MX2014000535A

MX2014000535A - Genes y proteinas para la sintesis de alcanoil-coa.

Info

Publication number: MX2014000535A
Application number: MX2014000535A
Authority: MX
Inventors: Jonathan E Page; Jason M Stout
Original assignee: Univ Saskatchewan
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2015-05-12
Also published as: EP2732037B1; WO2013006953A8; CA3130623A1; MX346923B; US20140141476A1; AU2012283708B2; CA2851316C; RU2014104668A; EP2732037A4; BR112014000735A2; WO2013006953A9; AU2012283708A2; RU2650766C2; ES2659526T3; KR20140108210A; NZ621037A; KR102031022B1; CL2014000096A1; US9546362B2; JP2014521311A

Abstract

Polipéptidos que tienen actividad alcanoil-CoA han sido identificados y caracterizados, como teniendo ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos. La expresión o sobre-expresión de los ácidos nucleicos altera los niveles de compuestos canabinoides en los organismos. Los polipéptidos pueden ser utilizados in vivo o in vitro para producir compuestos canabinoides.

Description

GENES Y PROTEÍNAS PARA SÍNTESIS DE ALCANOIL-COA Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana Serie No. U SSN 61 /507,331 presentada el 1 3 de j ulio del 201 1 , cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia. Cam po de la Invención La presente invención se refiere a moleculas de ácido nucleico y proteínas implicadas en la síntesis de tioésteres de alcanoil-CoA, y a los usos de las moléculas de ácido nucleico y proteínas para el diseño de la biosíntesis canabinoide en plantas, microorganismos o en sistemas libres de células, y para crear plantas canabis con contenido canabinoide incrementado o reducido.

Antecedentes de la Invención Cannabis sativa L. (canabis, hach ís, mariguana) es una de las plantas domésticas más antiguas y más versátiles, la cual tiene uso como fuente medicinal , alimenticia, cosmética y para productos industriales. También es bien conocida por su uso como un fármaco ilícito debido a su contenido de canabinoides psicoactivos (por ejemplo A9-tetrahidrocanabinol , A9-THC) . Los canabinoides y otros fármacos que actúan a través de los receptores canabinoides en los mamíferos, están siendo explorados por el tratamiento en diversas condiciones tales como dolor crónico , esclerosis múltiple y epilepsia.

Los canabinoides tienen sus orígenes biosinteticos tanto en el metabolismo de policétido como terpenoide y son denominados policétidos terpenofenólicos o prenilados (Page J . , Nagel J . (2006) Biosynthesis of terpenophenolics in hop and canabis (Biosíntesis de terpenofenólicos en lúpulo y canabis). In JT Romeo, ed , I nteq rative Plant Biochemistrv. Vol . 40. Elsevier, Oxford, pp 1 79-210) . La biosíntesis canabinoide ocurre en tricomas glandulares que cubren las flores femeninas en una alta densidad . Los canabinoides son formados a través de un proceso biosintético de tres pasos: formación de policétido, prenilación aromática y cielado (ver figura 1 ).

El primer paso enzimático en la biosíntesis canabinoide es la formación de ácido olivetólico mediante una enzima de sintasa de policétido que cataliza la condensación de hexanoil-coenzima A (CoA) con tres moléculas de malonil-CoA. Los canabinoides mayores, incluyendo ácido D9-tetrahidrocanabinólico y ácido canabidiólico, se forman a partir del precursor hexanoil-CoA, el cual es u n acil-CoA g raso de cadena media (ver figura 1 ). Otros canabinoides con cadenas laterales variantes se forman a partir de CoAs alifáticos de diferentes longitudes (por ejemplo, el ácido D9-tetrahidrocanabivarínico se forma a partir de un cebador n-butiril-CoA).

Hexanoil-CoA y otros tioésteres de acil-CoA en plantas son sintetizados mediante enzimas de activación de acilo (AAEs, tambien llamadas sintetasas de acil-CoA) que catalizan la activación de substratos de ácido carboxílico utilizando ATP. Estas enzimas actúan en una variedad de ácidos de carboxilato incluyendo ácidos g rasos de cadena corta , media , larga y muy larga, precursores de jasmonato, ácidos derivados de fenilpropanoide (por ejemplo, ácido cinámico) y otros ácidos orgánicos tales como malonato, acetato y citrato. M uy pocas sintetasas de acilo CoA de cadena media han sido previamente identificadas en la natu raleza. En plantas , tres enzimas procedentes de A. thaliana, AAE7, At4g05160 y At5g63380 han mostrado formar hexanoil-CoA a partir de hexanoato (Schneider K et al. (2005) . Un nuevo tipo de sintetasa de acilo peroxisomal-coenzima A de Arabidopsis thaliana, tiene la capacidad catalítica de activar precu rsores biosintéticos de ácido jasmónico. The 10urnal de Biologlcal Chemistry 280: 13962-72; Shockey J M , Fulda MS , Browse J (2003). Arabidopsis contains a large superfamily of acil-activating enzymes ( Arabidopsis contiene una superfamilia grande de enzimas de activación con acilo) . Phylogenetic and biochemical analysis reveáis a new class of acil-coenzyme a synthetases (El análisis filogenético y bioqu ímico , revela una nueva clase de acilo-coenzima en sintetasas). Plant Physiology 1 32 : 1065-76). Acil-CoA synthetases from Pseudomonas spp. have been shown to act on medium-chain fatty acids such as hexanoato (Las sintetasas de acil-CoA de seudomonas spp han demostrado actuar en ácidos g rasos de cadena media tal como hexanoato) (Fernandez-Valverde M, Reglero A, Martinez-Bianco H, Luengo JM ( 1993) . Purification of Pseudomonas putida acyl coenzyme A ligase active with a range de aliphatic and aromatic substrates (La pu rificación de la ligase de coenzima A de acilo de Pseudomonas putida se activa con u n rango de substratos alifáticos y aromáticos). Applied Environmental Microbiology 59: 1 149-1 154).

Los canabinoides son productos naturales valiosos. Los genes que codifican enzimas implicadas en biosíntesis canabinoides serán útiles en el diseño metabólico de canabis para prod ucir plantas que contienen muy bajos niveles, o niveles en cero de THCA y otros canabinoides a traves de mutagénesis dirigida (por ejemplo, TI LLI NG) u otras téenicas de eliminación de gen . Dichos genes también pueden probar utilidad para la creación , mediante selección asistida por marcador, de variedades de canabis específicas para la producción de farmacéuticos de base canabinoide, o para reconstituir la biosíntesis canabinoide en organismos heterólogos tales como bacteria o levad ura o para producir canabinoides en sistemas libres de células que utilizan proteínas recombinantes.

Los genes que codifican las enzimas de la biosíntesis canabinoide también pueden ser útiles en la síntesis de análogos canabinoides y la síntesis de análogos de precursores canabinoides. Los análogos canabinoides han sido sintetizados previamente y pueden ser útiles como productos farmaceuticos .

Existe aú n la necesidad en la téenica de identificar enzimas, y secuencias de nucleótidos que codifican dichas enzimas, que estén implicados en la síntesis de policétidos aromáticos.

Breve Descripción de la Invención Se han descubierto actualmente dos genes novedosos de canabis que codifican las sintetasas de alcanoil-CoA antes no conocidas. Estas dos nuevas sintetasas de alcanoil Co-A son referidas en la presente invención como sintetasa 1 de hexanoil-CoA de Cannabis sativa (CsHCS I ) y sintetasa 2 de hexanoil-CoA Cannabis sativa (CsHCS2) .

Por lo tanto, en un primer aspecto de la presente invención , se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado o pu rificada que comprende una secuencia de n ucleótido que tiene al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ I D NO : 1 , o una secuencia de degeneración de codón de la misma .

En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado o pu rificada q ue comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ I D NO : 3, o una secuencia de degeneración de codón de la misma.

En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipeptido aislado o purificado q ue comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ I D NO : 2, o u na secuencia de aminoácido conservadoramente sustituida de la misma .

En un cuarto aspecto de la presente invención , se proporciona un polipéptido aislado o pu rificado que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ I D NO : 4, o una secuencia de aminoácido conservadoramente sustituida de la misma .

En u n qumto aspecto de la presente invención , se proporciona un vector, construcción o sistema de expresión que comprende u na molécula de ácido nucleico de la presente invención .

En un sexto aspecto de la presente invención , se proporciona una célula h uésped transformada con u na molécu la de ácido n ucleico de la presente invención .

En un séptimo aspecto de la presente invención , se proporciona un proceso para sintetizar un alcanoil-CoA en presencia de una enzima de la presente invención.

En un octavo aspecto de la presente invención , se proporciona u n proceso para alterar los niveles de compuestos canabinoides en un organismo, célula o tejido, en donde el proceso comprende el uso de una molécula de ácido nucleico de la presente invención , o u na parte de la misma, para silenciar en el organismo, celula o tejido un gen que codifica una enzima q ue cataliza la síntesis de un alcanoil-CoA.

En un noveno aspecto de la presente invención , se proporciona un proceso para alterar los niveles de compuestos canabinoides en u n organismo, célula o tejido , en donde el proceso comprende mutar genes en el organismo, célula o tejido, y utilizar una molécula de ácido nucleico de la presente invención para seleccionar organismos , células o tejidos que contienen mutantes o variantes de un gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de un alcanoil-CoA.

En un décimo aspecto de la presente invención , se proporciona un proceso para alterar los niveles de compuestos canabinoides en un organismo, célula o tejido, en donde el proceso comprende expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico de la presente invención en el organismo, célula o tejido en comparación con una variedad similar del organismo, célula o tejido crecidos bajo cond iciones similares pero sin expresar o sobreexpresar la molécula de ácido n ucleico.

En un onceavo aspecto de la presente invención , se proporciona un proceso para alterar los niveles de compuestos canabinoides en un organismo, célula o tejido que comprende expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico q ue codifica un polipéptido de la presente invención en el organismo, célula o tejido en comparación con u na variedad similar del organismo, célula o tejido crecidos bajo condiciones similares pero sin expresar o sobreexpresar la molecula de ácido nucleico.

En un doceavo aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para sintetizar un compuesto canabinoide de origen natural o un análogo q ue no es de origen natural de un compuesto canabinoide en un organismo, célula o tejido, en donde el proceso comprende expresar una molécula de ácido nucleico de la presente invención en el organismo, célula o tej ido en la presencia de u n ácido carboxílico y CoA.

En un décimo tercer aspecto de la presente invención , se proporciona un proceso para sintetizar un alcanoil-CoA en u na reacción libre de células irt vitro, en donde el proceso comprende: hacer reaccionar u n ácido carboxílico con la presencia de la coenzima A de u na enzima de la presente invención .

Los polipéptidos que son enzimas que catalizan la síntesis de alcanoil-CoA, y las secuencias de nucleótido que codifica dichas enzimas, han sido identificados y caracterizados. Las secuencias de nucleótido se pueden utilizar para crear, a través de reproducción, selección o diseño genético, plantas de canabis que sobreproducen o su bprod ucen compuestos canabinoides, análogos de compuestos canabinoides o mezclas de los mismos. Estas secuencias de nucleótido también se pueden utilizar, solas o en combinación con genes que codifican otros pasos en las trayectorias de síntesis canabinoide, para g diseñar biosíntesis canabinoide en otras plantas o en microorganismos (por ejemplo, levadura, bacteria, hongo) u otros organismos procarióticos o eucarióticos o en sistemas libres de celulas. Además, el bloq ueo o la reducción de la expresión de estos genes en canabis puede ser utilizado para bloquear la biosíntesis canabinoide y de esta forma reducir la producción de canabinoides.

Las características adicionales de la presente invención, serán descritas o podrán ser apreciadas en el enrso de la siguiente descripción detallada.

Breve Descripción de las Figuras Con el objeto de que la presente invención pueda ser más claramente comprendida, a continuación se describirán las modalidades de las mismas con detalle a manera de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos, los cuales: La figu ra 1 , ilustra la trayectoria propuesta que conduce a los tipos canabinoides principales en Cannabis sativa. Abreviaturas: la sintetasa THCA es una sintetasa de ácido D9-tetrahidrocanabinólico; la sintasa CBDA es sintasa de ácido canabidiólico; la sintasa C BCA es sintasa de ácido canabicroménico.

Las fig uras 2A a 2F ¡lustran análisis de espectrometría de masa-cromatografía l íquida/espectrometría de masa (LC-MS/MS) de la actividad enzimática de las sintasas de hexanoil-CoA de Cannabis sativa. Cada una de las fig u ras de la 2A a 2F muestran la abundancia de iones (m/z 866>359) en el eje vertical, y el tiempo (minutos) en el eje horizontal . La figura 2A y 2B ilustran el tiempo de retención de u n estándar de hexanoil-CoA autentico. La figura 2C ilustra un ensayo de la proteína CsHCS I , CoA, MgC I2 hexanoato de sodio, ATP , y amortiguador de HEPES, en donde se produjo y se detectó el hexanoil-CoA. La figura 2D ilustra un ensayo de la proteína CsHCS2 , CoA, MgCI2, hexanoato de sodio, ATP, y amortiguador de H EPES, en donde se produjo el hexanoil-CoA. La fig u ra 2E ilustra un ensayo en el cual la proteína CsHCSI ha sido previamente desactivada hirviendo a una temperatu ra de 95°C d urante 15 minutos, CoA, hexanoato de sodio, ATP, y amortiguador de HEPES, en donde no se produjo el hexanoil-CoA. La figura 2F ilustra un ensayo en donde la proteína CsHCS2 ha sido desactivada previamente hirviendo a u na temperatura de 95°C d urante 1 5 minutos, CoA, hexanoato de sodio, ATP, y amortiguador de H EPES, en donde no se produjo el hexanoil-CoA.

La fig ura 3 , ilustra dos gráficas que ilustran substratos de ácido carboxílico utilizados por las enzimas de la presente invención . La figura 3A, ilustra substratos de ácido carboxílico utilizados por CsHCSI . La figu ra 3B ilustra substratos de ácido carboxílico utilizados por CsHCS2.

La figu ra 4, ilustra u n análisis de cromatografía líquida de alto desempeño de los productos producidos a través de un ensayo enzimático acoplado que consiste en la sintetasa CsHCS2 hexanoil-CoA de Cannabis sativa , sintetasa de malonil-CoA (MCS) , sintasa “de olivetol/sintasa de policetido” de Cannabis sativa, y sintasa de ácido olivetólico de Cannabis sativa. Los compuestos eluidos fueron detectados mediante absorbancia en 263 nm e identificados teniendo tanto los mismos tiempos de retención como estándares aislados, como su masa, utilizando u n detector de masa de cuadrupolo simple. La detección de olivetol y ácido olivetólico indica q ue CsHCS2 tiene la capacidad de proporcionar suficiente substrato de hexanoil-CoA para la síntesis de ácido olivetólico. Los ensayos que carecen de CsHCS2, CoA, o hexanoato, no produjeron productos de policétido. HTAL = lactona hexanoiltriacética, PDAL = lactona pentildiacética , OA = ácido olivetólico, OL = olivetol .

La figura 5 , ilustra una gráfica q ue muestra la producción de ácido olivetólico en células de levadu ra diseñadas para prod ucir ácido olivetólico utilizando CsHCS I y CsHCS2 para sintetizar hexanoil-CoA, y una fusión de canabis “sintasa de olivetor/sintasa de policétido (PKS) y sintasa de ácido olivetólico (OAS) para formar ácido olivetólico.

La figu ra 6, el análisis q RT-PC R de la expresión de sintasa CsHCS I , CsHCS2 y CBDA en diferentes tejidos del cultivo de hach ís de “Finóla”. Los valores de expresión de gen relativos a la actina, se trazaron como diferencias en multiplicación en comparación con hojas, con una expresión de hoja a la que se le asig nó un valor de 1 . Los insertos ilustran la expresión de gen en flores femeninas con y sin tricromos con los valores tambien indicados como d iferencias en multiplicación en comparación con hojas. R, raíces; S, tallos; L, hojas; FF + , flores femen inas con tricomas ; FF-, flores femeninas con tricomas eliminados mediante el método de Beadbeater; T, tricomas; MF, flor masculina. Los valores son promedio son ± SD , n = 3.

Descripción Detallada de la Invención Se secuenció una biblioteca de cADN específico de tricoma de canabis deom para prod ucir 9157 etiquetas de secuencia express (“ESTs”) q ue se ensamblaron en secuencias únicas 41 13 (1 227 contigs, 2886 singletones) . Se anotaron los u nigenes mediante comparación con la base de datos de la proteína UniProt™ utilizado la búsqueda en l ínea y la herramienta de comparación llamada blastx. Se identificaron proteínas de enzima que activan acilo de Can nabis med iante el uso de la secuencia de enzima de activación de acilo de Arabidopsis para consultar los ESTs de canabis ensamblados utilizando la búsqueda en línea y la herramienta de comparación llamada tblastn . Se identificaron once enzimas de activación de acilo y se nombraron de acuerdo con su abundancia de transcripción en la biblioteca de cADN . CsHCSI fue la enzima de activación de acilo más abu ndante con base en los niveles de transcripción (42 ESTs) ; CsHCS2 tuvo menor abundancia (5 ESTs) con base en sus niveles de transcripción en tricromas y la localización de CsHCS I para el citoplasma, es probable q ue esta enzima sea la enzima de activación de acilo implicada en suministrar hexanoil-CoA a la trayectoria canabinoide. CsHCS2 , que se localiza en el peroxisoma, es probable que no este implicada en la formación canabinoide. Sin embargo, sus propiedades cinéticas la hacen una enzima útil para sintetizar hexanoil-CoA en huéspedes heterólogos o en sistemas libres de células.

La secuencia del gen CsHCS I es como se indica: Cannabis sativa CsHCS I - 2163 pb (SEQ I D N O: 1 ) ATGGGT AAG AATT ACAAGT CCCT GGACT CTGTTGT GGCCTCT G ACTT CAT AG CCCT A GGTAT CACCT CT G AAGTT GCT GAG ACACTCCATGGT AGACTGGCCGAG AT CGT GTG T AATT ATGGCGCT GCCACT CCCCAAACAT GG AT CAAT ATT GCCAACC AT ATT CT GTCG CCT GACCT CCCCTT CT CCCT GCACCAG ATGCT CTT CT AT GGTT GCT AT AAAG ACTTT G G ACCT GCCCCT CCT GCTTGGAT ACCCGACCCGG AG AAAGT AAAGT CCACCAAT CT G GGCGCACTTTTGGAGAAGCGAGGAAAAGAGTTTTTGGGAGTCAAGTATAAGGATCC CATTT CAAGCTTTT CTCATTT CCAAG AATTTT CTGT AAG AAACCCT GAGGT GT ATTGG AG AACAGTACT AATGGAT G AG AT G AAG AT AAGTTTTT CAAAGG AT CCAGAAT GT AT AT T GCGT AG AGAT G AT ATT AAT AAT CCAGGGGGT AGT G AAT GGCTT CCAGG AGGTTAT C TT AACT CAGCAAAG AATTGCTT G AAT GT AAATAGT AACAAGAAATT GAAT GAT ACAAT GATTGTATGGCGTGATGAAGGAAATGATGATTTGCCTCTAAACAAATTGACACTTGAC CAATTGCGTAAACGT GTTTGGTT AGTTGGTT ATGCACTT GAAGAAATGGGTTTGGAG AAGGGTTGTGCAATTGCAATTGATATGCCAATGCATGTGGATGCTGTGGTTATCTAT CTAGCTATTGTTCTTGCGGGATATGTAGTTGTTTCTATTGCTGATAGTTTTTCTGCTC CTGAAAT ATCAACAAGACTT CGACT AT CAAAAGCAAAAGCCATTTTTACACAGGAT CA TATTATTCGTGGGAAGAAGCGTATTCCCTTATACAGTAGAGTTGTGGAAGCCAAGTC T CCCAT GGCCATT GTT ATTCCTT GT AGT GGCTCT AAT ATT GGTGCAG AATTGCGT G AT GGCGAT ATTTCTT GGGATT ACTTT CT AGAAAGAGCAAAAGAGTTTAAAAATT GTGAAT TT ACT GCT AG AG AACAACCAGTT G ATGCCT ATACAAACAT CCT CTT CT CATCT GG AAC AACAGGGGAGCCAAAGGCAATTCCATGGACTCAAGCAACTCCTTTAAAAGCAGCTG CAGATGGGTGGAGCCATTTGGACATTAGGAAAGGTGATGTCATTGTTTGGCCCACTA ATCTTGGTTGGATGATGGGTCCTTGGCTGGTCTATGCTTCACTCCTTAATGGGGCTT CTATTGCCTTGTATAATGGATCACCACTTGTTTCTGGCTTTGCCAAATTTGTGCAGGA T GCT AAAGT AACAATGCTAGGTGTGGTCCCTAGT ATTGTT CGAT CATGGAAAAGTAC CAATTGTGTTAGTGGCTATGATTGGTCCACCATCCGTTGCTTTTCCTCTTCTGGTGAA GCATCTAATGTAGATGAATACCTATGGTTGATGGGGAGAGCAAACTACAAGCCTGTT ATCGAAATGTGTGGTGGCACAGAAATTGGTGGTGCATTTTCTGCTGGCTCTTTCTTA CAAGCT CAAT CATT AT CTT CATTT AGTT CACAAT GTAT GGGTTGCACTTT AT ACAT ACT T G ACAAG AAT GGTT AT CCAAT G CCT AAAAAC AAACCAGG AATT GGT G AATT AG CG CT TGGTCCAGTCATGTTTGGAGCATCGAAGACTCTGTTGAATGGTAATCACCATGATGT TTATTTTAAGGGAATGCCTACATTGAATGGAGAGGTTTTAAGGAGGCATGGGGACAT TTTT G AG CTT AC AT CT AAT GGTT ATT AT C AT G C AC ATG GT CGT G CAG AT G ATACAAT G AAT ATT GG AGGCAT CAAGATT AGTTCCATAGAGATT GAACGAGTTTGTAATGAAGTT G ATGACAGAGTTTTCGAGACAACTGCTATTGGAGTGCCACCTTTGGGCGGTGGACCT G AG C AATT AGT AATTTT CTTT GT ATT AAAAG ATT CAAAT G AT AC AACT ATT G ACTT AAA T C AATT G AGGTT AT CTTT C AACTT GG GTTT ACAG AAG AAACT AAAT CCTCTGTT CAAG GT C ACT CGT GTT GTG CCT CTTT CAT CACTT CCG AG AAC AG CAACCAAC AAG AT CAT G AGAAGGGTTTTGCGCCAGCAATTTTCTCACTTTGAATGA La secuencia del GEN CsHCS2 es como se indica a contin uación : Cannabis sativa CsHCS2 - 1547 pb (S EQ I D NO : 3) AT G G AG AAAT CTTTTT C AG AAACT CAT CTT CAT ACCC ACAAAAG CCAG CT CT CATT G A TT CCGAAACCAACCAAAT ACT CT CCTTTTCCCACTT CAAAT CT ACGGTTAT CAAGGT C T CCCAT GGCTTT CT CAATCT GGGT AT CAAGAAAAACG ACGTCGTT CT CAT CT ACGCC CCT AATT CT AT CCACTT CCCT GTTT GTTTCCTGGGAATT AT AGCCT CT GGAGCCATTG CCACTACCT CAAAT CCT CT CT ACACAGTTT CCGAGCTTT CCAAACAGGT CAAGG ATT C CAAT CCCAAACT CATT AT CACCGTT CCT CAACT CTT GG AAAAAGTAAAG GGTTT CAAT CT CCCCACG ATT CT AATT G GTCCT G ATT CT G AACAAG AAT CTT CT AGT GAT AAAGT AA TGACCTTTAACGATTTGGTCAACTTAGGTGGGTCGTCTGGCTCAGAATTTCCAATTGT T G AT G ATTTT AAGCAG AGT GACACT GCTGCGCT ATT GT ACT CAT CT GGCACAACGGG AAT G AGT AAAGGT GT GGTTTT G ACT CACAAAAACTT CATTG CCT CTT CTTT AAT GGTG ACAAT GGAGCAAGACCT AGTT GGAG AGAT GG AT AAT GT GTTT CT ATGCTTTTT GCCA ATGTTTCATGTATTTGGTTTGGCTATCATCACCTATGCTCAGTTGCAGAGAGGAAACA CTGTT ATTT C AAT GG CG AG ATTT G ACCTT G AG AAG AT GTT AAAAG AT GT G G AAAAGT A TAAAGTTACCCATTTGTGGGTTGTGCCTCCTGTGATACTGGCTCTGAGTAAGAACAG TATGGTGAAGAAGTTTAATCTTTCTTCTATAAAGTATATTGGCTCCGGTGCAGCTCCT TTGGGCAAAGATTT AATGG AGG AGTGCT CT AAGGTT GTT CCTT AT GGT ATT GTTGCT C AGGGATATGGTATGACAGAAACTTGTGGGATTGTATCCATGGAGGATATAAGAGGAG GTAAACGAAATAGTGGTTCAGCTGGAATGCTGGCATCTGGAGTAGAAGCCCAGATA GTT AGT GT AGAT ACACT G AAGCCCTT ACCT CCT AATCAATTGGGGG AG AT ATGGGTG AAGGGGCCTAATATGATGCAAGGTTACTTCAATAACCCACAGGCAACCAAGTTGACT ATAGATAAGAAAGGTTGGGTACATACTGGTGATCTTGGATATTTTGATGAAGATGGA CAT CTTT AT GTT GTT G ACCGT AT AAAAG AGCTCAT CAAAT ATAAAGGATTT CAGGTT G CT CCT GCT GAG CTT GAAGG ATT GCTT GTTT CT CACCCT G AAATACTCG ATGCT GTTGT GATTCCATTTCCTGACGCTGAAGCGGGTGAAGTCCCAGTTGCTTATGTTGTGCGCTC T CCCAACAGTT CATTAACCG AAAAT G AT GT G AAG AAATTT AT CGCGGGCCAGGTTGC AT CTTT C AAAAG ATT GAG AAAAGT AAC ATTT AT AAAC AGT GTCCCG AAAT CT GCTT CG GGG AAAAT CCT CAG AAG AG AACT CATT CAGAAAGTACGCT CCAACAT GT G A CsHCS I y CsHCS2 fueron amplificadas mediante PCR como se describe en el Ejemplo 1 y se midió la sintetasa de alcanoil-CoA o la actividad de CoA-ligasa tal como se describe en el Ejemplo 2. Tal como se muestra en la fig u ra 2 , CsHCS I y CsHCS2 catalizan la producción de alcanoil-CoA de un ácido carboxílico y CoA.

Algu nas modalidades de la presente invención se refieren a una molecula de ácido nucleico aislada o purificada que tiene la SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos el 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

Algunas modalidades de la presente invención se refieren a una molecula de ácido nucleico aislado o purificada que tiene la SEQ ID NO: 3 o que tiene al menos el 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la SEQ ID NO: 3.

Se incluyen además moléculas de ácido nucleico que hibridan para las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente. Las condiciones de hibridación pueden ser rigurosas ya que la hibridación ocurrirá si existe al menos un 90%, 95% o 97% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que codifica la enzima de la presente invención. Las condiciones rigurosas pueden incluir las utilizadas para hibridaciones Southern conocidas tales como, por ejemplo, incubación durante la noche a u na temperatura de 42°C en una solución que tiene el 50% de formamida, 5x SSC ( 150 mM de NaCI , 15 mM de citrato trisódico) , 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5x de solución de Den hardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 microg ramos/mililitro de AD N de esperma de salmón esquilado, desnaturalizado, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0.1 x SSC a una temperatura de aproximadamente 65°C. Otras condiciones de hibridación son bien conocidas y se describen en la Publicación de Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Tercera Edición , Coid Spring Harbor, N .Y. (2001 ) .

Tal como lo pod rán apreciar los expertos en la teenica , los cambios ligeros en la secuencia de ácido nucleico, no alteran necesariamente la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado. Los expertos en la técnica podrán apreciar que los cambios en las identidades de n ucleótidos de u na secuencia de gen específica que cambian la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado, pueden dar como resultado la efectividad reducida o incrementada de los genes y que, en algunas aplicaciones (por ejemplo, antisentido, cosupresión , o ARN i) , las secuencias parciales con frecuencia ofrecen una operación tan efectiva como las versiones de longitud total. Las formas en las cuales puede variar o acortarse la secuencia de nucleótidos, son bien conocidas por los expertos en las teenicas, ya que son formas de probar la efectividad de los genes alterados . En ciertas modalidades, la efectividad puede ser fácilmente probada , por ejemplo, mediante cromatografía de gas convencional . Dichas variaciones de los genes por consiguiente se incluyen como parte de la presente descripción.

Tal como lo apreciará u n experto en la técnica, la longitud de la molécu la de ácido nucleico descrita anteriormente, dependerá de su uso proyectado. Por ejemplo , si el uso proyectado es como un cebador o sonda, por ejemplo, para la amplificación med iante PC R o para clasificación de una biblioteca, la longitud de la molécula de ácido nucleico será menor a la secuencia de longitud de total , por ejemplo, 15 a 50 nucleótidos. En estas modalidades, los cebadores o sondas pueden ser sustancialmente idénticos a la región altamente conservada de la secuencia de ácido n ucleico pueden ser sustancialmente idénticos ya sea al extremo 5’ o 3’ de la secuencia de ADN . En algu nos casos , estos cebadores o sondas pueden utilizar bases u niversales en las algunas posiciones , como para ser “sustancialmente idénticos”, pero aún proporcionar flexibilidad en el reconocimiento de secuencia. Es de observarse que las condiciones de hibridación de cebador y sonda adecuada, son bien conocidas en la técnica.

La presente invención también i ncluye la enzima CsHCSI . La secuencia de aminoácido de CsHCSI (SEQ I D NO : 2) es: MGKNYKSLDSWASDFIALGITSEVAETLHGRLAEIVCNYGAATPQTWINIANHILSPDLPF SLHQMLFYGCYKDFGPAPPAWIPDPEKVKSTNLGALLEKRGKEFLGVKYKDPISSFSHF QEFSVRNPEVYWRTVLMDEMKISFSKDPECILRRDDINNPGGSEWLPGGYLNSAKNCL NVNSNKKLNDTMIVWRDEGNDDLPLNKLTLDQLRKRVWLVGYALEEMGLEKGCAIAIDM PMHVDAWIYLAIVLAGYWVSIADSFSAPEISTRLRLSKAKAIFTQDHIIRGKKRIPLYSRV VEAKSPMAIVIPCSGSNIGAELRDGDISWDYFLERAKEFKNCEFTAREQPVDAYTNILFSS GTTGEPKAIPWTQATPLKAAADGWSHLDIRKGDVIVWPTNLGWMMGPWLVYASLLNGA SIALYNGSPLVSGFAKFVQDAKVT LGWPSIVRSWKSTNCVSGYDWSTIRCFSSSGEA SNVDEYLWLMGRANYKPVIEMCGGTEIGGAFSAGSFLQAQSLSSFSSQCMGCTLYILDK NGYPMPKNKPGIGELALGPVMFGASKTLLNGNHHDVYFKGMPTLNGEVLRRHGDIFELT SNGYYHAHGRADDTMNIGGIKISSIEIERVCNEVDDRVFETTAIGVPPLGGGPEQLVIFFV LKDSNDTTIDLNQLRLSFNLGLQKKLNPLFKVTRWPLSSLPRTATNKIMRRVLRQFSHFE Algunas modalidades se refieren a un polipeptido aislado o pu rificado que tiene la SEQ I D NO. 2 o que tiene al menos 85%, al menos 86% , al menos 87% , al menos 88% , al menos 89% , al menos 90% , al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% , al menos 95%, al menos 96% , al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácido tal como se establece en la SEQ I D NO: 2.

La presente invención también incluye la enzima CsHCS2. La secuencia de aminoácido de CsHCS2 (SEQ I D NO : 4) es: MEKSGYGRDGIYRSLRPPLHLPNNNNLSMVSFLFRNSSSYPQKPALIDSETNQILSFSHF KSTVIKVSHGFLNLGIKKNDWLIYAPNSIHFPVCFLGIIASGAIATTSNPLYTVSELSKQVK DSNPKLIITVPQLLEKVKGFNLPTILIGPDSEQESSSDKVMTFNDLVNLGGSSGSEFPIVD DFKQSDTAALLYSSGTTGMSKGWLTHKNFIASSLMVT EQDLVGEMDNVFLCFLPMFH VFGLAIITYAQLQRGNTVISMARFDLEKMLKDVEKYKVTHLWWPPVILALSKNSMVKKFN LSSIKYIGSGAAPLGKDLMEECSKWPYGIVAQGYGMTETCGIVSMEDIRGGKRNSGSA GMLASGVEAQIVSVDTLKPLPPNQLGEIWVKGPNMMQGYFNNPQATKLTIDKKGWVHT GDLGYFDEDGHLYWDRIKELIKYKGFQVAPAELEGLLVSHPEILDAWIPFPDAEAGEVP VAYWRSPNSSLTENDVKKFIAGQVASFKRLRKVTFINSVPKSASGKILRRELIQKVRSNM Algunas modalidades se re fieren a un polipéptido aislado o pu rificado que tiene la SEQ I D NO . 4 o que tiene al menos el 85% , al menos 86% , al menos 87% , al menos 88% , al menos 89% , al menos 90% , al menos 91 % , al menos 92% , al menos 93% , al menos 94% , al menos 95% , al menos 96% , al menos 97% , al menos 98% o al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácido tal como se establece en la SEQ I D NO: 4.

Algunas modalidades se refieren a u n vector, construcción o sistema de expresión que contiene un polinucleótido aislado o purificado que tiene la secuencia de SEQ I D NO : 1 o SEQ I D NO: 3, o al menos el 75% , al menos 76%, al menos 77%, al menos 78% , al menos 79% , al menos 80% , al menos 81 %, al menos 82% , al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86% , al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90% , al menos 91 % , al menos 92% , al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la SEQ I D NO: 1 o SEQ I D NO : 3. También , se proporciona u n método para preparar un vector, construcción o sistema de expresión que incluye una secuencia, o una parte de la misma , para la introducción de la secuencia o secuencia parcial en una orientación de sentido o antisentido o un complemento de la misma, en una célu la .

En alg u nas modalidades, las moléculas de ácido nucleico aisladas y/o purificadas, o los vectores, construcciones o sistemas de expresión que comprenden estas moléculas de ácido nucleico aisladas y/o purificadas, se pueden utilizar para que organismos transgénicos o células de organismos que producen polipéptidos que catalizan la síntesis de policétidos aromáticos. Por consig uiente, una modalidad se refiere a organismos transgenicos, células o tejidos de germen del organismo q ue comprende una molécula de ácido n ucleico aislada y/o purificada que tiene la SEQ I D NO : 1 o SEQ I D NO: 3 o que tiene al menos el 75% , al menos 76% , al menos 77% , al menos 78% , al menos 79% , al menos 80% , al menos 81 %, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86% , al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91 % , al menos 92% , al menos 93% , al menos 94% , al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la SEQ I D NO: 1 o SEQ I D NO: 3.

Preferentemente, el organismo es una planta, microorganismo o insecto. Las plantas son preferentemente del género de Cannabis, por ejemplo Cannabis sativa L, Cannabis indica Lam . y Cannabis ruderalis Janisch. Especialmente preferida es Cannabis sativa. Los microorganismos son preferentemente bacterias (por ejemplo, Escherichia coli) o levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae). El insecto es preferentemente Spodoptera frugiperda.

Los organismos, células y tejidos de germen de esta modalidad pueden tener niveles alterados de compuestos canabinoides. Con referencia a la fig u ra 1 , un experto en la téenica pod rá apreciar que la expresión o sobre-expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención , dará como resultado la expresión o sobre-expresión de la enzima que cataliza la síntesis de hexanoil-CoA, que, en combinación con otras enzimas puede dar como resultado la producción o producción incrementada de compuestos canabinoides tales como ácido canabigerólico (CBGA) , ácido D9-tetrahidrocanabinólico (THCA), ácido canabidiólico (CBDA), ácido canabicromenico (CBCA) , A9-tetrahid rocanabinol (THC), canabidiol (CBD), canabicromeno (C BC) , etc. En forma similar, dependiendo del substrato utilizado, la expresión o sobre expresión de las moléculas de ácido n ucleico de la presente invención , da como resultado la expresión o sobre-expresión de la enzima que cataliza la síntesis de hexanoil-CoA que puede dar como resultado la prod ucción o producción incrementada de análogos de compuestos canabinoides, o análogos o precursores de dichos compuestos .

La silenciación en el gen en el organismo, célula o tejido da como resultado la subexpresión de la enzima que puede dar como resultado la acumulación de precursores tal como ácido hexanoico (seis carbonos), ácido octanoico (ocho carbonos), ácido nonanoico (nueve carbonos) , ácido valérico (cinco carbonos) , ácido heptanoico (siete carbonos) u otros ácidos carboxílicos, y/o la reducción de los canabinoides tales como THCA (el precursor de THC) o CBDA (el precursor de CBD).

La presente invención incluye un proceso para alterar n iveles de compuestos canabinoides en un organismo, célula o tejido mediante la expresión o sobre-expresión de una enzima exógena de la presente invención en el organismo, celula o tejido, en comparación con una variedad similar del organismo, célula o tejido crecido bajo condiciones similares pero sin una enzima exógena de la presente invención siendo expresada o sobreexpresada.

La expresión o sobre-expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención puede realizarse en combinación con la expresión o sobre-expresión de uno o más de otros ácidos nucleicos que codifican una o más enzimas en una trayectoria biosintética canabinoide. Algu nos ejemplos de otros ácidos nucleicos incluyen los que codifican : una sintasa de policétido tipo I I I , una cielasa de policétido, una feniltransferasa aromática y una oxidociclasa que forma canabinoide. Los ejemplos específicos de estas enzimas incluyen “sintasa de oliveto /sintasa de policétido, sintasa de ácido olivetólico, geranilpirofosfato: geraniltransferasa de olivetolato, una sintasa de ácido A9-tetrahid rocanabinólico, u na sintasa de ácido canabidiólico o una sintasa de ácido canabicroménico. La síntesis de alcanoil-CoA en la presencia de un polipéptido de enzima de la presente invención , puede lograrse in vivo o in vitro. Tal como se mencionó anteriormente, dicha síntesis in vivo puede lograrse mediante la expresión o sobre-expresión de la molécula de ácido nucleico de la presente invención en un organismo, célula o tejido.

La síntesis de alcanoil-CoA ¡n vitro puede tener lugar en u n sistema libre de celulas. Como parte de un sistema libre de células in vitro, el ácido carboxflico y una enzima de la presente invención pueden mezclarse juntas en un envase de reacción adecuado para llevar a cabo la reacción .

In vitro, los polipéptidos de la presente invención pueden ser utilizados en combinación con otras enzimas para efectuar una síntesis completa de un compuesto canabi noide de un precursor. Por ejemplo, dichas otras enzimas puede estar implicadas en una trayectoria biosintética canabinoide tal como se describe en la figura 1 (tal como “sintasa de olivetor/PKS, sintasa de ácido olivetólico, preniltransferasa aromática, sintasa THCA, sintasa CBDA, sintasa CBCA).

Los polipéptidos de la presente invención , se pueden utilizar, in vivo o in vitro, para sintetizar análogos de compuestos canabínoides que no son de origen natural en especies huésped . Dichos análogos se pueden producir utilizando compuestos de ácido carboxílico además de los utilizados para producir compuestos canabínoides en plantas. Por ejemplo, ácido acético, ácido butírico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido laú rico, ácido mirístico, ácido palmítico; ácidos de cadena ramificada tales como ácido esovalérico; y ácidos hid roxicinámicos tales como ácido cinámico.

Términos: Con el objeto de facilitar la revisión de diversa modalidades de la presente descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de terminos específicos: Alcanoil-CoA: U n alcanoil-CoA es u n compuesto de carbonilo alifático que tiene u na porción de coenzima A enlazada al átomo de carbono del grupo carbonilo a través de un puente de sulfuro. Los compuestos de alcanoil-CoA preferidos comprenden de 2 a 1 0 átomos de carbono en la parte de carbonilo alifática del compuesto. Más preferentemente, el alcanoil-CoA es CoA-S-C(O)-(C H2)n-C H3, en donde n es un entero de 0 a 8. Algunos ejemplos de compuestos de alcanoil-CoA son acetil-CoA, butiril-CoA, hexanoil-CoA y octanoil-CoA. El uso de acetil-CoA proporciona una cadena lateral de metilo para el policétido aromático resultante; el uso de un butiril-CoA proporciona una cadena lateral de propilo; y el uso de un hexanoil-CoA proporciona una cadena lateral de pentilo. Hexanoil-CoA es especialmente preferido. Existen canabinoides con cadenas laterales más cortas en canabis (por ejemplo, ácido tetrahidrocanabivarínico que tiene una cadena lateral de propil en lugar de u na cadena lateral de pentilo de THCA).

Degeneración de codón : se podrá apreciar q ue la presente descripción abarca el uso de degeneración del uso de codón, tal como lo pueden apreciar los expertos en la téenica y tal como se ilustra en la Tabla 1 .

Tabla 1 . Degeneraciones de Codón Secuencia de nucleótido complementario: Queda entendido que una “Secuencia de nucleótido complementaria” de una secuencia significa cualquier molecula de ácido nucleico cuyos nucleótidos sean complementarios para los de una secuencia aq uí descritas, y cuya orientación sea invertida (secuencia antiparalela) .

Sustituciones conservadoras: Los expertos en la teenica podrán apreciar que se pueden realizar sustituciones conservadoras en la secuencia de aminoácido de u n polipéptido sin interrumpir la estructura tridimensional o función del polipéptido. Por consiguiente, la presente invención incluye polipéptidos que comprenden CsHCS I y CsHCS2 sustituidos en forma conservadora. Las sustituciones conservadoras son log radas por los expertos en la técnica, sustituyendo aminoácidos con hid rofobicidad , polaridad y long itud de cadena R similares a las de otros. Además, al comparar las secuencias alineadas de las proteínas homologas de diferentes especies, se pueden identificar sustituciones conservadoras localizando residuos de aminoácido que han sido mutados entre las especies sin alterar las funciones básicas de las proteínas codificadas. La Tabla 2 proporciona una lista de ejemplo de las sustituciones conservadoras.

Tabla 2. Sustituciones Conservadoras Grado o porcentaje de homología de secuencia: El término “grado o porcentaje de homología de secuencia” se refiere al grado o porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias después de la alineación óptima.

Secuencia aislada y/o purificada homologa: La “secuencia aislada y/o purificada homóloga” se entiende que significa una secuencia aislada y/o purificada que tiene un porcentaje de identidad con las bases de una secuencia de nucleótidos, o los aminoácidos de una secuencia de polipéptido, de al menos aproximadamente 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, o 99.7%. Este porcentaje es puramente estadístico, y es posible distribuir las diferencias entre los dos nucleótidos o secuencias de aminoácidos en forma aleatoria y sobre toda en su longitud. La identidad de secuencia puede ser determinada, por ejemplo, mediante programas de computadora diseñados para llevar a cabo alineaciones de secuencias simples y múltiples.

Incremento, disminución, modulación, alteración o similares: Tal como lo apreciarán los expertos en la téenica, dichos términos se refieren a la comparación con una variedad similar o cepa crecida bajo condiciones similares pero sin la modificación que da como resultado el incremento, disminución, modulación o alteración. En algunos casos, esto puede ser un control no transformado, un control transformado mock, o un control transformado con vector.

Aislado: Tal como lo apreciarán los expertos en la teenica, el término “aislado” se refiere a polipéptidos o ácidos n ucleicos que han sido “aislados” de su ambiente nativo.

Secuencia de nucleótido, polinucleótido , o ácido nucleico: Q uedará entendido que la “secuencia de n ucleótido, polinucleótido, o ácido nucleico” significa tanto de hebra doble como hebra simple en las formas monoméricas y diméricas (llamadas en tándem) y los productos de transcripción de las mismas.

Identidad de secuencia: Se dice que dos secuencias de aminoácido o nucleótido serán “idéntica” si la secuencia de aminoácidos o n ucleótidos en las dos secuencias, es la misma cuando se alinea para correspondencia máxima, tal como se describe más adelante. El porcentaje de identidad de secuencia (o grado de identidad) se determina comparando dos secuencias alineadas en forma óptima en u na ventana de comparación , en donde la parte de la secuencia de péptido o polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, brechas) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para alineación óptima de dos secuencias. Se calcula el porcentaje determinando el número de posiciones en donde ocurre el residuo de aminoácido o base de ácido nucleico idénticos en ambas secuencias para producir el n úmero de posiciones correspondidas, dividiendo el número de posiciones correspondidas entre el número total de composiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para prod ucir el porcentaje de identidad de secuencia.

La alineación óptima de secuencias para comparación se puede llevar a cabo a traves del algoritmo de homolog ía local de Smith y Waterman , Ad. App. Math 2: 482 (1 981 ), a través del algoritmo de alineación de homolog ía de Needleman y Wu nsch, J . Mol. Biol. 48: 443 (1970) , mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman , Proc. Nati. Acad. Sci. (E. U .A.) 85:2444 (1988), mediante implementación computarizada de estos algoritmos (GAP , BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Grupo de Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer (GCG) , 575 Science Dr. , Mad ison , Wis), o mediante inspección visual.

La definición de identidad de secuencia proporciona anterior, la definición que puede ser utilizada por un experto en la téenica. La definición por sí misma no necesita la ayuda de algoritmos, siendo los algoritmos útiles ú nicamente para log rar las alineaciones óptimas de las secuencias, en lugar del cálculo de identidad de secuencia.

A partir de la definición anterior, se entiende que existe un valor bien definido y únicamente uno para la identidad de secuencia entre dos secuencias comparadas, en donde el valor corresponde al valor obtenido para la mejor alineación o la alineación óptima.

Hibridación rigurosa: La hibridación bajo condiciones de rigurosidad con una secuencia de nucleótidos, se entiende que significa una hibridación bajo cond iciones de temperatura y resistencia iónica elegida de tal modo que permita el mantenimiento de la hibridación entre los dos fragmentos de moleculas de ácido nucleico complementarias.

Los homólogos de los genes novedosos aqu í descritos obtenidos de otros organismos, por ejemplo plantas, se pueden obtener clasificando bibliotecas adecuadas que incluyen los homólogos, en donde la clasificación se lleva a cabo con la secuencia de nucleótido de los genes específicos de la presente invención , o partes o sondas de los mismos , o se identifican mediante búsqueda de homolog ía de secuencia utilizando prog ramas de búsqueda de alineación de secuencia tales como BLAST o FASTA.

Está bien establecido el aislamiento y clonación de ácido nucleico. En forma similar, se puede insertar un gen aislado en un vector y transformarse en una célula mediante téenicas convencionales que son conocidas para los expertos en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico se pueden transformar en u n organismo. Tal como se sabe en la técnica , este n úmero de forma mediante las cuales se pueden introducir en los organismos genes, vectores, construcciones y sistemas de expresión , y la combinación de las técnica de transformación y cultivo de tejido han sido integradas en forma exitosa en estrategias efectivas para crear organismos transgenicos. Estos métodos que se pueden utilizar en la presente invención , han sido descritos en otras partes (Potrykus I ( 1991 ) Gene transfer a plants: Assessment of published approaches and results (Trasferencia de gen a plantas: Evaluación de métodos y resultados publicados) . Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42 : 205-225; Vasil I K (1994) Molecular improvement of cereals (Incremento molecular de cereales) . Plant Mol. Biol. 25: 925-937. Walden R, Wingender R (1 995) Gene-transfer and plant regeneration techniques (Téenicas de transferencia de gen y regeneración de plantas). Trends in Biotechnology 1 3: 324-331 ; Songstad DD, Somers DA, Griesbach RJ ( 1 995) Advances in alternative DNA delivery tech niques (Avances de técnicas de suministro de ADN alternativas) . Plant Cell Tissue Organ Cult. 40: 1 -15) , y son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los vectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en referencias técnicas generales tales como Pouwels et al . , Clonina Vectors. A Laboratory Manual , Elsevier, Amsterdam (1 986). Los vectores particularmente adecuados incluyen vectores de plásmido Ti . Por ejemplo, un experto en la técnica (sabrá con certeza) tendrá certeza de estar atento de que, además de la transformación transmitida por Agrobacterium de Arabidopsis mediante infiltración de vacío (Bechtold N , Bilis J , Pelletier G (1993) In planta Agrobacterium-med\ated gen transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants (Transferencia de gen transmitido por Agrobacterium en plantas mediante infiltración de plantas de Arabidopsis thaliana ad ultas) AGrobactye. C R Acad Sci París, Sciences de la vie/Life Sciences 316: 1 194-1 199) o inoculación de sanación (Katavic V, Haughn GW, Reed D , Martin M , Ku nst L (1 994) I n planta transformation of Arabidopsis thaliana (Transformación en plantas de Arabidopsis thaliana). Mol. Gen. Genet. 245: 363-370. ) , esto es igualmente posible para transformar otras especies utilizando transformación transmitida por plásmido-Ti de Agrobacterium (por ejemplo, hipocotilo (DeBlock M , DeBrouwer D, Tenning P (1 989) Transformation of Brassica napus and Brassica olerácea using Agrobacterium tumefaciens and the expresión of the bar and neo genes in the transgenic plants (Transformción de Brassica napus y Brassica olerácea utilizando Agrobacterium tumefaciens y expresión de los genes bar y neo en plantas transgenicas) . Plant Physiol. 91 : 694-701 ) o peciolo cotiledonario (Moloncy M M , Walker J M , Sharma KK (1989) High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors (Transformación de alta eficiencia de Brassica napus utilizado vectores de Agrobacterium) . Plant Cell Rep. 8 : 238-242), curación de infección , métodos de bombardeo de partículas/biol ísticos (Sanford JC , Klein TM , Wolf ED, Alien N (1987) Delivery of substances into cells and tissues using a partióle bombardment process (Suministro de sustancias en celulas y tejidos utilizando u n proceso de bombardeo de partículas) . J. Part. Sci. Technol. 5: 27-37) o métodos de transformación de protoplasto, asistidos por polietilenglicol (Rhodes CA, Pierce DA, Mettler I J , Mascaren has D, Detmer J J (1 988) Genetically transformed maize plants from protoplasts (Plantas de maíz genéticamente transformadas de protoplastos. Science 240: 204-207) .

Tal como lo pueden apreciar los expertos en la téenica, y tal como se describe en otras partes (Mcyer P (1 995) U nderstanding and controlling transgen expression (Comprensión y control de expresión de transgen). Trends in Biotechnology 13: 332-337; Datla R, Anderson JW, Selvaraj G (1 997) Plant promoters for transgen expression (Promotores de plantas de expresión de transgen). Biotechnology Annual Review 3: 269-296) , es posible utilizar promotores enlazados operativamente a la molécula de ácido nucleico para dirigir cualquier activación o desactivación proyectada de la expresión de transgen utilizando promotores no regulados (es decir, constitutivo) (por ejemplo, los basados en CaMV35S), o utilizado promotores que pueden dirigir la expresión genética a células particulares, tejidos (por ejemplo , promotor napin para la expresión de transgenes en el desarrollo de cotiledóneos de semillas), de órganos (por ejemplo, ra íces) , hasta una etapa de desarrollo particular, o en respuesta a un estímulo externo particular por ejemplo choque de calor.

Los promotores para utilizarse en la presente invención pueden ser inducibles, constitutivos o específicos de tejido o tener diversas combinaciones de dichas características. Los promotores útiles incluyen pero no se limitan a promotores constitutivos tales como promotor de virus de anillo grabado de clavel (CERV), promotor 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV) o más particularmente, el promotor de virus de mosaico de coliflor incrementado doble, que comprende dos promotores CaMV 35S en tándem (referido como promotor “Double 35S”). Puede ser deseable utilizar u n promotor especifico de tejido o regulado en forma de desarrollo en lugar de un promotor constitutivo en ciertas circunstancias. Un promotor específico de tejido permite la sobre-expresión en ciertos tejidos sin infectar la expresión en otros tejidos.

Las regiones promotoras y reguladoras de terminación serán funcionales en la celula h uésped y pueden ser heterólogas (esto es, no ocurren naturalmente) u homólogas (derivada de especies huésped) para la célula y el gen .

La región reguladora de terminación puede ser derivada de la región 3’ del gel del cual se obtiene el promotor o de otro gen. Las regiones de terminación adecuadas que serán utilizadas son bien conocidas en la téen ica, e incluyen el terminador de sintasa de nopalina Agrobacterium tumefaciens (Tnos) , el terminador de sintasa de manopina A. tumefaciens (Tmas) y el terminador CaMV 35S (T35S) . Las regiones de terminación particularmente preferidas para utilizarse en la presente invención , incluyen la terminación de región de subunidad pequeña de carboxilasa de bisfosfato de ribulosa de guisante (TrbcS) o la región de terminación Tnos. Las construcciones de gen para utilizarse en la presente invención , pueden ser clasificadas en forma adecuada para actividad , por ejemplo, mediante transformación en una planta h uesped med iante Agrobacterium y clasificación para niveles canabinoides alterados.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, o los fragmentos de las mismas, se pueden utilizar para bloquear la biosíntesis canabinoide en organismos que producen naturalmente compuestos canabinoide. La silenciación utilizando una molécula de ácido n ucleico de la presente invención , puede log rarse en u na cantidad de formas generalmente conocidas en la téenica, por ejemplo, técnicas de interferencia de ARN (ARNi), técnicas de microARN artificial, técnicas de silenciación de gen inducida por virus (VIGS), técnicas antisentido, técnicas de cosupresión de sentido y técnicas de mutagénesis dirigida.

Las técnicas de ARNi implican transformación estable utilizando construcciones de plásmido de interferencia de ARN (ARN i) (Helliwell CA, Waterhouse PM (2005) Constructs and methods for hairpin RNA-mediated gen silencing in plants (Construcciones y metodos para silenciación de gen transmitida por ARN de horquilla en plantas). Methods Enzymology 392:24-35). Dichos plásmidos están compuestos de un fragmento del gen objetivo que será silenciado en u na estructura de repetición invertida. Las repeticiones invertidas son separadas a través de un espaciador, con frecuencia un intrón . La construcción de ARN i conducida por u n promotor adecuado, por ejemplo, el promotor 35S del virus se mosaico de Coliflor (CaMV), se integra en el genoma de la planta y la transcripción subsecuente del transgen conduce a una molécula de ARN que se dobla hacia sí misma para formar un ARN de horq uilla de hebra doble. Esta estructura de ARN de hebra doble es reconocida por la planta y se corta en pequeños ARN (aproximadamente 21 nucleótidos de longitud) llamadas ARNs de interferencia peq ueña (siARNs) . Los siARNs se asocian con el complejo de proteína (RISC) que va hacia la degradación d irecta del mARN para el gen objetivo.

Las téenicas de microARN artificial (amiARN) explotan la trayectoria de microARN (miARN) que fu nciona para silenciar genes endógenos en plantes y otros eucariotos (Schwab R, Ossowski S, Riester M , Warthmann N , Weigel D (2006) H ighly specific gen silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis (Silenciación de gen altamente específica mediante microARNs artificiales en Arabidopsis) . Plant Cell 18 : 1 121 -33; Alvarez JP, Pekker I , Goldshmidt A, Blum E , Amsellem Z, Eshed Y (2006) Endogenous and synthetic microARNs stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of múltiple targets in diverse species (Los microARNs endógenos y sinteticos estimulan la regulación simultánea, eficiente y localizada de múltiples objetivos en diversas especies) . Plant Cell 18 : 1 134-51 ). En este método, se introducirán fragmentos del gen de 21 nucleótidos de largo que serán silenciados, en u n gen de pre-miARN para formar una construcción de pre-amiARN . La construcción de pre-amiARN se transfiere en el genoma del organ ismo utilizando u n método de transformación que pueden ser apreciados por los expertos en la téenica. Después de la transcripción del pre-amiARN, el procesamiento produce amiARNs que dirige los genes que comparten identidad de nucleótidos con la secuencia de amiARN de 21 nucleótidos.

En las técnicas de silenciación de ARN i , dos factores pueden influenciar la elección de la longitud del fragmento. Entre más corto es el fragmento, se logrará una silenciación efectiva menos frecuente, au nque las horquillas muy largas incrementan la oportu nidad en recombinación en cepas huésped bacterianas. La efectividad de silenciación también parece ser dependiente del gen y podría reflejar la capacidad de acceso del mARN objetivo o las abu ndancias relativas del mARN objetivo y el ARN de horq uilla en células en las cuales el gen está activo. Una longitud de fragmento de entre 100 y 800 pb, preferentemente entre 300 y 600 pb, generalmente es adecuada para maximizar la eficiencia de la silenciación obtenida. La otra consideración es la parte del gen q ue será dirigida. Se puede utilizar 5’ UTR, reg ión de codificación , y 3’ UTR con resultados igualmente buenos. Ya que el mecanismo de silenciación depende de la homolog ía de secuencia, existe u n potencial para silenciar en forma cruzada las secuencias de mARN relacionadas. Ya q ue esto no es deseable, se debe elegir una región con baja similitud de secuencia con otras secuencias, tal como 5’ o 3’ UTR. La regla para evitar la silenciación de homolog ía cruzada parece ser el uso de secuencias que no tienen bloq ues de identidad de secuencia de arriba de 20 bases entre la construcción y las secuencias de gen no objetivo. M uchos de estos mismos principios aplican la selección de genes objetivos para diseñar amiARNs.

Las teenicas de silenciación de gen inducidas por virus (VIGS) son una variación de técnicas de ARNi que explotan las defensas antivirales endógenas de las plantas. La infección de las plantas con virus VIGS recombinantes q ue contienen fragmentos de ADN huésped , conducen a la silenciación de gen postranscripción para el gen objetivo . En u na modalidad, el sistema VIGS basado en virus de cascabeleo del tabaco (TRV), se puede utilizar con las secuencias de nucleótido de la presente invención .

Las técnicas antisentido implican producir en una planta un oligonucleótido antisentido que enlazará al ARN mensajero (mARN) producido por el gen de interes. El oligonucleótido “antisentido” tiene una complementariedad de secuencia base con el ARN mensajero del gen (mARN) , q ue es denominado la secuencia “objetivo”. La actividad del segmento del sentido del mARN se bloquea a través del segmento de mARN antisentido, para desactivar en forma efectiva de esta manera la expresión del gen. La aplicación de antisentido para la silenciación de gen en planta se describe con mayor detalle en la Publicación de Stam M , de Brum R, van Blokland R, van der Hoorn RA, Mol J N , Kooter J M (2000) Distinct featu res of post-transcriptional gen silencing by antisense transgens in single copy y inverted T-DNA repeat loci (Características distintas de silenciación de gen postranscripción mediante transgenes antisentido en una sola copia y locus de repetición de T-ADN invertido) . Plant J. 21 :27-42.

Las téenicas de cosupresión de sentido implican introducir un transgen de sentido altamente expresado en una planta que da como resultado una expresión reducida tanto del transgen como del gen endógeno (Depicker A, Montagu MV (1997) Post-transcriptional gen silencing in plants (Silenciación de gen postrascripción en plantas) . Curr Opin Cell Biol. 9: 373-82). El efecto depende de la identidad de secuencia entre el transgen y el gen endógeno.

Se pueden utilizar técnicas de mutagénesis dirigida, por ejemplo TI LLING (Genomas de Lesiones I N Local I nducidas Mediante Dirección) y “eliminación de u n gen” utilizando bombardeo de neutrones rápido, para eliminar la función del gen en un organismo (Henikoff S, Till BJ , Comai L (2004) TI LLI NG. Traditional mutagensis meets functional genomics (La mutagenesis tradicional cumple con genómicas funcionales). Plant Physiol 135 :630-6; Li X, Lassner M , Zhang Y. (2002) Deleteagen : a fast neutrón deletion mutagensis-based gen knockout system for plants (Eliminación de u n gen : un sistema de eliminación de gen basado en mutagénesis de eliminación de neutrón rápido para plantas) . Comp Funct Genomics. 3: 158-60). TI LLI NG implica tratar el plasma germinal o células individuales con un mutagen para originar mutaciones de pu nta que posteriormente son descubiertas en genes de interés utilizando un método sensible para detección de mutación de nucleótido simple. Se puede log rar la detección de mutaciones deseadas (por ejemplo, mutaciones que dan como resultado la desactivación del producto del gen de interés) , por ejemplo, med iante métodos PCR. Por ejemplo, se pueden preparar cebadores de oligon ucleótido derivados del gen de interés y se puede utilizar PCR para amplificar las regiones del gen de interés de los organismos en la población mutagenizada. Los genes mutantes amplificados pueden ser endu recidos para genes tipo natural para encontrar desacoplamientos entre los genes mutantes y los genes tipo natural. Se pueden trazar las diferencias detectadas nuevamente en el organismo el cual tuvo el gen mutante, para revelar de esta forma que organismo mutagenizado tendrá la expresión deseada (por ejemplo, silenciación del gen de interés) . Estos organismos posteriormente pueden ser alimentados en forma selectiva para producir u na población que tiene la expresión deseada. TILLI NG puede proporcionar una serie alélica que incluye mutaciones de desacoplamiento y eliminación, que presentan expresión reducida del gen dirigido. TI LLI NG se promueve como un método posible para eliminación de gen que no implica introducción de transgenes, y por lo tanto puede ser más aceptable para los consumidores. El bombardeo de neutrones rápido induce mutaciones, es decir, eliminaciones , genomas de organismo que también pueden ser detectados utilizando PCR en una forma similar a TI LLING .

Quedará entendido por un experto en la téenica, que los procesos de la presente invención también se pueden llevar a cabo en un ambiente libre de células en la presencia de uno o más ácidos carboxílicos.

Las modalidades de la presente invención son susceptibles a diversas modificaciones y formas alternativas, además de los ejemplos específicos ahí incluidos. Por lo tanto, las modalidades de la presente invención no se limitan a las formas particulares descritas.

Ejemplos: Ejemplo 1: Amplificación y Clonación de CsHCSI y CsHCS2 CsHCS I y CsH CS2 fueron amplificadas con PC R a partir de clones de plásmido de cADN utilizando los cebadores descritos en la tabla 3 y la polimerasa Ph usion™ (Finnzymes). Los productos PCR fueron pu rificados y clonados en el vector de entrada pCR8/GW/TO PO (I nvitrogen). Despues de la transformación en células TOP 10 E. coli (I nvitrogen) , se verificaron clones individuales mediante secuenciación . Los genes CsHCSI y CsHCS2 fueron combinados en el vector de destino pH IS8/GW utilizando recombinasa LR (I nvitrogen). Los productos de reacción LR fueron transformados en células TOP 1 0 y verificados mediante secuenciación.

Tabla 3. Oligon ucleótidos Se transformaron pH IS8/GW-CsHCS1 y pH IS8/GW-CsHCS2 en células Rosetta 2 de E. coli (Merck) . Se utilizaron colonias individuales para inocular cultivos a pequeña escala del medio LB líq uido que contiene cloramfenicol y canamicina, q ue se utilizaron para inocular 500 mL del medio LB líq uido sin antibióticos. Despues de crecer a OD600 de 0.6, se indujo la expresión mediante la adición de IPTG para 0.2 mM. Los cultivos que expresan CsHCSI posteriormente se crecieron a una temperatura de 12°C con agitación durante 24 horas, mientras que los cultivos CsHCS2 se crecieron a una temperatura de 37°C durante 16 horas. Se utilizaron diferentes temperaturas debido a que se observó que CsHCSI no produjo proteína soluble en una mayor temperatura.

Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y resuspendidas en amortiguador de lisis de etiqueta His 10 mL (50 mM de Tris-HCI pH 7, 500 mM de NaCI, 2.5 mM de imidazol, 10% v/v de glicerol, 10 mM de b-mercaptoetanol , 1% v/v de Tween™ 20, y 750 mg/mL de lisozima). Las células resuspendidas fueron incubadas sobre hielo durante 1 hora, posteriormente Usadas mediante ultrasonido. Después de la centrifugación durante 20 minutos en 12,000 g a una temperatura de 4°C, se agregó la fracción de proteína soluble a 160 mL de resina Talón™ (Clontech) que había sido lavada previamente con amortiguador de lavado (HWB; 50 mM de Tris-HCI pH 7, 500 mM de NaCI, 2.5 mM de imidazol, 10% de glicerol, 10 mM de b-mercaptoetanol).

Las muestras fueron incubadas con agitación suave a una temperatura de 4°C, después de lo cual se aisló la resina mediante centrifugación (700 g durante 5 min). La resina se resuspendió en amortiguador HWB y se lavó con agitación suave a una temperatura de 4°C , posteriormente se centrifugó. El paso de lavado se repitió dos veces y la resina resuspendida se cargó sobre una columna de cromatografía y se dejó drenar. Despues de lavar la resina con 10 ml_ de amortiguador HWB , las proteínas etiquetadas con His fueron eluidas mediante la adición de 2.5 ml_ de amortiguador de elución His (50 mM de Tris-HCI pH 7, 500 mM de NaC I , 250 mM de imidazol, 10% v/v de glicerol, 10 mM de b-mercaptoetanol) . Los eluyentes fueron intercambiados con amortiguador en u n amortig uador de almacenamiento (50 mM de H EPES pH 9 , 10% v/v de glicerol , 2 mM de MgCI2, y 2 mM de ditiotreitol) utilizando columnas PD1 0 (Amersham Biosciences) . La pu reza de las proteínas aisladas se verificó med iante SDS-PAGE, y se determinó la concentración de proteína mediante ensayo Bradford.

Ejemplo 2: Análisis de Actividad de Sintetasa de Hexanoil-CoA Se midió la actividad de sintetasa de Hexanoil-CoA incubando 0.1 mg de enzima en una mezcla de reacción de 20 p L que contiene 50 mM de H EPES pH 9, 8 mM de ATP , 1 0 mM de MgC I2, 0.5 mM de CoA, y 4 mM de hexanoato de sodio. Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a u na temperatu ra de 40°C , se terminaron con 2 p L de 1 N HC I y se almacenaron sobre hielo hasta el análisis.

Las mezclas de reacción se diluyeron 1 : 100 con agua y subsecuentemente se separaron utilizando u n sistema Waters Acqu ity U PLC adaptado con una columna Acquity UPLC BEH C 1 8 (1 .7 mm de tamaño de partícula, columna de 2.1 x 50 mm), y se analizaron mediante MS/MS utilizando espectrómetro de masa de triple-cuádruplo Micromass Quattro Ultima. El sistema de solvente utilizado fue amortiguador A: 5 mM de TEA y 3 mM de ácido acetico en agua, y amortiguador B: 5 mM de TEA y 3 mM de ácido acético en 95:5 metanol :agua. El prog rama de flujo se muestra en la tabla 4. Las configuraciones del espectrómetro de masa fueron: modo positivo ES, energía de colisión 27 V, cono 135 V, escaneo para 866>359 transiciones.

Tabla 4: Programa de Flujo para Cromatografía Líq uida Tal como se muestra en la figu ra 2 , CsHCS I y CsHCS2 catalizaron la formación de hexanoil-CoA de hexanoato y CoA. Las fig uras 2A y 2 B muestran la elución del estándar hexanoil- CoA auténtico. La figu ra 2C muestra u n ensayo completo que comprende CsH CS I , 50 mM de HEPES pH 9, 8 mM de ATP, 10 mM de MgCI2, 0.5 m M de CoA, y 4 m M de hexanoato de sodio. Se puede observar a los 9.25 minutos u n compuesto con las mismas transiciones de masa y tiempo de elución que el estándar de hexanoil-CoA auténtico. La figura 2D muestra un ensayo completo que comprende CsHCS2, 50 mM de HEPES pH 9, 8 mM de ATP, 10 mM de MgCI2, 0.5 mM de CoA, y 4 m M de hexanoato de sodio. Se puede observar a los 9.25 minutos un compuesto con las mismas transiciones de masa y tiempo de elución que el estándar de hexanoil-CoA auténtico. Las figuras 2E y 2F muestran controles negativos con enzimas CsHCS I y CsHCS2 desactivadas (hervidas). Tal como se puede apreciar en las figu ras 2E y 2F, estos ensayos no mostraron síntesis de hexanoil-CoA.

Tanto CsHCS I como CsHCS2 presentaron una temperatura y pH óptimos de 40°C y pH 9, respectivamente . En las pruebas de un rango de cationes divalentes, CsHCS I utilizó óptimamente Mg2+ y en u n menor g rado Mn2+ y Co2 + . La actividad CsHCS2 fue la más alta utilizando Co2 + , pero también se observó como alta Mg2+, M n2+, y con u n menor g rado Ca2+. La relevancia biológica de alta actividad con Co2+ no es más clara y se utilizó Mg2+ para todos los ensayos adicionales.

Con hexanoato, CsHCS I tuvo u n Km de 6.1 ± 1 .0 mM , un Vmax de 1 5.6 ± 1 .7 pKat y un kcat de 4.5 sec 1. CsHCS2 tuvo un Km de 320 nM , un Vmax de 1 .7 pKat, y un kcat de 57.6 sec 1. Ejemplo 3: Pruebas con Diferentes Ácidos Carboxílicos Para probar el rango de ácidos carboxílicos que puede activar CsHCSI y CsH CS2 , se llevaron a cabo ensayos de enzima con un amplio rango de ácidos carboxílicos y ATP limitante. Las cond iciones de ensayo utilizadas fueron similares a Sch neider K et al . (2005) . U n nuevo tipo de sintetasa de acilo peroxisomal-coenzima A de Arabidopsis thaliana, tiene la capacidad catalítica de activar precursores biosinteticos y ácido jasmónico. The Journal of Biological Chemistry, 280: 13962-72. En síntesis, se incubó la enzima HCS purificada (1 pg) con 500 m M de substrato de ácido carboxílico y 1 00 mM de CoA en un ensayo que contiene 100 mM de H EPES pH 9, 250 m M de MgCI2, 50 m M de ATP y 1 mM de DTT. Todos los substratos de ácido carboxílico fueron disueltos en 2% v/v de Tritón™ X-1 00, lo que conduce a una concentración final de 0.05% de Tritón X-100 en el ensayo. Después de reaccionarse durante 3 horas a una temperatura de 29°C , se transfirieron 1 0 mL de alícuotas de las reacciones a placas de 96 depósitos para una medida a base de luciferina/luciferasa de ATP no consumido. Las placas fueron analizadas con un contador 1420 M ultilabel (PerkinElmer) . A cada depósito, se le inyectaron 90 p L de u na solución que contiene 100 mM de Tris pH 7.8, 1 m M de MgC I2, 2.3 mg de luciferina, y 0.5 pg de luciferasa, y después de ag itarse durante 2 seg undos, se midió la luminiscencia durante 1 5 segundos sin u n filtro en el lugar. Las texturas inferiores , en comparación con las reacciones sin substrato de ácido carboxílico, indican una mayor cantidad de actividad enzimática , y por consig uiente, utilización de substrato. Los resultados se muestran en la figura 3, en donde las barras de error representan el porcentaje de error de la proporción , n = 3.

Tal como se muestra en la figura 3A, se observó CsHCSI para utilizar hexanoato (seis carbonos), octanoato (ocho carbonos) , y nonanoato (n ueve carbonos) , y en un menor grado valerato (cinco carbonos) y heptanoato (siete carbonos) , como los substratos. En contraste, tal como se muestra en la figura 3B, CsHCS2 presentó mayor promiscuidad , y tiene la capacidad de utilizar un amplio rango de substratos que fluctúan de propanoato (C3) a araquidoato (C20) , y un n úmero de fenilpropanoides (cinamato, ferulato, y un menor grado p-coumarato) .

En un experimento separado, las propiedades cineticas de CsHCS I y CsHCS3 se miden en forma más precisa para CoA y ácidos grasos de cadena corta (butanoato) , med ia (hexanoato y decanoato) , y larga (palmitato) representativos (tabla 5). Las altas concentraciones de CoA inhibieron CsHCS I . Utilizando un modelo de inhibición de substrato de regresión no lineal, se estimula K¡ de CsHCS I como de 5.101 ± 1 .8 mM . CoA no inhibió CsHCS2 en las concentraciones probadas. El ácido decanoico inhibió CsHCS2 (K¡ = 120.8 ± 47.9 m M) e inhibió ligeramente CsHCS I en concentraciones superiores a 4 mM (K¡, no medido). Estos datos muestran las mismas tendencias que los datos cineticos presentados anteriormente.

Tabla 5: Propiedades cinéticas de CsHCSI y CsHCS2. ano determinado debido a la carencia de actividad catalítica Ejemplo 4: Síntesis de Ácido Olivetólico utilizando CsHCS2 Se utilizó CsHCS2 para la síntesis de coenzima del ácido olivetólico policétido. El ácido olivetólico es el primer precursor asignado para la biosíntesis canabinoide. Esta síntesis in vitro y su uso de cuatro enzimas recombinantes: CsHCS2 , sintetasa de malonil-CoA (MCS) de Rhizobium leguminosarum , “sintasa de olivetoT/sintasa de policétido de canabis, y sintasa de ácido olivetólico de canabis.

Se amplificó la sintetasa de Malonil-CoA (M CS) del ADN genómico de Rhizobium leguminosarum con los cebadores MCS directos y MCS inversos (ver tabla 3) . El producto PCR fue clonado en vector pCR8/GW/TOPO (I nvitrogen) recombinado en el vector pHIS8/GW. Despues de verificación mediante secuenciación , el plásmido se transfirió en la Rosetta I I de £. coli (DE3) . Se expresó MCS recombinante y se expresó como se describe para las enzimas CsHCS.

La clonación , expresión y pu rificación de “sintasa de olivetol”/sintasa de policétido y sintasa de ácido olivetólico se llevaron a cabo como se indica a continuación . Para la expresión en células E. coli, se amplificaron mediante PCR los cuad ros de lectu ra abierta de la sintasa de policétido/sintasa de olivetol y sintasa de ácido olivetólico, se clonaron en pH IS8/GW para sintasa de policétido/sintasa de olivetol o pET100 (I nvitrogen) para sintasa de ácido olivetólico y se transformaron en E. coli BL21 (DE3) (I nvitrogen) . La clonación se verificó mediante secuenciación .

Se expresó la sintasa de ácido olivetólico en 200 mL de caldo de cultivo Terrific, en tanto que la sintasa de policétido/sintasa de olivetol se creció en 1 L de cultivo. Ambos cultivos se incubaron en u na temperatura de 30°C/agitación 1 50 rpm, se ind ujeron con 0.5 m M de IPTG y se crecieron durante la noche. Los cultivos fueron centrifugados en 16 ,000 g durante 20 minutos, y los pelets se Usaron mediante tratamiento con lisozima y ultrason ido. Se mezclaron los Usados aclarados con resina Talón (200 p L para sintasa de ácido olivetólico, 1 mL para sintasa de policétido/sintasa de olivetol; Clontech) , se lavaron con 5 mL de Amortiguador de Lavado de etiqueta His (50 mM de Tris-HC I (pH 7) , 150 mM de NaCI , 20 mM de imidazol , 1 0 M de b-mercaptoetanol) y las proteínas recombinantes se eluyeron utilizando Amortiguador de Elución de etiqueta His (20 mM de Tris HCI (pH 7), 1 50 mM de NaCI , 100 mM de imidazol , 1 0 mM de b-mercaptoetanol). El eluyente se concentró utilizando un concentrador YM 10 y el amortig uador se intercambió al Amortiguador de Almacenamiento (20 mM de HEPES (pH 7.5), 25 mM de NaCI , 10% de glicerol, 5 mM de DTT) . Las soluciones de proteínas finales se cuantificaron utilizando un equipo de ensayo de proteína RC/DC (Bio-Rad) que encontró concentraciones de proteína de 0.5 mg/mL (sintasa de ácido olivetólico) y 5.6 mg/mL (sintasa de policetido/sintasa de olivetol) . El análisis de gel de SDS-PAGE confirmó la pureza de ambas proteínas.

La capacidad de acoplar la síntesis de hexanoil-CoA con síntesis de policétido aromático utilizando reactivos no costosos, se probó llevando a cabo ensayos de enzima que consisten en 4 mM de hexanoato, 8 mM de malonato, 0.4 mM de CoA, 0.4 mM de ATP, 5 m M de MgC I2, 2 m M de DTT, 20 mM de H EPES pH 7.5, 0.3 mg de CsHCS2 , 1 2 pg de MCS, 8 pg de “sintasa de olivetol’/PKS y 10 pg OAS. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 16 horas, se acidificó y extrajo en acetato de etilo. La fracción polar se recuperó , se evaporó hasta secarse y se resuspendió en 50 p L de metanol. Se analizó una al ícuota (5 m?_) mediante LCMS, y los prod uctos se identificaron mediante sus tiempos y masas de retención (ver figura 4).

Ejemplo 5: Síntesis de Ácido Olivetólico en Levadura utilizando CsHCS I y CsHCS2 Se diseñó la levad ura ( Saccharomyces cerevisiae) para producir ácido olivetólico utilizando CsHCS I y CsHCS2 para sintetizar hexanoil-CoA, y una fusión de “sintasa de olivetol”/sintasa de policetido (PKS) de canabis y sintasa de ácido olivetólico (OAS) para formar ácido olivetólico.

Se clonó OAS en la estructura con “sintasa de olivetor/PKS utilizando una secuencia enlazadora sintética que codifica los aminoácidos AATSGSTGSTGSTGSG RSTGSTGSTGSG RS HMV (SEQ I D NO: 1 ) en el vector de expresión de levad ura pESC-Trp (Stratagen) bajo el control del promotor GAL10. Se clonó el cuadro de lectu ra abierta de CsHCS I en el vector de expresión de levadura pYESDEST52-U ra (I nvitrogen) utilizando teenología Gateway. El cuadro de lectura abierta de CsHCS2 se clonó en el vector de expresión de levadura pESC-Trp (Stratagen) bajo el control del promotor GAL1 .

Se transformaron las células de levadu ra (I nVSc I , I nvitrogen) con las construcciones anteriores (OAS:"sintasa de olivetol”/fusión PKS sola, OAS:”sintasa de olivetol”/fusión PKS y CsHCSI ; OAS:’’sintasa de olivetol/fusión PKS y CsHCS2) y los transformantes se crecieron en una placa S D-Trp durante 3 d ías a una temperatura de 28°C. Para cada u no, se inoculó una sola colonia en 3 ml_ de medio de glucosa SD-Trp y se incubó con agitación a u na temperatura de 28°C d urante 2 d ías. Se utilizó u na alícuota de 0.5 mL de cultivo de in icio para inocu lar 10 ml_ del medio de galactosa SD-Trp que contiene 1 m M de hexanoato de sodio y se incubó a una temperatura de 20°C d u rante 4 días. El cultivo completo se extrajo con acetato de etilo, se secó y el residuo se resuspendió en 100 m I_ de 30% de aceton itrilo/70% de agua/0.05% de ácido fórmico . Los productos fueron analizados utilizando LCMS (ver figura 5).

Ejemplo 6: Desempeño de CsHSCI y CsHSC2 en Biosíntesis Canabinoide en Plantas A traves de un análisis basado en secuencia del conj unto de datos EST de tricoma y el ensayo bioqu ímico de cinco AAEs, se identificaron dos q ue poseen actividad de sintetasa de hexanoil-CoA (CsHSCI y CsHSC2) . Para determinar cuál de estos probablemente está implicado en la trayectoria biocinética canabinoide, se llevaron a cabo qRT-PCR y experimentos de localización subcelular. qRT-PCR y expresión de CsHSC I y CsHSC2 Se crecieron plantas ‘Finóla’ desde semillas hasta la etapa de floración media. Se muestrearon de tres plantas las raíces, tallos, hojas, flores femeninas (con tricomas y después del aislamiento de tricoma utilizando el Beadbeater) , células de tricoma y flores macho. Se aisló el ARN total tal como se describió anteriormente. El ARN tuvo un Abs26o: Abs2eo de > 1 .9 y mostró distintas bandas ribosomales en el gel de desnaturalización . Se sintetizaron los cADN de primera hebra utilizando 0.5 mg de ARN con un eq uipo de síntesis de cADN QuantiTect (Qiagen) . Cada 20 p L de muestra de cADN se diluyó 1 :4 con agua, y 1 mL se utilizó como una plantilla PCR. Se diseñaron cebadores específicos de gen para producir amplicones de 90-200 pb. Las reacciones PCR (20 pL) se llevaron a cabo en placas de 96 depósitos utilizando un ensayo basado en SYBR Green (equipo Q uantiFast SYBR Green , Qiagen) con un instrumento StepOne Plus (Applied Biosystems) . Los parámetros de cielado utilizados fueron de una temperatu ra de 95°C durante 5 minutos seguido de 40 ciclos de 95°C du rante 10 s, 60°C d urante 30 s, y un protocolo de disociación estándar (95°C 15 s, 60°C du rante 1 minuto, 60 a 95°C en incrementos de 0.3°C 15 s) . Se llevaron a cabo experimentos utilizando cADNs de tres plantas con dos replicas téenicas. Actina, la cual se descubrió que tiene expresión estable en todos los tejidos probados , se utilizó como un gen de referencia. Las eficiencias para todos los pares de cebador fueron de 90 a 1 10% como se calcula utilizando el método de curva estándar. Los valores Ct fueron calculados utilizando el Software StepOne (Applied Biosystems). El método 2 DDe* fue utilizado para análisis de expresión de gen relativa.

Localización subsecelular de CsHSCI y CsHSC2 Se construyeron fusions YFP.CsHSCI y YFP:CsHSC2 mediante recombinación en pEARLYGATEI 04 (Earlcy, K.W., Haag, J.R., Pontes, O., Opper, K., Juehne, T., Song, K. y Pikaard, C.S. (2006). Los vectores compatibles con las entradas para genómicos funcionales en plantas y proteómicos. Plant J. 45, 616-629) utilizando recombinasa LR (Invitrogen). Para generar una construcción OLS:CFP, se clonó OLS que carece de un codón de detención en pCR8/GW/TOPO antes de la recombinación en pEARLYGATEI 02 utilizando recombinasa LR. El marcador de peroxisoma PX-CK (Nelson, B.K., Cai, X. y Nebenfiihr, A. (2007). Un conjunto de multicolor de marcadores de organelo in vivo para estudios de colocalización en Arabidopsis y otras plantas. Plant J. 51, 1126-1136) fue de ABRC (www.arabidopsis.org). Los plásmidos fueron transformados en Agrobacterium tumefaciens GV3101 mediante electroporación y se seleccionaron en placas LB que contienen 10 mg/mL de rifampacina y 50 pg/mL de canamicina. Las hojas de dos semanas de edad de plantas Nicotiana benthamiana fueron infiltradas con la solución de Agrobacterium en OD6oo de 0.02 (Sparkes, I A, Runions, J., Kearns, A. y Hawes, C. (2006). Rapid, transient expressión of fluorescent fusión proteins in tobáceo plants and genration of stably transformed plants (La expresión rápida temporal de las proteínas de fusión fluorescente en plantas de tabaco y generación de plantas transformadas en forma estable). Nat. Protocol. 1 , 2019-2025.). Dos días despues de la infiltración , se visualizaron células epidérmicas en la hoja utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM510. Se visualizó C FP con excitación de 458 nm y colección de imagen con un filtro de paso de banda de 475-525 nm. YFP en 514 nm con un filtro de paso de banda 530-600 nm . Las imágenes se recolectaron y analizaron utilizando el paquete de software Zeiss LSM .

Los datos proporcionan evidencia de que CsH SC I es la enzima implicada en la biosíntesis canabinoide. CsHSC I fue la transcripción más abundante en el catálogo EST, y los datos qRT-PCR muestran que la expresión 100 veces más en las células de tricoma en comparación con otros tejidos (fig u ra 6). Además, CsHSC I se localiza en el citosol tal como se evidencia med iante el experimento de localización subsecuente celular, el cual es el mismo compartimento en donde se localiza la enzima canabinoide putativa OLS. La preferencia de substrato de CsH SC I proporciona evidencia adicional por su papel en la biosíntesis canabinoide, ya que muestra más especificidad para hexanoato y otro acilo CoAs graso de cadena corta que CsHSC2 (figu ra 3).

Aunque CsHSCI es la enzima implicada probablemente en la biosíntesis canabinoide en plantas, CsHSC2 es más eficiente q ue CsHSC I para sintetizar hexanoil-CoA. Sin embargo, CsHSC2 se localiza en la peroxisoma y no está claro cómo hexanoil-CoA formada en este compartimento , puede ser exportado al citoplasma, en donde se localiza la fase de síntesis de policetido de la trayectoria canabinoide. CsHSC2 acepta un rango muy amplio de substratos, lo que indica que es una sintetasa acil-CoA más generalizada que puede funcionar en la b-oxidación peroxisomal .

Tanto CsHSC I como CsHSC2 son herramientas ind ustriales valiosas. La eliminación de CsHSC I en plantas de canabis conducirá a u na mayor reducción en los niveles canabinoides en la plantas, lo cual es muy deseable para quienes cultivan hachís. La sobre-expresión de CsHSC I en canabis puede conducir a niveles canabinoides elevados, lo cual es útil para propósitos farmacéuticos. Por otra parte, CsHSC2 puede ser particularmente útil para reconstituir la formación canabinoide en microorgan ismos o en un sistema in vi tro.

Ejemplo 7: Generación de Mulantes en los genes CsHSCI y CsHSC2 utilizando Lesiones Locales Inducidas Dirigidas en Genomas (TILLING) Se puede log rar la identificación de plantas de cannabis con mutaciones en los genes CsHSC I o CsHCS2 utilizando TI LLI NG. Se clasifica u na población mutagenizada en plantas de canabis utilizando cebadores de oligonucleótido y PC R con el objeto de amplificar los genes de interés. Los genes mutantes amplificados se endurecen para genes naturales para encontrar desacoplamientos entre los genes mutantes y los genes naturales. Las diferencias detectadas se utilizan para identificar plantas q ue contienen mutaciones en uno de ambos de los genes CsHSCI o CsHCS2. Las plantas q ue contienen mutaciones que conducen a aminoácidos alterados en las posiciones son esenciales para la estabilidad o actividad de sintetasa alcanoil-CoA de las proteínas CsHSC I o CsHCS2 , no tienen la capacidad de producir precursores de alcanoil-CoA para biosíntesis canabinoide. Las plantas resultantes contienen niveles reducidos o alterados de prod uctos canabinoides.

La presente invención proporciona genes que codifican dos enzimas de sintetasa de alcanoil CoA de canabis. Estos genes pueden utilizarse para crear, mediante cultivo, mutagenesis dirigida o diseñado genético, antes de canabis con prod ucción canabinoide incrementada. Además, la desactivación o silenciación de un gen de la presente invención en canabis puede utilizarse para bloquear la biosíntesis canabinoide y de esta forma reducir la producción de canabinoides tales como THCA, el precu rsor de THC, en plantas de canabis (por ejemplo, hach ís industrial) . Los genes de la presente invención pueden ser utilizados, en combinación con genes que codifican otras enzimas en la trayectoria canabinoide, para diseñar biosíntesis canabinoide en otras plantas o en microorganismos, o en sistemas libres de células, o para prod ucir análogos de compuestos canabinoides o análogos de precursores canabinoides.

A lo largo de la presente descripción , se hace referencia a publicaciones, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia.

Otras ventajas que son inherentes a la presente invención, serán obvias para los expertos en la teenica . Las modalidades se describen en la presente invención en forma ilustrativa y no pretenden limitar el alcance de la presente invención , tal como se reivindica . Las variaciones de las modalidades anteriores serán evidentes por un experto en la técnica y están proyectadas por los inventores como comprendidas a través de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molecula de ácido nucleico aislado o purificada que comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos el 75% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótido de degeneración de codón, de la misma.

2. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótido es tal como se establece en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótido de degeneración de codón, de la misma.

3. Una molécula de ácido nucleico aislado o purificada que comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de nucleótido de degeneración de codón, de la misma.

4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia de nucleótido es tal como se establece en la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de nucleótido de degeneración de codón, de la misma.

5. Un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácido sustituida en forma conservadora de la misma.

6. Un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ I D NO: 4 o una secuencia de aminoácido sustitu ida en forma conservadora de la misma.

7. El polipeptido de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, que tiene actividad de alcanoil-CoA.

8. Un vector, construcción o sistema de expresión que comprende la molécula de ácido n ucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4.

9. Una célula huésped transformada con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4.

10. Un proceso para sintetizar un alcanoil-CoA q ue comprende: hacer reaccionar ácido carboxílico con CoA en la presencia del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7.

1 1 . El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el ácido carboxílico tiene de 2 a 1 0 átomos de carbono.

12. El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el alcanoil-CoA comprende hexanoil-CoA.

13. U n proceso para alterar los niveles de compuestos canabinoides en un organismo, célula o tejido, en donde el proceso comprende utilizar la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 4, o u na parte del mismo, para silenciar en el organismo, célula o tejido un gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de un alcanoil-CoA, en comparación con una variedad similar de un organismo, celula o tejido crecido bajo cond iciones similares pero sin el uso de la molécula de ácido nucleico para silenciación .

14. U n proceso para alterar los niveles de compuestos canabinoides en un organismo, célula o tejido que comprende la mutación de genes en el organismo, célula o tejido, y utilizar la molécula de ácido n ucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 4, para seleccionar organismos, células o tejidos q ue contienen mutantes o variantes de u n gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de una alcanoil-CoA.

1 5. U n proceso para alterar los niveles de compuestos canabinoides en un organismo, célula o tej ido que comprende expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 en el organismo, célula o tejido, en comparación con una variedad similar del organismo, célula o tejido crecida bajo condiciones similar pero sin la expresión o sobre-expresión de la molécula de ácido nucleico exógena .

16. U n proceso para alterar los niveles de compuestos canabinoides en un organismo, célula o tejido que comprende expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7 en el organismo, célula o tejido, en comparación con u na variedad similar del organismo, célula o tejido crecidos bajo condiciones similares pero sin expresar o sobreexpresar la molecula de ácido nucleico exógena.

17. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 5 o 16, en donde se incrementa el nivel de compuesto canabinoide.

18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en donde se disminuye el nivel de compuesto canabinoide.

19. Un proceso para sintetizar un compuesto canabinoide de origen natural o un análogo que no es de origen natural de un compuesto canabinoide en un organismo, célula o tejido en donde el proceso comprende expresar la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualqu iera de las reivindicaciones 1 o 4 en el organismo, célula o tejido en la presencia de un ácido carboxílico y CoA.

20. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a 19, en donde el organismo, célula o tejido es de un microorganismo.

21 . El proceso de conformidad con la reivindicación 20, en donde el microorganismo es levadura Saccharomyces cerevisiae o E. coli.

22. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 21 , en donde la molécula de ácido nucleico se expresa o sobreexpresa en combinación con la expresión o sobre-expresión de u no o más de otros ácidos nucleicos que codifican una o más enzimas en una trayectoria biosintética canabinoide.

23. El proceso de acuerdo con la reivindicación 22 , en donde la una o más enzimas en una trayectoria biosintetica canabinoide es una o más de una sintasa de ácido olivetólico, u na sintasa de policétido tipo I I I , una cielasa de policétido, una feniltransferasa aromática o una oxidociclasa que forma canabinoide

24. El proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la una u no o más enzimas en u na trayectoria biosintética canabinoide, es una o más de una sintasa de policétido/sintasa de olivetol tipo I I I , una geraniltransferasa de geranilpirofosfato:olivetolato, una sintasa de ácido D9-tetrah idrocanabinólico, una sintasa de ácido canabidiólico o u na sintasa de ácido canabicroménico.

25. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 24, en donde el compuesto canabinoide es uno o más de ácido canabigerólico, ácido D9-tetrahid rocanabinólico, ácido canabidiólico, ácido canabicroménico, ácido A9-tetrahidrocanabinol , canabidiol o canabicromeno o u n análogo de los mismos, que comprende una cadena lateral de 1 a 9 átomos de carbono de longitud .

26. U n proceso para sintetizar u na alcanoil-CoA en una reacción libre de células in vitro, en donde el proceso comprende: reaccionar un ácido carboxílico con la coenzima A a través de la acción del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7. RES UM EN Polipeptidos que tienen actividad alcanoil-CoA han sido identificados y caracterizados, como teniendo ácidos n ucleicos q ue codifican estos polipéptidos. La expresión o sobre-expresión de los ácidos nucleicos altera los niveles de compuestos canabinoides en los organismos. Los polipéptidos pueden ser utilizados in vivo o in vitro para producir compuestos canabinoides.