生存を可能にするのに十分なレベルで発現する場合、生存した細胞の集団がこれらの細胞である。細胞をさらに検定し、外来性ＤＮＡの安定な組み込みを確認してもよい。
望ましい選択剤を構成する、一つの除草剤は、広い範囲の除草剤であるビアラホスである。ビアラホスは、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクスが生成するトリペプチドの抗生剤であり、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）、Ｌ−グルタミン酸類似体および２つのＬ−アラニン残基で構成される。細胞内ペプチダーゼによるＬ−アラニン残基の除去に際して、ＰＰＴが放出され、ここでＰＰＴは、アンモニア同化および窒素代謝に関与する重要な酵素であるグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）の強力な阻害剤である（Ogawa et al., 1973）。除草剤リバティの活性成分である合成ＰＰＴもまた、選択剤として有効である。ＰＰＴによる植物のＧＳの阻害は、アンモニアの迅速な蓄積および植物細胞の死を引き起こす。
ビアラホスを生成する生物およびストレプトマイセス属の他種はまた、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクスのｂａｒ遺伝子およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネスのｐａｔ遺伝子によってコードされる、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）酵素を合成する。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードする除草剤耐性遺伝子の使用は、DE 3642 829 Aに言及され、ここでこの遺伝子は、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネスから単離される。細菌源の生物において、この酵素はＰＰＴのフリーのアミノ基をアセチル化し、自己毒性を防ぐ(Thompson et al., 1987)。ｂａｒ遺伝子はクローン化され（Murakami et al., 1986; Thompson et al., 1987）、トランスジェニックタバコ、トマト、ジャガイモ（De Block et al., 1987）、アブラナ（De Block et al., 1989）およびトウモロコシ（米国特許第5,550,318号）において発現されてきた。以前の報告では、耐性遺伝子を発現したいくつかのトランスジェニック植物は、温室において、ＰＰＴおよびビアラホスの市販製剤に対する完全な耐性を有した。
本発明の実施において、形質転換細胞株の選択に有用な除草剤の別の例は、広い範囲の除草剤であるグリホサートである。グリホサートは、芳香族アミノ酸生合成経路に活性のある酵素ＥＰＳＰＳの作用を阻害する。この酵素の阻害は、アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびそれらに由来する二次代謝物の欠乏を導く。米国特許第4,535,060号は、ＥＰＳＰＳ、ａｒｏＡにおけるネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)遺伝子上に、グリホサート耐性を与える、ＥＰＳＰＳ変異の単離を記述する。ＥＰＳＰＳ遺伝子をトウモロコシからクローン化し、グリホサート耐性ａｒｏＡ遺伝子において見出された変異に類似する変異を、インビトロで導入した。グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ酵素をコードする変異遺伝子は、例えば国際特許WO 97/4103に記述される。グリホサート耐性を与える、最も良く特徴付けられた変異ＥＰＳＰＳ遺伝子は、１０２番目および１０６番目の残基のアミノ酸交換を含むが、他の変異もまた有用であることが予測される（PCT/WO97/4103）。
ｂａｒ−ビアラホス選択システムまたはＥＰＳＰＳ−グリホサート選択システムを使用するため、形質転換した組織を、非選択的な培地で０〜２８日間培養し、次いで、１〜３ｍｇ／Ｌビアラホスまたは１〜３ｍＭグリホサートを含む適切な培地に移行する。１〜３ｍｇ／Ｌビアラホスの範囲または１〜３ｍＭグリホサートの範囲が典型的に好ましいが、０．１〜５０ｍｇ／Ｌビアラホスまたは０．１〜５０ｍＭグリホサートに有用性が見出されることが考えられる。
スクリーニング可能なマーカーの形質の例は、酵素のルシフェラーゼである。基質であるルシフェリンの存在下では、ルシフェラーゼを発現する細胞は、写真用フィルムまたはｘ線フィルム、ルミノメーター（または液体シンチレーションカウンター）、暗視能力を高める装置、または高い感光性ビデオカメラ（フォトンカウンティングカメラなど）によって検出できる、光を発する。これらのアッセイは非破壊であり、形質転換細胞を同定後、さらに培養してもよい。フォトンカウンティングカメラは、実時間で、ルシフェラーゼを発現している特定の細胞または細胞群を同定し、それらを操作できるため、特に有用である。類似の様式で使用できる、別のスクリーニング可能なマーカーは、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。
再生および種子生成
選択剤への暴露を生き延びた細胞、またはスクリーニングアッセイにおいてポジティブスコアであった細胞を、植物の再生を助ける培地で培養してもよい。代表的な実施態様において、ＭＳ培地およびＮ６培地を、成長制御因子などのさらなる物質を含むことによって、改変してもよい。一つのこのような成長制御因子は、ジカンバまたは２，４−Ｄである。しかしながら、ＮＡＡ、ＮＡＡ＋２，４−Ｄまたはピクロラムを含む、他の成長制御因子を用いてもよい。これらの方法およびこれらに類似する方法における培地の改変は、特定の発達段階における細胞の成長を促進することが見出されてきた。十分な組織が植物の再生の試みを始めるのに利用できるまで、または繰り返しの手動の選定後、組織の形態が再生に適するまで、少なくとも２週間、組織を、成長制御因子を含む基本培地上で維持し、次いで、胚様体の成熟を促す培地に移行してもよい。培地を２週間毎にこの培地に移行する。芽の発達は、成長制御因子を含まない培地へ移行する時期を示す。
選択またはスクリーニングによって同定され、再生を助ける適切な培地で培養された、形質転換細胞は、植物に成熟できる。発達している小植物を、例えば、環境的に制御されたチャンバー（例えば、約８５％の相対湿度、６００ｐｐｍのＣＯ２および２５〜２５０マイクロアインシュタインｍ２ｓ−１の光）において、無土壌の植物成長混合物に移行し、硬化する。植物をグロースチャンバーまたは温室で成熟させてもよい。植物を、形質転換体の同定後、初期の組織に依存して、約６週間から１０月、再生してもよい。再生の間、細胞を、組織培養容器において固体培地上で成長させてもよい。そのような容器の具体的な実施態様は、ペトリ皿およびPlant Consである。再生する植物を約１９〜２８℃で成長させてもよい。再生する植物が芽および根の発達段階に達した後、それらを、さらなる成長および検定のために温室に移行してもよい。
形質転換植物の種子は、種子発達の停止および植物の未成熟老化のため、場合により、胚救出を必要とし得る。発達する胚を救出するため、それらを、表面が殺菌された種子から、受粉後１０〜２０日で切除し、培養する。この段階の培養で用いる培地の実施態様は、ＭＳ塩、２％スクロースおよび５．５ｇ／ｌアガロースを含む。胚救済において、大きな胚（３ｍｍを超える長さと定義する）を、適当な培地上で直接、発芽させる。それよりも小さな胚を、１０−５Ｍアブシジン酸および上記成分を含む培地で１週間培養し、次いで、発芽のために成長調節因子を含まない培地に移行してもよい。
特徴付け
再生する植物における外来性ＤＮＡまたは「導入遺伝子」の存在を確認するため、多様なアッセイが実行できる。そのようなアッセイは、例えば、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングおよびＰＣＲ（商標）などの「分子生物学的」アッセイ；例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）または酵素機能によって、タンパク質産物の存在を検出することなどの「生化学的」アッセイ；葉または根のアッセイなどの植物部分のアッセイ；および再生された植物全体の表現型を分析するアッセイを含む。
ＤＮＡ組み込み、ＲＮＡ発現および遺伝
ゲノムＤＮＡを細胞株または任意の植物の部分から単離し、当業者によく知られた技術を用いて、外因性遺伝子の存在を決定してもよい。おそらくは細胞における配列の再配置または欠失のため、無傷の配列が常に存在するわけではないことに注意すべきである。本発明の方法で導入したＤＮＡ要素の存在を、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（商標））によって決定してもよい。この技術を用いて、ＤＮＡの個々の断片を増幅し、ゲル電気泳動によって検出する。この種の分析は、遺伝子が安定な形質転換体に存在するか否かを決定できるが、導入された遺伝子がホスト細胞ゲノムに組み込まれたことを証明しない。しかしながらこの場合において、ＤＮＡは、ＰＣＲ（商標）分析を介して遺伝子の存在を示す全ての形質転換体のゲノムに、典型的に組み込まれてきた。さらに、ＰＣＲ（商標）技術を用いて、形質転換体がゲノムの異なる部位に導入された外来性遺伝子を有するか否か（すなわち、形質転換体が独立した起源であるか否か）を決定することは通常不可能である。ＰＣＲ（商標）技術を用いて、導入された遺伝子に隣接するホストゲノムＤＮＡの断片をクローニングすることは可能であると想定される。
ホストゲノムへのＤＮＡ組み込みの確実な証拠および形質転換体の独立した同一性を、サザンハイブリダイゼーションの技術を用いて決定してもよい。この技術を用いて、ホストゲノムに導入された特定のＤＮＡ配列および隣接するホストＤＮＡ配列を同定できる。したがって、所定の形質転換体のサザンハイブリダイゼーションのパターンは、その形質転換体の特徴を同定するものとして役立つ。さらに、サザンハイブリダイゼーションを介して、高分子量のＤＮＡに導入された遺伝子の存在を示す（すなわち、導入された遺伝子がホスト細胞ゲノムに組み込まれたことを確認する）ことが可能である。サザンハイブリダイゼーションの技術は、ＰＣＲ（商標）を用いて得られる情報（例えば、遺伝子の存在）を提供するが、ゲノムへの組み込みをも示し、個々の形質転換体を特徴付ける。
サザンハイブリダイゼーション技術の改変であるドットブロットハイブリダイゼーションまたはスロットブロットハイブリダイゼーションの技術を用いて、ＰＣＲ（商標）に由来する情報と同様の情報（例えば、遺伝子の存在）を得ることができると想定される。
ＰＣＲ（商標）およびサザンハイブリダイゼーション技術の両方を用いて、導入遺伝子の子孫への遺伝を示すことができる。ほとんどの場合、所定の形質転換体における特徴的なサザンハイブリダイゼーションのパターンは、１以上のメンデル遺伝子として子孫で分離し（Spencer et al., 1992）、これは導入遺伝子の安定な遺伝を示す。
ＤＮＡ分析技術は、植物の任意の部分から単離したＤＮＡを用いて実行できるが、ＲＮＡは特定の細胞または組織型でのみ発現するため、分析用のＲＮＡをこれらの組織から調製する必要がある。ＰＣＲ（商標）技術を用いて、導入された遺伝子から生成するＲＮＡを検出および定量化してもよい。ＰＣＲ（商標）のこの適用では、ＲＮＡを、逆転写酵素などの酵素を用いてＤＮＡに逆転写し、次いでこのＤＮＡを、従来のＰＣＲ（商標）技術を用いて増幅することがまず必要である。ほとんどの場合、ＰＣＲ（商標）技術は有用であるが、ＲＮＡ産物の完全性を証明しない。ＲＮＡ産物の性質に関するさらなる情報を、ノーザンブロッティングによって得ることができる。この技術は、ＲＮＡ種の存在を示し、そのＲＮＡの完全性に関する情報を与える。ＲＮＡ種の存在または非存在を、ドットブロットノーザンハイブリダイゼーションまたはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを用いて決定してもよい。これらの技術はノーザンブロッティングの改変であり、ＲＮＡ種の存在または不存在のみを示す。
遺伝子発現
サザンブロッティングおよびＰＣＲ（商標）を用いて、対象の遺伝子を検出してもよいが、それらは、対応するタンパク質が発現されているか否かに関する情報を提供しない。発現を、導入された遺伝子のタンパク質産物またはＲＮＡ産物を特異的に同定することによって、またはそれらの発現によって生じる表現型の変化を評価することによって、評価できる。
特定のタンパク質の生成および同定におけるアッセイは、タンパク質の物理−化学的性質、構造的性質、機能的性質または他の性質を利用できる。固有の物理−化学的性質または構造的性質は、そのタンパク質を電気泳動法（天然ゲル電気泳動、変性ゲル電気泳動または等電点電気泳動など）またはクロマトグラフィー技術（イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル排除クロマトグラフィーなど）によって分離および同定することを可能にする。個々のタンパク質の固有の構造は、それらの存在を、ＥＬＩＳＡアッセイなどの様式で、特異的な抗体を用いて検出する機会を与える。手法の組合せを、ウエスタンブロッティングなどのより大きな選択性を伴って使用でき、ここでウエスタンブロッティングは、抗体を用いて、電気泳動技術によって分離した個々の遺伝子産物の位置を示す。さらなる技術（精製後のアミノ酸シークエンシングによる評価など）を用いて、対象の産物の同一性を絶対的に確認してもよい。これらは最も一般的に使用されるものの一つであるが、他の手法をさらに用いてもよい。
アッセイの手法を用いて、タンパク質の機能性、特に特異性な基質および産物を含む特異的な化学反応を触媒する酵素の能力によって、そのタンパク質の発現を同定できる。これらの反応後、基質の損失または反応生成物の生成を、物理的または化学的手法によって、提供および定量化してもよい。その例は分析する酵素によって様々であり、２つを挙げると、ホスフィノトリシンおよび１４Ｃ−アセチルＣｏＡからの放射性標識されたアセチル化ホスフィノトリシンの生成後の、ＰＡＴの酵素活性におけるアッセイ、またはアントラニル酸の蛍光の損失後の、アントラニル酸シンターゼ活性におけるアッセイを含み得る。
遺伝子産物の発現を、その発現の表現型の結果を評価することによって、よく決定する。これらのアッセイはまた、限定されないが、植物の化学組成、形態、または生理学的性質の変化を分析することを含む多くの形式を取ることができる。化学組成を、アミノ酸組成を変化させる酵素または貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現によって、改変でき、アミノ酸分析によって、または近赤外反射分光法によって分析できる澱粉量を変化させる酵素によって、検出できる。形態変化はより高い背丈またはより太い茎を含み得る。課された処理に対する植物または植物の部分における最も頻度の高い変化を、注意深く制御された条件下で評価し、これはバイオアッセイと呼ばれる。
本発明の植物の育種
本発明において調製したコンストラクトでの、特定の植物の遺伝子型の直接的な形質転換に加えて、トランスジェニック植物を、本発明の選択されたＤＮＡを有する植物をそのコンストラクトを有さない第２の植物と交雑することによって、作成してもよい。例えば、選択されたリグニンの生合成をコードする配列を、特定の植物変種に直接形質転換する必要なく、所定の植物変種に交雑によって導入できる。したがって、本発明は、直接形質転換した植物または、本発明によって形質転換した細胞から再生した植物だけでなく、そのような植物の子孫も包含する。
本明細書において、用語「子孫」は、本発明によって調製された親植物の任意の世代の子孫を示し、ここでこの子孫は、選択されたＤＮＡコンストラクトを有する。本明細書で開示されるように、植物を「交雑」し、開始植物系に対して１以上の付加された導入遺伝子を有する植物系を与えることは、開始植物系を、本発明の導入遺伝子を含むドナー植物系と交雑することによって、本発明の導入遺伝子を植物系に導入することをもたらす技術として定義される。これを達成するため、例えば以下の工程を行う：
（ａ）第１の親植物（開始系）および第２の親植物（本発明の導入遺伝子を有するドナー植物系）の種子を植える工程；
（ｂ）第１の親植物および第２の親植物の種子を、花を咲かせる植物に成長させる工程；
（ｃ）第１の親植物の花を第２の親植物の花粉で授粉させる工程；および
（ｄ）受精した花を咲かせた親植物が生成した種子を収穫する工程。
戻し交配は、本明細書において、
（ａ）所望の遺伝子、ＤＮＡ配列またはＤＮＡ要素を含む第１の遺伝子型の植物を、その所望の遺伝子、ＤＮＡ配列またはＤＮＡ要素を含まない第２の遺伝子型の植物と交雑する工程；
（ｂ）所望の遺伝子、ＤＮＡ配列またはＤＮＡ要素を含む１以上の子孫植物を選択する工程；
（ｃ）子孫植物を第２の遺伝子型の植物と交雑させる工程；および
（ｄ）所望のＤＮＡ配列を、第１の遺伝子型の植物から第２の遺伝子型の植物に移行させる目的で、工程（ｂ）および（ｃ）を反復する工程、
を含む方法と定義される。
ＤＮＡ要素の植物遺伝子型への遺伝子移入は、戻し交配の変換の方法の結果と定義される。ＤＮＡ配列を遺伝子移入した植物の遺伝子型は、戻し交配変換された遺伝子型、戻し交配変換された系、戻し交配変換された同型繁殖体または戻し交配変換されたハイブリッドと呼ばれ得る。同様に、所望のＤＮＡ配列を有さない植物の遺伝子型は、未変換の遺伝子型、未変換の系、未変換の同型繁殖体または未変換のハイブリッドと呼ばれ得る。
アサの医学的な利点、カンナビノイドの含有量およびその分析
アサから単離された１以上のカンナビノイドに起因し得る、いくつかの医学的な利点は、痛み、吐き気、ＡＩＤＳによる体重の減少および衰弱、多発性硬化症、アレルギー、感染症、鬱病、片頭痛、双極性障害、高血圧、脳卒中後の神経保護、てんかんおよび線維筋痛症の処置、ならびに腫瘍成長、血管形成および転移の阻害、を含む。研究は、カンナビノイドがまた、緑内障、パーキンソン病、ハンチントン病、片頭痛、炎症、クローン病、ジストニア、関節リウマチ、化学療法による嘔吐、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、心的外傷後ストレス障害、心臓再かん流傷害、前立腺がん、およびアルツハイマー病などの症状を処置するのに有用であり得ることを示した。例えば、米国特許第6,630,507号は、抗酸化剤および神経保護薬としての使用におけるカンナビノイドを開示する；米国特許第7,105,685号は、免疫機能障害に関連する疾患、特にＨＩＶ疾患および腫瘍性疾患の処置におけるカンナビノイドを開示する；米国特許第7,109,245号は、血管収縮薬として有用なカンナビノイドを開示する；米国特許出願公開US2011/0257256は、認識機能障害および認知症の処置または予防に使用するための、ＴＨＣ−ＣＢＤ組成物を開示する；ＰＣＴ出願WO/2009/147439は、がん、特にグリオーマ腫瘍の処置に使用する薬剤の製造におけるカンナビノイドの使用を開示する；ＰＣＴ出願WO/2007/148094は、神経障害痛の処置のためのカンナビノイド組成物の使用を開示する；そして、米国特許出願公開US2010/0286098は、カンナビノイドを投与し、大腸炎を患う患者の組織傷害を処置する方法を開示する。
広範な医学的使用が同定されてきたが、特定の疾患または状態において、カンナビノイドによって達成される利点は、カンナビノイドのサブグループ、または個々のカンナビノイドに起因し得ると考えられる。すなわち、種々のサブグループまたは単一のカンナビノイドは、ある状態において有益な効果を有するが、他のサブグループまたは個別のカンナビノイドは他の状態において、有益な効果を有する。例えば、ＴＨＣは、アサが生成する主要な向精神性のカンナビノイドであり、その生物学的活性および広範囲の疾患における潜在的な治療上の適用によって、よく特徴付けられる。アサの別の主要なカンナビノイド構成物であるＣＢＤは、ＣＢ１およびＣＢ２カンナビノイド受容体のインバースアゴニストとして働く。ＴＨＣと異なり、ＣＢＤはヒトにおいて向精神性効果を生じない。ＣＢＤは、鎮痛、抗酸化、抗炎症性、および免疫調節性の効果を発揮することが報告されている。
テルペン（テルペノイドを含む）は、アサが生成する別の分類の化合物である。報告によると、２００以上ものテルペンがアサ植物によって生成され得るが、アサ系によって生成するテルペンの種類および比率は、遺伝学的状態および成長条件（例えば、照明、受精、土壌、散水頻度／散水量、湿度、二酸化炭素濃度など）ならびに齢、成熟化および時刻に依存する。テルペンは、医学的性質を有することが示されており、アサの医学的価値の少なくとも一部分を担ってい得る。
アサから単離された１以上のテルペンに起因し得る、いくつかの医学的な利点は、睡眠障害、精神障害、不安、てんかんおよび発作、痛み、微生物感染（真菌、細菌など）、がん、炎症、けいれん、胃逆流、鬱病ならびにぜんそくの処置を含む。いくつかのテルペンは、血液脳関門を横切る抵抗力を低下させ、カンナビノイド受容体および他の神経細胞受容体に作用し、免疫系を刺激し、かつ／または食欲を抑制することが示されてきた。
しかしながら現在、医療用のアサは、患者が、医薬品の効果をもたらす種々のカンナビノイド全体を利用することによって、一般的な製品として用いられる。特定の疾患を患う患者において、アサの医学的利点を最大化する試みがなされてきたが、そのような試みは常に困難であった。例えば、ＴＨＣは向精神性であるため、いくつかの患者および規制機関(regulatory authority)は、高いＣＢＤ（および低いＴＨＣ）を有するアサを、合法的、医学的および／または文化的に容認されている伝統的なアサの代替物であると見なす。さらに、現在患者に用いられているアサは、カンナビノイドの構成要素および濃度が一貫していないことがあるため、それによって、患者に最大の利益を提供できない。
アサは、多様な疾患の処置に有用な大量のカンナビノイドを発現する。しかしながら、特定の疾患におけるアサの品種の有用性は、１以上の特定のカンナビノイドの濃度、および／またはその品種で生成するカンナビノイド間の含量の比に依存する。
治療効果を有するアサの他の構成要素は、カンナビゲロール（抗菌性ならびに、ケラチノサイトおよびがん細胞の増殖阻害）、デルタ−８−テトラヒドロカンナビノール（食欲刺激薬）を含む。アサの他の構成要素は、カンナビエルソイン、カンナビノトリオール、カンナビクロメン、カンナビノール、カンナビシクロール(Cannabicycol)、およびテルペノイド（アルファ−ピネン、リナロール、ミルセン、ベータ−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド(carophyllene oxide)、フムレン−フムレン(humulene-humulene)、リモネンおよびテルピノレンを含む）を含む。
カンナビノイドの生合成は、雌花を高密度で覆う腺毛状突起内で主に生じる。カンナビゲロール酸は、ＴＨＣ、ＣＢＤおよびカンナビクロメンの前駆体である。特に、ＴＨＣＡ合成酵素は、カンナビゲロール酸からのデルタ−９−テトラヒドロカンナビノール酸の生成を触媒する；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール酸は熱変換を起こし、ＴＨＣを形成する。ＣＢＤＡ合成酵素は、カンナビゲロール酸からのカンナビジオール酸の生成を触媒する；カンナビジオール酸はＣＢＤへの熱変換を起こす。ＣＢＣＡ合成酵素は、カンナビゲロール酸からのカンナビクロメン酸の生成を触媒する；カンナビクロメン酸はカンナビクロメンへの熱変換を起こす。U.S. 2013/0067619は、カンナビス・サティバにおける主要なカンナビノイド種を導く経路を記述し、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
「アサ」、「アサ種」、「アサ植物」、または「大麻」は、カンナビス・サティバ、カンナビス・ルデラリスおよびカンナビス・インディカの種（または亜種）を含む顕花植物を指す。
「カンナビノイド」は、カンナビノイド受容体に作用する化学化合物の分類を指す。「内在性カンナビノイド」は、動物（ヒトを含む）において、天然に生成される。「植物性カンナビノイド」は植物において生成される、天然に生じるカンナビノイドである。「合成カンナビノイド」は人工的に製造されるカンナビノイドである。
アサ種は、少なくとも８５種の異なる植物性カンナビノイドを発現し、これらは線網状突起で生成する樹脂で濃縮される。植物性カンナビノイドを、カンナビゲロール、カンナビクロメン、カンナビジオール、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、カンナビノジオールおよび他のカンナビノイドを含む、構造に基づくサブクラスに分類する。
アサにおいて発見されたカンナビノイドは、限定されないが：カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビノール（ＣＢＮ）およびカンナビノジオール（ＣＢＤＬ）、カンナビシクロール（ＣＢＬ）、カンナビバリン（ＣＢＶ）、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビクロメバリン（ＣＢＣＶ）、カンナビゲロバリン(cannabigerovarin)（ＣＢＧＶ）、カンナビゲロールモノメチルエーテル(cannabigerol monomethyl ether)（ＣＢＧＭ）、カンナビネロール酸(cannabinerolic acid)、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビノールプロピル変異体(cannabinol propyl variant)（ＣＢＮＶ）、カンナビトリオール（ＣＢＯ）、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）ならびにテトラヒドロカンナビバリン酸（ＴＨＣＶＡ）を含む。植物性カンナビノイドおよびそれらの構造は、米国特許出願公開第2013/0059018号においてより詳細に議論され、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。
植物性カンナビノイドは、ペンチル（５個の炭素原子）変異体またはプロピル（３個の炭素原子）変異体のいずれかとして生じてもよい。プロピル変異体およびペンチル変異体は、互いに異なる性質を有し得る。例えば、ＴＨＣはＣＢ１受容体のアゴニストであるが、プロピル変異体であるＴＨＣＶはＣＢ１受容体のアンタゴニストであり、これはＴＨＣＶがＴＨＣとはほとんど逆の効果を有することを意味する。
「テルペン」または「テルペノイド」は、アサを含む植物が生成する化合物の分類を指す。用語「テルペノイド」は、（例えば酸化によって）化学修飾されたテルペンを、一般的に指す。本明細書において、テルペンは、テルペノイドを含む。テルペンおよびテルペノイドは大抵、芳香族炭化水素であり、それらに関連する強い臭いを有し得る。
アサが生成することが知られているテルペンは、限定されないが、アロマデンドレン、ベルガモチン、ベルガモトール、ビサボレン、ボルネオール、４−３−カレン、カリオフィレン、シネオール/ユーカリプトール、ｐ−シメン、ジヒドロジャスモン、エレメン、ファルネセン、フェンコール、酢酸ゲラニル、グアイオール、フムレン、イソプレゴール、リモネン、リナロール、メントン、メントール、メントフラン、ミルセン、酢酸ネリル、ネオメンチルアセテート(neomenthylacetate)、オシメン、ペリリルアルコール、フェランドレン、ピネン、プレゴン、サビネン、テルピネン、テルピネオール、テルピネオール−４−オール(terpineol-4-ol)、テルピノレンおよび、それぞれの誘導体、異性体、エナンチオマーなどを含む。
アサ植物および製品はまた、フラボノイドおよび植物ステロール（例えば、アピゲニン、クェルセチン、カンフラビンＡ、ベータ−シトステロールなど）を含む、薬剤に関連する他の化合物を含み得る。
本明細書における用語「アサの製品」、「植物派生製品」、「アサ植物派生製品」、「アサ派生製品」または「加工製品」は、アサ植物由来の任意の製品を指し、限定されないが、花、樹脂（ハシシ）および油（ハシシオイル）ならびにそれらの任意の調製物を含む。調製物は、限定されない例として、ドライフラワー、マリファナ、ハシシ、チンキ、ハシシオイル、浸剤(infusion)、パイプ樹脂(pipe resin)、食料品などを含む。
本明細書において、用語「花」、「蕾」または「ドライフラワー」は、乾燥させたアサの花、ならびにそれらに付随する葉（例えば苞葉）および茎を指す。これは、最も広範に消費されているアサの形式である。
用語「チンキ」は、度数の高いアルコールで作成されたアサの抽出液を指す。
用語「アサ油」は、アサの花および葉から抽出された油を指す。
用語「浸剤」は、多様な製品におけるアサの浸剤を指す。限定されない例は、茶、ココアバター、乳製品のバター、調理用油、グリセリンおよび他の油（例えば、皮膚の保湿液）を含む。浸剤は、ビール、ソーダ、ピーナッツバターなどの食料品を含む。
「食用の」アサの製品は、食品として消費できる任意のアサの製品を指す。いくつかの場合では、食料品は、アサを食材に注入することによって作成される。いくつかの場合では、食料品は、食料品（クッキー、チョコレート、キャンディー、ビール、ポップコーンなど）を作成するために、アサの製品（ドライフラワー、マリファナ、ハシシ、チンキ、ハシシオイルまたは浸剤）を、他の材料と組み合わせることによって、作成される。
植物は栄養成長期を経て、開花周期(flowering cycle)となる。発芽または挿木発根と開花の間の成長期は、植物発生の栄養期として知られている。栄養期は、アサ植物の胞子体段階である。植物は栄養期の間、花を生成せず、開花に望ましい生成サイズまで大きくなる。栄養期の間、植物は盛んに光合成を行い、開花および生殖に必要な資源を蓄積する。
「開花周期」または「開花期」（「発蕾周期(bud cycle)」とも呼ばれる）は、植物が蕾および花を生成する期間を指す。これは植物成長の生殖期であり、アサは別個の植物が雌および雄の生殖器官を有する雌雄異株である。開花は、アサの配偶体段階または生殖段階である。産業的には、雌のみが栽培のために選択される。いくつかの品種において、栄養期から開花期への転換は光依存的である。いくつかの品種は自動開花(autoflowering)であり、それらが自動的に(例えば、齢などによって)開花期に転換することを意味する。
「アサ品種」は、１以上の望ましい特徴において選択され、繁殖したアサ植物を指す。品種という用語を用いる場合、品種は、育種の結果および／または遺伝子操作の結果であり得ることが理解される。本明細書で記述されるアサ品種は、天然起源ではない。繁殖は任意の様式（限定されないが、有性生殖（種子など）、クローニング（挿し木、栄養繁殖など）、自家授粉など）で起こしてよい。
本明細書における「複数」は、１よりも大きいことを指す。例えば、複数のカンナビノイドは、２、３、４、５またはそれ以上のカンナビノイドであり得る。
本明細書における用語「活性カンナビノイド」は、酸性型の脱炭酸で形成すると推定される非酸性型の量を加えた、非酸性型のカンナビノイドを指す。
酸性型のカンナビノイド（例えば、ＣＢＤＡまたはＴＨＣＡ）は、脱炭酸によってそれらの非酸性型（例えば、ＴＨＣまたはＣＢＤ）に変換できる。脱炭酸は、カンナビノイドを加熱すると起こる。さらに、酸性型カンナビノイドは、治療活性を有することが示されてきた。カンナビノイドを酸性型から非酸性（「活性」）型に変換すると、質量が減る。脱炭酸後に存在する活性カンナビノイドの推定量を決定するため、酸性型の量に８７．７％を乗じてもよい。これは概算の推定量であり、生成した活性カンナビノイドの実際の量は、カンナビノイド、脱炭酸の方法および脱炭酸処理（例えば、熱による）中のカンナビノイドのさらなる分解などに依存する。
一つの実施態様において、「治療上有効な量」は、患者の症状の予防もしくは改善、または所望の生物学的結果（例えば、臨床症状の改善、疾患発症の遅延など）をもたらす、化合物の量を指す。有効な量は、当業者によって決定され得る。選択される投与量のレベルは、限定されないが、処置される状態の重症度ならびに処置される患者の状態および既往歴、を含む要素に依存し得る。しかしながら、所望の治療上の効果を達成するのに必要なレベルより低いレベルで、化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加することは、当分野の技術に含まれる。
用語「調節する」または「調節すること」は、哺乳類などの対象における疾患または障害の任意の処置を意味し：疾患もしくは障害を予防し、または疾患もしくは障害から保護すること、すなわち異常な生物学的反応または症状が発現しないようにすること；疾患または症状を阻害すること、すなわち異常な生物学的反応および／または臨床症状の発現を停止または抑制すること；および／または、疾患もしくは障害を軽減すること、すなわち異常な生物学的反応および／または臨床症状の軽減を生じること、を含む。
本明細書において、用語「予防すること」は、患者が必要とする予防的な処置を指す。予防的な処置は、病気を患う危険性のある対象に、適切な投与量の治療薬を提供し、それによって病気の発症を実質的に防ぐことで、達成され得る。
本明細書において、用語「状態」は、本明細書で提供される化合物、組成物および方法を用いるための、病態を指す。
本明細書において、用語「患者」または「対象」は、哺乳類を指し、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む。本明細書における特別な実施態様において、患者または対象はヒトである。
一つの態様において、高いレベルのＣＢＤ（および／またはＣＢＤＡ）および低いレベルのＴＨＣ（および／またはＴＨＣＡ）を生成するアサ品種であるアサ植物を、本明細書で記述する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１８％〜約６０％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約２０％〜約４０％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約２０％〜約３０％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約２５％〜約３５％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。上述の値における任意のサブ値(subvalue)またはサブレンジが、本明細書で記述される実施態様で用いられることが想定されると理解されるべきである。
一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約１８％濃度のアッセイ可能なの、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約１９％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。好ましい実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２０％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２１％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２２％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２３％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２４％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２５％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２６％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２７％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２８％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約２９％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、少なくとも総重量で約３０％のアッセイ可能な濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを生成する。
一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約３％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約２％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約１％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．３％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．１％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０９％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０８％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０７％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０６％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０５％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０４％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０３％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０２％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０％〜約０．０１％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０２％〜約３％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。好ましい実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０２％〜約２％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０３％〜約２％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０５％〜約２％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０７％〜約２％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。上述の値における任意のサブ値またはサブレンジが、本明細書で記述される実施態様で用いられることが想定されると理解されるべきである。
一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約３％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約２％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１．９％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１．８％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１．７％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１．６％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１．５％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１．４％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１．３％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１．２％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約１％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．５％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．３％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．２％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．１％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０９％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０８％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０７％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０６％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０５％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０４％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０３％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０２％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０１％未満のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。一つの実施態様において、アサ品種は、総重量で約０．０７％のアッセイ可能な濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を生成する。
一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、重量約１８％ないし約６０％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、重量約２０％ないし約６０％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、重量約２０％ないし約５０％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、重量約２０％ないし約４０％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、重量約２０％ないし約３０％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、重量約２０％ないし約２５％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、重量約２５％ないし約４０％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、重量約２５％ないし約３０％である。上述の値における任意のサブ値またはサブレンジが、本明細書で記述される実施態様で用いられることが想定されると理解されるべきである。
一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約１８％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約１９％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２０％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２１％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２２％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２３％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２４％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２５％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２６％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２７％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２８％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約２９％である。一つの実施態様において、推定される活性カンナビジオールの濃度は、少なくとも重量約３０％である。
一つの実施態様において、本発明はアサ系またはその製品に関し、ここで推定される活性カンナビジオールと推定される活性ＴＨＣとの比は、約４００：１ないし約１５：１である。一つの実施態様において、活性カンナビジオールと活性ＴＨＣとの比は、約３００：１ないし約２０：１である。一つの実施態様において、活性カンナビジオールと活性ＴＨＣとの比は、約３００：１ないし約２５：１である。一つの実施態様において、活性カンナビジオールと活性ＴＨＣとの比は、約３００：１ないし約３０：１である。一つの実施態様において、活性カンナビジオールと活性ＴＨＣとの比は、約３００：１ないし約５０：１である。一つの実施態様において、活性カンナビジオールと活性ＴＨＣとの比は、約３００：１ないし約７０：１である。一つの実施態様において、活性カンナビジオールと活性ＴＨＣとの比は、約３００：１ないし約８０：１である。一つの実施態様において、活性カンナビジオールと活性ＴＨＣとの比は、約３００：１ないし約１００：１である。一つの実施態様において、活性カンナビジオールと活性ＴＨＣとの比は、約３００：１ないし約２００：１である。
カンナビノイドの濃度は、アサ植物の任意の部分に由来する試料に基づいて決定され得る。カンナビノイドの濃度は、植物の生活環の任意の時点において得た試料に基づいて決定され得る。好ましい実施態様において、試料はアサ植物の花（または花序）由来である。一つの実施態様において、試料は花、葉、茎またはそれらの組合せの１つまたはそれ以上に由来する。一つの実施態様において、試料を、アサの生活環の成長期に得る。一つの実施態様において、試料を、アサの生活環の開花期に得る。
一つの態様において、アサ系のカンナビノイドの組成および／またはテルペンの組成は、バッチ間で一貫している。一つの実施態様において、特定の系のカンナビノイドの組成および／またはテルペンの組成は、異なる時期に成長および回収されたバッチ間で一貫している。一つの実施態様において、特定の系のカンナビノイドの組成および／またはテルペンの組成は、異なる場所（例えば、異なる栽培施設）で成長および回収されたバッチ間で一貫している。用語「一貫している」は、特定の系において存在する所定のカンナビノイドおよび／またはテルペンの濃度が、２０％、好ましくは１５％、１０％または５％を超えて変動しないことを意味する。一つの実施態様において、カンナビノイドは植物性カンナビノイドである。一つの実施態様において、カンナビノイドはＣＢＤである。一つの実施態様において、カンナビノイドはＴＨＣである。一つの実施態様において、カンナビノイドはＣＢＮである。一つの実施態様において、カンナビノイドは、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビノール（ＣＢＮ）およびカンナビノジオール（ＣＢＤＬ）、カンナビシクロール（ＣＢＬ）、カンナビバリン（ＣＢＶ）、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビクロメバリン（ＣＢＣＶ）、カンナビゲロバリン（ＣＢＧＶ）、カンナビゲロールモノメチルエーテル（ＣＢＧＭ）、カンナビネロール酸、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビノールプロピル変異体（ＣＢＮＶ）、カンナビトリオール（ＣＢＯ）、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）またはテトラヒドロカンナビバリン酸（ＴＨＣＶＡ）の少なくとも１つである。
一つの態様において、系のカンナビノイドの組成および／またはテルペンの組成は、収集した生成物のサブセット（例えば、試料）における、少なくとも１つのカンナビノイドの濃度をアッセイすることによって、決定される。一つの実施態様において、ＴＨＣ濃度をアッセイする。一つの実施態様において、ＣＢＤ濃度をアッセイする。一つの実施態様において、カンナビノイドはＣＢＮである。一つの実施態様において、カンナビノイドは、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビノール（ＣＢＮ）およびカンナビノジオール（ＣＢＤＬ）、カンナビシクロール（ＣＢＬ）、カンナビバリン（ＣＢＶ）、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビクロメバリン（ＣＢＣＶ）、カンナビゲロバリン（ＣＢＧＶ）、カンナビゲロールモノメチルエーテル（ＣＢＧＭ）、カンナビネロール酸、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビノールプロピル変異体（ＣＢＮＶ）、カンナビトリオール（ＣＢＯ）、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）またはテトラヒドロカンナビバリン酸（ＴＨＣＶＡ）の少なくとも１つである。一つの実施態様において、１以上のテルペン濃度をアッセイする。
カンナビノイドの濃度を決定するために用いる従来のアッセイは、同一の植物において著しい偏差を示す。そのような偏差は、アサ産業全体、特に再現性を必要とする医療用アサ産業において問題となる。注意深い検査により、アッセイされた組成物の含水量が、アッセイされた濃度のばらつきに重要なパラメータであることが想定される。驚くべきことに、そのようなばらつきは、アッセイ毎に一貫した含水量を与えることで最小化できる。一つの態様において、本発明は、アッセイが異なる試料（例えば、バッチおよび／または系）間で再現性のある結果を与えるように、アサ試料のカンナビノイド濃度をアッセイする方法に関する。
一つの実施態様において、検査（例えば、カンナビノイド含量について）される試料の含水量は、アッセイを行う前に一貫したレベルに調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、４０％以下の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約４０％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約３０％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約２０％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約１５％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約１４％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約１３％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約１２％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約１１％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約１０％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約９％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約８％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約７％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約６％の含水量に調整される。一つの実施態様において、検査される試料は、約５％の含水量に調整される。さらに別の手法において、組成物をアッセイ前に凍結乾燥する。含水量を決定する方法は、当分野でよく知られている。
検査される試料の含水量を、含水量を調整するための任意の方法を用いて、調整してもよい。一つの実施態様において、試料をアッセイ前に、所望の湿度レベルの保湿室または湿度室に一定時間放置することによって、含水量を調整する。一つの実施態様において、含水量を、試料を所望の含水量まで脱水することによって、調整する。試料を任意の脱水方法で脱水してよい。一つの実施態様において、含水量を、試料を凍結乾燥することによって、調整する。一つの実施態様において、２以上の試料の含水量を同時に調整する。一つの実施態様において、試料の含水量を、調整の工程の前に、決定する。一つの実施態様において、試料の含水量を、調整の工程の前に、決定しない。
一つの実施態様において、カンナビノイドの濃度を、含水量に関係なく、決定する。例えば、試料の乾燥重量を決定してもよく、カンナビノイドの含量を乾燥重量に対して決定する。
所望の含水量を達成した後、カンナビノイドの含量を任意の方法で決定してよい。この方法は、限定されないが、ラジオイムノアッセイ、ガスクロマトグラフィー／質量分析、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー／質量分析および酵素免疫測定法を含む。
上述したものを考慮して、当業者は、開示された特定の態様において改変を行い、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。したがって、本明細書で開示される特定の構造的および機能的詳細は、限定するものとして解釈されない。本明細書で引用するそれぞれの参考文献の開示全体は、本出願の開示の中に取り込まれることが理解されるべきである。
実施例１：ＴＨＣＡ合成酵素のクローニングおよびシークエンシング
数種のカンナビス・サティバのＴＨＣＡ合成酵素の配列を配列比較した。図１は、world wide web.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2で利用できる、CLUSTAL O (1.2.1)マルチプルシークエンスアライメントプログラムを用いて得たアライメントを示す。
GenBankにおける３０種のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子目録(gene accession)のアライメントは、高度に保存された配列領域（２１から４２ｂｐの１３領域）を同定し、ＰＣＲプライマーをＤＮＡ増幅のために生成し、その後、介在ベクター(intermediate vector)にクローニングした。ＰＣＲによって導入されるエラーを減らすため、編集酵素を用いてもよく、複数の独立した増幅は、シークエンシングのためのＤＮＡを提供し得る；したがって、増幅の過程で生じ得るまれな変異の除去が可能である。ある実施態様において、TWEED（登録商標）で用いるアサ系のＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子配列を用いて、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）の機能性を確認できる。
３種のカンナビス・サティバ系（ＤＫ−１、ＮＤ−１およびＳＨ−４）のＴＨＣＡ合成酵素をコードする遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、ＰＣＲの誤りを避けるためにTHERMO FISHER（登録商標）の校正ポリメラーゼであるPHUSION（登録商標）を用いて増幅し、ＰＣＲ産物を、シークエンシングのためのｐＧＥＭベクターにクローニングした。各ＰＣＲ反応からの２個または３個の独立した（ｐＧＥＭベクターにおける）クローンを配列決定し、配列を確認した。図２のアライメントに用いたＤＫ−１およびＳＨ−４は、クローンの代表的な配列であり、ＤＮＡ配列を少なくとも２つのシークエンシング反応で確認し、これは同一の配列をもたらし、全ゲノム配列の構築が可能であった。
ＤＫ−１およびＳＨ−４において得られたクローン化ＴＨＣＡ合成酵素の配列を、図２に示すように、ＮＣＢＩ配列AB057805.1（配列番号４０）；AB212829.1（配列番号２８）；AB212833.1（配列番号２４）；AB292683.1（配列番号４１）；JQ437487.1（配列番号２）；およびJQ437491.1（配列番号１３）と共に配列比較した。ＤＫ−１＿ｆｕｌｌ（配列番号４６）およびＳＨ−４＿ｆｕｌｌ（配列番号４７）ならびにＮＤ系由来のＴＨＣＡ合成酵素の配列は、AB057805-1（配列番号４０）との同一性を示した。さらに図２はまた、コンセンサス配列（配列番号８６）を示す。配列のアライメントを、DNAMAN（登録商標）を用いて行った。
実施例２：ＲＮＡ干渉コンストラクトの設計
無関係の遺伝子／タンパク質をサイレンシングすることによるオフターゲット効果を避けるため、ＲＮＡ干渉コンストラクトを設計する際、保存されたドメインを避けた。保存されたタンパク質ドメインを、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースにおいて保存されたドメインを探索することによって、ＴＨＣＡ合成酵素において同定した。図５は、ＴＨＣＡ合成酵素の４８０−５３８のアミノ酸領域、８１−２１８のアミノ酸領域にそれぞれ位置する、タンパク質ドメインであるベルベリンおよびベルベリン様（ＢＢＥ）ドメイン、ならびにＦＡＤ結合ドメインを示す。ＦＡＤ結合ドメインは、補因子として、ＦＡＤに結合する様々な酵素に存在する。ＢＢＥドメインは、様々なイソキノリンアルカロイドの生合成に関与する、複数の酵素において発見されている。ＧｌｃＤドメイン（８１−５４０のアミノ酸領域に位置し、図５に示される）もまた同定された。このドメインは、原核生物の酵素に特有な、グリコール酸オキシダーゼのサブユニットであるＧｌｃＤドメインであり、したがってほとんど問題はない。しかしながら、ＲＮＡ干渉コンストラクトを設計する際、ＦＡＤ結合ドメインおよびＢＢＥドメインを回避した。
実施例３：アンチセンスコンストラクトの設計
二本鎖ＲＮＡの形成を介してＲＮＡサイレンシングを誘導する、ＲＮＡｉコンストラクトをコードする発現カセットを作成するため、ＤＮＡ（配列番号８１）をコードする全アンチセンスＲＮＡを、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲで用いたプライマーは、ＴＨＣＡ−ＦｕｌｌＡＳ−Ｆ（配列番号５９）およびＴＨＣＡ−ＦｕｌｌＡＳ−Ｒ（配列番号６０）であった。ＰＣＲフラグメントをｐＧＥＭベクターにクローン化し、配列を確認した。
アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの導入遺伝子発現に適した基本ベクターを作成するため、プロモーターおよび適切なマルチクローニングサイトをｐＣＡＭＢＩＡ１３９１ベクターに挿入し、ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１−３５Ｓベクターを作成し、図６に示した。３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーターであり、カンナビス・サティバにおける構成的なアンチセンス発現のためのユニバーサルプロモーターとして使用でき、ＲＮＡ干渉コンストラクトにおいても有用である。あるいは、ｔＣＵＰプロモーター（トマト潜在性(cryptic)プロモーター）もまた、カンナビス・サティバにおける高い構成的発現のために使用できる。
ＤＮＡをコードする全アンチセンスＲＮＡを、介在ｐＧＥＭベクターから切除し、植物の形質転換の基本ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３９１−３５Ｓの３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターとの間の部位（図６に示すＭｌｕＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位）にクローン化し、挿入物の存在を制限解析(restriction analysis)によって確認し、シークエンシングによって確認できる。
実施例４：小ヘアピンコンストラクトの設計
ＲＮＡ干渉を介してＲＮＡサイレンシングを誘導するベクターを作成するため、小ヘアピンＲＮＡコンストラクトを、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子をコードする配列の５’末端に対応するＤＮＡをコードする、センス−ループ−アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡとして設計した。このコンストラクトのセンス部分は、約２００塩基対に相当し（配列番号６１）、カンナビス・サティバにおける全ての保存されたドメインおよび他の酵素をコードする遺伝子の潜在的なサイレンシングを回避する。センス部分はまた、最もアクセスしやすい領域として同定されたＲＮＡ領域に位置する（図３および図４参照）。センス部分を、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＳＮ−Ｆ１（配列番号５１）およびＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＳＮ−Ｒ１（配列番号５２）のプライマーを用いて増幅し、その後ループ部分（配列番号６２）を増幅した。ループ部分に続いて、アンチセンス部分（配列番号６３）を、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＡＳ−Ｆ１（配列番号５３）およびＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ１−ＡＮ−Ｒ１（配列番号５４）を用いて増幅した。ＤＮＡをコードする、完全なセンス−ループ−アンチセンスＲＮＡ配列を、配列番号６４に示す。干渉ＲＮＡの導入遺伝子発現に適した基本ベクターを作成するため、プロモーターおよび適切なマルチクローニングサイトをｐＣＡＭＢＩＡ１３９１ベクターに挿入し、ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１−３５Ｓベクターを作成し、図６に示した。
小ヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡを、介在ｐＧＥＭベクターから切除し、植物の形質転換の基本ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３９１−３５Ｓの３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターとの間の部位（図６に示すＭｌｕＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位）にクローン化し、挿入物の存在を制限解析によって確認し、シークエンシングによって確認できる。
実施例５：大ヘアピンコンストラクトの設計
ＲＮＡ干渉を介してＲＮＡサイレンシングを誘導するベクターを作成するため、大ヘアピンＲＮＡコンストラクトを、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子をコードする配列の中央部に対応するＤＮＡをコードする、センス−ループ−アンチセンスＲＮＡとして設計した。このコンストラクトのセンス部分は、約５５０塩基対に相当し（配列番号６９）、最も共通する可能性の高いドメイン（ＦＡＤ結合ドメインおよびＢＢＥドメイン）を回避し、したがってカンナビス・サティバにおける他の酵素をコードする遺伝子の潜在的なサイレンシングを回避する。センス部分を、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＳＮ−Ｆ２（配列番号５５）およびＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＳＮ−Ｒ２（配列番号５６）のプライマーを用いて増幅し、その後ループ部分（配列番号７０）を増幅した。ループ部分に続いて、アンチセンス部分（配列番号７１）を、ＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＡＳ−Ｆ２（配列番号５７）およびＴＨＣＡ−ｈｐＲＮＡ２−ＡＳ−Ｒ２（配列番号５８）を用いて増幅した。ＤＮＡをコードする、完全なセンス−ループ−アンチセンスＲＮＡ配列を、配列番号７２に示す。
小ヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡを、介在ｐＧＥＭベクターから切除し、植物の形質転換の基本ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３９１−３５Ｓの３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターとの間の部位（図６に示すＭｌｕＩ−ＢｓｔＥＩＩ部位）にクローン化し、挿入物の存在を制限解析によって確認し、シークエンシングによって確認できる。
実施例６：アサのポリヌクレオチドでの形質転換
アサの組織培養（カルス、芽および根の誘導）を確立できる。微粒子銃での形質転換後に、一過性の形質転換およびアサのＧＵＳ染色を必要な範囲で行う。次いで、本発明のポリヌクレオチドを、アサ植物に形質転換してもよい。特に、アサの生殖細胞におけるアグロバクテリウムを介する形質転換を、フローラルディップ法／真空浸潤法を用いて行い、その後、種子の回収および分析を行ってもよい。さらに、体細胞におけるアグロバクテリウムを介する形質転換（リーフディスク法およびカルスの形質転換後、組織培養での再生）を行ってもよい。特別な実施態様において、葉柄または花器官を形質転換してもよい。一過性の形質転換実験から選択される方法論を用いる、微粒子銃の形質転換の手法を行ってもよく、植物は組織培養から再生できる。さらに、ＰＥＧを介するプロトプラストの形質転換を行ってもよい。ある実施態様において、ＧＵＳレポーター遺伝子を、形質転換前に、ベクターに挿入してもよい。
形質転換体（例えばアグロバクテリウム、微粒子銃、またはＰＥＧを介する形質転換などによって再生した形質転換体）を、ＤＮＡ分析（ＰＣＲ）およびＧＵＳ染色する。
実施例７：安定な形質転換体の生成、ＴＨＣＡ合成酵素のサイレンシングの分析、ならびに代謝物分析および産業上の応用に最も適した系の選択
複数の形質転換したアサ植物を再生した後、ポリヌクレオチド分析を行い、遺伝子の組み込みを確認し、ＲＮＡの発現レベルを決定してもよい。さらに、ＴＨＣＡ合成酵素のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを決定してもよい。植物組織における１以上の生理活性代謝物（テルペンまたはカンナビノイドなど）の含量を決定してもよい。例えば、ＴＨＣ、ＣＢＤおよび／またはカンナビクロメンの１つまたはそれ以上の含量を、よく確立された手法（米国特許出願公開第20160139055号に記述される方法など、これはその全体が本明細書に取り込まれる）で決定してもよい。ＴＨＣＡ合成酵素の活性が減少した植物および、ＴＨＣ含量が減少し、かつ／またはＣＢＤ含量が増加した植物を、選択する。

Claims (22)

  1. アサ植物における１以上のカンナビノイドの含量を変化させる方法であって、アサ植物におけるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の活性を下方制御することを含む、方法。
  2. カンナビノイドの含量を変化させることが、アサ植物において、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）含量を減少させること、またはカンナビジオール（ＣＢＤ）含量を増加させること、を含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記下方制御が、植物に、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を抑制するのに有効なアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする選択されたＤＮＡを、導入することを含み、選択されたＤＮＡが、異種プロモーターに作動可能に連結している、請求項１記載の方法。
  4. 選択されたＤＮＡを含まない類似の遺伝子型のアサ植物と比較して、所望のＴＨＣ含量の減少、ＣＢＤ含量の増加、またはＴＨＣ含量の減少かつＣＢＤ含量の増加を伴う、アサ植物を選択することをさらに含む、請求項２記載の方法。
  5. 選択されたＤＮＡを導入することが、形質転換を含む、請求項３記載の方法。
  6. ｓｉＲＮＡが、
    （ａ）配列番号６１、６３、６４、６９、７１、７２、６８およびそれらの相補体からなる群から選択される配列と、少なくとも８５％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号６１、６３、６４、６９、７１、７２、６８およびそれらの相補体からなる群から選択される配列の、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド配列；または、
    （ｃ）ＴＨＣＡ合成酵素の、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列またはその相補体であって、ＴＨＣＡ合成酵素が、配列番号１〜４７からなる群から選択される配列と、少なくとも８５％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド配列、
    によってコードされている、請求項３記載の方法。
  7. アンチセンスＲＮＡが、
    （ａ）配列番号８１、またはそのフラグメントであって、ＴＨＣＡ合成酵素の発現を減少させることができるフラグメント、を含む、ポリヌクレオチド配列；または、
    （ｂ）配列番号８１の少なくとも２００個の連続するヌクレオチドと、少なくとも８５％同一である、ポリヌクレオチド配列；
    によってコードされており、選択されたＤＮＡの転写がＴＨＣＡ合成酵素の発現を抑制する、請求項３記載の方法。
  8. ＴＨＣＡ合成酵素の活性を下方制御することが、
    （ａ）アサ植物またはその細胞に、（ｉ）少なくとも１つの核局在シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ、または少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、および場合により、（ｉｉｉ）少なくとも１つのドナーポリヌクレオチド、を導入すること；および、
    （ｂ）アサ植物またはその細胞を、各ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを染色体配列における標的部位に誘導するように、培養し、そこでＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは標的部位に二本鎖切断を導入し、二本鎖切断は、染色体配列を改変するように、ＤＮＡ修復過程によって修復され、ここで標的部位がＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子に位置し、染色体の改変がＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子の転写および／または翻訳を妨げ、または阻害すること、
    を含む、請求項１記載の方法。
  9. ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム由来である、請求項８記載の方法。
  10. ＴＨＣＡ合成酵素の活性を下方制御することが、外来性遺伝物質を挿入せずに、天然に存在しないアサ植物またはその細胞を作成する、請求項８記載の方法。
  11. ＴＨＣＡ合成酵素の活性を下方制御することが、
    （ａ）アサ植物またはその細胞のＤＮＡ配列において、少なくとも１つのＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座を同定すること；
    （ｂ）少なくとも１つのＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座において、少なくとも１つのカスタムエンドヌクレアーゼ認識配列を同定すること；
    （ｃ）アサ植物またはその細胞に、少なくとも第一のカスタムエンドヌクレアーゼを導入し、ここでアサ植物またはその細胞が、カスタムエンドヌクレアーゼの認識配列を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座内またはその近位に含み、カスタムエンドヌクレアーゼが一過性または安定に発現されること；
    （ｄ）アサ植物またはその細胞を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座を構成するＤＮＡまたはそれに隣接するＤＮＡにおける、カスタムエンドヌクレアーゼを介する改変について、アッセイすること；および、
    （ｅ）アサ植物、その細胞またはその子孫細胞を、ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子座に改変を含むものとして同定すること、
    を含む、請求項１記載の方法。
  12. 請求項１記載の方法によって作成される、トランスジェニックアサ植物。
  13. 選択されたＤＮＡを含む、請求項１２記載のトランスジェニック植物の種子。
  14. デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）含量の減少、カンナビジオール（ＣＢＤ）含量の増加、またはＴＨＣ含量の減少かつＣＢＤ含量の増加を伴い、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）合成酵素の発現の減少を含む、アサ植物。
  15. ＴＨＣＡ合成酵素の発現を抑制するのに有効なアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする選択されたＤＮＡを含み、選択されたＤＮＡが異種プロモーターに作動可能に連結しており、ここでアサ植物が、選択されたＤＮＡを含まない類似の遺伝子型のアサ植物と比較して、ＴＨＣ含量の減少、ＣＢＤ含量の増加、またはＴＨＣ含量の減少かつＣＢＤ含量の増加を含む、請求項１４記載のアサ植物。
  16. 請求項１４記載のアサ植物の、種子、細胞、または一部。
  17. 請求項１４記載の植物由来の、アサ植物派生製品。
  18. 総重量で約１８％〜約６０％の濃度または総重量で約７％〜約３０％の濃度の、カンナビジオール酸およびカンナビジオールを含む、請求項１７記載のアサ植物派生製品。
  19. 総重量で約０％〜約３％の濃度の、デルタ−９−テトラヒドロカンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール酸を含む、請求項１７記載のアサ植物派生製品。
  20. アサの油、アサのチンキ、乾燥したアサの花および／または乾燥したアサの葉を含む、請求項１７記載のアサ植物派生製品。
  21. 吸入、経口摂取、舌下摂取または局所摂取に適合する、請求項１７記載のアサ植物派生製品。
  22. 医療用のアサの組成物を生成する方法であって、
    （ａ）請求項１４記載のアサ植物を得ること；
    （ｂ）アサ植物を植物成長条件下で成長させ、アサ植物から植物組織を生成させること；および、
    （ｃ）植物組織から医療用のアサの組成物を調製すること、
    を含む、方法。
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