JP7015836B2 - 新規無機リン酸ベースエネルギー再生機能を備えた無細胞発現系 - Google Patents

Description

本出願は２０１６年１２月３０日に出願の米国特許仮出願第６２／４４０，９７５号の優先権の利益を主張するものである。上記で言及の出願の全明細、図および配列表は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる。

本発明は、無細胞発現系、インビトロ転写／翻訳機構に必要な全ての無細胞反応成分を含む反応混合物、エネルギーをもたらし、タンパク質合成に必要なアミノ酸、ヌクレオチド、代謝成分に関する。本発明は、高収率の対象発現産物が生じ得る新規の無機リン酸ベースエネルギー再生系を組み込んだインビトロ無細胞発現系にさらに関する。本発明は、インビトロ無細胞遺伝子発現用の装置にさらに関する。さらに、本発明は、診断用途および／またはアッセイに組み込まれ得る新規無機のリン酸ベースエネルギー再生系に関する。

無細胞発現系（インビトロ転写／翻訳、無細胞タンパク質発現、無細胞翻訳、または無細胞タンパク質合成としも知られる）は、研究者による機能的タンパク質またはその他の標的分子のインビトロでの発現を可能とする分子生物学的技術である。細菌または組織培養細胞ベースのインビボ技術に比べて、インビトロタンパク質発現は、遺伝子導入、細胞培養または様々なタンパク質精製を必要としないので、かなり高速である。このような系の別の利点は、発現される標的タンパク質が宿主細胞に毒性であるか、または通常、細胞発現と相性が悪い場合が多く、インビボ系がタンパク質発現に全く効果的でない手段であるとは言わないまでも、実用的でなくなるという点である。

より具体的には、無細胞発現系は、生細胞を使用することなく、ＲＮＡ種およびタンパク質などの標的分子および複合体を生成する。典型的な無細胞発現系は、１つまたは複数の標的遺伝子を含むＤＮＡから標的分子を生成するための、細胞溶解物で見出される生物学的成分／機構を利用し得る。典型的な無細胞発現系反応の共通成分には、通常は細胞培養溶解物に由来する細胞抽出物、ＡＴＰなどのエネルギー源、アミノ酸補給物、マグネシウムなどの補助因子、および目的の遺伝子を有する、通常、プラスミド合成テンプレートの形の核酸合成テンプレート、または直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）発現テンプレート（または合成テンプレート）（ＬＥＴまたはＬＳＴ）が含まれる。細胞抽出物は、目的の細胞を溶解し、細胞壁、ゲノムＤＮＡ、およびその他の残骸を遠心分離または他の沈殿法で除去することにより、得られ得る。溶解物の残りの部分、または細胞抽出物は、標的分子の発現に必要な細胞機構を含み得る。

一般的な無細胞発現系は、無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）を含む。１つまたは複数の目的のタンパク質を作製するために、典型的なＣＦＰＳ系は、微生物、植物、または動物細胞の粗製溶解物からのエネルギー生成およびタンパク質合成に必要な、一揃いの触媒成分を利用する。粗製溶解物は、ＤＮＡからＲＮＡ転写、ＲＮＡからタンパク質翻訳、タンパク質折り畳み、およびエネルギー代謝（例えば、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、翻訳開始および伸長因子、リボソーム終結因子、ヌクレオチド再利用酵素、代謝酵素、シャペロン、フォルダーゼ、など）のために必要な要素を含む。今日使用されている通常の細胞抽出物は、大腸菌（ＥＣＥ）、ウサギ網状赤血球（ＲＲＬ）、コムギ胚芽（ＷＧＥ）、および昆虫細胞（ＩＣＥ）、さらには、哺乳動物細胞（ＭＣ）から作製されている。

無細胞発現系の多くの有利な側面にもかかわらず、これまで、いくつかの障害がタンパク質産生技術としての使用をそれらの制限してきた。これらの障害には、活性タンパク質合成の短い反応時間、低タンパク質産生速度、小さい反応規模、複数のジスルフィド結合を含むタンパク質を正しく折り畳む限られた能力、および「ブラックボックス」科学としてのその最初の開発が含まれる。従来の無細胞発現系で見出される１つの大きな制限事項は、付随する化学的環境の有害な変化を生じない、転写／翻訳のために必要なタンパク質合成の強力なエネルギーおよび基質ニーズに対する供給の困難性である。さらに、特に、ヌクレオチドの形の高エネルギーリン酸化学薬品の高価な試薬コスト、および二次エネルギー源が、このような従来の無細胞発現系の実用を制限する。

インビトロ無細胞発現系に対する主要な制約要因の１つは、エネルギー再生である。例えば、無細胞タンパク質合成の開始後、産生は通常、１つの基質（例えば、ＡＴＰ、システイン、など）が枯渇するまで、または副産物（例えば、無機リン酸塩）の蓄積が阻害濃度に達するまで継続される。従って、任意の無細胞発現系が適切なエネルギー源を効率的に再生できないことが、制約要因として作用し、全体の系の実行時間および最終的な収率を低下させる。さらに、法外に高いことに加えて、高レベルのＡＴＰがタンパク質発現を実際に抑制し得るので、無細胞発現系に追加のＡＴＰを単に加えるだけということは、非現実的である。

これらの問題に対処するために、従来の無細胞発現系は、主に、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）またはクレアチンリン酸（ＣＰ）とクレアチンキナーゼ（ＣＫ）またはその他の類似化合物の形の補助的エネルギー源の追加に依存している。しかし、このようなエネルギー補充は、大きな制限がある。第１に、ＰＥＰおよびＣＰ両基質は、インビトロ条件下で機能的限られた寿命しか持たず、それらの反応副産物ピルビン酸塩は、インビトロ翻訳に阻害性である。第２に、上述のように、これらの基質はインビトロ用途に対し、コストを大きく増加させる。第３に、両方の酵素ＰＫおよびＣＫは、劣化／不活性化までに、３～４回の限られた総代謝回転数しか持たないことが示されており、エネルギー再生源としてそれらの有用性をさらに制限する。タンパク質「代謝回転」または代謝回転数（ｋ_ｃａｔとも呼ばれる）は、単一触媒部位が所与の酵素濃度に対し実行する、秒当たりの基質分子の化学変換最大数として定義され得る。その結果、その不十分な代謝回転数のために、ＰＫおよびＣＫ酵素は、かなりの量を加える必要があり、これが、インビトロ用途の実行時間を制限し、同時にコストも上昇させる。

より具体的な例では、現在の大腸菌ベース無細胞系は、主に、クレアチンリン酸／クレアチンキナーゼ、またはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）に、主要エネルギー再生系として依存しているが、この系では、ＰＫは、低い一桁の総代謝回転数であり、また、副産物のピルビン酸塩は、翻訳反応の阻害剤であることが明確になっている。このように、本発明の細胞のエネルギー再生系は、従来の無細胞発現系とは異なるのみでなく、実際に、当該技術分野において既知の従来の無細胞発現系に勝る実証可能な改善を示している。

その結果、例えば、より長い反応時間およびより速いタンパク質合成速度、最終的により高いタンパク質収率をもたらす、よりエネルギー的に効果的で堅牢な無細胞発現系に対する必要性が存在する。実際に、無細胞発現系、特に、これらの系内のエネルギー再生に関する前述の問題は、長年求められてきた、効果的－および経済的な－これに対する解決策を必要とする代表例である。これらの要素の実装は利用可能であったかもしれないが、この必要性を満たす実際の試みは、幾分不足していた可能性がある。これは、当業者が付随する問題および課題の性質の完全に正当な評価または理解に対する失敗に起因する可能性がある。この理解の欠如の結果として、これらの長年のニーズに適合する試みは、ここで特定された１つまたは複数の問題または課題を効果的に解くことに失敗した可能性がある。これらの試みは、さらには、本発明の技術により採用された技術的方向から離れた方向に導かれた可能性があり、その結果として、この分野の一部の人により採用された手法が少々予想外の結果と見なされる本発明の技術成果をもたらすことになったのかもしれない。

Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｅｒｉｋ Ｄ．ｅｔ ａｌ．"Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｅ ｏｆ Ａｇｅ．" Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｄｖａｎｃｅｓ ３０．５（２０１２）：１１８５－１１９４．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１ Ｊａｎ．２０１８．

以降でより詳細に考察されるように、現在の本発明の技術は、従来の無細胞発現系の制限、特に、それらのエネルギー使用の制限を克服し、同時に、より長い反応時間およびより高い産生収率をもたらす、真にエネルギー的に効果的で堅牢なインビトロ無細胞発現系の目的に適合する。

一般に、本発明の技術は、無細胞発現系に関する。本発明の１つの目的は、より長い反応時間、最終的により高い収率の目的とする発現産物を産生する、より高い反応効率、および改善された反応安定性をもたらす新規組成物、装置および手順を含む無細胞発現方法を提供することであり得る。

本発明の別の目的は、一実施形態では、新規系およびエネルギー再生方法を含み得る、改善された無細胞発現系を提供することであり得る。例えば、好ましい一実施形態では、本発明の技術は、新規無機リン酸ベースエネルギー再生系を組み込んだインビトロ無細胞発現系を含み得る。この好ましい実施形態では、エネルギー再生は、無機リン酸の添加および選択微生物菌株から単離および精製された相乗的高効率キナーゼタンパク質により達成され得る。これらのキナーゼタンパク質は、無細胞発現系内で、細胞エネルギー源アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の高効率の化学的再生を推進し得る。この改善されたエネルギー再生は、無細胞発現系の活性の持続を可能とし、タンパク質などの対象発現産物のより高い収率をもたらす。

特定の実施形態では、この無機リン酸ベースエネルギー再生系は、種々の無細胞発現系に適用し得る。例えば、好ましい一実施形態では、新規エネルギー再生系は、化学エネルギー枯渇の前の、より長い系の実行時間および無細胞翻訳系からのタンパク質などの、より高い発現産物収率を可能とし得る。

本発明の技術野別の目的は、エネルギー依存性プロセスおよび／または診断アッセイに関し得る。具体的には、本発明の技術は、無機リン酸ベースエネルギー再生系を有する改善されたインビトロＡＴＰ依存性プロセスおよび／またはアッセイを含み得る。好ましい一実施形態では、本発明のエネルギー再生系は、無機リン酸ベースエネルギー再生系を有するインビトロＡＴＰ依存性タンパク質活性アッセイを含み得る。この実施形態では、アッセイ内のエネルギー再生は、選択微生物菌株から単離および精製された相乗的高効率キナーゼタンパク質の添加により達成され得る。これらのキナーゼタンパク質は、ＡＴＰ依存性アッセイで、ＡＴＰの高効率化学的再生を推進し得る。この実施形態は、化学エネルギー枯渇前により長いアッセイ実行時間を可能とし得、これは、次に、改善されたアッセイ性能および感度を可能とし得る。

本発明の技術の追加の目的は、本明細書で記載のものなどの無細胞インビトロ系における増大した安定性、熱安定性および酵素活性および／または代謝回転を示す特定の微生物菌株からのＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の特定、単離、精製および／または修飾を含む。一実施形態では、耐熱性細菌性ＲＮＡポリメラーゼは、特定のプロモーター下で、または特定のプロモーターの制御なしで、コスミドＤＮＡのゲノムのアンフォールドを支援し得る、より高い安定性および従来の温度より高い温度でのＤＮＡ構築物からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生合成を可能とし得る。好ましい一実施形態では、インビトロ転写、インビトロｃＤＮＡ産生、およびインビトロ転写／翻訳発現系などの無細胞発現系中で、この高安定性ＲＮＡＰを用いて発現産物を生成し得る。特定の酵素を有する無細胞発現系中でこの高安定性ＲＮＡＰを用いて、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、および／またはシチジン三リン酸ＣＴＰ、ならびに本明細書で一般的に記載の無機リン酸エネルギー再生系などのエネルギー源／基質を生成し得る。この実施形態では、本明細書で一般的に記載のＲＮＡポリメラーゼタンパク質の増大した安定性が、無細胞発現系における増大した実行時間およびより高い収率を可能とし得る。

本発明のさらに別の目的は、無細胞発現系での使用に最適化され得る１つまたは複数の遺伝子改変細菌株を提供することであり得る。このような改変の例には、例えば、２～３例挙げると、タンパク分解性リボヌクレアーゼ活性、および／または芽胞形成活性を有し得る特定の遺伝子の除去を含み得る。追加の実施形態は、直鎖ＰＣＲ産物のインビトロプロモーター認識を容易にし、ＲＮＡＰの発現上昇をもたらし得る特定のσ因子を過剰発現する遺伝子改変細菌を含み得る。

本発明の別の目的は、新規無細胞発現系増殖培地を提供し得る。特定の実施形態では、本発明は、無細胞発現系で使用し得る変性増殖培地に関する。この新規培地は、毒性金属塩および金属イオンキレート化剤の存在なしで、最適な細菌増殖を可能とし得る。

本発明の技術の追加の目的は、以降で示される詳細な開示、図および特許請求の範囲から明らかになろう。本明細書に組み込まれ、その一部を形成する添付図面は、本発明の１つまたは複数の実施形態を例示し、説明とともに本発明の技術の特定の態様を説明するに役立つ。描画は、１つまたは複数の本発明の好ましい態様を例示することのみを目的とするものであって、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。

熱耐性無細胞発現系発酵槽の一実施形態の概略図を示す。 無細胞発現系発酵槽の一実施形態の概略図を示す。 Ｇｓｔ Ａｄｋ発現ベクターの一実施形態を示す。 ＴａｑＰＰＫ発現ベクターの一実施形態を示す。 天然のＲＮＡＰタンパク質サブユニットおよびＲｐｏＤに付加される追加のアミノ酸のリストである。 Ｇｓｔ Ａｄｋ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生系を利用したＡＴＰ再生を示すＡＴＰアーゼルシフェラーゼアッセイの図である。データは具体的には、次の通り：行Ａ：各ウエルにおける２００ｕｌ標準ＡＴＰアーゼルシフェラーゼアッセイ中の１０ｕＭ ＡＴＰ；行Ｂ：１０ｕＭ ＡＴＰ、標準的ＰＥＰ／ＰＫ条件（２００ｕＭ ＰＥＰ、０．０２Ｕ／ｍｌ ＰＫ）；行Ｃ：１０ｕＭ ＡＴＰ、比率ＰＰＫ／Ｇｓｔ Ａｄｋ（４：１）合計１ｕｇ／ｍｌ；行Ｄ：１０ｕＭ ＡＴＰ、比率ＰＰＫ／Ｇｓｔ Ａｄｋ（１：１）合計１ｕｇ／ｍｌ；行Ｅ：１０ｕＭ ＡＴＰ、比率ＰＰＫ／Ｇｓｔ Ａｄｋ（１：４）合計１ｕｇ／ｍｌ；列１～３：１ｕｌ（１０ｍｇ／ｍｌポリリン酸）；列４～６：３ｕｌ（１０ｍｇ／ｍｌポリリン酸）；列７～９：６ｕｌ（１０ｍｇ／ｍｌポリリン酸）；列１０～１２：１０ｕｌ（１０ｍｇ／ｍｌポリリン酸）。全反応は、９６ウェルプレート中で１３７分間にわたりＴｅｃａｎプレートリーダーで連続的に記録された（Ｘ軸は、各ウエル）。合計相対的発光が記録され、各ウエルに対し示される（Ｙ軸）。 図４と同じ条件下で、ＡＴＰアーゼルシフェラーゼアッセイ反応が、連続的に記録した３９２分（Ｘ軸）に対する、ＡＴＰ、ＰＥＰ／ＰＫおよびＧｓｔ Ａｄｋ／ＰＰＫ ＰＰｉ系のルシフェラーゼ／Ｄ－ルシフェリンベースＡＴＰアーゼアッセイの相対発光の全記録データポイントの線形表現で提示される。相対発光（同じ尺度、同じ読み値、同じプレート）は、Ｙ軸により表される。３つ全ての系の分離は、経時的に明確になる。 次記の３回の反復の全ての記録データポイント（５つの独立した実験）を平均した、ルシフェラーゼ／Ｄ－ ルシフェリンベースＡＴＰアーゼアッセイにおける相対発光の対数表示の図である：２００ｕｌアッセイにおける１０ｕＭ ＡＴＰ、ＰＥＰ／ＰＫ条件（２００ｕＭ ＰＥＰ、０．０２Ｕ／ｍｌ ＰＫ）による１０ｕＭ ＡＴＰ、１０ｕＭ ＡＴＰ、比率ＰＰＫ／ＡｄＫ（４：１）合計１ｕｇ／ｍｌおよび３ｕｌ（１０ｍｇ／ｍｌポリリン酸）。１００８分後に、追加のデータポイントに対し実験を記録した。全プレートをプレートリーダー中に置いたままにし、光退色を防いだ。 組換えタンパク質Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫの単離と精製を示す図である。 種々のポリリン酸濃度でのＡＴＰエネルギー再生系を示す図である。 分離されたＡＴＰエネルギー生成反応産物を示すルシフェラーゼアッセイの図である。 ルシフェラーゼアッセイに用いられたＧｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫ ＡＴＰエネルギー再生系の一般反応スキームを示す図である。 基質源としての無機ポリリン酸およびＡＭＰからＡＴＰエネルギーを生成する相乗的Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫ酵素の図である。 文献および組換えＰＰＫタンパク質配列の比較を示す。 無細胞発現系のための無細胞発現バイオリアクターの一実施形態の上面図である。 無細胞発現系のための無細胞発現バイオリアクターの一実施形態の側面図である。 細胞培養物を生成するための細胞培養装置の一実施形態の図である。

本発明は、種々の態様を含み、これは様々な方法で組み合わせ得る。以下の説明は、複数の要素を列挙するために提供され、本発明のいくつかの実施形態を記載する。これらの要素は、最初の実施形態で列挙されるが、それらは任意の方法で、および任意の数で組み合わせて、追加の実施形態を生成し得ることを理解されたい。様々に記載された実施例および好ましい実施形態は、明示的に記載された系、技術、および用途に本発明を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、記載は、種々の実施形態、系、技術、方法、装置、およびいくつかの開示要素を有する、各要素単独を有する、およびこの用途またはいずれかのその後の用途における全ての要素の種々の並べ替えおよび組み合わせを有する用途の説明および特許請求の範囲の全てを裏付け、包含するものと理解されたい。

本技術は、限定されないが、例えば、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰの制御のために提供される細胞抽出物および／または補充基質および酵素を有する転写系；インビトロ翻訳系、インビトロ（ＡＴＰ依存性）タンパク質活性アッセイ系およびインビトロ転写／翻訳系の組み合わせを含む無細胞発現系のための用途を有する新規無機リン酸ベースエネルギー再生を含む。

特定の実施形態では、無細胞発現系で利用されるこのようなエネルギー的に相乗的遺伝子産物は、限定されないが、アデノシルキナーゼ（ＡｄＫ）、および／またはポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を含み得る。
一般に、ＰＰＫは、ＡＴＰおよび無機ポリリン酸の可逆的形成を触媒する：

一般に、ＡｄＫは、アデニンヌクレオチドの相互変換を触媒し、すなわち、２ＡＤＰが１ＡＴＰおよび１ＡＭＰに変換され得る：

いくつかの事例では、このようなエネルギー的に相乗的遺伝子産物は通常、耐熱性であり、いくつかの事例では、無細胞発現系での使用のために、遺伝子改変され得る。このＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー制御系は、無細胞発現系、ならびに他のＡＴＰ依存性反応、診断薬用途および／またはアッセイで利用され得る。

以降で詳細説明されるように、ＡｄＫ／ＰＰＫエネルギー制御系は、種々の細菌種ならびに組換え発現などの種々の発生源由来のＡｄＫおよび／またはＰＰＫタンパク質を含み得る。従って、いくつかの実施形態では、ＡｄＫおよび／またはＰＰＫ遺伝子またはタンパク質は、明確に特定され得るが、しかし、ＡｄＫおよび／またはＰＰＫの特定は通常、全てのＡｄＫおよび／またはＰＰＫ遺伝子またはタンパク質およびそれらのホモログ、パラログおよびオルソログならびに全ての遺伝子改変種を包含し得ることに留意されたい。このような遺伝的改変種には、１つまたは複数の点変異などの、タンパク質の酸性度を高め得る変異を含み得る。

一実施形態では、本発明の技術は、選択細菌種由来の１つまたは複数のエネルギー的に相乗的遺伝子産物の特定および単離を含み得る。広範な視点から図４を参照すると、好ましい一実施形態では、ＡｄＫは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のｇＤＮＡから、上記で概要を記載した技術を利用して、クローニングされ得る。さらに、ＰＰＫは、大腸菌（配列番号９）からクローニングされ得る（ｅｃＰＰＫ）か、または下記で考察のように、好ましい一実施形態では、ＰＰＫは、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）などの好熱性および／または熱耐性細菌からクローニングおよび／または改変され得る（ＴａｑＰＰＫ）。

例えば、好ましい一実施形態では、Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のｇＤＮＡは、約２０ｍｌの一晩の培養液から単離された。Ｇ．ステアロサーモフィルス培養液は、ペレット化され、ｇＤＮＡは、例えば、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｅｌｏＳｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｋｉｔなどの市販のキットを用いて単離され得る。その後、ｇＤＮＡは、エタノール沈殿を用いて濃縮され得る。これは通常、塩およびエタノールをｇＤＮＡ含有溶液に加えてｇＤＮＡを沈殿させ、これを、例えば、遠心分離機で再度ペレット化した後、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水に再懸濁させることにより、達成され得る。Ｔ．アクアチクス中のｇＤＮＡ含有ＰＰＫ遺伝子の単離は、上記と類似の手段により単離および濃縮され得る。

上記で参照した記載と同様に、好ましい一実施形態では、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫの両方が、各遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計され得る特異的プライマーを用いてクローニングされ得る。この実施形態では、選択発現ベクター中への対象遺伝子の導入のための特異的制限酵素部位を含む、順方向および逆方向プライマーの両方を生成し得る。好ましい一実施形態では、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫ遺伝子をＩＢＡ ＳｔａｒＧａｔｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ中に特異的に導入する制限酵素部位を含む順方向および逆方向プライマーが生成され得る。Ｇｓｔおよび大腸菌由来の対象プライマーおよびｇＤＮＡを個別のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫ遺伝子をそれぞれ増幅し得る。一実施形態では、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはｅｃＰＰＫ遺伝子の両方の個別のＰＣＲは、標準的マスターミックス反応液およびＧ．ステアロサーモフィルスおよび大腸菌（表１）からそれぞれ単離した５０ｎｇの入力ｇＤＮＡを用いて実施し得る。

好ましい実施形態では、耐熱性ＰＰＫ酵素は、好熱性Ｔ．アクアチクスから誘導し得（ＴａｑＰＰＫ）、上記でほぼ特定したＧｓｔ Ａｄｋ（配列番号８）を有する本発明の無細胞発現系とさらに組み合わせ得る。この実施形態では、ＰＰＫ文献タンパク質配列（配列番号１０；図１２）を用いて、ＤＮＡに逆翻訳した。次に、配列を大腸菌用にコドン最適化し、遺伝子を発現させるために、ｐＥＴ１５１／Ｄ－ＴＯＰＯ中にサブクローン化した（図２ｂ）。この実施形態では、通常、ＴａｑＰＰＫとして特定される、サーマス・アクアチクス由来のサブクローン化ＰＰＫ遺伝子は、Ｎ－末端に追加の非天然アミノ酸を含むように遺伝子改変された。これらの追加の非天然アミノ酸は：１）６ｘＨｉｓタグ；２）Ｖ５エピトープタグ、および３）ＴＥＶ切断部位（配列番号１１）を含む。表２に記載のように、これらの３つの遺伝子改変は、ｐＥＴ１５１骨格の一部であり、発現および精製を促進し得る。ＴａｑＰＰＫは、ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現され、概ね本明細書で記載の方法を用いて精製された。

一実施形態では、ＰＣＲプロセスにより増幅されたＧｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫ遺伝子ＤＮＡ配列が単離され得る。好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応液は、１％臭化エチジウムアガロースゲルで分析され、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＰＰＫ遺伝子は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌおよび／またはＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐなどの産業界で既知のアガロースゲル抽出および／またはＰＣＲ精製法により単離され得る。これらの単離遺伝子はその後、適切な送達ベクター中に挿入され得る。例えば、一実施形態では、前に生成した遺伝子フラグメントおよび選択ベクター、この実施形態では、適切なベクター（例えば、図２ａ～ｂをそれぞれ参照）は、選択制限酵素で消化され、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔとして商業的に入手可能な、３：１ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応により連結され得る。このおよび全ての他の実施形態の場合、各遺伝子断片は、個別の送達ベクター中に連結され、選択微生物菌株またはほかの適切な細胞中に形質転換され得ることに留意されたい。その他の実施形態は、同義遺伝子断片の送達ベクター中への連結反応および共発現される選択微生物菌株中への形質転換を含み得る。

この実施形態では、連結したＧｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫ遺伝子およびプラスミドベクターは、個々にまたはひとまとめにして選択微生物菌株中に形質転換され得る。好ましい実施形態では、個別に連結したベクターは、高率の形質転換効率を有するように構成され得るＴｏｐ１０コンピテント大腸菌中に形質転換され得る。この実施形態では、Ｔｏｐ１０コンピテント大腸菌は、ｒｅｃＡ遺伝子中に、ＤＮＡ組換え促進プラスミドベクターの安定性を低下させ得る変異を含み得、また、非特異的エンドヌクレアーゼ活性を低下させて、プラスミドベクター収率および品質を改善し得るｅｎｄＡ遺伝子ノックアウトをさらに含み得る。

形質転換に成功した細菌は、例えば、陽性遺伝子検出ＰＣＲ、または他の既知の方法により特定し得、また、その後引き続いて培養して、増殖している細菌性コロニー中でプラスミドベクターの複数コピーを生成し得る。好ましい実施形態では、プラスミドベクターＤＮＡは単離され、別の選択微生物菌株中に再形質転換され（ｓｕｂ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）得る。好ましい実施形態では、作製したプラスミドベクターＤＮＡは、最適タンパク質発現のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌の高発現株中に再形質転換され得る。

一実施形態では、本発明の技術は、それぞれが選択分子タグを有するＧｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫの両方のタンパク質の個別発現を含み得る。この実施形態では、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＰＰＫタンパク質は、それぞれ、ポリＨｉｓまたはＨｉｓ－６－タグを含むように構成され得、このタグは、後でタンパク質精製のために使用し得る。この実施形態では、発現したＧｓｔ Ａｄｋおよび／またはＰＰＫタンパク質は、一連のヒスチジン残基が、適切な緩衝液条件下でニッケル、コバルトおよび銅を含むいくつかのタイプの固定された金属イオンに結合するために、検出され、精製され得る。

一実施形態では、タグ付きＧｓｔ Ａｄｋ（配列番号８）および／またはＴａｑＰＰＫ（配列番号１１）タンパク質は、個々に発現、精製され得る。この好ましい実施形態では、個々のＨｉｓ－６タグ付きＧｓｔ Ａｄｋおよび／またはＰＰＫタンパク質は、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株中で発現され得る。この実施形態では、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株は、ＮＹＺ培地中で培養され得、この培地は、特に、ラクトースを欠き、全ての発現タンパク質を分解する可能性がある特定のプロテアーゼを誘導し得る。タンパク質発現は、特定の細菌増殖の光学密度（ＯＤ）で誘導され得る。好ましい実施形態では、約ＯＤ ０．７で、タンパク質発現は、０．２５ｍＭのイソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の３０～３２℃で６～８時間の添加により、誘導され得る。ＩＰＴＧは、ラクトースの代謝物であるアロラクトースを模倣する分子試薬で、プラスミドベクター中でｌａｃオペロンの転写の引き金を引き、それにより、対象遺伝子、この場合、ｌａｃオペレーターの制御下にある、それぞれＧｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫ遺伝子のタンパク質発現を誘導する。

この好ましい実施形態では、個別のＢＬ２１（ＤＥ３）培養物は、溶解されて、溶解物が調製され、金属イオン帯電樹脂を通過され得る。個別の溶解物は、Ｎｉ帯電ＩＭＡＣ樹脂を通過し、そこで、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫタンパク質上のＨｉｓ－６タグが樹脂上の固定されたニッケルイオンに結合し得る。非結合および非特異的結合タンパク質が、この実施形態では、５ｍＭのイミダゾールの添加により、さらに除去されて、非結合および非特異的結合タンパク質は除去されるが、Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫタンパク質は、樹脂に結合したまま残る。再度、上述のように、上述のタンパク質精製ステップがＧｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫタンパク質の両方に対し個別に行われ得る。

Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫタンパク質はその後、３００ｍＭのイミダゾールの添加またはその他の既知の方法により、個別に溶出され得る。タンパク質の存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示され、タンパク質純度は、ＦＰＬＣ ＵＶプロファイルによりさらに示され得る。好ましい実施形態では、個別に精製されたタンパク質は、インビトロ転写／翻訳適合性緩衝液条件下、Ｇｓｔ Ａｄｋに対しては１３ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＰＰＫに対しては１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、－２０℃で、その後の使用のために保存され得る。

さらに、ＡＴＰ測定アッセイを実施して、ポリリン酸の存在下で、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＰＰＫタンパク質の機能を確認し得る。このようなアッセイにより、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）ならびにＡＴＰ産生のレベルを定量化し得る。ＡＴＰ（図６参照）は、糖部分に対しエステル化された３つのリン酸基からなるアデニンヌクレオチドであり、全ての生細胞中で認められる。アデノシン三リン酸は、代謝プロセスならびにＲＮＡおよびタンパク質合成のためのエネルギー産生に関与する。

好ましい実施形態では、無機ポリリン酸、この場合では、ポリリン酸ナトリウムは、インビトロＡＴＰ依存性系中の系のためのエネルギー源として供給され得る。単離および精製されたＧｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫをこの無細胞発現系に添加し得る。好ましい一実施形態では、ＴａｑＰＰＫに対してＧｓｔ Ａｄｋを、無細胞発現系、または他のアッセイ、診断または系に添加し得、ＴａｑＰＰＫに対するＧｓｔ Ａｄｋの比率をＴａｑＰＰＫに比べてより多量のＧｓｔ Ａｄｋとし得る。一実施形態では、約３：１～４：１のモル比で、ＴａｑＰＰＫに対してＧｓｔ Ａｄｋをこの系に添加し得る。このような比率は、単に例示的なものであり、他の比率も本発明の範囲内に入ることを理解されたい。例えば、一実施形態では、ＴａｑＰＰＫに対するＧｓｔ Ａｄｋは、限定されないが、１：１、２：１、３：１、５：１、５：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、などを含む凡そのモル比率でこの系に添加し得る。

図８に大まかに示すように、別の好ましい実施形態では、単離および精製されたＧｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫは、一定量の無機ポリリン酸をこの無細胞発現系に添加し得る。一実施形態では、無機ポリリン酸のこの量は、最適ポリリン酸濃度範囲を含み得る。この好ましい実施形態では、このような最適ポリリン酸濃度範囲は通常、反応の平衡を安定に維持する無機ポリリン酸（ＰＰｉ）の濃度と定義されている。この好ましい実施形態では、最適ポリリン酸濃度範囲は、約０．２～２ｍｇ／ｍｌのＰＰｉであり得る。

上述のように、ＰＰＫは、ポリリン酸とＡＭＰからＡＤＰを合成できる。この好ましい実施形態では、Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＰＰＫの組み合わせた作用により、２つのＡＤＰをＡＴＰとアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）に変換することにより、系からアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を除去し得る：

この反応は、ＰＰＫの平衡反応を、ＡＤＰの産生方向に進めるのに十分な程度に高速であり得る：

この系では、より高い濃度のＡＭＰの存在が、ＴａｑＰＰＫ反応をＡＤＰの方向にさらに進め得る。

再度、図４～６に示すように、ＡＴＰ測定アッセイでは、ＰＰＫ／ＡｄＫエネルギー（ＡＴＰ）再生系のＡＴＰ再生速度は、従来のＰＥＰ／ＰＫエネルギー産生系に比べて、かなり速い。いくつかの実施形態では、最初のＡＴＰ変換速度は、同等の条件下での従来のＰＥＰ／ＰＫ系に比べて、約１０倍速くなり得る。さらに、図４～６にさらに示されるように、Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＰＰＫは、より高い総代謝回転数を有し得、これは、長時間にわたる検出可能なＡＴＰ再生をもたらし、この実施形態では、最大１２時間であった。

ＴａｑＰＰＫの組み込みは、さらに、１２時間を超えて、検出可能なＡＴＰ再生をもたらす。このようなＡＴＰ再生代謝回転は、上記の従来のインビトロＡＴＰ再生系よりかなり高い。他の実施形態では、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＴａｑＰＰＫは、改善された塩耐性を含み、その他のＡｄＫタンパク質に対しては阻害性であるはずの塩濃度中で、継続した酵素活性および／または代謝回転を可能とし得る。従って、ポリリン酸の存在下で、Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫ（ならびに、ＡｄＫおよび／またはＰＰＫおよび限定されないが、好熱性および／または熱耐性微生物株を含む種々の他の細菌由来のそれらのホモログ）が、無細胞発現系内でどのように相乗的に機能して細胞エネルギー源ＡＴＰを再生し得るかを知ることができる：

本発明の技術の特定の実施形態は、改善されたエネルギー再生系を有する無細胞発現系を含み得る。好ましい一実施形態では、インビトロ転写および／または翻訳系などの無細胞発現系は、選択微生物菌株由来の耐熱性のＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）をさらに含み得る無機ポリリン酸エネルギー再生機能を含むように構成され得る。

好ましい一実施形態では、無細胞タンパク質発現系で使用するために、細菌種ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスから、ＲＮＡＰサブユニットアルファ（配列番号１）、ベータ配列番号２）、ベータ’および／またはベータ’（ｏｐｔ）（それぞれ、配列番号３および配列番号４）、デルタ（配列番号５）およびオメガ（配列番号６）が特定され、クローニングされ、精製および調製された。Ｇ．ステアロサーモフィルスは、内側細胞膜および肉厚の細胞壁を特徴とするグラム陽性好熱性細菌であることに留意されたい。Ｇ．ステアロサーモフィルスは、熱水噴出孔または温泉などの好熱性環境中で見つけられるロッド形状の嫌気性菌である。

Ｇ．ステアロサーモフィルス由来のＲＮＡＰ（Ｇｓｔ ＲＮＡＰ）は、本明細書で概略記載のように、特定され、クローニングされた後、精製され得る。この実施形態では、Ｇｓｔ ＲＮＡＰは、例えば、大腸菌などの非極限環境微生物細菌由来の標準的ＲＮＡＰよりも安定であり得る。Ｇｓｔ ＲＮＡＰは、改善された熱安定性、ならびに改善された反応速度安定性を有し、それにより、インビトロ系で、従来の無細胞発現系で使用される他のＲＮＡＰバリアントより長期間にわたりｍＲＮＡの産生を触媒することが実行可能なままで残り得る。

好ましい一実施形態では、耐熱性のＧｓｔ ＲＮＡＰは、高発現大腸菌株中にクローニングおよび形質転換され得る。この耐熱性のＧｓｔ ＲＮＡＰは、クローニングされ、単離および精製された後、１つまたは複数の選択遺伝子を含むプラスミドおよび／または直鎖ＤＮＡなどの遺伝物質の存在下で、無細胞発現系に導入され、選択遺伝子のｍＲＮＡ転写物を産生可能とし得る。一実施形態では、これらのｍＲＮＡ転写物は、細菌性またはその他の細胞抽出物に導入、またはそれと混合され得る。抽出物は、ＤＮＡからＲＮＡ転写物、ＲＮＡからタンパク質翻訳、タンパク質折り畳み、およびエネルギー代謝のための必要な要素を含み得る。上述のように、この実施形態では、単離および精製されたＴａｑＰＰＫおよびＧｓｔ Ａｄｋは、タンパク質翻訳中に、例えば、無細胞発現系の細胞抽出物、ならびに、一定量の１つまたは複数のポリリン酸に添加され、改善されたＡＴＰ再生機序をもたらし得る。

この好ましい実施形態では、標的ｍＲＮＡ転写物の翻訳は、１つまたは複数の選択タンパク質を生成し得、同時に、ＴａｑＰＰＫ、Ｇｓｔ Ａｄｋおよびポリリン酸の相乗作用が向上したＡＴＰ再生をもたらし、必要に応じ、可能なより高い温度で、全体としてより高いタンパク質収率をもたらすより高い代謝回転数を有する、無細胞発現系のより長い実行時間を可能にし得る。この実施形態では、高度に安定なＧｓｔ ＲＮＡＰの存在が、無細胞発現系内で、可能なより高い温度で、変性されることなく、より多いｍＲＮＡ転写物をもたらすより高い代謝回転数を有し、最終的に、より高いタンパク質収率をもたらす、ｍＲＮＡ転写物の産生のためのより長い実行時間を可能とする。

本発明は、通常、無細胞発現系と呼ばれる、改善されたインビトロ転写／翻訳系にさらに関する。一実施形態では、この無細胞発現系は、抽出物での使用のために開発され得る１つまたは複数の好熱性または熱耐性細菌の遺伝子改変株を含み得る。好ましい実施形態では、ゲオバチルス株などの好熱性細菌の遺伝子改変株は、無細胞（ＣＦ）抽出調製物のために、およびインビトロ転写／翻訳のために開発および使用され得る。ゲオバチルス株は通常、大腸菌（３５～３７℃）に比べて、高い増殖温度（５２～５５℃）を示す。この熱差異は、ＣＦ抽出調製物での、より高いタンパク質安定性およびより高いタンパク質密度耐性を可能とする。さらに、ゲオバチルス株の好熱性属性は、ほかの酵素、および酵素機能、例えば、限定されないが、アミノ酸シンターゼ；リボソーム；ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；σ因子；ならびにＡＴＰ再生および糖分解の酵素に対する安定性の増加を可能とし得る。

ゲオバチルス由来の細菌はまた、ＣＦ抽出調製物に有利である。ファーミキューテスであるので、それらは、特定の条件下で、Ｏ_２耐性または厳密に好気性である。嫌気性好熱菌の取り扱い、発酵および抽出調製物は、かなり複雑で高価であり、雰囲気の酸化性条件に起因する酵素安定性関して追加の不確定性があり得る。さらに、ゲオバチルスは、既知のヒトの健康への影響がないことが知られており、従って、ＣＦ系から臨床的材料を産生するのに好適する。

本発明の遺伝子改変ゲオバチルス株に関しては、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）が予測され、遺伝子解析により、大腸菌タンパク質発現株の発現構築物の標準的ＲＢＳと同じであるか、または同等であることが実証され、好ましい実施形態の本発明の技術が既存の遺伝子構築物の保存および利用を可能とすることが結論付けられた。

別の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変ゲオバチルス株は、ｔＲＮＡコドン使用頻度の好ましいカバー度を示した。一実施形態では、ｔＲＮＡ集団分布に関して、知的所有権下にあるソフトウェアツールを用いて生物情報学分析を実施し、希なまたはカバーされていないｔＲＮＡコドンが原因でインビトロ翻訳反応が停止するのを防ぐ可能性のある全てのまたはほとんど全てのコドンをカバーする株を特定した。このゲオバチルス株の抽出物はまた、精製された大腸菌ｔＲＮＡを利用し、これは、この株のアミノ酸シンターゼにより認識される。これは、完全なおよびほとんど等しく分布したコドンカバー度を可能とする。本実施形態は、熱力学的に偏りのない分布に有利なように、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスおよびサーモフィルス・アクアティクスなどの種々の株の、天然の不均等なｔＲＮＡコドン使用頻度の分布を用いる。

上記で広範な視点から考察したように、好ましい一実施形態では、遺伝子改変微生物菌株が、無細胞発現系での使用のために開発された。好ましい実施形態では、ゲオバチルス株は、特定の酵素の発現を除くおよび／または低減させるように、および発酵プロセス中に酵素を構成的に過剰産生して、ＣＦ抽出調製物の使用を容易にするように、遺伝子改変された。（この遺伝子改変株は、一般に、「ゲオバチルスＣＦ］と呼ばれることもあり得る）。この実施形態では、ゲオバチルスは、強力なプロテアーゼＯｍｐＴホモログ、ＲＮアーゼＩ、およびＤＮＡメチル化依存性ＤＮアーゼをノックアウトするように遺伝子改変された。この実施形態では、遺伝子ノックアウト改変は、これらの遺伝子転写調節の細菌ゲノムからの選択的除去により達成された。それらは、一般に既知であり、また当該技術分野において理解されているので、その他のノックアウト方法もまた、採用され得る。この実施形態では、培養密度依存性芽胞形成オペロンの活性は、芽胞形成プロセスを遅らせ、培養液中の細菌密度を高める遺伝子改変（ノックダウン）により低減され、より高い効率およびＣＦ抽出物収率の改善を可能とした。

再度、上記で概略考察したように、特定の実施形態では、遺伝子改変微生物菌株は、σ因子のＲｐｏＤを過剰発現して、インビトロ転写で直鎖ＰＣＲ産物から選択されるように特定のプロモーターを認識する。好ましい実施形態では、ゲオバチルスＣＦは、株の発酵中に、σ因子のＲｐｏＤを過剰発現するように遺伝子改変された。この遺伝子改変ＲｐｏＤの過剰発現は、このσ因子の発現を天然のσ７０の細胞濃度を超えて上昇させ、これは、次に、遺伝子改変ゲオバチルス株中の細菌性ＲＮＡＰの濃度を高めた。最終的に、遺伝子改変細菌性ゲオバチルス株は、当該技術分野において既知の大腸菌タンパク質発現株と同等の増殖速度を示す。ＣＦ抽出調製物に対し遺伝子改変ゲオバチルス株を用いるさらなる利点には次記が含まれる：１）高い増殖温度（約５２～５５℃）、これは、培養による混入の可能性を大きく低減する；および２）「使用済」発酵培地は、単純で、有害でなく、嫌気性好熱菌の場合には必要となり得る廃棄物処理の必要性を減らす。

追加の実施形態では、細胞抽出物は、いくつかの異なる微生物から生成され得る。例えば、細胞抽出物は、大腸菌（ＥＣＥ）、ウサギ網状赤血球（ＲＲＬ）、コムギ胚芽（ＷＧＥ）、および昆虫細胞（ＩＣＥ）、さらには、哺乳動物細胞（ＭＣ）から生成され得る。追加の実施形態では、微細藻類由来の細胞抽出物が生成され得る。このような実施形態は、細菌がイントロンを認識し、除去するどのような機序も提供しないので、有利であり得る。他方では、ナノクロロプシスなどの微細藻類は、イントロンを有し、細胞機構がそれらを除去する－これは、天然の微細藻類細胞抽出物の成分であり、本発明を植物タンパク質およびその他の発現産物の生産のために適用可能にするであろう。

本明細書で使用される場合、インビトロ無細胞発現は、生物学的抽出物および／または所定の無細胞反応成分を含む反応混合物または溶液中のポリペプチドの無細胞合成を意味する。反応混合物は、高分子、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの産生のための、テンプレート、または遺伝子テンプレート；合成され高分子のためのモノマー、例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、などおよび補助因子、酵素およびその他の合成に必要な試薬、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子、などを含み得る。無細胞合成反応、および／または細胞アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）エネルギー再生系の成分は、バッチ、連続流、または半連続流として実施／添加され得る。

上述のように、本発明は、多くのアッセイ、および他の診断用途に適用し得る。例えば、一実施形態では、ＰＰｉおよびＡＭＰと共に、二重酵素ＡｄＫ／ＰＰＫの添加は、任意のＡＴＰエネルギー依存性アッセイまたは診断用途、例えば、ルシフェラーゼアッセイ内で、ＡＴＰ再生を可能とし得る。好ましい一実施形態では、Ｇｓｔ Ａｄｋの第１の量、およびＴａｑＰＰＫの第１の量が、第１の量のＰＰｉおよび第１の量のＡＭＰと共に、ＡＴＰ依存性アッセイまたは診断に加えられ得る。この好ましい実施形態では、細胞ＡＴＰエネルギー再生が達成され、アッセイ診断実行時間、出力、感度の改善を可能とし、ならびに従来のエネルギー補充技術に比べて成分の安価な本質に起因して安価を可能とする。上記言及成分のそれぞれは、指定された時間経過を超えると、さらに補充され得る。

ＡＴＰ依存性用途の例としては、限定されないが、次のエネルギー依存光反応または酵素反応が利益を得るであろう；エピメラーゼ、脱水酵素、ＮＡＤＰＨ水和物脱水酵素、セルラーゼ、クロマチンリモデリング酵素、ＡＴＰ依存性ペプチドリガーゼ、ＤＮＡ連結反応、および従来の無細胞発現系。本発明の系は：シンテターゼ；リン酸化反応；ＣｏＡ依存性酵素（合成洗剤、香味料産業）；Ｄｅａｍｉｎｏａｃｉｄｅ ａｍｉｄｅｓ（Ｄｅａｌａ－Ｄｅａｌａ－Ｌｉｇａｓｅｓ）の生成に適用し得る。

上述のように、本発明の一実施形態では、ＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生系を有する無細胞発現系は、無機ポリリン酸（ＰＰｉ）の添加を含み得る。別の実施形態では、ＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生系を有する無細胞発現系は、第１の量のＰＰｉの添加を含み得、また他の実施形態は、複数の量のＰＰｉの添加を含み得る。この実施形態では、複数の量のＰＰｉが、所定の時間間隔で添加され得る。

好ましい一実施形態では、ＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生系を有する無細胞発現系は、平衡に近い状態でエネルギー調節反応を維持するのに十分な、および／または最大、または所望のレベルのＡＴＰを産生するのに十分な濃度範囲を含み得る。さらに別の好ましい実施形態では、ＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生系を有する無細胞発現系は、約０．１～５０ｍｇ／ｍｌ ＰＰｉまたはそれを超える濃度を含み得る。さらに別の好ましい実施形態では、ＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生系を有する無細胞発現系は、平衡に近い状態でエネルギー調節反応を維持するのに十分な濃度範囲含み、このような範囲は、約０．３～４ｍｇ／ｍｌ ＰＰｉであり得る。

さらに別の好ましい実施形態では、ＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生系を有する無細胞発現系は、平衡に近い状態でエネルギー調節反応を維持するのに十分な濃度範囲含み、このような範囲は、約０．２～２ｍｇ／ｍｌ ＰＰｉであり得る。さらに別の好ましい実施形態では、ＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生系を有する無細胞発現系は、平衡に近い状態でエネルギー調節反応を維持するのに十分な濃度範囲含み、このような範囲は、約０．５～０．６ｍｇ／ｍｌ ＰＰｉであり得る。天然では、全てのこのような比率は、無細胞発現反応の大きさ、持続時間およびエネルギーの必要性に基づいて、必要に応じて、拡大または縮小され得る。いくつかのその他の実施形態では、機能的範囲はまた、追加のＰＰｉを含まない、または０ｍｇ／ｍｌとし得る。

図１３ａ～ｂを全体的に参照すると、一実施形態では、本発明は、無細胞発現バイオリアクター（２２）に関する（要素１０～２０を参照）。複数の無細胞系は本発明で実装し得るので、このようなバイオリアクターは、例示的なものに過ぎないことに留意されたい。本発明のバイオリアクターは、従来の温度より高い温度で無細胞発現を可能とし、例えば、フィーダー反応溶液から、バッチ、連続的なまたは半連続として運転するように構成され得る。

再度図１４を参照すると、この実施形態では、本発明は、無細胞培養装置（２１）をさらに含み得る（要素１～９を参照）。この細胞培養装置は、特定の好ましい実施形態では、好熱性細菌を培養するように構成され得る。発酵容器は取り外し可能であり、好ましい実施形態では、別々にオートクレーブできる。

さらに、この無細胞培養装置（２１）は、好気性ならびに嫌気性生物の増殖に適応するように構成され得る。さらに、無細胞発現バイオリアクター（２２）および無細胞培養装置（２１）の両方は、微細藻類、植物細胞、などの種々の細胞培養物に適応し得る。

次の無細胞タンパク質発現系は、本質的に例示的なものであり、異なる構造およびシステムでも上述の無機ポリリン酸エネルギー再生系を組み込み得ることに留意されたい。さらに、新規無機リン酸エネルギー再生系は、種々の既知の無細胞発現系に適合され、さらに、適合可能なキット中に配置され得る。

本発明は、遺伝子改変された生物を含み、組換えＤＮＡ技術を含むので、次の定義が本発明の記述を助けるために提供される。本明細書で使用される場合、用語の「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、天然状態で、またはその物質が製造されたときに、その物質に通常付随する成分を実質的にまたは基本的に含まない物質を意味する。例示的実施形態では、純度および均一性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて測定される。調製物中に存在する主要な種である核酸または特定の細菌は、実質的に精製される。例示的実施形態では、用語の「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で基本的に１本のバンドとして生ずることを意味する。通常、単離核酸またはタンパク質は、範囲として表現される純度のレベルを有する。成分の純度の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。

本明細書で使用される場合、用語の「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのポリマーを意味する。通常、「核酸」ポリマーは、短鎖または二本鎖型で発生するが、三本以上の鎖を含む構造を形成するものも知られている。用語の「核酸」は、天然の核酸ポリマーならびに既知のヌクレオチド類似体または改変骨格残基または連結を含む核酸を含み、これらは、合成、天然、および非天然であり、基準核酸と類似の結合特性を有し、基準ヌクレオチドに類似の方式で代謝される。例示的類似体には、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸フラグメント」、および「単離核酸フラグメント」は、本明細書では同じ意味で用いられる。核酸の場合、大きさは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で与えられる。推定値は通常、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動法から、配列決定された核酸から、または発表されたＤＮＡ配列から得られる。タンパク質の場合、大きさは、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動法から、配列決定されたタンパク質から、アミノ酸配列から、または発表されたタンパク質配列から推定される。

特に指示がない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、相補的（または補完）配列、および逆相補配列、ならびに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択（または全てのコドン）の第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することにより実現され得る（例えば、Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４）を参照されたい）。アミノ酸をコードするヌクレオチドコドンの縮重性に加えて、所与の位置で化学的に等価なアミノ酸の産生をもたらすが、コードされたポリペプチドの機能特性に影響を与えないポリヌクレオチドの変化は、当該技術分野において周知である。「保存的アミノ酸置換」は、基準ポリペプチドの特性を妨害するのが最も少ないことが予測される置換である。換言すれば、保存的アミノ酸置換は、基準タンパク質の構造および機能を実質的に保存する。したがって、疎水性アミノ酸であるアラニンアミノ酸のコドンは、別のより少ない疎水性の、グリシンなどの残基をコードするコドンにより、またはより高い疎水性の、バリン、ロイシン、またはイソロイシンなどの残基により置換され得る。同様に、別の残基の１つの負に帯電している残基による置換、例えば、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換、または別の残基の１つの正に帯電している残基による置換、例えば、アルギニンまたはヒスチジンのリシンによる置換を生ずる変化はまた、機能的に等価なタンパク質またはポリペプチドを産生することが予測できる。例示的保存的アミノ酸置換は、当業者に既知である。保存的アミノ酸置換は通常、（ａ）置換領域でのポリペプチド骨格の構造、例えばベータシートまたはアルファらせん構造、（ｂ）置換部位での分子の電荷もしくは疎水性、および／または（ｃ）側鎖の嵩、を維持する。

相同性（例えば、パーセント相同性、配列同一性＋配列類似性）は、対での配列アライメントを計算する任意の相同性比較ソフトウェアを用いて決定できる。本明細書で使用される場合、２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、「配列同一性」または「同一性」は、整列させた場合に同じである２つの配列中の残基への言及を含む。タンパク質に関連して、配列同一性のパーセンテージが使われる場合、同じでない残基位置が多くの場合保存的アミノ酸置換により異なり、アミノ酸残基が類似の化学の特性の他のアミノ酸残基（例えば、電荷または疎水性）を置換し、したがって、分子の機能的特性を変えないことがわかる。保存的置換で配列が異なる場合、置換の保存的性質を修正するために、パーセント配列同一性を高める方向に調節し得る。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有することになる。この調節を行う手段は、当業者には既知である。通常、これは、保存的置換を全体のミスマッチではなく部分的ミスマッチとして採点し、それにより、パーセンテージ配列同一性を高めることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられる場合、非保存的置換はゼロのスコアが与えられ、保存的置換は、０～１の間のスコアが与えられる。保存的置換の採点は、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＳおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧのアルゴリズムに従って計算される［Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９（２２）：１０９１５－９］。

特定の実施形態では、ホモログ配列は、本明細書で提供される配列（核酸またはアミノ酸配列）に対し、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一、あるいは同一である。本発明の特定の実施形態では、配列番号１～２２の５０％～９９％同一のホモログ配列が含まれ得る。

本明細書で使用される場合、用語の「プライマー」は、好適な条件下でＤＮＡ合成の開始点で作用できるオリゴヌクレオチドを意味する。このような条件には、適切な緩衝液中および好適な温度で、４種の異なるヌクレオシド三リン酸および延長用の試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導されるものが含まれる。

プライマーは、好ましくは、一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適切な長さは、プライマーの目的とする用途に依存するが、通常は、約６～約２２５ヌクレオチドの範囲で、１５～３５ヌクレオチド、１８～７５ヌクレオチドおよび２５～１５０ヌクレオチドなどの中間的範囲を含む。短いプライマー分子は通常、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度が必要である。プライマーは、テンプレート核酸の正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートにハイブリッド形成するのに十分に相補的でなければならない。所与の標的配列の増幅のための好適なプライマーは、当該技術分野において周知であり、本明細書で引用した文献に記載されている。

本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を意味する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。既知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、特に、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼおよびサーマス・アクアチクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチドの重合を触媒する。前述のＤＮＡポリメラーゼの例は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしても知られる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはまた、ＤＮＡポリメラーゼの範囲に入り、レトロウイルスによりコードされるウイルスポリメラーゼを含む逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの一例である。ＲＮＡポリメラーゼ（「ＲＮＡＰ」）の既知の例には、例えば、特に、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼおよび大腸菌 ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。前述のＲＮＡポリメラーゼの例は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしても知られる。いずれかの上記酵素のポリメラーゼ活性は、当該技術分野において周知の手段で決定できる。

本明細書で使用される場合、用語の「反応混合物」または「無細胞反応混合物」は、所定の反応を実行するのに必要な試薬を含む溶液を意味する。無細胞発現系「反応混合物」または「反応溶液」は通常、粗製または部分的精製抽出物（例えば、細菌、植物細胞、微細藻類、真菌、または哺乳動物細胞由来の）、ヌクレオチド翻訳テンプレート、および無細胞タンパク質合成を促進するための好適な反応緩衝液を含む。いくつかの態様では、ＣＦ反応混合物は、外来性ＲＮＡ翻訳テンプレートを含むことができる。他の態様では、ＣＦ反応混合物は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのために、プロモーター配列に作動可能に連結されたオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡ発現テンプレートを含むことができる。これら他の態様では、ＣＦ反応混合物はまた、オープンリーディングフレームをコードするＲＮＡ翻訳テンプレートの転写を指示するための、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。これら他の態様では、追加のＮＴＰおよび二価の陽イオン補助因子を、ＣＦ反応混合物中に含めることができる。反応混合物は、反応させるのに必要な全ての試薬を含む場合、完全と見なされ、必要な試薬のサブセットのみを含む場合、不完全と見なされる。利便性、貯蔵安定性の理由で、または用途に応じた成分濃度の調節を可能とするために、反応成分は、それぞれ全成分のサブセットを含む別々の溶液として定常的に貯蔵されること、および反応成分は、完全な反応混合物を生成するために反応の前に混合されることは、当業者には理解されよう。さらに、反応成分は、商品化のために別々に梱包されること、および有用な市販キットは、任意のサブセットの本発明の反応成分を含み得ることは、当業者には理解されよう。さらに、当業者なら、特定の実施形態で利用される間に、反応混合物中のいくつかの成分は、無細胞発現産物を生成する必要があるとは限らないことを理解するであろう。

用語の「無細胞発現産物」は、無細胞発現系により産生された任意の生物学的製品であり得る。

用語の「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、統計的に意味のある範囲内の、示した濃度、長さ、分子量、ｐＨ、時間枠、温度、圧力または容積などの値（単一または複数）を意味する。このような値または範囲は、ある大きさの程度以内、典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、およびさらにより典型的には５％以内の所定の値または範囲であり得る。「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」により包含される許与される変動は、調査下の特定の系に依存する。用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に断らない限り、開放型用語（すなわち、「限定されるものではないが、以下が含まれる」）と解釈されるべきである。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、その範囲内に入り、範囲を規定する境界の端点を含む個別の各値を個々に表すことの簡略法として用いることを意図したものにすぎず、個別の各値は、それが本明細書に個々に列挙されているかのうように本明細書に組み込まれる。

例えば、細胞、または核酸、タンパク質またはベクターへの言及で使用される場合、用語の「組換え」または「遺伝子改変」は、細胞、生物、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、または天然の核酸またはタンパク質の変化により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞から得られていることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、天然（非組み換えまたは野生）型の細胞には認められない遺伝子を表し、またはそれ以外の方法では、異常に発現される、過剰発現される、過小発現されるまたは全く発現されない天然遺伝子を表し得る。

本明細書で使用される場合、「形質転換」または「遺伝子改変」という用語は、１つまたは複数の核酸分子の細胞中への導入を意味する。微生物は、核酸分子が安定に複製される場合、細菌または細胞または生物中に形質導入された核酸分子により「形質転換」または「遺伝子改変」される。本明細書で使用される場合、「形質転換」または「遺伝子改変」という用語は、核酸分子が細胞または細菌などの生物中に導入できる全ての技術を包含する。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、転写の開始点から上流にあり、転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与し得るＤＮＡの領域を意味する。プロモーターは、細胞中での発現のためのコード配列に作動可能に連結され得るか、またはプロモーターは、細胞中での発現のためのコード配列に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。

調節配列およびコード配列に関連して用いられる場合、用語の「作動可能に連結された」は、調節配列が連結コード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」または「制御配列」は、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター；翻訳リーダー配列；イントロン；エンハンサー；ステムループ構造；リプレッサーまたは結合配列；終止配列；ポリアデニル化認識配列；などを含み得る。特定の調節配列は、作動可能に連結されたコード配列の上流および／または下流に位置し得る。また、コード配列に作動可能に連結された特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連相補的鎖上に位置し得る。

本明細書で使用される場合、「ゲノム」という用語は、細胞の核ないで見出される染色体ＤＮＡを意味し、また、細胞の細胞内成分内に見出されるオルガネラＤＮＡも意味する。用語の「ゲノム」は、細菌に適用される場合、細菌細胞内の染色体およびプラスミドの両方を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子が細菌のゲノム中に統合されるように、細菌中に導入され得る。これらのおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、染色体に統合され得、または安定なプラスミドとしてもしくはその中に位置し得る。

用語の「遺伝子」または「配列」は、何らかの方法で、遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡ）の発現を調節できる適切な調節配列に操作可能なように連結されたコード領域を意味する。遺伝子は、コード領域（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）の前（上流）および後ろ（下流）のＤＮＡの非翻訳調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、など）、ならびに、適用可能な場合、個別のコード領域（すなわちエキソン）の間の介在配列（すなわち、イントロン）を含む。本明細書で使用される場合、用語の「構造遺伝子」は、ｍＲＮＡに転写され、その後、特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列を意味することが意図されている。

本明細書で使用される場合、用語の「発現」、または「コード配列（例えば、遺伝子または導入遺伝子）の発現」は、核酸転写性ユニット（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む）のコードされた情報が、細胞の操作、非操作、または構造的部分に変換されるプロセスで、多くの場合、タンパク質の合成を含むプロセスを意味する。遺伝子発現は、外部シグナル；例えば、細胞、組織、または生物の遺伝子発現を上昇させるまたは低下させる薬剤への曝露、により影響され得る。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡへ、タンパク質への経路中のどこでも調節され得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセッシング、ｍＲＮＡなどの中間体分子の分解に対する制御作用により、または活性化、不活性化、区画化、または作製後の特定のタンパク質分子の分解により、またはこれらの組み合わせにより、起こる。遺伝子発現は、限定されないが、ノーザン法、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはインビトロ、インサイツ、またはインビボタンパク質活性アッセイを含む、当該技術分野において既知の任意の方法により、ＲＮＡレベルでまたはタンパク質レベルで測定できる。

用語の「ベクター」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはポリペプチドが宿主中に導入され得る何らかの手段を意味する。宿主中に導入されるポリヌクレオチド、タンパク質、およびポリペプチドは、性質上、治療的または予防的であり得る；抗原をコードまたは抗原であり得る；性質上、調節的であり得る、等々。ウイルス、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、および細菌を含む様々な種類のベクターが存在する。

「発現ベクター」は、選択宿主細胞または生物中で複製できる核酸である。発現ベクターは、独立した構造体として複製でき、あるいは宿主細胞染色体またはオルガネラの核酸中に、全体的にまたは部分的に、一体化でき、または外来性ＤＮＡを細胞中に送達するためにシャトルとして使用され、したがって、宿主細胞ゲノムと共に複製する。したがって、発現ベクターは、選択宿主細胞、オルガネラ、または生物中で複製できるポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、核酸フラグメントであり、それにより、発現ベクター上の特定の遺伝子（目的の遺伝子を含む）が転写されて、細胞、オルガネラまたは生物内でポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される；または発現ベクターは、「発現カセット」を含む当該技術分野において既知の任意の好適な構築物である。対照的に、本明細書で実施例に記載のように、「カセット」は、本発明の発現ベクターのポリヌクレオチド含有部分である。カセットの使用は、発現ベクターの構築を助ける。発現ベクターは、プラスミドなどのレプリコン、ファージ、ウイルス、キメラウイルス、またはコスミドであり、これらは、発現制御配列に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチド配列を含む。

本明細書で一般的に記載の無細胞発現系で発現されるタンパク質に関する場合、用語の「発現産物」は、約５アミノ酸を超えるアミノ酸を有する任意のペプチドまたはタンパク質を通常意味し、これらと同義に使用される。ポリペプチドは、外来種に対し相同または外来性であり得、それらが、無細胞抽出物が得られる生物に対し異種、すなわち、外来性であることを意味し、例えば、無細胞抽出物中で産生された、ヒトタンパク質、植物タンパク質、ウィルスタンパク質、酵母タンパク質、などであり得る。

「無細胞抽出物」または「溶解物」は、細菌、好熱性細菌、熱耐性細菌、古細菌、ファーミキューテス、真菌、藻類、微細藻類、植物細胞培養物、および植物浮遊培養物を含む種々の生物および／または細胞に由来し得る。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別義が指示されない限り、複数の参照物を含む。従って、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」に対する言及は、複数のこのような細胞を含み、「培養物（ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）」への言及は、１種または複数の培養物および当業者に既知のその等価物への言及を含む、等である。明確に別義が指示されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

これまで本発明について概略説明してきたが、次の実施例に言及することによりさらに容易に理解されるであろう。これらの実施例は、本発明の実施形態の特定の態様を例示する目的のためのみに含められている。当業者なら、上記教示および次の実施例から、その他の技術および方法が特許請求の範囲を満たすことができ、請求発明の範囲から逸脱することなく、これらを採用できることをわかると思われるので、実施例は、本発明を限定することを意図していない。実際に、本発明を、その好ましい実施形態に関連して、詳細に提示し、説明してきたが、添付した特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態や詳細を様々に変更し得ることを当業者なら理解するであろう。

実施例
実施例１：Ｇ．ステアロサーモフィルスからの耐熱性Ｇｓｔ ＲＮＡＰの生成。
この好ましい実施形態では、本発明者らは、Ｇ．ステアロサーモフィルス由来のＲＮＡポリメラーゼ（Ｇｓｔ ＲＮＡＰ）が、Ｇ．ステアロサーモフィルスから単離したゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からクローニングされ得ることを示した。この実施形態では、約２０ｍｌのＧ．ステアロサーモフィルスを一晩の培養で増殖させ、その後、例えば、遠心分離機でペレット化した。その後、この例では、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｅｌｏＳｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｋｉｔなどの市販のｇＤＮＡ精製キットを用いてｇＤＮＡを単離した。その後、ｇＤＮＡは、エタノール沈殿を用いて濃縮され得る。これは通常、塩およびエタノールをｇＤＮＡ含有溶液に加えてｇＤＮＡを沈殿させ、これを、例えば、遠心分離機で再度ペレット化した後、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水に再懸濁させることにより、達成され得る。

この好ましい実施形態では、Ｇｓｔ ＲＮＡＰのサブユニットが、各遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計され得る特異的プライマーを用いてクローニングされ得る。サブユニット遺伝子を発現ベクター中に導入するための特異的制限酵素部位を含む順方向および逆方向プライマーを利用し得る。好ましい一実施形態では、そのサブユニット遺伝子をＩＢＡ ＳｔａｒＧａｔｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ中に特異的に導入する制限酵素部位を含む順方向および逆方向プライマーが生成され得る。次に、対象プライマーおよびｇＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、Ｇｓｔ ＲＮＡＰサブユニット遺伝子を増幅し得る。好ましい一実施形態では、ＰＣＲは、標準的マスターミックス反応液およびＧ．ステアロサーモフィルスから単離した５０ｎｇの入力ｇＤＮＡを用いて実施し得る。

上述のように、おそらく、内部制限酵素部位の存在に起因すると思われる、最適化遺伝子配列としての役割を果たすＧｓｔ ＲＮＡＰサブユニットを選択することが好ましい場合がある。表１を広範な視点から参照すると、Ｇｓｔ ＲＮＡＰサブユニットベータ（ｏｐｔ）（配列番号４）が特定され、上記と類似の方法でクローニングされ得る。また表１を参照すると、転写因子、この場合ＲｐｏＤ（配列番号７）を、市販品として入手できるコドン最適化された遺伝子合成物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から用いて、直接に発現ベクター中にクローニングし得る。

一実施形態では、ＰＣＲプロセスにより増幅されたＧｓｔ ＲＮＡＰサブユニットＤＮＡ配列が単離され得る。好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応液は、１％臭化エチジウムアガロースゲルで分析され、サブユニットフラグメントが、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐなどの産業界で既知のアガロースゲル抽出および／またはＰＣＲ精製法により単離され得る。これらの遺伝子フラグメントはその後、適切な送達ベクター中に挿入され得る。例えば、一実施形態では、前に生成した遺伝子フラグメントおよび選択ベクター、この実施形態では、商業的に入手できるＳｔａｒＧａｔｅ ｖｅｃｔｏｒ（例えば、図２参照）は、選択制限酵素で消化され、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔとして商業的に入手可能な、３：１ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応により連結され得る。

次に、この実施形態では、連結した遺伝子フラグメントおよびプラスミドベクターは、選択微生物菌株中に形質転換され得る。好ましい実施形態では、連結したベクターは、高率の形質転換効率を有するように構成され得る細菌大腸菌、特にＴｏｐ１０コンピテント大腸菌中に形質転換され得る。この実施形態では、Ｔｏｐ１０コンピテント大腸菌は、ｒｅｃＡ遺伝子中に、ＤＮＡ組換え促進プラスミドベクターの安定性を低下させ得る変異を含み得、また、非特異的エンドヌクレアーゼ活性を低下させて、プラスミドベクター収率および品質を改善し得るｅｎｄＡ遺伝子ノックアウトをさらに含み得る。

形質転換に成功した細菌は、例えば、陽性遺伝子検出ＰＣＲ、または他の既知の方法により特定し得、また、その後引き続いて培養して、増殖している細菌性コロニー中でプラスミドベクターの複数コピーを生成し得る。好ましい実施形態では、プラスミドベクターＤＮＡは単離され、別の選択菌株中に再形質転換され（ｓｕｂ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）得る。好ましい実施形態では、作製したプラスミドベクターＤＮＡは、最適タンパク質発現のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌の高発現株中に再形質転換され（ｓｕｂ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）得る。

一実施形態では、１つまたは複数の発現ＲＮＡＰサブユニットタンパク質は、分子タグで構成され得る。ここで図３を参照すると、ＲＮＡＰベータ’（ｏｐｔ）サブユニットは、ポリＨｉｓまたはＨｉｓ－６－タグを含むように構成され得、このタグは、後でタンパク質精製のために使用し得る。この実施形態では、発現したＨｉｓタグ付きＲＮＡＰベータ’（ｏｐｔ）サブユニットは、一連のヒスチジン残基が、適切な緩衝液条件下でニッケル、コバルトおよび銅を含むいくつかのタイプの固定された金属イオンに結合するために、精製され、容易に検出され得る。

一実施形態では、タグ付きＧｓｔ ＲＮＡＰは、発現、精製され得る。この好ましい実施形態では、Ｈｉｓ－６タグ付きベータ’（ｏｐｔ）サブユニットは、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株中で発現され得る。この実施形態では、大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株は、ＮＹＺ培地中で培養され得、この培地は、特に、ラクトースを欠き、全ての発現タンパク質を分解する可能性がある特定のプロテアーゼを誘導し得る。タンパク質発現は、特定の細菌増殖の光学密度（ＯＤ）で誘導され得る。好ましい実施形態では、ＯＤ ０．７で、タンパク質発現は、０．２５ｍＭのイソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の３０～３２℃で６～８時間の添加により、誘導され得る。ＩＰＴＧは、ラクトースの代謝物であるアロラクトースを模倣する分子試薬で、プラスミドベクター中でｌａｃオペロンの転写の引き金を引き、それにより、ｌａｃオペレーター（図２ａ参照）の制御下で、Ｇｓｔ ＲＮＡＰサブユニット遺伝子のタンパク質発現を誘導する。

この好ましい実施形態では、ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物は、溶解されて、溶解物が調製され、金属イオン帯電樹脂を通過され得る。この溶解物は、Ｎｉ帯電ＩＭＡＣ樹脂を通過し、そこで、ベータ’（ｏｐｔ）上のＨｉｓ－６タグが樹脂上の固定されたニッケルイオンに結合し得る。非結合および非特異的結合タンパク質が、この実施形態では、５ｍＭのイミダゾールの添加により、さらに除去されるが、ベータ’（ｏｐｔ）サブユニットは、樹脂に結合したまま残る。

次に、残っているＧｓｔ ＲＮＡＰサブユニットの発現と単離を行い得る。好ましい実施形態では、残りのＧｓｔ ＲＮＡＰサブユニットのための、タンパク質発現株の合わせた溶解物が調製され、ベータ’（ｏｐｔ）充填樹脂と共に、約２３時間にわたりインキュベートした。非結合および非特異的結合タンパク質が、５ｍＭのイミダゾールの添加により、再度除去される。発現したサブユニットは、アセンブルして、ベータ’（ｏｐｔ）サブユニットを介して樹脂に結合したＲＮＡＰ複合体を形成し、アセンブルされたＧｓｔ ＲＮＡＰは、その後、３００ｍＭのイミダゾールの添加またはその他の既知の方法により、溶出され得る。Ｇｓｔ ＲＮＡＰのアセンブリーは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより実証され得、インビトロ転写／翻訳適合性緩衝液条件下、－２０℃下、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、その後の使用のために保存され得る。さらに、タンパク質活性アッセイを実施して、Ｇｓｔ ＲＮＡＰ複合体のアセンブリーおよび機能を検証し得る。ｍＲＮＡ転写物の存在は、Ｇｓｔ ＲＮＡＰの単離およびアセンブリーの成功を示す。一実施形態では、下記を含む、２５μｌアッセイを実施し得る：
－４ｍＭの各リボヌクレアーゼ三リン酸（ｒＮＴＰ）；
－２５０ｎｇ ＤＮＡ；
－２μｌ Ｇｓｔ ＲＮＡＰ；
－２０Ｕ ＲＮアーゼ阻害剤；および
－５μｌ ５ｘ反応緩衝液

実施例２：Ｇｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫ単離および精製。
本発明者らは、Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫの単離と精製を示し、この精製タンパク質を以下に記載のその後のアッセイに利用した。具体的には、本明細書で概略記載の方法を用いて、Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫが発現および単離された。図７を参照すると、精製された組換えタンパク質が４～２０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析された。ゲルは、クマシー染料で染色された。

具体的には、一定分量の精製されたタンパク質の純度と正確なサイズをＳＤＳ ＰＡＧＥで分析した。以前の精製テストのＰＰＫタンパク質（ＰＰＫ）を、組換えＴａｑＰＰＫ（ＰＰＫ画分１～３）のロット精製のための追加のサイズマーカーとして用いた。精製カラムから溶出した全画分を純粋として明らかにし、約７４ｋＤａの正確なサイズを示す。精製されたＧｓｔ Ａｄｋは、混入タンパク質がないことを示し、約２５ｋＤａの正確なサイズを有する。

実施例３：ＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるＡＴＰエネルギー再生。
本発明者らは、商業的に入手できるＡＴＰ測定アッセイにより、本発明のＡｄＫ／ＰＰＫの組み合わせによるＡＴＰ再生能力を実証した。ここでは、本発明者らは、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＤ－ルシフェリン、Ａ２２０６６を用いて、Ｇｓｔ Ａｄｋおよび／またはＰＰＫタンパク質（この実施形態では、大腸菌由来）のＡＴＰ再生における機能を実証した。

この実施形態では、標準的２００μｌアッセイ成分に加えて、次の材料をアッセイに加え得る。結果は、図４～６に提供される。
ｉ）１０μＭ ＡＴＰ
ｉｉ）５μｌ Ｇｓｔ Ａｄｋ

ｉｉｉ）５μｌの大腸菌由来ＰＰＫ（例示のみ）
ｉｖ）５０μｌ ポリリン酸（１ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）

図４～６に示したように、これらのデータは、一般に、本発明のＡｄＫ／ＰＰＫ－ＰＰｉ ＡＴＰエネルギー再生系の向上したＡＴＰ再生能力、およびＡＴＰ単独、ならびに、従来のＰＥＰ／ＰＫエネルギー補充に対するその改善を実証している。具体的には、このデータは、次のように明確に分別する；最下位：ＡＴＰ、中位：ＰＥＰ／ＰＫ、および上位：ＡｄＫ／ＰＰＫ－ＰＰｉ。

実施例４：変化するポリリン酸濃度でのＡｄＫ／ＰＰＫエネルギー再生。
本発明者らは、商業的に入手できるＡＴＰ測定アッセイにより、本発明のＧｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫの組み合わせによるエネルギー再生が種々のポリリン酸濃度で達成され得ることを実証した。具体的には、添加するＰＰｉの量の標準反応設定を種々変更した。ルシフェラーゼシグナル（ＲＬＵ）を経時的に（分）測定した。

図８に示すように、反応の平衡を維持する１つの濃度範囲を、約０．２～２ｍｇ／ｍｌ ＰＰｉであると決定した。その他の濃度範囲は、反応の平衡を維持するように決定した。具体的には、このような範囲は、０．１～４ｍｇ／ｍｌ ＰＰｉ、および／または０．５～０．６ｍｇ／ｍｌ ＰＰｉ、および／または０．１～７ｍｇ／ｍｌ ＰＰｉであると決定した。図８に示すように、機能的範囲内で、限定されないが、約０～４８ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える範囲を含む、いくつかの追加のＡＴＰ再生を見出した。

一実施形態では、１００μｌルシフェラーゼアッセイの標準的反応設定は下記を含む。

再度、図８に示すように、ＡＴＰ再生は、５時間を超えて持続し、その時点で測定を中止した。示したように、本発明者らは、より高いまたはより低いＰＰｉの入力が、Ｇｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫの安定な反応サイクルを乱し得、機能的である間は、最高レベルの連続的なエネルギー再生を生じない。元来このような範囲は近似であり、限定することを意図したものではない。

実施例５：ＡｄＫ／ＰＰＫの分離によるＡＭＰ／ＰＰｉからのＡＴＰエネルギー再生。
本発明者らは、Ｇｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫ系が、発生源としてのＰＰｉおよびＡＭＰなどの安価な材料からエネルギー（ＡＴＰ）を生成できることを実証した。この新規ＡＴＰ再生系をさらに確証するために、本発明者らは、ルシフェラーゼアッセイからＧｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫの反応を分離した。具体的には、本発明者らは、最初に、精製されたＧｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫ ＡＴＰタンパク質を用いて、ＡＭＰ／ＰＰｉからＡＴＰを生成し、反応物を精製し、試料を使用してルシフェラーゼアッセイを実施した－これは、上記のように、発光するためにＡＴＰを必要とする。

図９に示すように、本発明者らは、全ての反応成分を用いた標準的設定のみが、ルシフェラーゼ発光反応のための十分なＡＴＰを供給した。個別の化合物／酵素を有する、またはこれらの組み合わせを含まない対照は、ルシフェラーゼ反応の成功のためのＡＴＰを供給しなかった。ＡＴＰエネルギーは、このアッセイでは生成されなかったので、ルシフェラーゼシグナルは経時的に低下し、約７分後にはほぼバックグラウンドに達し、この時点で、予め生成された全てのＡＴＰは消費された。

実施例６：ＡＭＰ／ＰＰｉからのＡＴＰエネルギーの生成およびＧｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫによるその生成。
本発明者らは、ＡＭＰおよびＰＰｉからのＡＴＰエネルギーの生成、およびＧｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫエネルギー再生系の少なくとも１つの一実施形態によるＡＴＰの生成を実証した。具体的には、本発明者らは、通常必要なＡＴＰをＡＭＰで置換し、エネルギー再生系成分、すなわち、Ｇｓｔ Ａｄｋ、ＴａｑＰＰＫ、およびＰＰｉを加えた、ルシフェラーゼアッセイを実施した。対照実験では、本発明者らは、それぞれの成分およびこれらの組み合わせを除外した。

Ｇｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫ ＡＴＰエネルギー再生系の反応スキームを、発光するためのＡＴＰを使用したルシフェラーゼ反応という状況で、一般的に図１０に示す。第１のステップでは、ＡＭＰおよびＰＰｉを発生源として用いた、ＰＰＫによる不可逆反応でＡＤＰが生成される。ＡＤＰは、ＰＰＫおよびＡｄＫにより、ＡＴＰに変換でき、両方とも、可逆的反応で、平衡状態のＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰの量で保持される。その後、ＡＴＰがルシフェラーゼにより使用され、ルシフェリンを変換して、発光する。

図１１に示すように、標準的エネルギー再生系成分は、十分なＡＴＰが作製され、発光反応が支援されると、ルシフェラーゼシグナル（ＲＬＵ）が増大する。このシグナルは、約７時間後に最大に達するまで、経時的に増大する。エネルギー再生系を欠く対照反応は、何らのＲＬＵも示さない。したがって、本発明者らは、これは、基質源としての安価なポリリン酸およびＡＭＰからＡＴＰエネルギーを生成する、組み合わされた、または相乗的Ｇｓｔ ＡｄｋおよびＴａｑＰＰＫ酵素であることを実証した。本発明者らは、約２０時間にわたり発光反応を測定でき（図示せず）、その新規系により可能となる堅牢なエネルギー再生をさらに実証した。

実施例７：無細胞抽出調製物。
遺伝子改変生物不含（ＧＭＯ－ｆｒｅｅ）、精製大豆ペプトンおよび動物起源物質不含（ＡＳＭ－ｆｒｅｅ）カゼイントリプトンベースの、明確で、非毒性、非有害な培地が、遺伝子改変ゲオバチルス株の発酵のために本発明者らにより開発された。この培地は、遺伝子改変ゲオバチルス株の生産的発酵のための、潜在的に毒性の金属塩類または金属イオンキレート化剤（例えば、トリニトリル酢酸、など）の添加を必要としない。発酵温度範囲は、約５２～５５℃に設定され、安定に保持され得るが、より大きな温度範囲も意図されており、使用可能である。培養は、ｐＨ約７．２～７．６に維持され得るが、より広いｐＨ範囲も意図されており、使用可能である。１０ｍＭのヘペス緩衝液の添加は、必要に応じて行われ得る。非毒性のシリコーン系消泡剤は、制御された発酵プロセスのために、必要に応じ添加され得る。

リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、増殖している培養物から、発酵プロセスの種々のステージで単離され、それらの濃度が培養装置当たりのリボソーム濃度の尺度として、測定される。ｒＲＮＡのサイダ濃度は、新鮮培地中での増殖の６～７時間後に観察された。いくつかの実施形態では、培養物は、次第に増加する体積を有する多相中で増殖され、最終的には７．５Ｌになり得る。培養物は、０．５のＯＤ_６００になるように接種され、５２～５５℃で６～８時間増殖されて、２．５～２．８の最終ＯＤ_６００およびｐＨ７．２～７．６になる。

収集、洗浄された細胞（３ｘ）から、１回の凍結／解凍サイクルを－８０℃で一晩実施後、溶解物が調製される。凍結／解凍サイクル後、細胞をＲＮアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤含有ヘペス緩衝生理食塩水中に再懸濁し（１．２５：１の細胞対緩衝液比）、確立されたプロトコルを用いて、２～４℃で５分間未満の時間（１０秒「オン」、３０秒「オフ」サイクル）超音波により粉砕した。使用したリシスバッファー、ＣＦ－Ｌ１は、非毒性、非有害性である。粒子は、遠心分離（１２，０００ｇ、４℃、１０分）により溶解物から除去され、反応緩衝液ＣＦ－１に組成が類似であるが２０％ｖ／ｖのグリセロールを含み、プロテアーゼ阻害剤を含まない、無毒性貯蔵緩衝液、ＣＦ－Ｓｔ、に対して透析した。抽出物を清澄化するための、３０分の流出反応（閉管中、２５０ｒｐｍおよび３０℃で振盪）および追加の遠心分離（同じ条件）は、通常必要ない。生き残っている可能性のある細菌および／または細菌および真菌混入を、溶解物およびペレット化残骸をｍＬＢ／ＣＳ培地、ＮＢ、ＩＳＰ２、血液－脳寒天の寒天プレート上で画線培養することにより特定し、３０℃および５５℃で２日間インキュベートする。細胞破壊比率は、一貫して約９９．９５％超（２００μＬの再懸濁残骸当たり１生存物未満および１ｍＬの溶解物当たり１コロニー形成単位（ＣＰＵ）未満）である。一実施形態では、７．５Ｌの発酵槽の処理により、約３０ｍｌの抽出物を生成し得る。当然のことであるが、操作者の要望および／または必要に応じて、それに合うように、これらの量／体積は、スケールアップおよび／またはスケールダウンされ得る。

清澄化溶解物の全ＲＮＡ抽出物を用いて、リボソーム濃度を測定し得る。溶解物の全タンパク質濃度は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法により測定され、一貫して１５０～１６０ｍｇ／ｍＬの範囲にある。一定分量の溶解物が－８０℃で貯蔵され、これは、抽出物の安定性測定（沈殿物なし）およびＣａｓ９－ｓｆＧＦＰ構築物の一貫したインビトロ転写／翻訳速度（ＵＶ／Ｖｉｓ吸収および蛍光測定により測定）により示されるように、６ヶ月間以上安定であり得る。溶解物およびインビトロ転写／翻訳反応は、ｐＨ７．８～８．０の範囲で維持され得る。ＣＦ反応条件の塩濃度は変化し得る。各溶解物バッチは、Ｃａｓ９－ｓｆＧＦＰ直鎖構築物（一貫性のある折り畳みを有するより大きなタンパク質の生成）およびルシフェラーゼ構築物（酵素活性）のインビトロ転写／翻訳活性により評価され得る。

実施例８：遺伝子改変ゲオバチルス株を利用して生成した無細胞抽出物。
上述のように、本発明者らは、σ因子ＲｐｏＤ（ゲオバチルス由来）の過剰発現が大腸菌およびゲオバチルスの細菌培養物中の細菌性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）を発現上昇させたことを観察した。組み換え遺伝子構築物は、ゲオバチルス中で構成的に遺伝子改変バージョンのＲｐｏＤ_ｘを発現するように調製された。遺伝子構築物の機能的信頼性およびタンパク質発現レベルが測定され、同じゲオバチルス株中に形質転換されたｓｆＧＦＰ構築物を用いて、作製した溶解物の５１０ｎｍの蛍光読み値により、モニターされる。

本発明者らは、インビトロ転写のために、細菌性ＲＮＡＰと一緒に、ＲｈＩＩＩプロモーターを追加して利用した。より厳密なＲｐｏＤ／プロモーター認識のために、組換えにより改変されたＲｈＩＩＩプロモーターはいくつかの実施形態で利用され得る。あるいは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡＰポリメラーゼがＣＦ反応に添加される場合には、Ｔ７プロモーターが使用できる。いくつかの実施形態では、知的所有権下にある、バクテリオファージＴ７由来の天然のＲＮＡＰに比べて１つまたは複数の単一点変異を有する遺伝子改変Ｔ７ ＲＮＡＰ（Ｔ７ｘ）が利用され得る。このような点変異は、二重鎖ＤＮＡのより高速な融解を可能とし、ＲＮＡＰの単鎖テンプレートＤＮＡとの複合体安定性を高め得る。この実施形態では、Ｔ７ｘは、不完全性が顕著に少ない転写物を可能とし、市販のＴ７－ＲＮＡＰに比べて、一貫してより高いｍＲＮＡ濃度をもたらし得る。本発明者らは、両方のＲＮＡＰが確実に機能し、４５，０００塩基長までの構築物について、再現可能で予測可能な結果をもたらすことを実証した。

実施例９：新規ＡＴＰエネルギー再生系を有するインビトロ無細胞発現系。
上記で詳述のように、特定の実施形態では、本発明は、細胞エネルギー源、ＡＴＰが、二重酵素系を用いて無機ポリリン酸から再生される無細胞発現系に関する。大腸菌からクローニングされ、産生されたホモログ酵素（ｅｃＰＰＫまたはＰＰＫ）に対して、ポリリン酸加水分解活性が観察された後で、サーモフィルス・アクアティクス由来の耐熱性のポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）（ＴａｑＰＰＫ）を利用して、系のための１つの酵素が開発された。報告されたＰＰＫ活性の他に、コレラ菌から単離されたＴａｑＰＰＫおよびｅｃＰＰＫは、ＡＭＰからＡＤＰを生成し、加水分解された無機ポリリン酸（ｉＰＰｉ）を生成するのが好ましい。第２の酵素ステップとして、その後、２分子のＡＤＰが、耐熱性のアデノシンキナーゼ（ＡｄＫ）により再構成されて、１つのユニットのＡＴＰおよびＡＭＰを形成する。

ルシフェリン発光の測定により判断して、この系は、１０ｎＭのＡＭＰ、１５０μｇ／ｍｌのルシフェリン、１ｍｇ／ｍｌのｉＰＰｉおよび触媒量の酵素からなる溶液へのルシフェラーゼの添加後、少なくとも３２時間にわたり効率的に作用することが明らかになった。少なくとも３００の総酵素代謝回転数が、Ｇｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫ対で測定された。この酵素ループは、少なくとも７２時間、および少なくとも最大１週間以上活性なままで維持され得る。一実施形態では、供給溶液中のＡＴＰ濃度は、安定な１．５ｍＭ ＡＴＰで維持され得る。本発明者らは、ＴａｑＰＰＫは、約３，０００の最大総代謝回転数を有し、したがって、本発明の無細胞発現系において、ＴａｑＰＰＫのタンパク質濃度のさらなる削減が可能となることをさらに示した。これは、蓄積するピロリン酸塩／ピロホスフェートによる無細胞反応系へのフィードバック抑制の原因となる、ポリリン酸のランダム加水分解を防止または最小化し、同時に、所望のレベルのＡＴＰを産生／維持し得る。

現在の大腸菌ベース無細胞系は、主に、クレアチンリン酸／クレアチンキナーゼ、またはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）に、主要エネルギー再生系として依存しているが、この系では、ＰＫは、低い一桁の総代謝回転数であり、また、副産物のピルビン酸塩は、翻訳反応の阻害剤であることが明確になっているので、このような新規エネルギー再生特性は重要である。このように、本発明は、従来の無細胞発現系とは異なるのみでなく、実際に、当該技術分野において既知の従来の無細胞発現系に対する実証可能な改善を示している。

本発明者らの無細胞発現系のレドックス電位は、ソルビトール－脱水素酵素（ＳＤＨ）により安定化され得る。一実施形態では、このＳＤＨは、耐熱性（ｔＳＤＨ）であり得る（このようなｔ表記は、本明細書で言及される他の分子に一般的に適用可能である）。精製タンパク質試料のＮＡＤＨの３４０ｎｍ吸収を用いた酵素アッセイは、ソルビトールおよびＮＡＤ／ＮＡＤ（Ｐ）からフルクトースおよびＮＡＤＨ／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの順方向の変換は、逆方向の反応に比べて、８倍高速であることを示した。本発明者らは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスから、前本明細書で記載したように（Ｇｓｔ ＳＤＨ）、大腸菌中での発現のためにも最適化された、この遺伝子改変耐熱性酵素を生成し、これを２００ｍＭのソルビトールと一緒に供給溶液中に加え得る。反応産物はまた、解糖を介した追加のエネルギー源を提供し、反応混合物中に蓄積しない。

特定の実施形態では、無細胞発現系は、５ｍｌの初期体積の無細胞反応量、および８０ｍｌの供給溶液を含み、容器中での連続的な交換反応および均一反応条件を確保し得る。０．５ｍｌ～２リットル以上の反応量の無細胞発現系がさらに意図され得る。

実施例１０：無細胞発現系反応設定。
一実施形態では、ＣＦ系は、トリス酢酸緩衝液（ＣＦ－１）を用いて、供給および反応コンパートメント中でｐＨ６．９～８．０の範囲で調節および安定化され得る。反応容器中の溶解物の最終濃度は、１００～１１０ｍｇ／ｍｌ総タンパク質であり得、一方、テンプレートＤＮＡ（あるいは、プレランＲＮＡ／ＲＮＡＰ反応として一緒に）は、補助因子、アミノ酸およびヌクレオチドと一緒に溶解物に添加される。供給溶液は、同一濃度のヌクレオチドおよび全天然アミノ酸を含む。補助因子、ソルビトールおよび上述の酵素も同様に添加される。材料の詳細リストは、夏季に適用され、通常、無細胞反応成分と呼ばれ得る。さらに、二重酵素ＡＴＰ再生系の一般的成分を含め得る。好ましい一実施形態では、このような成分は、限定されないが、一定量のＧｓｔ Ａｄｋ、一定量のＴａｑＰＰＫ、および／または一定量のＰＰｉ、および／または一定量のＡＭＰを含み得る。追加の実施形態は、一定量のＧｓｔ ＳＤＨおよびソルビトールを含み得る。

この例示的無細胞反応は、インキュベーター中、約３５～３７℃で実施し得、この間、反応器は約３００ｒｐｍで１６時間撹拌される。特定の実施形態では、この反応設定または組み合わせたインビトロ転写／翻訳反応の反応混合物は、３日超にわたり、標的タンパク質を生成するのに好適し得る。一例示的実施形態では、本発明の無細胞発現系は、３６時間超にわたりタンパク質を生成する安定性を提供し得る。

特定の一実施形態では、限定されないが、反応成分は、次記を含み得る：
－アミノ酸
－ポリリン酸塩
－トリス酢酸
－Ｍｇ（ＯＡｃ）_２
－Ｋ^＋－グルタミン酸
－アミノ酢酸
－ＮａＣｌ
－ＫＣｌ
－ＭｇＣｌ_２
－ＤＴＴ
－オクチル－ｂ－グリコシド
－ＮＡＤ（系中でＮＡＤＨに変換）
－ＮＡＤＰ（系中でＮＡＤＰＨに変換）
－ソルビトール
－ＦＡＤＨ（ＮＡＤＨ／ＦＡＤＨ細胞プロセスにより再生）
－ＡＴＰ
－ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰそれぞれ
－ＣｏＡ
－ＰＬＰ
－ＳＡＭ

特定の一実施形態では、限定されないが、無細胞反応成分は、次記を含み得る：
－２ｍＭの各天然アミノ酸
－１ｍｇ／ｍｌのポリリン酸
－５ｍＭのトリス酢酸
－４ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）_２
－１２ｍＭのＫ^＋－グルタミン酸
－１ｍＭのアミノ酢酸
－１００ｍＭのＮａＣｌ
－１０ｍＭのＫＣｌ
－５ｍＭのＭｇＣｌ_２
－０．１ｍＭのＤＴＴ
－０．２％のオクチル－ｂ－グリコシド
－０．８ｍＭのＮＡＤ（系中でＮＡＤＨに変換）
－０．４ｍＭのＮＡＤＰ（系中でＮＡＤＰＨに変換）
－２００ｍＭのソルビトール
－０．５ｍＭのＦＡＤＨ（ＮＡＤＨ／ＦＡＤＨ細胞プロセスにより再生）
－１．５ｍＭのＡＴＰ
－１ｍＭのそれぞれＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ
－１ｍＭのＣｏＡ
－２ｍＭのＰＬＰ
－０．２ｍＭのＳＡＭ

いずれかの無細胞反応成分の全ての量、濃度、容量および比率は、反応量、持続時間、または産生される発現産物、および他の変量に応じて変化し得るので、例示的なものに過ぎない。無細胞反応成分は、限定されないが、細胞抽出物により供給されるにしても、または細胞抽出物に添加するにしても、転写／翻訳機構に必要な全ての他の成分、エネルギーを供給すると共に合成に必要なアミノ酸、ヌクレオチド、代謝成分をさらに含み得る。無細胞反応成分は、採用され得る細菌、藻類、微細藻類、古細菌、真菌および／またはファーミキューテスの株に特異的な一定量のｔＲＮＡをさらに含み得る。例えば、この上記実施形態では、天然ゲオバチルスｔＲＮＡが添加され得る。さらに、無細胞反応成分は、レアコドンに起因する翻訳の停止を克服し得る一定量のｔＲＮＡをさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、レアコドンに起因する翻訳の停止を克服するために、大腸菌ｍｒｅ６００由来のｔＲＮＡを無細胞反応系中に含み得る。

実施例１１：インビトロ無細胞発現による破傷風菌Ｅ８８テントキシリシンの高効率生成。
本発明者らは、例示的実施形態として、本明細書で一般的に記載のＧｓｔ Ａｄｋ／ＴａｑＰＰＫの組み合わせによるＡＴＰエネルギー再生を利用する本発明の無細胞発現系の少なくとも１つの実施形態を利用して、テントキシリシン（破傷風神経毒）のインビトロ発現を実証する。

テントキシリシン（ＴｅｔＮＴ）は、１５０ｋＤの単鎖プロトタンパク質として天然で産生される。ＴｅｔＮＴは、エンドペプチダーゼモチーフ、Ｍ_２３２ＨＥＬＩＨＶＬ_２３９の位置でＺｎ^２＋カチオンに配位結合し、これは、Ａ_４５７とＳ_４５８の間での完全長ポリペプチドのタンパク質切断を可能にする。２つのシステイン残基（Ｃ_４３９およびＣ_４５７）の選択的酸化は、両鎖間でジスルフィド架橋を形成し、短鎖、Ｍ_１～Ａ_４５７、および調査、Ｓ_４５８～Ａ_１３１９からなる活性破傷風毒素タンパク質複合体の形成を可能とする。その後、このタンパク質は、破傷風菌ファミリーの天然産生株により排出される。

ＴｅｔＮＴは、内在化するＺｎ^２＋依存性エンドペプチダーゼであり、毒素／ガングリオシド受容体複合体形成を介して、シナプトブレビン－２をＧｌｎ_７６とＰｈｅ_７７との間で加水分解する。シナプス小胞上のシナプトブレビン－２受容体の加水分解は、阻害性神経伝達物質ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の放出を防止する。これは最終的に、破傷風とされている患者で、他の症状に加えて、硬直筋けいれんを引き起こす。ｔｅｔＸ遺伝子は、破傷風菌Ｅ８８ゲノム中に位置し、前もって、大腸菌タンパク質発現プラスミドＣＴＣ＿ｐ６０上にさらにコードされていた。遺伝子産物は、以前にクローニングされ、異種のタンパク質として発現されて、タンパク質活性が確認され、また、高解像度構造タンパク質調査が行われた。ＴｅｔＮＴの潜在的Ｎ－アセチル－ｂ－ノイラミン酸改変活性は、以前に記載され、当該技術分野において既知でもある。

ＦＤＡ規則によると、現在のヒトワクチン接種に好適な、ｔｅｔＸトキソイドは、活性破傷風菌培養物から得られる。完全に折り畳まれ、排出された毒素は、硫酸アルミニウムおよび硫酸アンモニウムの添加から生じた綿状沈殿により活性培養物から取り出される。抽出された毒素はその後、ホルムアルデヒドの添加により不活化され、ワクチン接種に好適するトキソイドが得られる。ＦＤＡは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣプロファイルおよび精製の形の品質管理手段を提案しているが、これは現時点では必要とされていない。

確定した当該技術分野において現時点の既知の単離および調製プロトコルは、危険を伴う。官庁により、破傷風ワクチン接種を、７歳以上の子供および成人に対して推奨していることから、これらの危険性はＦＤＡにより認識されている。ワクチン接種は、５％の破傷風菌感染の危険性を有する。Ｔｅｔトキソイドの発酵に基づく生産の最大の課題は、毒素の完全な失活を保証するホルムアルデヒド濃度の制御、および全てのワクチン接種の４０％を効果的でなくする最終生成物中のトキソイド濃度の制御である。

例示的実施形態として、これらの課題および生産制限は、発酵プロセスを本発明のインビトロ転写／翻訳ベース製造方法に置き換えることにより対処できる。芽胞の持ち越し汚染およびいずれか他の残存菌は存在せず、医薬品有効成分（ＡＰＩ）の完全無菌性を保証する。タンパク質濃度は、全プロセス中にモニターされ、最終生成物は標準的実験室法により制御され得る。

本発明者らは、ＴｅｔＮＴ発現用の遺伝子構築物を生成した。この実施形態では、遺伝子構築物は、遺伝子合成用に設計され、具体的には、直鎖ＰＣＲテンプレートとして、インビトロ転写／翻訳反応、または無細胞発現反応中に供給されるように設計された。存在する無細胞発現系における直鎖ＤＮＡの使用は、いくつかの実施形態では、それが導入できないので、それが組み替え、複製または形質移入できないので、好ましい。直鎖遺伝子構築物は、次の基礎的構成を含み得る：（（プロモーター）－（ＲＢＳ）－（開始）（発現産物検出部位－検出タグ＋精製タグ）（停止））。特定の一実施形態では、この構成は次記を含み得る：（プロモーター）－（ＲＢＳ）－（開始）（ＴｅｔＮＴ ＴＥＶ ｍＣｈｅｒｒｙ Ｈ６）（停止）。

この実施形態では、プロモーターは、ＲｈＩＩＩプロモーター配列（配列番号１８）、あるいは、Ｔ７プロモーター配列（配列番号１９）を含み得る。ＲＢＳ（リボソーム結合部位）は、ゲオバチルス配列（配列番号２０）と一致したＴ７遺伝子ファージに由来し得る（本来、これらの例示的実施例とは別に、いくつかのプロモーターを利用し得る）。組換えＴｅｔＮＴ遺伝子は、配列番号２１を含み得る。この組み換えＴｅｔＮＴ遺伝子では、ストップ配列が除去される。最終的に、ＴＥＶｓｉｔｅ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｈｉｓ６は、ｍＣｈｅｒｒｙからストップを除去して、配列番号２２を含み得る。留意すべきは、別の配列として提供されているが、遺伝子構築物は一般的に説明されたＤＮＡの単一の直鎖ＰＣＲフラグメントとして提供され得ることである。

この例では、安全上および機密上の懸念から、好ましい実施形態では、完全長破傷風毒素をコードするＤＮＡ遺伝子合成は、２つの別々の環状構築物として進め得、これは、増幅目的のために、実験室で単一プラスミドに組み替えられることになる。例えば、第１の構築物は、自己触媒プロテアーゼ位置（配列番号１３）およびジスルフィド架橋形成システインを有するＴｅｔＮＴ軽鎖（配列番号１２）をコードする。第２の構築物は、ＴｅｔＮＴ重鎖（配列番号１４）をコードし、これは、部分的に統合されたＴＥＶ部位（配列番号１５）およびｍＣｈｅｒｒｙ－Ｈｉｓ６（配列番号１６）をコードする。個別の遺伝子構築物およびアミノ酸配列として組換えタンパク質が提供されるが、このような配列は、最終的に単一直鎖ポリペプチド（配列番号１７）を生成する単一構築物の一部となり得、この単一構築物は、ＰＣＲ増幅直鎖ＤＮＡ構築物として、ポリヌクレオチド配列に対応し得る。追加の実施形態は、単一直鎖ポリペプチドを形成する異なる構築物を含み得る。

本発明者らは、前に記載した二重酵素ＡＴＰ再生系をさらに利用した、無細胞タンパク質合成により完全長１５０ｋＤａのプロトキシンの発現を示した。この特定の実施形態では、無細胞タンパク質合成による完全長１５０ｋＤａのプロトキシンの発現は、記載条件による５ｍｌの反応器中で起こり得る。反応進行は、５８７ｎｍ励起波長および赤方偏移蛍光を有するタグ付きｍＣｈｅｒｒｙの昼光蛍光によりによってモニターし得る。タンパク質濃度の増加がそれ以上観察されなくなった後で、反応容器の含有物を５０ｍｌの反応管に移す。達成された反応時間およびタンパク質濃度が連続的に測定できる。

ラクトース含有１０ｍＭのヘペス緩衝液ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴを加えて、反応混合物を１０倍に希釈し得る。１～２ｍＬのＮｉ－ＩＤＡ樹脂をこの溶液に加え、約２０～２５℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。この樹脂の結合能力は、６０ｍｇまでのＨｉｓ６－タグ付きタンパク質に対し、十分であり得る。Ｈｉｓ６－タグプロトキシンが樹脂に結合後、樹脂を収集し、上清洗浄緩衝液を取り出す。直ぐに、蛍光により、ＴｅｔＮＴプロトキシンが上清中に存在しないことを確認する。

収集したタンパク質充填樹脂を５０ｍｌのラクトース含有ヘペス緩衝液ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、還元剤非存在下の周囲温度でインキュベートした。還元剤の非存在下で、種々の時間にわたり、種々の濃度（２％～大気中の量）のＯ_２に曝露下、自然発生的折り畳み／リフォールディング、自然ジスルフィド架橋の酸化的形成を、ＴｅｔＮＴの長鎖内およびＴｅｔＮＴの長鎖と短鎖の間で開始する。

折り畳み／リフォールディングの後で、ＺｎＣｌ_２をタンパク質溶液に２ｍＭの最終濃度まで加え得る。これは、内部自動タンパク質分解活性を活性化して、樹脂吸着ＴｅｔＮＴの長鎖と短鎖との間のペプチド結合を切断する。最初は、２０～２５℃で約２時間のインキュベーション時間を使用し得る。遺伝子改変されたｍＣｈｅｒｒｙおよびＨｉｓ６－タグが天然標的の認識および結合部位の立体障害により活性を阻止するので、この時点で、毒素は不活性になる。さらに、樹脂のビーズサイズが全体粒径をかなり増大させ、タンパク質がエアロゾル化または吸収される危険性を減らす。ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光検出の容易さは、この段階で、タンパク質の跡をたどるのに、および潜在的に毒性の材料の望ましくない曝露または意図しない廃棄を防止するのに役立つ。緩衝液を交換して、全てのジスルフィド架橋を形成しなかった不完全に折り畳まれた毒素フラグメントを除去し得、また、溶液から過剰のＺｎＣｌ_２を除去する。

精製Ｈｉｓ６－タグ付きＴＥＶプロテアーゼが、反応混合物に添加され得、試料が２０～２５℃で数時間インキュベートされる。ＴＥＶプロテアーゼも同様に、樹脂に吸着され得、結合したままで残るが、活性化される破傷風毒素は、ＴＥＶプロテアーゼ部位を切断することにより樹脂から放出される。このプロセスは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の消光によりモニターできる。消光は、ｍＣｈｅｒｒｙの欠損したＮ－末端と重なり合うＴＥＶ部位の切断およびその結果としての、蛍光タンパク質の部分的アンフォールドが原因である。蛍光が検出できなくなった後で、まだアンフォールドｍＣｈｅｒｒｙ－Ｈｉｓ６およびＴＥＶ－Ｈｉｓ６プロテアーゼを保持している樹脂は、集められ、上清は、目的の無菌緩衝液中の純粋なＴｅｔＮＴのみを含むはずである。

本発明者らにより、上清は、知的所有権下にある抗Ｔｅｔ Ｆａｂを用いて試験して、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットアッセイで適切なタンパク質折り畳みが確認され、同時に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＦＰＬＣプロファイルにより、試料の純度が確認される。タンパク質濃度の測定後、必要量のホルムアルデヒドを加えて、不活化トキソイドを得ることができる。最終試料中の、適切に折り畳まれた活性タンパク質のレベルを確認するための有効量を決定する動物アッセイを実施し得る。無論、上述のように、このプロトコルは性質上、例示的なものである。当業者なら、このようなプロトコルを同様に採用して、過度な実験をすることなく、他のクロストリジウムから類似のタンパク質ならびにその他の目的のタンパク質を産生し得ることを理解するであろう。

配列リスト
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの事例では、アミノ酸の単一文字表記が本明細書で適用されるが、電子的に提出されたフォーマットでは、３文字表記が適用されている。米国特許仮出願第６２／４４０，９７５号で開示された全ての先行配列データは、参照により本明細書に組み込まれる。
表１：配列表
配列番号１
SGSSMIEIEKPKIETVELSEDAKYGKFVVEPLERGYGTTLGNSLRRILLSSLPGAAVTSVQIDGVLHEFSTIDGVVEDVTAIILNIKKLALKIYSDEEKTLEIDVQGEGVVTAADITHDSDVEILNPDLHIATLAEGGRLRMRMTAKRGRGYVPAEANKREDQPIGVIPIDSIYTPVSRVSYQVENTRVGQV
TDYDKLTIDVWTDGSIGPKEAISLGAKILTEHLNIFVGLTDEAQNAEIMVEKEDDQKEKVLEMT
IEELDLSVRSYNCLKRAGINTVQELTQKTEEDMMKVRNLGRKSLEEVKAKLAELGLSLRKDDGRRAA
配列番号２
SGSSMTGRLVQYGRHRQRRSYARISEVLELPNLIEIQTSSYQWFLDEGLREMFREISPIEDESGNLSLEFIDYSLGEPKYTVEEAKERDVTYAAPLRVKVRLINKETGEVKEQDVFMGDFPLMTETGTFIINGAERVIVSRLVRSPSVYYSDKVDKNGKRGYSATVIPNRGAWLEYETDAKDVVYVRIDRTRKLPVTVLLRALGFSSDQEIIDLLGDNEYLRNTLEKDNTDSTEKALIEIYERLRPGEPPTLENAKNLLASRFFDPKRYDLASVGRYKINKKLHIKNRLFNQRLAETIIDPETKEVIAEAGAMIDRRTLNRLLPYLEKGVGLQTYRPAEGVVDGDISVQTIKIYAPNDPDGEKVINVIGNGFIAEDVKHITPADIIASISYFFNLLHGVGDTDDIDHLGNRRLRSVGELLQNQFRIGLSRMERVVRERMSIQDTNTITPQQLINIRPVIAAIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLTRERAGFEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSTYAKVNKFGFIETPYRRVDPETGRVTDQIDYLTADEEDNYVVAQANVPLAEDGTFLEENVVARFRGENIVVKRDRVDYMDVSPKQVVSAATACIPFLENDDSNRALMGANMQRQAVPLLEPEAPIVGTGMEYVSAKDSGAAVICKHRGIVERVEAKEIWVRRLIEVDGKEVKGDLDKYRLLKFVRSNQGTCYNQRPIVKKGDIVEKGEILADGPSMDKGELALGRNVLVAFMTWDGYNYEDAIIMSERLVKEDVYTSIHIEEYEAESRDTKLGPEEITRDIPNVGEDALKNLDERGIVRIGAEVKDGDLLVGKVTPKGMTELTAEERLLHAIFGEKAREVRDTSLRVPHGGGIVLDVKVFNREDGDELPPGVNQLVRVYIVQKRKISEGDKMAGRHGNKGVISRILPEEDMPFLPDGTPIDIMLNPLGVPSRMNIGQVFELHLGMAAKKLGLHIASPVFDGATEEDVWNILEEAGLARDAKTVLYDGRTGEPFDNRVSVGIMYMIKLAHMVDDKLHARSTGPYSLVTQQPLGGKAQFGGQRFGEMEVWALEAYGAAYTLQEILTVKSDDVVGRVKTYEAIVKGENIPEPGVPESFKVLIKELQSLGMDVTILTSDEQEVNMENFDDDDDHAPDAIMVDVKPAEREEAGEEKDAVTKEGRRAA
配列番号３
SGSSMLDVNKFEYMKIGLASPEKIRSWSYGEVKKPETINYRTLKPEKDGLFERIFGPTKDWECHCGKYKRVRYKGVVCDRCGVEVTRSKVRRERMGHIELAAPVSHIWYFKGIPSRMGLVLDMSPRALEEVIYFASYVVTDPGDTPLEKKQLLSEKEYRAYREKYGQSFQASMGAEAIKKLLQDIDLDKEVAALKEELKTAQGQRRARIIKRLEVLEAFRSSGNDPAWMVLDVLPVIPPELRPMVQLDGGRFATSDLNDLYRRVINRNNRLKRLLDLGAPNIIVQNEKRMLQEAVDALIDNGRRGRPVTGPGNRPLKSLSHMLKGKKGRFRQNLLGKRVDYSGRSVIVVGPNLKMYQCGLPKEMALELFKPFVMKELVERGLAHNIKSAKRKIERVHPEVWDVLEDVIKEHPVLLNRAPTLHRLGIQAFEPTLVEGRAIRLHPLVCTAYNADFDGDQMAVHVPLSAEAQAEARLLMLAAQNILNPKDGKPVVTPSQDMVLGNYYLTMEREGAIGEGMVFKDTDEALLAYHNGYVHLHSRIAIHAGSLKNETFTEEQNNKLLLTTVGKLIFNEILPNSFPYINEPTTENIEGRTPDKYFLDKGVNVREEIRKRELVPPFKKKVLGQIIAEVFKRFKITETSKMLDRMKDLGFQYSTKAGITIGVADIVVLPEKQEILDEAQAKVDTVLKQFRRGLITDEERYERVISIWSAAKDKIQDRLMKSLDKRNPIFMMSDSGARGNASNFTQLAGMRGLMANPAGRIIELPIKSSFREGLTVLEYFISTHGARKGLADTALKTADSGYLTRRLVDVAQDVIVREEDCGTDRGILARALTDGTEVVVKLEERLVGRYAHKTVRHPETGEVIVRKDEMITEDIANEIIKAGITEVWIRSVFACNTRHGVCKKCYGRNMATGMDVEVGEAVGIIAAQSIGEPGTQLTMRTFHTGGVAGDDITQGLPRVQELFEARNPKGQAVISEIDGTVISINETRDNQYEIVVQSEVETRTYVAPYNARLKVEEGQRVERGQELTEGSVDPKQLLRVRDITSVQEYLLREVQKVYRMQGVEISDKHIEVMVRQMLRKVRVIDAGDTDVLPGTLLDVHQFTDVNAKALREGKRPATARQVLLGITKASLETDSFLSAASFQETTRVLTDAAIKGKRDELLGLKENVIIGKLVPAGTGMARYRKVKPAVKKETAGGTVSSKGRRAA
配列番号４
SGSSMLDVNKFEYMKIGLASPEKIRSWSYGEVKKPETINYRTLKPEKDGLFCERIFGPTKDWECHCGKYKRVRYKGVVCDRCGVEVTRSKVRRERMGHIELAAPVSHIWYFKGIPSRMGLVLDMSPRALEEVIYFASYVVTDPGDTPLEKKQLLSEKEYRAYREKYGQSFQASMGAEAIKKLLQDIDLDKEVAALKEELKTAQGQRRARIIKRLEVLEAFRSSGNDPAWMVLDVLPVIPPELRPMVQLDGGRFATSDLNDLYRRVINRNNRLKRLLDLGAPNIIVQNEKRMLQEAVDALIDNGRRGRPVTGPGNRPLKSLSHMLKGKKGRFRQNLLGKRVDYSGRSVIVVGPNLKMYQCGLPKEMALELFKPFVMKELVERGLAHNIKSAKRKIERVHPEVWDVLEDVIKEHPVLNRAPTLHRLGIQAFEPTLVEGRAIRLHPLVCTAYNADFDGDQMAVHVPLSAEAQAEARLLMLAAQNILNPKDGKPVVTPSQDMVLGNYYLTMEREGAIGEGMVFKDTDEALLAYHNGYVHLHSRIAIHAGSLKNETFTEEQNNKLLLTTVGKLIFNEILPNSFPYINEPTTENIEGRTPDKYFLDKGVNVREEIRKRELVPPFKKKVLGQIIAEVFKRFKITETSKMLDRMKDLGFQYSTKAGITIGVADIVVLPEKQEILDEAQAKVDTVLKQFRRGLITDEERYERVISIWSAAKDKIQDRLMKSLDKRNPIFMMSDSGARGNASNFTQLAGMRGLMANPAGRIIELPIKSSFREGLTVLEYFISTHGARKGLADTALKTADSGYLTRRLVDVAQDVIVREEDCGTDRGILARALTDGTEVVVKLEERLVGRYAHKTVRHPETGEVIVRKDEMITEDIANEIIKAGITEVWIRSVFACNTRHGVCKKCYGRNMATGMDVEVGEAVGIIAAQSIGEPGTQLTMRTFHTGGVAGDDITQGLPRVQELFEARNPKGQAVISEIDGTVISINETRDNQYEIVVQSEVETRTYVAPYNARLKVEEGQRVERGQELTEGSVDPKQLLRVRDITSVQEYLLREVQKVYRMQGVEISDKHIEVMVRQMLRKVRVIDAGDTDVLPGTLLDVHQFTDVNAKALREGKRPATARQVLLGITKASLETDSFLSAASFQETTRVLTDAAIKGKRDELLGLKENVIIGKLVPAGTGMARYRKVKPAVKKETAGGTVSSKGRRAA
配列番号５
SGSSMSLQQQYSPEELQEMSFVELANLILLDKREALPFDQLVREAAALAGISEEEMEARLAQYY
TDLNIDGRFICVGENVWGRAWYPFDQTEDETVTIVKPKKKKKALDDEYDEYDELLEDEDLDYDDLDEYDEEELELDEDELLEDEEFDLDEDVAFDDDILGDEEFELGDAPLDEELDLEEPEEDEGRRAA
配列番号６
SGSSMLYPSIDLLMQKVDSKYKLVTVVAKRARELQDGAELMVKKPVSKKFVGQALEEIAGDKVELVEEEKGRRAA
配列番号７
MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTMAEKPAQSKQAEAAGESLEQVKEQLAELGKKRGILTYEEIAERLSGFDLDSDQMDEYYEYLAEQGIEVISESDLEADPDIDDLAKEEEFDLNDLSVPPGVKINDPVRMYLKEIGRVPLLSAEEEIELAKRIEQGDEEAKRRLTEANLRLVVSIAKRYVGRGMLFLDLIQEGNMGLIKAVEKFDYRKGYKFSTYATWWIRQAITRAIADQARTIRIPVHMVETINKLIRVQRQLLQDLGREPTPEEIAEEMDLTPEKVREILKIAQEPVSLETPIGEEDDSHLGDFIEDQDATSPSEHAAYELLKEQLEDVLDTLTDREENVLRLRFGLDDGRTRTLEEVGKVFGVTRERIRQIEAKALRKLRHPSRSKRLKDFLE
配列番号８
SGSSMNLVLMGLPGAGKGTQAGKIVEAYGIPHISTGDMFRAAIKEGTPLGLQAKQYMDRGDLVPDELQAKQYMDRGDLVPDEGFLLDGFPRTVAQAEALETLLSEIGRKLDYVIHIDVRQEVLMERLTGRRICRNCGATYHLVFHPPAKPGVCDKCGGDLYQRPDNEATVANRLEVNMKQMKLLLDFYEQKGYLRHINGEQEMEKVFADICEVLGGLARGRRAA
配列番号９
SGSSMGQEKLYIEKELSWLSFNERVLQEAADKSNPLIERMRFLGIYSNNLDEFYKVRFAELKRRIIISEEQGSNSHSRHLLGKIQSRVLKADQEFDGLYNELLLEMARNQIFLINERQLSVNQQNWLRHYFKQYLRQHITPILINPDTDLVQFLKDDYTYLAVEIIRGDTIRYALLEIPSDKVPRFVNLPPEAPRRRKPMILLDNILRYCLDDIFKGFFDYDALNAYSMKMTRDAEYDLVHEMEASLMELMSSSLKQRLTAEPVRFVYQRDMPNALVEVLREKLTISRYDSIVPGGRYHNFKDFINFPNVGKANLVNKPLPRLRHIWFDKAQFRNGFDAIRERDVLLYYPYHTFEHVLELLRQASFDPSVLAIKINIYRVAKDSRIIDSMIHAAHNGKKVTVVVELQARFDEEANIHWAKRLTEAGVHVIFSAPGLKIHAKLFLISRKENGEVVRYAHIGTGNFNEKTARLYTDYSLLTADARITNEVRRVFNFIENPYRPVTFDYLMVSPQNSRRLLYEMVDREIANAQQGLPSGITLKLNNLVDKGLVDRLYAASSSGVPVNLLVRGMCSLIPNLEGISDNIRAISIVDRYLEHDRVYIFENGGDKKVYLSSADWMTRNIDYRIEVATPLLDPRLKQRVLDIIDILFSDTVKARYIDKELSNRYVPRGNRRKVRAQLAIYDYIKSLEQPEGRRAA
配列番号１０
MRLLPEESWLQFNRRVLRQSERPDFPLLERMRFLAIWNRNLDEFFAARIAKPFLKHRGSAHLRLLKEAEDQARLAEGRYRALLAEAAPHLKILEPEELDDLDWLYFRVFLAEVVVPKTDLIAWEAAKEASHGALYFASEDHLVRLPQDLPRLLKVPGREGTYVRLGALMRARSDLFLPRESPLYEFRVLRLLESERARADWDELAQALEGRQEGLSTLLVAERGFPKGWLEGLQEALGLLPEEVILLSPPLNLTLVETLVAEGPSRWRFPPLEPKRPRAFMKNPLKRLQEKDLVLYHPFEDYAALERFAEAALSEEVEEV
YATLYRIGEANPLAEALIQAARAGKRVHVLLEPRARFDELLNLSWYLRFLRAGVAVLPLSERKV
HAKALLLLTQKGGYAHLGTGNYNPQNGRQYTDFSLFTARKEVVMEVAEFFRALQEGRTPRLNLL
KTGEAIQELLLEHIRAESHPKGRILLKCNHLTDPALLEALARAADKGARVDLIVRSTLTLLHPRFRARSLVGRFLEHARVAAFYQGGRWALYLTSADLMPRNFQNRFELLFPVLDKEGKAKVLEVLKRQLKDDRNAFLLSPKGETPLWGGRHDAQRILAW
配列番号１１
MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTMRLLPEESWLQFNRRVLRQSERPDFPLLERMRFLAIWNRNLDEFFAARIAKPFLKHRGSEAHLRLLKEAEDQARLAEGRYRALLAEAAPHLKILEPEELDDLDWLYFRVFLAEVVVPKTDLIAWEAAKEASHGALYFASEDHLVRLPQDLPRLLKVPGREGTYVRLGALMRARSDLFLPRESPLYEFRVLRLLESERARADWDELAQALEGRQEGLSTLLVAERGFPKGWLEGLQEALGLLPEEVILLSPPLNLTLVETLVAEGPSRWRFPPLEPKRPRAFMKNPLKRLQEKDLVLYHPFEDYAALERFAEAALSEEVEEVYATLYRTGEANPLAEALIQAARAGKRVHVLLEPRARFDELLNLSWYLRFLRAGVAVLPLSERKVHAKALLLLTQKGGYAHLGTGNYNPQNGRQY
TDFSLFTARKEVVMEVAEFFRALQEGRTPRLNLLKTGEAIQELLLEHIRAESHPKGRILLKCNHLTDPALLEALARAADKGARVDLIVRSTLTLLHPRFRARSLVGRFLEHARVAAFYQGGRWALYLTSADLMPRNFQNRFELLFPVLDKEGKAKVLEVLKRQLKDDRNAFLLSPKGETPLWGGRHDAQRIAW
配列番号１２
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSS
LIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGS
IMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSK
QEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDID
SYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTA
配列番号１３
MHELIHVL
配列番号１４
SLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGI
TELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDiNNDIISDISGFNSS
VITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQY
GTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVF
ITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTNDGSA.
配列番号１５
ENLYFQS
配列番号１６
GSGSNGSSGSVSMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYRSGGGHHHHHHGDL
配列番号１７
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDII
SDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTNDGSAENLYFQSGSGSNGSSGSVSMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYRSGGGHHHHHHGDL
配列番号１８
ATTCTGCAAAATCCTATTGTTTATCATACCTGATATAATGAAAAGATACGACACTAGGAGTGAATGGGCATG
配列番号１９
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC
配列番号２０
CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC
配列番号２１
ATGCCAATAACCATAAATAATTTTAGATATAGTGATCCTGTTAATAATGATACAATTATTATGATGGAGCCACCATACTGTAAGGGTCTAGATATCTATTATAAGGCTTTCAAAATAACAGATCGTATTTGGATAGTGCCGGAAAGGTATGAATTTGGGACAAAACCTGAAGATTTTAACCCACCATCTTCATTAATAGAAGGTGCATCTGAGTATTACGATCCAAATTATTTAAGGACTGATTCTGATAAAGATA
GATTTTTACAAACCATGGTAAAACTGTTTAACAGAATTAAAAACAATGTAGCAGGTGAAGCCTTATTAGATAAGATAATAAATGCCATACCTTACCTTGGAAATTCATATTCCTTACTAGACAAGTTTGATACAAACTCTAATTCAGTATC/TTTTAATTTATCAGAACAAGACCCCAGTGGAGCAACTACA
AAATCAGCAATGCTGACAAATTTAATAATATTTGGACCTGGGCCTGTTTTAAATAAAAATGAGG
TTAGAGGTATTGTATTGAGGGTAGATAATAAAAATTACTTCCCATGTAGAGATGGTTTTGGTTCAATAATGCAAATGGCATTTTGCCCAGAATATATACCCACTTTTGATAATGTAATAGAAAATATT
ACGTCACTCACTATTGGCAAAAGCAAATATTTTCAAGATCCAGCATTACTATTAATGCACGAACTTATACATGTACTACATGGTTTATACGGAATGCAGGTATCAAGCCATGAAATTATTCCATCCAAACAAGAAATTTATATGCAGCATACATATCCAATAAGTGCTGAAGAACTATTCACTTTTGGCGGA
CAGGATGCTAATCTTATAAGTATTGATATAAAAAACGATTTATATGAAAAAACTTTAAATGATTATAAAGCTATAGCTAACAAACTTAGTCAAGTCACTAGCTGCAATGATCCCAACATTGATATTGATAGCTACAAACAAATATATCAACAAAAATATCAATTCGATAAAGATAGCAATGGACAATATATT
GTAAATGAGGATAAATTTCAGATACTATATAATAGCATAATGTATGGTTTTACAGAGATTGAATTGGGAAAAAAATTTAATATAAAAACTAGACTTTCTTATTTTAGTATGAATCATGACCCTGTAAAAATTCCAAATTTATTAGATGATACAATTTACAATGATACAGAAGGATTTAATATAGAAAGCAAAGATCTGAAATCTGAATATAAAGGTCAAAATATGAGGGTAAATACAAATGCTTTTAGAAATGTTGATGGATCAGGCCTAGTTTCAAAACTTATTGGCTTATGTAAAAAAATTATACCACCAACAAATATAAGAGAAAATTTATATAATAGAACTGCATCATTAACAGATTTAGGAGGAGAATTATGTATAAAA
ATTAAAAATGAAGATTTAACTTTTATAGCTGAAAAAAATAGCTTTTCAGAAGAACCATTTCAAGATGAAACAGTTAGTTATAATACAAAAAATAAACCATTAAATTTTAATTATTCGCTAGATAAAATTATTTTAGATTATAATCTACAAAGTAAAATTACATTACCTAATGATAGGACAACCCCAGTTACAAAAGGAATTCCATATGCTCCAAAATATAAAAGTAATGCTGCAAGTACAATAGAAATACATAATA
TTGATGACAATACAATATATCAATATTTGTATGCTCAAAAATCTCCTACAACTCTACAAAGAATAACTATGACTAATTCTGTCGATGACGCATTAATAAATTCCACCAAAATATATTCATATTTTCCA
TCTGTAATCAGTAAAGTTAACCAAGGTGCACAAGGAATTTTATTCTTACAGTGGGTGAGAGATA
TAATTGATGATTTACCAATGAATCTTCACAAAAAACTACTATTGATAAAATTTCAGATGTATCCACTATTGTTCCTTATATAGGACCCGCATTAAACATTGTAAAACAAGGCTATGAGGGAAACTTTATAGGTGCTTTAGAAACTACCGGAGTGGTTTTATTATTGGAATATATTCCAGAAATTACTTTACCAGTAATTGCAGCTTTATCTATAGCAGAAAGTAGCACACAAAAAGAAAAGATAATAAAAACAATA
GATAACTTTTTAGAAAAAAGATATGAAAAATGGATTGAAGTATATAAACTAATAAAAGCAAAATGGTTAGGCACAGTTAATACGCAATTCCAAAAAAGAAGTTATCAAATGTATAGATCTTTAGAATATCAAGTAGATGCAATAAAAAAAATAATAGACTATGAATATAAAATATATTCAGGACCTGATAAGGAACAAATTGCCGACGAAATTAATAATCTGAAAAACAAACTTGAAGAAAAGGCTAATAAAGCAA
TGATAAACATAAATATATTTATGAGGGAAAGTTCTAGATCATTTTTAGTTAATCAAATGATTAA
CGAAGCTAAAAAGCAGTTATTAGAGTTTGATACTCAAAGCAAAAATATTTTAATGCAGTATATA
AAAGCAAATTCTAAATTTATAGGTATAACTGAACTAAAAAAATTAGAATCAAAAATAAACAAAGTTTTTTCAACACCAATTCCATTTTCTTATTCTAAAAATCTGGATTGTTGGGTTGATAATGAAGAAGATATAGATGTTATATTAAAAAAGAGTACAATTTTAAATTTAGATATTAATAATGATATTATA
TCAGATATATCTGGGTTTAATTCATCTGTAATAACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCCGGAATAAATGGCAAAGCAATACATTTAGTAAACAATGAATCTTCTGAAGTTATAGTGCATAAAGCTATGGATATTGAATATAATGATATGTTTAATAATTTTACCGTTAGCTTTTGGTTGAGGGTTCCTAAAGTATCTGCTAGTCATTTAGAACAATATGGCACAAATGAGTATTCAATAATTAGCTCTATGAAAAAATATAGTCTATCAATAGGATCTGGTTGGAGTGTATCACTTAAAGGTAATAACTTAATATGGACTTTAAAAGATTCCGCGGGAGAAGTTAGACAAATAACTTTTAGTGATTTATCTGATAAATTTAATGCTTATTTAGCAAATAAATGGGTTTTTATAACTATTACTAATGATAGATTATCTTCTGCTAATTTGTATATAAATGGAGTACTTATGAAAAATGCAGAAATTACCGGTTTAGGAGCTATTAGAGAGGATAATAATATAACATTAAAACTAGATAGATGTAATAATAATAATCAATACGTTTCTATTGATAAATTTAGGATATTTTGCAAAGCATTAAATCCAAAAGAGATTGAAAAATTATACACAAGTTATTTATCTATAACCTTTTTAAGAGACTTCTGGGGAAACCCTTTACGATATGATACAGAATATTATTTAATACCAGTAGCTTCTAGTTCTAAAGATGTTCAATTGAAAAATATAACAGATTATATGTATTTGACA
AATGCGCCATCGTATACTAACGGAAAATTGAATATATATTATAGAAGGTTATATAGTGGACTAA
AATTTATTATAAAAAGATATACACCTAATAATGAAATAGATTCTTTTGTTAAATCAGGTGATTT
TATTAAATTATATGTATCATATAACAATAATGAGCACATTGTAGGTTATCCGAAAGATGGAAATGCCTTTAATAATCTTGATAGAATTCTAAGAGTAGGTTATAATGCCCCAGGTATCCCTCTTTATA
AAAAAATGGAAGCAGTAAAATTGCGTGATTTAAAAACCTATTCTGTACAACTTAAATTATATGATGATAAAAATGCATCTTTAGGACTAGTAGGTATCCGTAATGGTCAAATAGGCAACGATCCAAATAGGGATATATTAATTGCAAGCAACTGGTACTTTAATCATTTAAAAGATAAAACTTTAACATGTGATTGGTACTTTGTACCTACAGATGAAGGATGGACAAATGATTAA
配列番号２２
GAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTGGTAGTGGGAGCAACGGCAGCAGCGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTCCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

表２：６ｘＨｉｓ－タグ；Ｖ５エピトープタグおよびＴＥＶ切断部位を示す組換えＴａｑＰＰＫのアミノ酸配列（配列番号１１）
His6 V5 tag TEV ＼/ TaqPPK
MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTMRLLPEESWLQFNRRVLRQSERPDFPL
LERMRFLAIWNRNLDEFFAARIAKPFLKHRGSEAHLRLLKEAEDQARLAEGRYRALLAEA
APHLKILEPEELDDLDWLYFRVFLAEVVVPKTDLIAWEAAKEASHGALYFASEDHLVRLP
QDLPRLLKVPGREGTYVRLGALMRARSDLFLPRESPLYEFRVLRLLESERARADWDELAQ
ALEGRQEGLSTLLVAERGFPKGWLEGLQEALGLLPEEVILLSPPLNLTLVETLVAEGPSR
WRFPPLEPKRPRAFMKNPLKRLQEKDLVLYHPFEDYAALERFAEAALSEEVEEVYATLYR
IGEANPLAEALIQAARAGKRVHVLLEPRARFDELLNLSWYLRFLRAGVAVLPLSERKVHA
KALLLLTQKGGYAHLGTGNYNPQNGRQYTDFSLFTARKEVVMEVAEFFRALQEGRTPRLN
LLKTGEAIQELLLEHIRAESHPKGRILLKCNHLTDPALLEALARAADKGARVDLIVRSTLTLLHPRFRARSLVGRFLEHARVAAFYQGGRWALYLTSADLMPRNFQNRFELLFPVLDKEGKAKVLEVLKRQLKDDRNAFLLSPKGETPLWGGRHDAQRILAW

Claims (12)

1. 耐熱性無細胞タンパク質発現系であって、
   －インビトロ高分子合成に必要な全ての無細胞反応成分を有する好熱性ゲオバチルス培養物由来の細胞抽出物であって、前記好熱性ゲオバチルスが、
   －ＯｍｐＴホモログのノックアウト；
   －ＲＮアーゼＩのノックアウト；
   －ＤＮＡメチル化依存性ＤＮアーゼのノックアウト；
   －σ因子ＲｐｏＤの過剰発現；および
   －ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の過剰発現、またはこれらの任意の組み合わせ；のために遺伝子改変されている細胞抽出物；
   －少なくとも１つの核酸合成テンプレート；
   －一定量の精製耐熱性ＲＮＡＰ；
   －細胞アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）エネルギー再生系であって、
   －一定量の精製アデノシルキナーゼ（ＡｄＫ）酵素；および
   －一定量の精製ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）酵素；
   －一定量の無機ポリリン酸（ＰＰｉ）；および
   －一定量のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を含むエネルギー再生系；を含み、
   －前記ＡｄＫおよびＰＰＫ酵素が相乗的に作用して、ＰＰｉおよびＡＭＰから細胞ＡＴＰエネルギーを再生し、
   前記ＡｄＫが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡｄＫ（Ｇｓｔ ＡｄＫ）であり、前記ＰＰＫが、サーマス・アクアチクス由来のＰＰＫ（ＴａｑＰＰＫ）である、耐熱性無細胞タンパク質発現系。
2. 無細胞タンパク質発現系であって、
   －無細胞発現バイオリアクターであって、
   －インビトロ高分子合成に必要な全ての無細胞反応成分を有する好熱性ゲオバチルス由来の細胞抽出物を含む反応混合物；
   －少なくとも１つの核酸合成テンプレート；
   －細胞アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）エネルギー再生系であって、
   －一定量の耐熱性アデノシルキナーゼ（Ａｄｋ）酵素；および
   －一定量の耐熱性ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）酵素；
   －一定量の無機ポリリン酸（ＰＰｉ）；および
   －一定量のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を含むエネルギー再生系；を含み、
   －前記ＡｄＫおよびＰＰＫ酵素が相乗的に作用して、ＰＰｉおよびＡＭＰから細胞ＡＴＰエネルギーを再生し、
   前記ＡｄＫが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡｄＫ（Ｇｓｔ ＡｄＫ）であり、前記ＰＰＫが、サーマス・アクアチクス由来のＰＰＫ（ＴａｑＰＰＫ）である、耐熱性無細胞タンパク質発現系。
3. 前記耐熱性のＧｓｔ Ａｄｋ酵素が、配列番号８を含む、請求項２に記載の無細胞タンパク質発現系。
4. 一定量のソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）をさらに含む、請求項２に記載の無細胞タンパク質発現系。
5. 前記細胞抽出物の生成に使用したのと同じタイプの微生物から単離した一定量のｔＲＮＡをさらに含む、請求項２に記載の無細胞タンパク質発現系。
6. 前記少なくとも１つの核酸合成テンプレートが、直鎖ＤＮＡテンプレートを含む、請求項２に記載の無細胞タンパク質発現系。
7. 無細胞タンパク質発現系であって、
   －無細胞発現バイオリアクターであって、
   －インビトロ高分子合成に必要な全ての無細胞反応成分を有する好熱性ゲオバチルス由来の細胞抽出物を含む反応混合物；
   －少なくとも１つの核酸合成テンプレート；
   －細胞アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）エネルギー再生系であって、
   －一定量の精製アデノシルキナーゼ（ＡｄＫ）酵素；および
   －一定量の精製ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）酵素；
   －一定量の無機ポリリン酸（ＰＰｉ）；および
   －一定量のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を含むエネルギー再生系；を含み、
   －前記ＡｄＫおよびＰＰＫ酵素が相乗的に作用して、ＰＰｉおよびＡＭＰから細胞ＡＴＰエネルギーを再生し、
   前記ＡｄＫが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡｄＫ（Ｇｓｔ ＡｄＫ）であり、前記ＰＰＫが、サーマス・アクアチクス由来のＰＰＫ（ＴａｑＰＰＫ）である、耐熱性無細胞タンパク質発現系。
8. 一定量の耐熱性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）をさらに含む、請求項７に記載の無細胞タンパク質発現系。
9. 前記核酸合成テンプレートが、直鎖ＤＮＡテンプレートを含む、請求項７に記載の無細胞タンパク質発現系。
10. 無細胞発現系であって、
    －無細胞発現系であって、
    －インビトロ高分子合成に必要な全ての無細胞反応成分を有する好熱性ゲオバチルス由来の細胞抽出物を含む反応混合物；
    －核酸合成テンプレート；を有する無細胞発現系；
    －細胞アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）エネルギー再生系であって、
    －一定量の精製された耐熱性のアデノシルキナーゼ（Ａｄｋ）酵素；および
    －一定量の精製された耐熱性ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）酵素；
    －一定量の無機ポリリン酸（ＰＰｉ）；および
    －一定量のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を含むＡＴＰエネルギー再生系、を含み、
    前記ＡｄＫが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡｄＫ（Ｇｓｔ ＡｄＫ）であり、前記ＰＰＫが、サーマス・アクアチクス由来のＰＰＫ（ＴａｑＰＰＫ）である、耐熱性無細胞発現系。
11. 無機リン酸ベースエネルギー再生系を組み込んだ無細胞タンパク質発現方法であって、
    －好熱性ゲオバチルス微生物を樹立するステップであって、前記好熱性ゲオバチルスが、
    －ＯｍｐＴホモログのノックアウト；
    －ＲＮアーゼＩのノックアウト；
    －ＤＮＡメチル化依存性ＤＮアーゼのノックアウト；
    －σ因子ＲｐｏＤの過剰発現；および
    －ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の過剰発現、またはこれらの任意の組み合わせ；のために遺伝子改変されているステップと、
    －前記遺伝子改変好熱性ゲオバチルス微生物の細胞培養物を生成するステップと、
    －前記細胞培養物の細胞溶解物を生成するステップと、
    －前記細胞抽出物を１つまたは複数の無細胞反応成分で補充して、インビトロ高分子合成に必要な成分を有する反応混合物を形成するステップと、
    －前記反応混合物を、前記好熱性ゲオバチルス微生物と同じ株由来の精製ｔＲＮＡで補充するステップと、
    －前記反応混合物を、大腸菌由来の精製ｔＲＮＡで補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量のゲオバチルス由来の耐熱性ソルビトール脱水素酵素で補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量のソルビトールで補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量の耐熱性のアデノシルキナーゼ（ＡｄＫ）酵素で補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量の耐熱性のポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）酵素で補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量の無機ポリリン酸（ＰＰｉ）で補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）で補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量のゲオバチルス由来の精製耐熱性ＲＮＡＰで補充するステップと、
    －１つまたは複数の発現産物を生成するように構成された直鎖ＤＮＡ合成テンプレートを導入するステップと、
    －前記反応混合物を無細胞発現バイオリアクター中でインキュベーションするステップと、
    －前記無細胞発現バイオリアクター中で前記１つまたは複数の発現産物を生成するステップと、
    －１つまたは複数の前記発現産物を前記反応混合物から単離および精製するステップ、とを含む方法。
12. 無細胞発現系によりタンパク質を生成する方法であって、
    －好熱性ゲオバチルス微生物の細胞培養物を生成するステップと、
    －前記細胞培養物の細胞溶解物を生成するステップと、
    －前記細胞抽出物を１つまたは複数の無細胞反応成分で補充して、インビトロ高分子合成に必要な成分を有する反応混合物を形成するステップと、
    －前記反応混合物を一定量の耐熱性のアデノシルキナーゼ（ＡｄＫ）酵素で補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量の耐熱性のポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）酵素で補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量の無機ポリリン酸（ＰＰｉ）で補充するステップと、
    －前記反応混合物を一定量のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）で補充するステップと、
    －１つまたは複数の発現産物を生成するように構成された核酸合成テンプレートを導入するステップと、
    －前記反応混合物を無細胞発現バイオリアクター中でインキュベーションするステップと、
    －前記無細胞発現バイオリアクター中で前記１つまたは複数の発現産物を生成するステップと、
    －１つまたは複数の前記発現産物を前記反応混合物から単離および精製するステップであって、前記発現産物がタンパク質である、ステップ、とを含み、
    前記ＡｄＫが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＡｄＫ（Ｇｓｔ ＡｄＫ）であり、前記ＰＰＫが、サーマス・アクアチクス由来のＰＰＫ（ＴａｑＰＰＫ）である、方法。

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