JP2014521311A - アルカノイル−ｃｏａ合成のための遺伝子およびタンパク質 - Google Patents

アルカノイル−ｃｏａ合成のための遺伝子およびタンパク質 Download PDF

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Abstract

アルカノイル−ＣｏＡ活性を有するポリペプチドが同定され特徴付けられ、これらのポリペプチドをコードする核酸を有する。核酸の発現または過剰発現は生物でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する。ポリペプチドはインビボまたはインビトロでカンナビノイド化合物を生産するために用いることができる。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年７月１３日に出願された米国仮出願シリアルナンバーＵＳＳＮ６１／５０７，３３１号明細書の利益を主張し、その全ての内容が参照することにより本発明に組み込まれる。
発明の背景
発明の分野
本発明は、アルカノイル−ＣＯＡチオエステルの合成に関わる核酸分子およびタンパク質、ならびに植物、微生物でのまたは非細胞系でのカンナビノイド生合成を作るためおよび増強されたまたは減少されたカンナビノイド含有量のカンナビス植物を創出するための核酸分子およびタンパク質の使用に関する。
発明の背景
カンナビス・サティバＬ．（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）（カンナビス、大麻、マリファナ）は最も古い最も多目的な栽培植物の一つであり、今日では、薬品、食品、化粧品、工業製品の原料としての使用が知られている。精神活性カンナビノイド（例えば、Δ９−テトラヒドロカンナビノール、Δ９−ＴＨＣ）というその含有物のために違法薬物としてのその使用も周知である。哺乳類のカンナビノイド受容体を介して作用するカンナビノイドおよびその他の薬物は、慢性疼痛、多発性硬化症およびてんかんなど様々な症状の治療を目的として研究されている。
カンナビノイドは、その生合成起源をポリケチドおよびテルペノイド代謝の両方に有し、テルペノフェノリックポリケチドまたはプレニル化ポリケチドと呼ばれる(Page J., Nagel J. (2006) Biosynthesis of terpenophenolics in hop and cannabis. In JT Romeo, ed, Integrative Plant Biochemistry, Vol. 40. Elsevier, Oxford, pp 179-210.)。カンナビノイド生合成は最初に高密度で雌花を覆う腺状トリコーム（glandular trichomes）で生じる。カンナビノイドは、ポリケチド形成、芳香族プレニル化、環化の３つの工程により形成される（図１参照）。
カンナビノイド生合成で最初の酵素工程は、ポリケチド合成酵素によるオリベトール酸の形成であり、これはマロニル−ＣｏＡ３分子によりヘキサノイル−コエンザイムＡ（ＣｏＡ）の縮合を触媒する。Δ９−テトラヒドロカンナビノール酸およびカンナビジオール酸などの主要なカンナビノイドは、ヘキサノイル−ＣｏＡ前駆体から形成され、それは中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡである（図１参照）。異なる側鎖を有する他のカンナビノイドは、異なる長さの脂肪族−ＣｏＡから形成される（例えば、Δ９−テトラヒドロカンナビバリニック酸はｎ−ブチリル−ＣｏＡプライマーから形成される）。
植物でのヘキサノイル−ＣｏＡおよび他のアシル−ＣｏＡチオエステルは、ＡＴＰを用いてカルボン酸基質の活性化を触媒するアシル活性化酵素（ＡＡＥ、アシル−ＣｏＡシンテターゼとも呼ばれる）により合成される。これらの酵素は、短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸および極長鎖脂肪酸などの多様なカルボキシレート酸、ジャスモネート前駆体、フェニルプロパノイド誘導酸（例えば、ケイ皮酸）およびマロネート、アセテートおよびシトレートなどの他の有機酸上で作用する。天然ですでに同定されている中鎖アシルＣｏＡシンテターゼはほとんどない。植物では、シロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）由来の３つの酵素（ＡＡＥ７、Ａｔ４ｇ０５１６０およびＡｔ５ｇ６３３８０）はヘキサノエートからヘキサノイル−ＣｏＡを形成することが示されている(Schneider K et al. (2005) A new type of peroxisomal acyl-coenzyme A synthetase from Arabidopsis thaliana has the catalytic capacity to activate biosynthetic precursors of jasmonic acid. The Journal of Biological Chemistry 280:13962-72; Shockey JM, Fulda MS, Browse J (2003) Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes. Phylogenetic and biochemical analysis reveals a new class of acyl-coenzyme a synthetases. Plant Physiology 132:1065-76.)。シュードモナスの一種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）由来のアシル−ＣｏＡシンテターゼはヘキサノエートなどの中鎖脂肪酸上で作用することが示されている(Fernandez-Valverde M, Reglero A, Martinez-Blanco H, Luengo JM (1993) Purification of Pseudomonas putida acyl coenzyme A ligase active with a range of aliphatic and aromatic substrates. Applied Environmental Microbiology 59:1149-1154.)。
カンナビノイドは有益な天然産物である。カンナビノイド生合成に関わる酵素をコードする遺伝子は、カンナビノイドの代謝工学において標的突然変異誘発（例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ）または他の遺伝子ノックアウト技法によるＴＨＣＡおよび他のカンナビノイドを極めて低いレベル、またはゼロレベルで含む植物を生産するために有用であろう。このような遺伝子はまた、カンナビノイドベース医薬の製造のための特定のカンナビス品種のマーカーアシスト選抜による創出のため、または細菌もしくは酵母などの異種生物でのカンナビノイド生合成の再構築のため、または組み換えタンパク質を利用する非細胞系でのカンナビノイド製造に有用であることがわかるだろう。
カンナビノイド生合成の酵素をコードする遺伝子はカンナビノイドアナログの合成およびカンナビノイド前駆体アナログの合成においても有用であろう。カンナビノイドアナログは既に合成されており、医薬品として有用であろう。
当技術分野では芳香族ポリケチドの合成に関わる酵素および前記酵素をコードするヌクレオチド配列を同定する必要が依然として残されている。
カンナビス由来の２つの新規な遺伝子が発見され、それは以前知られていなかったアルカノイル−ＣｏＡシンテターゼをコードする。これらの２つの新規なアルカノイルＣｏＡ−シンテターゼは本明細書ではカンナビス・サティバ ヘキサノイル−ＣｏＡシンテターゼ１（ＣｓＨＣＳ１）およびカンナビス・サティバ ヘキサノイル−ＣｏＡシンテターゼ２（ＣｓＨＣＳ２）という。
従って本発明の第１の面では、配列番号１と少なくとも７５％配列同一性を有するヌクレオチド配列またはそのコドン縮重配列を含んでなる単離されたまたは精製された核酸分子が提供される。
本発明の第２の面では、配列番号３と少なくとも７５％配列同一性を有するヌクレオチド配列またはそのコドン縮重配列を含んでなる単離されたまたは精製された核酸分子が提供される。
本発明の第３の面では、配列番号２と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列またはその保存的置換アミノ酸配列を含んでなる単離されたまたは精製されたポリペプチドが提供される。
本発明の第４の面では、配列番号４と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列またはその保存的置換アミノ酸配列を含んでなる単離されたまたは精製されたポリペプチドが提供される。
本発明の第５の面では、本発明の核酸分子を含んでなるベクター、構築物または発現系が提供される。
本発明の第６の面では、本発明の核酸分子により形質転換された宿主細胞が提供される。
本発明の第７の面では、本発明の酵素の存在下でアルカノイル−ＣｏＡを合成する方法が提供される。
本発明の第８の面では、本発明の核酸分子またはその一部を用いて、生物、細胞または組織でのアルカノイル−ＣｏＡの合成を触媒する酵素をコードする遺伝子を抑制することを含んでなる、生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法が提供される。
本発明の第９の面では、生物、細胞または組織での遺伝子を変異させ、かつ本発明の核酸分子またはその一部を用いて、アルカノイル−ＣｏＡの合成を触媒する酵素をコードする遺伝子の変異体またはバリアントを含む生物、細胞または組織を選択することを含んでなる、生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法が提供される。
本発明の第１０の面では、生物、細胞または組織で、本発明の核酸分子を発現または過剰発現させる以外は類似の条件下で育てられた該生物、細胞または組織の類似の異種と比較して、本発明の核酸分子を発現または過剰発現させることを含んでなる、生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法が提供される。
本発明の第１１の面では、生物、細胞または組織で、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を発現または過剰発現させる以外は類似の条件下で育てられた該生物、細胞または組織の類似の異種と比較して、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を発現または過剰発現させることを含んでなる、生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法が提供される。
本発明の第１２の面では、生物、細胞または組織でのカルボン酸およびＣｏＡ存在下で本発明の核酸分子を発現させることを含んでなる生物、細胞または組織での自然に生じるカンナビノイド化合物またはカンナビノイド化合物の非天然アナログを合成する方法が提供される。
本発明の第１３の面では、インビトロ非細胞反応でのアルカノイル−ＣｏＡを合成する方法が提供され、前記方法は本発明の酵素の存在下でコエンザイムＡとカルボン酸を反応させることを含んでなる。
アルカノイル−ＣｏＡの合成を触媒する酵素であるポリペプチドおよび前記酵素をコードするヌクレオチド配列は今般同定され特徴づけられた。ヌクレオチド配列は、選択または遺伝子操作を介して、カンナビノイド化合物、カンナビノイド化合物のアナログ、またはその混合物を過剰生産または過少生産するカンナビス植物の創出に用いることができる。これらのヌクレオチド配列はまた、単独またはカンナビノイド合成経路の別の工程をコードする遺伝子と組み合わせて用い、他の植物または微生物（例えば、酵母、細菌、カビ）または他の原核生物または真核生物または非細胞系でのカンナビノイド生合成を作ることができる。さらに、カンナビスでのこれらの遺伝子の発現を遮断または減少することは、カンナビノイド生合成を遮断しそれによりカンナビノイドの生産を減少することに用いることができる。
本発明の更なる特性は、以下の詳細な説明の過程に記載されるまたは明らかであろう。
本発明をより明らかに理解するために、本明細書の実施態様は添付する図面を参照して実施例の方法により詳細に説明するだろう。
図１はカンナビス・サティバの主要なカンナビノイドタイプを導く予定経路を表す。略語：ＴＨＣＡシンターゼはΔ９−テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼである；ＣＢＤＡシンターゼはカンナビジオール酸シンターゼである；ＣＢＣＡシンターゼはカンナビクロメン酸シンターゼである。 図２Ａ〜２Ｆは、カンナビス・サティバ ヘキサノイル−ＣｏＡシンターゼの酵素活性の液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析を表す。各図２Ａ〜２Ｆは、縦軸にイオンアバンダンス（ｍ／ｚ８６６＞３５９）、横軸に時間（分）を示す。図２Ａおよび２Ｂは真正ヘキサノイル−ＣｏＡスタンダードの保持時間を示す。図２Ｃは、ＣｓＨＣＳ１タンパク質、ＣｏＡ、ＭｇＣｌ２、ヘキサン酸ナトリウム、ＡＴＰおよびＨＥＰＥＳ緩衝液のアッセイを示し、ヘキサノイル−ＣｏＡが産出され検出されたことを示す。図２Ｄは、ＣｓＨＣＳ２タンパク質、ＣｏＡ、ＭｇＣｌ２、ヘキサン酸ナトリウム、ＡＴＰおよびＨＥＰＥＳ緩衝液のアッセイを示し、ヘキサノイル−ＣｏＡが産生されたことを示す。図２Ｅは、事前に９５℃１５分で煮沸することにより不活化されたＣｓＨＣＳ１タンパク質、ＣｏＡ、ヘキサン酸ナトリウム、ＡＴＰおよびＨＥＰＥＳ緩衝液のアッセイを示し、ヘキサノイル−ＣｏＡが産生されなかったことを示す。図２Ｆは、事前に９５℃１５分で煮沸することにより不活化されたＣｓＨＣＳ２タンパク質、ＣｏＡ、ヘキサン酸ナトリウム、ＡＴＰおよびＨＥＰＥＳ緩衝液のアッセイを示し、ヘキサノイル−ＣｏＡが産出されなかったことを示す。 図３は本発明の酵素により利用されるカルボン酸基質を説明する２つのグラフを表す。図３ＡはＣｓＨＣＳ１により利用されるカルボン酸基質を表す。図３ＢはＣｓＨＣＳ２により利用されるカルボン酸基質を表す。 図４は、カンナビス・サティバ ヘキサノイル−ＣｏＡシンテターゼＣｓＨＣＳ２、マロニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＭＣＳ）、カンナビス・サティバ「オリベトールシンターゼ」／ポリケチドシンターゼ、およびカンナビス・サティバ オリベトール酸シンターゼからなる共役酵素分析による生産物の高速液体クロマトグラフィー分析を表す。溶出化合は２６３ｎｍの吸光度により検出され単離されたスタンダードと比較して同じ保持時間を有することおよびシングル四重極質量検出器を用いてそれらの質量により特定される。オリベトールおよびオリベトール酸の検出は、ＣｓＨＣＳ２がオリベトール酸の合成のための十分なヘキサノイル−ＣｏＡ基質が提供できることを意味する。ＣｓＨＣＳ２、ＣｏＡまたはヘキサノエートを欠くアッセイはいかなるポリケチド産物も産生しなかった。ＨＴＡＬ＝ヘキサノイル三酢酸ラクトン(hexanoyltriacetic lactone）、ＰＤＡＬ＝ペンチル二酢酸ラクトン(pentyldiacetic lactone)、ＯＡ＝オリベトール酸、ＯＬ＝オリベトール。 図５は、ヘキサノイル−ＣｏＡを合成するためのＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２と、オリベトール酸を形成するための「オリベトールシンターゼ」／ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）およびオリベトール酸シンターゼ（ＯＡＳ）の融合物とを用いることによって、オリベトール酸を産生するように作られた酵母細胞でのオリベトール産生を示すグラフを表す。 図６は、大麻品種「フィオナ(Fiona)」の様々な組織でのＣｓＨＣＳ１、ＣｓＨＣＳ２およびＣＢＤＡシンターゼ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を表す。アクチンに対する遺伝子発現値を葉と比較した倍率差異として表し、葉の発現として１の値を割り当てた。挿入画はトリコームを有するまたは有さない雌花での遺伝子発現を表し、値はまた葉と比較した倍率差異として示した。Ｒは根；Ｓは茎；Ｌは葉；ＦＦ＋はトリコームを有する雌花；ＦＦ−はＢｅａｄｂｅａｔｅｒ方法により取り除いたトリコームを有する雌花；Ｔはトリコーム；ＭＦは雄花。値は平均±ＳＤであり、ｎ＝３である。
発明の具体的説明
好ましい実施態様の説明
トリコーム特異的ｃＤＮＡライブラリ デオムカンナビス(deom cannabis)をシークエンスし、４１１３個のユニーク配列（１２２７個のコンティグ、２８８６個のシングルトン）を設計する９１５７個の発現配列タグ（「ＥＳＴ」）を作出した。Ｕｎｉｇｅｎｅｓをオンライン検索およびｂｌａｓｔｘと呼ばれる比較ツールを用いてＵｎｉＰｒｏｔTMタンパク質データベースとの比較により注釈付けた。カンナビス アシル活性化酵素タンパク質をシロイズナズナ アシル活性化酵素配列を利用することにより同定し、オンライン検索およびｔｂｌａｓｔｎと呼ばれる比較ツールを用いて設計したカンナビスＥＳＴをクエリした。１１個のアシル活性化酵素が同定され、ｃＤＮＡライブラリでのそれらの転写物量に準じて名前を付けた。ＣｓＨＣＳ１は転写レベルに基づく最も豊富なアシル活性化酵素（４２ＥＳＴ）であり、ＣｓＨＣＳ２はより低い量（５ＥＳＴｓ）を有した。トリコームでのその高い転写レベルおよび細胞質へのＣｓＨＣＳ１の局在性からこの酵素はカンナビノイド経路へのヘキサノイル−ＣｏＡの供給に関わるアシル活性化酵素であるように考えられる。ＣｓＨＣＳ２はペルオキシソームに局在し、おそらくカンナビノイド形成には関与しない。しかしながらその動力学的性質により異種宿主でのまたは非細胞系でのヘキサノイル−ＣｏＡ合成のための有用な酵素となる。
ＣｓＨＣＳ１遺伝子の配列は下記の通りである。
カンナビス・サティバ ＣｓＨＣＳ１−２１６３ｂｐ（配列番号１）
ＣｓＨＣＳ２遺伝子の配列は下記の通りである。
カンナビス・サティバ ＣｓＨＣＳ２−１５４７ｂｐ（配列番号３）
ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２を実施例１の記載のとおりにＰＣＲ増幅し、アルカノイル−ＣｏＡシンテターゼまたはＣｏＡ−リガーゼ活性を実施例２の記載のとおりに測定した。図２に示されるようにＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２はカルボン酸およびＣｏＡからアルカノイル−ＣｏＡの生産を触媒する。
本発明の幾つかの実施態様は、配列番号１を有するあるいは配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一性を有する単離されたまたは精製された核酸分子に関する。
本発明の幾つかの実施態様は、配列番号３を有するあるいは配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一性を有する単離されたまたは精製された核酸分子に関する。
上記核酸配列にハイブリダイズする核酸分子もさらに含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、本発明の酵素をコードする核酸分子と少なくとも９０％、９５％または９７％配列同一性がある場合にハイブリダイゼーションが生じる点でストリンジェントである。ストリンジェント条件としては、例えば、４２℃で一晩、５０％フォルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液(Denhardt's solution)、１０％硫酸デキストラン、および変性し断片化させたサーモン精子ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌを有する溶液でインキュベーションした後、約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中でハイブリダイゼーション支持物を洗浄するなど、既知のサザンハイブリダイゼーションで用いられるものも挙げることができる。他の既知のハイブリダイゼーション条件は周知であり、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)に記載されている。
熟練した実践者に理解されるように、核酸配列での微々たる変化はコードするポリペプチドのアミノ酸配列を必ずしも変更しない。コードするポリペプチドのアミノ酸配列を変化する特定の遺伝子配列でのヌクレオチドの同一性の変化により遺伝子の減少されたまたは増強された効果を引き起こすことができ、かつ、幾つかの用途（例えば、アンチセンス、コサプレッションまたはＲＮＡｉ）では一部分の配列がフルレングスバージョンとして有効にしばしば働くことは当業者により理解されるであろう。変更された遺伝子の効果を試験する方法としてヌクレオチド配列を変化しあるいは短くできるという方法は当業者に周知である。ある実施態様では、効果を、例えば従来のガスクロマトグラフィーにより容易に試験することができる。従って全てのこのような遺伝子の変形物は、本発明の開示の一部として含まれる。
当業者により理解されるように、上記核酸分子の長さは目的とする用途に依存するであろう。例えば、例えばＰＣＲ増幅またはライブラリのスクリーニングのためのプライマーまたはプローブとして使用する場合、核酸分子の長さはフルレングス配列よりも小さく、例えば１５〜５０ヌクレオチドであろう。これらの実施態様では、プライマーまたはプローブは、核酸配列の高保存領域と実質的に同一である、あるいはＤＮＡ配列の５’または３’末端のいずれかと実質的に同一であろう。幾つかの場合、これらのプライマーまたはプローブは「実質的に同一」であるが未だ配列認識での柔軟性を提供するように幾つかの位置でのユニバーサル塩基を使用できる。適切なプライマーおよびプローブハイブリダイゼーション条件は当技術分野で周知であることに留意する。
本発明はまた酵素ＣｓＨＣＳ１も含む。ＣｓＨＣＳ１のアミノ酸配列（配列番号２）は、
である。
幾つかの実施態様は、配列番号２を有するあるいは配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一性を有する単離されたまたは精製されたポリペプチドに関する。
本発明はまた酵素ＣｓＨＣＳ２も含む。ＣｓＨＣＳ２のアミノ酸配列（配列番号４）は、
である。
幾つかの実施態様は、配列番号４を有するあるいは配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一性を有する単離されたまたは精製されたポリペプチドに関する。
幾つかの実施態様は、配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１もしくは配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一性の配列を有する単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドを含むベクター、構築物または発現系に関する。その上、センスまたはアンチセンス方向での配列または部分配列またはその相補配列を細胞に導入するための前記配列またはその一部を含むベクター、構築物または発現系の製造方法が提供される。
幾つかの実施態様では、単離されたおよび／または精製された核酸分子、またはこれらの単離されたおよび／または精製された核酸分子を含んでなるベクター、構築物もしくは発現系は、芳香族ポリケチドの合成を触媒するポリペプチドを産生するトランスジェニック生物または生物の細胞を創出するために用いることができる。従って、一つの実施態様は、配列番号１もしくは配列番号３を有するあるいは配列番号１もしくは配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一性を有する単離されたおよび／または精製された核酸分子を含んでなるトランスジェニック生物、生物の細胞または胚組織に関する。
好ましくは、生物は植物、微生物または昆虫である。植物は好ましくはカンナビス属であり、例えば、カンナビス・サティバＬ．、カンナビス・インディカＬａｍ．(Cannabis indica Lam.)およびカンナビス・ルデラリス(Cannabis ruderalis)Ｊａｎｉｓｃｈ．である。特に好ましくはカンナビス・サティバである。微生物は好ましくは細菌（例えば大腸菌）または酵母（例えば、サッカロマイセス・セルビジエ(Saccharomyces cerevisiae)である。昆虫は好ましくは、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)である。
この実施態様の生物、細胞および胚組織は、変更されたレベルのカンナビノイド化合物を有するだろう。図１を参照して、本発明の核酸分子の発現または過剰発現によって、ヘキサノイル−ＣｏＡの合成を触媒する酵素の発現または過剰発現が起こり、ヘキサノイル−ＣｏＡを他の酵素と組み合わせると、カンナビゲロール酸(cannabigerolic acid)（ＣＢＧＡ）、Δ９−テトラヒロドカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、Δ９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）などのようなカンナビノイド化合物の産生または増加された産生を引き起こすことができることは当業者であれば理解できるだろう。同様に、使用する基質に依存して、本発明の核酸分子の発現または過剰発現により生じるヘキサノイル−ＣｏＡの合成を触媒する酵素の発現または過剰発現はカンナビノイド化合物のアナログ、または前記化合物の前駆体のアナログの産生または増加された産生を引き起こすだろう。
生物、細胞または組織での遺伝子の抑制(Silencing)は、酵素の発現下では、ヘキサン酸（６炭素）、オクタン酸（８炭素）、ノナン酸（９炭素）、吉草酸（５炭素）、ヘプタン酸（７炭素）または他のカルボン酸など前駆体の蓄積、および／またはＴＨＣＡ（ＴＨＣの前駆体）またはＣＢＤＡ（ＣＢＤの前駆体）などのカンナビノイドの減少を引き起こすだろう。
本発明は、発現または過剰発現された本発明の外因性酵素以外は同様の条件下で育てられた生物、細胞または組織の類似の異種と比較して、生物、細胞または生物、細胞または組織で本発明の外因性酵素を発現または過剰発現させることによる、生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法を含む。
本発明の核酸分子の発現または過剰発現は、カンナビノイド生合成経路の一以上の酵素をコードする一以上の他の核酸の発現または過剰発現と組み合わせて行われてもよい。他の核酸の幾つかの例としては、３型ポリケチドシンターゼ、ポリケチドシクラーゼ、芳香族ペンチルトランスフェラーゼおよびカンナビノイド形成オキシドシラーゼ(oxidocylase)をコードする核酸が挙げられる。これらの酵素の特定の例としては、「オリベトールシンターゼ」／ポリケチドシンターゼ、オリベトール酸シンターゼ、ゲラニルピロリン酸：オリベトレート ゲラニルトランスフェラーゼ、Δ９−テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ、カンナビジオール酸シンターゼまたはカンナビクロメン酸シンターゼが挙げられる。本発明の酵素ポリペプチドの存在下でのアルカノイル−ＣｏＡの合成は、インビボまたはインビトロで成し遂げられてもよい。前述したようにインビボでの前記合成は生物、細胞または組織での本発明の核酸分子の発現または過剰発現により成し遂げられてもよい。
インビトロでのアルカノイル−ＣｏＡの合成は非細胞系で行うことができる。インビトロ非細胞系の部分として、カルボン酸および本発明の酵素を適切な反応容器で一緒に混合し、反応をもたらしてもよい。
インビトロでは、本発明のポリペプチドを前駆体からカンナビノイド化合物の完全合成をもたらす他の酵素と組み合わせて用いてもよい。例えば、このような他の酵素は、図１に記載されているようにカンナビノイド生合成経路に関与してもよい（例えば、「オリベトールシンターゼ／ＰＫＳ、オリベトール酸シンターゼ、芳香族プレニルトランスフェラーゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、ＣＢＣＡシンターゼ）。
本発明のポリペプチドはインビボまたはインビトロで宿主種では自然に生じないカンナビノイド化合物のアナログを合成するために用いてもよい。このようなアナログは、植物での天然のカンナビノイド化合物を産生するために用いられる以外のカルボン酸化合物を用いて産生することができる。例えば、酢酸、酪酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソ吉草酸などの分岐鎖酸、およびケイ皮酸などヒドロキシケイ皮酸である。
用語
開示の様々な実施態様の見直しを容易にするため以下の特定用語の説明を提供する。
アルカノイル−ＣｏＡ：アルカノイル−ＣｏＡは、スルフィド架橋を介してカルボニル基の炭素原子に結合しているコエンザイムＡ部分を有する脂肪族カルボニル化合物である。好ましくは、アルカノイル−ＣｏＡ化合物は該化合物の脂肪族カルボニル部分に２〜１０個の炭素原子を含んでなる。より好ましくは、アルカノイル−ＣｏＡはＣｏＡ−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３であり、ｎは０〜８の整数である。アルカノイル−ＣｏＡ化合物の幾つかの例は、アセチル−ＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ、ヘキサノイル−ＣｏＡおよびオクタノイル−ＣｏＡである。アセチル−ＣｏＡの使用はメチル側鎖を提供し、芳香族ポリケチドを生じ、ブチリル−ＣｏＡの使用はプロピル側鎖を提供し、ヘキサノイル−ＣｏＡの使用はペンチル側鎖を提供する。ヘキサノイル−ＣｏＡは特に好ましい。より短い側鎖を有するカンナビノイドはカンナビスに存在する（例えば、ＴＨＣＡのペンチル側鎖の代わりにプロピル側鎖を有するテトラヒドロカンナビ吉草酸）。
コドン縮重：当業者は理解でき、かつ、表１に説明されるため本明細書がコドン使用の縮合を包含することは理解されるだろう。
相補性ヌクレオチド配列：配列の「相補性ヌクレオチド配列」は、核酸分子のヌクレオチドが本明細書で記載されている配列の核酸分子に対して相補的であり、その方向は反対（アンチパラレル配列）である核酸分子を意味すると理解される。
保存的置換：保存的置換はポリペプチドの三次元構造または機能を妨害することなくポリペプチドのアミノ酸配列で行われることを当業者により理解されるだろう。従って、本発明は保存的置換されたＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２を含んでなるポリペプチドを含む。保存的置換は、当業者により類似な疎水性、極性およびＲ鎖長を有するアミノ酸ともう一方とを置換することにより遂行される。さらに、異なる種由来のホモログタンパク質のアラインされた配列を比較することによって、タンパク質をコードする基礎機能を変更することなく種間で変異された局在アミノ酸残基により保存的置換を特定してもよい。表２は保存的置換の典型的なリストを提供する。
配列相同性の度または割合：「配列相同性の度または割合」という用語は、最適アライメント後の二つの配列の間の配列同一性の度または割合を指す。
単離されたおよび／または精製された配列のホモログ：「単離されたおよび／または精製された配列のホモログ」は、ヌクレオチド配列の塩基、またはポリペプチド配列のアミノ酸と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％または９９．７％の同一性の割合を有する単離されたおよび／または精製された配列意味すると理解される。この割合は単に統計によるものであり、ランダムにおよびそれらの長さの全てでの二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の差を分配することができる。
増加する、減少する、調節する、変更するなど：当業者により理解されるように、前記用語は、増加、減少、調節または変更を生じることのない類似の条件下で育てられた類似の異種または株との比較を指す。幾つかの場合、これは非形質転換コントロール、モック(mock)形質転換コントロール、またはベクター形質転換コントロールである。
単離された：当業者に理解されるように、「単離された」は、自然環境から単離されたポリペプチドまたは核酸を指す。
ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸配列：「ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸配列」は、単量体または二量体（いわゆるタンデム）形態での二本鎖または一本鎖の両方およびその転写産物を意味することが理解されるだろう。
配列同一性：２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列は、後述する最大一致のアライメントを行った際、２つの配列でのアミノ酸またはヌクレオチドの配列が同じ場合「同一」といわれる。配列同一性の割合（または同一度）は、比較ウィンドウを通して２つの最適アライメントした配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウではペプチドまたはポリヌクレオチド配列の部分が、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して二つの配列の最適アライメントについて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。割合は、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両方の配列で生じる位置の数を決定し、一致する位置の数を得て、比較ウィンドウでの位置の全ての数により一致する位置の数を割り、結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより算出される。
比較のための配列の最適アライメントは、Smith and Waterman, Ad. App. Math 2: 482 (1981)の局所相同アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)の類似の方法の検索により、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.でのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる遂行により、または外観検査により行うことができる。
前述した配列同一性の定義は、当業者により用いられる定義である。それ自体の定義はいかなるアルゴリズムの助けも必要とせず、前記アルゴリズムは配列同一性の算出よりはむしろ配列の最適アライメントを得るためにのみ有用である。
前述した定義から、２つの比較された配列の間には明確に定義されたただ一つの値があり、その値は最高のまたは最適なアライメントについて得られた値と対応することが理解される。
ストリンジェントハイブリダイゼーション：ヌクレオチド配列とストリンジェンシーな条件下でのハイブリダイゼーションは、相補性核酸分子の２つの断片間のハイブリダイゼーションを維持することができる方法で選択された温度およびイオン強度の条件下でのハイブリダイゼーションを意味することが理解される。
他の生物、例えば植物から得られた本明細書に記載の新規遺伝子のホモログは、ホモログを含む適切なライブラリをスクリーニングすることにより得ることができ、スクリーニングは本発明の特定の遺伝子のヌクレオチド配列、そのタンパク質またはプローブを用いて行われるか、あるいはＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの配列アライメント検索プログラムを用いて検索された配列相同性により特定される。
核酸単離およびクローニングは確立されている。同様に、単離された遺伝子は当業者に周知な従来技術によりベクターに挿入され、細胞に形質転換されてもよい。核酸分子は生物に形質転換されてもよい。当技術で知られているように、遺伝子、ベクター、構築物および発現系を生物に導入することができる多数の方法があり、形質転換と組織培養手法との組合せはトランスジェニック生物を創出するための有効な戦略にうまく組み込まれている。本発明で用いることができるこれらの方法は文献(Potrykus I (1991) Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and results. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225; Vasil I K (1994) Molecular improvement of cereals. Plant Mol. Biol. 25: 925-937. Walden R, Wingender R (1995) Gene-transfer and plant regeneration techniques. Trends in Biotechnology 13: 324-331; Songstad DD, Somers DA, Griesbach RJ (1995) Advances in alternative DNA delivery techniques. Plant Cell Tissue Organ Cult. 40:1-15)に記載されており、当業者に周知である。
適切なベクターは当業者に周知であり、Pouwels et al., Cloning Vectors. A Laboratory Manual, Elsevier, Amsterdam (1986)などの一般技術参照に記載されている。特に適切なベクターとして、Ｔｉプラスミドベクターが挙げられる。例えば、当業者であれば、真空湿潤(Bechtold N, Ellis J, Pelletier G (1993) In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C R Acad Sci Paris, Sciences de la vie/Life sciences 316: 1194-1199.)または有傷接種(Katavic V, Haughn GW, Reed D, Martin M, Kunst L (1994) In planta transformation of Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 245: 363-370.)によるシロイヌナズナの形質転換を介在するアグロバクテリウム(Agrobacterium)に加えて、アグロバクテリウムＴｉ−プラスミド介在形質転換（例えば、胚軸(DeBlock M, DeBrouwer D, Tenning P (1989) Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol. 91: 694-701)または子葉柄(cotyledonary petiole)(Moloney MM, Walker JM, Sharma KK (1989) High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Cell Rep. 8: 238-242.)、
創傷感染、パーティクルガン(particle bombardment/biolistic)法(Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N (1987) Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process. J. Part. Sci. Technol. 5: 27-37.)またはポリエチレングリコールアシストプロトプラスト形質転換法(Rhodes CA, Pierce DA, Mettler IJ, Mascarenhas D, Detmer JJ (1988) Genetically transformed maize plants from protoplasts. Science 240: 204-207)を用いることで他の植物種での形質転換が同じくらい可能であることに確実に留意するだろう。
当業者に明らかであり文献(Meyer P (1995) Understanding and controlling transgene expression. Trends in Biotechnology 13: 332-337; Datla R, Anderson JW, Selvaraj G (1997) Plant promoters for transgene expression. Biotechnology Annual Review 3: 269-296.)に記載されているように、制御されない（すなわち構成的な）プロモ−ター（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓに基づくもの）を用いて、あるいは、特定の細胞、組織（例えば、発育種子子葉での導入遺伝子の発現のためのＮａｐｉｎプロモーター）、生物（例えば根）、特定の発育段階に、または特定の外部刺激（例えば、熱ショック）の対応において、遺伝子発現を標的できるプロモーターを用いることによって、導入遺伝子発現の目的とするアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに向く核酸分子に動作可能に連結したプロモーターを使用することができる。
本発明で用いられるプロモーターは誘導性であり構成的であり、または組織特異的であってもよく、あるいは前記特性の様々な組合せを有していてもよい。有用なプロモーターとしては、制限されないが、カーネーションエッチドリングウイルスプロモーター（ＣＥＲＶ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、またはより詳細には２つのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターをタンデムで含んでなる２倍強化カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（「ダブル３５Ｓ(Double 35S)」プロモーターと呼ばれる）などの構成的プロモーターが挙げられる。特定の環境では構成的プロモーターの代わりに組織特異的または発生学的に調節されているプロモーターを用いることが望ましいこともある。組織特異的プロモーターは特定の組織では他の組織での発現に影響せずに過剰発現を起こすことができる。
プロモーターおよび終結制御領域は宿主細胞で機能的であり、細胞および遺伝子に対して、異種（すなわち、自然に生じない）またはホモログ（宿主種由来の）であってもよい。
終結制御領域はプロモーターが得られた遺伝子の３’領域由来またはもう一方の遺伝子由来であろう。適切な終結領域としては、当技術分野で周知であるものを用いてもよく、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼターミネーター（Ｔｎｏｓ）、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓマノピンシンターゼターミネーター（Ｔｍａｓ）およびＣａＭＶ３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）が挙げられる。本発明で用いられる特に好ましい終結領域としては、ｐｅａリブロースニリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット終結領域（ＴｒｂｃＳ）またはＴｎｏｓ終結領域が挙げられる。本発明に用いられる遺伝子構築物は、活性について、例えばアグロバクテリウムを介して宿主植物に形質転換し変更されたカンナビノイドレベルをスクリーニングすることによって適切にスクリーニングされるだろう。
本発明の核酸分子またはその断片は天然にカンナビノイド化合物を産生する生物でのカンナビノイド生合成を遮断するために用いることができる。本発明の核酸分子を用いるサイレンシングは当技術分野で一般に知られている多数の方法、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技法、人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ技法、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）技法、アンチセンス技法、センスコサプレッション技法および標的突然変異誘発技法により成し遂げることができる。
ＲＮＡｉ技法としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）プラスミド構築物(Helliwell CA, Waterhouse PM (2005) Constructs and methods for hairpin RNA-mediated gene silencing in plants. Methods Enzymology 392:24-35)を用いる安定な形質転換が挙げられる。このようなプラスミドは、逆位反復構造でサイレンシングされる標的遺伝子の断片から構成される。逆位反復は、スペーサー、しばしばイントロンで区切られている。適切なプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターにより動かされるＲＮＡｉ構築物は植物ゲノムに挿入され、導入遺伝子の後続転写がＲＮＡ分子を導きこれはＲＮＡ分子自体を折り畳み二本鎖ヘアピンＲＮＡを形成する。この二本鎖ＲＮＡ構造は植物により認識され低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる小さなＲＮＡ（約２１ヌクレオチド長）に切断される。ｓｉＲＮＡはタンパク複合体（ＲＩＳＣ）と関連があり、これは標的遺伝子のｍＲＮＡの分解を行う。
人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）技法は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）経路を利用し植物および他の真核生物での異種遺伝子をサイレンシングするように作用する(Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D (2006) Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis. Plant Cell 18:1121-33; Alvarez JP, Pekker I, Goldshmidt A, Blum E, Amsellem Z, Eshed Y (2006) Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species. Plant Cell 18:1134-51)。この方法では、サイレンシングされる遺伝子の２１ヌクレオチド長断片がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ遺伝子に導入され、ｐｒｅ−ａｍｉＲＮＡ構築物を形成する。ｐｒｅ−ａｍｉＲＮＡ構築物は当業者に明かである形質転換方法を用いて生物ゲノムに形質転換される。ｐｒｅ−ａｍｉＲＮＡの転写後、プロセシングにより２１ヌクレオチドａｍｉＲＮＡ配列と同一であるヌクレオチドを共有する標的遺伝子であるａｍｉＲＮＡが得られる。
ＲＮＡｉサイレンシング技法では、二つのファクターが断片の長さの選択に影響できる。断片が短いほど少ない頻度で有効なサイレンシングが得られるが、極めて長いヘアピンは細菌宿主株での組換えの機会を増加する。サイレンシングの有効性は遺伝子依存性により明らかになり標的ｍＲＮＡの利用性または遺伝子が活性である細胞での標的ｍＲＮＡとヘアピンＲＮＡの相対量に反映することができる。１００〜８００ｂｐ、好ましくは３００〜５００ｂｐの断片長が得られるサイレンシングの有効性を最大にするために通常適切である。他に考慮すべき事は標的とされる遺伝子の部分である。領域をコードする５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ断片は同様に良好な結果を挙げて用いることができる。配列相同性に依存するサイレンシングのメカニズムのため、関係するｍＲＮＡ配列のクロスサイレンシングの可能性がある。クロスサイレンシングが望ましくない場所では、５’または３’ＵＴＲなどの他の配列に低い配列類似性を有する領域を選択すべきである。交差相同性サイレンシングを避けるための方法は、構築物と非標的遺伝子配列との間の２０塩基を超える配列同一性ブロックを有さない配列を用いることであるようにみえる。これらと同じ原理の多くは設計されたａｍｉＲＮＡの標的領域の選択に適用する。
ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）技法は、ＲＮＡｉ法の変形であり、植物の内因性抗ウリウス防御を利用する。宿主ＤＮＡの断片を含む組換えＶＩＧＳウイルスでの植物の感染は、標的遺伝子について転写後遺伝子サイレンシングを引き起こす。一つの実施態様では、ＶＩＧＳシステムに基づいてタバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）を本発明のヌクレオチド配列と用いることができる。
アンチセンス技法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを植物に導入することを含み、目的の遺伝子により産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合する。「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と相補的な塩基配列を有し、これは「センス」配列と呼ばれる。ｍＲＮＡのセンスセグメントの活性はアンチセンスｍＲＮＡセグメントにより遮断され、よって遺伝子発現が有効に不活化される。植物での遺伝子サイレンシングへのアンチセンスの適用は、より詳細にはStam M, de Bruin R, van Blokland R, van der Hoorn RA, Mol JN, Kooter JM (2000) Distinct features of post-transcriptional gene silencing by antisense transgenes in single copy and inverted T-DNA repeat loci. Plant J. 21:27-42により記載されている。
センスコサプレッション技法は高発現センス導入遺伝子を植物に導入し導入遺伝子および内因性遺伝子の両方の発現の減少を含む(Depicker A, Montagu MV (1997) Post-transcriptional gene silencing in plants. Curr Opin Cell Biol. 9: 373-82)。効果は、導入遺伝子と内因性遺伝子との間の配列同一性に依存する。
標的突然変異誘発法（例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)および高速中性子爆発を用いた「遺伝子欠失」は生物でのノックアウト遺伝子に用いられている(Henikoff S, Till BJ, Comai L (2004) TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol 135:630-6; Li X, Lassner M, Zhang Y. (2002) Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3: 158-60)。ＴＩＬＬＩＮＧは生殖質または個別細胞を突然変異原で処理し点変異を引き起こすことを含み、これはシングルヌクレオチド変異欠失についての感度の高い方法を用いて標的の遺伝子でみつかる。望ましい変異の検出（例えば、標的の遺伝子産物の不活化を引き起こす変異）は例えばＰＣＲ法により成し遂げられるだろう。例えば、標的遺伝子由来のオリゴヌクレオチドプライマーは調製され、ＰＣＲは突然変異誘発群での生物由来の標的遺伝子領域を増幅するために用いられるだろう。人工変異遺伝子は野生型遺伝子にアニールされ、変異遺伝子と野生型遺伝子との間のミスマッチを見つけることができる。差異の検出は変異遺伝子を有する生物にさかのぼり、それにより変異誘発生物は望ましい発現（例えば、標的遺伝子のサイレンシング）を有することを明らかにすることができる。これらの生物はその後望ましい発現を有する群を生産するために選択育種されてもよい。ＴＩＬＬＩＮＧは、ミスセンスおよびノックアウト変異を含むアレル群を提供することができ、それらは標的遺伝子の減少された発現を示す。ＴＩＬＬＩＮＧは導入遺伝子の導入を含まない遺伝子ノックアウトへの可能な手法として勧められており、よって需用者により利用可能である。高速中性子爆発は生物ゲノムでの変異、例えば欠失を誘導し、これはＴＩＬＬＩＮＧと類似の手法のＰＣＲを用いることで検出できる。
本発明の方法は一以上のカルボン酸存在下の非細胞環境で行うことができることを当業者は理解することができるだろう。
本発明の実施態様は様々な修飾を可能であり、変更形態さらに特定の実施例も本明細書に包含される。よって、本発明の実施態様は開示されている特定の形態に限定されない。
実施例１：ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２の増幅およびクローニング
ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２を 表３に記載のプライマーおよびＰｈｕｓｉｏｎＴＭポリメラーゼ(Finnzymes)を用いてｃＤＮＡプラスミドクローンからＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅産物を精製しｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ ｅｎｔｒｙベクター(Invitrogen)にクローニングした。大腸菌ＴＯＰ１０細胞(Invitrogen)に形質転換した後個々のクローンをシークエンスにより検証した。ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２遺伝子をＬＲリコンビナーゼ(Invitrogen)を用いてｐＨＩＳ８／ＧＷ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターで組換えた。ＬＲ反応産物をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、シークエンスにより検証した。
ｐＨＩＳ８／ＧＷ−ＣｓＨＣＳ１およびｐＨＩＳ８／ＧＷ−ＣｓＨＣＳ２を大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２細胞(Merck)に形質転換した。個別のクローンをクロラムフェニコールおよびカナマイシンを含む液体ＬＢ培地の小スケール培養への植えつぎに用い、それを抗生物質なしの液体ＬＢ培地５００ｍＬへの植え継ぎに用いた。ＯＤ６０００．６まで増殖後、ＩＰＴＧを０．２μＭまで添加することにより発現を誘導した。ＣｓＨＣＳ１発現培養物をその後１２℃で震盪させながら２４時間増殖させる一方ＣｓＨＣＳ２培養物を３７℃で１６時間増殖させた。異なる温度を用いた理由はＣｓＨＣＳ１がより高い温度では溶解性タンパク質を産生しないことが明らかであったためである。
細胞を遠心分離により回収し１０ｍＬのＨｉｓ−標識溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ イミダゾール、１０％ｖ／ｖ グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、および７５０μｇ／ｍＬ リソチーム）に再懸濁した。再懸濁した細胞を氷上で１時間インキュベーションした後超音波により溶解した。２０分、１２，０００ｇ、４℃で遠心分離した後、溶解性タンパク質画分を１６０μＬのＴａｌｏｎ（商標）レジン(Clontech)に加え、これを事前にＨｉｓ−標識洗浄緩衝液（ＨＷＢ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）で洗浄した。試料を優しく揺らしながら４℃でインキュベーションし、その後レジンを遠心分離（７００ｇ、５分）により単離した。レジンをＨＷＢ緩衝液で再懸濁し、優しく揺らしながら４℃で洗浄した後遠心分離した。千住尾工程をその後２回繰返し、再懸濁レジンをクロマトグラフィーカラムに装填し流させた。１０ｍＬのＨＷＢ緩衝液でレジンを洗浄後、Ｈｉｓ−標識プロテインを２．５ｍＬのＨｉｓ−標識溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、１０％ｖ／ｖグリセロール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）を添加することにより溶出させた。溶出物をＰＤ１０カラム(Amersham Biosciences)を用いて保存緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ９、１０％ｖ／ｖグリセロール、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２ｍＭ ジチオトレイトール）に緩衝液交換した。単離されたタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検証し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により決定した。
実施例２：ヘキサノイル−ＣｏＡシンテターゼ活性の分析
ヘキサノイル−ＣｏＡ活性を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ９、８ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣｏＡ、および４ｍＭ ヘキサン酸ナトリウムを含む２０μＬ反応混合物に０．１μｇの酵素を加えることにより測定した。反応を１０分間、４０℃でインキュベーションし、２μＬの１Ｎ ＨＣｌにより終了し、分析まで氷上で保存した。
反応混合物を水で１：１００に希釈し続いてＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ粒径、２．１ｘ５０ｍｍカラム）を取り付けたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ システムを用いて分離し、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａ ｔｒｉｐｌｅ−ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ質量検出器を用いたＭＳ／ＭＳにより解析した。溶媒系は緩衝液Ａ：５ｍＭ ＴＥＡおよび３ｍＭ酢酸／水および緩衝液Ｂ：５ｍＭ ＴＥＡおよび３ｍＭ酢酸／９５：５ メタノール：水を用いた。流出プログラムを表４に示す。質量検出器のセッティングは、ＥＳＩポジティブモード、ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ ２７Ｖ、ｃｏｎｅ １３５Ｖ、８６６＞３５９トランジションを測定。
図２に示すようにＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２はヘキサノエートおよびＣｏＡからヘキサノイルＣｏＡの形成を触媒した。図２Ａおよび２Ｂは真正ヘキサノイル−ＣｏＡスタンダードの溶出物を示す。図２ＣはＣｓＨＣＳ１、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ９、８ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣｏＡ、および４ｍＭヘキサン酸ナトリウムを含んでなる完全分析を示す。真正ヘキサノイル−ＣｏＡスタンダードと同一の質量トランジションと溶出時間を有する化合物は９．２５分で確認できる。図２ＤはＣｓＨＣＳ２、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ９、８ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣｏＡ、および４ｍＭヘキサン酸ナトリウムを含んでなる完全分析を示す。真正ヘキサノイル−ＣｏＡスタンダードと同一の質量トランジションと溶出時間を有する化合物は９．２５分で確認できる。図２Ｅおよび２Ｆは不活化（煮沸した）ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２酵素を有するネガティブコントロールを示す。図２Ｅおよび２Ｆからわかるように、これらの分析はヘキサノイル−ＣｏＡ合成を示さない。
ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２の両方は４０℃およびｐＨ９にそれぞれ温度およびｐＨの最適性を示した。２価陽イオンの範囲の試験では、ＣｓＨＣＳ１はＭｇ２＋を最適に用い、Ｍｎ２＋およびＣｏ２＋をより少ない程度で用いた。ＣｓＨＣＳ２活性は、Ｃｏ２＋を用いることで最も高いが、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋を用いても高いことが観察され、Ｃａ２＋はより少ない程度であった。Ｃｏ２＋と高活性の生物学的関連性は明らかではなく、全ての追加分析はＭｇ２＋を用いた。
ヘキサノエートを含むＣｓＨＣＳ１は、Ｋｍ ６．１±１．０ｍＭ、Ｖｍａｘ １５．６±１．７ｐＫａｔおよびｋｃａｔ ４．５ｓｅｃ−１を有する。ＣｓＨＣＳ２はＫｍ ３２０ｎＭ、Ｖｍａｘ １．７ｐＫａｔ、およびｋｃａｔ ５７．６ｓｅｃ-１を有する。
実施例３：異なるカルボン酸を用いた試験
ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２が活性化できるカルボン酸の範囲を試験するため、広範なカルボン酸および限定したＡＴＰを用いて酵素分析を行った。分析条件はSchneider K et al.(2005)と同様のものを用いた。シロイヌナズナ由来のペルオキシソームアシル−コエンザイムＡの新規タイプはシ゛ャスモン酸の生合成前駆体を活性化する触媒力を有する。The Journal of Biological Chemistry, 280:13962-72.すなわち、精製されたHCS酵素(1μg)を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ９、２５０ μＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ ＡＴＰおよび１ ｍＭ ＤＴＴを含むアッセイで５００μＭカルボン酸基質および１００μＭ ＣｏＡと共にインキュベーションした。全てのカルボン酸基質を２％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００に溶解し、アッセイでの最終濃度０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ｔなるようにした。３時間、２９℃で反応後、消費されていないＡＴＰの測定に基づくルシフェリン／ルシフェラーゼのために反応物の１０μＬ部分を９６ウェルプレートに移動した。このプレートを１４２０マルチラベルカウンター(PerkinElmer)で解析した。各ウェルに対して１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．８、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．３μｇルシフェリンおよび０．５μｇルシフェラーゼを含む９０μＬの溶液を接種し、２秒間震盪後、所定の場所でフィルターなしで発光を１５秒間測定した。カルボン酸基質無しの反応と比べて読み取りがより低いものは、より高い量の酵素活性およびそれによる基質利用を示す。結果を図３に示し、エラーバーを比率のパーセントエラーで表し、ｎ＝３である。
図３Ａに示されるように、ＣｓＨＣＳ１は基質としてヘキサノエート（６炭素）、オクタノエート（８炭素）およびノナノアート（９炭素）の使用が観察され、バレレート（５炭素）およびヘプタノエート（７炭素）はそれほどではなかった。逆に、図３Ｂに示されるようにＣｓＨＣＳ２はより大きな混乱を示し、ＣｓＨＣＳ２は、プロパノエート（Ｃ３）からアラキドネート（Ｃ２０）までおよび多数のフェニルプロパノイド（シンナメート、フェルラートおよびそれほどではないがｐ−クマレート）にわたる広範な基質を使用することができる。
別の試験では、ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ３の動力学的性質を、ＣｏＡおよび類似物短鎖（ブタノエート）、中鎖（ヘキサノエートおよびデカノエート）および長鎖（パルミテート）脂肪酸についてより正確に測定した（表５）。高いＣｏＡ濃度はＣｓＨＣＳ１を阻害した。非線形回帰基質阻害モデルを用いて、ＣｓＨＣＳ１ｎＫｉを５．１０１±１．８ｍＭと評価した。ＣｏＡは試験した濃度ではＣｓＨＣＳ２を阻害しなかった。デカン酸は４ｍＭ超え（Ｋｉは測定していない）の濃度では、ＣｓＨＣＳ２を阻害し（Ｋｉ＝１２０．８±４７．９μＭ）、わずかにＣｓＨＣＳ１を阻害した。これらのデータは上記に示した動力学的データと同じ傾向を示す。
実施例４：ＣｓＨＣＳ２を用いたオリベトール酸の合成
ＣｓＨＣＳ２を芳香族ポリケチドオリベトール酸の化学的酵素的合成に用いた。オリベトール酸はカンナビノイド生合成のための最初の関係した前駆体である。このインビトロ合成を４つの組換え酵素：ＣｓＨＣＳ２、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ由来のマロニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＭＣＳ）、カンナビス由来の「オリベトール酸」／ポリケチドシンターゼ、およびカンナビス由来のオリベトール酸シンターゼを用いて行った。
マロニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＭＣＳ）をプライマーＭＣＳ ｆｏｒｗａｒｄおよびＭＣＳ ｒｅｖｅｒｓｅ（表３参照）を用いてＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍのゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)にクローニングし、ｐＨＩＳ８／ＧＷベクターに組換えた。シークエンスによる検証後、プラスミドを大腸菌ＲｏｓｅｔｔａＩＩ（ＤＥ３）に形質転換した。組換えＭＣＳを発現させＣｓＨＣＳ酵素の記載のとおりに精製した。
「オリベトール酸」／ポリケチドシンタ−ゼおよびオリベトール酸シンターゼのクローニング、発現および精製を以下の通り行った。大腸菌細胞での発現のために、ポリケチドシンタ−ゼ／オリベトールシンターゼおよびオリベトール酸シンターゼのオープンリーディングフレームをＰＣＲにより増幅し、ポリケチドシンタ−ゼ／オリベトールシンターゼについてはｐＨＩＳ８／ＧＷにクロ−ニングし、あるいはオリベトール酸シンターゼについてはｐＥＴ１００(Invitrogen)にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）(Invitrogen)に形質転換した。クローニングをシークエンスにより検証した。
１Ｌ培養でポリケチドシンターゼ／オリベトールシンターゼを増殖させると同時に、オリベトール酸シンターゼをｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ培地２００ｍＬで発現させた。両方の培養物を３０°Ｃ／１５０ｒｐｍで震盪しながらインキュベートし、０．５μＭ ＩＰＴＧを添加し、一晩増殖させた。培養物を１６，０００ｇで２０分間遠心分離し、ペレットをリソチームおよび超音波で処理することにより溶解した。透明な溶解物をＴａｌｏｎレジン（オリベトール酸シンターゼに対しては２００μＬ、ポリケチドシンタ−ゼ／オリベトールシンターゼ１ｍＬ；Clontech）と混合し、５ｍＬのＨｉｓ−標識洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）で洗浄し、組換えタンパク質をＨｉｓ−標識溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）を用いて溶出した。溶出物をＹＭ１０濃縮器を用いて濃縮し、緩衝液を保存緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭＤＴＴ）に変換した。最終タンパク質溶液をＲＣ／ＤＣタンパク質アッセイキット(Bio-Rad)を用いて定量し、０．５ｍｇ／ｍＬ（オリベトール酸シンターゼ）および５．６ｍｇ／ｍＬ（ポリケチドシンタ−ゼ／オリベトールシンターゼ)のタンパク質濃度が見出された。両方のタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析で確認した。
安価な試薬を用いてヘキサノイル−ＣｏＡ合成と芳香族ポリケチド合成とを連結する能力を、４ｍＭヘキサノエート、８ｍＭマロネート、０．４ｍＭＣｏＡ、０．４ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．３μｇ ＣｓＨＣＳ２、１２μｇＭＣＳ，８μｇ「オリベトールシンターゼ」／ＰＫＳおよび１０μｇＯＡＳからなる酵素アッセイを行うことにより試験した。反応を室温で１６時間インキュベートし酢酸エチル中で酸性化し抽出した。極性画分を回収し、蒸発乾固させ、５０μＬのメタノールで再懸濁した。一部（５μＬ）をＬＣＭＳにより解析し、産物をそれらの保持時間および質量により特定した（図４参照）。
実施例５：ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２を用いる酵母でのオリベトール酸の合成
ヘキサノイル−ＣｏＡを合成するＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２と、オリベトール酸を形成するカンナビス「オリベトールシンターゼ」／ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）およびオリベトール酸シンターゼ（ＯＡＳ）の融合とを用いることにより、酵母（サッカロマイセス・セルビジエ）をオリベトール酸を産生するように遺伝子操作した。
ＯＡＳを、「オリベトールシンターゼ」／ＰＫＳを有するフレームにアミノ酸：AATSGSTGSTGSTGSGRSTGSTGSTGSGRSHMV（配列番号１１）をコードする合成リンカー配列を用いてｐＥＳＣ−Ｔｒｐ酵母発現ベクター(Stratagene)にてＧＡＬ１０プロモーターの制御下でクロ−ニングした。ＣｓＨＣＳ１のオープンリーディングフレームを酵母発現ベクターｐＹＥＳＤＥＳＴ５２−Ｕｒａ(Invitrogen)にGateway手法を用いてクローニングした。ＣｓＨＣＳ２のオープンリーディングフレームをｐＥＳＣ−Ｔｒｐ酵母発現ベクター(Stratagene)にＧＡＬ１プロモーター制御下でクローニングした。
酵母細胞（ＩｎＶＳｃ Ｉ、Invitrogen）を上記構築物（ＯＡＳ：「オリベトールシンターゼ」／ＰＫＳ融合単独、ＯＡＳ：「オリベトールシンターゼ」／ＰＫＳ融合およびＣｓＨＣＳ１；ＯＡＳ：「オリベトールシンターゼ」／ＰＫＳ融合ＣｓＨＣＳ２）と形質転換し、形質転換物をＳＤ−Ｔｒｐプレートにて３日間２８℃で増殖させた。それぞれについて単一コロニーを３ｍＬのＳＤ−Ｔｒｐグルコース培地に植えつぎ、震盪させながら２８℃で２日間インキュベートした。最初の培養物の０．５ｍＬ部分を１ｍＭヘキサン酸ナトリウムを含む１０ｍＬのＳＤ−Ｔｒｐガラクトース培地に植えつぎ、２０°Ｃで４日間インキュベートした。完全培養物を酢酸エチルで抽出し、乾燥させ、残渣を１００μＬの３０％アセトリニトリル／７０％水／０．０５％ギ酸に再懸濁した。産物をＬＣＭＳを用いて解析した（図５参照）。
実施例６：植物のカンナビノイド生合成でのＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２の役割
トリコームＥＳＴデータセットの配列に基づく解析および５つのＡＡＥの生化学的アッセイを通して、ヘキサノイル−ＣｏＡシンテターゼ活性をもつ二つを特定した（ＣｓＨＳＣ１およびＣｓＨＳＣ２）。これらのどれがカンナビノイド生合成経路に関与するのかを決定するためにｑＲＴ−ＰＣＲおよび細胞内局在試験を行った。
ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２のｑＲＴ−ＰＣＲ
「フィオナ」植物を種子からｍｉｄ−ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ段階まで育てた。根、茎、葉、雌花（トリコームを有するものおよびＢｅａｄｂｅａｔｅｒを用いてトリコーム単離後のもの）、トリコーム細胞およびも花を３つの植物からサンプルとした。上記のとおり全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡはＡｂｓ２６０：Ａｂｓ２８０＞１．９を有し変性ゲル状で別個のリボソームバンドを示した。ファーストストランドｃＤＮＡを０．５μｇＲＮＡを用いてＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ｃＤＮＡ合成キット(Qiagen)で合成した。各２０μＬｃＤＮＡ試料を水で１：４に希釈して、１μＬをＰＣＲテンプレートとして用いた。遺伝子特異的プライマーを９０〜２００ｂｐのアンプリコンを産生するように設計した。ＰＣＲ反応（２０μＬ）を９６ウェルプレートでＳＹＢＲグリーンによるアッセイ（ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｋｉｔ、Qiagen）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ装置(Applied Biosystems)で行った。サイクルパラメーターは９５°Ｃ５分、続けて９５°Ｃ１０秒、６０°Ｃ３０秒を４０サイクル、および標準解離プロトコール（９５°Ｃ１５秒、６０°Ｃ１分、０．３°Ｃで６０〜９５°Ｃまで１５秒で上昇）。試験を３つの植物由来のｃＤＮＡを用いて２つの技術的繰り返しにより行った。試験した全ての組織で安定発現が確認されたアクチンを参照遺伝子として用いた。全てのプライマー対の有効性は標準曲線法を用いて算出したところ９０〜１１０％であった。Ｃｔ値をＳｔｅｐＯｎｅソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて算出した。２-ΔΔＣｔ法を関連する遺伝子発現解析のために用いた。
ＣｓＨＣＳ１およびＣｓＨＣＳ２の細胞内局在
ＹＦＰ：ＣｓＨＳＣ１およびＹＦＰ：ＣｓＨＳＣ２融合をＬＲリコンビナーゼ(Invitrogen)を用いてｐＥＡＲＬＹＧＡＴＥ１０４に組換えることにより構築した(Earley, K.W., Haag, J.R., Pontes, O., Opper, K., Juehne, T., Song, K. and Pikaard, C.S. (2006). Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant J. 45, 616-629.)。ＯＬＳ：ＣＦＰ構築物を調製するために、停止コドンを欠くＯＬＳをｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯにクローニングした後ｐＥＡＲＬＹＧＡＴＥ１０２にＬＲリコンビナーゼを用いて組換えた。ペルオキシソームマーカーＰＸ−ＣＫ(Nelson, B.K., Cai, X. and Nebenfuhr, A. (2007). A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136.)はＡＢＲＣ(www.arabidopsis.org)由来である。プラスミドをシロイヌナズナＧＶ３１０１に電気穿孔法により形質転換し、１０μｇ／ｍＬリファンピシンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。２週齢のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の葉をＯＤ６００が０．０２のアグロバクテリウム溶液に浸漬した(Sparkes, I.A., Runions, J., Kearns, A. and Hawes, C. (2006).Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nat. Protocol. 1, 2019-2025.)。浸漬後２日に葉表皮細胞をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。ＣＦＰを４５８ｎｍ励起で４７５〜５２５ｎｍバンドパスフィルタを用いたイメージコレクションで視覚化した；ＹＦＰは５１４ｎｍで５３０〜６００ｎｍバンドパスフィルタを用いて視覚化した。イメージをＺｅｉｓｓ ＬＳＭソフトウェアパッケージを用いて収集し解析した。
データはＣｓＨＣＳ１がカンナビノイド生合成に関与する酵素である証拠を提供した。ＣｓＨＣＳ１はＥＳＴカタログで最も豊富な転写物であり、ｑＲＴ−ＰＣＲデータはその発現はトリコーム細胞では他の組織と比較して１００倍を超えることを示す（図６）。さらにＣｓＨＳＣ１は細胞内局在試験により証明されたように細胞質ゾルに局在し、これは推定カンナビノイド酵素ＯＬＳが局在される場所と同じ部分である。ＣｓＨＣＳ１の基質選択は、ＣｓＨＣＳ１がＣｓＨＣＳ２よりヘキサノエートおよび他の短鎖脂肪酸アシルＣｏＡに対する特異性を示すため（図３）、カンナビノイド生合成のＣｓＨＣＳ１の役割について更なる証拠を提供する。
ＣｓＨＣＳ１は植物でのカンナビノイド生合成に関与する可能性のある酵素であるが、ＣｓＨＣＳ２はヘキサノイル−ＣｏＡを合成する際ＣｓＨＣＳ１よりもより有効である。しかしながらＣｓＨＣＳ２はペルオキシソームに局在し、カンナビノイド経路のポリケチド合成段階が位置するこの部位でヘキサノイル−ＣｏＡがどのように形成され、細胞質に輸送できるのか明らかでない。ＣｓＨＣＳ２は極めて広範囲の基質を受容し、それはより一般化されたアシル−ＣｏＡシンテターゼであることを示し、これはペルオキシソームβ酸化に作用するだろう。
ＣｓＨＳＣ１およびＣｓＨＳＣ２は工業的ツールに有益である。カンナビス植物でのノックアウトＣｓＨＳＣ１は植物でのカンナビノイドレベルの大部分の減少を引き起こすことができこれは大麻栽培者にとって極めて好ましい。カンナビスでのＣｓＨＳＣ１の過剰発現は高められたカンナビノイドレベルをもたらしこれは医薬目的に有用である。一方で、ＣｓＨＳＣ２は微生物またはインビトロ系での再構築に特に有用であろう。
実施例７：Targeted Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) を用いたＣｓＨＳＣ１およびＣｓＨＳＣ２遺伝子での変異生成
ＣｓＨＳＣ１またはＣｓＨＣＳ２遺伝子での変異を有するカンナビス植物の特定はＴＩＬＬＩＮＧを用いることで成し遂げることができる。カンナビス植物の突然変異誘発群をオリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲを用いてスクリーニングし、目的の遺伝子を増幅する。増幅した変異遺伝子を野生型遺伝子とアニールして変異遺伝子と野生型遺伝子の間のミスマッチを見つける。検出された差異はＣｓＨＳＣ１またはＣｓＨＣＳ２遺伝子の一つに変異を含む植物を同定するために用いられる。ＣｓＨＳＣ１またはＣｓＨＣＳ２タンパク質の安定性またはアルカノイルＣｏＡシンテターゼ活性に不可欠な位置での変更されたアミノ酸を引き起こす変異を含む植物はカンナビノイド生合成のためのアルカノイル−ＣｏＡ前駆体を生産できない。得られた植物は減少したまたは変更されたレベルのカンナビノイド産物を含む。
本発明はカンナビス由来の２つのアルカノイル−ＣｏＡシンテターゼ酵素をコードする遺伝子提供する。これらの遺伝子は育種、標的の突然変異誘発または遺伝子操作を通して高められたカンナビノイド産生をもつカンナビス植物を作出するために用いることができる。さらに、カンナビスでの本発明の遺伝子の不活化またはサイレンシングはカンナビノイド生合成を遮断し、よってカンナビス植物（例えば、工業用大麻）でのＴＨＣＡ、ＴＨＣの前駆体などのカンナビノイドの生産を減少するために用いることができる。本発明の遺伝子は、カンナビノイド経路の他の酵素をコードする遺伝子と組合せて他の植物でまたは微生物でまたは非細胞系でカンナビノイド生合成を遺伝子工学作り、あるいはカンナビノイド化合物のアナログまたはカンナビノイド前駆体のアナログを産生するために用いることができる。
本明細書のいたるところで参照を文献に求め、それぞれの全ての内容はこの参照により組み込まれる。
本発明固有の別の利点は当業者には明らかである。実施態様は実例として本明細書に記載されているが主張する本発明の範囲を限定することを意味するものではない。前記実施態様の変形は当業者に明らかであり、かつ、本発明者らにより言及され、以下の特許請求の範囲により包含される。

Claims (26)

  1. 配列番号１と少なくとも７５％配列同一性を有するヌクレオチド配列またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列を含んでなる単離されたまたは精製された核酸分子。
  2. ヌクレオチド配列が配列番号１に記載されている配列またはそのコドン縮合ヌクレオチド配列である、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 配列番号３と少なくとも７５％配列同一性を有するヌクレオチド配列またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列を含んでなる単離されたまたは精製された核酸分子。
  4. ヌクレオチド配列が配列番号３に記載されている配列またはそのコドン縮合ヌクレオチド配列である、請求項３に記載の核酸分子。
  5. 配列番号２と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列またはその保存的置換アミノ酸配列を含んでなる単離されたまたは精製されたポリペプチド。
  6. 配列番号４と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列またはその保存的置換アミノ酸配列を含んでなる単離されたまたは精製されたポリペプチド。
  7. アルカノイル−ＣｏＡ活性を有する、請求項５または６に記載のポリペプチド。
  8. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなるベクター、構築物または発現系。
  9. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞。
  10. アルカノイル−ＣｏＡの合成方法であって、請求項７のポリペプチド存在下でカルボン酸とＣｏＡを反応させることを含んでなる、方法。
  11. カルボン酸が２〜１０個の炭素原子を有する、請求項１０に記載の方法。
  12. アルカノイル−ＣｏＡがヘキサノイル−ＣｏＡを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
  13. 生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子またはその一部を用いて、生物、細胞または組織でのアルカノイル−ＣｏＡの合成を触媒する酵素をコードする遺伝子を、抑制するための核酸分子を使用しない以外は類似の条件下で育てられた生物、細胞または組織の類似の異種と比較して抑制することを含んでなる、方法。
  14. 生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法であって、生物、細胞または組織での遺伝子を変異させ、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて、アルカノイル−ＣｏＡの合成を触媒する酵素をコードする遺伝子の変異体またはバリアントを含む生物、細胞または組織を選択することを含んでなる、方法。
  15. 生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法であって、生物、細胞または組織での請求項１〜４のいずれか一項に記載の外因性核酸分子を、外因性核酸分子を発現または過剰発現させること以外類似の条件下で育てられた生物、細胞または組織の類似の異種と比較して発現または過剰発現させることを含んでなる、方法。
  16. 生物、細胞または組織でのカンナビノイド化合物のレベルを変更する方法であって、生物、細胞または組織での請求項７に記載のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を、外因性核酸分子を発現または過剰発現させること以外は類似の条件下で育てられた生物、細胞または組織の類似の異種と比較して発現または過剰発現させることを含んでなる、方法。
  17. カンナビノイド化合物のレベルを増加させる、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. カンナビノイド化合物のレベルを減少させる、請求項１５または１６に記載の方法。
  19. 生物、細胞または組織でのカルボン酸およびＣｏＡ存在下で請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子を発現することを含んでなる生物、細胞または組織での自然に生じるカンナビノイド化合物またはカンナビノイド化合物の非天然アナログを合成する方法。
  20. 生物、細胞または組織が微生物由来である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 微生物がサッカロマイセス・セルビジエ酵母または大腸菌である、請求項２１に記載の方法。
  22. カンナビノイド生合成経路の一以上の酵素をコードする一以上の他の核酸の発現または過剰発現と組み合わせて核酸分子を発現または過剰発現させる、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. カンナビノイド生合成経路の一以上の酵素が、オリベトール酸シンターゼ、３型ポリケチドシンターゼ、ポリケチドシクラーゼ、芳香族ペンチルトランスフェラーゼまたはカンナビノイド形成オキシドシラーゼの一以上である、請求項２２に記載の方法。
  24. カンナビノイド生合成経路の一以上の酵素が、３型ポリケチドシンターゼ／オリベトールシンターゼ、ゲラニルピロリン酸：オリベトレート ゲラニルトランスフェラーゼ、Δ９−テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ、カンナビジオール酸シンターゼまたはカンナビクロメン酸シンターゼの一以上である、請求項２３に記載の方法。
  25. カンナビノイド化合物が、カンナビゲロール酸、Δ９−テトラヒロドカンナビノール酸、カンナビジオール酸、カンナビクロメン酸、Δ９−テトラヒドロカンナビノール、カンナビジオール、カンナビクロメンまたは炭素原子１〜９個の長さの側鎖を含んでなるそのアナログの一以上である、請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. インビトロ非細胞反応でのアルカノイル−ＣｏＡの合成方法であって、請求項７に記載のポリペプチドの作用を介してコエンザイムＡとカルボン酸を反応させることを含んでなる合成方法。
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